Abt. Genetik Inst. f. Biologie Nanostrukturen aus biologischer
Sicht II Molekulare Maschinen
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2008 Wolfgang Nellen
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Inhalte: Isolierung von
Proteinen Reinigung komplexer molekularer Maschinen Knstliche
Konstruktion von Dimeren Antikrper zur Detektion von Modifikationen
an Einzelmoleklen Targeting von Proteinen an Nukleinsuren Detektion
und Funktion von RNP Maschinen Die Notwendigkeit
molekularbiologischer Grundlagen
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Molekularbiologische
Nanomaschinen werden (meist) nicht de novo konstruiert oder
synthetisiert. Um sie zu verstehen und letztlich manipulieren zu
knnen, ist zuerst ihr Aufbau und ihre Funktion zu analysieren.
Anders als in der Synthesechemie erfolgt dies reduktionistisch und
Top-Down. Die Charakterisierung molekularer Nanomaschinen erfordert
die Kenntnis molekularbiologischer Methoden und ein Verstndnis
dafr, was diese Methoden aussagen knnen und was nicht.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Beispiel 1: An eine
eukaryotische mRNA wird ein Linker ligiert, um die mRNA ber PCR zu
amplifizieren. TGGAGTTGCGGAATTCACTAGTTG.....CGAAAAA Warum geht das
nicht? Wie kann man das Problem lsen?
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Beispiel 2: Eine molekulare
Maschine produziert aus dem Substrat X in vivo das Produkt Y. Ein
Kandidaten-Gen A wird im Organismus ausgeschaltet und die Reaktion
von X nach Y fllt aus. Das Produkt des Gens A wird rekombinant
hergestellt und die Reaktion wird in vitro durchgefhrt. Die
Produktion von Y findet nicht statt. Genprodukt A ist notwendig,
aber nicht hinreichend fr die Reaktion. Was knnen die Grnde dafr
sein und wie kann man das herausfinden?
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie - hammerhead ribozyme cis
cleavage Das Hammerhead-Ribozym ist eine katalytische RNA Sequenz,
die ein subvirales (z.B. Viroid) Rolling-Circle-Transkript in
Fragmente von Einheitslnge zerschneidet. Beispiel 3:
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie A A A A A G G G U U U C C 3'5'
stem III stem I stem II Natural cis cleavage Die Struktur des
Ribozyms wurde aufgeklrt und der Mechanismus (weitgehend)
verstanden.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Kann diese einfache molekulare
Maschine so umgebaut werden, dass sie fr andere Zwecke eingesetzt
werden kann? A A A A A G G G U U U C C 3'5' stem III stem I stem II
Engineered trans cleavage 3' 5' C. Hammann et al. (1997) Nucleic
Acids Res. C. Hammann et al. (1999) Antisense Nucleic Acid Drug
Dev. Ein Teil des Ribozyms wird in vivo produziert. Der zweite Teil
wird von einer zellulren Ziel- RNA gestellt. Hybridisierung des
(partiellen) Ribozyms mit dem Ziel rekonstruiert die enzy- matisch
aktive Struktur. Die Ziel-RNA wird zerschnitten. A A A A A G G G U
U U C C 3'5' stem III stem I stem II Die minimale katalytisch
aktive Sequenz wurde bestimmt. Sie kann in vitro aus drei einzelnen
Moleklen zusammengesetzt werden.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie A A A A A G G G U U U C C 3'5'
stem III stem I stem II Natural cis cleavage A A A A A G G G U U U
C C 3'5' stem III stem I stem II Engineered trans cleavage 3' 5'
Die Reaktion ist allerdings nicht sehr effektiv. Was ist der
Unterschied zwischen den beiden Strukturen? Welche Vermutungen kann
man anstellen? Wie knnte die Reaktion verbessert werden?
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie R. Przybilski et al. (2005)
Plant Cell Ara2 AU C 3'5' III I II L1L2 AAGAAG UGAUGA C U G A U G A
A A C U C AA A GG C Scheinbar einfache Molekle wie RNA erlauben
eine Vielzahl unterschiedlicher dreidimensionaler Strukturen. Die
Aufklrung dieser Strukturen und ihre Vorhersage steckt noch in den
Kinderschuhen.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Klassische Reinigungsmethoden
der Biochemie zur Reinigung von Proteinen und Proteinkomplexen:
Zellfraktionierung Gelfiltration Ultrazentrifugation
Ionenaustauscher HPLC
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Reinigung ber 6x His-Tag (6 CAU
Codons an 5- oder 3-Ende) nitrilotriaceticacid (NTA)HistidinNi-NTA
Coordinierung von 2 His an ein Ni 2+
www.uni-giessen.de/biochem/BC_GS
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Das Protein Beta-Galaktosidase
hat ein Molekulargewicht von 116kD. Die funktionelle Maschine ist
ein Tetramer von 464kD. Die gesamte Maschine kann einfach und
funktionsfhig als rekombinantes Protein gereinigt werden
(Praktikumsversuch). LysatWaschschritte 1 2 - 3 Eluat (dieses Gel
zeigt die Aufreinigung von EriA, nicht von Beta-Gal!)
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Science Bridge 2007 Daniela Moll
& Sara Mller PDB IX4 Fehlfunktion oder Mutation fhrt zu
Laktoseintoleranz (besonders verbreitet im asiatischen Raum, in
Sdamerika und Sdafrika).
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Nachteile von His-Tags:
Endogene, Histidin-reiche Proteine binden auch an die Sule.
Unspezifische Bindung von Lektinen an die Agarose-Matrix. andere
ionische Wechselwirkungen knnen Proteinkomplexe stren Vorteile von
His-Tags: kurzer Tag, meist geringe Auswirkungen auf
Proteinfunktion Reinigung einfach und schnell Imidazol im
Eluat
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Ntzliche Beispiele fr
Proteinreinigung: Taq Polymerase Pfu Polymerase TEV Protease SP6
RNA Polymerase Vor ca. 25 Jahren reinigten Diplomanden, Doktoranden
oder TAs als Gemeinschaftsaufgabe Restriktionsenzyme, weil es sie
kommerziell nicht gab oder weil sie zu teuer waren. In den 90er
Jahren konnte man alles kaufen. Was es nicht bei Boehringer gab,
das gab es einfach nicht. Und das Geld war da, um Enzyme zu kaufen
und nicht die Zeit von Wissenschaftlern zu verschwenden. Heute
reinigen Diplomanden, Doktoranden oder TAs Taq, Pfu, TEV, SP6 und
andere, weil es sich bei dem knappen Etat lohnt, etwas Geld zu
sparen.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie TAP-Tag (tandem affinity
purification) The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A
General Procedure of Protein Complex Purification Oscar Puig,
Friederike Caspary, Guillaume Rigaut, Berthold Rutz, Emmanuelle
Bouveret, Elisabeth Bragado-Nilsson, Matthias Wilm, and Bertrand
Seraphin, METHODS 24, 218229 (2001) geeignet fr gute und schnelle
Reinigung komplexer Maschinen
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie IgG Protein A TEV CBP Protease
Calmod. PAGEMS
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Zwei IgG Bindedomnen von Protein
A (aus Staph. aureus) Calmodulin binding protein (CBP) bindet nur
in Gegenwart von Ca 2+ an Calmodulin (Elution mit Chelator EGTA).
Schnittstelle fr (virale) TEV Protease: 7 AA Consensus Sequenz
Glu-X-X-Tyr-X-Gln-Ser. Komplex wird von der Matrix
abgeschnitten
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Das Gen Rse1 wurde mit TAP
getagged und ist als CBP-Rse1 Fusion am strksten auf dem Gel
vertreten. (aus Puig et al., 2001) Proteine der isolierten Komplexe
werden durch SDS-PAGE aufgetrennt. Einzelne Banden werden dann
massenspektrometrisch identifiziert. (TEV Protease geht im zweiten
Reinigungsschritt in den Abfall! oft wird nur ein Reinigungsschritt
durchgefhrt!)
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Variationen: Strep-Tag Basiert
auf der Interaktion von Streptavidin mit Biotin (K d ~ 10 15 M -1 )
Mit kombinatorischen Methoden wurde ein Streptavidinderivat
Strep-tactin entwickelt, das hochaffin an ein kurzes Peptid (Strep
Tag - ersetzt Biotin) bindet: NH 2 WSHPQFEK COOH Das Zielprotein
wird mit dem Strep-Tag fusioniert und an eine Matrix mit
gekoppeltem Strep-tactin gebunden. Die Elution erfolgt mit einem
Biotinderivat (Desthiobiotin).
http://smid.blueprint.org/mod2pcsimilar.php?id=698 Biotin
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Vorsicht bei Isolierung von
getaggten Proteinen mit ihren putativen Bindungspartnern!
berexpression: Die Fusionsproteine werden meist berexprimiert, die
anderen Teile der molekularen Maschine aber nicht! a) viel hilft
nicht viel! substoichiometrische Mengen an Bindungspartnern! b)
groe Mengen knnen zu Bindung mit unspezifischen Partnern fhren.
Zellulre Reaktionen: a) Tags knnen in der Zelle Stressreaktionen
auslsen (Stressproteine, stressbedingte, andere
Interaktionspartner). b) Getaggte Proteine knnen andere (geringere)
Affinitten als das endogene Protein haben und konkurrieren manchmal
schlechter um Interaktionspartner.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Lsungsmglichkeiten: Single Copy
Insertionen in das Genom Knock out des Endogens Einfgung des Tags
in das Endogen (homologe Rekombination) Alle Lsungen sind
suboptimal, besonders bei molekularen Maschinen, die in geringer
Anzahl in der Zelle vorhanden sind. 10 9 bis 10 10 Zellen sind
meist erforderlich, d.h. ca. 10 bis 20 l Zellkultur!
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Eine weitere (suboptimale)
Alternative, Interaktionspartner zu identifizieren: Bindung des
rekombinanten Bait-Proteins an eine Matrix (z.B. Ni-NTA).
Inkubation mit einem Zellextrakt Waschen Elution des Bait-Proteins
mit assoziierten Partnern Problem: in der Zelle liegt das endogene
Bait-Protein im Komplex mit den Partnern vor. Das Experiment
funktioniert nur, wenn der Komplex einen ausreichenden turn-over
hat.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Artifizielle Zusammensetzung von
verschiedenen Komponenten (artifizielle Dimere).
Yeast-Two-Hybrid-System Yeast-One-Hybrid-System FK506 System
Lokalisation durch RNA bindende Proteine
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Yeast two hybrid system
Deutsches Ressourcenzentrum fr Genomforschung GmbH Gal4 DNA binding
domain: Bait-Vector (TRP1) Gal4 Activation domain: Prey-Vector
(Leu2) mit cDNA Bibliothek. basiert auf dem modularen Aufbau von
Transkriptionsfaktoren
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Xiaoxioa Zhang, 2006
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie A -Gal Gen mit Gal4 aktiviertem
Promotor (Gal1) liegt im Genom der Hefe. Ein Gal4 aktiviertes His3
ist ebenfalls im Hefegenom integriert. TRP1 liegt auf Bait Vector
Leu2 liegt auf Prey Vector c-myc Epitop zum Nachweis der
Bait-Expression. T7 prom. u.a. als priming site um Gal4 DBD Bait
ORF zu besttigen.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Selektion, Screening auf
Interaktion zwischen Bait und Prey: Selektion auf Leu -, Trp -
Medium (Test auf Anwesenheit von beiden Vektoren) Screening auf
X-gal Medium fr Interaktion zwischen Bait und Prey Selektion auf
His - mit 3-Amino-1,2,4-trizol (3-AT) unterscheidet starke und
schwache Interaktionen. Restriktionsverdau positiver Prey Vektoren
(eventuelle Duplikate ausschlieen). Sequenzierung der Prey Inserts,
Vermutungen zu wahrscheinlichen Partnern. Rckfhrung der Prey
Vektoren in E. coli (andere Resistenz als Bait Vektor!) Umkehrung
von Prey und Bait Vektoren Screening auf Interaktion berprfung, ob
Prey Vektor die Induktion alleine vermitteln kann (Y1H!)
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Das Y2H System wird auch
eingesetzt, um vermutete Interaktionen direkt zu prfen. Das heit,
in Bait- und Prey-Vektor werden bekannte Gene eingesetzt und es
wird berprft, ob die Kombination zur Induktion von -Gal fhrt.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Verschiedene Mglichkeiten,
Interaktion zu besttigen: FRET (fluorescence resonance energy
transfer), Biacore, funktionelle Assays in vitro, Co-Lokalisation
mit GFP / RFP getaggten Versionen in vivo (FM).
Co-Immunprzipitation Beachte: Die beschriebene Methode gilt fr
Proteine, die im Zellkern interagieren knnen. Membranproteine,
extrazellulre Proteine, Proteine in Zellorganellen sind nicht mit
dieser Methode zu erfassen!
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Y2H System fr Membranproteine PM
AD DBD baitprey Ub-NUb-C
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Y2H System fr Membranproteine PM
AD DBD bait Ub-N prey Ub-C
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Y2H System fr Membranproteine PM
AD DBD bait Ub-N prey Ub-C AD DBD zum Kern
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Beispiel fr extrazellulre
Proteine GHR (Growth hormone receptor) mit Gal4 DBD exprimiert.
(GHR ist ein intrazellulrer Rezeptor, kein Membranrezeptor! GH
(growth hormone) mit Gal4 AD exprimiert. GH wird sekretiert, kann
in andere Zellen eindringen und an den cytoplasmatischen Rezeptor
GHR binden. Der Rezeptor-Ligandenkomplex wird in den Kern
transportiert. Die durch GH GHR Komplex verbundenen Gal4 Domnen
aktivieren -gal.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Yeast one hybrid Nutzt allein
die Aktivierungsdomne fr verschiedene Analysen. Wenn unbekanntes
Protein an DNA-Motiv bindet, wird Reporter aktiviert.
Identifizierung von DNA-Bindedomnen. AD ? Reporterbinding site
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie AD DBD DNA library Die
Bindestelle auf der DNA wird durch eine Bibliothek verschiedener
Varianten ersetzt. Bestimmung der Consensus-Sequenz, die eine
Interaktion erlaubt.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie AD DBD binding site Mutagenese
der DBD Bestimmung der AA Sequenz und Proteinstruktur, die
Interaktion erlaubt.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie In vivo Targeting von Proteinen
Proteine knnen mit verschiedenen Tricks innerhalb der Zelle an
verschiedene Orte dirigiert werden. Dort kann so die lokale
Konzentration erhht werden Proteine knnen bevorzugt in bestimmte
Komplexe eingebaut werden. Proteine knnen durch Interaktionsdomne
in einen Komplex gezwungen werden.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie FK506 and FKBP Durch ein
externes Signal knnen in der lebenden Zelle zwei Proteine mit
einander verbunden werden. Damit knnen Komplexe geschaffen werden,
die auf natrliche Weise nicht vorkommen. Die lokale Konzentration
eines Proteins kann an einem Ort der Zelle erhht werden, wenn einer
der Partner in der Zelle spezifisch lokalisiert ist.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Die Zugabe eines Liganden fhrt
zur Interaktion der beiden Proteine. Wenn eines an einem Ort der
Zelle konzentriert ist, wird es die Konzentration des Partners an
diesem Ort erhhen.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie FK506 and FKBP Tacrolimus
(Prograf) Macrolide Lakton aus Streptomyceten. Verwendung als
Immunsuppressor wie Cyclosporin. GD Van Duyne, et al., Science 252,
839 (1991) 2 FKBPs binden cooperativ an ein FK506 Molekl. FK506
kann wieder aus der Zelle ausge- waschen werden und die Protein-
assoziation wird rckgngig gemacht.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie FK506 and FKBP Durch rational
design und Mutagenese wurde eine FKBP konstruiert, die ohne FK506
dimerisiert. Die Zugabe von FK506 fhrt bei diesem Derivat zu einer
Dissoziation des Dimers.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Targeting von Proteinen an
spezifische RNA oder DNA Sequenzen (kleiner Exkurs in Nukleinsure
Protein Interaktionen). Manche Proteine erkennen spezifisch DNA
Sequenzen oder Strukturen. (z.B. Restriktionsenzyme,
Modifizierungsenzyme). M EcoRV Anspach, Nellen, Jeltsch Die Bindung
verursacht in manchen Fllen Strukturnderungen in der
Nukleinsure-Komponente des Komplexes. Hier jedoch nur, wenn das
Protein an der richtigen Bindungsstelle (Mitte) sitzt.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie J. R. Horton, K. Liebert, M.
Bekes, A. Jeltsch, X. Cheng Journal of Molecular Biology, 358,
559-570 Structure and substrate recognition of the Escherichia coli
DNA adenine methyltransferase.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Moleklmitte! Bestimmung der
Bindungsstelle mit SFM. Messung des Knickwinkels der DNA an korrekt
gebundenem Protein. Knickwinkel an unspezifischen Binde-
stellen.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Manche Proteine erkennen
spezifische RNA Strukturen und Sequenzen. ADAR (adenosine deaminase
that acts on RNA) erkennt eine spezifische Hairpinstruktur. (Bei
dieser Moleklkonstruktion ist die Orientierung durch die Gabelung
erkennbar)
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Auswertung der SFM Daten zeigt
wo und mit welcher Genauigkeit (im Vergleich zu unspezifischer
Bindung) das Protein seine Erkennungssequenz im Molekl findet. Als
Kontrolle werden Molekle ohne die Erkennungssequenz/Struktur oder
mit mutierten Sequenzen verwendet.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Biochemisch wird der
Interaktionsnachweis auch durch Gelshif Assays (EMSA =
electrophoretic mobility shift assay) gefhrt. Biacore Experimente
wurden in der Biochemie erklrt.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Einschub: was versteht wer unter
Nanostrukturwissenschaften? (zugegeben: mit gewisser
Voreingenommenheit!) Synthesechemie physikalische Charakterisierung
chemische Charakterisierung Anwendung physikalische
Methodenentwicklung proof of principle experiment (Fragestellung
spielt nicht unbedingt eine Rolle ) Theorie- entwicklung
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Beobachtung eines biologischen
Mechanismus Isolierung der Komponenten (Methoden dazu!)
Identifizierung/Annahme eines molekularen Mechanismus, einer
molekularen Maschine reduktionistische Rekonstruktion der Maschine
in vitro strukturelle Analyse (chemische/physikalische Methoden)
funktionelle Analyse der Komponenten in vivo (zurck zu den Genen im
Organismus) molekulare Analyse der Funktion in vivo (was kann die
Maschine?) funktionelle Analyse in vitro (Assay- Entwicklung,
Synthese von Komponenten, Synthese von Substraten) funktionelle
Besttigung, (Detailanalyse mit modifizierter Maschine und (chem.)
modifizierten Substraten in vitro) rationales Design modifizierter
Maschinen (fr technische, biomedizinische Anwendung) systembiol.
Komponenten- analyse, (verwandte Mechanismen
Struktur-Funktion-Verhltnis, Bioinformatik) Dynamik der Maschine in
vitro (Assembly/Disassembly, transiente Komponenten) Dynamik der
Maschine im Systemnetzwerk (erfordert Analyse aller interagierenden
Maschinen wie oben)
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Die Analyse biologischer
Nanomaschinen erfordert die Entwicklung bzw. Adaptation chemischer,
physikalischer, mathematischer und bioinformatischer Werkzeuge, die
genau auf die jeweilige Problem- stellung ausgerichtet sind. Das
Verstndnis der biologischen Fragestellung sowie das Verstndnis
biologischer Systeme ist erforderlich, um zu wissen, welche
chemischen/ physikalischen Methoden man sinnvoll einsetzen
kann/soll. (Beispiel: Lngenmessung von DNA Fragmenten nicht mit AFM
sondern mit Gelelektrophorese) Ein einfaches proof-of-principle
Experiment kann eine neue Methode interessant machen, lst aber
nicht das Problem der spezifischen An- passung an die
Fragestellung. Beispiel: die Mglichkeit, chemisch methylierte DNA
mit SFM zu detektieren, lst nicht das Problem, in vivo methylierte
DNA zu detektieren.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Weitere Beispiele fr Proteine,
die spezifische RNA Strukturen oder Sequenzen erkennen: CBP PABP
TBP prokaryotische RNA Polymerase virale Proteine: Tat bindet an
HIV TAR RNA (Hairpin) N-Protein (Page Lambda) bindet an B-Box auf
RNA (Antiterminator)
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Konstrukt Nr. 1: Reportergen
Luziferase (fr quantitative Bestimmung der Genexpression/
Translation), 5 B-Box Sequenzen im 3-UTR. Gezeigt ist die
transkribierte mRNA. Luciferase AAAAA N-ProteinAgo A Konstrukt Nr.
2 Fusion von N-Protein und Testprotein (hier AgoA) mit flexiblem
Linker. Expression des Fusionsproteins in Zelle. Assoziierung eines
Proteins mit einer spezifischen mRNA
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Luciferase AAAAA AgoA wird
normalerweise durch kleine RNAs (miRNAs) spezifisch an den 3 UTR
einer mRNA rekrutiert und inhibiert die Translation. Das Experiment
zeigt, dass die miRNA keine weitere Funktion als die eines Guides
hat. AgoA kann Translation auch inhibieren, wenn es durch Protein
RNA Interaktion an den 3 UTR gebracht wird. R. S. PILLAI, C. G.
ARTUS, and W. FILIPOWICZ, (2004): RNA, 10:15181525. Neuere
Ergebnisse zeigen jedoch, dass der knstliche Komplex in einer Ein-
bahnstrae landet und und ohne die miRNA nicht reaktiviert werden
kann.
Folie 57
Abt. Genetik Inst. f. Biologie Proteinen-Protein oder
Proteinen-Nukleinsure-Interaktionen werden von (lokalen)
Konzentrationen und Affinitten bestimmt. Interaktionen ndern sich
mit lokalen und temporren Konzentrationen Liganden knnen
miteinander in Konkurrenz treten konkurrierende Substrate und
Liganden knnen ihre Affinitt durch Modifikationen ndern Der in
vitro gemessene K D Wert sagt nicht viel ber die Situation in einer
Zelle aus!
Folie 58
Abt. Genetik Inst. f. Biologie g Protein % Komplex Vergleich
der Komplexbildung zwischen zwei verschiedenen dsRBDs mit einem
dsRNA Substrat (EMSA, Endpunktbestimmung nach festgelegter
Inkubationszeit)
Folie 59
Abt. Genetik Inst. f. Biologie HelF Dicer Dicer-dsRBD hat
niedrigeren K ass als HelF aber gleichen K diss K ass 2,72 e 5 1/Ms
K diss 4,4 e -3 1/s K D 19,5 nM K ass 4,7 e 4 1/Ms K diss 7,7 e -3
1/s K D 171 nM Biacore, Kinetik in Echtzeit Popova & Biaffin,
2005
Folie 60
Abt. Genetik Inst. f. Biologie HelF-dsRBD - Mg 2+ + Mg 2+
Dicer-dsRBD - Mg 2+ + Mg 2+ k ass (1,3 0,5)e 4 l/Ms(4,7 1,0)e 4
1/Ms(2,0 0,6)e 5 1/Ms(2,7 1,2)e 5 1/Ms k diss (8,0 2,2)e -3 1/s(7,7
2,6)e -3 1/s(2,2 0,8)e -3 1/s(4,4 2,2)e -3 1/s KDKD (70,6 27,1)
nM(171 39) nM(12,1 3,9) nM(19,5 9,3) nM HelF-dsRBD - Mg 2+ + Mg 2+
Dicer-dsRBD - Mg 2+ + Mg 2+ k ass 2,7 e 4 1/Ms 8,2 e 4 1/Ms6,6 e 4
1/Ms k diss 3,4 e -4 1/s5,8 e -4 1/s8,9 e -4 1/s1,0n e -3 1/s KDKD
12,7 nM21,1 nM10,9 nM15,3 nM Pre-let7 dsRNA
Folie 61
Abt. Genetik Inst. f. Biologie HelF dsRBD interagiert mit
pre-miRNA (Bulges) bei hherem K D als mit perfekter dsRNA. Die
dsRBD von Dicer unterscheidet nicht zwischen den beiden Substraten.
Der Unterschied beruht hauptschlich auf einem Unterschied in K
diss. Die Daten werden durch quantitative EMSAs und Scanning Force
Microscopie (SFM) untersttzt.
Folie 62
Abt. Genetik Inst. f. Biologie ChIP: Chromatin Immune
Precipitation Identifizierung von Genen, die mit bestimmten Formen
von Chromatin assoziiert sind. Epigenetische Regulation erfolgt ber
die Remodellierung von Chromatin. Dabei werden z.B. Histonvarianten
ausgetauscht, andere spezifische Proteine mit dem Chromatin
assoziiert und wieder andere Proteine (z. B. Histone)
posttranslational modifiziert. Die klassische Aufteilung in
Euchromatin (aktiv) und Heterochromatin (inaktiv) ist nicht mehr
ausreichend, es gibt weitere Formen, die durch spezifische Komplexe
gekennzeichnet sind.
Folie 63
Abt. Genetik Inst. f. Biologie H3: blau H2A: gelb H2B: rot H4:
grn 147 bp DNA 1,65 Windungen Core-Nucleosom Zur Erinnerung aus der
Grundvorlesung
Folie 64
Abt. Genetik Inst. f. Biologie
Folie 65
Obwohl Histonmodifikationen evolutionr konserviert sind, ist fr
genauere Chromatinuntersuchungen eine Kartierung der Modifikationen
sinnvoll. Kartierung von H3A Modifikationen in vegetativen
Dictyosteliumzellen Diese Karte sagt noch nichts ber eventuelle
Modifikationen (und entsprechende nderungen der molekularen
Maschinen) in der Entwicklung aus!
Folie 66
Abt. Genetik Inst. f. Biologie Es stehen Antikrper zur
Verfgung, die einzelne Histonmodifizierungen erkennen, z.B.
H3K9me2, H3K9me3. Weiterhin gibt es Antikrper gegen andere
Chromatinproteine und gegen histonmodifizierende Proteine. 1.
Zellen mit Paraformaldehyd behandeln, um DNA und Protein zu
crosslinken. 2. Zellen mit Ultraschall behandeln, um Chromatin in
Fragmente von ca. 400bp zu schreddern. 3. Immunprzipitation mit
Antikrper gegen Chromatinprotein oder Histonmodifikation. 4.
Crosslink wieder aufheben und DNA aus der Chromatinprparation
isolieren. 5. PCR auf verschiedene Gene, die man in der
entsprechenden Chromatin- fraktion vermutet.
Folie 67
Abt. Genetik Inst. f. Biologie Chromatin wurde mit einem
Antikrper gegen H3K9me2 przipitiert (meist Heterochromatin). Es
wurden drei verschiedene Stmme verwendet, zwei enthielten getaggtes
Hcp Protein. Fr jedem Stamm wurde die PCR Reaktion drei mal
durchgefhrt. Die Genloci DIRS-1 und skipper sind in der
przipitierten Heterochromatinfraktion enthalten. Das (aktive)
Actin-Gen ist in der Fraktion nicht nachweisbar. Kaller et al.,
2006
Folie 68
Abt. Genetik Inst. f. Biologie 0510 0 1.0 0.5 tri di mono ACA 5
036912 ACA Northern rasG Northern 036912h 051015h 0 1.0 1.5 0.5
rasG 5 036912h V18 Northern 051015h 0 1.0 2.0 V18 5 Die
Trimethylierung von H3K4 korreliert mit aktiven Genen whrend Mono-
und Di- methylierung inaktives Chromatin reprsentiert. ChIP
Experimente wurden zu verschiedenen Zeiten der
Dictyostelium-Entwicklung mit verschiedenen Antikrpern durchgefhrt
und mit PCR auf ACA, rasG und V18 Gene geprobt. Northern-Blots
reprsentieren das Expressionsmuster der Gene.
Folie 69
Abt. Genetik Inst. f. Biologie Wie findet man unbekannte
genetische Loci, die mit einer bestimmten Chromatinkonstellation
verbunden sind? Zur Erinnerung:
Folie 70
Abt. Genetik Inst. f. Biologie a) Microarrays Krankes
GewebeGesundes Gewebe RNA isolieren rot markierengrn markieren mehr
in krankem Gewebe gleich in beiden mehr in gesundem Gewebe
Folie 71
Abt. Genetik Inst. f. Biologie ChIP on Chip
http://www.chem.agilent.com
Folie 72
Abt. Genetik Inst. f. Biologie Durch ChIP on Chip werden Gene
identifiziert, die in einem bestimmten Stadium mit bestimmten
Chromatinproteinen besetzt sind. Ebenso knnen Gene identifiziert
werden, die von bestimmten Transkriptionsfaktoren reguliert
werden.
Folie 73
Abt. Genetik Inst. f. Biologie Isolierung von genspezifischem
Chromatin Griesenbeck et. al., 2004, Meth. Enzym. 375, 170-178
Konstrukt Nr. 1 Zielgen wird flankiert von RS-Rekombinationsstellen
und Bindestellen fr das bakterielle LexA Protein. Das Konstrukt
wird in das Genom der Zelle integriert. GenLexA RS Chrom. je nach
Aktivittszustand des Gens ist der Bereich mit verschiedenen Formen
von Chromatin belegt. Wie findet man die Chromatinzusammensetzung
eines spezifischen Gens unter verschiedenen Bedingungen?
Folie 74
Abt. Genetik Inst. f. Biologie Konstrukte Nr. 2 und 3 Plasmid
mit Gen fr R-Rekombinase und LexA unter der Kontrolle eines
induzierbaren Promotors. Induktion mit Galaktose fhrt zur
Expression von R-Rekombinase und LexA mit Tap-Tag.
R-RekombinaseGal1-P und LexA TAP-Tag Gal1-P
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Chromosom Zielgen Recombinase
ber die RS-Sites rekombinieren die Flanken des Zielgens. Die
Rekombinase schneidet an der Rekombinationsstelle.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Es entsteht ein Ring des
Zielgens mit einer RS-Site. Auf dem Chromosom verbleibt die zweite
RS-site. Zielgen Chromosom
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie An die LexA Sites bindet das
LexA Protein mit TAP-Tag. Der ganze Chromatinkomplex kann aus dem
Kernlysat ber Affinittschromatografie an IgG und Calmodulin
aufgereinigt werden. Als positive Kontrolle wird eine PCR mit
Primern zum Zielgen, als negative Kontrolle eine PCR mit Primern zu
einem anderen, Nicht-Zielgen durchgefhrt. Das in-vivo assemblierte
Chromatin kann ber MS auf seine Zusammensetzung und z.B. auf
Modifikationen der Histone untersucht werden.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Problem an der Sache: Ein Gen
(Dictyostelium) hat ca. 1500 bp und damit etwa 10 Nukleosomen Aus 2
x 10 9 Zellen (1 Liter Kultur) knnen demnach theoretisch 2 x10 10
genspezifische Nukleosomen isoliert werden. Das entspricht 2 x 10
-13 Mol eines Proteins, das an ein Nukleosom assoziiert ist. Das
entspricht 200 fM Dictyosteliumzellen wachsen auf eine Dichte von 2
x 10 6 Zellen /ml Bei einer Ausbeute von 10% muss man mit
mindestens 10l Kultur anfangen, um ausreichend Material fr MS zu
bekommen. Bei Sugerzellen wird das richtig teuer!
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Neue Funktion fr eine alte
Maschine oder doppelte Funktion? (wie kommt man zu
Funktionsvorhersagen? Wie werden sie untersucht? Wie entstehen
wissenschaftliche Fragestellungen?) Sequenzhnlichkeit, besonders im
katalytischen Zentrum, legt Funktion als DNA Methyltransferase
nahe.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Lokalisation im Zellkern
(Dictyostelium) steht mit einer Funktion an der DNA im Einklang....
aber in Drosophila und in Sugern wird hauptschlich cytoplasmatische
Lokalisation gefunden.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Arbeitet das Enzym als
Methyltransferase? Findet man DNA Methylierung? Ist diese von der
Gegenwart des Enzyms abhngig? Es gibt DNA Methylierung an wenigen
Stellen (diese im Genom zu finden ist ein Problem fr sich!)
Methylierung ist in einer KO-Mutante reduziert (oder nicht
vorhanden) und damit abhngig von der Gegenwart des Enzyms.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie In vitro findet man mit dem
rekombinanten Protein weder DNA Bindung (EMSA) noch DNA
Methylierung.... das kann an fehlenden Co-Faktoren oder sub-
optimalen Inkubationsbedingungen liegen, schliet eine Aktivitt aber
nicht aus. In Drosophila findet man zwei Proteine, Nup50 (Porin,
cytoplasmatisch) und p68 (Helikase, nukler) als In-
teraktionspartner dass diese fr enzymatische Aktivitt erforderlich
sind, ist eher unwahrscheinlich aber nicht unmglich!
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Es zeigte sich dann berraschend,
dass Dnmt2 aus Maus tRNA Asp methyliert. (Goll, 2006).
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Dnmt2 ? DNA MethRNA Meth Bunicki
et al. Nucleic acids res. Vol. 32, 2453, adapted by T. Jurkowski,
A. Jeltsch, Jacobs University, Bremen
Folie 85
Abt. Genetik Inst. f. Biologie Welchen Mechanismus benutzt
Dnmt2? C292 SAM C287 E119 R160R162 C140 C24 T. Jurkowski, A.
Jeltsch, Jacobs University, Bremen Austausch aller Cys um zu sehen,
ob es ein zweites gibt, das den RNA Mechanismus erlaubt.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie R X R C F T ? DNA Mechanismus
oder Hybrid DNA-RNA Mechanismus T. Jurkowski, A. Jeltsch, Jacobs
University, Bremen
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Kann das Enzym beide Substrate
methylieren? Hat es unterschiedliche Interaktionspartner fr die
verschiedenen Reaktionen? Gibt es weitere RNAs, die methyliert
werden? Was ist die Funktion der DNA und/oder der RNA Methylierung?
1.Dnmt2 in Fisch fr Leber, Hirn und Retina-Entwicklung notwendig.
2.Dnmt2 in Drosophila fr lngeres Leben und gutes Kletterverhalten.
3.Dnmt2 in Dictyostelium fr Immobilitt eines Retrotransposons. Was
haben diese Phnotypen gemeinsam? weitere biochemische,
biophysikalische, genetische und zellbiologische Experimente.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Ein paar SFM Anwendungen...
Kraftmessungen der einfachsten Art: Nukleinsure bindet unspezifisch
an Mica (Glimmer = Schichtsilikat) Nukleinsure bindet ebenfalls un-
spezifisch an Siliziumcantilever. Bei Entfernung vom Substrat wird
die Nukleinsure gespannt und es treten messbare Krfte auf.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie -2000200400600800100012001400
1600 -400 -300 -200 -100 0 100 200 300 400 melting-phase F P Bonin
et al., Nucleic Acids Res., 30, e81, (2002) L 0 : kraftfreies
Anheben der Nukleinsure F P : Streckung bei B-S Transition L P :
kraftfrei Extension der S-Form Kraft-Abstandskurve
Folie 90
Abt. Genetik Inst. f. Biologie Plateau-Force F P ist abhngig
vom GC Gehalt der Nukleinsure F P ist bei RNA grer als bei DNA
Bonin et al., Nucleic Acids Res., 30, e81, (2002)
Folie 91
Abt. Genetik Inst. f. Biologie S-Value: L P / L 0 Dehnbarkeit
der S-Form (relativ zur ursprnglichen Lnge des Molekls in B- bzw. A
Konformation. Bonin et al., Nucleic Acids Res., 30, e81,
(2002)
Folie 92
Abt. Genetik Inst. f. Biologie Fortgeschrittene
Kraftspektroskopie Fragestellung: der Transkriptionsfaktor expG
bindet an Sequenzen in verschiedenen Promotoren. Unterscheiden sich
diese Bindungen in ihrer Strke?
Folie 93
Abt. Genetik Inst. f. Biologie Fortgeschrittene
Kraftspektroskopie Funktionalisierung der Spitze (hier DNA an PEG),
Protein auf der Mica-Oberflche. Bartels et al, 2003 Unbinding force
(rupture) wird gemessen. Die verschiedenen Promotoren zeigen dabei
keine signifikanten Unterschiede.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Die Bindungsstrke kann ber die
Loading rate genauer bestimmt werden. Die Loading rate ist
definiert als: Federkonstante (nN/nm) x retraction velocity (nm/s)
= nN/s Bei hoher Loading rate spielt die thermodynamische off-rate
der Protein DNA Interaktion eine grere Rolle und die Bindung an die
ver- schiedenen Promotoren unter- scheidet sich signifikant.
Kraftspektroskopie liefert zu- stzliche Informationen, die EMSA
Experimente ergnzen. Bartels et al, 2003
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Ein paar Ideen... Knnen Krfte
der enzymatischen Aktivitt gemessen werden? Hybridisierung von RNAs
an Oberflche und Cantilever Spannen der RNA Zugabe einer Helikase
und Aktivierung mit ATP Entwindung und Relaxation des
Cantilevers
Folie 96
Abt. Genetik Inst. f. Biologie Bindung der dsRNA an Oberflche
und Cantilever Spannen der RNA Zugabe von Dicer und Aktivierung mit
Mg 2+ Schnitt und Relaxation des Cantilevers Knnen Krfte der
enzymatischen Aktivitt gemessen werden?
Folie 97
Abt. Genetik Inst. f. Biologie Detektion von DNA Modifikationen
an Einzelmoleklen: Der Traum von der Einzelmolekl-Sequenzierung. U.
Bockelmann, et al. Phy. Rev. Lett. 79, 4489 (1997). G-C: 20pN A-T:
9pN Resolution limit: 10 basepairs
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Antikrper gegen 5-Methylcytosin
als Modell 1 2 Cantilever Crosslinker Antibody ssDNA Methyl-
cytidine Aldehyde glass Force (pN) Distance (nm) 12 Der Abstand
zwischen zwei Bindungsereignissen an einem Antikrper kann durch
Kraft- spektroskopie gemessen werden. R. Zhu, P. Hinterdorfer,
pers. Mitteil.
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Abt. Genetik Inst. f. Biologie R. Zhu, P. Hinterdorfer, pers.
Mitteil. 5 methylcytosines separated by 4 nucleotides DNA -
methylcytosine
Folie 100
Abt. Genetik Inst. f. Biologie In einem gegebenen
einzelstrngigen DNA Fragment kann der Abstand zwischen
Methylcytosinen mit einer Auflsung von einem Nucleotid ge- messen
werden. Spezifische Antikrper gegen normale Nucleotide knnen
hergestellt werden. branched crosslinker Antibody fragment against
specific nucleoside ssDNA Nucleoside Cantilever 1 Force (pN)
Distance (nm) 12 2 Die Auflsung und Detektions- weite kann durch
monovalente Antikrperfragmente und durch verzweigte Crosslinker
ver- bessert werden. R. Zhu, P. Hinterdorfer, pers. Mitteil.
Folie 101
Abt. Genetik Inst. f. Biologie Arrays von 1.000 x 200
Cantilevers knnten auf einem 2 x 2cm Chip 200.000 Proben
gleichzeitig messen.
Folie 102
Abt. Genetik Inst. f. Biologie Ob diese Methode eine
Alternative zu anderen Sequenzierverfahren bieten wird, ist eher
fraglich. Fr die SNP Analyse (single nucleotide polymorphism) oder
die Detektion modifizierter Nucleotide knnte sie jedoch einsetzbar
werden. Aber: DNA Modifizierung geht bei Clonierung oder bei PCR
Amplifikation verloren. Die gezeigten Ergebnisse entstanden an
synthetischen Moleklen mit synthetisch plazierte
Methylcytosinen!
Folie 103
Abt. Genetik Inst. f. Biologie Das waren Nanostrukturen aus
(molekular)biologischer Sicht.