© W. Puppe Multiplex-RT-PCR-ELISA. Copyright & Rechtliche Hinweise Das Copyright für diese Präsentation und einzelner Folien dieser Präsentation bleibt

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Multiplex-RT-PCR-ELISA

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©W. Puppe 2003. Universitätsklinikum Schleswig Holstein, Campus Kiel, Klinik für Allgemeine Pädiatrie, Schwanenweg 20, 24105 KIEL

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UK-SH / Campus KielAllgemeine Pädiatrie

Pädiatrische InfektiologieChristian Albrechts Universität zu Kiel

Mikrobiologische Labor der KinderklinikMikrobiologische Labor der Kinderklinik

Nachweis von Erregern

bei

Akuten Infektionen des Respirationstraktes

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Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitRT-PCRRT-PCR

RT-PCR

- Nachweis viraler RNA durch reverse Transkription mit anschließender Polymerase Chain Reaction

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Zielsequenz (RNA)Primer

Reverse Transkriptase

d-ATPd-CTPd-GTPd-TTP

RT-PCR

- reverse Transkription der RNA in der Probe


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RT-PCR


Primer


ACGGTCTTGZielsequenz (RNA)


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Primer


ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTACGGTGTTGTAZielsequenz (RNA)

RT-PCR



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PrimerACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTACGGTGTTGTACACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGT

ERGEBNIS c-DNA

RT-PCR



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RT-PCR

- reverse Transkription der RNA in der Probe- anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction

1 Kopiec-DNA


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c-DNA denaturieren bei

94°C

RT-PCR



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RT-PCR


c-DNA denaturieren bei

94°C


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annealen von spezifischen Amplifikations-Primernan Einzel-Strang

50°C

Primer 1

Primer 23‘5‘

RT-PCR



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Transkription durch Taq-Polymerase 72°C

Taq-Polymerase

d-ATP;d-CTP; d-GTP; d-TTP

Primer 23‘5‘

CA

RT-PCR



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Taq-Polymerase


Primer 23‘5‘

CTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA


RT-PCR



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Taq-Polymerase


Primer 23‘5‘

TGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA


1. Zyklus1 Kopie

RT-PCR



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Denaturieren 94°C

2. Zyklus

3‘5‘TGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA

RT-PCR



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Denaturieren 94°C

2. Zyklus

3‘5‘

TGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA

RT-PCR



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annealing der Primer50°C

2. Zyklus

Primer 23‘5‘

d-ATP; d-CTP; d-GTP; d-TTP

RT-PCR


CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT

Primer 1


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Transkription mit Taq-Polymerase72°C

2ter Zyklus


Primer 23‘5‘

Primer 1

TGGTACACTGCATTCCA

ACGGTCTTGCAA

RT-PCR



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2ter Zyklus

Primer 23‘5‘

ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAG

RT-PCR



Primer 1

CATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA


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2ter Zyklus

Primer 23‘5‘

RT-PCR



Primer 1

CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA

ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA


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nach dem 2ten Zyklus

2 Kopien

GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA

3‘5‘CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT

RT-PCR




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3ter Zyklus

94°C




RT-PCR



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3ter Zyklus

50°C




RT-PCR


Primer 2

Primer 2

Primer 1

Primer 1


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3ter Zyklus

72°C




RT-PCR


Primer 2ACACTGCATTCCA

Primer 2ACACTGCATTCCA

Primer 1 ACGGTCTTGCAAT

Primer 1 ACGGTCTTGCAAT


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3ter Zyklus

72°C




RT-PCR


Primer 2ACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA

Primer 2ACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA

Primer 1 ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGAT

Primer 1 ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGAT


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4 Kopien nach 3tem Zyklus

72°C




RT-PCR


Primer 2CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA

Primer 2CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA

Primer 1 ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA

Primer 1 ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA


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nach dem 4ten Zyklus

8 Kopien

CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAATGAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA

GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTACTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT





RT-PCR





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nach dem 5ten Zyklus16 Kopien

RT-PCR



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in der Praxis erhält man nach21 bis 31 Zyklen

106 bis 109 Kopieneines Fragmentes welches auf der Zielsequenz

mit einem hoch spezifischen Primer Paar amplifiziert wurde

RT-PCR



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Multiplex-RT-PCR


Nachweis von Erregern mitNachweis von Erregern mitmultiplex-RT-PCRmultiplex-RT-PCR

Verwendung von 14 + 5 Primer Paarendie spezifisch für hoch konservierte Zielsequenzen

der 19 Erreger sind

in einem RT-PCR-Ansatz

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Ergebnis einer m-RT-PCR

m-RT-PCR

- reverse Transkription der RNA in der Probe- anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction- Analyse der amplifizierten Fragmente im Agarosegel

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

2% Agarose

501404331

242190147140

bp

3. entero virus (154)

4. M. pneumoniae (277)

5. Inf A (190)

6. Inf B (249)

1. standard

2. negative controle

7. adenovirus (134)

8. C. pneumoniae (463)

9. PIV1 (179)

10. PIV3 (205)

11. RSV (239)

12. B. pertussis

13. B. parapertussis


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m-RT-PCR

- reverse Transkription der RNA in der Probe- anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction- Analyse der amplifizierten Fragmente im Agarosegel- Spezifizierung der Amplifikate im PCR-ELISA


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Primer 2

Primer 1

Primer 1

Primer 2

GCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA

GCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA

ACGGUCTTGCAATGCGTGUACCGTAC-------ACGTAG

ACGGUCTTGCAATGCGTGUACCGTAC-------ACGTAG

d-UTP

d-UTP


RT-PCR-ELISA

- Einbau von DIG-11-dUTP ( ) in die Amplifikate bei der PCR

3‘5‘

5‘3‘




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d-UTP

d-UTP

d-UTP

d-UTP

d-UTP

RT-PCR-ELISA

- DIG-11-dUTP markierte Fragmente aus der PCR- alkalische Denaturierung


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GATAGTAACTCACUGTTTGTTAACATGTAAGTGCTTAAAGGTGTUGTTACACCTGCATTGACACTGAATTCTCTGGTGATTTCCAACAATCTGCUGTTCTTCTGCTGGAATUCTATAACTGTTT GGACGTAACTGTGACTTAAG

RT-PCR-ELISA

- DIG-11-dUTP markierte Fragmente aus der PCR- alkalische Denaturierung - Hybridisierung mit spezifischer Sonde (Biotin markiert )


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RT-PCR-ELISA

- DIG-11-dUTP markierte Fragmente aus der PCR- alkalische Denaturierung - Hybridisierung mit spezifischer Sonde (Biotin markiert) - Bindung an Strepavidin beschichtete Mikrotiterplatte


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RT-PCR-ELISA

- DIG-11-dUTP markierte Fragmente aus der PCR- alkalische Denaturierung - Hybridisierung mit spezifischer Sonde (Biotin markiert) - Bindung an Strepavidin beschichtete Mikrotiterplatte- Antikörper gegen DIG (Konjugat mit Enzym )


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RT-PCR-ELISA

- DIG-11-dUTP markierte Fragmente aus der PCR- alkalische Denaturierung - Hybridisierung mit spezifischer Sonde (Biotin markiert) - Bindung an Strepavidin beschichtete Mikrotiterplatte- Antikörper gegen DIG (Konjugat mit Enzym )- Zugabe von Substrat


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RT-PCR-ELISA

- DIG-11-dUTP markierte Fragmente aus der PCR- alkalische Denaturierung - Hybridisierung mit spezifischer Sonde (Biotin markiert) - Bindung an Strepavidin beschichtete Mikrotiterplatte- Antikörper gegen DIG (Konjugat mit Enzym )- Zugabe von Substrat Farbentwicklung


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RS

V S

on

de

Ev-Sonde

Mp-Sonde

InfA-Sonde

InfB-Sonde

Ad-Sonde

Cpn-Sonde

PIV3-Sonde

PIV1-Sonde

RS

V S

on

de

En

tero

vir

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M.

pn

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A

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PIV

1

PIV

3

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ne

g.

Prä

pa

rati

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Ko

ntr

oll

en

RT-PCR-ELISA

- Ergebnis eines m-RT-PCR -ELISA (Mikrotiterplatte)


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RS

V S

on

de

Ev-Sonde

Mp-Sonde

InfA-Sonde

InfB-Sonde

Ad-Sonde

Cpn-Sonde

PIV3-Sonde

PIV1-Sonde

RS

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vir

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M.

pn

eu

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nia

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Infl

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nza

A

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PIV

1

PIV

3

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Prä

pa

rati

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Ko

ntr

oll

en

2% Agarose

501404331

242190147140

bp

PIV1 (179)

PIV3 (205)

RSV(239)

Cpn (463)

Av(134)

InfB(249)

InfA(190)

Mpn(277)Ev

(154)

RT-PCR-ELISA

- Ergebnis eines m-RT-PCR -ELISA (Mikrotiterplatte & Gel)


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