85 4 K L I N I S C H E W O C H E N S C H

A u c h eine n e n n e n s w e r t e V e r m i n d e r u n g des a r t e r i e l l en Sauer - s tor ies b e s t e h t be i H y p e r t o n i k e r n n ich t , ebensowenig eine V e r m e h r u n g de r Blutmilchs~iure, kurz, yon e iner , , ch ron i schen E r s t i c k u n g " k a n n n i c h t die Rede sein (8. Tabel le 7).

Die Ger ingf i ig igkei t de r E f f ek t e j e n e r a n a l e p t i s c h e n Mit te l , die s ich im Z u s t a n d de r Vasomotore l l schw~che , im Kol laps usw. k l in i sch schon v ie l f ach b e w ~ h r t h a b e n , in u n s e r e n V e r s u c h s r e i h e n d i i r f t e d a r a u f zu r i i ckzu i i i h r en sein, d a b die A n s p r e c h b a r k e i t de r V a s o m o t o r e n a p p a r a t e ftir diese Mi t t e l i m N o r m a l z u s t a n d eine ger ingere zu sein sche in t .

Zusammen/a~urgl: i . Die d u r c h s c h n i t t l i c h e E r r e g b a r k e i t de r V a s o k o n s t r i k t i o n s z e n t r e n n i m m t m i t vo r r t i cke l ldem Al t e r bei n o r m 0 t o n e n M e n s c h e n in h o h e m G r a d e zu.

2. Sie i s t bei essen t ie l lem u n d a r t e r i o s k l e r o t i s c h e m H o c h - d r u c k zume i s t s t a r k e r h6h t , bei a k u t e r N e p h r i t i s dagegen n ich t .

3. Sic w i rd d u t c h H y p o p h y s e n s t o f f e (Pi tuisal l , Tol lephi l l , P r a e p h y s o n ) n i c h t beeinf luBt .

4. Sie wi rd bei N o r m o t o n e n d u r c h S t r y c h n i n u n d O c t i n u m e twas geste iger t , d u r c h Cardiazol , , A n a l e p t i c m n 3o67" u n d S y m p a t o l n i ch t .

5. Sic wi rd bei H y p e r t o n i k e r n d u t c h Morph ium, L u m i n a l u n d P a d u t i n b e t r g e h t t i c h v e r m i n d e r t , d u r c h Dory l n i ch t .

6. S y m p a t o l w i r k t re in p e r i p h e r d rucks t e ige rnd , D o r y l w i r k t re in p e r i p h e r d r u c k h e r a b s e t z e n d .

7. Die V a s o m o t o r e n z e n t r e n a l t e r n l ld essent ie l l bzw. a r t e r io s lde ro t i s ch h y p e r t o n i s c h e r Menschen r eag ie ren au f V e r m e h r u n g und auf V e r m i n d e r u n g de r Blut-CO~ genau so wie d ie jen igen yon V e r s u c h s t i e r e n bei O a Mange l bzw. loka le r S g u e r u n g de r Zen t r en . H i e r aus werden SchluBfolgerul lgen h i n s i c h t l i c h de r P a t h o g e n e s e de r genama ten H o c h d r u c k f o r m e n abgele i te t .

8. B e i m k o m p e n s i e r t e n H o e h d r u c k b e s t e h e n keil lerlei o b j e k t i v e A n h a l t s p u n k t e ft ir eine ungenf igende L u n g e n - v en t i l a t i on .

L i t e r a t u r : ~ FxE'z u. I~RAUT, Arch. f_ exper. Pa th . I33, 1 (1928). - - ~ HELLER u. KUSUNOtr Arch. f. exper. Pa th . 173, 3Ol (1933). - - a HEYMANS U. BOUCKAERT, C. r. Soc. Biol. Paris I l i , 145 (1932) . _ 4 LvnwlG, Arch. f. exper. Path . I6o, 302 (1931). - - ~ MOI~L- MAN,r, Virchows Arch. 266, 712 (I927). - - ~ R~AB, a) Z. exper. Ned. 68, 337 (I929) - - b) Z. klin. Med. 118, 618 (1931 ) - - c) Arch, int. Med. 47, 727 (1931) - - d) Erg. inn. Med. 46, 452 (1934). - - ~ tI*AB u. FnlnI)MA~m, Z. ldin. Med. (im Druck). - - s RAAB u. REIII~ICH, Z. klin. Med. (im Druck). - - ~ R&I~I~APOI~T, J. amer. reed. Assoc. 92~ 1158 (1929). - - 10 REEKE U. XYEHRLE, Z. exper. IVied. 96, 404 (I935). _ l~ SC~ti~ANN U. M*c M~oI~, Virchows Arch. 291, 47 (1933) (S. 135 ). - - ~ TIRALA, a) Wien. klin. Wschr. ~929, 137 -- b) t te i lung der Blutdruckkrankhei t durch Atemfibungen. Frankfur t a. M.: H. Bechhold 1935. - - ~ VOlTu. CYB~, Miinch. meal. Wschr. 1933, 1466.

UBER DIE VITAMIN C-BESTIMMUNGSMETHODE VON MARTINI UND BONSIGNORE.

V o n

P r i v a t d o z e n t D r . W . NEUWEILER. Aus der Universit&ts-Frauenklinik Bern (Direktor: Prof, Dr. H. GUGGISBERG).

Zur B e s t i m m u n g y o n V i t am i n C in O r g a n e n wie ill K6 rpe r - f l i i ss igkei ten s t e h t uns, wie v o n a l ien A u t o r e n s t e t s b e t o n t wurde , u n d wie w i t a u c h in unsere l l A r b e i t e n i m m e r aus- dr f ickl ich fes tges te l l t h a b e n , zu r Zei t ke ine abso lu t s ichere chemische M e t h o d e zur Verf i igung. S~tmtliche bis j e t z t be- k a n n t e n Ver fah re l l s ind zweifellos m e h r ode r weniger uu- spezif isch. D a die Ms j e t z t h a u p t s g c h l i c h gebrguch l iehe l l M e t h o d e n auf de r B e s t i m m u n g des R e d o x p o t e n t i a l e s der Ascorb insgure be ruhen , s ind es in den K6rper f l t i s s igke i t en u n d in den O r g a n e x t r a k t e n be sonde r s die schwefe lha l t igen R e d u k t o r e n Cyst in , G l u t a t h i o n , Thio l le in im Ur in , die die R e a k t i o n s t6ren . F e r n e r k o m m e n n o c h b e s t i m m t e a n o r g a n i - sche S u b s t a n z e n wie Th iosu l f a t (D iabe t ike ru r in ) in Be- t r a c h t . M a n k a n n also sagen, d a b die einzige his h e u t e a b s o l u t s ichere l B e s t i m m u n g s m e t h o d e die biologische P r i i f ung a m Tier ist, die j e d o c h ffir genaue q u a n t i t a t i v e Versuche eine zu ger inge Genau igke i t bes i t z t , d a i m m e r h i n i m b e s t e n Fal le

R I F T . 15 . J A I K R G A N G . N r . 24 13. JUNI ~936

m i t e iner Feh le rg renze yon l O - - 2 o % zu rechne l l ist. F e r n e r b e d a r f es zu r biologischel l T i t r a t i o n r e l a t i v grol3er Mengen yon V i t a m i n C (o ,5- -1 m g Ascorbins~ture t ag l i ch pro Tier), also Mengen, die uns im H i n b l i c k au f die ger ingen K o n z e n t r a t i o n e n des V i t a m i n C in den zu n n t e r s u c h e n d e n E x t r a k t e n me i s t ens n i c h t zu r Ver f i igung s t ehen .

I n l e t z t e r Ze i t w u r d e n u n yon MARTini u n d ]3ONSIGNORE eine neue, a n s c h e i n e n d spezif ische M e t h o d e de r Ascorb in - s ~ u r e b e s t i m m u n g angegeben , die d a r a u f b e r u h t , d a b Ascor- bins~ture, d e m Lich te ausgese tz t , i h r R e d o x p o t e n t i a l in k u r z e r Zei t n a c h de r n e g a t i v e n Seite h in ver~indert , besonde r s in G e g e n w a r t gewisser p h o t o d y n a m i s c h e r Subs t anzen . SO wird z. 13. e ine L 6 s u n g yon IVlethlyenblau d u r c h die Ascorb in - s f u r e r a sch in ih re L e u k o b a s e i ibergef i ihr t . Diese IReaktion soll in s a u e r e m Milieu q u a n t i t a t i v u n d spezif isch sein, d a ke ine de r bis j e t z t b e k a n n t e n in den O r g a n i s m e n v o r k o m - me l lden S u b s t a n z e x in de r in B e t r a c h t f a l i enden K o n z e n t r a - t ion diese lZeakt ion zeigt.

Die Autoren siild prakt isch so vorgegangen, dal3 sie einen 8proz. trichloressigsauren Organextrakt mi t Nat r iumci t ra t und Nat r iumbicarbonat gepuffert haben uild bei sukzessivem Zusatz yon Methylenblaul6sung uilter Belichtung feststellten, wieviel Methylen- blaul6sung verbraucht~ d. h. wieviel Farbstoff dutch die Anwesen- heir yon Ascorbins~ure in die Leukobase umgewandelt wird. Um die Wiederauff~rbung der Leukobase ein wenig hintanzuhal ten , setzten die Autoren vor der Belichtung etwas Natr iumthiosulfa t zn. Der Zusa%z von NaKCO~ hat den Zweck, dutch die ei l ts tehende l(oMens~ure den im Reaktionsgemisch gelosten Sauerstoff aus- zutreiben. Was weitere Einzelheiten anbelangt, so verweisen wir hier auf die Originalarbeit yon MARTINI und BONSmNORE. Um festzustellen, wieviel MethylenblauI6sung einer bekannten Ascorbin- s~uremenge entspricht , d . h . um den Umrechnungsquot ienten zu bestimmen, wird eine Ascorbins~urel6sung yon bekannter Konzen- t ra t ion mi t 1Viethylenblaul6snng t i t r iert , wobei der Quotient Methylenblau-Ascorbins~ure olme weiteres enni t te l t werden kann. Die Methode scheint recht spezifisch zu sein*, da die Sulfhydril- verbiildungen die Reaktion nicht st6reil oder bewirken, eine Tat- sache, die wir auch in unsereil Nachpri~fungen best~.tigen konnten.

Die B e s t i m m u n g s m e t h o d e w u r d e yon CAVFIER und AMMON, AMMON u n d H I N S B E R G , n e u e r d i n g s a u c h y o n G.aBBE p r a k t i s c h a n g e w a n d t , a n d es w u r d e n dabe i r e e h t b e m e r k e n s - we r t e R e s u l t a t e ge funden . Die A u t o r e n k o n n t e n n~ml ich Asco rb ins~urewer t e he rans t i t r i e re l l , die wel t u n t e r den m i t 2 ,6 -Dich lo rpheno l indophenoI e r m i t t e l t e n lagen. Die U n t e r - schiede b e t r a g e n m a n c h m a l m e h r als das 6 - - 8 f a c h e . Es is t ja ohne wei teres zu e rwar ten , d a b eille spezif ische M e t h o d e ger ingere W e r t e e rgeben w i r d als die bis j e t z t geb r~uch i i chen unspez i f i schen I n d o p h e n o l - ode r sogar J o d m e t h o d e n . I m m e r - hi l l t i b e r r a s c h t e n die R e s u l t a t e doch, well sie wei t f iber das h inausgehen , was m a n v ~ dur f t e . W~ihrend wir z. B. in de r P l a c e n t a an f G r u n d de r I n d o p h e n o l r e a k t i o n f iber 2o m g % Ascorb i l l sgure - - V i t a m i n C - - nachwiesen , f a n d e n CAFFIE~ u n d AMMON m i t de r M e t h o d e yon 1ViARTINI a n d BOI~Sm~,'ORE n u t e inen d u r c h s c h n i t t l i c h e n G e h a l t yon I m g %. N u n k f l l n t e dieser U n t e r s c h i e d abe r a u c h d a r a u f zur i ick- gef i ih r t w-erden, d a b in de r A u s i i i h r u n g de r Me thode y o n MXRTINI u n d BONSlGNORX gewisse F e h l e r m 6 g l i c h k e i t e n be- s t ehen , zumaI die bis j e t z t pub l i z i e r t en K o n t r o l l e n yon MARTINI u n d BONSlGNOI~E U. a. uns n i c h t gen i igend erschei- nell, u m so we i tgehende Schliisse zu ziehen. MARTINI u n d BONSmNORE h a b e n ausschl ieBlich fo lgende K o n t r o l l e n vor- g e n o m m e n : z u n g c h s t L 6 s u n g o h n e Ascorbins~iure, d a n n O r g a n e x t r a k t e u n d schlieBlich reine, d o p p e l t t i t r i e r t e Ascorb in - sXure. Es tehlen, sowei t wi r aus d e n P u b l i k a t i o n e n e r sehen k6nnen , I4on t ro l l en m i t Z u s a t z y o n b e s t i m m t e n 1Viengen yon AscorbinsXure zu den b e t r e f f e n d e n O r g a n e x t r a k t e n sowie die pa -Kon t ro l l en . Diese b e i d e n I~ont ro l len e r sche inen uns unerl~iBIich, scholl deshMb, weil n u r au f diese A r t u n d \u eille P r t i f u n g des U m r e c h n u l l g s q u o t i e n t e n m6gl ich ist. W i r h a b e n dies n a c h g e h o l t u n d kons t a t i e r t , d a b wi t be i Z n s a t z yon genan t i t r i e r t e n A s c o r b i n s ~ u r e m e n g e n zu O r g a n e x t r a k t e n weder m i t d e m v o n ~V~ARTINI n n d BONSlGNORE a n g e g e b e n e n Q u o t i e n t e n yon o,o48 n o c h m i t d e m von CAFFIEI~ u n d AMMON fes tges t e l l t en yon o,o86 oder d e m yon uns g e f u n d e n e n

* Stark reduzierende Sub~tanzen wie H~S entffirben a]lerdings MethylenMau.

I3. J U N I 1936 K L I N I S C H E W O C H E N S C H R I F T . 15 . J A H R G A N G . N r . 24 855

yon 0,09 den Z u s a t z an Ascorb insgure h e r a u s t i t r i e r e n k o n n t e n . Also m u B t e n n o c h i rgendwelche y o n diesen A u t o r e n n i c h t - a n g e g e b e n e F e h l e r q u e l l e n vor l iegen.

Zur Best immung des Quotienten benutz ten wir eine 8proz. trichloressigsaure Ascorbins~urel6sung. 5 cem dieser L6sung werden mit 2 ccm Natr ium-Bicarbonatpuffer versetzt und i ccm 5proz. Na-Thiosulfatl6sung zugefiigt. Damis wird nun der Um- rechnungsfaktor bes t immt. Wi t fanden mit dieser Versuchs- anordnung, wie gesagt, einen Quotienten yon o,o 9.

Auf fa l l end i s t unseres E r a c h t e n s , d a b die v e r s c h i e d e n e n A u t o r e n so groBe Di f fe renzen in de r B e s t i m m u n g des U m r e c h - n u n g s f a k t o r s b e o b a c h t e t e n . ~V~ARTINI u n d BONSIGNORE geben e inen r echne r i s ch e r m i t t e l t e n Q u o t i e n t e n yon o,o48 an, CA~FIER u n d AMMON e inen fa s t u m ioo % h 6 h e r e n yon o,o8. SchlieBlich h a t uns MARTINI in e iner b r ie f l i chen M i t t e i l u n g e inen so lchen v o n o, 5 angegeben . V o r a u s s e t z u n g ffir die g e n a u e ]3e s t immung de r Asco rb ins~ure i s t doch s e l b s t ve r s t ~nd l i ch die E r m i t t l u n g eines r i c h t i g e n U m r e c h n u n g s q u o t i e n t e n . I n zah l r e i chen K o n - t r o l l v e r s u c h e n h a b e n w i t n u n n a c h w e i s e n k6nnen , daB das Ver - h/~ltnis Asco rb ins~ure zu r b e n u t z t e n M e t h y l e n b l a u l 6 s u n g v o n de r W a s s e r s t o f f i o n e n k o n z e n t r a t i o n a b h ~ n g i g ist. Der Q u o t i e n t i s t also eine F u n k t i o n des Pu des Reak t ionsgemisches . Diesen Nachwe i s u n d die F e s t l e g u n g eines U m r e c h n u n g s q u o t i e n t e n h a b e n w i t so durchgef f ih r t , d a b die M e t h y l e n b l a u r e a k t i o n in v e r s e h i e d e n e n P u f f e r l 6 s u n g e n yon b e s t i m m t e m Pa (Puffer n a c h MCILVAINE, he rges te l l t v o n d e r F i r m a Siegfr ied A.-G. in Zof ingen ; e l ek t r i sch geprfift) , 4 ,o - -%o, v o r g e n o m m e n wurde, u n d d a b e i h a b e n wir zeigen k6nnen , d a b je n a c h d e m Pu de r

.~ 0,7 ~.a,e ~o,s ,~ 0,r .P o,a

"~ 0,1

5a

/ /

/ I

~,s # s,s r e,s fg N ~

Abb. I.

L 6 s u n g eine k o n s t a n t e M e n g e yon Ascorb ins~ure ganz ve r - sch iedene Mengen v o n M e t h y l e n b l a u en t fArbt . A n t d iese A r t u n d Weise k o n n t e eine K u r v e fiir d iesen E x p o n e n t e n aufges te l l t werden , die wi r dieser M i t t e i l u n g bei legen. M a n e r s i eh t da raus , d a b bei e inem Pa yon 4,o ~ ccm M e t h y l e n b l a u - t 6 sung d u t c h o, o 9 m g Ascorb ins~ure e n t f ~ r b t wird . Bei e i n e m Pu yon 4,5 i s t dazu o , i m g Ascorb ins~ure n6t ig , bei PH 5,5 o,15 mg, bei Pu 6,o 2, 5 mg, bei Pu 6,5 sogar 0,5 m g Ascorbins~ture usw*. Z u r g e n a u e n B e s t i m m u n g de r Ascorb in - s ~ u r e k o n z e n t r a t i o n in e inem E x t r a k t g e h 6 r t also unbedingt eine ganz genaue pu-Bestimmung, und zwar muff diese au] 0,05 genau sein, was p r a k t i s c h besonde r s bei g e t r i i b t e n oder ge f~ rb ten L 6 s u n g e n n i c h t u n e r h e b l i c h e Schwie r igke i t en be re i t e t . Als p u - B e s t i m m u n g s m e t h o d e h a b e n wir das s tu fen - p h o t o m e t r i s c h e V e r f a h r e n n a c h JANKE benf i tz t , das me i s t ens

* Die nOtigen Mengen reiner Ascorbins/iure warden uns in dankenswerter Weise yon der Firma Hoffmann-La Roche & Co. A.-G., Basel, zur VerIfigung gestellt.

der ge fo rde r t en Genau igke i t genf igen dfirf te. D a b e i m u g m a r eine aus r e i chende F l f i s s igke i t smenge zu r Ver f f igung h a b e n , d a m i t b e i m Z u s a t z des I n d i c a t o r s de r Pu n i c h t ve rAnde r t wird. W i c h t i g ist, d a b als Verg le ichs l6sung (ohne Zusa t z des Ind ica to r s ) a u c h bei a n s c h e i n e n d fa rb losen L 6 s u n g e n n i c h t Wasse r , s o n d e r n das R e a k t i o n s g e m i s c h v e r w e n d e t wird . Die E x t r a k t e weisen hXufig leichte, n u r im T y n d a l l - V e r s u c h n a c h w e i s b a r e T r t i b u n g e n auf, die den A b l e s u n g s w e r t wei t - g e h e n d bee in f lussen k6nnen .

W i r s ind n u n im p r a k t i s c h e n Fal le bei T i t r a t i o n vor~ O r g a n e x t r a k t e n , U r i n e n usw. fo lgende rmaBen v o r g e g a n g e n :

Eine bes t immte Menge Organ wird mit einer gewissen Quan- t i t~t 8proz. Trichloressigs~ure extrahiert . 5 c c m dieses klaren Ext raktes werden mit 2 ecm der yon MARTINI und BONSIGNORE angegebenen Pufferl6sung (15 g Natr iumci t ra t , 4 g Nat r ium- bicarbonat , Aqua dest. ad IOO) versetzt und I ccm 5proz. Na t r ium- thiosulfatI6sung zugeffigt. In einem zweiten R6hrchen befinden sich als Vergleich 8 ccm H20 mi t einem Zusatz yon o,2 ccm Methylen- blaul6sung i : i oooo . Es wird nun Enter Belichtung (Lampe: Osram-Nitrophot-K., 6ooo Lm.) sukzessive so vim Methylenblau zugesetzt, his kein Methylenblau mehr entfXrbt wird und die beiden R6hrchen die gleiche Farbe aufweisen. Die verbrauchte Nethylen- blaul6sung (Zusatz yon Methylenblau minus 0,2 cem) entspr icht dann der vorhandenen AscorbinsXure. Um den Quotienten zu ermitteln, bes t immen wit nun die Wasserstoff ionenkonzentrat ion im Reaktionsgemisch* (Extrakt plus Pufferl6sung plus Thiosulfat) und lesen in der Kurve den Quotienten ab. Die Ausrechnung ist dann eine auBerordenttich einfache. Man brauch t nur die ge- fundenen Kubikzent imeter Methylenblaul6sung mi t dem in der Tabelle ermit te l ten Quotienten zu multiplizieren, um die in den 5 ccm enthal tene Ascorbins~ure zu finden. Wir haben auI diese Ar t und ~Veise zahlreiche Best immungen vorgenommen, yon denen einige in beiliegender Tabelle ver6ffentl icht sind.

Se lb s tve r s t~nd l i ch h a b e n wi t a u c h die e ingangs ge fo rde r t en K o n t r o l l b e s t i m m u n g e n v o r g e n o m m e n , i n d e m wi t ve r sch iede- n e n E x t r a k t e n genau b e s t i m m t e A s c o r b i n s ~ u r e m e n g e n zu- gese tz t h a b e n . A u c h ffir diese L 6 s u n g e n nluB na t f i r l i ch jewei len de r p a b e s t i m m t u n d der Q u o t i e n t neu abge lesen werden . E r s t au f diese Weise ge lang es, den Z u s a t z q u a n t i - t a t i v zu er fassen u n d die R i c h t i g k e i t des U m r e c h n u n g s - f ak to r s zu beweisen. Es geh t n u n aus d iesen B e s t i m m u n g e n he rvor , d a b die I n d o p h e n o l m e t h o d e u n d die M e t h y l e n b l a u - m e t h o d e n i c h t so s t a r k d ive rg i e rende R e s u l t a t e e rgeben wie die yon den o b e n g e n a n n t e n A u t o r e n ge fundenen . Die ~ b e r e i n s t i m m u n g is t e igen t l i ch eine r e c h t gute. Bei de r P l a , c e n t a z. B. s t i m m e n die W e r t e z iemlich g u t t iberein, so d a b wir n a e h wie vo r b e r e c h t i g t sind, yon e inem im In t e r e s se des K indes l i egenden S p e i c h e r u n g s v e r m 6 g e n de r P l a c e n t a ffir V i t a m i n C zu sprechen . Ledig l ieh be im U r i n k 6 n n e n wi r die zu e r w a r t e n d e T a t s a c h e fes ts te l len, d a b de r m i t I n d o - p h e n o l ge fundene W e r t i m a l lgemeinen zu h o c h ist. Besonde r s h o c h is t er, w e n n w i t konzen t r i e r t e , d u n k l e U r i n e t i t r i e ren , w ~ h r e n d in hellen~ wXsserigen U r i n e n der U n t e r s c h i e d wesen t - l ich ger inger ist. W i r h a b e n a u c h eine Re ihe yon angere icher - t e n U r i n e n u n t e r s u c h t u n d d o r t fes t s te l len k6nnen , dab ein U n t e r s c h i e d zwischen I n d o p h e n o l - u n d M e t h y I e n b l a u b e s t i m - m u n g k a u m m e h r be s t eh t . W i t werden auf diese Verh~ l tn i s se

* Wit m6ehten hier ausdrtieklieh betonen, dab die Bestimmung derWasserstoffionen- konzentration sofort nach Zusatz der Pufferi6sung vorgenommen werden muB, bevor das entstehende CO2 vollst~indig entwichen ist, da sonst die Werte nieht mehr genau stimmen warden.

KSrperfliissigkeit oder 0rganextrakt

Urin H., dunkel . . . . . . . . . Ur in S., hell . . . . . . . . . . . Ur in A., angereichert . . . . . . . Urin F . , angereichert . . . . . . . Frauenmilch M . . . . . . . . . . Corpus lu teum-Ext rak t 194 . . . . P lacen taex t rak t 194 . . . . . . . P lacen taex t rak t 193 . . . . . . . P lacentaext rak t 192 . . . . . . . Nebennierenextrakt (Kaninchen) . . Leberextrakt (Kaninehen) . . . . .

Titration Indophenol, in mg% Ascorbins~ure

Nach MARTINI und BON- SIGNORE, in mg% Ascor- [

binshttre

0,83 1,o2

I I , I 33,3

2,8 1,66 7, I4 4,16 2,1 I,I 3,9

o,21 5,58 I,O 5,5

12,8 5,5 g 35,2 5,22

2,8 4,66 1,54 4,82 6,84 6,3 4,29 6,33 1,9 5,74 1,43 4,92 3,22 5,9

Nach MARTINI und BONSIGNORE naeh Abzug des Zusatzes yon %1 mg AscorbinsEure zur belieh- • Menge t~xtrakt usw. in mg %

Ascorbins~ure

lO,46 31,2

7,16

2,21 1,64

PU

5,62 5,7

6,25

5,69 5,3

856 K L I N I S C H E W O C H E N S C H R I F T . 15 . J A H R G A N G . N r . 24 13. JUN[ I936

in e iner a n d e r e n A r b e i t n o c h genaue r z u r f i c k k o m m e n u n d d o r t a u c h die t i e r expe r imen te l l e B e s t a t i g u n g e rb r ingen k 6nnen .

Z u m Schlusse m 6 c h t e n wir noch ganz kn rz 2 wei te re V o r s i c h t s m a g r e g e l n e rw~hnen , au f die schon ~V[ARTINI u n d 13ONSlGNORE h ingewiesen h a b e n u n d de ren U n t e r l a s s u n g n i c h t n n e r h e b l i c h e Feh le r v e r u r s a c h e n k a n n .

Zung~chst dar t der Natriumthiosulfatzusatz, der iibrigens nicht unbedingt notwendig ist und auf den man bei raschem Arbeiten verziehten kann, wie uns kt~rzlich auch MARTINI mitteilte, nur dem gepufferten Reaktionsgemisch zugesetzt werden, welches einen p~ nicht unter 4, 5--4,8 aufweisen dart. Wird Thiosulfat ether sauerern L6sung zugegeben, so wird Schwefel abgespalten, der ebenfalls in der Lage ist, Methylenblau zu entfXrben. Ferner ist es wiehtig, dab die Ascorbins~urekonzentration im Reaktions- gemisch nieht eine altzu hohe ist. Die Konzentrat ion smite so gewXhlt werden, dab bet der Reaktion nicht mehr als 1,5, h6chstens 1,8 ccm Methylenblau!Ssung I ; 1ooo0 verbrancht werden. Sind gr6Bere Mengen n6tig, so wird die Bestinlmung ungenau, und es t r i t t dann eine eigentiimliche, yon der Methylenblaukontrolle ver- schiedene und nicht mehr vergteichbare 131auf~rbung auf, wodurch eine quant i ta t ive Best immnng unm6glieh wird. Is t der Ex t rak t also zu vitaminreieh, so muB er mit 8proz. Trichloressigs~ure ver- d i innt werden.

ZusammenJassung: 1. Die V i t a m i n C - B e s t i m m u n g s m e t h o d e y on MARTINZ u n d BONSmNORX schein t , sowei t i ibe r sehbar , spezi f i sch zu sein, da S u l f h y d r i l v e r b i n d u n g e n in den in ]3e- t r a c h t f a l l enden K o n z e n t r a t i o n e n die R e a k t i o n n i c h t geben.

2. D a je n a c h de r W a s s e r s t o f f i o n e n k o n z e n t r a t i o n die gleiche ?r Ascorbins~iure ve r sch i edene Mengen M e t h y l e n - b lau entf~irbt , m u g j edesma l im R e a k t i o n s g e m i s c h de r p~ auf o,05 genau b e s t i m m t werden, d a m i t in de r K u r v e de r e n t s p r e c h e n d e U m r e c h n u n g s q u o t i e n t e r m i t t e l t w e r d e n kann .

3. De r Z u s a t z des N a t r i u m t h i o s n l f a t e s smite, w e n n i iber- h a u p t , e r s t n a c h de r P u f f e r u n g des R eak t i ons gemisches au f m i n d e s t e n s 4,8 v o r g e n o m m e n werden .

4. Die K o n z e n t r a t i o n v o n Ascorbins/~ure im E x t r a k t soll so gew~ihlt werden , d a b n i e h t m e h r als 1 , 5 - - 1 , 8 ccm Me- t h y l e n b l a u l 6 s u n g v e r b r a u c h t werden.*

L i t e r a t u r : A~aMON U. HINSBERG Klin. Wschr. I936, 85. -- CAFFIER U. AMMOIV, Zbl. Gyn~k. x936, I. -- G ~ E , Klin, Wschr. I936, 292. - - JANI~E U. SEKEI~A, Biochem. Z. 245, 362 (1932). - -

MARTINI U. BONSlG~IOR~, Biochem. Z. 273, 17 ~ (1934).--WAcI~HOLDEg, Klin. Wschr. I936, 593.--WAcH~IOLI)ER U. PODESTA, I-tOPPE-SEYLERS Z. 239, 149 (I936) �9

UBER DIE FERMENTMETHODE ZUR VITAMIN C- BESTIMMUNG UND DAS VORKOMMEN VON

ASCORBINSAURE-OXYDASE IN PFLANZ- LICHEN PRODUKTEN.

(Vorl~iufige Mitteilung.) W o n

Privatdozent Dr. W. NEUWEILER, Aus der Universit~tts-Frauenklinik Bern (Direktor: Prof. Dr. H. GUGGISBERG).

Wir m 6 c h t e n i m fo lgenden ku rz f iber unse re N a e h p r t i f u n g e n de r F e r m e n t m e t h o d e zu r V i t a m i n C - B e s t i m m u n g v o n TAUBER u n d NLEINER 1 (vgl. a u c h V. EEKELEN 2) b e r i c h t e n . Diese NIethode des Ascorb ins~urenachwe i ses b e r u h t au f de r 13eobach- tung , d a b in de r K i i r b i s f r u c h t H u b b a r d s q u a s h oder s u m m e r s q u a s h eine Oxydase v o r k o m m t , die fiir V i t a m i n C spezif isch sein soil. Die A u t o r e n k o n s t a t i e r t e n n~mlich , dab de r Z u s a t z eines a lkoho l i schen E x t r a k t e s aus d e m Fruoh t f l e i s ch dieser K f i r b i s a r t zn e iner Ascorbins /~urel6sung dieselbe in r e c h t k u r z e r Zeit , ~/2--I S t u n d e bet 38~ vo t t s t~nd ig oxydie r t , wobei also i h r R e d u k t i o n s v e r m 6 g e n ve r lo rengeh t . I m P r inz ip g e s t a l t e t s ich n u n die auf diese 13eobachtung a u f g e b a u f e V i t a m i n C-13es t immungsmethode so, d a b " die zu unte~'- * Anmerkungbeide~'~or~'ektu~': Kilrzl ichhatWAeHHOLDER auf eineweitereFehler- quelle der Methode hingewiesen. Er maeht darauf aufmerksam, dab fiir die BeIieh- tung elne gelaiigend intensive LiehtquelIe benutzt werden rauB. Aueh wit betonen diese Notwendigkeit, mfehte n allerdings darauf aufmerksam machen, dab bet Anwendung einer zu starken Liehtquelle, z. 13. Bogenlicht, Methylenblau in saurer L6sung auch bet fehlender Ascorbins~iure innerhalb weniger als i Minute entfarbt werden kanu.

suchende L6sung (Extrakt usw.) vor und nach Zusatz des Fermentes mit 2,6-Dichlorphenolindophenol titriert wird. Der Verlust an IReduktionskraft entspricht dann dem tat- s~ichlichen Ascorbins~iuregehalt. I)as noch iibrigbleibende l~eduktionsvermSgen (Restreduktion)dart infolgedessen nicht der Ascorbins~iure, dem Vitamin C, zugeschrieben werden, sondern ist auf andere reduzierende Substanzen zurfickzuffih- ten. Die Ascorbins~Lure wird durch das Ferment zuerst in die reversibel oxydierte Form fibergeffihrt und erst allm~Lhlieh zers t6r t .

D a wi r gegenw~irtig t iber ga r ke ine zuverl~issige chemische A s c o r b i n s ~ u r e - B e s t i m m u n g s m e t h o d e verf i igen, die fiir L a b o r a - t o r i umszwecke ohne gr6Bere A p p a r a t u r s ichere R e s u l t a t e e r g i b t (bet de r M e t h o d e yon MARTINI und BOZCSlGNORE b r a u e h t es, wie wir v o r s t e h e n d mi tge t e i l t h a b e n , e ine genaue B e s t i m m u n g des Pa), so schien es uns wf inschenswer t ; dieses V e r f a h r e n zu prf i fen u n d i h m wet te r nachzugehen . W i r geben im folgen- den ku rz unse re R e s u l t a t e b e k a n n t u n d b e h a l t e n uns vor, in e iner gr6f ieren A r b e i t ausf i ih r l icher da r f ibe r zu be r i ch ten .

I m Pr inz ip s ind wir so v o r g e g a n g e n wie TAUBER u n d KLEINER.

Wir haben zun~tchst einen Extrakt aus Kiirbisfleisch hergestellt, indem wir etwa 250 g zerkleinertes Pflanzengewebe mi t 75 ~ ccm 3oproz. Alkohol versetzten, 5 1Vfinuten lang schfittelten und dann filtrierten. Der Ex t rak t ist sof0rt gebrauchsfertig, aber nur etwa 2 Tage haltbar. Die Ext rakt ion dar t nur bei Zimlnertemperatur, n icht etwa im Brutschrank, vorgenommen werden. Ein solcher Ex t r ak t wird der gepufferten zu best immenden L6sung zugesetzt und nach einem Brutschrankaufentha l t yon etwa 1--2 Stunden der Reduktionswert mit dem urspriingliehen verglichen. Der Ver- lust an Redukt ionskraf t miiBte dann, fails das Ferment spezifisch wirkt, ausschlieBlich der Ascorbins~ure zugeschrieben werden. Es ha t sich auch in der Ta t gezeigt, dab Cystin und Glutathion dureh dieses Oxydaseferment nach I - -2s t t indiger Einwirkung in ihrer Reduktionsf~thigkeit keine EinbuBe erleiden. Ers t nach inehr aIs IO Stunden kann ein gr6Berer Verlust der Reduktions- kraft nachgewiesen werden.

Das F e r m e n t , diese Oxydase is t also en tgegen der A n s i e h t yon TALTBER lilld KLEINER n i e h t fiir Ascorb ins~ure spezifisch, n u t s che in t eben die Aseorbins~iure besonders empf ind l i ch u n d le ich t o x y d a b e l zu sein. W e n n ke ine allzu lange Be- b r i i t u n g v o r g e n o m m e n wird, so b r a u c h t dieser Mange l a n Spezifit~it n i c h t wesen i l i eh zn s t6ren .

TAUBER u n d I{LEINER s te l len die F o r d e r u n g ant , d a b ein b r a u c h b a r e r K i i r b i s e x t r a k t so s t a r k sein muB, d a b 0,5 m g Ascorb ins~ure d u t c h I o c e m E x t r a k t in 1/2 S t u n d e bet 380 vo l l s t~nd ig o x y d i e r t sein muB. I n u n s e r e n N a c h p r i i f n n g e n h a b e n , w i t a u c h bet V e r w e n d u n g n i c h t ab so lu t gle icher K i i r b i s a r t e n E x t r a k t e yon ungefXhr de r gle iehen W i r k s a m k e i t ge funden . M a n c h m a l f a n d e n wir sogar w i r k s a m e r e E x t r a k t e , die n a c h I S t u n d e bet 38 ~ 1,5 m g Ascorb ins~ure zu o x y d i e r e n in de r Lage waren . I n dieser Zei t v e r m o c h t e n sie eine Cys te in- wie eine G l u t a t h i o n l 6 s u n g n i c h t zu ver~indern; a u c h a n d e r e V e r b i n d u n g e n , w i e H y d r o c h i n o n u n d N a t r i u m t h i o s u l f a t , w e r d e n n a c h n n s e r e r B e o b a c h t u n g d u t c h dieses F e r m e n t n i c h t bee inf luBt . ES is t also tats~tchlich m6glich, auf diese Weise d u t c h die B e s t i m m u n g des R e d u k t i o n s w e r t e s vor u n d n a c h E i n w i r k u n g des F e r m e n t e s Rtickschlf isse auf den t a t s a c h - l i chen G e h a t t a n V i t a m i n C in d e m b e t r e f f e n d e n E x t r a k t zu z i e h e n . V o r a u s s e t z u n g is t nat i i rHch, d a b m a n e inen wi rk- s a m e n E x t r a k t zur Ver I i igung ha t , de r a u c h tats~tchlieh in de r Lane ist, die v o r h a n d e n e Ascorb ins~ure zu oxyd ie ren . Derse lbe d a r t also n i c h t ~ilter als i 2 Tage sein u n d m u g vo r G e b r a u c h geprf i i t werden . F e r n e r d a r t die zu u n t e r s u c h e n d e L 6 s u n g n i c h t al lzu v i t a m i n r e i c h seth, m a n wi rd n6t igenfa l l s e n t s p r e e h e n d e V e r d f i n n u n g e n v o r n e h m e n mtissen. D a schlieB- l ich die W i r k s a m k e i t de r Oxydase p a - a b h ~ n g i g ist, sol l te der E x t r a k t auf e inen b e s t i m m t e n W a s s e r s t o f f i o n e n b e r e i c h gepuf fe r t werden . N a c h u n s e r e n E r f a h r u n g e n d t i r l t e ein p~-Bere ich u m 6,o Ifir diese f e r m e n t a t i v e ' O x y d a t i o n gf ins t ig sein. 13ei e i n e m Pn u n t e r 4,0 s che in t es zu e ther Abschw{ichung evi l . Z e r s t S r u n g des F e r m e n i e s zu k o m m e n . Das F e r m e n t is t s / iureempfindl ich , f e rner auch h i t zeunbes t / ind ig .

P r a k t i s e h s ind w i t so vorgegangen , d a b wir die auf Vi t a - m i n C zu u n t e r s u c h e n d e Fl t i ss igkei t gepuf fe r t (ungefi ihr au f