Als Rod MacKinnon am Neujahrstag 1998 er-wachte, fürchtete er, dass alles nur ein Traumgewesen sein könnte. Bis spät in die Nachthatte er an der Synchrotron-Strahlungsquelleder Cornell-Universität in Ithaka (NY) Datenaufgenommen, um die Struktur eines Kalium-kanals aus der Zellmembran zu ermitteln – einer Art Schleuse für geladene Teilchen. Sei-ne Kollegen waren nach Hause gegangen,und er hatte alleine weitergearbeitet. Mitter-nacht war vorüber, und mit jeder Neuberech-nung der Daten gewann das Bild des Kanalsauf seinem Computerschirm an Schärfe.Schließlich begannen sich die Umrisse ein-zelner Kaliumionen abzuzeichnen, aufgereihtwie die Spielkugeln eines Flipper-Automaten

– genauso, wie es Alan Hodgkin fast fünfzigJahre zuvor prophezeit hatte: „Ions must beconstrained to move in a single file, and there should on average, be several ions in the channel at any moment“. MacKinnon wartotal aus dem Häuschen...

FESTGESETZT: EIN MOLEKÜL IN HANDSCHELLEN

Es war kein Traum. Tatsächlich hatte RodMacKinnon eine wissenschaftliche Glanztatvollbracht, die ihm fünf Jahre später den No-belpreis für Chemie einbringen sollte. Dabei

hatten viele Kollegen die Erfolgsaussichtenvon MacKinnons Vorhaben, die Struktur vonIonenkanälen zu enthüllen, stark bezweifelt.Es galt als extrem schwierig, tierische oderpflanzliche Membranproteine für Röntgen-struktur-Untersuchungen zu kristallisieren(siehe Kasten S. 4). Gewohnt, sich einzelnin eine Lipidschicht einzubetten, zeigenMembranproteine nämlich wenig Neigung,sich mit ihresgleichen zu einem Kristall zu-sammenzulagern. Warum kam der Amerika-ner zum Erfolg, wo andere gescheitert wa-ren? Zunächst wählte MacKinnon für seineArbeiten einen Ionenkanal, der aus einemsehr wärmeliebenden (hyperthermophilen)Bakterium stammt. Die Proteine solcher

Organismen erlangen die für ihre Funktionnotwendige Beweglichkeit erst bei hohenTemperaturen, im Bereich um 20°C sind siesehr viel starrer als entwicklungsgeschicht-lich verwandte Moleküle anderer Organis-men. Sie lassen sich daher etwas einfacherin eine gemeinsame Form bringen. Diesen ersten Kristallen fehlte aber immer noch dienotwendige exakte innere Ordnung. Die Forscher mussten daher zu einem weiterenTrick greifen: Um das Proteinmolekül endgül-tig festzusetzen, entwickelten sie einenmonoklonalen Antikörper, der sich mit ei-ner speziellen Bindungsstelle genau an jene

MAXBION E U G I E R I G A U F W I S S E N S C H A F T

AUSGABE 15FRÜHJAHR

2004

Spannung auf allen Kanälen – Wie Ionen durch die Zellmembran schlüpfen

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Ionenkanäle (orange) sind auf den Transport anorganischer Ionen(rot bzw. dunkelgrün) spezialisierteProteine, die in die Membran (grün)von Zellen eingebettet sind.

Region des Kanalproteins heftet, in der of-fenbar die größte Beweglichkeit herrscht.Auf die unspezifischen Teile des Antikörperskonnten die Forscher im weiteren verzichten– für ihre Kristallisationsexperimente nutz-ten sie lediglich das spezifische Teilstück,das so genannte Fab-Fragment. Die damithergestellten Kristalle lieferten dann dieRöntgenbeugungsdaten, aus denen sich jenehoch aufgelöste Struktur des Ionenkanals ab-leiten ließ, die im Mai 1998 die Titelseite derrenommierten Fachzeitschrift Nature zierte.

Das war nahezu ein halbes Jahrhundertnachdem Alan Hodgkin, Andrew Huxley undBernhard Katz in Großbritannien Aktionspo-tenziale am Riesenaxon des Tintenfischesuntersucht hatten. Ihre Messungen bestätig-ten das so genannte Membrankonzept: Danach basieren alle bekannten elektrischenSignale – Aktionspotenziale, synaptischeSignale und Rezeptorpotenziale – auf Ände-rungen in der Membranpermeabilität, alsoder Durchlässigkeit der Membran für Ionen.Um die bei einem Aktionspotenzial auftre-tenden Änderungen in der Leitfähigkeit derMembran formal beschreiben zu können,entwickelten Hodgkin und Huxley die Vor-stellung von spannungsgeregelten Ionen-kanälen. Dafür erhielten die beiden Physiolo-gen aus Cambridge 1963 den Nobelpreis fürMedizin. Die Bezeichnung Natriumkanal undKaliumkanal wurde seither vielfach benutzt,obwohl es keinen direkten Beweis für dieExistenz solcher Kanäle auf der Basis biolo-gischer Präparationen gab.

Im Falle künstlicher Membranen war das an-ders. Diese „black lipid membranes“ dientenseit Ende der 1960er Jahre als experimentel-les Modellsystem und ähnelten in vielerleiHinsicht der Lipidmembran lebender Zellen. Die Membranen stellten sehr guteIsolatoren dar; aber versetzt mit Antibiotikaoder Proteinen wurden sie elektrisch leit-fähig. Weil der hindurch fließende Stromsich stufenartig änderte, vermuteten dieWissenschaftler, dass einzelne Proteinmo-leküle Kanäle durch die künstliche Membranbilden, wobei die Stufen dem Öffnen undSchließen dieser Kanäle entsprechen. Ähnli-che Untersuchungen an biologischen Memb-ranen ließen sich zu diesem Zeitpunkt nochnicht durchführen. Die Methoden zur Mes-sung elektrischer Ströme an lebenden Zellenlieferten ein Hintergrundrauschen, das zwarnur zehn Milliardstel Ampere (100 pA) be-trug, damit aber immer noch hundert Malgrößer war, als die an den künstlichen Memb-ranen beobachteten Einzelkanalströme.Also mussten die Forscher über neue Mess-methoden nachdenken.

Am Max-Planck-Institut in München tatendas Anfang der 1970er Jahre Erwin Neherund Bert Sakmann. Die Messgeräte wür-den, so die Überlegung der beiden Wissenschaftler, nur dann mit der ge-wünschten Empfindlichkeit ansprechen,wenn es gelänge, aus der Zellmembran einsehr kleines Areal zu isolieren (einenMembranfleck oder „patch“). Dazu benutz-ten sie eine mit einer elektrisch leitendenFlüssigkeit gefüllte Glaspipette, die sieauf eine enzymatisch gereinigte Muskel-faser aufsetzten – in der Hoffnung auf die-se Weise einige wenige Ionenkanäle vonder übrigen Membran isolieren zu könnenund damit ein klares Messsignal zu erhal-ten. Es erwies sich allerdings als äußerstschwierig, eine dichte Verbindung zwi-schen der Glaspipette und der Membranherzustellen. Die beiden Max-Planck-Forscher kämpften mit Lecks, durch wel-che die Flüssigkeiten außerhalb und inner-halb der Pipette in Kontakt gerieten. Alsooptimierten sie die Pipettenspitze und rei-nigten die Zelloberfläche noch sorgsamer.

LAUSCHANGRIFF AUF DIE ZELLMEMBRAN

1976 wurden ihre Mühen endlich belohnt:Erstmals konnten die Wissenschaftler ander neuromuskulären Synapse, der Kon-taktstelle zwischen Nervenfaser und Mus-kelzelle, Ströme durch einzelne Kanäle beobachten. Diese ersten Messungen bestätigten viele ältere Annahmen überEinzelkanalströme – insbesondere die Ver-mutung, dass die elektrischen Signale inPulsen stets gleicher Amplitude (Strom-größe), aber von unterschiedlicher Dauerauftreten. Einige Jahre später entdecktenNeher und Sakmann durch Zufall, dasssich der elektrische Widerstand der Sig-nalquelle um mehrere Zehnerpotenzen aufmehr als eine Milliarde Ohm (GΩ) erhöhenließ, wenn man in der Glaspipette einenkleinen Unterdruck erzeugte und so denMembranfleck leicht ansaugte. Damitwurde das Hintergrundrauschen noch ge-ringer, und die Forscher konnten nun auchIonenkanäle anderer Synapsen-Typen un-tersuchen. Für diese mittlerweile zum

Durch einen halboffenen Käfig (kleines Bildoben) wird die Messapparatur im Labor vor elek-trisch störenden Einflüssen abgeschirmt. Detail-bild (links) von der Mess- und Haltepipette unter dem Mikroskopobjektiv bei einer Patch-Clamp-Messung. (Fotos: Wolfgang Filser)

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Standard in den elektrophysiologischenForschungslabors zählende Methode, die„Patch-Clamp-Technik“, bekamen diebeiden Deutschen 1991 den Nobelpreis fürMedizin (Abb. B).

EIN PASSGENAUER TUNNEL FÜR IONEN

Auch Nobelpreisträger Rod MacKinnon hat-te zunächst mit der Patch-Clamp-Technikversucht, die Eigenschaften von Ionen-kanälen zu erforschen. Dazu veränderte erSchlüsselstellen des Kanals mit gentechni-schen Methoden – er tauschte also be-stimmte Aminosäuren aus – und prüfteanschließend, wie sich das auf die Kanal-eigenschaften (z. B. die Leitfähigkeit) aus-wirkte. Auf diese Weise konnte ergrundsätzliche Aussagen zur Struktur desvon ihm untersuchten bakteriellen Kalium-kanals treffen: Demnach besteht diese Ionenschleuse aus vier Untereinheiten, diedie Zellmembran durchspannen und sichdabei um eine zentrale Pore gruppieren.MacKinnon konnte genau zeigen, welcheder Aminosäuren die Selektivität des Kanals festlegen – ihn also nur für Kalium-ionen, nicht aber für andere Ladungsträgerdurchlässig machen. Zu ähnlichen Einsichtenwar man zuvor schon beim Studium von Nat-rium leitenden Kanälen gelangt. Doch allediese Ergebnisse warfen neue Fragen auf,die sich mit molekularbiologischen und elek-trophysiologischen Methoden alleine nichtbeantworten ließen. Wie waren die Unter-einheiten räumlich angeordnet? Und wiewar es möglich, dass diese Kanäle einer-seits hochselektiv waren, andererseits aberenorme Durchflussraten erlaubten? So wer-den Kaliumionen hundert Mal besser gelei-tet als die kleineren Natriumionen (pro Milli-sekunde strömen etwa 10.000 Kaliumionendurch die Membran).

Um diese Fragen zu klären, begann MacKin-non sich mit Kristallographie zu beschäf-tigen – Voraussetzung für Röntgenstruktur-Untersuchungen. Seine daraus resultieren-den Arbeiten enthüllten schließlich die mo-lekulare Basis dieses Phänomens, über dassich die Forscher jahrzehntelang den Kopfzerbrochen hatten: Die Kanalpore muss räumlich eng genug sein, um durchfließen-de Ionen in engen Kontakt zu den Wändendes Kanals zu bringen, sodass nur Ionen ei-ner bestimmten Größe und Ladung hindurchpassen. Um nacheinander diese engsteStelle des Kanals – den Selektivitäts-

filter – durchqueren zu können, müssen dieIonen nahezu alle gebundenen Wassermo-leküle abstreifen. Das tun sie nur sehr un-gern, denn diese Hydrathülle bedingt fürdas Ion einen thermodynamisch sehr günstigen Zustand. Aber die Natur zeigtsich einfallsreich: Die Kanal bildenden Polypeptidketten kleiden nämlich mit ihrenSauerstoffatomen die Innenwand des tunnelähnlichen Selektivitätsfilters aus.Sauerstoffatome sind stark elektronegativ,d. h. sie ziehen Elektronen von anderenAtomen an und laden sich dabei negativauf. Kaliumionen sind positiv und werdendaher von den negativ geladenen Sauer-stoffatomen angezogen. Der Tunnel imitiertalso quasi die „Umarmung“ der Ionendurch die Wassermoleküle. Und das er-klärt, warum sich das Kalium so bereitwil-lig „entkleidet“, um in dehydratisierterForm in die Kanalpore einzutreten. Damitdiese elektrostatische Anziehung funk-tioniert, dürfen die Entfernungen zwischenSauerstoffatomen und positivem Ion aller-dings nicht zu groß sein. Beim Kaliumkanalsind die Sauerstoffatome passgenau ange-ordnet, um ein Kaliumion unterzubringen.Vom kleineren Natriumion liegen die Ato-me dagegen zu weit entfernt – ein energe-tischer Nachteil. Das Ion bleibt ausge-schlossen, da es den Energieaufwand nichtausgleichen kann, der mit dem Verlust derWassermoleküle beim Eintritt in die Kanal-pore verbunden wäre (Abb. C).

SCHLÜSSELMOLEKÜLE IM ZELLGESCHEHEN

Ionenkanäle spielen eine universelle Rolleim „Nachrichtenwesen“ eines Organismus:

(a) Ein in die Zellmembran eingebetteter Ionen-kanal im Querschnitt. Ionenkanäle können die Ladungsträger in beide Richtungen transportieren.Die Kanalpore stellt den Selektivitätsfilter dar –hier entscheidet sich, welches Ion durchgelassenwird und welches nicht.

(b) Ionen sind in einen Komplex von Wasser-molekülen eingebunden. Für den Ionenfluss durchdie Kanalpore muss diese Hydrathülle entferntwerden, da der Porendurchmesser nur weniggrößer ist als das transportierte Ion.

(c) Die Sauerstoffatome (lila) des Selektions-filters bilden für das eintretende Kaliumion (rot) eine Umgebung, die jener außerhalb des Filtersähnelt. So können die Kaliumionen ohne erkenn-baren Widerstand aus ihrer Hydrathülle schlüpfen.

(d) Das kleinere Natriumion (dunkelgrün) passtnicht genau zwischen die Anordnung der Sauer-stoffatome des Filters. Die elektrostatischen Anzie-hungskräfte (gelb) reichen nicht aus, und die Ionenbleiben daher in der wässrigen Umgebung außer-halb des Kanals.

a

b

c

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Ihre Aufgaben reichen von der elektrischenSignalverarbeitung im Gehirn bis zu lang-samen Prozessen wie der Salz-Rückgewin-nung in der Niere. Wie viele unterschied-liche Ionenkanäle es im menschlichen Kör-per gibt, hat die Sequenzierung des Human-genoms eindrucksvoll belegt. Dabei stellenKaliumkanäle unter den Ionenkanälenwahrscheinlich die größte Proteinfamilie.Sie finden sich in den Membranen der meis-ten Zelltypen – ein Hinweis auf ihre ent-scheidende Rolle bei der Weiterleitung vonSignalen. Ihre am besten bekannte Funktionist die Regulation des Membranpotenzialsin Nervenzellen, d.h. der Aufbau und dieAufrechterhaltung einer Spannungsdiffe-renz zwischen dem Inneren und Äußeren einer Zelle. Es gibt sie aber auch in nicht-erregbaren Zellen. Die so genannten ATP-abhängigen Kaliumkanäle beispielsweisefinden sich in den meisten Organen undsind mit zahlreichen Stoffwechselvorgän-gen verknüpft – wie der Insulinausschüt-tung, der Steuerung des Muskeltonus derBlutgefäße oder der körpereigenen Antwor-ten auf Herzinfarkt und Schlaganfall. DasVerständnis der Funktion von Ionenkanälenist daher außerordentlich wichtig für dieBeantwortung medizinischer Fragen.

EIN DEPLAZIERTERKALIUMKANAL UND DIE FOLGEN

Anfang der 1990er Jahre nahmen WalterStühmer und seine Mitarbeiter am Max-Planck-Institut für experimentelle Medizinin Göttingen einen Kaliumkanal unter dieLupe, der die originelle Bezeichnung„Ether-á-go-go“, kurz EAG, trägt. Bei Mutanten der Taufliege Drosophila führtder Ausfall dieses Kanals dazu, dass sichdie kleinen Fliegen unter Einfluss desBetäubungsmittels Ether rhythmisch bewe-gen – daher der Name. Entdeckt hatten die-sen Kanal amerikanische Forscher schon1969. Zwanzig Jahre später liefertenSequenzuntersuchungen erste Hinweise,dass es sich bei EAG um einen Kaliumkanalhandelt. Analoge Gene bzw. Proteine wur-den danach bei Ratten und schließlich auchbeim Menschen nachgewiesen. Bei diesenSäugern wird die genetisch festgelegteBauanleitung für den Kanal normalerweisenur in Nervenzellen des Gehirns ausge-führt, d.h. nur hier wird das entsprechendeProtein auch tatsächlich hergestellt.

Die Göttinger Max-Planck-Forscher unter-suchten Zellen, die kein EAG1-Gen be-

saßen, und veränderten sie genetisch so,dass sie das EAG1-Protein bilden konnten.Die manipulierten Zellen wuchsen nichtnur schneller, sondern sie begannen, sichauch unabhängig von Wachstumsfaktorenzu teilen. Indem die Wissenschaftler dieseZellen Mäusen mit Immundefekt einimpf-ten, konnten sie bei den Tieren sogar dieBildung einzelner Tumore auslösen. Offen-bar greift das EAG1-Protein, wenn es irr-tümlicherweise in Geweben außerhalb desGehirns gebildet wird, in die Zellteilungein: Der Kanal wird zu einem potenziellenOnkogen, das heißt er kann Krebs aus-lösen. Diese Befunde machten die Göttin-ger hellhörig, und so begannen sie, ver-schiedene Zelllinien aus Tumorgewebenvon Menschen zu überprüfen. Tatsächlichfanden sie das EAG1-Protein in den unter-schiedlichsten Tumorproben, unter ande-rem in Lunge, Leber, Schilddrüse, Magenund Bauchspeicheldrüse. Daraus schlossendie Wissenschaftler, dass das Auftretenvon EAG1 in Geweben außerhalb des Ge-hirns ein Hinweis auf Krebs sein kann. DerKaliumkanal könnte sich somit als Marker-Protein für die Krebsdiagnose anbieten.

Doch auch für die Krebstherapie weckt dasEAG1-Protein Hoffnungen: Indem man denKanal gezielt „verstopft“, lässt sichwomöglich die Teilungsrate von Tumorzel-len und damit das Wachstum von Tumorenreduzieren. Im Experiment stellten die

Biologen fest, dass der funktionierende Ionenkanal Voraussetzung für das Tumor-wachstum ist. Die Max-Planck-Forscher su-chen deshalb nach einem Wirkstoff, derden Kanal ausschaltet – und haben inzwi-schen eine Substanz ausfindig gemacht, dieden Kanal schon bei nanomolaren Konzen-trationen blockiert. Dieser Wirkstoff, wenner sich therapeutisch einsetzen ließe, hätteden Vorteil, dass kaum Nebenwirkungen zuerwarten sind – denn an seinem ange-stammten Ort, im Zentralen Nervensystem,ist das EAG1-Protein durch die so genannteBlut-Hirn-Schranke abgeschottet.

Schlagwörter: Röntgenstruktur-Untersuchungen,monoklonale Antikörper, Aktionspotenzial, Membranper-meabilität, Lipidmembran, Einzelkanalströme, Patch-Clamp-Methode, Kristallographie, Selektivitätsfilter,elektrostatische Anziehung, OnkogenLeseempfehlung: Alberts, Johnson, Lewis, Raff,Roberts und Walter, Molekularbiologie der Zelle, Wiley-VCH Verlag, Weinheim, 2003Internet: http://www.hhmi.org/biointeractive/neuroscience/vlab.htmlhttp://pb010.anes.ucla.edu/KHTML/K_chan.htm

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Um die dreidimensionale Struktur von Molekülen zu ermitteln, benutzen Forscher die so ge-nannte Röntgen-Kristallstrukturanalyse. Bei dieser Technik wird ein enger, gebündelterRöntgenstrahl auf eine Probe von reinem Protein gelenkt. Die meisten Röntgenstrahlen pas-sieren die Probe ungehindert, ein kleiner Anteil jedoch wird von den Atomen in der Probegestreut. Handelt es sich bei der Probe um einen streng geordneten Kristall, so verstärkensich die gestreuten Wellen an einigen Punkten gegenseitig und erscheinen dann auf einemgeeigneten Röntgenstrahlendetektor jeweils als Beugungsfleck. Die Lage und Intensitätdieser Beugungsflecken enthält Informationen über die Positionen der Atome im Kristall.Aus dem vollständigen Röntgenbeugungsmuster (s. Bild) können die Forscher eine komple-xe dreidimensionale Karte der Elektronendichteverteilung ableiten. Ist die Aminosäurese-quenz des Proteins bekannt, so lässt sichmithilfe des Computers ein Atommodellberechnen. Dabei sucht der Computernach der bestmöglichen Übereinstim-mung zwischen der Proteinsequenz undder Elektronendichteverteilung. Die Zu-verlässigkeit des Modells hängt von derAuflösung der ursprünglichen kristallo-graphischen Daten ab: Eine Auflösung von 0,5 Nanometer ergibt eine schwach auf-lösende Karte des Polypeptidgerüsts; 0,15 Nanometer erlaubt dagegen eine zuverlässige Zuordnung der Nicht-Wasserstoffatome im Molekül.

L I C H T A U F P R O T E I N K R I S T A L L E

DIE „MAX“-REIHEauch unter www.max-reihe.mpg.de

BIOMAX, GEOMAX und TECHMAX erscheinenjeweils zweimal im Jahr und berichten über aktuelle Forschungsergebnisse aus den Max-Planck-Instituten vor allem für Lehrer undSchüler. Weitere Exemplare können unter folgender Adresse kostenlos bestellt werden:

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