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Genomreplikation von DNA-Viren
Sommersemester 2006
Molekularbiologie IV: Strategien der Virusreplikation
Elisabeth SchwarzDKFZ
20. Juni 2006
Genexpression und DNA-Replikation
früh (early, E) spät (late, L)
Early-late switch
Replikation von DNA-Viren
Wo: Cytoplasma oder Kern?Kern > Transkription
> DNA-Replikation
G2
S
G1
MS-Phase•angewiesen auf S-Phase•Induktion von S-Phase
Wann?
DNA-Replikation
DNA-abhängige DNA-Polymerasen
semikonservative Replikation
Initiation:origin of replication = ori (Replikationsursprung)
Elongation:bidirektionale ReplikationReplikationsgabelnbidirektionale Wanderungsrichtung der ReplikationsgabelReplikationsblasen
+
DNA-Replikation• keine de-novo-Synthese! RNA-Primer
• DNA-Synthese durch Anheftung von Nucleotiden an das 3'-OH-Endeder RNA-Primer
• Template (Matrize) und Primer (Starter)
• Direktionalität: Kettenverlängerung in 5'-> 3'-Richtung
• dsDNA: Stränge komplementär und antiparallelPolymerisationsrichtung = Wanderungsrichtung der Replikationsgabel>kontinuierliche Synthese (leading strand, Leitstrang, Vorwärtsstrang)Polymerisationsrichtung gegenläufig zur Wanderungsrichtung>diskontinuierliche Synthese (lagging strand, Folgestrang, Rückwärtsstrang)
© Molecular Cell Biology, 2004
Initiation der DNA-Replikation
1.
2.
3.
4.
SV40
T-Ag
T-Ag
T-Ag
T-Ag
Zelle
ORC
Cdc6/Cdt1/ORC
MCM
Cdc6/Cdt1/ORC
• Ziel: viele neue Virusgenome
• T-Antigen
SV40• Ziel: Verdopplung!• origin „licensing“ +• origin-Aktivierung• ORC (origin recognition
complex, 6 Proteine)• CDC6, CDT1• MCM2-7• CDC7, S-CDKs, CDC45
Chromosom
DNA-Replikation
DNA-Replikationvon SV40
12
3
44
3
2
1
•ori•bidirektionaleReplikation
© Molecular Cell Biology, 1999
Fareed et al., 1972
DNA-Replikation von SV40
• Bindung von T-Antigen (doppeltes Hexamer) an ORI
• lokales Entwinden der Doppelhelix(Helicase-Aktivität von T-Antigen)
• Öffnen des Doppelstrangs (benötigt ATP + RFA als ssDBP)
• Bindung von Primase-Polymerase-alpha
• Synthese der Primer durch Primase• Bindung von RFC stimuliert dieLeitstrang-Synthese
© Molecular Cell Biology, 1999
• Bindung von PCNA> Inhibition und Verdrängung von Polα> Unterbrechung der Leitstrang-
Synthese• Bindung von Polδ an PCNA/RFC> erhöhte Prozessivität> Synthese des Leitstrangs• Bindung von Polα-Primase (+ RFC) anFolgestrang-Template
• Synthese des Folgestrangs> Okazaki-Fragmente (100-200 Nucl.)• Entfernen der RNA-Primer durch5’>3’-Exonuclease-Aktivität von Polα
• Auffüllen und Ligation der Fragmente• Wanderung der Replikationsgabel:durch T-Antigen erleichtert
• Trennung der beiden Tochtermoleküle:Topoisomerase II© Molecular Cell Biology, 1999
DNA-Replikation von SV40
© Molecular Cell Biology, 2004
Struktur des SV40 oriminimaler ori: ca. 65 bp, 3 essentielle Elemente– T-Ag-Bindungsstelle II
• inverted repeat, 23-34 bp, GC-reich• T-Bindungsstellen G-A/G-G-G-C
– AT-reiche Sequenz (15-20 bp)– early imperfect palindrome
© Principles of Virology, 1999, 2004
SV40: T-Ag und origin
Hexamer-Bildung von T-AgBindung an LT-BS IIStrukturveränderung von earlypalindrome (EP)Bindung von RFA (RpA)Entwinden der DNA-SträngeStabilisierung durch RFA
1.
2.
3.
© Principles of Virology, 1999, 2004
SV40 DNA-Replikation
• Präinitiationskomplex:ori + T-Ag + RFA
• Initiationskomplex:(ori + T-Ag + RFA) + Primase-Polα
• Bildung des Initiationskomplexes bestimmt den engen Wirtsbereich von Polyomaviren
© Principles of Virology, 1999, 2004
SV40 DNA-ReplikationTopoisomerasen
Decatenation
© Principles of Virology, 2004
Papillomaviruses Different modes of DNA replication
1. Establishment replicationLimited amplification:50-100 copies/cell
2. Maintenance replication(1+2: bidirectional replication)
3. Productive replication(rolling circle replication)
© Principles of Virology, 2004
Rolling-circle replication
© Principles of Virology, 1999
Initiation der DNA-Replikationbei Papillomviren
1. Kooperative Bindung von E1 und E2 an ori.2. ATP-abhängige Bindung von weiteren E1-Molekülen
und Verdrängung von E2
Das Enden-Replikationsproblembei linearen DNA-Genomen
© Principles of Virology, 1999
Problem: Replikation der GenomendenProblemlösungen
• eukaryote Chromosomen
• Bakteriophage T7• Bakteriophage T4• Adenoviren• Herpesviren
Bakteriophage Lambda• Pockenviren• Parvoviren
Telomere / Telomerase
terminale Redundanz (tR)tR, zirkuläre PermutationProtein-PrimerZirkularisierung
self priming, hairpin loopsself priming
Bakteriophage T7
Virion:polyedrischer Kopf (Durchmesser 30 nm)kurzer, nicht kontraktiler SchwanzFamilie Podoviridae
Genom:ds-DNA, linear, ca. 40 kbSequenzwiederholungen an den Enden(160 bp): > terminale Redundanz
© Bakterienviren, 1992
Bakteriophage T7: DNA-Replikation
• origin bei ca. 15% am linken Genomende• bidirektionale Replikation (RNA-Primer)• unvollständige Replikation des Folgestrangs
> einzelsträngige 3’-Enden• wegen terminaler Repeats: überstehende 3’-Enden komplementär• Zusammenlagerung zu Dimeren• Auffüllen der Lücken durch DNA-Ligase• sequenzspezifische versetzte Spaltung durch Endonuclease gp3
> überstehende 5’-Enden• Auffüllen der Einzelstrang-Enden
> vollständige Genome mit terminalen Repeats• bei weiterer Replikation: Bildung von Konkatemeren
(bis ca. 100 Kopien) durch Stranginvasion (strand invasion)
Bakteriophage T7: DNA-Replikation
5‘-ATTCAT ATTCAT-3‘3‘-TAAGTA TAAGTA-5‘
ori
5‘-ATTCAT ATTCAT3‘-TAAGTA TAAGTA
ATTCAT-3‘TAAGTA-5‘
ba
5‘-ATTCAT ATTCAT-3‘3‘-TAAGTA -5‘
5‘- ATTCAT-3‘3‘-TAAGTA TAAGTA-5‘
+a
b
bid. Replikation
ZusammenlagerungLigation
Bakteriophage T7: DNA-Replikation
a
5‘-ATTCAT ATTCAT-3‘-TAAGTA TAAGTA-
ATTCAT-3‘TAAGTA-5‘
a b
Spaltung durch gp3
5‘-ATTCAT ATTCAT-3‘3‘-TAAGTA TAAGTA-5‘
b+5‘-ATTCAT ATTCAT-3‘3‘-TAAGTA TAAGTA-5‘
5‘-ATTCAT
5‘-ATTCAT
3‘-TAAGTA TAAGTA-5‘
ATTCAT-3‘TAAGTA-5‘
+
aAuffüllen der Enden
b
Bakteriophage T4Virion:elongierter polyedrischer Kopf (111 nm x 78 nm)langer kontraktiler SchwanzFamilie Myoviridae, geradzahlige T-Phagen
Genom:ds-DNA, linear, ca. 166 kbGenom in Virionen ca. 171 kb, wegen:Sequenzwiederholungen an den Enden (ca 5 kb): terminale Redundanzzirkuläre Permutation
© Viren, 1993
Bakteriophage T4: DNA-Replikation• mehrere origins• frühe Replikation: bidirektionale Replikation > unvollständige Enden
• späte Replikation:Konkatemerbildung durch Rekombination(recombination-dependent DNA replication)Invasion der 3’-Enden in homologe ds-DNA (strand invasion)> komplexes Netzwerk von replizierender Virus-DNA
• Verpackung des Genoms in Phagenkopf:“head full”-MechanismusVerpackungslänge größer als Genomlänge> terminale Redundanz, zirkuläre Permutation
Bakteriophage T4: DNA-Replikation
ABCD...........YZA
BCDE..........YZAB
CDEF.........YZABC
Terminale Redundanz und zirkuläre Permutation
A A A A AZ Z Z ZA A A A A A AZ Z Z Z Z Z Z
T4 + T7: Virale ReplikationsfaktorenT4• DNA-Polymerase
(gp43)• Helikase, Primase
(gp41 + gp61)• Einzelstrang-bindendes
Protein gp32• ca. 30 virale
Genprodukteinsgesamt
T7• DNA-Polymerase
(gp5)• Helikase, Primase
(gp4)• Endonuclease
(gp3)• DNA-Ligase
>> autonomer viraler Replikationsapparat mit allennotwendigen Komponenten
Adenoviren
Viruspartikel:• Ikosaeder (Durchmesser 80-110 nm)• 252 Capsomere(240 Hexone, 12 Pentone)
• 1953 aus Rachenmandeln (adenoids) isoliert
• Erkrankungen der Atemwege, des Gastrointestinalbereichs, der Augenbindehaut
• >100 Adenovirus-Typen bei Wirbeltieren
Adenoviren als Modellsysteme:• effiziente Vermehrung in Zellkultur• Genexpression: Splicing• DNA-Replikation• Onkogenese, Zelltransformation• Vektoren© Viren, 1993
Adenoviren: Genom
• terminales Protein TP kovalent an 5‘-Enden• Interaktion der TPs > quasizirkulärer Zustand der DNA• Strangtrennung: ITRs > Hybridisierung der komplementären Sequenzen > Pfannenstiel-Strukturen
• lineare doppelsträngige DNA, 36 – 38 kb• inverted terminal repeats (ITRs, 54-166 bp)
© Molekulare Virologie, 2003
Adenoviren: InitiationTP 80 kD TP 55 kD
• Bindung von pTP + Pol an terminalen ORI
• Bindung von NF-1 und Oct-1 an ORI• kovalente Bindung von dCMP an Serin-OH: TP-C (Protein-Primer)• TP-C komplementär zu 3‘-terminalem G• Initiation der DNA-Synthese an TP-C• Bindung von ssDBP an verdrängten Einzelstrang
©M
olek
ular
e V
irolo
gie,
200
3
Adenoviren: ElongationPhase I:• kontinuierliche Leitstrang-synthese
• Strangverdrängung(strand displacement)
Phase II:• verdrängter Strang: ITR>Pfannenstielstruktur
• Gegenstrangsynthese
Virale Replikationsproteine:• Pol, pTP, ssDBP
© Molekulare Virologie, 2003
Herpesviren• große umhüllte Viren (Durchmesser 100-200 nm)• Envelope durch Knospung an innerer Kernmembran• lytische Infektion• Etablierung von latenten Infektionen (> Viruspersistenz)
• Reaktivierung
Genom:• lineare ds-DNA(130-240 kb)
• im Virus-Corespulenförmig um Proteinmatrix gewickelt
• Enden werden zusammengehalten• unique (ULund US) und repetitive Sequenzen
© Molekulare Virologie, 2003
© Viren, 1993
Herpesviren beim Menschen
Herpes-simplex-Virus: Genom ca. 150 kbHSV1: Herpes labialis (Lippenbläschen)HSV2: Herpes genitalis
Varizellen-Zoster-Virus (VZV): Genom ca. 125 kbVarizellen = Windpocken: PrimärinfektionZoster = Gürtelrose: Rezidiv
Cytomegalievirus (CMV): Genom ca. 230 kbinapparente Infektionenbei Immunsupprimierten schwere Verläufe
Epstein-Barr-Virus (EBV): Genom ca. 172 kbinfektiöse Mononucleose (Pfeiffer’sches Drüsenfieber)Burkitt-Lymphom (B-Zell-Lymphom), AfrikaNasopharynx-Karzinom, Südchina
Herpesviren beim Menschen
Humanes Herpesvirus 6 (HHV-6):1986 entdecktExanthema subitum (Rubeola infantum, Dreitagefieber)
Humanes Herpesvirus 71990 entdeckt, verwandt mit HHV-6
Humanes Herpesvirus 8:Genom ca. 270 kb1994 entdecktKaposi-Sarkome bei AIDS-Patienten
Herpesviren: DNA-Replikation
• Zirkularisierung der DNA
• rolling-circle-Mechanismus > head-to-tail-Konkatemere
• Spaltung der Konkatemere und Verpackung:miteinander verbundene Prozesse (virales cleavage-packaging protein)
•„head full“-Mechanismus
Rolling-circle replication
© Principles of Virology, 1999
Herpesviren
HSV-kodierte Enzyme für DNA-Replikation
Proteine für virale origin-abhängige DNA-ReplikationDNA-PolymeraseHelicase-Primaseorigin-bindendes ProteinssDNA-bindendes ProteinProzessivitätsfaktoren
Enzyme für Nucleinsäuremetabolismus
Bakteriophage Lambda
• Genom: dsDNA, linear, 48502 bp• überstehende 5‘-Enden (m, m‘, cos)(12 Nucleotide, komplementär)
• Infektion: Ringschluss• ori, O-Protein, P-Protein• 1. Bidirektionale Replikation• 2. „Rolling Circle“-Replikation• Concatemere > Encapsidierung > Spaltung durch Terminase(GenA+GenNu1) an cos(m/m‘) © Molekulare Genetik, 2001
Pockenvirengroße, komplex aufgebaute Viruspartikel (350 x 270 nm)im Lichtmikroskop sichtbar
Virusreplikation:im Cytoplasma, in „factory areas“(Virusfabriken)in kernlosen Zellen möglichBeginn der DNA-Replikation: ca 1-2 h p.i.Produktion: ca. 10.000 Genom-kopien/Zelleca. 50 % werden verpackt
© Molekulare Virologie, 2003
© Viren, 1993
PockenvirenVariolavirus
Erreger der Pocken (variola: scheckig)im 6. Jh. von Asien nach Europa eingeschlepptHöhepunkt der Pockenepidemie in Europa: 18. Jh.
Variola major:schwarze Blattern (hämorrhagische Pocken), Letalität 5-40%Variola minor:weiße Blattern, Letalität ca. 1 %
Ausrottung der Pocken 1977 durch weltweites Impfprogramm der WHO
DNA-Replikation:im Cytoplasma: keine Verwendung zellulärer Faktoren möglichalle Replikationsfaktoren vom Virusgenom codiert
Enzyme für Nucleotidmetabolismus(um genügend große Mengen an dNTPs für DNA-Replikationherzustellen):ThymidinkinaseThymidylatkinaseRibonucleotidreductasedUTPase
Pockenviren Virale Faktoren für DNA-Replikation
PockenvirenGenom:lineare ds-DNA 130-300 kbKodierungskapazität: 150-200 Genehairpin loops an den Enden + inverted terminal repeats (ITRs)
ITR-Länge: 725 bp (Variola) bis 12 kb (Vaccinia)
Vacciniavirus ITR
© Molekulare Virologie, 2003
Pockenviren DNA-Replikation
Priming:Setzen eines Nicks: self-priming (i.e. DNA-Primer)Rückfalten der ITRskein definierter ori
Elongation:Strand displacement (i.e. keine lagging strand-Synthese)Concatemer-BildungAuflösung der Concatemere in unit-length-Moleküle(Monomere) erfordert Synthese von späten Proteinen
Pockenvirennicks>self-priming
inverted repeats>hairpin loops
concatemers
nick
©Fields Virology, 2001
Parvoviren
Helferfunktionen für AAVAdenoviren: frühe Genprodukte > Induktion von S-Phasekeine direkte Interaktion von Ad-Proteinen mit AAV-GenomHerpesviren: HSV-Replikationsproteine
Parvovirinae (Vertebraten), Densovirinae (Insekten)felines Panleukopenievirus (Katzenseuche)Minute virus of mice (MVM)Aleutian mink disease virus (Aleuten-Nerzvirus)B19: Erythema infectiosum (Ringelröteln)Dependovirus (helferabhängige Viren): AAV 1-5
kleine nicht umhüllte DNA-Viren (Durchmesser 18-26 nm)(parvus = klein)Genom: lineare ss-DNA, ca. 5000 Basen
Parvoviren DNA-ReplikationGenom:• lineare einzelsträngige DNA, ca. 5000 Basen• Palindromsequenzen am 5'- und 3'-Ende: > hairpin-Strukturen• 3'-Palindrom: ca 100 Basen, 5'-Palindrom: 200-250 Basen
DNA-Replikation:• im Kern, notwendig: S-Phase• Parvoviren können S-Phase nicht induzieren>Parvoviren sind die am stärksten von zellulären Funktionen abhängigen Viren• Primer: terminale 3'-Sequenzen der Genom-DNA• single strand displacement (model)• unidirektionale Leitstrangsynthese• „rolling hairpin“-Synthese
Virales Protein für Replikation: NS-1nukleäres Phosphoprotein, sequenz-spezifische DNA-Bindung, Helicase,an 5'-Ende von replikativer DNA (+ Virion-DNA)kovalent gebunden
ParvovirenDNA-Replikation
AAV-2
3‘-terminaler hairpin > primer-templateInitiation
Nick (Rep) > Elongation
self-priming, Rückfaltung der Terministrand displacement, „rolling hairpin“
replicationintermediate
genomicDNA
© Principles of Virology, 1999
Genomreplikation von DNA-Viren
Viren Genom Replikationsproteineviral zellulär
PrimingElongation
Polyoma5 kb
T-AgPrimase
PolymeraseSSBP (RF-A)
RF-C (Bel.faktor)
PCNA (Proz.faktor)
Topo II
RNAbidirektionale
Replikation
Papillom8 kb
E1 wie PolyomaE2
RNAbid. Replikation
Genomreplikation von DNA-Viren
Viren Genom Replikationsproteineviral zellulär
PrimingElongation
Adeno 35 kb pTP Initiation:Pol NFIDBP NFIII/Oct1
Elongation:NFII (Topo)
für Elongation >9000 bp
Protein (pTP)strand
displacement
Genomreplikation von DNA-Viren
Viren Genom Replikationsproteineviral zellulär
PrimingElongation
Herpes 150 kb DNA-Pol. UL30ssDBP UL29ori-bind. Protein UL9Proz.faktor UL42Primase/Helicase:UL5, 8, 52
RNArolling circlehead-to-tail-
KonkatemereSpaltung in Monomere
Genomreplikation von DNA-VirenViren Genom Replikationsproteine
viral zellulärPriming
ElongationPocken 130-300 kb
DNA-Polymerase????Resolvase
Replikation im Cytoplasma!
self-primingRückfaltung der Termini
strand displacement
„rolling hairpin“
Parvo 5 kb NS1 DNA-Pol. self-primingRückf. der Termini
strand displacement„rolling hairpin“
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