J. SCI~OI~Mi3I~LEI~, R. WI:ESK:E und It. WINTER: Beitr~ge zur Bioehemie der K~sereifung. IX. 35

anderen mit Ninhydrin anf~rbbaren Substanzen zugegen sind. Sie kann Ms quanti- tative Methode bei Wasser-Margarine und bei Margarine mit bekanntem MilchgehMt angewandt werden. Ffir die Unterscheidung yon Mflchm~rgarine und Wasser- margarine wurde ein einfacher quMitativer ~achweistest ausgearbeitet. Bei Mar- garine mit unbekanntem Milchzusatz lassen sich mittels der Methode zwar keine gesicherten quantitativen Aussagen machen, doch sind auch hier die Untersuchungs- ergebnisse wesentlich zuverli~ssiger Ms bei der Eigelbbestimmung nach FE~DLn~ und VO~L~SE.

Beitr~ige zur Biochemie der K~isereifung. IX. Mittei~ung.

Die Peptidasen des Sauermilchkiises und deren Aktivitiit im Verlauf der Reihmg.

Yon

J. SCH0UMCLLER~ R. W~ESKE und It. WINTER*° Mitteilung aus dem Institut liar Lebensmittelchemie und Lebensmittelteehnologie der Teehnischen

Universitiit Berlin-Uharlottenburg.

Mit 6 Textabbildungen.

(Eingegangen am 6. Mai 1954.)

I n e iner vorhergehenden Arbei t 1 ha t t en wir untersucht , welche Fermente veto Typ der Prote inasen an der Reifung yon Sauermilchk~se beteiligt sind. Fe rmente also, die den Pro te inante i l des K~ses zu hochmolekularen Eiweii3bruchstficken, wie Albumosen, Pep tonen u . a . abbauen und damit den , ,Umfang" der Reifung be - dingen. Die im folgenden geschflderte n Unte r suchungen sollen sich mi t der Gruppe yon Proteasen besch~ftigen, welche die Hydrolyse und Synthese yon in der ~achba r - schaft dissoziierender Gruppen befindl ichen Pep t idb indungen beschleunigen. Sie spal ten EiweiBbruchstficke der obengenalmten Ar t bis zu den Aminos~uren und sind dami t - - soweit dies den Prote inante i l des K~ses betrffft - - zum Tell fiir die ,,Tiefe" der l~eifung verantwort l ich.

Sie m~chen dartiber hinaus dutch Freisetznng der Aminos~uren den Weg frei fiir reduktive, oxyda~ive und hydrolytische Des~minierung oder fiir Decarboxylierung fermentativer Art, wobei aus den Aminosi~uren die Vielzahl der Abbauprodukte entstehen kann, wie wir sie Ms Miphatische und aromatische Amine, S~uren oder Oxys~uren, Ammoniak u. ~. m. in reffem K~se linden. An der Bfldung niedermolekularer EiweiBbruchstiicke sind indessen nicht nut diese, unter dem Sammelbegrfff der Peptidasen oder Exopeptidasen zusammengefaI~ten Proteasen betefligt. SeilG den grundlegenden Arbeiten v0n BERG~A~N 2 wissen wir, dab fiir den Angriff aller Proteasen - - im Gegensatz zu friiheren Annahmen - - die MolektilgrSBe des Substrates yon untergeordneter Bedeutung is~. Der Wirkungsbereich yon Proteinasen erstreckt sich n~m- lich nicht nur auf groi]e Proteinmolekfile, sondern ~uch auf 1)eptide. BEI~GMA~t~ konnte Zeigen, dab die Proteinasen Pepsin, Trypsin und Chymotrypsin auch einfache synthetische Substrate hydrolysieren kSnnen, und damit aueh an der ,,Tiefe" der Reffungsmechanismen beteiligt sind.

Peptidasen, welche die Spaltung der Polypeptide zu freien Aminos~iuren und umgekehrt die Synthese yon Peptiden ~us Aminos~iuren k~talysieren, sind als Exkretionsenzyme und intracelhl]~re Enzym-Komplexe im gesamten Tier- und Pflanzenreich weir verbreitet. Sic ]iegen meist in Gemisehen vor, wie das lange Zei~ ffir einheitlich gehaltene Erepsin der Darmschleimhaut.

* Die Durehffihrung der Arbeit wurde dm'ch Gew~hrung einer ForschungsbeihiLfe gefSrdert. Unser Dank hierffir gebfihrt dom Senator ffir Kreditwesen und dem Senator fiir Volksbildung. IIauptamt Wissenschaft und Forschung Berlin.

1 Sct~ol~l~I~l~, J., R. WIa~SK]~ u. It. WI~T]~I~: Diese Z. 99~ 437 (1954). B~RG~I~I~, M., u. W. F. Ross: J. of Biol. Chem. 114, 717 (1936).

3*

36 J. SC~IORNIULLEI% 1~.. WI:ESK]] und H. WI~T~:

Seit der Kennzeichnung der Hefepeptidasenspezffit~t dutch definierte synthetische Peptid- substrate (WILLS~XW~I¢ mid GI~ASSMA~S ~) hat sieh in der Folgezeit die Klassffizierung dcr einzelnen Peptidase-Typen nach den yon ihnen gespaltenen Peptiden als besonders fruehtbar erwiesen. Dabei zeigte sich, dab bei der Bildung tier Enzym-Substrat-Additionsverbindung die AnlagerungsmSglichkeit der Peptidasen an eine bestimmte Anordnung einmal yon spezffischen Gruppen im Substratmo]ekifl, daneben auch yon der Lgnge der Peptidkette abh~ngig ist ~. AuBerdem sind alle Peptidasen, mit Ausnahme der d-Dipeptidase, lediglich zur Spaltung der aus den natfirlich vorkommenden Aminosguren der ]-Reihe aufgebauten Peptide befghigt.

Wi t haben in unseren Un te r suchungen diese - - auf der Nu tzung synthet ischer Pept idsubs t ra te aufgebaute - - KennzeichnungsmSgl ichkei t herangezogen u n d zu- n~chst Aminopeptidase, Carboxypeptidase u n d Dipeptidase des reifenden K~ses ge- priift. Die Un te r suchung zweier weiterer Pept idasen, die ffir die Geschmacksaus- b i ldung des K~Lses yon besonderer Bedeutung sein diirften, n~mlich dcr yon GI~Ass- ~ A ~ 1929 en tdeck tcn Prolinase u n d der yon B E I ~ A ~ u n d Fl~Vros 1936 beschriebenen Prolidase, ist im Gange. Sic erforderte die besonders zei t raubende Herste]lung Prol in en tha l tender Pept ide und wurde deshalb ge t renn t durchgefiihrt .

Spezifit~it und Wirkungsbereich yon Peptidasen.

I m folgenden soil Spezifit~t u n d Wirkungsbereich der hier un te r such ten Pepti- dasen nach bisher vorl iegenden Ergebnissen der Li te ra tur kurz gekennzeichnet werden.

A minopeptida se. Diese, 1929 yon W~DSC~DT-L~ITZ und Mitarbeitern ~ beschriebcnc Polypeptidase finder

sich in dcr Diinndarmmucosa, in Pankreas, Leber, ~iere, Milz und Blutserum sowie in der Kefc. Sic spaltet wcder Dipeptide noch EiweiB, wohl aber Tri-, Tetra- und hShere Peptide. Der Spalt- prozeB beginnt am Aminoende des in unmittelbarer Nachbarschaft der CO-NI~-Bindung stehenden Peptidmolekfils, wobei die zugeh6rige endst~ndige Aminosi~ure abgespalten wird. Dieser ProzeB wicderholt sich so lange, bis nur noch ein Dipeptid vorliegt. Peptidderivate, deren freie COOI-I- Gruppe vcrester~ ist, werden durch dicses Enzym ebenfalls gespalten~ sofern sic eine freie Amino- gruppe besitzen. Substitution der freicn Aminogruppe zerstSrt die Angreifbarkeit, dcsgleiehen sind Substrate inaktiv, deren freie Aminogruppe aus einer d-S~ure stammt. Die wesentliche t~o]le der freien Aminogruppe ffihrte zur Bezeichnung Aminopeptidase. Als zweite I-Iaftstelle ffir die Enzym-Substrat-Bindung wurde die Iminogruppe ermittelO. ])as p.-Optimum des Enzyms ]iegt zwischen 7 und 8, das einer yon SMIT~ und Mitarbeitern 5 beschriebenell Leucin- Aminopeptidase bei p~ 7,8--8,0.

Carboxypeptidase. Eine weitere, in Darmmucosa und Pankreas gefundenc, 1935 yon A~so~ 6 zum erstenmal

in kristallisierter Form erhaltene Polypeptidase wurde wegen ihres spezffischen Wirkungs- bereiches als Carboxypeptidase (friiher ~uch als Carboxypolypeptidase) bezeichnet. Wesentlich fiir die Substrataktivit~t sind eine COOI-I-Gruppe und die Konfiguration der angrenzenden Peptidbindung. Die Wirkung des Enzyms ~uBert sich in der Abspaltung der Aminos~uren yore freien Carboxylende her. Ffir die Verankcrung der Carboxypeptidase ist nur die Anordnung der Atome yon dcr COOtt-Gruppe her ma~gebend und nicht ihre stcrische Konfiguration. So erfolgt z.B. die Hydrolyse des racemischen Tripeptids d,l-Leucyl-glycyl-l-tyrosin durch Aminopeptidase asymmetrisch, nnter Bcschl'~nkung auf die den ]-Leucinrest tragende Kom- ponente; durch Carboxypep~idase dagegen symmetrisch, unter Bildung yon d,l-Leucylglycin

WILLSTXT~]~a, R., u. W. G~ASSMA~N: I-Ioppe-Seylers Z. 153, 250 (1926). 2 GRASSlAnd, W. : ]:[oppe-Seylers Z. 167,202 (1927). - - GRASS~±~X, W., u. ]:[. I)YCK]~aOFF :

I-Ioppe-Seylers Z. 175, 18 (1928) . - WALDSCI-EVIIDT-LEITZ, E., W. GI%ASSlVIANN U. I-I. SCttLATTER: Ber. dtsch, chem. Gcs. 60, 1906 (1927).

3 WALDSCIx'MIDT-LEITZ, E., A. K. BALLS U. J. WALDSCHMIDT-GRASER: Ber. dtsch, chem. Ges. 62,956 (1929).

BALLs, A. K., u. F. K6t~LEI~: Ber. dtsch, chem. Ges. 64,. 294 (1931); l~oppe-Seylers Z. 205,157 (1932).

5 SMIT~,E. L., D. tt. S r A C K ~ u. W, I. POLOL~SE: J. of Biol. Chem. 199, 801 (1952). A~so~, L.: Science [Lancaster, Pa.~ 81, 467 (1935); J. gem Physiol. 20, 663, 777 (1937).

Beitr/~ge zur Biochemie der Ki~sereffung, IX. 37

neben t-Tyrosin. Ffir die Angreffbarkeit yon Snbstraten durch Carboxypeptidase hat man einen bestimmten Ionisationsgrad der freien COOH-Gruppe verantwortlich gemacht und damit den Einflu$ besonderer Aminosi~uren auf die Spaltbarkeit yon Peptiden erkl~rtL So werden besonders leieht Peptidbindungen hydrolysiert, an welchen die ~-Aminogruppen yon 1-Phenyl- alanin, 1-Tyrosin oder 1-Tryptophan beteiligt sind. Auch dutch eine Aeylierung der freien Amino- gruppe in den Peptiden kann man den elektronegativen Charakter der COOtt-Gruppe verst/irken und so die Bindung des Enzyms an das Substrat ermSglichen. So wird z. B. Benzoylglyeylglycin durch Carboxypeptidase zerlegt, das freie Dipeptid Glycylglycin hingegen nicht. Neuere ein- gehende Studien fiber strukturelle Forderungen fiir Carboxypeptidase-Substrate stammen yon BEX~G1VIA_~N u n d FRUTOIN 2 sowie VOn NEURATH und Scn~VE~T a.

Dipeptidase. Aus Itefe, Pankreasgewebe, D/inndarmmueosa, Niere und gewissen anaeroben Bakferien

gewonnene Enzympraparate vermSgen nur Dipeptide zu hydrolysieren. I)abei spaltet die hierbei wirksame Dipeptidase jedoeh Bur solche CO-Ntt-Bindungen, denen zugleich eine freie ~-Amino- und eine freie Carboxylgruppe benaehbart ist. I)er Wasserstoff der Peptidbindung daft nicht substituiert sein, denn Voraussetzung zur SpaRung ist die MSglichkeit zur Umlagerung in die Iminohydrinform~. Der Spezffitatsuntcrschied gegenfiber der Aminopeptidase, fiir welchen nur die Li~nge der Peptidkette maBgebend ist, scheint auf der Verschiedenheit im sauren Charakter von Dipeptiden einerseits und Polypeptiden andererseits zu beruhen. Er is~ yon Einflu$ auf die Bildung der Enzym-Peptid-Verbindung. W~DSC~I~)T-L~ITz 5 vertritt die Ansieht, dab I)ipeptidase gleich der Aminopeptidase mit den Aminogruppen der Substrate unter Bildung Scmwrscher Basen kondensiert. I)as Wirkungsoptimum der I)ipeptidase liegt bei p~ 7,6--7,8. Im Gegensatz zu ttefe- und Aspergilbas-Peptidase wird das Enzym tieriseher tterkunft durch ~n" , Mg'" und teflweise auch dutch Co" aktiviert. I)a die Wirksamkeit der Dipeptidase dutch tyloische Metall-Inhibitoren, wie ttCN und I-I~S stark gehemmt wird, liegt die Annahme eines Metall-Cofermentes nahe. ~ber die Eigenschaften der y o n GRASSMAIqN 6 getrennt gewonnenen Co- und Apofermentkomponenten des Enzyms ist wenig bekannt.

Die Bestimmung der Peptidasen in reifendem Harzer KKse.

Die Darstellung zellfreier LSsungen mit Peptidase-Wirksamkeit aus ~¢[ikroorganismen ist in der Literatur vielfach beschrieben worden. Die Peptidasen liegen wahrscheinlich meist endo- cellular vor, denn man finder sie nicht in Medien junger Kulturen, die nur geringe Autolyse zeigen. Wirksame Peptidase15sungen liefern vielmehr Filtrate alter Kulturen oder ~¢[azerate und Antolysate gewaschener Zellen ~. Beispiele fiir andere, in neuerer Zeit zur l%eflegung und Abtrennung yon Peptidasen verschiedener I-Ierkunft beschriebene Verfahren sind die fraktionierte F~llung der Hefedipeptidase mit Aceton bei pn 7,0 ~, die Anreicherung einer Aminopeptidase aus ])armschleimhaut durch F/~llung mit Aceton und Aufarbeittmg mit Ammonsulfat 9 oder die Abtrennung der Prolidase aus Darmmucosa durch F/~llung mit Bleiacetat 9. Weiterhin sei an die Freisetzung yon Endopeptidasen aus Clostridium histolyticum durch Behandlung mit Ultra- schallwellen ~° und die Abtrermung yon Fremdmaterial durch n-Butanol tl erinnert.

1. Die verwendeten 8ynthetischen Substrate. An Pept iden, welche den eingangs aufgezeigten s t rukture l len Forderungen ffir die

Bes t immung der einzelnen Pept idasen geniigten, wurden verwendet :

1 WALDSCm~DT-L~I~Z, E., W. KL~I~ u. A. SCHXFFNER: Ber. dtsch, chem. Ges. 61, 2092 (1928).

2 BE~G~AlW, M., U. I. S. F~UTON: Adv. in Enzymol. 1, 63 (1941). 3 NEURATH, I-I., u . G . W . SCItWERT: Chem. Rev. 46, 69 (1950). 4 Vgl. T~. BEI~SIN: Kurzes Lehrbueh der Enzymologie. S. 111. Leipzig: Akad. Verl. Ges.

Geest u. Porticy K.G. 1951. 5 WALDSCtIMIDT-LEITZ, E.: Z. angew. Chem. 44, 577 (1931). 6 GEASS~C-~NN, W.: Biochem. Z. 298, 8 (1938). 7 BA~A~N, E., u. K. MYRBXCK: Methoden der Fermentforschung. Bd. II, S. 1208. Leipzig:

G. Thieme 1941. 8 SCHALES, 0., u. R. M. Roux: J. of Biol. Chem. 182, 569 (1950). 0 SMITE, E. L., u. M. BEEGM~NE: J. of Biol. Chem. 158, 632 (1944).

10 KOCHOLATY, W., L. SMITer u. L. WEIL: Biochemie. J. 82, 1691 (1938). 11 MORTOn, K. It.: Nature [London] 166, 1092 (1950).

3a

38 J. SCHO~Hi~LLER, R. W~ESK~ und H. W~N~ER:

a) Fi~r Dipeptidase: Gtycylleucin (GL), Glycylalanin (GA), d,l-Leucylglycin (LG) und Glycyl-

glycin (GG);

b) /i~r Aminopeptidase : d,l-Alanylglycylglycin (AGG), 1-Leucylglycylglycin (LGG) und Glycylglycyl-

glycin (GGG) ;

c) /iir Carboxypeptidase: Chloracetyl-l-tyrosin (ChlT), Chloracetyl-l-leucin (ChlL) und Benzoylglycyl-

glycin (BGG). Sie wurden z. T. selbst dargestellt, wie Glycylglycin nach E. FISCHER 1 (N ber.

21,21~o; N gef. 20,460), Glycyl-Leucin und Glycylglycylg!ycin nach E. F~SCHER 2 (N ber. 14,89~o bzw. 22,22%; N ge l 14,95~o bzw. 22,40~o) und Benzoylglycylglycin nach E. FISCHER ~ (5[ ber. 11,90~o; N gef. 11,28~o). Die relativ gro~e Zahl yon Substraten wurde gew~hlt, da - - wie auch MERTEN a betont - - bei der Priifung yon Fermentl5sungen auf ihre peptidatische Wirkung die Verwendung mSglichst vieler Substrate anzustreben ist. Die einzelnen Substanzen kSnnen sich in ihrer Abbau- f~higkeit nicht nur quantitativ, sondern je nach dem Fermentsystem des reifenden K~ses auch qualitativ unterscheiden.

2. Die Bestimmungsmethode der Peptidasen-AIctivit~t.

Zun~chst wurden zur Bestimmung der Peptidasen im Harzerk~se als Enzym- zubereitung die in der friiheren Arbeit 4 eingehend beschriebenen Glycerinextrakte verwendet. Fiir die Bestimmung der proteolytischen Spaltung synthetischer Peptide durch Peptidasen mi~t man die Zunahme der freien Carboxyl- bzw. der freien Aminogruppen. Da in der Literatur ffir die Bestimmung der Peptidasen der Organe, des Verdauungstraktus und der Here fiberwiegend die Titration in alkoholischer LSsung angegeben ist, wurde ffir die folgenden Untersuchungen das auch frfiher benutzte modffizierte Verfahren yon G~SSMA~N-HEYD]~ ffir die Messung der Peptidspaltung durch Ki~se-Glycerinextr~kte angewendet. Zun~chst wurden b e i dem zu erwartenden, yon anderen Autoren angegebenen p~-0p t imum der Peptidasen K~tseextrakte auf 'd ie zehn obengenannten synthetischen Peptidsubstrate zur Ein- wirkung gebracht, um festzustellen, ob die Peptidasenaktivit~t nach Abzug der Selbstspaltung meBbare Spaltungswerte lieferte.

Die Peptidsubstrate wurden unter Zusatz yon n-NaOI-I ge]Sst and auf p . 7,8 eingeStellt. Die Substratkonzentration betrug 0,05 mmol/ml ffir die optiseh aktiven Verbindungen und 0,1 mmol/ml ffir die Racemate. Die Bebrfitungsansgtze warden derart bemessen, dai~ bei Titra- tion yon 0,5 ml des Ansatzes der 100%igen Spaltung einer CO-Rrl=LBindung des Substrates (bereehnet auf die 1-Form), ein Aeiditgtszuwachs yon 1,00 ml 0,01 n-Lauge entsprach. Dan~eh waren im Versuchsansatz yon 5 ml enthalten: 2 ml Substrat]Ssung 0,05 n (bzw. 0,1 n), 2 ml m/15 Phosphatpuffer pa 7,8 und 1 ml Fermentextrakt. Die geringffigige, yon LvMR¥ und Mitarbeitern s bei Carboxypeptidase aus Pankreas besehriebene (kompetitive) Hemmung dutch Or~hophosphat dfirfte hier zu vernachl~ssigen sein. Nach Zugabe yon 0,1 ml Toluol wurden Proben yon 0,5 ml

1 FISCHER, E. : Untersuehungen fiber AminosAuren, Polypeptide und Proteine. S. 282, 425. Berlin: Springer 1906.

2 FISC~]~R, E.: Untersuehungen fiber Aminosguren, Polypeptide und Proteine. S. 602. Berlin: Springer 1923.

3 M_E~TE~, R.: Bioehem. Z. 818, 167 (1947). 4 SOHOR~IffLLE~, J., R. WlESXE U. H. WI~TE~: Zit. S. 35, Anm. 1. s LUMRr, R., E. L. S~azT~ u. R. R. GLA~TZ: J. Amer. Chem. :Soe. 78, 4330 (1951).

Beitrage zur Biochemie der K~sereifung. IX. 39

entnommen, naeh dem iibliehen Verfahren mit 0,05 n-NaOtt zum Farbumschlag gebraeht und in 90% alkoholischer LSsung mit 0,01 n-alkoholischer KOH (Indicator Thymolphthalein) titriert. Die Spaltungszeit betrug 24 Std., die Reaktionstemperatur 37 ° C.

Nach Abzug der iiblichen Kontrollen K~ (ohne Ferment) und K 2 (ohne Substrat) ergaben sich folgende Spaltungswerte (Tab. 1) fiir einea aus hochgereiftem Harzerki~se (16 Tage Reifungsdauer) dargestellten Glycerinextrakt (13,69 mg N/ml):

Tabelle 1. Peptid-Hydrolyse verschiedener Substrate I dutch einen Kdse-Glycerin.Extrakt bei PH 7,8. Maximale Spaltung ~- 100%.

Substra t ~ ChlL

Spaltung , . , % 72

Den Ergebnissen zufolge wurden s~mtliche Substrate bei PH 7,8 dureh den Ext rak t kri~ftig hydrolysiert, und zwar solche ffir Dipeptidase (aui3er GG) am st~rksten (80--90%). Substrate fiir Aminopeptidase wurden zu etwa 60%, solche fiir Carboxypeptidase unterschiedlich, jedoch im allgemeinen schw~cher, gespalten. Die Selbstspaltung des Extraktes war m~i~ig und hinreichend konstant (etwa 0,13 ml 0,01 n-KOH), w~hrend die Selbstspaltung der Peptide (K1) praktisch gleich Null war.

Die gleichen Substrate wurden weiterhin der Spa]tung durch zwei auf verschiedene Weise aus einer 22 Tage gerefften K~seprobe gewonnene Extrakte unterworfen. Glycerinextrakt I (N-Gehalt 7,45 mg/ml) wurde wie fiblich dargestellt. Bei der Gewinnung yon Glycerinextrakt I I (N-Gehalt 4,58 mg/ml) wurde der zerkleinerte K~se mit fliissiger Luft eingefroren, 15 rain im gefrorenen Zustand gehalten, in angew~rmtem Wasser aufgetaut und anschlie]~end in /iblicher Weise der Glycerinextrakt bereitet.

Tab. 2 zeigt die bei verschiedenen Bebriitungszeiten erhaltenen Ergebnisse nach Abzug der Kontrollen. Beide Extrakte waren peptidatisch aktiv, doch ]egte die Behandlung mit fliissiger Luft hier keine weiteren Fermentmengen frei. Das in anderen F/illen oft recht erfolg- reiche Einfrieren bietet nach orientie- renden Versuchen (Tab. 2) in den yon uns untersuchten Systemen keine Vor- teile, es wurde deshalb nicht weiter angewendet.

Vergleicht man die hydrolysierende Wirkung der beiden vorstehend unter- suchten, aus 16 und 22 Tage gereiften K/~seproben s tammenden Extrakte, so ist fiir beide Proben unter den ge- w/~hlten Spalbungsbedingungen die Dipeptidasenaktivit/it am grSBten, in abnehmender l~eihe folgen Amino- peptidase- und Carboxypeptidasewir- kung. Bemerkenswert ist, dab Leucin enthaltende Substrate yon ])ipeptidase

Tabelle 2. Peptidhydrolyse bei Pn 7,8 durch Ex- trakte, die ohne (I) uncl mit ( I I ) vorhergehendem

Ein/rieren der Kiisemasse erhaIten waren.

Spaltung dutch E x t r a k t

I I i i Substrat ~

nach einer lCeaktionszeit yon

GA GL LG LGG AGG GGG BGG ChiT ChlL

3 Std. %

6

l l

20 Std. %

63 83

107 98 46

16 28

24 Std. %

71 86

105 94 71 44 20 30 13

20 S~d. 24 Std. % %

36 53 - - - y

~ 70

19 31

und Aminopeptidase besonders leicht gespalten werden. Inwieweit dies eine Be- stgtigung dutch besonders weitgehende Freisetzung dieser Aminos~ure in reffendem K~se findet, bedarf weiterer Untersuchungen.

1 Abkiirzung der Substrate: vgl. S. 38, Abschnitt la--c.

40 J . SCtlORMOLLER, R. WIESKE und H. WI~m~:

Zusammen/assend ergab sich aus dieser Versuchsreihe, dab die fri iher zur P ro t e ina sebes t immung in reffendem Ki~se benu t z t en Glyce r inex t rak te auch Sub- s t r a t e ffir Dipep t idase , Aminopep t idase und CarSoxypep t idase teilweise s tark , zu- mindes t aber gu t me6bar , spa l te ten . D a m i t war dis Anwesenhei t dieser F e r m e n t e in Harzerk~tse fes tgestel l t und gleichzeit ig die Brauchba rke i t derar t iger E x t r a k t e ffir Pep t idase -Un te r suchungen erwiesen.

Nach MORTO~ ~ bietet die Extraktion mit n-Butanol bei tiefer Temperatur ffir die Freflcgung yon Fel~nenten aus tierischem Material wesentliche Vorteile. Der Autor hat dies fiir eine groBe Zahl yon Fcrmenttypen, darunter auch ffir proteolytische Enzyme, gezeigt. Wir priiften, ob das gcnannte Verfahren auch fiir die Anreicherung and Freilegung yon Bakterienpeptidasen uus l~arzerk~se anwendbar ist. Zu diesem Zweck wurde eine 25%ige Suspension yon hoch- reifem Ease in 0,02 m-NaHCO~-LSsung, enthaltend 0,85% NaC1, mit 30 ml n-Butanol bei 2 ° C durchgeriihrt und nach 30 rain Stehcn bci diescr Temperatur zentrifugiert (3000 U/rain). Die wM~rige Schicht (75 ml) lieferte den Fermentextrakt I (8,14 mg I~/ml). Ein Teil dieses Extraktes wurde in der KMte 24 Std. gegen einc 0,01 m-l~attCO3-LSsung, dann 48 Std. gegen Wasser in Cellophan dialysiert (Extrakt//; 2,80 mg N/ml). Die Volumzunahme bei der DiMyse wurde im Fermentansatz entsprechend berficksichtigt. Zum Vergleich mit der Wirksamkeit der bisher benutzten Glycerinextrakte wurde aus dem glcichen Ki~se ein derartiger, 25%iger Extrakt bereitet (Extrakt I I I ; 4,9 mg N/ml). Spaltungsbestimmungen erfolgten unter den iiblichen Bedingungen durch Titration yon 0,5 ml des Ansatzes, wobei der Zuwachs yon 1,00 ml 0,01 n-KOI-I einer maximalen Aufspaltung der Peptidbindung entsprach.

Wie aus Tab. 3 hervorgeht , lagen die Al~tivitgten der drei Ki~sepeptidasen gegeniiber ihren typ i schen Subs t r a t en bei Verwendung yon 25~/oigen Ki~seextrakten

Tabelle 3. Hydrolyse yon Peptiden dutch Gt rcerin- und n-Butanolextralcte.

1%

7,8 7,0 7,0

Subs~rat ~

LG LGG BGG

Spaltung dutch Extrakt

I II III % % %

38 66 51 3~ 33 32

13 10

um etw~ die H~ffte n i e d r i g e r als bei dan vorangegangenen Versuchen mi t doppe l t so s t a rken Glycer inex t rak ten , wo 50 g K~se 100 ml Fe rmen t lSsung l ieferten. Wesen t - l iche Spaltungsunterschiede zwischen An- s~ttzen mi t Glycerin- und n - B u t a n o l e x t r a k t e n t r a t e n n ich t auf, m i t Ausnahme einer Stei- gerung der Dipep t idasewi rkung bei dialy- s ier tem Bu ta no l e x t r a k t .

])as Verfahren yon MORTO~ bot demnach keine Vorteile fiir die Freilegung yon Peptidasen aus Kgsesuspensionem Die yon MO~TO~ bei Gewcbs-

extrakten verschiedener Art gefundene, R o ~ s o ~ and Mitarbeitern abei der Extraktion der Peptidasen aus Hundeniere bestatigte gfinstige Wirkung des Butanols beruht zweffellos vor allem auf der Abtrennung yon Lipoiden and der Spaltung yon Lipoproteiden, Fraktionen, die in den yon nns geprfiften K~sesuspensionen nicht oder in nur unwesentlicher Menge vorhanden sind.

3. Die p~-Abhi~ngigkeit der enzymatischen Hydrolyse spezi/ischer Peptidasensubstrate.

Zur Fes t l egung op t ima le r Spa l tungsbed ingungen wurde dio pE-Abhi~ngigkeit der enzymat i schen H y d r o l y s e dreier spezifischer Subs t r a t a un tersucht , und zwar yon t -Leucylg lycylg lyc in (I-LGG) ffir Aminopep t idase , d , l -Leucylg lyc in (LG) fiir Di- pep t idase a n d Benzoylg lycy lg lyc in (BGG) ffir die Wi rkungse rmi t t l ung der Carboxy- pep t idase .

Im Versuchsansatz yon 5 ml waren enthalten: 0,1 mmol bzw. 0,2 mmol (bei d,l-Leucylglycin) Snbstrat, 2 ml m/15 Phosphatpuffer p , 7,8 und 1 ml Glycerincxtrakt eines 16 Tage gercfften K~ses. Der gewiinschte p~-Wert wurde mit einigen Tropfen n-KC1 odcr n-KOI~ nachgestellt.

1 Mo~To~,K. I t . : Zit. S. 37, Anm. 11. 2 Abkiirzung: vgl. S. 38. a ROBInson, D. S., S. M. BIX~I]3Av~ u. J. R. G I ~ I , IST]~I~: Arch. of Biochem. a. Biophysics

39, 230 (1952); J. of Biol. Chem, 202, 1 (1953).

Beitr~ge zur Bioehemie der K£sereifung. IX. 4 t

Abb. 1 zeigt die prozentuale Spaltung einer Peptidbindung in Abh~ngigkeit vom p.-Wert nach 24stiindiger Bebrfitung und Abzug der Kontrollen. Danaeh e r s t r eck t sich die P e p t i d a s e n a k t i v i t ~ t f iber e inen re la t iv wei ten p . -Bere ich . Die S p a l t u n g s o p t i m a ffir d i e Amino- pep t idase und die Carboxypep t idase l iegen bei PH 7,0--7,2, fiir die Dipep t i- dase u m p . 7,8. Die absolu te Ak t iv i t~ t d e r einzelnen Pep t idasen war aueh hier grSl~enordnungsm£1~ig i ibereinst im- mend mi t den Ergebnissen der voran- gehenden Untersuchungsre ihen. Ersa tz des a l lgemein benu~zten Phospha t - puffers durch Veronalpuffer nach Mm~AELIS 1 ergab keine wesent l ichen Un%erschiede in der Spal tungsgesehwin- d igkei t v0n LG, L G G und B G G durch K£seex t rak te . I m Gegensatz zu

zoo I % 8ol, *>("/. ""'~ ~

/ Y % ~80 "-~..

% /" \

20 6.~ _

o ' " / I . . . . . 6 7 3 g

p# Abb. 1. pn-Akiivit~tskttrven ftir Pep~idasen. Dioeptidase (Substrat: LG), - - - - - - AminopeP~idase

(Substrat: LGG) und . . . . . Carboxypeptklase (Substrat: BGG).

Er fahrungen mi t verschiedenen Puffern bei anderen F e r m e n t t y p e n , wie z . B . bei Phospha t a sen 2 beeinf lussen die beiden un te r sueh ten Puffersys teme das Verha l ten der gepr i i f ten Subs t r a t e gegeniiber Pep t ida sen n ieht 3.

Die Peptidasenaktivit~it im Verlauf der Reifung.

Zur Pr i i fung der Peptidasenaktivi%~t yon G lyc e r ine x t r a k t e a aus re i fendem Harzerk~se versehiedenen Al ters wurden zwei Re i fungsre ihen un te rsuch t .

Das angelieferte K~se-Rohmaterial wurde einraal ohne Reifungssalze (ReiheI), zum anderen mit Reifungssalzen (Reihe II) angesetzt. Aus beiden Versuehsfiihrungen wurden nach ver- schiedenen Reffungszeiten in der iiblichen Art Glycerinextrakte dargestellt, wobei 50 g ttomo- genisat 100 ml Extrakt lieferten. Die 5~essung der Hydrolyse effolgte fiir LG bei p . 7,8, fiir LGG und BGG bei p~ 7,0. Die Reaktionsdauer betrug 20 Std. bei 37 ° C. Die Versuehsans~tze

Tabelle 4. Alctivi~t der Peptidasen im Verlauf der Rei/ung.

Extrakt

I ohne

Reifungs- salze

I I mR

Reifungs- s&lze]l

Reffungs- 4auer

Tage

0 8

14 22 26

0 8

14 22 26

P. ides Ex~raktes

4,8 5,8 6,0 6,2 6,6

5,5 6,2 6,4 6,6 7,0

Gesamt-N ml Extrakt

mg

0,91 1,76 1,96 4,76 7,07

1,40 2,59 4,20 4,62 6,51

Trocken- substanz/0,5 g

K~se mg

158,5 183,3 195,4 187,25 190,45

173,75 172,35 174,85 172,45 169,75

LG 4 %

1 40,5 46 60 65

77 82 84

Spaltung des

LG~ %

33 54 51

40 74 76

BGG %

3 2 6,5

17 15

8 14 20 24 21

1 M~C~AEmS, L.: J. of Biol. Chem. 87, 35 (1930). Vgl. z. B. H. A~BI: Schweiz. reed. Wschr. 82, 135 (!952); W. RITTE~: Milchwiss. 7, 301

(1952); CH. A. ZITTL~ U. E. S. D~L~ M o r o n : Arch. of Biochem. 26, 112 (1950). a Vgl. LuMa¥, R., E. L. S~IT~ u. R. R. GLAXTZ: Zit. S. 38, Anm. 5. 4 Abkiirzung: vgl. S. 38.

42 J. SC]~OI~IVIULL:EI% R. WIESKE und I-I. VV'I~TEI%:

waren wie bei der pn-Aktivitatsbestimmung bemessen. Die Werte der Tab. 4 geben die aus dem Zuwachs der ¢itrierten COOH-Gruppen nach Abzug der Kontrollwerte errechneten Spal$ungen in Prozenten an, berechnet auf die 1-Form der Peptide. Sic wurden aul~erdem auf den Gehalt der K~setrockenmasse im Ausgangsmaterial (,Nullquark I/0 bzw. II/0") umgerechnet, wobei

vorausgesetzt wird, dab die enzyma- 8O %

20 . . . . . . " - . . . . . . ~ . ~ . ~ . ~ . . . . . .

G ¢ ~ ld l~ 20 2¢ 'T~qe

Rc/funff3daucr Abb. 2, Ak~ivi£~t der ~)ep6idasen tm Verl~uf der KEsereffung. ]~xtrak¢ I (ohne 1%eifungssalze). - - Dipep~idase ( S u b s t r a t :

L G), - - - - - - Aminol0e!otidase ( S u b s t r a t : L G G) und . . . . . Carboxypep¢idase Subs t r~ t : B G G ) .

%

I o o Rc/~n3sdaucr

Abb. 3. A k t i v i ~ t der l ' e p t i d a s e n im Ver l au f der K~isereifung. ]]xtrak~II(mit l%ei fungssalzen) , - - n ipep t tda se (Subs t r a t :

LG)~ - - - - - - Aminopept idase (Subs t r a t : L G G ) und . . . . . Carboxypept idase) ( S u b s t r a t : B G G ) .

tische I{ydrolyse proportional der Menge an ex~rahierter K~semasse ist° Aul~erdem sind in Tabi 4 die Werte der Gesamtstiekstoffbestimmung naeh KJ~LD~L-PA~AS ffir die Glycerin- extrakte und der Trockensubs~anz- gehalt der frisehen K~seproben auf- geffihrt.

Wie T~b. 4 und die Abb. 2 und 3 zeigen, steigt in beiden Reifungsreihen die Aktivit~t der Carboxypeptidase in den ersten 8 Tagen kaum an, w~hrend im gleiehen Zeitraum die Wirksam- keit der beiden anderen Peptida- sen stark zunimm~ und einem Grenzwert zustrebt. Alle drei Peptidasen entfalten im K~se m i t Reifungssalzen grS~ere Aktivit~t als in dem ohne solchen Zusatz gefiihrten I~eifungsansatz. Die hydrolysierende Wirkung auf LG ist auch hier wieder am grSl~ten, gefolgt yon der auf LGG. Mit Abstand am geringsten t r i t t sie bei BGG in Erscheinung. Ent- sprechend dem Anstieg des Stick- stoffgehaltes der Ext rak te nahm deren Selbstspaltung infolge des

steigenden Ballasteiweil~gehaltes im Verlauf der Reifung zu. Die elektrometrisch gepriiften p~-Werte der Ans~tze schwankten durchschnittlich um 0,1, maximal um 0,2 p~-Stufen im Verlauf der Versuchsffihrung. '~

Die Kennzeiehnung der K~sepeptidasen. 1. Die Kinetik.

l~iir die drei bisher untersuchten Peptidasen des Harzerk~ses wurde die Hydro- lysenabh~tngigkeit der spezifischen Substrate LG, L G G und BGG yon der Reaktions- zeit und der Enzymmenge uatersucht. Die Ans~tze waren wie bisher so bemessen, dal~ ein Zuwachs yon 1,00ml 0 ,01n-KOtt der vollst~ndigen Aufspaltung einer CO-~H-Bindung in den Peptiden entsprach. Spaltungsbedingungen und Bestim- mungsverfahren waren dieselben wie bei den in Tab. 4 wiedergegebenen Versuchen. Wie Abb. 4 zeigt, entspricht die Hydrolyse yon BGG einer Reaktion nullter Ordnung-, w~hrend bei L G G und LG die Spaltungsgeschwindigkeit ann~hernd nach der ersten Ordnung verl~uft. Zur Darstellung der Peptidasenaktivit~t in Abh~tngigkeit yon der Fermentmenge (Abb. 5) wurden steigende Mengen eines Glycerinextraktes aus 26 Tage gereiftem K~se der Reihe I I unter sonst gleichbleibenden Bedingungen (optimaler p~-Wert, 24 Std., 37 ° C) den S~ibstraten LG, L G G und BGG zugesetzt.

Beitr~ge zur Biochemie der K~sereifung. IX. 43

Es ergab sieh l ineare Abh~tngigkeit der Hydro ly se yon L G G und B G G bis zu einer F e r m e n t e x t r a k t m e n g e yon 1 ml pro 5 ml Ansatz , bei wei te rem Ans t ieg Ann~herung an einen Grenzwer t der Spa l tung . Bei der t I yd ro ly se yon L G war der Max ima lwer t der Spa l tung p rak t i s ch berei ts fiir 0,5 ml E x t r a k t m e n g e pro 5 m l Ansa tz erreieh~ ~.

8 0

..o . . . . . . . . .

o~.~ ~ ~,...=o

~f.~ . ~ . ~. "~'" - - -/- °- ,

0 ~ 8 ~Z z~ ZO S/d 211 Reaklion~ze/t

Abb. 4. Die Akt iv i t~ t der Pep t idasen in Abh~ingigkeit yon de r Reak~ionszeik - - D i p e p t i d a s e (Subs t r a t : LG), - - - - - - Aminopept idase (Subs t r a t : L G G ) und . . . . .

Carboxypept idase (Substra~: BGG) .

80 %

~¢0 . I"

0 . '~" I I I I r I 0 0 ,25 0,5 0,75 1'0 1,25 rat 7,5

fermen/ex/ra~/

Abb. 5. Die A k t i v i t ~ der Pep t idasen in Abh~ngig- ke i t yon der Fe r me n tmenge . - - Dipept idase (Subs t r a t : L G), - - - - - - kminopep t idase (8ubst ra~: L G G ) mad . . . . . Carboxypept idase (Subs t r a t :

BG~). 2. Die Hitze-Inaktivierung.

Zur wei teren Kennze ichnung der KKsepept idasen wurde die H i t z e - I n a k t i v i e r u n g a n e inem E x t r a k t der Reihe I i fiir eine 22 Tage gereffte Ki tsepr0be gemessen.

Gleiche Mcngen dieses Extraktes wurden vor Zugabe yon Subs~rat und Puffer jeweils 10 rain bei verschiedenen Temperaturen im Wasserbad-Thermostaten gehalten. Vor und nach Ablauf der Reaktionszeit yon 24 Std. erfolgte die titrimetrische Bestimmung der freien COOH-Gruppen in 0,5 ml des fiblichen Ansatzes.

Abb. 6 zeigt, dal3 bei einer Erh i t zungs tempe- r a t u r yon 60°C alle drei Pep t idasen kaum ge- sch~digt wurden und dab bei 80°C immerh in noch t in be t r~cht l icher Teil der F e r m e n t w i r k u n g i n t a k t war. Bei wei terer Tempera tu r s t e ige rung tri tb, vor a l lem ffir Dipep t idase und Aminopep- t idase , r ap ide r Ak t iv i t i~ sve r lu s t ein, bis bei 100 ° C p rak t i sch volls t i indige Inak t i v i e rung fest- zustel len w a r .

Die oft unerwarte~ groBe I-Iitzestabitit~t, vor allem unreiner Fermentsysteme, ist seit langem bekannt (vgl. z. B. z). Kiirzlich habcn sie KIERMEI~ und CoDtr~o 2 fOr Brotenzyme, OLIVam a ffir Decarboxy!asen einiger Sypischcr Milchs~urebakterien im /Kinblick auf flare Be- deutung bei der K~seherstellung erSrtert. Die I-Iitze- resistenz yon K~sefcrmenten dfirfte u. a. wesentliche Be- dcutung bei der Dosenkonservierung yon K~sc bcsitzen.

80~ %'

60

20'

37 6'0 80 700 °C [rh/?zung31emperalur

Abb. 6. H i t ze - Inak t iv i e rung der Pep~idasen (10 rain bei verschiedenen Tempera tu ren) . - - Dipept idase (Subs t ra t : L G), - - - - - - Aminopept idase (Subs~rat : L G G ) trod . . . . . Carboxypept idase ( Subs t ra t : B G G).

3. Versuche zur Trennung der Peptidasen.

I m folgenden wurde versucht , en t sprechend den A nga be n yon WALDSCItMIDT- LEITZ 4 au f der Basis eines Arbe i t sganges nach H A w x und OSER 5 die Trennung der K~sepep t idasen zu erreichen.

1 M~LLA~¥, J . , u. V. J. WOOLL~¥: J. of Physiol. 47, 339 (1913), 2 K I E R M E I E R , F R . , U. E . C O D U R O : Diese Z. 96, 405 (1953). 3 OLrv]~a, W. I{.: J. Gen. Microhiol. 7, 329 (1952). 4 W A L D S C t Z M I D T - L E I T Z , E . , A . K . B A L L S 11. J . W A L D S C H M I D T - G R A S E R : Zi~ . S . 37, Anm. 1. 5 HAWK, P. B., B. L. 0 s ~ u. W. I-L SVMM~RSO~: Pract~ical Physiological Chemistry. S. 367.

London: J. a. A. Churchill, Ltd. 1951.

44 J. Sc~on~iiL~,~, R. W~SKE trod If. WIN~Ell:

50 g eines durchgereiften I-Iarzerk~ses wurden mit 250 ml Glycerin DAB. 6. im M6rser sorg- fitltig angeriihrt und 18 Std. bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Zu diesem Ansatz (300:mi) wurden 900 ml Wasser gegeben, die Suspension wurde 10 min bei 3000 U/rain zentrifugiert. 100 ml der fiberstehenden LSsung warden als L6sung A abgezogen, der Rest yon 900 ml wurde mit 90 ml 0,1 n-Essigs~ure versetzt, eine flockige Fallung yon Eiwei~ abzentrifugiert und ver- worfen. 800 ml der RestlSsnng wurden mit 8 ml n-Natriumaceta% (p, 5,0) und 160 ml Tonerde- y-Suspension (85,65 rag A12Os/ml ) naeh Wn~LSTXTTER ~ versetzt, 15 rain durehgerfihrt und zentrifugiert. Die Adsorptionsrestl6sun.q T sollte die Carboxypeptidase (daneben die Proteinasen) enthalten. Der v-Niederschlag wurde zweimal mit je 500 ml 20%igem Glycerin gewasehen und das Wasehwasser verwoffen. Die Eluierung des Riickstandes erfolgte mit 250 ml 0,1 m- Na~ttPOa-LSsung, die 20% Glycerin enthielt (pz 8,2). Nach dem Anrfihren blieb das Gemisch 20 rain stehen, ansehlieBend wurde zentrffugiert. 230 ml der fiberstehenden L6sung P soltten naeh den Befunden yon WAL~SCE~IDT-LEITZ I)ipeptidase und Aminopeptidase enthalten, jedoeh frei yon Trypsin und Carboxypeptidase sein. Ein Teil dieser LSsung wurde im Vakuum bei 30 ° C auf ein Viertel des Ansgangsvolumens eingeengt (L6sung P I1). 160 ml der L6sung P wurden bei 2 ° C dureh Zngabe yon 10 ml n-Aeetatpuffer p , 3,8 und n-Essigs~ure auf p , 4,2 gebracht mxd 20 ml Eisenhydroxydsuspension (gealtert, 198 mg F%Oa/5 ml, hergestellt naeh I~&WK, OSER 11114 SUMMERSON 2) zugesetzt. Nach dem Zentrifugieren wurden zu 215 ml fiber- stehender L5snng nochmuls 15 ml Eisenhydroxyd:Suspension gegeben und dieses Verfahren mit weiteren 15 ml Suspension wiederholt. Alle Operationen wurdefl bei 2°C durchgefiihrt. Die AdsorptionsrestlSsung (LSsungAP) sollte nur die Aminopeptidase enthalten. Ein Tefl der LSsung wurde im Vakuum auf ein Drittel des Anfangsvolumens eingeengt (L6sung APII) . SchlieBlich erfolgte die Elution des ersten Eisenhydroxyd-Niederschlages mit 1 t ige r Na~I-IPO4- L6sung, die 20% Glycerin enthielt. ])as Elu~t lieferte naeh Behandlung mit Celit ~ zur Ent- fernung kolloid gel6sten Eisens und nach Filtration die klare L6sung DP, welehe nach dem Trennungsschema yon WALDSCtI1VIIDT~LEITZ nur die Dipeptidase enthalten sollte.

Die nach diesen Arbei tsg~ngen resul t ierenden L6sungen wurden auf ihre Ferment - aktivit~t~ gegeniiber den for die einzelnen Pept idasen spezifischen Subs~raten wie iiblieh gepriift.

Tabelle 5. Proteolytische Alctivitgt der Adsorptions/raktionent

Die Titrationswer%e beziehen sich auf eine Probe yon 0,5 ml, enthaltend 0,2 ml Substrat (0,05 n bzw. 0,1 n), 0,2 ml Fermentextrakt und 0,1 ml Phosphatpuffer m/15.

Fermen~16snng 5

Spaltung yon LG in . . . . . . . . . % Spaltung yon AGG in . . . . . . . . % Spaltung yon LGG in . . . . . . . . % Spaltung yon BGG in . . . . . . . . % Spaltung yon Casein (6 %ig) in ml 0,01 n-KOH

Proteolytische Aktivit~$ der Adsorptionsfraktionen

p. ~ A ~ P

7,0 29 40 7,0 - - - - 7,0 1 - - 7,8 1

P II AP I Ap II

19 __ __

DP

33 45 47 0 3

Die Wer te der Tab. 5 zeigen, dag die yon WALDSCHMIDT-LEITZ 6 ffir Pankreas- u n d Hefeproteasen sowie ffir Pept idasen der Darmschle imhaut beschriebene Frak- t ionierung, insbesondere die T r e n n u n g der Pept idasen, in dem yon uns gepriiften K~se-Glycer inext rakt nich~ gelang. Dipept idase und Aminopept idase g inger ge- me insam durch Mle F r a k t i o n e n u n d f~nden sich angereichert i m E lua t des Tonerde y- Niederschlages sowie im weiteren Verlauf des Trermungsganges im E lua t des Eisenhydroxyd-Niedersehlages.

1 WILLSTATTER, R. , I~.~RAUT U. O. ]~RBACHER: Bcr. dtsch, chem. Ges. 58, 2448 (1925). 2 HAWK, P. B., B. L. OsE~ u. W. ~t. SvMm~so~: Zit. S. 43, Anm. 5; daselbst S. 1226. s ,,Standard Super Cel" der Celite Corporation, Johns (Manville, USA.). 4 Bezeiehnungen: vgl. Text.

Sahstratbezeichnungen vgl. S. 38. WALDSCHMIDT-LEITZ, E., A. K. BALLS U. J. WALDSCII~IIDT-GI%iSER: Zit. S. 36, Anm. 3.

Beitr/~ge zur Bioehemie der K~sereifung. IX. 45

4. Aktivierungs- und Hemmungsversuche.

Zur Klg rung der Spezif i t~tsverh~l tnisse a n d des chemischen Aufbaues der Pelotidasen , insbesondere der Dipept idasen , s ind in der L i t e r a t u r zahlreiche Akt i - vierungs- wie Hemmungsve r suche mi t Metal lsalzen oder anderen Subs tanzen be- schrieben. So wird z. ]3. im Gegensatz zur Dipep t idase aus Hefe und Aspergillus orycae das entsprechende E n z y m t ier ischer H e r k u n f t du tch Mn'" und Mg'" ak t iv i e r t I. Nach M~SC~MA~N ~ vermSgen auBerdem geringe Mengen yon Co"-Sa lzen die Wirk- samke i t yon Pep t idasen aus Blu t se rum bet r~cht l ich zu steigern, ein Befund, der kfirzlich yon SChWArTZ 3 bei der g a t t e in vivo bes t~t ig t wurde.

Bei den im folgenden beschriebenen Versuchsreihen wurde zun/~chst der EinfluB einiger 3£etalls~lze auf die Aktivit~t yon Peptidasen aus Iffarzerk~se gepriift. Der Versuchsansatz (Gesamtvolumen 5 ml) enthielt: 2 ml Substrat 0,05 n bzw. 0,1 n (fiir LG), 1 ml m/15-Phospha~- puffer p~ 7,8, 1 ml Glyeerinextrakt aus einer 14 Tage gereiften KAseprobe und 1 ml Wasser bzw. MetMlsalzlSsung versehiedener Konzentration 0,01 m und 0,O01 m, bezogen auf das Ansatz- volumen. Ein Zuwaehs yon 1,00 ml 0,01 n-alkoholiseher KMilauge fiir 0,5 ml der Untersuehungs- probe entsprieht dem Maximum der Spaltung (100%) dutch die 1-Peptidasen.

Der E inf lug yon Mn", Co" und Mg" au f die Hydro ly se yon LG, L G G und B G G unte r den i ibl iehen op t ima len Bedingungen ist aus den in Tab. 6 wiedergegebenen Befunden ersiehtl ieh. Danach wirk te ein Mn"-Zusa tz fas t durehgehend s t a rk akt i - v ierend; Co"- Ionen e rh6hten lediglieh gegeniiber L G und L G G das Sloaltungs- ausmag, w~hrend sie bei B G G ausgesproehen h e m m e n d waren. Der Zusatz yon Mg ~" h e m m t e deut l ieh die Hydro ly se yon LG, w a h r e n d e r b e i L G G leieht ak t iv ie rend , bei B G G ohne EinfluB au f die Spa l tung war.

Tabelle 6. Der Ein/lufl yon Metallsalzen au/ die A ktivit~it der Kgse-Peptidasen.

Spal tung

mi~ Zusatz -con

Subst ra t Mn'" Co" 2¢Ig'"

0,01 m 0,001 m 0,01 m % % %

LG LGG BGG

ohne Zusatz

%

57 16

95 99 34

99 80 14

0,01 m 0,001 m % %

105 85 95 75 6 10

52 65 20

0,001 m %

67 61 15

Wei t e rh in wurde der E in f lug spezifischer, in der vorhergehenden Arbe i t ~ ein- gehend erSr ter te r Hemmstof fe auf die Aktivit /~t der Pep t idasen , wie der yon HCN, Na2S, Cyste in (vgl. 5), Laurylsuffon~t , D i i sop ropy l f luo rphospha t (D PFP) , Formal - d e h y d und einigen Schwermeta l l sa lzen untersueht . Die Inh ib i t o rw i rkung wurde an Glycerinextrakten aus je einem 14 und 15 Tage alten K/iseansatz geprfift. Die Sloaltungsans~tze und -bedingungen entsprachen denen der Aktivierungsver- suehe. Die Spaltung ohne Zus/~tze wurde gleich 100% gesetzt. Ergebnisse der- artiger Versuche sind in den Tab. 7 und 8 zusammengefaBt.

1 B~o~a~, E., u. O. Scm~n~n: Bioehem. Z. 308, 130 (1941). 2 MASCmUA~r, E. : Naturwiss. 28, 765, 780 (1940). 8 SChWArTZ, Tm B.: J. of Biol. Chem. 204, 61 (1953); vg]. Tm B. Scmv~Tz, F. L. E~o~,L

u. C. C. Towing: J. of Biol. Chem. 197, 381 (1952). 4 S c ~ o ~ t i L L ~ , J., 1~. WI~SK~ u. tI. WI~T~: Zit. S. 35, Anm. 1. 5 G~ASSMA~, W., u. I-I. DYCK~OF~: I-Ioppe-Seylers Z. 179, 41 (1928).

46 J. SCHOI~?CliYLLEI~, I~. WIESKE und II. WIdThs:

Tabelle 7. Der Ein/lufl yon Inhibitoren au] die Aktivitiit yon Kiise-Peptidasen. 14 Tage alter K dis ea nsatz.

Spaltung

mit Zusatz yon

Substrat'

LG LGG BGG

ohne Zusatz

%

100 100 100

too/2 °

/o

67 67

100

KCN

m[200 %

84 74

100

Na~S

m]:50 m/o7 ~50 yo )/o

86 96 26 75 80 1001

Cystein-IICl

m/100 m/250 % %

66 91 63 71 65 10

Lauryl- sulf.

m/100 %

76 57 5O

DPFP

m/100 %

99 76 95

Bei Fermentextrakten aus 14 Tage altem K~se hemmt der Zusatz von KCN deut l ich die I-Iydrolyse yon L G und L G G , n ich t aber die yon BGG. N a t r i umsu l f i d

Tabelle 8. Peptidaseaktivitiit eines 15 Tage alten Kiise- ansatzes ohne und mit Zusatz yon E//ectoren.

Substra~

LG GL GG LGG AGG BGG ChIT GGG

SDaltung

bei Zusatz yon Ohne

Zusatz

%

94 106

19 86

2 46 52

PD'"

0,002 m %

100

Ag" FormMdehyd

0,002 m 0,02 m 0,01 m % % %

64 68 89

72

43

setz t die W i r k s a m k e i t des Fer- m e n t e x t r a k t e s gegeniiber L G G s tark , gegeniiber L G und R G G sehwaeh herab. Cystein, HCI und Laury l su l fona t s ind yon deut l ich h e m m e n d e m Einf lug auf die S p a l t b a r k e i t s~mtl icher drei Subs t ra te . Die H e m m u n g der Dipep t idase durch Cyste in h a t ki irzl ieh SCEWARTZ ~ fiir die g a t t e in v ivo best/£tigt. Der Zusa tz yon Di - i sopropy l f luo rphospha t war p rak t i sch ohne W i r k u n g au f die H y d r o l y s e yon L G und BGG, h e m m e n d anfd ie jen ige yon LGG.

Bei en t sprechenden Versuchen an einer 15 Tage gereif ten K/ise-

p robe wurde zur Erg/~nzung fr i iherer Un te r suehungen die P e p t i d a s e a k t i v i t ~ t an einer grSl3eren Anzah l yon P e p t i d s u b s t r a t e n z . T . auch ohne Zusa tz von Effee- to ren gepriif t . Der hier in l~ede s tehende E x t r a k t hydro lys ie r t e Leue in ent- ha l t ende D i p e p t i d a s e - S u b s t r a t e p rak t i sch 100%ig. Aueh die Aminopep t idasen- ak t i v i t~ t war be im Leuc inde r iva t L G G bedeu tend h6her als bei A G G . Subs t r a t e fiir Ca rboxypep t ida se wurden zu e twa 4 0 - - 5 0 % gespal ten. Ba r Zusa tz yon Ag ' - Ionen sowie yon F o r m M d e h y d i ib te einen deut l ieh h e m m e n d e n EinfluB auf die Spal- tungsgesehwindigke i t der drei un te r sueh ten Pep t ide aus, wghrend P b " - I o n e n ohne oder yon nur m~Biger W i r k u n g waren.

5. Das Verhalten der Pep t idasen bei Dia lyse yon Fermentez t rak ten . Zur weiteren Kennzeiehnung der K~sepeptidasen wurde ehl Glyeerinextrakt aus 15 Tage

gereiftem K~tse der Dialyse unterworfen, i5 ml dieses Extraktes (p~ 7,2; 8,12 nag N/ml) wurden im Cellophansehlaueh mit etwas Toluol fibersehiehtet und 20 Std. zun~ehst gegen flieBendes Leitungswasser, ansehliegend 22 Std. bei 4 ° C gegen desk Wasser dialysiert. Beim Vergleieh des Dialysates mit einer unter denselben Bedingungen aufbewahrten undialysierten Extrakt- probe wurde die Vohmzunahme der dialysierten L6sung im Versuehsansatz berfieksiehtigt.

Na~S-Konzentration m]1500. SC~W~TZ, Tm ]3.: Zit. S. 45, Anm. 3.

Beitr~ge zur Bioehemie der K/~sereifung. IX. 47

Tab. 9 Zeigt, dal~ dnrch die Dialyse prakLiseh kein Aktivit/~LsverlusL des Extraktes gegeniiber LG, LGG und BGG eingetreLen war, obgleieh etwa die H/ilfte der SLick- stoffsubstanz im Verlauf der Dialyse abwanderte. Die Entfernung niedermolekularer Ballaststoffe durch Dialyse sLellt somiL eine wohlgeeigneLe MeLhode znr teilweisen Reinigung der PeptidasenexLrakte dar. GleichzeiLig erweisen die Versuche eine relaLiv hohe BesL/~ndigkeiL der Peptidasen, die auch nach 44 Std. noch ihre volle Aktivit/~L in den Glycerinextrakten bewahrten.

6. Die Spaltung von Carbonaphthoxy-d,l-phenylalanin durch K~ise-Glycerinextrakte.

Bei allen Untersuchungen hatte sich gezeigt, dab yon den geprfiften Peptidase- Lypen die Carboxypeptidase weitaus am geringsten im Enzymgemisch der K~se- extrakte vertreten ist. Wir haben zur wei- teren Kennzeichnung dieser Peptidasefrak- Lion em m lungster ZeiL yon RAw~ und SELIC~A~ 1 beschriebenes SubstraL heran- gezogen, das nach Angaben dieser Autoren die grundlegenden sLrukturellen Forderungen eines Substrates ffir Carboxypep~idase er- fiillL: das Carbonaphthoxy-d,l-phenylManin (CNP). Es wird durch kristMlisierte Carb- oxypeptidase und PankreaLin, nicht dureh kristallisiertes Trypsin, Chymotrypsin und Pepsin hydrolysiert. Das SpalLprodukL Naphthylkohlens~ure deearboxyliert spontan

Tabelle 9. Der Einflu/3 der Dialyse au/ die Peptidasenaktivitdit eines Glycerin/erment-

extra/ctes.

. Subs~rat

Spaltung dutch Glycerinextrakb

un- 44 Std. 44 Std. behandelt aufbewahrt dialysiert

% % %

LG I 94 LGG 86 BGG 44

101 84 43

98 81 37

und liefert soforL fl-NaphLhol, welches mit einem Diazoniumsalz zu einem unl5slichen AzofarbsLoff gekuppelt werden kann. Zur quanLitativen Bestimmung der EnzymaktiviL~L wird der Azofarbstoff aus tetrazotiertem DiorLhoanisidin und zwei Molekeln fl-Naphthol gebildet und naeh der ExLraktion mit ALhylaceLaL die Farbin~ensit~L photometrisch bestimmt. Der Bestimmung liegL also dieselbe l~eaktion wie bei der Messung der ChymotrypsinakLiviL~t mittels N-AceLyl-d,l-phenylalanin-fl-naphthylester zugrunde. Demzufolge konnte ffir unsere Untersuchungen bei der Benutzung yon CNP als Substrat zur Messung der hydrolysierenden Wirkung yon zwei verschiedenen K~se- exLrakten sowie yon Pankreatin (Merck) nnd kristallisiertem Trypsin nach der friiher gegebenen Arbeitsvorschrift verfahren werden ~.

Der Versuchsansatz yon 5 ml enthielt 2 m] einer 0,01 m-CNP-Stamml6sung (33,5 mg in 100 ml Aceton-Wasser}, 2 ml Veronalpuffer p~ 7,8 und I ml FermentlSsung. Nach Zusatz yon 0,1 ml Toluol wurden die Ansgtze mit den entsprechenden Fermen~16sungen 2 Std. (bei Pan- krea~in) bzw. 22 Std. (bei kristallisiertem Trypsin und bei den Kgseextrakten) bebriitet (37 ° C). Als t(ompensationsl6sung bei der colorimetrischen Messung dienten gleichlaufend bebrtitet~ Proben, die an Stelle des Substrates 2 ml Wasser enthieltem Um die erhebliche Selbstspaltung des Substrates zu erfassen, wurden auBerdem Kon~rollen ohne Fermentl6sung angesetzt und gegen Wasser colorimetriert. Die weitere Behandlung s/~mtlicher Ans/~tze erfolgte vor und nach Ablauf der Reaktionszeib gem/~g frtiheren Axlgaben. An Hand einer Eichkurve wurde aus dem Zuwachs der Extinktionswerte naeh Abzug der Kontrollen die aus dem Substrat abgespaltene Menge fl-Naph~hol ermit~elt.

Wie aus Tab. 10 hervorgeht, lieferLen die Modellversuche mit kristallisiertem Trypsin nnd mit Pankreatin die erwarteten Ergebnisse.

1 RAv~, It. A., u. A. M. SnLI~MA~: J. of Biol. Chem. 190, 391 (1951). 2 Setro~id~n~, J., R. WInsx~ u. It. YVI~c~E~: Zit. S. 35, Anm. 1.

48 J. SCHO~t~LLEa, ~ . WIES~:E und H. WInTeR:

Tabelle 10. Hydrolyse von CN P durch verschiedene Ferment- 16sungen und Glycerinextralcte (Pu" Wert 7,6).

I Bebrtltungs- Zuwaehs an ]Ferment ze i t fi-Naphthol

Std. mg

Pankreatin (Merck) (2 rag) . . [ 2 0,013 Trypsin, krist. (1 mg) . . . . ] 22 0 Glycerinextrak~ I . . . . . . I 22 0 Glycerinextrakt I I . . . . . . [ 22 0

Die l~ichtspaltbarkeit des Substrates durch die Ferment- extrakte aus 14 (Extrakt I) bzw. 15 (Extrakt I I ) Tage gerefftem K~se zeigt die Un- wirksamkeit der K~se-Carb- oxypeptidase gegenfiber CNP. Damit reih~ sich dieses ](~se- enzym in Carboxypeptidase- typen anderer Art ein, wie

etwa solche aus verschiedenen Gewebshomogenaten yon l~atte, Meerschweinchen oder Mensch, bei denen fibereinstimmend mit unseren Befunden RAvI~ und SELm- MA~ 1 gleichfalls keine Carboxypeptidaseaktivitgt gegeniiber CNP feststellen konnten.

Diskussion der Ergebnisse.

Aus der Spaltbarkeit zahlreicher Peptidsubstrate, welche die strukturelten For- derungen fiir Dipeptidasen, Aminopeptidasen und Carboxypeptidasen erfiillen, geht die Anwesenheit yon Enzymen der genannten Art in Fermentext rakten aus reifem Harzerkase hervor. Auch der unterschiedliche Verlauf der p.-Aktiviti~tskurven sowie die Abstufungen in den Aktivi taten gegeniiber spezifischen Substraten sprechen flit das Vorliegen yon versehiedenen Peptidasen. Die hier untersuchten Fermente sind zum gr5i~ten Tefl nur schwach gebunden, da sic unter den gegebenen Ver- suchsbedingungen sehon bei einmaliger Extrakt ion mit Glycerin-Wasser herausgelSst werden; sic geh5ren also zu den Lyo-Enzymen. Etwa vorhandene Desmo-An- teile scheinen - - nach den Ergebnissen bei der Behandlung der Ki~semasse mit fliissiger Luft - - sehr lest an die Zellstruktur gebunden zu sein.

Das Adsorptionsverhalten der Dipeptidase und Aminopeptidase aus Ki~se- extrakten gegeniiber Eisenhydroxyd-Suspension entsprieht nicht dem fiir Pepti- dasen yon Darmschleimhaut und Hefe aus der Literatur bekannt gewordenen. Die Adsorptionsteehnik scheint jedoch aussichtsreich ffir die Anreicherung beider Fer- mente aus Kitseextrakten zu sein.

Da bei Beginn der Reffung fiir den Ausgangsquark ohne und mit Reifungssalz- zusatz die Enzymakt iv i ta t gegeniiber Substraten fiir alle drei Peptidasen praktiseh gleich Null ist, kSnnen die gefundenen Peptidasen - - ebenso wie dies friiher ~ fiir die K~seproteinasen erwiesen wurde - - im wesentlichen nur der Lebensti~tigkeit der Reifungspilze und -bakterien entstammen. Die im Ver]auf der Ki~sereifung mit der Verschiebung des pH-Wertes sich entwickelnde Mikroflora bildet neben den Pro- teinasen auch Peptidasen, deren Ti~tigkeit an das Vorliegen yon Proteinasenspalt- produkten, also yon Polypeptiden und Peptiden gebunden ist. Man sollte daher annehmen, dab die Peptidasen erst in spiiteren Stadien der Reffung auftreten. Dies ist aber nicht der Fall; sic entfalten vielmehr bereits in den ersten Reifungs- tagen, zusammen mit den Proteinasen, eine deutliche Aktivitiit. Hierbei ist die Fermentproduktion offenbar abh~ngig yon den Reifungsbedingungen: K~tse mit Reifungssalzzusatz weist ungleich st~rkere Peptidasenwirksamkeit auf als Ansatze, die ohne Reifungssalze gehalten waren.

Die zun~chst ansteigende und dann beim Fortschreiten der Reffung abnehmende Peptidasen- aktivit~t diirfte nicht unwesentlich durch die den Peptidasen im reffenden Ki~se verffigbaren Peptidfraktionen beding~ sein. Wir wissen, da2 Peptide fiir die in Rede stehenden Fermente

1 RAVIn, A., u. A. M. S~LIa~A~: Zi~. S. 47, Aura. 1. 2 SCHO~i2LL~a, J., R.. WI~S~:E u. I-L WI~T~: Zit. S. 35, Anm. 1.

Beitr~ge zur Biochemie der K~sereifung. IX. 49

bei verschiedenen Mikroorganismen in noch wenig geklartem Reaktionsablauf einmal als Wuchs- aktivatoren wirksam sein kSnnen, so z. B. ttistidin- ~ und Serinpeptide ~ bei Lactobacillus Del- briickii, Alanin- und Tyrosinpeptide bei Lactobacillus caseis. Zum anderen vermSgen sie in- dessen auch wachstumshemmende Wirkung zu entfalten, wie dies fiir ein dureh Bacillus subtilis produziertes Polypeptid a, und fiir verschiedene Leueinpeptide bei Echerichia coli ~ oder bei Pep- tidase aus Rinder-Darmsehleimhaut s nachgewiesen wurde. Danachwiirde zunehmende Peptidasen- aktivitat dutch wuchsfSrdernde, die gegen Ende der Reifung beobachtete VerzSgerungsphase jedoch durch hemmende Peptide mitbedingt. Uber das Stoffwechselverhalten derartiger Peptide, insbesondere die Verwertung synthetiseher Peptide durch Mutanten yon Escherichia coli haben FRv~OX mud SI~ONDS ~ eingehend berichtet.

Peptidasen mikrobieller t ierkunft zeigen nach Angaben der Literatur p.-Optima der Enzym- wirkung, die den yon nns bei ttarzerkase gefundenen entspreehen. So entfaltet die Dipeptidase der ttefe ihre optimale Wirkung bei ps 7,8, die entsprechende Aminopeptidase bei ps 7,0 s. Ffir Carboxypeptidase des Verdauungstraktes liegt der 0ptimalwert bei ps 7,5. Die frfiher erwahnten, yon GoriNg" studierten Aeidoproteolyten sowie einige Schimmelpilzarten ~° pro- duzieren Peptidasen mit einem Optimum im schwaeh alka]ischen Gebiet. Peptidasen des submers geziichteten Pilzes Gliocladium roscum allerdings hydrolysieren synthetische Peptidsubstrate

11 12 opt imal bei PH 4,8 . K o c H O L & T Y , SMITH und WEIL fanden in zellffeien Ffltraten yon Clostriaium 'histolyticum eine Oipeptidase mit einem p~-Optimum bei 7,6, eine Polypeptidase mit einem solchen bei 8,7. Die Dipeptidasen vieler Mikroorganismen wirken naeh M ~ s c ~ _ ~ ~a optimal bei p~ 7,8, die Aminopeptidasen bei p~ 7,2. Auch die Polypeptidase bzw. das Peptonspaltungs- System der Milchs~urebakterien ~ hat ein pH-Optimum yon 7,0 bzw. 6,3--7,0. Es ist jedoch zu bedenken, dab viele dieser Werte - - ~hnlich wie bei unseren .U.ntersuehungen - - an ungerei- nigten FermentlSsungen bestimmt wurden und daher oft woh] als Uberlagerungswerte verschiede- nor Peptidasewirkungen aufzufassen sind. Wie fiir die Proteinasen der Bakterien gilt aueh fiir die Peptidasen, dal~ zwar die Zahl der an der Eiwei~spaltung beteiligten Fermentsysteme ffi~ tierische Organismen weitgehend erforscht ist, " b u t comparatively few studies in detail have been made of the corresponding enzymes formed by bacteria" (GA~E~).

N a c h d e n U n t e r s u c h u n g e n f iber d e n E in f l uB spez i f i scher P e p t i d a s e - E f f e c t o r e n ~ h n e l n die K ~ s e p e p t i d a s e n bezf igl ich ih re r A k t i v i e r b a r k e i t d u r c h Mn'" u n d C o " (und z. T. a u c h d u r c h M g " ) den mo i s t en b i sher be sch r i ebenen P e p t i d a s e n t i e r i sche r u n d bak te r i e l l e r H e r k u n f t , so d e n t i e r i s chen O r g a n d i p e p t i d a s e n 1~, d e n P e p t i d a s e n aus B l u t s e r e n ~ sowie aus F o r m e l e m e n t e n des m e n s c h l i c h e n u n d t i e r i s chen B l u t e s ~s. M ~ s c ~ N ~ la fo lge r t aus de r A k t i v i e r b a r k e i t y o n D i p e p t i d a s e n aus d e n K u l t u r - f i l t r a t e n a n a e r o b e r B a k t e r i e n d u r c h F e " - u n d M n " - I o n e n , dab d ie se A n a e r o - d i p e p t i - da sen M e t a l l ( I I ) - p r o t e i d e dars te l len , Besonde r s e ine aus der D a r m s e h l e i m h a u t y o n

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50 J . SC~O]a~t)LLV~R, 1~. WI]~sx]s und t t . WINTm~: Beitrgge zur Biochemie der Ki~sereifung. IX.

SMITII nnd BERGMANN 1 bereitete Sog. 1-Leucin:amino-exopeptidase wird hochgradig spezifisch durch Mn'" und Mg'" aktiviertL Dieses Enzym entspricht der ,,Leucyl- peptidase" (,,Peptidase II") von LINDS.RST~5~-LANG ~, welche LGG und Leucyl- diglycylglycin geuau so vie Leucylglycin gut spaltet. Die im Versuchsteil beschriebe- nen Ergebnisse zeigen, da~ in der Mehrzahl der Falle Leucin enthaltende Di- und Tripeptide durch Glycerinextrakte aus HArzerkase tatsi~chlieh schneller hydrolysiert werden als Peptide, in denen diese Aminos~ure nicht vorkommt. Vielleicht sprechen diese Ergebnisse fiir die yon MASCHMANN a im Falle der Serumpeptidasen vertretene Ansicht, daI~ ,,Dipeptidase" bzw. ,,Aminopeptidase" nich~ als einheitliehe Enzyme, sondern als Gemische mehrerer substratspezifischer Fermente aufzufassen seien; dementsprechend ware auch in den yon uns geprfiften Kaseauszfigen mit einem solchen Gemiseh qualitativ und quan~itativ verschiedener Di- und Aminopeptidasen zu reehnen.

Auch bezfiglieh ihrer Hemmbarkeit dureh die fiblichen Metallinhibitoren wie KCN, Iqa~S und Cystein entsprechen die Kasepeptidasen den Di- und Amino- loeptidasen der Hefe ~, der Darmschleimhaut s sowie vielen Bakterienpeptidasen v. :Nur die Benzoylglycylglycin-spaltende Carboxypeptidase aus Kaseextrakten, welche

• allgemein bestgndiger gegeniiber Einflfissen yon Effectoren war, wurde dnrch KCN, NasS und Diisopropyffluorphosphat nicht beeinflu~t. Diese Befunde stehen im Einldang mit Angaben der Literatur aus jfingster Zei~ (NS~U~ATH und DE MARIAS; SMI~]~, Lu~Rr und POLG~ASE 9). SM~Tg und HANSON ~° berichten allerdings, da[~ auch Carboxypeptidase durch Metallgifte, wie Sulfid und Cyanid sowie andere, organische Anionen gehemmt werde. Aus dem Ablauf derartiger ttemmungsmechanismen wurde der SchluI~ gezogen, da~ Carboxypeptidase ein Metall-Protein-Komplex mR Magnesium als aktivem Metallion sei. Die Hemmung durch verschiedene Schwer- metalle, insbesondere Ag', ist bei Peptidasen haufig zu finden. Die auch yon uns beobachtete Hemmung yon Aminopeptidase und Dipeptidase durch Formaldehyd wird auf einen Umsatz des Inhibitors mit der freien Aminogruppe des Substrates zuriickgeffihrt ~. Aus der Hemmbarkeit yon Aminopeptidase und Dipeptidase des Harzerki~ses dutch die erwi~hnten Metallgifte geht hervor, da2 diese Enzyme hier zusammen mi~ Metallionen vorkommen. I~ach den Ergebnissen der Dialyse ist jedoch das Vorliegen dialysabler, niedermolekularer Coenzyme bei den in K~se- extrakten enthaltenen Peptidasen nicht anzunehmen. Aueh SCHA~ES und l~oux ~ hal~en bei Here die Annahme eines dialysab]en, organischen Coenzyms fiir fiber- flfissig. Zum Abschlu2 sei kurz au f ein anderes Problem verwiesen, das mR dem Vorkommen der Peptide in reifendem Kase eng verbunden ist. Bekanntlich spielen Peptide verschiedener Art bei der Synthese yon Proteinen eine l~olle, Dieser noch wenig erforschte, doch eindeutig nachgewiesene, z. T. yon Aminosauren ausgehende Eiweil~aufbau fiihrt fiber niedermolekulare Peptide zu den sog. ,,Plasteinen". Die

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10 S~IT~, E. L., u. t t . T. I - I ~ s o ~ : J . of Biol. Chem. 176, 997 (1949). z~ Vg]. T~. BERSI~: Zit. S. 37, Anm. 4; daselbst S. 108.

~-L lVlAIR-WALDBURG und W. STU~: Znm Nachweis yon Konservierungsmitteln in Kase. 51

Umkehrbarkeit prote01ytiseher Hydrolysen hat schon BER¢~ANN ~ gezeigt, spi~ter wurde sie yon versehiedenen Autoren (vgl. z .B. V~T~_WEN ~ und B~]~]~R a) be- statigt. Sie dfirfte im proteolytischen Fermentsystem der K~tsereifung zweffellos eine Rolle spielen.

Zusammenfassung.

Naeh Prfifung verschiedener Verfahren zur Gewinnung aktiver, loeptidasen- haltiger FermentextraktlSsungen aus Harzerkase wurde an Glycerin-Wasser- Extrakten die Fermentaktivitat gegenfiber synthetisehen, ffir Dipeptidase, Amino- peptidase und Carboxypeptidase spezffischen Substraten bestimmt. Alle benutzten Peptidsubstrate wurden bei p . 7~8 gut gespalten, der Spaltungsgrad betrug ffir Dipeptidasen 70--100~o, ffir Aminopeptidasen 60--90% und Ffir Carboxypeptidasen 10--40~o, die entsprechenden p.-Optima lagen ffir die Dipeptidase bei.etwa p~ 7,8, ffir die beiden anderen Fermente bei p~ 7,0--7,2. Im Verlaufe einer 26tagigen Kasereffung (mit und ohne Reffungssa]zen) steigt die Wirksamkeit der Peptidasen gegenfiber d,l-Leucylglycin und Benzoylglyeylglycin in den ersten 8 Tagen stark, gegenfiber 1-Leueylglyeylglycin kaum an und strebt einem Grenzwert zu. Im Extrakt aus Ki~se mit Reifungssalzen ist die Aktiviti~t gegenfiber allen drei Substraten deutlieh hSher. Die Hydrolyse yon Benzoylglyeylglycin dutch Kaseextrakte ent- spricht einer l~eaktion nullter, die Spaltung yon d,l~Leueylglycin und 1-Leueyl- glycylglycin einer solehen erster Ordnung. Die Peptidasenaktivitat ist relativ hitze- stabil, durch langeres Erhitzen geht sie vollkommen verloren. Dialyse beeinfluBt sie nicht. Aktivierungs- und Hemmungsversuche mit verschiedenen Substanzen zeigen, dal~ die in Rede stehenden Peptidasen weitgehend analoges Verhalten wie die aus Here, Bakterien und tierischen Geweben stammenden Fermente zeigen.

Zum Nachweis von Konservierungsmitte!n in K~ise und Schmelzk~ise.

~-0171

H. MAIR-WALDBURG lind W. STURM.

Mitteilung aus der .Milchwirtscha]tlichen Untersuchungs- und Versuchsanstalt Kempten.

(Eingegangen am 12. Juni 1954.)

An VerSffentlichungen fiber dieses Thema sind besonders die beiden grund- legenden Arbeiten yon SCHWARZ, F I s c m ~ und KA~L]~T t bzw. SchmAlz und KA~ILEiaT 5 zu nennen. SCHWARZ und Mitarbeiter beschreiben vor allem die Ver- fahren der Mikrosublimation und der Wasserdampfdestillation, mit deren Hilfe

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