Versuchsübersicht Mikrobiologische Wasseruntersuchungen · Prinzip des Nachweises von E. coli und...

Versuchsübersicht

Mikrobiologische Wasseruntersuchungen

Tag Versuch 13

Bestimmung

der Kolonie-

zahl

Versuch 14

Nachweis

E. coli und

Coliforme:

Flüssigkeitsan-

reicherung

Versuch 15

Nachweis

E. coli und

Coliforme:

Membran-

filtrations-

verfahren

Versuch 16

Nachweis

E. coli und

Coliforme:

Colilert-

Verfahren

Versuch 17

Nachweis

E. coli:

Mikrotiter-

platten-

verfahren

Versuch 18

Identifizierung

mit API 20 E-

System

Montag Anlegen von

Gussplatten

Ansatz von

Flüssigkulturen

Membran-

filtration

Animpfen von

Quanti-Trays

Animpfen

von Mikro-

titerplatten

-

Dienstag - Subkulturen

Endo-Agar

Subkulturen

CASO-Agar

Auswertung - -

Mittwoch Auszählung Ansatz: kleine

Bunte Reihe

Oxidase-Test,

Auswertung

- Auswertung -

Donners-

tag

Auszählung Auswertung

Bunte Reihe

- - - Ansetzen von

Teststreifen

Freitag Auszählung Auswertung

Bunte Reihe

- - - Auswertung

Versuchsübersicht

Mikrobiologische Wasseruntersuchungen

Tag Versuch 13

Bestimmung

der Kolonie-

zahl

Versuch 14

Nachweis

E. coli und

Coliforme:

Flüssigkeitsan-

reicherung

Versuch 15

Nachweis

E. coli und

Coliforme:

Membran-

filtrations-

verfahren

Versuch 16

Nachweis

E. coli und

Coliforme:

Colilert-

Verfahren

Versuch 17

Nachweis

E. coli:

Mikrotiter-

platten-

verfahren

Versuch 18

Identifizierung

mit API 20 E-

System

Montag Anlegen von

Gussplatten

Ansatz von

Flüssigkulturen

Membran-

filtration

Animpfen von

Quanti-Trays

Animpfen

von Mikro-

titerplatten

-

Dienstag - Subkulturen

Endo-Agar

Subkulturen

CASO-Agar

Auswertung - -

Mittwoch Auszählung Ansatz: kleine

Bunte Reihe

Oxidase-Test,

Auswertung

- Auswertung -

Donners-

tag

Auszählung Auswertung

Bunte Reihe

- - - Ansetzen von

Teststreifen

Freitag Auszählung Auswertung

Bunte Reihe

- - - Auswertung

1. Tag (Montag)

Proben: Trinkwasser, Ruhrwasser.

Ansatz: je 100 mL Trinkwasser und

Ruhrwasser.

Anlegen von Primärkulturen in

Lactose-Pepton-Bouillon (Flüssig-

keitsanreicherung).

Bebrütung: 36 °C, 24 h.

Quelle: Süßmuth et al., 1999

Versuch Nr. 14: Nachweis von E. coli und coliformen

Bakterien mittels Flüssigkeitsanreicherung

2. Tag (Dienstag)

Ablesen der Primärkulturen in

Lactose-Pepton-Bouillon auf

Trübung, Farbumschlag und

Gasbildung.

Bei negativer Reaktion, weitere

Bebrütung bei 36 °C für 24 h.

Anlegen von 2 Subkulturen auf

Endo-Agar (nur aus Ruhrwasser-

ansatz).

Bebrütung: 36 °C, 24 h.

Quelle: Süßmuth et al., 1999

Versuch Nr. 14: Nachweis von E. coli und coliformen

Bakterien mittels Flüssigkeitsanreicherung

Beim Umgang mit Endo-Agar unbedingt

Schutzhandschuhe tragen!

Prinzip des Nachweises von E. coli und coliformen

Bakterien in Lactose-Pepton-Bouillon

E. coli und coliforme Bakterien verwerten Lactose.

Abbau von Lactose erfolgt durch

1. enzymatische Spaltung von Lactose

2. Vergärung von Glucose zu organischen Säuren, Alkoholen

und Gas (Säurebildung: Farbumschlag von rot nach gelb;

Gasbildung: Gasblasen im Gärröhrchen)

H

H

-D-Galactosidase

D-Galactose

D-Glucose

Vergärung von Glucose durch E. coli und coliforme

Bakterien

Quelle: Madigan und Martinko, Brock Mikrobiologie, 2009

Formiat

Versuchsübersicht

Mikrobiologische Wasseruntersuchungen

Tag Versuch 13

Bestimmung

der Kolonie-

zahl

Versuch 14

Nachweis

E. coli und

Coliforme:

Flüssigkeitsan-

reicherung

Versuch 15

Nachweis

E. coli und

Coliforme:

Membran-

filtrations-

verfahren

Versuch 16

Nachweis

E. coli und

Coliforme:

Colilert-

Verfahren

Versuch 17

Nachweis

E. coli:

Mikrotiter-

platten-

verfahren

Versuch 18

Identifizierung

mit API 20 E-

System

Montag Anlegen von

Gussplatten

Ansatz von

Flüssigkulturen

Membran-

filtration

Animpfen von

Quanti-Trays

Animpfen

von Mikro-

titerplatten

-

Dienstag - Subkulturen

Endo-Agar

Subkulturen

CASO-Agar

Auswertung - -

Mittwoch Auszählung Ansatz: kleine

Bunte Reihe

Oxidase-Test,

Auswertung

- Auswertung -

Donners-

tag

Auszählung Auswertung

Bunte Reihe

- - - Ansetzen von

Teststreifen

Freitag Auszählung Auswertung

Bunte Reihe

- - - Auswertung

Versuch Nr. 15: Nachweis von E. coli und coliformen

Bakterien mittels Membranfiltration (ISO 9308-1)

1. Tag (Montag)

Proben: Trinkwasser, Ruhrwasser.

Ansätze:

- Trinkwasser 100 mL

- Ruhrwasser 10 mL und 1 mL.

Membranfiltration (0,45 µm Filter)

Anlegen von Primärkulturen:

Transfer der Filter auf Chromogenen Coliformen-Agar (CCA)

und Bebrütung (36 °C, 24 h).

Versuch Nr. 15: Nachweis von E. coli und

coliformen Bakterien mittels Membranfiltration

2. Tag (Dienstag)

Auswertung der Primärkulturen auf CCA:

- Auszählung aller dunkelblauen bis violetten Kolonien (E. coli),

Berechnung der Konzentration von E. coli (KBE/100 mL)

- Auszählung aller rosa bis roten Kolonien (verdächtige coliforme

Bakterien, die nicht E. coli

sind).

Anlegen von Subkulturen von

4 verdächtigen rosa bis roten

Kolonien aus der Ruhrwasser-

probe auf Trypton-Soja-Agar

(CASO-Agar) und Bebrütung

der Subkulturen (36 °C, 24 h)

Oxidase-Test.

Testprinzip

Nachweis von coliformen Bakterien: 6-Chlor-3-indoxyl--D-galactopyranosid (Salmon-Gal; chromogenes Substrat) -D-Galactosidase 6-Chlor-3-indoxyl + -D-Galactose (rosa bis rote Färbung der Kolonien) Nachweis von E. coli: 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-glucuronsäure Cyclohexylammoniumsalz-Monohydrat

(X-Gluc; chromogenes Substrat) -D-Glucuronidase

5-Brom-4-chlor-3-indoxyl + -D-Glucuronat

5-Brom-4-chlor-3-indoxyl wird von O2 der

Luft zum tiefblauen Farbstoff 5,5'-Dibrom-

4,4'-dichlor-indigo oxidiert (dunkelblaue bis

violette Färbung der Kolonien)

Salmon-Gal

X-Gluc

Versuchsübersicht

Mikrobiologische Wasseruntersuchungen

Tag Versuch 13

Bestimmung

der Kolonie-

zahl

Versuch 14

Nachweis

E. coli und

Coliforme:

Flüssigkeitsan-

reicherung

Versuch 15

Nachweis

E. coli und

Coliforme:

Membran-

filtrations-

verfahren

Versuch 16

Nachweis

E. coli und

Coliforme:

Colilert-

Verfahren

Versuch 17

Nachweis

E. coli:

Mikrotiter-

platten-

verfahren

Versuch 18

Identifizierung

mit API 20 E-

System

Montag Anlegen von

Gussplatten

Ansatz von

Flüssigkulturen

Membran-

filtration

Animpfen von

Quanti-Trays

Animpfen

von Mikro-

titerplatten

-

Dienstag - Subkulturen

Endo-Agar

Subkulturen

CASO-Agar

Auswertung - -

Mittwoch Auszählung Ansatz: kleine

Bunte Reihe

Oxidase-Test,

Auswertung

- Auswertung -

Donners-

tag

Auszählung Auswertung

Bunte Reihe

- - - Ansetzen von

Teststreifen

Freitag Auszählung Auswertung

Bunte Reihe

- - - Auswertung

1. Tag (Montag)

Proben: Trinkwasser, Ruhrwasser.

Ansätze: 100 mL Trinkwasser und

100 mL Ruhrwasser.

Zugabe des Colilert-18-Reagenzes.

Den gesamten Ansatz in Quanti-Tray füllen.

Quanti-Tray versiegeln.

Bebrütung: 36 °C, 18 h - 22 h.

1

2

3

Versuch Nr. 16: Nachweis von E. coli und coliformen

Bakterien mit dem Colilert-18/Quanti-Tray-System

Nachweis von E. coli und coliformen Bakterien

mit dem Colilert-System: Auswertung

2. Tag (Dienstag)

Auszählung aller gelben großen und kleinen

Vertiefungen (coliforme Bakterien).

Auszählung aller gelben + fluoreszierenden

großen und kleinen Vertiefungen unter einer

UV-Handlampe bei 366 nm (Escherichia coli).

Ablesung der wahrscheinlichsten Zahl aus der

MPN-Tabelle für coliforme Bakterien und E. coli;

Ergebnisangabe: MPN/100 mL.

MPN: Most Probable Number

(„wahrscheinlichste Keimzahl“)

Ergebnisse in Tabelle (Aushang) eintragen.

Anmerkung:

Keine Vertiefung positiv: < 1 MPN/100 mL

Alle Vertiefungen positiv: > 2419,2 MPN/100 mL

Große Vertiefungen

Kleine

Vertiefungen

Versuch Nr. 16: Nachweis von E. coli und coliformen

Bakterien mit dem Colilert-System

Nachweis von coliformen Bakterien: o-Nitrophenyl--D-galactopyranosid (ONPG; chromogenes Substrat) -D-Galactosidase o-Nitrophenol + -D-Galactose (Gelbfärbung) Nachweis von E. coli: 4-Methylumbelliferyl--D-glucuronid (MUG; fluorogenes Substrat) -D-Glucuronidase

4-Methylumbelliferon + -D-Glucuronat (hellblaue Fluoreszenz)

MUG

ONPG

MPN-Verfahren in einem Schritt

Konventionelles MPN-Verfahren:

Verschiedene Verdünnungsröhrchen

in Mehrfachansätzen notwendig.

MPN-Verfahren (Colilert-System):

ein Ansatz ausreichend.

Versuch Nr. 16: Nachweis von E. coli und coliformen

Bakterien mit dem Colilert-System

Gleichzeitiger Nachweis von Coliformen und E. coli in einem

Schritt.

Verwendung von Indikator-Nährstoffen (ONPG, MUG), die

von den Zielorganismen durch spezifische Enzyme hydroly-

siert und metabolisiert werden.

Ergebnisse in 18 Stunden; keine Bestätigungstests notwendig.

Geringer Arbeits- und Zeitaufwand.

In Deutschland: Colilert-18/Quanti-Tray als alternatives

Nachweisverfahren zum Referenzverfahren (Membranfiltration,

DIN EN ISO 9308-1) nach Trinkwasserverordnung vom

Umweltbundesamt zugelassen.

Das Verfahren ist genormt: DIN EN ISO 9308-2 (Juni 2014).