Cyr61: Ein durch Östrogen reguliertes Markergen der ... · Endometrioseherde in der Pleura könnten auch dadurch erklärt werden, daß endometriale Zellen und Fragmente über die

Cyr61: Ein durch Östrogen reguliertes Markergen der Endometriose

Inaugural-Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades

Dr. rer. nat.

des Fachbereichs

Bio- und Geowissenschaften, Landschaftsarchitektur

an der

Universität Duisburg-Essen

vorgelegt von

Yvonne Absenger

aus Wuppertal

April 2003

Die der vorliegenden Arbeit zugrundeliegenden Experimente wurden am Institut für Anatomie

der Universität Duisburg-Essen durchgeführt.

1. Gutachter: Prof. Dr. E. Winterhager

2. Gutachter: Priv. Doz. Dr. L. Klein-Hitpaß

Vorsitzender des Prüfungsausschusses: Prof. Dr. H. Burda

Tag der mündlichen Prüfung: 17. September 2003

I

Danksagung

An dieser Stelle möchte ich allen danken, die mich bei der Durchführung dieser Doktorarbeit

unterstützt haben.

Ein besonderer Dank gilt Frau Prof. Dr. Elke Winterhager für die Überlassung des

interessanten Themas, die gute Betreuung dieser Arbeit sowie ihrer ständigen Bereitschaft

zur Diskussion.

Ebenso bedanke ich mich bei Herrn Dr. Holger Hess-Stumpp und Frau Dr. Anja Schmidt der

Schering AG für die Betreuung dieser Arbeit und die Überlassung von Testsubstanzen.

Der Abteilung für Gynäkologie des Universitätsklinikums Essen unter der Leitung von Herrn

Prof. Dr. Schindler bzw. Herrn Prof. Dr. Kimmig danke ich für die Bereitstellung der

Gewebeproben und der dazugehörigen Hormonwerte.

Bei Herrn Dr. Norbert Schütze der Orthopädischen Universitätsklinik in Würzburg möchte ich

mich für die Überlassung des Antiserums bedanken.

Ich bedanke mich bei Daniela Kottmann, Natalie Knipp und Georgia Rauter für die

Unterstützung bei der Durchführung vieler Versuche, sowie bei Dave Kittel für die Hilfe bei

der Bildbearbeitung.

Ich danke allen Mitarbeitern der Arbeitsgruppe Winterhager und dabei ganz besonders

Alexandra Gellhaus und Mark Kibschull, die mir jederzeit mit Hilfestellungen zur Verfügung

standen.

Der größte Dank gilt meinen Eltern und meinem Freund Marc Absenger, die mich mit viel

Geduld während der gesamten Zeit dieser Doktorarbeit unterstützt haben.

Die vorliegende Arbeit wurde durch die Schering AG gefördert.

II

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung............................................................................................................1

1.1 Endometriose................................................................................................1

1.1.1 Morphologie und Lokalisation der Endometrioseherde ..........................3

1.1.2 Klassifikation der Endometriose.............................................................4

1.1.3 Symptome der Endometriose und Therapieansätze ..............................4

1.1.4 Infertilität ................................................................................................7

1.1.5 Einfluß von Steroidhormonen auf die Endometriose..............................9

1.2 Angiogenese ...............................................................................................12

1.2.1 Angiogenetische Faktoren ...................................................................13

1.2.2 Angiogenese im Uterus........................................................................15

1.2.3 Angiogenese in der Endometriose .......................................................16

1.3 Cyr61, ein Protein der CCN-Familie............................................................18

1.4 Tiermodelle für die Untersuchung der Endometriose..................................20

2 Zielsetzung .......................................................................................................22

3 Material und Methoden ....................................................................................23

3.1 Feinchemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien................................23

3.2 Humane Gewebeproben .............................................................................25

3.3 Molekularbiologische Methoden..................................................................26

3.3.1 RNA-Isolierung.....................................................................................26

3.3.2 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren...................................26

3.3.3 DNase-Verdau .....................................................................................27

3.3.4 Reverse Transkription (RT)..................................................................27

3.4 Genexpressionsanalysen............................................................................28

3.4.1 Gene-Arrays.........................................................................................28

3.4.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR).......................................................28

3.4.2.1 RT-PCR ........................................................................................28

3.4.2.2 Real-time RT-PCR........................................................................30

3.5 Proteinbiochemische Methoden..................................................................32

3.5.1 Protein-Isolierung und Konzentrationsbestimmung..............................32

3.5.2 Fällung von Proteinen ..........................................................................32

3.5.3 SDS-Gelelektrophorese .......................................................................33

3.5.4 Western Blot ........................................................................................33

III

3.6 Untersuchungen im Nacktmausmodell........................................................35

3.6.1 Aufarbeitung des Gewebes..................................................................35

3.6.2 Versuchstiere .......................................................................................35

3.6.3 Transplantation der endometrialen Fragmente ....................................36

3.6.4 Behandlung der Nacktmäuse...............................................................36

3.6.5 Entnahme der transplantierten endometrialen Fragmente...................37

3.6.6 Histologische Aufarbeitung der Fragmente..........................................38

3.7 Immunhistochemische Untersuchungen .....................................................38

3.7.1 Immunhistochemischer Nachweis mit 3,3´-Diaminobenzidin (DAB) ....39

3.7.2 Immunhistochemischer Nachweis durch Fluoreszenz .........................39

3.7.3 Immunhistochemischer Nachweis von Ki67.........................................40

3.8 Statistische Auswertung..............................................................................40

4 Ergebnisse........................................................................................................41

4.1 Genexpressionsanalysen der Endometrien von Frauen mit und ohne

Endometriose..............................................................................................41

4.1.1 Validierung der Ergebnisse der „Gene-Array“ Analysen ......................42

4.1.1.1 Herunterregulierte Gene ...............................................................42

4.1.1.2 Hochregulierte Gene.....................................................................45

4.1.2 Cyr61-Expression in den endometriotischen Läsionen ........................51

4.1.3 Cyr61-Expression im Verlauf des Menstruationszyklus .......................52

4.2 Expression von Cyr61 auf Proteinebene.....................................................53

4.2.1 Western Blot ........................................................................................53

4.2.2 Immunhistochemie...............................................................................54

4.3 Untersuchungen zur hormonellen Regulation von Cyr61............................54

4.3.1 Validierung des Nacktmausmodells .....................................................55

4.3.1.1 Uterus- und Ovargewichte der Nacktmäuse .................................55

4.3.1.2 Zellhöhe und Proliferation des Uterusepithels der behandelten

Nacktmäuse..................................................................................56

4.3.2 Einfluß der hormonellen Behandlung auf die transplantierten

Fragmente ...........................................................................................58

4.3.2.1 Expression der Östrogenrezeptoren ERα und ERβ ......................59

4.3.2.2 Morphologie ..................................................................................61

4.3.2.3 Genexpression..............................................................................64

IV

4.4 Lokale Östrogensynthese in ektopen endometriotischen Läsionen? ..........69

4.4.1 Aromatase-Expression.........................................................................69

4.4.2 Expression von 17β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Typ 1 ................70

4.4.3 Expression von 17β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Typ 2 ................72

4.4.4 Expression von Cyr61 in GnRH behandelten endometriotischen

Läsionen ..............................................................................................72

4.5 Angiogenese ...............................................................................................74

4.5.1 Expression angiogenetischer Faktoren im eutopen Endometrium.......74

4.5.2 Untersuchungen zur Angiogenese im Nacktmausmodell.....................75

4.5.2.1 Zeitlicher Verlauf der Angiogenese...............................................76

4.5.2.2 Angiogenetische Faktoren im Nacktmausmodell ..........................78

4.5.2.3 Hormonelle Regulation von VEGF und bFGF...............................80

4.5.2.4 Behandlung der Nacktmäuse mit einem VEGF-Antagonisten ......82

5 Diskussion ........................................................................................................85

5.1 Veränderung des Genmusters der Endometrien der Sekretionsphase von

Endometriosepatientinnen ..........................................................................85

5.2 Regulation der Cyr61-Expression im Endometrium durch Östrogen...........87

5.3 Validierung des Nacktmausmodells für funktionelle Untersuchungen.........90

5.4 Validierung des Nacktmausmodells für die Angiogenese ...........................96

5.5 Mögliche Funktionen von Cyr61 in der Pathogenese der Endometriose...100

6 Ausblick ..........................................................................................................104

7 Zusammenfassung ........................................................................................105

8 Literatur...........................................................................................................107

9 Anhang............................................................................................................125

9.1 Primer-Sequenzen ....................................................................................125

9.2 Ergebnisse der „Gene-Array“ Analysen ....................................................126

V

Abkürzungen

17β-HSD 17β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Abb. Abbildung aFGF „acidic fibroblast growth factor“ bFGF „basic fibroblast growth factor“ bGFG-R „basic fibroblast growth factor receptor“ β-ME β-Mercaptoethanol BSA Rinder- („bovine“-) Serumalbumin bp Basenpaare cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat cDNA komplementäre („complementary“) DNA CT „Threshold-Cycle“ CTGF „connective tissue growth factor“ Cyr61 „cysteine rich protein 61“ Cx Connexin DAB 3,3´-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid DMEM Dulbecco´s Modified Eagle Medium DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxynukleosid-5´Triphosphat DTT Dithiothreitol EDTA Ethylendiamin-N,N,N´,N´-tetraessigsäure ER Östrogenrezeptor EtOH Ethanol FGF-R-1 „fibroblast growth factor receptor 1“ FITC Fluoreszeinisothiocyanat FSH Follikelstimulierendes Hormon, Follitropin GnRH „Gonadotropin Releasing Hormon“, Gonadoliberin HMVEC „human microvascular endothelial cells”, Endothelzellinie HUVEC „human umbilical vein endothelial cells”, Endothelzellinie IGFBP „insulin-like growth factor binding protein“ IgG Immunglobulin kDa Kilodalton LH Luteinisierendes Hormon, Lutropin LHRH Luteinisierendes Hormon Releasing Hormon min Minute mRNA Boten- („messenger“-) RNA Nov „nephroblastoma overexpressed“ OD optische Dichte PCR Polymerase-Kettenreaktion p.o. per oral PR Progesteronrezeptor RNA Ribonukleinsäure rpm Umdrehungen pro Minute RT Raumtemperatur sec Sekunde s.c. subkutan SCID „severe combined immunodeficient“ SDS Natrium- („sodium“-) dodecylsulfat SERM selektiver Östrogenrezeptor-Modulator Std. Stunde Tab. Tabelle Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan TSP-1 „thrombospondin type 1 repeat“ U Unit ü.N. über Nacht

VI

VEGF „vascular endothelial growth factor“ VEGF-R/KDR „vascular endothelial growth factor receptor“ VPF „vascular permeability factor“ vWC „von Willebrand factor type C repeat“ WISP „Wnt-1-induced secreted protein” w/v Gewichtsprozent

VII

Einleitung

1 Einleitung

1.1 Endometriose

Bei Endometriose handelt es sich um eine benigne Krankheit, die durch das Vorkommen von

endometrialem Gewebe außerhalb des Uterus charakterisiert ist. Sie ist eine der häufigsten

gynäkologischen Erkrankungen, von der fast 10 % aller Frauen im reproduktiven Alter

betroffen sind (Mahmood und Templeton, 1991). Endometriose wurde erstmals vor über 300

Jahren als „peritoneale Geschwüre” beschrieben, die auf der Oberfläche der Blase, des

Darms und des Uterus gefunden wurden (Shroen, 1690). Im 18. Jahrhundert schilderten

Ärzte dann zunächst einen Zusammenhang zwischen Vernarbungen, Gewebe-

Schädigungen und Unterbauchschmerzen, aber erst im 19. Jahrhundert konnte mit dem

Fortschritt der mikroskopischen Technik das Wachstum von ektopem endometrialem

Gewebe identifiziert werden (Witz, 2002). Heute werden drei verschiedene Formen der

Endometriose unterschieden (Donnez et al., 1992), die peritoneale Endometriose, die

ovarielle Endometriose und die rektovaginale Endometriose. Die Ätiologie und die

Pathogenese der Endometriose sind bis heute nicht geklärt.

Es werden unterschiedliche Theorien zur Entstehung vor allem der peritonealen

Endometriose in der Literatur diskutiert. Die älteste Vorstellung beruht auf der Annahme, daß

Endometriose in situ entweder aus Überresten des Müller-Gangs oder durch Metaplasie

entsteht (Ridley 1968; Lauchlan, 1972). Die Theorie der Metaplasie postuliert, daß

pluripotente Zellen des Coelomepithels durch Stimuli eine metaplastische Umwandlung zu

Endometrium vollziehen (Meyer 1919, Thomas 1992). Mit dieser Theorie kann die

Entstehung jeder Endometriose erklärt werden, die dort vorkommt, wo Mesothel vorhanden

ist (Suginami, 1991). In mehreren Studien wurde bereits das Auftreten von

Endometrioseherden außerhalb des Bauchraumes, z.B. in der Pleura beschrieben (Hobbs

und Bortnick, 1940; Cassina et al., 1997; Van Schil et al., 1996; Bhatia 35, 1998; Jubanyik

und Comite, 1997), was durch die Coelom-Metaplasie erklärt werden kann. Zum anderen

gibt es Beschreibungen von Männern, die wegen eines Prostatakarzinoms mit hohen

Östrogendosen therapiert wurden und während dieser Behandlung Endometrioseherde

entwickelten (Pinkert et al., 1979; Schrodt et al., 1980). Abgesehen von diesen Fallstudien

fehlt allerdings der experimentelle oder klinische Beweis für die Richtigkeit der Metaplasie-

Theorie (van der Linden, 1997). Endometrioseherde in der Pleura könnten auch dadurch

erklärt werden, daß endometriale Zellen und Fragmente über die Blut- oder Lymphbahn

transportiert worden sind (Javert, 1949; Leyendecker et al., 1995).

Die am häufigsten angenommene Implantationstheorie zur Entstehung von Endometriose,

auch als Sampson´s Theorie bezeichnet, postuliert, daß endometriale Fragmente während

der Menstruation durch die Eileiter in den Bauchraum gelangen, hier adhärieren und in

1

Einleitung

umgebendes Gewebe invadieren, so daß endometriotische Läsionen entstehen (Sampson,

1927) (Abb. 1A). Schon in den 1950er Jahren konnte gezeigt werden, daß das

Menstruationssekret vitale endometriale Zellen enthält, die zum einen kultiviert werden

können (Kettel und Stein, 1951), zum anderen in der Lage sind, an ektopischen Stellen zu

adhärieren und zu proliferieren (Ridley und Edwards, 1958). Auch durch Tierversuche an

Primaten konnte bestätigt werden, daß durch den Rückfluß von Menstruationssekret in den

Bauchraum Endometriose induziert werden kann (TeLinde und Scott, 1950; D´Hooghe et al.,

1995). Daß die retrograde Menstruation eine mögliche Ursache für die Entstehung der

Endometriose ist, wird auch durch die Beobachtung unterstützt, daß Frauen mit einer

abweichenden Anatomie, die den Abfluß des Menstruationssekrets über die Vagina hemmt,

ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung einer Endometriose besitzen (Olive und Henderson,

1987; Sanflippo et al., 1986).

E

d

e

re

vo

E

in

T

Abb. 1A: Schematische Darstellung desUterus mit Tuben und Ovarien zurVerdeutlichung der retrogradenMenstruation. B: Die sich bildendenendometriotischen Läsionen verteilensich mit unterschiedlicher Häufigkeit imgesamten Bauchraum (Schweppe,1989).

s gibt allerdings auch einige Hinweise dafür, daß das Konzept der Endometriose

ifferenzierter gesehen werden muß. Möglicherweise liegen die Ursachen der Entstehung

ndometriotischer Läsionen in einem nicht adäquat differenzierten Endometrium. Denn

trograde Menstruation scheint ein physiologischer Vorgang zu sein, der in allen Frauen

rkommt (Liu und Hitchcock, 1986). Dennoch entstehen nicht bei jeder Frau

ndometrioseherde. Zudem ist die Rezidivrate der Endometriose sehr hoch, und es kommt

sehr vielen Fällen nach einer vermeintlich erfolgreichen hormonellen und/oder operativen

herapie innerhalb eines Jahres zum erneuten Auftreten endometriotischer Läsionen

2

Einleitung

(Wheeler und Malinak, 1983). Ein weiterer Hinweis dafür, daß im Endometrium selbst die

Ursachen der Krankheit liegen könnten, ist die Korrelation von Endometriose und Infertilität.

Bei fast 60 % der Patientinnen, die sich aufgrund von Fertilitätsstörungen operativ

untersuchen lassen, wird Endometriose diagnostiziert (Ledger, 1999). Ob und welche

molekularen Unterschiede zwischen den Endometrien von Frauen mit und ohne

Endometriose bestehen, ist bis heute nicht geklärt.

1.1.1 Morphologie und Lokalisation der Endometrioseherde

Das makroskopische Bild der Endometriose kann sehr unterschiedlich sein. Die Bandbreite

der beobachteten Veränderungen ist vielgestaltig und enthält in unterschiedlicher

Zusammensetzung Drüsen- und Stromaelemente. Die optisch erkennbaren Läsionen haben

eine durchschnittliche Größe von 1-4 mm und umfassen wasserklare blasige Auflagerungen,

rote Papeln, umgeben von einer mehr oder weniger ausgeprägten Vaskularisation, gelb-

braune, blaue, schwarze und weiße Areale (Abb. 2). Diesen farblich unterschiedlichen

Gewebeveränderungen kommt eine divergente biologische Aktivität zu. Aktive Läsionen

einer peritonealen Endometriose erscheinen rot, sind hypervaskularisiert und werden

begleitet von Ödemen und entzündlichen Zellinfiltraten (Schweppe, 2002). Sie zeigen in den

Drüsen und im Stroma proliferative Aktivität, was sich anhand der Mitoserate darlegen läßt.

Außerdem sind sie parakrin aktiv, sezernieren Adhäsionsmoleküle und Wachstumsfaktoren

und induzieren Neoangiogenese. Sind die Läsionen dagegen schwarz/braun und enthalten

wenige Blutgefäße, sind sie eher inaktiv (Schweppe, 2002). Neben den peritonealen

Läsionen sind erstmals im 19. Jahrhundert auch zystische Formationen im Bereich der

Ovarien mit hämorrhagischem Inhalt als eine Form der Endometriose beschrieben worden

(Russel, 1899). Diese Zysten enthalten häufig eine zähflüssige, dunkelbraune Masse und

werden aufgrund ihres Aussehens als Schokoladenzysten bezeichnet. Sie können eine

Größe von bis zu 10 cm erreichen und erfordern eine andere Behandlung als die peritoneale

Endometriose (Schweppe, 2002).

Abb. 2: Endoskopische Darstellung einer endometriotischen Läsion, lokalisiert auf der Harnblase. Das Bild wurde übernommen aus dem Internet: www.endogyn.at/endometriose.htm.

3

Einleitung

Die Läsionen der peritonealen Endometriose treten bei etwa 60 % der Patientinnen an den

Ligamenta sacrouterina auf, man findet sie aber auch häufig im Douglas-Raum (28 %), auf

der Harnblase (15 %) oder dem Rektum (12 %) (Abb. 1B) (Schweppe, 1989). Weniger häufig

sind Läsionen am Dick- und Dünndarm, am Ureter, an der Bauchdecke, am Nabel, am

Diaphragma, in der Pleura, an der Lunge, der Gallenblase, der Milz, am Magen oder an der

Niere (Luciano, 1982) zu finden.

Eine maligne Entartung der Endometriose wird selten beobachtet, nach Schätzungen ist es

etwa 1 % (Mostoufizadeh und Scully, 1980; Scully, 1966). Die Malignome sind überwiegend

im Bereich von Ovar oder Blase anzutreffen (Schreiner, 1985). Bei höchstens 5 % der Fälle

kann sich aus einem ovariellen Endometrioseherd ein endometrioides Adenokarzinom

entwickeln (Scully, 1978). Es besteht jedoch immer die Möglichkeit, daß überall dort, wo

auch endometriale Läsionen beobachtet werden, maligne Transformationen entstehen, z.B.

am Spatium rectovaginale, am Nabel oder der Pleura (Crum et al., 1981; Christmann und

Strobel, 1985).

1.1.2 Klassifikation der Endometriose

Die Endometriose wird eingeteilt in vier verschiedene Stadien, die heute weltweit

gebräuchlichste Klassifikation ist die „Revised American Society Classification 1985” (rAFS)

(American Fertility Society, 1985). Bei der Untersuchung des kleinen Beckens wird die

Anzahl, Größe und Lokalisation (Peritoneum, Ovarien, Eileiter) der ektopen endometrialen

Läsionen vermerkt und entsprechend dem Schweregrad eine festgelegte Anzahl von

Punkten zugeordnet (Hucke und Distler, 1989). Die ermittelte Punktzahl kennzeichnet das

entsprechende Stadium der Endometriose (I = gering, II = mäßig, III = schwer, IV =

ausgedehnt). In dieser Klassifikation nicht berücksichtigt sind die unterschiedlichen

biologischen Aktivitätsmerkmale der einzelnen Läsionen. Ebensowenig werden Läsionen im

Bereich von Vagina, Darm, Blase oder anderen Lokalisationen gewichtet, sie können

allenfalls unter Besonderheiten aufgeführt werden. Um diese Unzulänglichkeiten zu

beseitigen, wird derzeit eine intensive Diskussion um die Erneuerung des

Klassifikationssystems geführt. Für vergleichende internationale Studien zur Abschätzung

der Prognose und des einzuschlagenden therapeutischen Weges scheint allerdings eine

einheitliche Klassifizierung unerläßlich, damit unterschiedliche Ergebnisse vergleichbar

gemacht werden können.

1.1.3 Symptome der Endometriose und Therapieansätze

Endometriose ist assoziiert mit einer Vielzahl von Symptomen, viele Frauen leiden vor allem

unter chronischen Unterbauchschmerzen. Diese äußern sich als sekundäre Dysmenorrhoe,

Dysparunie oder nichtzyklische Rückenschmerzen. Andere Symptome wie zyklische rektale

4

Einleitung

Blutungen, Hämaturie oder Handrang sind häufig abhängig von der Lokalisation der

endometriotischen Läsionen oder der peritonealen Entzündungsreaktion. Untypische

Lokalisationen der Läsionen, wie z.B. an der Lunge, können ungewöhnliche Symptome wie

Brustschmerzen, Pneumothorax oder zyklisches Bluthusten hervorrufen (Foster et al., 1981).

Analog dazu können sehr selten auftretende Endometrioseherde im Gehirn zu typisch

rezidivierenden Kopfschmerzen und neurologischen Ausfallerscheinungen führen (Muse,

1988). Als typisch für eine Endometriose gilt, daß sich alle Beschwerden, gleichgültig wo sie

auftreten, zur Menstruationszeit verstärken. Die Symptome können sowohl vereinzelt als

auch in Kombination auftreten, ansonsten scheint es jedoch keinen Zusammenhang zu

geben, zwischen dem Umfang des Krankheitsbildes und der Intensität des empfundenen

Schmerzes (Fedele et al., 1990). Eine eindeutige Diagnose der Endometriose ist meist nur

durch direkte Betrachtung des Abdominalraumes möglich, bei der zusätzlich häufig eine

Gewebeprobe entnommen wird. Als beste Methode zur Diagnose der Endometriose gilt die

Laparoskopie, in ungünstigen Fällen kann auch eine Laparatomie notwendig werden (Hucke

und Distler, 1989).

Seitdem die Endometriose als eine hormonabhängige Krankheit identifiziert wurde (Dizerega

et al., 1980), wurde versucht, neben der operativen Sanierung eine möglichst effektive

hormonelle Therapie zu entwickeln. Daher werden am häufigsten orale Kontrazeptiva gegen

die Symptome der Endometriose eingesetzt, seit den 1960er Jahren sind einige

hochdosierte Empfängnis-Verhütungsmittel als Behandlung gegen Endometriose anerkannt.

Leider fehlen in der Literatur Ergebnisse von klinischen Studien, die die Wirksamkeit dieser

Therapie belegen. In einer Vergleichsstudie konnte lediglich gezeigt werden, daß die

Anwendung von oralen Kontrazeptiva im Vergleich zu dem „Gonadotropin-Releasing

Hormon”- (Gonadoliberin, GnRH-) Agonisten Goserelin gleiche Erfolge in der Linderung von

menstruationsunabhängigen Schmerzen erzielen konnte, in der Behandlung von Dysparunie

war jedoch das Goserelin wirksamer (Vercellini et al., 1993).

In den 1970er Jahren wurde Danazol, ein Derivat des 17-α Ethinyltestosteron, als Therapie

gegen die Endometriose eingeführt. Durch negative Rückkopplung wird durch dieses

Androgen-Analog die Produktion des Follikelstimulierenden Hormons (Follitropin, FSH) und

des Luteinisierenden Hormons (Lutropin, LH) reduziert und das Hypothalamus-Hypophysen-

Gonaden-System zum Teil herunterreguliert. Danazol beeinflußt weiterhin das Immunsystem

durch die Supprimierung von Antikörpern gegen autologes Endometrium (Dmowski, 1995).

Die Wirkung von Danazol in der Behandlung von Endometriose-Beschwerden konnte in

vielen internationalen klinischen Studien bewiesen werden (Wheeler et al., 1992, 1993). Eine

wirksame Dosis Danazol ruft jedoch ein erhebliches Spektrum an Nebenwirkungen hervor,

wie androgene Nebenwirkungen (z.B. Gewichtszunahme, fettige Haut), sowie geringe

hypoöstrogene Nebenwirkungen und meist erträgliche systemische Nebenwirkungen wie

5

Einleitung

Kopfschmerzen, Muskelkrämpfe und Übelkeit (Shaw, 1992; Wheeler et al., 1993). Trotz

dieser Nebenwirkungen gilt Danazol als Maßstab für die Behandlung von Endometriose, der

für alle nachfolgenden Therapien einen Bezugspunkt setzt (Miller und Anderson, 1997).

Erstmals in den 1980er Jahren wurden GnRH-Agonisten zur Endometriosebehandlung

eingesetzt. Nach einer kurzen Stimulationsphase bewirken GnRH-Agonisten eine

Desensitivierung und/oder Herunterregulation der Hypophyse durch Rezeptorblockade und

damit zum Wirkungsverlust des weiterhin pulsatil abgegebenen „Luteinisierendes Hormon

Releasing Hormon” (LHRH). Als Konsequenz dieser chemischen Kastration nimmt die FSH-

und LH- Freisetzung ab, die Ovarien werden nicht mehr stimuliert, und es resultiert eine

hypogonadotrope hypoöstrogene Amenorrhoe. Die gute Wirksamkeit in der

Schmerzlinderung von GnRH-Agonisten, vor allem des häufig angewendeten

Leuprorelinacetat, konnte in klinischen Studien bewiesen werden (Dlugi et al., 1990).

Verglichen mit Danazol wurde nach sechs Monaten durch beide Therapien gleich effektiv die

Anzahl der endometriotischen Läsionen sowie die Schmerzsymptomatik reduziert (Rivlin et

al., 1990; Wheeler et al., 1992). Hauptsächlich auftretende Nebenwirkungen während der

Behandlung mit GnRH-Agonisten sind vor allem abnehmende Knochendichte und

Hitzewallungen, die hervorgerufen werden durch den niedrigen Östrogenlevel der mit GnRH-

Agonisten behandelten Patientinnen. Eine längere Therapie mit GnRH-Agonisten ist daher

nur als sog. „Add-Back“-Therapie möglich, bei der den Patientinnen gerade soviel Östrogen

verabreicht wird, um die gefährlichen Nebenwirkungen zu unterdrücken. Laut einer Studie

kann es bis zu zwei Jahre dauern, bis die Dichte der Knochen nach 6monatiger Behandlung

mit GnRH-Agonisten wiederhergestellt ist (Paoletti et al., 1996). Trotz vieler Therapien

existiert bis heute keine Behandlungsmethode, die eine vollständige Heilung der

Endometriose bewirkt, die Rezidivrate dieser Krankheit ist sehr hoch. Nach Behandlung mit

Leuprorelinacetat kommt es innerhalb eines Jahres bei 60 % der Patientinnen zum erneuten

Auftreten von Beschwerden, 28 % müssen sich einer erneuten medikamentösen bzw.

operativen Endometriosebehandlung unterziehen (Regidor et al., 1996).

6

Einleitung

1.1.4 Infertilität

Eines der am häufigsten diskutierten Symptome der Endometriose ist die Infertilität. Der

Zusammenhang von Endometriose und Infertilität scheint jedoch durch eine Anzahl von

Studien zumindest bei den Patientinnen bestätigt zu werden, die keine morphologischen

Veränderungen des Reproduktionstraktes als Ursache für die Fertilitätsstörungen aufweisen

(Garrido et al., 2000). Es existieren zudem einige Hinweise darauf, daß selbst die mildeste

Form der Endometriose Infertilität induzieren kann. Bei Frauen, die unter Infertilität leiden,

wird zunächst sehr viel häufiger Endometriose diagnostiziert als im Durchschnitt. Bis zu 60 %

der Frauen, die sich aufgrund von Fertilitätsproblemen einer Laparoskopie unterziehen,

haben Endometriose (Ledger, 1999), während im Allgemeinen ca. 10 % der Frauen im

reproduktiven Alter betroffen sind (Mahmood und Templeton, 1991). Des weiteren wurde in

Tiermodellen demonstriert, daß durch eine induzierte Endometriose die Fruchtbarkeit

reduziert wird (Schenken und Asch, 1980; Vernon und Wilson, 1985; Barragan et al., 1992).

Zudem wurde in Mäusen eine geringere Implantationsrate beobachtet, nachdem den Tieren

Peritonealflüssigkeit von Endometriosepatientinnen injiziert wurde. Mäusen, denen

Peritonealflüssigkeit von fertilen Frauen injiziert wurde, zeigten keine reduzierte

Implantationsrate (Illera et al., 2000).

Der genaue Einfluß der Endometriose auf die reduzierte Fertilität der Patientinnen ist noch

ungeklärt. Durch schwere Formen der Krankheit können Läsionen am Eileiter oder am Ovar

entstehen, die mechanisch den Eisprung oder den Eitransport beeinträchtigen. Die Ursachen

für die Fertilität in Patientinnen mit milderen Formen der Endometriose könnten unter

anderem in Fehlfunktionen bei der Entwicklung der Oozyte liegen. Tummon et al. (1988)

detektierten Fehlfunktionen des Ovars in Endometriosepatientinnen, die sich unter anderem

in einer erhöhten Anzahl von dabei durchschnittlich kleineren Follikeln äußerten. Auch

wurden geringere Östrogenspiegel in der präovulatorischen Phase und nach dem LH-Peak

gemessen (Tummon et al., 1988). Fehlregulationen der Hypophysen-Gonaden-Achse in

Patientinnen mit Endometriose wurden ebenfalls von Cahill et al. (1995) diskutiert. Diese

äußerten sich in veränderten endokrinen Funktionen der Granulosazellen, sowohl die

Progesteron-Produktion als auch die Aromatase-Funktion war herunterreguliert. In einer

anderen Studie mit ähnlichem experimentellem Design dagegen wurde eine Überproduktion

von Progesteron in der Follikelflüssigkeit und in kultivierten Granulosazellen von Frauen mit

Endometriose detektiert (Pellicer et al., 1998). Auch Defekte in der Rezeptivität des

Endometriums von Endometriosepatientinnen, die die Implantation des Embryos verhindern

könnten, werden diskutiert (Garrido et al., 2002). Kontroverse Ansichten herrschen hier vor

allem über die Expression von Integrinen, die als sensitive Indikatoren des endometrialen

Status gelten, da sich ihr Expressionsmuster während der Implantation verändert (Lessey et

al., 1994a). Während Lessey et al. (1994b) eine Herunterregulation des Integrins αvβ3 im

7

Einleitung

eutopen Endometrium von Endometriosepatientinnen beschreiben, konnte diese

Beobachtung durch andere Studien nicht bestätigt werden (Bridges et al., 1994; Creus et al.,

1998; Hii und Rogers, 1998). Zudem werden Störungen des Immunsystems mit der

Ausbildung von Antikörpern gegen das Endometrium oder Ovarialgewebe diskutiert (Kreiner

et al., 1986; Gleicher et al., 1987). Allerdings konnte bis heute nicht vollständig geklärt

werden, ob tatsächlich Antikörper existieren, die auf endometriale Proteine reagieren (Wild

und Shivers, 1985; Gleicher et al., 1987; Kennedy et al., 1990; Switchenko et al., 1991;

Fernandez-Shaw et al., 1993). Odukoya et al. (1995) detektierten in der Hälfte der Seren von

Endometriosepatientinnen Antikörper der Klasse IgG, die gegen Antigene des eutopen

Endometriums gerichtet waren. Zusätzlich zeigte sich in dieser Studie bezüglich des

Vorkommens solcher Antikörper ein signifikanter Unterschied zwischen Frauen mit und ohne

Endometriose (Odukoya et al., 1995). Diese Resultate wurden zuletzt bestätigt, dennoch ist

nicht geklärt, welche Rolle die gegen das Endometrium gerichteten Antikörper bei der

Infertilität spielen könnten (Tanaka et al., 2000).

Obwohl die Ursachen der Fertilitätsstörungen von Patientinnen mit milder Form von

Endometriose wahrscheinlich in der Krankheit begründet liegen, ist es durch die Reduktion

der Größe oder der Aktivität der endometriotischen Läsionen nicht möglich, die Fertilität der

Frauen wiederherzustellen. In klinischen Studien wurde gezeigt, daß weder die Behandlung

mit GnRH-Agonisten noch mit Danazol die Fertilitätsrate in Endometriosepatientinnen

steigern kann (Thomas und Cooke, 1987). Studien, die die Schwangerschaftsraten nach

alleinigem operativen Entfernen der Läsionen durch Laparoskopie mit den Resultaten

verglichen, nach denen die Patientinnen zunächst supprimiert und dann operiert wurden,

demonstrierten, daß die Suppression der ovariellen Hormonproduktion keine geeignete

Therapie zur Behandlung der Endometriose-assoziierten Infertilität darstellt (Hughes et al.,

1993). Diese Ergebnisse wurden durch Adamson und Pasta (1994) bestätigt, die eine

Behandlung von Endometriose nicht für sinnvoll erachten, wenn außer Infertilität keine

weiteren Symptome der Krankheit auftreten. Allerdings bestreiten auch sie nicht die

Möglichkeit, daß eine medikamentöse Behandlung vor einem operativen Eingriff von Vorteil

sein kann (Adamson und Pasta, 1994). Denn es gibt zahlreiche Hinweise dafür, daß eine

länger andauernde Behandlung mit GnRH-Agonisten vor einer Sterilitätstherapie zu einer

deutlichen Verbesserung der Schwangerschafts- und Lebendgeburtrate führt (Marcus und

Edwards, 1994; Nakamura et al., 1992; Yovich, 1991). Diese Verbesserung wird dadurch

begründet, daß die uterine Rezeptivität möglicherweise nach einem Östrogenentzug deutlich

erhöht ist (Marcus und Edwards, 1994).

8

Einleitung

1.1.5 Einfluß von Steroidhormonen auf die Endometriose

Es gibt viele Hinweise darauf, daß die vom Ovar produzierten Steroidhormone eine große

Rolle bei der Entstehung von Endometriose spielen. Erste Symptome der Krankheit

entstehen normalerweise erst nach der ersten Menstruationsblutung und nur in seltenen

Fällen wurde Endometriose in postmenopausalen Frauen beobachtet (Thomas, 1995). Wie

bereits erwähnt, zielen auch die bis heute angewandten Therapien gegen die Endometriose,

wie die Behandlung mit GnRH-Agonisten, darauf ab, die ovarielle Hormonproduktion zu

unterdrücken und damit eine Linderung der Symptome zu erzielen.

Der Phänotyp des Endometriums unterliegt zyklischen Veränderungen, die hormonell durch

das Ovar gesteuert werden. Die Wirkung der vom Ovar gebildeten Hormone Östrogen und

Progesteron wird durch die Östrogenrezeptoren ERα und ERβ sowie durch die

Progesteronrezeptoren PR-A und PR-B vermittelt. Beide Östrogenrezeptor-Isoformen, ERα

und ERβ gehören zur Superfamilie der Steroidrezeptoren. Sie sind Transkriptionsfaktoren

(Parker et al., 1993) und spielen wahrscheinlich eine wichtige Rolle in der

Wachstumsregulation des Endometriums sowie der endometriotischen Läsionen. Die beiden

wichtigsten Domänen der Rezeptoren sind eine DNA-Bindungsdomäne und eine Liganden-

Bindungsdomäne, die in den verschiedenen Rezeptoren konserviert sind (Dhingra, 1999).

Die DNA-Bindungsdomäne enthält zwei Zinkfinger-Motive, die die Bindung der Rezeptoren

an spezifische DNA-Regionen, sog. „estrogen response elements”, vermitteln (Kumar et al.,

1987). Die wichtigste Funktion der Östrogenrezeptoren ist die Aktivierung der Transkription

bestimmter Gene nach Bindung von Östrogen an den Rezeptor (Dhingra, 1999). Die beiden

Progesteronrezeptoren PR-A und PR-B gehören ebenfalls zur Familie der

Hormonrezeptoren, die in den Nukleus übertreten können (Beato, 1989). Bei PR-A handelt

es sich um ein Protein von 94 kDa, während PR-B 164 zusätzliche Aminosäuren am N-

Terminus besitzt und ein Molekulargewicht von 114 kDa aufweist (Horwitz und Alexander,

1983; Alexander et al., 1989; Lessey et al., 1983). Ob beide Isoformen durch alternatives

Splicen einer mRNA (Conneely et al., 1987) oder durch verschiedene Promotoren (Kastner

et al., 1990) entstehen, ist bis heute ebenso ungeklärt wie die genaue Funktion der beiden

Isoformen. Während PR-B als Aktivator von progesteronregulierten Genen fungiert, scheint

PR-A ein Repressor von PR-B zu sein (Tung et al., 1993; Vegeto et al., 1993).

Wie das eutope Endometrium reagieren auch die ektopen endometriotischen Läsionen

sensitiv auf die Anwesenheit von Östrogenen, sie scheinen jedoch nicht auf die gleiche

Weise auf diese Hormone anzusprechen wie das eutope Endometrium. Durch

immunhistochemische Studien, in denen parallel ektope Läsionen und das

korrespondierende eutope Endometrium einer Patientin untersucht wurden, wurden sowohl

unterschiedliche Morphologien als auch verschiedene Rezeptorenausstattungen zwischen

9

Einleitung

den Geweben festgestellt (Lessey et al., 1989; Bergquist und Ferno, 1993a). Während im

eutopen Endometrium die Expression der Östrogenrezeptoren zyklischen Schwankungen

unterworfen ist (Koji und Brenner, 1993; Matsuzaki et al., 1999), konnte dies in

endometriotischen Läsionen nicht nachgewiesen werden (Lessey et al., 1989). Beide

Östrogenrezeptor-Isoformen wurden im prämenopausalen und fetalen Uterus detektiert

(Brandenberger et al., 1997), wobei im zyklischen Endometrium vorwiegend ERα exprimiert

wird (Enmark et al., 1997). In isolierten Stromazellen aus endometriotischen Läsionen

konnten ebenfalls beide Östrogenrezeptoren nachgewiesen werden, allerdings zeigte sich

hier eine andere Verteilung der Isoformen verglichen mit Stromazellen aus eutopen

Endometrien (Brandenberger et al., 1999). In den endometriotischen Läsionen wurde eine

geringere Expression von ERα beobachtet als im eutopen Endometrium, zudem war auch

das Verhältnis von ERα zu ERβ in den Läsionen reduziert (Brandenberger et al., 1999). Da

die beiden Rezeptor-Isoformen unterschiedliche Bindungsaffinitäten zu ihren Liganden

besitzen (Kuiper et al., 1997; Tong und Perkins, 1997), könnte das unterschiedliche

Expressionsverhältnis in den endometriotischen Läsionen verglichen mit dem eutopen

Endometrium funktionelle Folgen haben. Auch wäre es therapeutisch möglich, durch

Interaktion mit den Signaltransduktionswegen beider Isoformen das Wachstum und die

Persistenz der endometriotischen Läsionen zu beeinflussen (Brandenberger et al., 1999).

Die Verteilung der Progesteronrezeptoren in endometriotischen Läsionen scheint sich

ebenfalls von der Verteilung im eutopen Endometrium zu unterscheiden. Beide

Progesteronrezeptor-Isoformen konnten im eutopen Endometrium detektiert werden und

scheinen während des Zyklus unterschiedlich stark exprimiert zu werden (Mangal et al.,

1997; Mote et al., 1999). In endometriotischen Läsionen dagegen wurde ein geringerer

Expressionslevel der Progesteron-Rezeptoren beobachtet (Prentice et al., 1992; Bergqvist

und Ferno, 1993a, b). Attia et al. (2000) konnten sogar nur PR-A in endometriotischen

Läsionen nachweisen, PR-B dagegen wurde in dieser Studie nicht detektiert. Da beide

Progesteronrezeptor-Isoformen zum einen unterschiedlichen Einfluß auf die Genexpression

haben, zum anderen sowohl zelltypspezifisch als auch promotorspezifisch induziert werden,

könnte die abweichende Expression in den endometriotischen Läsionen die Wirkung von

Progesteron in den Läsionen verändern (Attia et al., 2000). Die in den endometriotischen

Läsionen detektierte und von eutopen Endometrien abweichende Expression von

Steroidhormonrezeptoren könnte zudem ein Grund für die hohe Rezidivrate von

Endometriose sein. Durch die geringeren Expressionslevel der Hormonrezeptoren reagieren

die endometriotischen Läsionen möglicherweise nicht sensitiv genug auf endokrine

Therapien (Revelli et al., 1995).

Neben der unterschiedlichen hormonellen Ansprechbarkeit könnte allerdings auch eine

lokale Östrogensynthese in den endometriotischen Läsionen ein Grund für die hohe

10

Einleitung

Rezidivrate der Endometriose sein (Zeitoun und Bulun, 1999; Bulun et al., 2001). Bei Frauen

im reproduktiven Alter sind die Ovarien der wichtigste Ort der Östrogensynthese, diese wird

katalysiert durch das Enzym Aromatase. Aromatase wird in verschiedenen Geweben des

menschlichen Körpers exprimiert, in den Granulosazellen des Ovars, dem

Synzytiotrophoblasten der Plazenta, im Fettgewebe und im Gehirn (Simpson et al., 1994).

Durch die pulsatorische Ausschüttung des im Hypothalamus gebildeten GnRH werden von

der Adenohypophyse LH und FSH freigesetzt. Nach der Bindung des FSH an seinen G-

Protein gekoppelten Rezeptor in der Zellmembran der Granulosazellen, steigt die

intrazelluläre cAMP-Konzentration an, wodurch die Bindung der zwei Transkriptionsfaktoren

SF-1 („steroidogenic factor-1“) und CREB („cAMP response element binding protein“) an den

proximalen Promotor II des Aromatase-Gens erhöht wird (Michael et al., 1995, 1997).

Dadurch wird die Expression der Aromatase aktiviert und Östrogen im präovulatorischen

Follikel synthetisiert (Simpson et al., 1994; Michael et al., 1995). Aromatase katalysiert die

Umwandlung von Androstendion, welches in der Nebenniere oder direkt im Ovar gebildet

wird, zu Östron. Östron hat keine ausgeprägte östrogene Wirkung und wird daher durch das

Enzym 17β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Typ 1 (17β-HSD1) zu aktivem Östrogen, dem

17β-Östradiol, reduziert (Isomaa et al., 1993; Labrie et al., 1989). Ein weiteres Isoenzym,

17β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Typ 2 (17β-HSD2) katalysiert die Umwandlung von 17β-

Östradiol zu Östron und Androstendion zu Testosteron in verschiedenen Geweben wie der

Plazenta und der Leber (Wu et al., 1993). Ein hoher mRNA-Level von 17β-HSD2 wurde auch

in den Drüsenepithelzellen des humanen Endometriums während der Sekretionsphase

nachgewiesen, weshalb angenommen wird, daß dieses Enzym durch Progesteron stimuliert

wird (Casey et al., 1994; Mustonen et al., 1998). Es scheint, als sei die Inaktivierung von

Östradiol durch 17β-HSD2 im Endometrium der Sekretionsphase ein wichtiger

Schutzmechanismus dieses durch Östrogen regulierten Gewebes.

Es wurde postuliert, daß auch in endometriotischen Läsionen lokal Östrogen synthetisiert

werden kann. Während im normalen eutopen Endometrium keine Aromatase-Expression

nachweisbar ist (Noble et al., 1997), konnte in endometriotischen Läsionen ein hoher mRNA

Expressionslevel von Aromatase gefunden werden (Kitawaki et al., 1997). Weiterhin wurde

in kultivierten Stromazellen aus endometriotischen Läsionen nach Inkubation mit einem

cAMP-Analog hohe Aromatase-Aktivität detektiert (Noble et al., 1997). Zusätzlich konnte

eine Unregelmäßigkeit in der Expression der Enzyme 17β-HSD1 und 17β-HSD2 in den

endometriotischen Läsionen beobachtet werden. Während 17β-HSD1 in den Läsionen

exprimiert wird (Zeitoun et al., 1998; Labrie et al., 1989), kann 17β-HSD2 weder auf mRNA-

Ebene noch auf Proteinebene detektiert werden (Zeitoun et al., 1998). Durch die

vorhandenen Enzyme Aromatase und 17β-HSD1 kann daher zirkulierendes Androstendion

in Östradiol umgewandelt werden, der Abbau des Östradiol in das weniger östrogene Östron

11

Einleitung

wäre durch die fehlende 17β-HSD2 jedoch kaum effizient. Dadurch kann es lokal in den

endometriotischen Läsionen zu einer Synthese von Östradiol kommen, die unabhängig von

der ovariellen Östrogensynthese ist. Damit wäre es auch nicht möglich, diese

Östrogensynthese durch die medikamentöse Behandlung mit GnRH-Agonisten zu

blockieren, was eine weitere Erklärung für die hohe Rezidivrate der Endometriose wäre. Eine

postmenopausale Patientin wurde daher mit Anastrozol, einem Aromatase-Inhibitor, gegen

wiederkehrende Beschwerden bei bekannter Endometriose behandelt (Takayama et al.,

1998; Zeitoun und Bulun, 1999).

1.2 Angiogenese

Neben der hormonellen Versorgung scheint die Angiogenese bei der Entstehung der

Endometriose ebenfalls eine große Rolle zu spielen. Als Angiogenese wird der Prozeß

bezeichnet, bei dem aus einem bereits bestehenden Kapillarnetzwerk neue Blutgefäße

entstehen. Angiogenese geschieht vor allem während der embryonalen Entwicklung, im

adulten Organismus findet dieser Vorgang physiologisch nur in wenigen Geweben statt,

hierzu gehört vor allem der weibliche Reproduktionstrakt. In ovariellen Follikeln, im Corpus

luteum sowie im Endometrium erfolgt Angiogenese (Findlay, 1986; Gordon et al., 1995).

Pathologisch spielt die Bildung neuer Blutgefäße aber auch eine große Rolle während des

Tumorwachstums (Goldberg und Rosen, 1997; Zetter, 1998) und in weiteren Krankheiten

(Folkman, 1995), zu denen auch die Endometriose zählt (Smith, 1997).

Abb. 3: Schematische Darstellung derBildung neuer Blutgefäße, übernommen ausFujimoto et al. (1999). Angiogenese ist einkomplexer Vorgang, der folgende Prozesseumfaßt: Auflösung der Basalmembran durchProteasen, Migration und Proliferation vonEndothelzellen und die Ausbildunglumenhaltiger Gefäße.

12

Einleitung

Die Neubildung von Kapillaren wird von verschiedenen angiogenetischen Faktoren initiiert

und beginnt mit einem Anstieg der Kapillardurchlässigkeit (Dvorak et al., 1995) (Abb. 3).

Fibrinogen und andere Serumproteine sind dadurch in der Lage, die Kapillaren zu verlassen

und es entsteht eine lockere perivaskuläre Fibringelmatrix. In diese Fibringelmatrix können

nach einer geordneten Fragmentierung der Basalmembran durch Metalloproteinasen

Endothelzellen mit Hilfe von Adhäsionsmolekülen und Plasminogenaktivatoren einwandern.

Beim Kontakt mit der extrazellulären Matrix rollen sich die Endothelzellen ein und bilden

lumenhaltige Kapillargefäße, in die allmählich Blut einzuströmen beginnt. Der Prozeß der

Angiogenese wird mit der Neusynthese der Basalmembran abgeschlossen. Damit

verschwindet auch die vorübergehend erhöhte Gefäßdurchlässigkeit wieder, die Fibrinmatrix

wird abgebaut und durch ein reifes kollagenhaltiges Granulationsgewebe ersetzt. Die

wichtigsten angiogenetischen Faktoren, die eine Schlüsselrolle bei der Entstehung neuer

Blutgefäße spielen, sind der „basic fibroblast growth factor” (bFGF) (Klein et al., 1997) und

der „vascular endothelial growth factor” (VEGF) (Ferrara und Davis-Smith, 1997; Ferrara,

1999).

1.2.1 Angiogenetische Faktoren

Die Familie der Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGF) umfaßt bis zum jetzigen Zeitpunkt

neun Mitglieder, von denen die wichtigsten aFGF (acidic FGF) und bFGF sind. Die FGF-

Wachstumsfaktoren können mit mindestens vier unterschiedlichen Membranrezeptoren

interagieren, bei denen es sich um Tyrosinkinase-Rezeptoren handelt. FGF-Rezeptor 1

(FGF-R-1) ist der am häufigsten vorkommende Rezeptor, der in den unterschiedlichsten

Zelltypen exprimiert wird. Durch Bindung eines Wachstumsfaktors an den Rezeptor,

dimerisiert dieser und aktiviert eine Tyrosinkinase, die den Rezeptor autophosphoryliert. Der

aktivierte Rezeptor stimuliert eine Reihe von Signaltransduktionswegen in den

verschiedenen Zellen (Klint und Claesson-Welsh, 1999). bFGF war der erste aufgereinigte

Wachstumsfaktor, für den gezeigt werden konnte, daß er Angiogenese induziert (Shing et

al., 1984). bFGF stimuliert die Proliferation, Migration und Differenzierung von

Endothelzellen, glatten Muskelzellen und Fibroblasten. In diesen Zelltypen konnten auch

Rezeptoren für bFGF nachgewiesen werden (Klein et al., 1997). bFGF wurde im normalen,

nicht-schwangeren Uterus verschiedener Spezies nachgewiesen, wie im Menschen (Ferriani

et al., 1993; Sangha et al., 1997), im Affen (Samathanam et al., 1998), im Schaf (Reynolds et

al., 1998a), im Schwein (Gupta et al., 1997), in der Maus (Wordinger et al., 1994) und in der

Ratte (Rider et al., 1997). In den einzelnen Studien wurde bFGF immunhistochemisch in

unterschiedlichen Zelltypen lokalisiert, wie der Basallamina der uterinen Blutgefäße im

Endometrium und im Myometrium, in uterinen Stromazellen und der extrazellulären Matrix

sowie der Basallamina von Drüsen- und Oberflächenepithelzellen (Hyder und Stancel, 1999).

13

Einleitung

Auch der Rezeptor für bFGF, FGF-R-1, konnte in Drüsenepithelzellen, stromalen

Fibroblasten und Endothelzellen des humanen Endometriums detektiert werden (Sangha et

al., 1997). Es besteht daher die Möglichkeit, daß bFGF Einfluß auf verschiedene intrakrine,

autokrine und/oder parakrine Reaktionen ausübt. Während die Lokalisation von bFGF im

Uterus sehr genau untersucht wurde, ist die Regulation dieses Wachstumsfaktors durch

Steroidhormone bis heute ungeklärt. In kultivierten humanen Fibroblasten des Endometriums

(Fujimoto et al., 1997), verschiedenen endometrialen Krebs-Zellinien (Presta, 1988) und in

Kaninchen (Rider et al., 1997) wurde die Expression von bFGF durch Östrogene auf mRNA-

und Proteinebene gesteigert, während Progesteron in einigen Zellinien die

östrogeninduzierte Stimulation herunterregulierte (Fujimoto et al., 1997). Auf molekularer

Ebene konnte bisher nicht eindeutig geklärt werden, ob die Regulation von bFGF durch

Steroidhormone ein primärer oder ein sekundärer Effekt ist. Die Sequenz des humanen

bFGF-Gens enthält sowohl ein „progestrone response element” als auch ein „estrogen

response element” (Rider et al., 1997), funktionelle Studien sind bisher jedoch noch nicht

durchgeführt worden.

Die VEGF-Familie besteht bis zum heutigen Zeitpunkt aus fünf verschiedenen Mitgliedern

(Ferrara und Davis-Smyth, 1997; Achen et al., 1998; Carmeliet und Collen, 1998; Eriksson

und Alitalo, 1999), hierzu zählen VEGF-A (Leung et al., 1989), VEGF-B (Olson et al., 1994),

VEGF-C (Joukov et al., 1996; Lee et al., 1996) VEGF-D (Orlandini et al., 1996; Achen et al.,

1998) und PLGF („placental growth factors“) (Maglione et al., 1991). Die Bezeichnungen

VEGF-A und VEGF werden heute synonym verwendet (Breier, 2000). VEGF ist ein

multifunktionales Zytokin, daß ursprünglich in Tumorzellen identifiziert wurde, in denen es

eine Erhöhung der Kapillarpermeabilität induziert (Dvorak et al., 1995), daher wurde es

zunächst auch als VPF („vascular permeability factor“) bezeichnet. Später wurde entdeckt,

daß VEGF selektiv auf Endothelzellen wirkt und hier Angiogenese stimuliert (Ferrara und

Davis-Smyth, 1997; Ferrara, 1999). Sowohl das humane als auch das murine VEGF-Gen

besteht aus acht Exons mit sieben Introns, wobei unterschiedliche Splice-Varianten

existieren (Ferrara, 1999), die sich durch ihre Fähigkeit der Heparinbindung unterscheiden.

Anders als bFGF besitzt das VEGF-Gen eine Signalsequenz, so daß VEGF von

verschiedenen Zellen sezerniert werden kann und sowohl autokrine als auch parakrine

Funktionen bei der Angiogenese erfüllt (Hyder und Stancel, 1999). VEGF kann mit zwei

unterschiedlichen Rezeptoren interagieren, VEGF-R1 (auch als flt bezeichnet) und VEGF-R2

(auch als flk oder KDR bezeichnet). Es handelt sich hierbei um Tyrosinkinase-Rezeptoren,

die hauptsächlich aber nicht ausschließlich auf Endothelzellen exprimiert werden. Bindung

von VEGF an den Rezeptor führt zum einen zur Autophosphorylierung des Rezeptors, zum

anderen zur Phosphorylierung weiterer Faktoren, wie der Phospholipase Cγ oder dem

GTPase aktivierenden Ras-GAP. Die Aktivierung des VEGF-Rezeptors hat eine Vielzahl von

14

Einleitung

zellulären Antworten zur Folge, die eine Rolle bei der Angiogenese oder der Gewebe-

Umbildung spielen (Ferrara, 1999). Wichtigste Aufgabe des VEGF ist vor allem seine

Fähigkeit, Kapillarfenestration in vivo zu induzieren (Roberts und Palade, 1995). Während

bFGF verschiedene Zelltypen aktiviert, wirkt VEGF selektiv auf Endothelzellen. 1993 konnte

VEGF erstmals im Uterus der Maus (Shweiki et al., 1993), des Menschen (Charnock-Jones

et al., 1993) und der Ratte (Cullinan-Bove und Koos, 1993) nachgewiesen werden, seitdem

wurde es auch im Schaaf (Reynolds et al., 1998a), im Kaninchen (Das et al., 1997) und im

Affen (Greb et al., 1997) gefunden. VEGF und sein Rezeptor sind in diesen Studien im

Uterus hauptsächlich im Endometrium lokalisiert worden, seltener konnte der

Wachstumsfaktor im Myometrium identifiziert werden (Charnock-Jones et al., 1993;

Harrison-Woolrych et al., 1995; Brown et al., 1997). Auch die Expression von VEGF scheint

im weiblichen Reproduktionstrakt durch Östrogen reguliert zu werden, dies konnte für

endometriale Adenokarzinomzellen (Charnock-Jones et al., 1993), für primäre Kulturen

humaner uteriner Stromazellen (Shifren et al., 1996) sowie für Rattenuteri in vivo (Cullinan-

Bove und Koos, 1993; Hyder et al., 1996) nachgewiesen werden. Es scheint sich hier um

primäre Effekte des Östrogens zu handeln, die durch den Östrogen-Rezeptor induziert

werden, da die Induktion des VEGF sehr schnell erfolgt und durch reine Anti-Östrogene

blockiert werden kann (Hyder et al., 1997). Allerdings war es bisher nicht möglich, ein

„estrogen response element” im VEGF-Gen zu identifizieren (Hyder und Stancel, 1999).

Weniger bekannt ist bis heute die Wirkung von Progestinen auf die Expression von VEGF, in

einigen Studien wurde gezeigt, daß VEGF in humanen Stromazellen durch Progestine

induziert werden kann (Greb et al., 1997; Shifren et al., 1996).

1.2.2 Angiogenese im Uterus

Im humanen Uterus spielt Angiogenese eine sehr wichtige Rolle beim Wiederaufbau des

Stratum functionale des Endometriums nach der Menstruation und bei der Vorbereitung des

Endometriums auf die Implantation und Plazentation (Torry et al., 1996). Es ist bis heute

nicht geklärt, durch welche Mechanismen das Wachstum der Gefäße im Endometrium

kontrolliert wird oder in welcher Phase des Menstruationszyklus die Bildung neuer

Blutgefäße stattfindet (Rogers, 1996). Immunhistochemische Studien weisen darauf hin, daß

im Endometrium keine klassische Angiogenese stattfindet (Abb. 3), sondern durch

proliferierende Endothelzellen innerhalb eines Gefäßes neue Gefäße entstehen (Rogers und

Gargett, 1999). Die proliferierenden Endothelzellen wandern in das Lumen des Gefäßes ein

und teilen dieses. So entstehen aus einem Gefäß zwei Gefäße, die entweder parallel

verlaufen oder ein Netzwerk bilden können (Risau, 1997). Die wichtigsten Regulatoren der

uterinen Gefäßfunktionen und damit auch der endometrialen Angiogenese scheinen die

zirkulierenden Steroidhormone Östrogen und Progesteron zu sein (Magness, 1998; Hyder

15

Einleitung

und Stancel, 2000; Reynolds und Redmer, 2001). Die beiden wichtigsten angiogenetischen

Faktoren bFGF und VEGF werden im Uterus von ovariektomierten Schafen wenige Stunden

nach Applikation von Östrogen um das 3-10fache hochreguliert (Reynolds et al., 1998a, b).

Mit dieser Hochregulation auf mRNA-Ebene geht auch eine Steigerung der endometrialen

bFGF und VEGF Proteinexpression einher, ebenso wie eine Zunahme der uterinen

Angiogenese und der Durchblutung dieses Organs (Magness, 1998; Reynolds et al., 1998a,

b).

1.2.3 Angiogenese in der Endometriose

Endometriales Gewebe, das außerhalb des Uterus am Peritoneum adhäriert und

endometriotische Läsionen bildet, ist auf eine ausreichende Blutversorgung angewiesen,

daher erscheinen diese Läsionen unabhängig von der Morphologie und der Lokalisation in

endoskopischen Aufnahmen immer reich vaskularisiert (Abb. 2). Ähnlich wie Tumore, die

ohne eine ausreichende Blutversorgung nicht größer werden können als 3 mm3 (Folkman,

1995), scheinen auch die endometriotischen Läsionen, die außerhalb des Uterus wachsen,

eine angiogenetische Kaskade in dem Gewebe zu induzieren, an das sie adhärieren. In

laparoskopischen Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß endometriotische Läsionen

mit Blut des umgebenden Peritoneums versorgt werden (Shaw, 1993). An diesen

angiogenetischen Prozessen, die zur Entstehung von endometriotischen Läsionen führen,

sind scheinbar sowohl bFGF als auch VEGF beteiligt, allerdings erfüllen sie unterschiedliche

Funktionen. bFGF konnte immunhistochemisch in Endometrien von Frauen mit und ohne

Endometriose sowie in endometriotischen Läsionen hauptsächlich in den

Drüsenepithelzellen nachgewiesen werden (Ferriani et al., 1993). Veränderungen in der

Expression von bFGF wurden weder während des Menstruationszyklus noch zwischen den

verschiedenen Gewebetypen detektiert (Ferriani et al., 1993). In isolierten Stromazellen

normaler Endometrien und endometriotischer Läsionen konnte bFGF ebenso nachgewiesen

werden wie sein Rezeptor, bFGF-R (Di Blasio et al., 1995). Die Expressionsstärke von bFGF

war im allgemeinen in den Zellen aus endometriotischen Läsionen geringer als im eutopen

Endometrium, allerdings zeigten Zellen aus größeren Läsionen eine stärkere bFGF-

Expression (Di Blasio et al., 1995). In der Peritonealflüssigkeit von Endometriosepatientinnen

dagegen war die Konzentration von bFGF so gering, daß eine Reaktion mit seinem Rezeptor

nicht möglich war (Huang et al., 1996). bFGF scheint daher die Entwicklung von

Endometriose über autokrine und parakrine Mechanismen zu beeinflussen, die unabhängig

sind von der hormonellen Situation (Fujimoto et al., 1999).

Die Peritonealflüssigkeit mit den enthaltenen Makrophagen, Wachstumsfaktoren und

angiogenetischen Faktoren könnte bei der Entstehung von Endometriose eine große Rolle

spielen (Ramey und Archer, 1993; Halme et al., 1987). Die Peritonealflüssigkeit füllt den

16

Einleitung

Bauchraum, wo die meisten endometriotischen Läsionen gefunden werden und könnte daher

direkten Einfluß haben auf die Adhäsion der Läsionen aber auch auf deren Persistenz und

Vaskularisierung sowie die Ausweitung der Krankheit (Ramey und Archer, 1993; Koninckx et

al., 1998). Höhere Konzentrationen von VEGF wurden in der Peritonealflüssigkeit von

Frauen mit Endometriose verglichen mit Frauen ohne Endometriose detektiert (McLaren et

al., 1996b).

Es stellt sich daher die Frage, ob durch anti-angiogenetische Therapien (Leenders, 1998) die

Entwicklung von endometriotischen Läsionen verhindert werden kann. Durch den komplexen

Prozeß der Angiogenese bieten sich unterschiedliche therapeutische Ansatzpunkte, die die

VEGF-Produktion, die Bindung von VEGF an seinen Rezeptor, die Auflösung der

extrazellulären Matrix, die Proliferation oder Migration der Endothelzellen und die

Kapillarneubildung einschließen (McLaren, 2000). Untersuchungen an transplantierten

Tumoren im Tiermodell zeigten, daß vor allem die Inhibition der Bildung von VEGF und

dessen Bindung an seinen Rezeptor effektive Reduktionen des Tumorwachstums und der

Vaskularisierung zur Folge haben (Saleh et al., 1996; Benjamin und Keshet, 1997; Millauer

et al., 1996). Auch Versuche, in denen die Verfügbarkeit von VEGF durch Transfektion von

Tumorzellen mit dem löslichen VEGF-Rezeptor inhibiert wurde, zeigten nach Transplantation

der transfizierten Zellen in Nacktmäuse eine signifikante Inhibition der Implantation und des

Wachstums der Tumore (Goldman et al., 1998). Ob die in der Zukunft für die Behandlung

von Tumoren entwickelten Therapien allerdings auch bei der Behandlung der Endometriose

eingesetzt werden können, müssen weitere Versuche zeigen.

17

Einleitung

1.3 Cyr61, ein Protein der CCN-Familie

Ein weiterer angiogenetischer Faktor, der Einfluß auf die Entstehung von endometriotischen

Läsionen haben könnte, ist Cyr61 („cysteine-rich protein”), ein Protein der CCN-Familie. Die

CCN-Familie besteht bis zum heutigen Tag aus sechs strukturell homologen Proteinen, die

verschiedenste Funktionen erfüllen (Babic et al., 1998, 1999) (Abb. 4).

Abb. 4: Schematische Darstellung der strukturellen Domänen der CCN-Proteine, übernommen aus Lau und Lam (1999). IGFBP: Domäne homolog zu „insulin-like growth factor binding“-Proteinen, vWC: Domäne homolog zum „von Willebrand factor type C repeat“, TSP-1: Domäne homolog zu „thrombospondin-1“, CT: C-terminale Domäne.

Cyr61, CTGF („connective tissue growth factor”) und Nov („nephroblastoma overexpressed”)

waren die ersten drei Proteine dieser Familie, die entdeckt wurden, daher entstand der

Name „CCN”-Familie (Bork, 1993). Proteine der CCN-Familie werden sekretiert, sind an die

extrazelluläre Matrix assoziiert und regulieren zelluläre Vorgänge, wie Adhäsion, Migration

und Differenzierung. Sie sind aber auch an komplexeren Vorgängen wie der Angiogenese

und Knorpelentwicklung beteiligt, außerdem spielen sie eine Rolle während der

Wundheilung, beim Tumorwachstum und in weiteren Krankheiten (Lau und Lam, 1999).

Cyr61 war das erste Mitglied der CCN-Familie, das kloniert wurde (Lau und Nathans, 1985).

Das humane Cyr61 Gen ist lokalisiert auf dem kurzen Arm des Chromosoms 1 (1p22-31)

(Jay et al., 1997) und kodiert für ein Protein von 381 Aminosäuren mit einem

Molekulargewicht von 42 kDa (Brigstock, 1999). Das Cyr61 Protein besteht aus strukturellen

Domänen, die jeweils von einem separaten Exon kodiert werden (Lau und Lam, 1999) (Abb.

4). Durch diese einzelnen Domänen ist Cyr61 in der Lage, verschiedene Funktionen zu

induzieren. Die erste Domäne besteht aus einem Signalpeptid, das bewirkt, daß Cyr61 von

der Zelle sezerniert wird. Die zweite Domäne ist homolog zu N-terminalen Regionen von

„insulin-like growth factor binding”-Proteinen (IGFBP). Sie fungiert wahrscheinlich als

Rezeptor für Wachstumsfaktoren, und induziert vor allem Migration (Grzeszkiewicz et al.,

2002). Das dritte Exon kodiert für eine Domäne, die Homologien zum von Willebrand Faktor

Typ C (vWC) beinhaltet, mit verschiedenen Integrinen interagieren kann und durch diese

Interaktionen Migration induziert. Vom gleichen Exon kodiert wird eine variable Region, die

18

Einleitung

wahrscheinlich als Verbindung dient zwischen dem N-Terminus und dem C-Terminus.

Darauf folgt eine Domäne, die homolog ist zum Thrombospondin Typ 1 (TSP-1). Hier bindet

das Integrin α6β1, durch das Cyr61 nach Interaktion Zell-Adhäsion vermittelt. Es folgt der C-

Terminus, der den C-Termini anderer extrazellulärer Proteine wie dem von Willebrand Faktor

oder Muzinen ähnelt. Das Integrin αMβ2 und Heparansulfat Proteoglykane interagieren mit

dem C-Terminus von Cyr61 und induzieren möglicherweise die Adhäsion von Monozyten an

Cyr61 (Schober et al., 2002).

Cyr61 ist ein sekretiertes, Heparin-bindendes Protein, das in Maus-Fibroblasten durch

verschiedene Stimuli wie Serum, Wachstumsfaktoren oder Zytokinen innerhalb von Minuten

induziert werden kann (Lau und Nathans, 1985, 1987; Brunner et al., 1991). Cyr61 reguliert

verschiedene Prozesse wie Proliferation, Migration, Differenzierung und Angiogenese, alles

Vorgänge, die beim Tumorwachstum und der Metastasierung eine Rolle spielen (Lau und

Lam, 1999). Cyr61 konnte bereits in vielen Tumorzellinien identifiziert werden und scheint

wichtig zu sein für die Tumor-Genese (Babic et al., 1998). Dem widerspricht allerdings die

Beobachtung, daß Cyr61 in Prostata-Tumoren herunterreguliert ist (Pilarsky et al., 1998).

Neben Wachstumsfaktoren und Zytokinen wird Cyr61 auch durch Hormone induziert, in Uteri

von ovariektomierten Ratten steigt die Cyr61-Expression nach Zugabe von 17β-Östradiol

innerhalb weniger Stunden um das 10fache (Rivera-Gonzales et al., 1998). Sampath et al.,

(2001a) konnten zeigen, daß auch in myometrialen Fragmenten ex vivo nach Zugabe von

17β-Östradiol Cyr61 innerhalb einer Stunde um das zweifache ansteigt. Diese Induktion wird

durch den Östrogenrezeptor ERα vermittelt, da sie durch das pure Anti-Östrogen ICI inhibiert

werden kann (Sampath et al., 2001a), welches die durch den Östrogenrezeptor ERα

induzierte Transkriptionsaktivierung blockiert (Hermenegildo und Cano, 2000). Auch in der

humanen Brustkrebszellinie MCF-7 wird die Cyr61-Expression durch Östradiol innerhalb

einer Stunde stark hochreguliert und ist hier wichtig für die hormonabhängige Zellproliferation

(Sampath et al., 2001b). Zusätzlich konnte beobachtet werden, daß Cyr61 zwar nicht im

gesunden Brustgewebe exprimiert wird, aber in Tumoren von Patientinnen mit invasiven

Karzinomen (Sampath et al., 2001b). Diese Studien belegen, daß es sich bei Cyr61 um ein

östrogenreguliertes Gen handelt, allerdings konnte bisher nicht geklärt werden, ob es sich

bei dieser Reaktion um einen primären Effekt des Östrogens handelt. Nur im murinen Cyr61-

Gen konnte bis heute ein „estrogen response element” detektiert werden (Sampath et al.,

2001a), da das humane Gen jedoch in 93 % mit der Maussequenz übereinstimmt (Jay et al.,

1997), kann die Existenz dieses Elementes nicht ausgeschlossen werden.

Laut Sampath et al. (2001a) wird Cyr61 im humanen Endometrium in den

Drüsenepithelzellen exprimiert. Nähere Untersuchungen zur Regulation von Cyr61 im

19

Einleitung

Endometrium und seiner möglichen Rolle bei der Entstehung von Endometriose sind bisher

jedoch noch nicht erfolgt.

1.4 Tiermodelle für die Untersuchung der Endometriose

Für die Entstehung einer spontanen Endometriose ist die Abstoßung des Endometriums

während der Menstruation Voraussetzung, daher findet man diese physiologisch nur beim

Menschen und bei Primaten. Die geringe Verbreitung von spontaner Endometriose in Affen

und die hohe Kostenintensität dieser Versuche, limitieren den Nutzen des Affen als

Tiermodell für die Erforschung der Endometriose (MacKenzie und Casey, 1975; Fanton und

Hubbard, 1983). Um andere Tiere als experimentelles Modell nutzen zu können, ist die

operative Verpflanzung des autologen Endometriums an ektopische Orte außerhalb des

Uterus erforderlich. Solche Versuche wurden bereits an Kaninchen, Ratten oder auch Affen

durchgeführt (Schenken und Asch, 1980; Vernon und Wilson, 1985; Dunselmann et al.,

1989; Schenken et al., 1991; Sharpe et al., 1991; D´Hooghe et al., 1995). Es bestehen

allerdings signifikante phylogenetische und biochemische Unterschiede zwischen humanem

und tierischem Endometrium, so daß Beobachtungen aus diesen Versuchen nicht

zwangsläufig auf den Menschen übertragbar sind (Awwad et al., 1999). Auch die hormonelle

Regulation unterscheidet sich zwischen Mensch und Tier. Proteine, die im Endometrium von

Nagetieren durch Östrogen induziert werden, können im humanen Endometrium durch

Progesteron beeinflußt werden (Awwad et al., 1999). Als sinnvoll erscheinen daher die

Modelle, bei denen humanes Endometrium in Tiere transplantiert werden kann. Für diese Art

von Versuchen eignen sich besonders immundefiziente Mäuse. Die SCID-Maus („severe

combined immunodeficient“) besitzt weder ein intaktes T-Zellsystem, noch verfügt sie über

ein intaktes B-Zellsystem. Es konnte bereits gezeigt werden, daß verschiedene

Transplantate in diesen Mäusen wachsen, ohne abgestoßen zu werden (Phillips et al.,

1989). Awwad et al. (1999) injizierten endometriale Fragmente in die Bauchhöhle von

weiblichen SCID-Mäusen und konnten nach 14 Tagen in 96,5 % der Fälle implantiertes

Gewebe beobachten. In diesen Implantaten konnten histologisch sowohl endometriale

Drüsen als auch stromales Gewebe nachgewiesen werden, und eine hormonelle

Beeinflussung war gegeben. Andere Studien zeigten, daß auch die Nacktmaus ein

geeignetes Modell zur Untersuchung von Endometriose darstellt (Zamah et al., 1984;

Bergqvist et al., 1985; Zaino et al., 1985; Bruner et al., 1997; Grümmer et al., 2001). Die

homozygote Nacktmausmutante (nu/nu) hat eine angezüchtete Thymusaplasie, was zur

Folge hat, daß diese Mäuse nicht über ein intaktes T-Zellsystem verfügen (Wortis, 1971). Sie

besitzen jedoch ein B-Zell-Abwehrsystem, auch die „Natural Killer”-Zellen (NK-Zellen) sind

aktiv (Hebermann, 1978). Trotz dieser restlichen Immunabwehr können endometriotische

Läsionen in der Bauchhöhle von Nacktmäusen nach Injektion von endometrialen Zellen

20

Einleitung

gefunden werden (Tabibzadeh et al., 1999). Die Adhäsion und Implantation der Zellen wurde

in diesen Versuchen durch die Zugabe von Peritonealflüssigkeit von

Endometriosepatientinnen zusätzlich erhöht. Nach der Transplantation von endometrialen

Fragmenten in die Bauchhöhle von Nacktmäusen, konnten Nisolle et al. (2000a) in 87 % der

untersuchten Fälle nach 21 Tagen endometriotische Läsionen aus Drüsen und Stromazellen

detektieren. Es zeigte sich, daß die transplantierten Fragmente in der Nacktmaus

Angiogenese induzieren und einen hohen Level an VEGF aufweisen (Nisolle et al., 2000a).

Die Entstehung der Blutgefäße und das Einwachsen in die humanen Fragmente wurden von

Grümmer et al. (2001) untersucht. Bereits nach zwei Tagen konnte die Adhäsion der

humanen Fragmente an verschiedenen Organen der Nacktmaus beobachtet werden. Das

Einwachsen von Maus-Blutgefäßen in die humanen Fragmente begann nach 4 Tagen,

unabhängig vom Ort der Adhäsion der Fragmente. Insgesamt zeigte es sich, daß das

Nacktmausmodell bis zu einem Zeitraum von 14 Tagen ein geeignetes Modell zur

Untersuchung von Endometriose ist, da die humanen Fragmente ihre morphologischen

Charakteristika sowie Differenzierungsparameter behalten (Grümmer et al., 2001). Bis zu

diesem Zeitpunkt ist es damit möglich, den Einfluß verschiedener Substanzen auf die

Entwicklung und die Persistenz der transplantierten endometrialen Fragmente zu

untersuchen.

21

Zielsetzung

2 Zielsetzung

Die molekularen Mechanismen, die die Pathogenese von Endometriose beeinflussen, sind

bis heute nicht vollständig geklärt. Es existieren viele verschiedene Hinweise dafür, daß die

Ursache für die Entstehung endometriotischer Läsionen bereits in unterschiedlichen

Genexpressionsprofilen der Endometrien von Endometriosepatientinnen im Vergleich zu den

Endometrien von Frauen, die keine Endometriose entwickeln, begründet liegt. Mit Hilfe von

„Gene-Array“ Analysen, die bei Beginn dieser Doktorarbeit vorlagen, sollten daher gezielt

Veränderungen im endometrialen Genexpressionsmuster von Frauen mit und ohne

Endometriose erfaßt und mögliche Dedifferenzierungen im Endometrium von

Endometriosepatientinnen detektiert werden. Unterschiedlich exprimierte Gene, die durch die

Array-Analysen identifiziert wurden, sollten zunächst anhand weiterer Gewebeproben

überprüft werden, um falsche Resultate auszuschließen. Mögliche Kandidatengene sollten

anschließend in zusätzlichen Versuchen lokalisiert und näher charakterisiert werden, um ihre

Rolle bei der Entstehung der Endometriose zu klären.

Ein etabliertes Nacktmausmodell sollte genutzt werden, um den Einfluß und die Regulation

dieser Gene experimentell zu überprüfen. Weiterhin sollte in diesem Modell zum einen die

Bedeutung der Angiogenese für die Entstehung der Endometriose untersucht und zum

anderen neue Therapieansätze getestet werden. Durch Behandlung der Nacktmäuse mit

unterschiedlichen Substanzen sollte der Einfluß von Hormonen und Anti-Hormonen auf die

Morphologie und die Genexpression der transplantierten endometrialen Fragmente getestet

werden. Zur Untersuchung der Funktion von Angiogenese für die Persistenz der Fragmente,

sollten zunächst verschiedene angiogenetische Faktoren identifiziert werden, die in den

transplantierten Fragmenten exprimiert werden und eine Rolle bei der Bildung neuer

Blutgefäße und dem Einwachsen dieser Gefäße in die Fragmente spielen könnten.

Anschließend sollte nach der Inhibition des angiogenetischen Faktors VEGF die Morphologie

und die Persistenz der transplantierten Fragmente untersucht werden.

22

Material und Methoden

3 Material und Methoden

3.1 Feinchemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien

Alle verwendeten Chemikalien entsprachen dem höchsten käuflichen Reinheitsgrad.

Neben den gebräuchlichen Laborchemikalien wurden verwendet:

Agarose peqLab (Erlangen) Albumin Bovine (BSA) Sigma (Deisenhofen) Antibody diluent with background reducing components DAKO (Hamburg)

Aprotinin Sigma (Taufkirchen) Arachisöl Henry Lamotte GmbH (Bremen) Micro BCA Protein Assay Reagent Kit Pierce (Rockford, Illinois, USA) Bromphenolblau Sigma (Taufkirchen) β-Mercaptoethanol Merck (Darmstadt) DAB + liquid chromogen solution (Diaminobenzidin) DAKO (Hamburg)

DMEM Gibco BRL (Karlsruhe) DMSO Merck (Darmstadt) 100 bp DNA Ladder Genecraft (Münster) 1Kb DNA-Ladder Genecraft (Münster) DNase I Invitrogen (Karlsruhe) dNTP-Mix Genecraft (Münster) DTT Invitrogen (Karlsruhe) Eosin (gelb) Merck (Darmstadt) 17β-Estradiol Sigma (Taufkirchen) Ethidiumbromid Serva (Heidelberg) Formaldehyd (37 %) Merck (Darmstadt) Glycerin Sigma (Taufkirchen) Ham’s F-12 Biochrom KG (Berlin) Histomount (Xylolersatz-Eindeckmedium) Shandon (Frankfurt) Instant Hämatoxylin Shandon (Frankfurt) Milchpulver Biorad (Hercules, Californien) 2-Methyl-2-Butanol (t-Amylalkohol) Sigma (Taufkirchen) M-MLV Reverse Transcriptase + Puffer Invitrogen (Karlsruhe) Nahtmaterial Ethicon (Norderstedt) Na-Deoxycholat Sigma (Taufkirchen)

Nitrocellulose-Membran Amersham Lifescience (Buckinghamshire, UK)

Nonidet P-40 Sigma (Taufkirchen) Oligo(dT)16 MWG (Ebersberg) PBS Dulbecco Seromed (Berlin) Penicillin Boehringer (Mannheim) Ponceau S-Lösung Sigma (Taufkirchen) Protease inhibitor cocktail tablets Boehringer (Mannheim) RNeasy Mini Kit QIAGEN (Hilden) RNeasy Midi Kit QIAGEN (Hilden) Streptomycin Boehringer (Mannheim) Suprapur Wasserstoffperoxid (30 %) Merck (Darmstadt) 2,2,2- Tribromethanol Aldrich (Taufkirchen) Taq Polymerase + Puffer Genecraft (Münster)

Tissue Tek Sakura O.C.T.TM Compound (Niederlande)

23


Toluidinblau Sigma (Taufkirchen) Tween 20 Sigma (Taufkirchen) Vecta shield Vector Laboratories (Peterbourgh, UK)Whatman-Papier Schleicher und Schuell (Kassel)

24


3.2 Humane Gewebeproben

Das für die Experimente verwendete Gewebematerial wurde von der gynäkologischen

Abteilung des Universitätsklinikums Essen (Prof. Schindler, Prof. Kimmig) zur Verfügung

gestellt. Mit dem Routinelabor wurden die Östrogen- und Progesteronserumwerte der

Patientinnen 24-48 Std. vor der Operation erfaßt, die zur Bestimmung der Zyklusphase

herangezogen wurden. Ein Progesteronserumwert von 1 ng/ml wurde als Grenzwert

festgelegt. Lag der gemessene Progesteronwert unter 1 ng/ml befanden sich die

Patientinnen definitionsgemäß in der Proliferationsphase, lag der Wert darüber, befanden sie

sich in der Sekretionsphase. Diese sowie weitere Informationen über vorherige

Behandlungen, die allgemeine Anamnese sowie über Medikamente, die vor der

Gewebeentnahme eingenommen wurden, wurden den Krankenakten entnommen. Die

Gewebeentnahme sowie die anschließende Bearbeitung wurden von der örtlich zuständigen

Ethikkomission genehmigt.

Insgesamt wurden 96 verschiedene Endometrien in den unterschiedlichen Versuchen

verwendet, 49 dieser Endometrien stammten von Frauen ohne Endometriose, 47

Endometrien stammten von Endometriosepatientinnen.

Die für die folgenden Versuche verwendeten Endometrien stammten aus Strichkürettagen

von prämenopausalen Frauen im Alter zwischen 19 und 48 Jahren aus der

Proliferationsphase und der Sekretionsphase, die sich aufgrund von Fertilitätsproblemen,

chronischen Unterbauchschmerzen oder unregelmäßigen Blutungen einer laparoskopischen

Behandlung unterziehen mußten. Auch von Patientinnen, bei denen aufgrund eines Uterus

myomatosus eine Hysterektomie durchgeführt wurde, wurde Gewebe verwendet. Hier wurde

das Endometrium aus dem Uterus nach der Operation entnommen.

Einige Patientinnen mußten sich wegen des Verdachts auf Endometriose einer Operation

unterziehen. Die 16 hierbei entfernten und für die Versuche verwendeten endometriotischen

Läsionen stammten vor allem von den Ligamenta sacrouterina, von der Blase oder aus dem

Douglas-Raum. Von diesen Patientinnen wurden sowohl die endometriotischen Läsionen als

auch, sofern möglich, das Endometrium untersucht. Zusätzlich wurden 3 endometriotische

Läsionen von Patientinnen verwendet, die zuvor 6x mit 3,57 mg Leuprorelin, einem GnRH-

Agonisten (Enantone-Gyn, Takeda) behandelt wurden.

Bei zwei Patientinnen wurden im Rahmen der operativen Behandlung die Ovarien bzw. ein

Teil des Brustdrüsengewebes entnommen. Bei einer weiteren Patientin konnte nach einer

Hysterektomie Myometrium entnommen werden. Diese Gewebe wurden für verschiedene

Versuche als Kontrollgewebe genutzt.

25


Die Gewebe wurden unmittelbar nach der Entnahme in kalte Moscona-Lösung (4°C)

überführt und für alle weiteren Versuche in das Labor des Instituts für Anatomie des

Universitätsklinikums Essen gebracht. Hier wurden die Proben unter sterilen Bedingungen

mit Moscona-Lösung gespült, um Verunreinigungen durch Blut zu vermeiden. Für

Untersuchungen der Genexpression wurde das Gewebe in flüssigem Stickstoff (-196°C)

gefroren und bis zur weiteren Verwendung bei -80°C gelagert. Um das Endometrium im

Tiermodell untersuchen zu können, wurde frisches Gewebe sofort nach der Entnahme mit

einem Skalpell in 1-2 mm große Fragmente zerschnitten und in Nährlösung bei 37°C und 5

% CO2 für kurze Zeit aufbewahrt (s. 3.6.1). Für immunhistochemische Färbungen wurde das

Gewebe für die Paraffineinbettung in 10 % Formalin fixiert bzw. frisch für Kryostatschnitte

(Leitz) in Tissue Tek eingefroren und bei -20°C gelagert (s. 3.6.6).

3.3 Molekularbiologische Methoden

3.3.1 RNA-Isolierung

Die Isolierung von Gesamt-RNA aus den Endometrien, die für die Genexpressionsanalysen

genutzt wurden sowie dem Ovar-Gewebe, das als Kontrolle diente, erfolgte mit dem

„RNeasy Midi Kit“ der Firma QIAGEN. Das bei -80°C gelagerte Gewebe wurde je nach

Menge in 2 oder 4 ml RLT-Lysepuffer mit Hilfe eines Homogenisators (Kinematika) bei einer

Geschwindigkeit von 19000 rpm homogenisiert. Die weitere Aufreinigung erfolgte nach dem

Protokoll „RNeasy Midi Protocol for Isolation of Total RNA from Animal Tissues“ (QIAGEN).

Die Gesamt-RNA wurde in 150 µl RNase freiem Wasser (Qiagen) eluiert.

Aus endometriotischen Läsionen sowie endometrialen Fragmenten, die in die Nacktmaus

transplantiert wurden und dem nicht-transplantierten Kontrollgewebe wurde die Gesamt-RNA

mit Hilfe des „RNeasy Mini Kit“ (Qiagen) isoliert. Die Gewebe wurden in 1 ml RLT-Lysepuffer

mit Hilfe eines Homogenisators (Kinematika) bei einer Geschwindigkeit von 19000 rpm

homogenisiert. Zur feineren Lyse wurden die Homogenate anschließend mehrfach durch

eine Kanüle (Terumo Neolus, 20Gx1 1/2’’, 0,9x40 mm) aufgezogen. Die weitere Aufreinigung

erfolgte nach dem Protokoll „RNeasy Mini Protocol for Isolation of Total RNA from Animal

Tissues“ (QIAGEN). Die Gesamt-RNA wurde in 30 µl RNase freiem Wasser (Qiagen) eluiert.

3.3.2 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren

Die Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren erfolgte über die Messung der optischen

Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm. Bei dieser Wellenlänge haben Nukleinsäuren

in Lösung ihr Absorptionsmaximum. Die Konzentration der Lösung ist proportional zur

gemessenen Extinktion und kann unter Berücksichtigung der eingesetzten Verdünnung

berechnet werden. Eine Extinktion von 1,0 entspricht 40 µg/ml RNA bzw. 50 µg/ml

26


doppelsträngiger DNA. Die Bestimmung der Konzentration von RNA wurde in Quarzküvetten

mit Hilfe des RNA/DNA Calculator Gene Quant II (Pharmacia Biotech) durchgeführt.

3.3.3 DNase-Verdau

DNase I ist ein Enzym, das in der Lage ist, einzel- und doppelsträngige DNA abzubauen,

ohne die während der Reaktion vorhandene RNA zu schädigen. Zur Beseitigung von

möglichen DNA-Kontaminationen in der isolierten Gesamt-RNA wurde daher ein DNase-

Verdau durchgeführt. Nach dem Protokoll von Invitrogen wurden 2 µg Gesamt-RNA in 1x

DNase I-Puffer mit 2 U DNase I (Invitrogen) für 15 min bei RT inkubiert. Zur Inaktivierung des

Enzyms wurden anschließend 2 µl EDTA (25 mM) zugesetzt. Die RNA konnte dann direkt in

die Reverse Transkriptions- (RT-) Reaktion eingesetzt werden.

Nach der Isolierung von Gesamt-RNA aus endometriotischen Läsionen oder endometrialen

Fragmenten, die in die Nacktmaus transplantiert worden waren, war es teilweise wegen der

geringen Ausbeute nicht möglich, die Konzentration der Gesamt-RNA zu bestimmen. Dann

wurde die gesamte isolierte RNA in der SpeedVac (Savant) eingedampft und komplett in den

DNase-Verdau und die anschließende reverse Transkription eingesetzt.

3.3.4 Reverse Transkription (RT)

Bei der reversen Transkription wird aus RNA cDNA synthetisiert, die anschließend als

Template für PCRs dienen soll. Die 2 µg mit DNase I verdaute Gesamt-RNA wurde zur

Aufhebung von Sekundärstrukturen zunächst in einem Thermocycler für 10 min bei 65°C

denaturiert und anschließend für 2 min auf Eis gekühlt. Nach Zugabe des RT-Mixes erfolgte

bei 37°C im Thermocycler innerhalb einer Stunde die Synthese des komplementären DNA-

Stranges durch das Enzym „Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase“ (M-

MLV RT) (Invitrogen). Als Primer wurden Oligo-dT16-Primer (MWG) verwendet. Zur

Inaktivierung des Enzyms und zur Denaturierung des RNA/DNA-Doppelstranges wurde der

RT-Ansatz anschließend für 5 min bei 90°C erhitzt. Die erhaltene cDNA konnte dann sofort

für verschiedene PCR-Experimente eingesetzt werden.

Zusammensetzung des RT-Mixes: 2 µg RNA

1x First-Strand Buffer (5x) (Invitrogen) 10 mM dNTP-Mix (Genecraft) 0,5 µg Oligo dT16 (MWG) 0,1 M DTT (Invitrogen) 200 U M-MLV RT (Invitrogen)

ad 50 µl RNase freies Wasser

27


3.4 Genexpressionsanalysen

3.4.1 Gene-Arrays

In Kooperation mit der Schering AG (Berlin) wurden im dortigen „Labor für Fertilitätskontrolle

und Hormontherapie-Forschung“ zum Vergleich von Genexpressionsmustern der

Endometrien von Frauen mit und ohne Endometriose aus der Proliferationsphase und der

Sekretionsphase „Gene-Array“ Analysen mit den Arrays U95A der Firma Affymetrix mit mehr

als 12000 Genen durchgeführt. Die verwendeten Endometrien stammten aus der

gynäkologischen Abteilung des Universitätsklinikums Essen. Mit jeder Gewebeprobe wurde

eine Array-Analyse durchgeführt und zur Identifizierung unterschiedlich exprimierter Gene

wurde jedes normale Endometrium mit jedem Endometrium einer Endometriosepatientin der

gleichen Zyklusphase verglichen.

Die Validierung der Array-Ergebnisse wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit am Institut für

Anatomie des Universitätsklinikums Essen mittels RT-PCR und real-time RT-PCR

durchgeführt.

3.4.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

3.4.2.1 RT-PCR

Zum Nachweis der Transkripte und zur relativen Quantifizierung der Expression

unterschiedlicher Gene wurde die PCR in einem Thermocycler mit beheizbarem Deckel

(Biometra) nach dem unten angegeben Programm angewendet. 4 µl des RT-Ansatzes (s.

3.3.4) wurden mit genspezifischen Primern (Sequenzen s. Anhang) in die PCR eingesetzt. In

einem Reaktionsansatz wurden gleichzeitig das gewünschte Zielgen und ein konstitutiv

exprimiertes Gen, hier β-Aktin, amplifiziert. Bedingt durch die unterschiedlichen

Fragmentgrößen der Zielgene wurden zwei verschiedene β-Aktin-Primer-Paare verwendet,

die Fragmente von 698 bp oder 214 bp amplifizierten (Tab. 1, Sequenzen s. Anhang). Um

sicherzustellen, daß die Amplifikation beider PCR-Produkte auch im letzten Zyklus noch

exponentiell verlief, wurden die Primerkonzentrationen sowie die Anzahl der Zyklen in den

verschiedenen Reaktionen variiert. Auch die Annealing-Temperatur wurde für jedes

zielgenspezifische Primerpaar individuell verändert (Tab. 1). Nach der Amplifikation wurden

die Transkripte mit DNA-Probenpuffer (5x) versetzt, in einem 2 %igen Agarose-Gel

elektrophoretisch aufgetrennt und durch Ethidiumbromid (Serva) unter UV-Licht sichtbar

gemacht (Gel Imager, Intas). Die Bestimmung der Bandenstärke nach Abzug des

Hintergrundes erfolgte densitometrisch mit Hilfe des Programms Gelscan Professional V4.0.

Der Expressionslevel des β-Aktins wurde als 1 gesetzt und der relative Expressionslevel des

Zielgens wurde gegen diesen Wert abgeglichen und so normalisiert. Diese Normalisierung

erfolgte in Excel.

28


Tab. 1: PCR-Bedingungen und Primerkombinationen Zielgen-Primer Konzentration β-Aktin-1/2 β-Aktin-F/R Annealing Zyklen

Nidogen-F/R je 25 pmol - je 2,5 pmol 62°C 27 p27-F/R je 25 pmol - je 2,5 pmol 62°C 27 Fibronektin-F/R je 25 pmol - je 2,5 pmol 62°C 27 Elastin-F/R je 25 pmol - je 2,5 pmol 62°C 27 KollIV-F/R je 25 pmol - je 2,5 pmol 62°C 27 PAC1-F/R je 25 pmol je 2 pmol - 60°C 28 CTGF-F/R je 25 pmol je 2 pmol - 57°C 30 Cyr61-up/dw2 je 25 pmol je 2 pmol - 59°C 30-34 hCx43-F/R je 25-50 pmol - je 2,5 pmol 63°C 30-34 hCx26-F/R je 25-50 pmol - je 2,5 pmol 68°C 30-34 hVEGF-d/k je 12,5-25 pmol - je 2,5 pmol 65°C 30-34 bFGF-F/R je 12,5-25 pmol - je 2,5 pmol 65°C 30-34 ERα-F/R je 50 pmol je 2 pmol - 59°C 34 ERβ-F/R je 50 pmol je 2 pmol - 56°C 34 Aromatase-F/R je 50 pmol je 2 pmol - 56°C 34 17β-HSD1-F/R je 50 pmol je 2 pmol - 58°C 34 17β-HSD2-F/R je 50 pmol je 2 pmol - 58°C 34 bFGFR-F/R je 12,5 pmol - je 2,5 pmol 65°C 30 KDR-F/R je 12,5 pmol - je 2,5 pmol 65°C 30

PCR-Ansatz: 4 µl RT-Ansatz (2 µg RNA in RT-Reaktion eingesetzt)

1x PCR-Puffer 10 mM dNTP-Mix

je x pmol antisense/sense genspezifische Primer je x pmol antisense/sense β-Aktin Primer

2,5 U Biotherm DNA-Polymerase (Genecraft) ad 50 µl H2O

PCR-Programm im Thermocycler: 94°C 10 min 94°C 1 min

Annealing 45 sec 72°C 90 sec 72°C 10 min

x Zyklen

DNA-Probenpuffer (5x): 25 mM Tris/HCl (pH 7,0)

150 mM EDTA 0,05 % Bromphenolblau

25 % Glycerin

29


3.4.2.2 Real-time RT-PCR

Zur Untersuchung von Expressionsunterschieden uns interessierender Gene im

Endometrium und in endometriotischen Läsionen wurde die semiquantitative real-time RT-

PCR angewendet. In der Reaktion wurden 1 µl des RT-Ansatzes (s. 3.3.4) mit

genspezifischen Primern (s.u., Sequenzen s. Anhang) eingesetzt. Die Konzentrationen der

Primer wurde zuvor in einer sog. Primermatrix ausgetestet. Bei der real-time RT-PCR erfolgt

der Nachweis der PCR-Produkte über einen fluoreszierenden Farbstoff, SYBR Green I, der

in doppelsträngige DNA interkaliert, wodurch die Fluoreszenz meßbar erhöht wird. Da SYBR

Green I an jede doppelsträngige DNA bindet, konnten das Zielgen und β-Aktin, was auch

hier als „Housekeeping-Gen“ verwendet wurde, nur in getrennten Reaktionsansätzen

amplifiziert werden. Zusätzlich wurden die PCR-Produkte in einem 2 %igen Agarose-Gel

elektrophoretisch aufgetrennt und so kontrolliert, daß keine unspezifischen Produkte

amplifiziert wurden. Für jede Gewebeprobe wurden die Reaktionen für Cyr61 und β-Aktin

dreimal durchgeführt, jede dritte Probe wurde auf das Gel aufgetragen.

Der PCR-Lauf wurde in einem ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied

Biosystems) in einer 96er well-Platte (96-well optical reaction plate, Applied Biosystems) mit

optischen Deckeln (MicroAmp optical caps, Applied Biosystems) durchgeführt. Bei diesem

Gerät handelt es sich um einen Thermocycler für die PCR-Reaktion, der zusätzlich mit einem

Laser ausgestattet ist, der die Fluoreszenz des Farbstoffes SYBR Green I anregt. Die

Messung der Fluoreszenzstärke erfolgt durch einen CCD-Detektor („charge-coupled

device“). Während des PCR-Laufs akkumuliert das PCR-Produkt und die Menge des

gebundenen SYBR Green I nimmt mit der Menge des PCR-Produktes zu. Bei dem

Threshold-Cycle (CT-Wert) handelt es sich um den PCR-Zyklus, bei dem sich das

Fluoreszenzsignal gerade deutlich vom Hintergrund abhebt. Zu diesem Zeitpunkt ist die

Vermehrung des PCR-Produktes noch exponentiell, daher wird der CT-Wert für die spätere

Auswertung herangezogen. Je kleiner der gemessene CT-Wert ist, desto größer muß die

Ausgangsmenge an cDNA gewesen sein.

Für die relative Quantifizierung konnte die vergleichende CT-Methode (∆∆CT-Methode)

herangezogen werden, da das Zielgen und das „Housekeeping-Gen“ gleich effizient

amplifiziert wurden. Bei dieser Methode wurde zur Relativierung der Expressionsstärke des

Zielgens der für β-Aktin gemessene CT-Wert jeder einzelnen Probe von dem für das Zielgen

bestimmte CT-Wert der gleichen Probe abgezogen und man erhielt den ∆CT-Wert. Bei der

vergleichenden CT-Methode wird die Expressionsstärke der Proben mit einem sog.

Calibrator verglichen, der eigenständig festgesetzt wird. Die ∆CT-Werte, d.h. die gegen β-

Aktin abgeglichenen Expressionslevel der einzelnen Gewebetypen, wurden für jede

Zyklusphase als Mittelwert zusammengefaßt und der ∆CT-Wert des festgesetzten Calibrators

30


abgezogen, man erhielt so den ∆∆CT-Wert. Wurde die Expression eines Gens in

Endometrien von Frauen mit und ohne Endometriose verglichen, wurde der ∆CT-Wert der

gesunden Frauen als Calibrator festgelegt und als 1 gesetzt. Beim Vergleich der

Endometrien von Frauen mit Endometriose mit der Expression in endometriotischen

Läsionen, wurde das Endometrium als Calibrator bestimmt. Für die Untersuchungen der

Genexpression während des Menstruationszyklus, fungierte das Endometrium aus der

Proliferationsphase als Calibrator. Mit der Formel 2-∆∆CT (berechnet wird ∆∆CT+s und ∆∆CT-s,

wobei s der Standardabweichung entspricht) wurde die xfache Genexpression eines

Gewebes verglichen mit dem Calibrator berechnet. Bei dieser Formel wurden die

Standardabweichungen einbezogen, dargestellt wurde der Mittelwert des berechneten

Bereiches ohne Standardabweichungen. Die Auswertung (ABI PRISM 7700 Sequence

Detection System User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression, P/N 4303859)

wurde mit dem Programm Excel durchgeführt.

Zielgen-Primer Konzentration β-Aktin-F/R Annealing Zyklen Cyr61-F/R 900/300 nM je 50 nM 60°C 40

Real-time RT-PCR-Reaktionsansatz: 1 µl RT-Ansatz (2 µg RNA in RT-Reaktion eingesetzt)

x nM Forward-Primer x nM Reverse-Primer

12,5 µl SYBR Green Master Mix (2x, Applied Biosystems) ad 25 µl H2O

SYBR Green Master Mix: SYBR Green I dye AmpliTaq Gold DNA Polymerase dNTPs (mit dUTP) Referenz-Farbstoff Puffer

Real-time RT-PCR-Programm: 50°C 2 min 95°C 10 min 95°C 15 sec 60°C 1 min 40 Zyklen

31


3.5 Proteinbiochemische Methoden

3.5.1 Protein-Isolierung und Konzentrationsbestimmung

Myometrium, Brustdrüsengewebe sowie Endometrien von Frauen mit und ohne

Endometriose wurden in 2 ml modifiziertem RIPA-Puffer mit einem Homogenisator

(Kinematika) bei einer Geschwindigkeit von 19000 rpm homogenisiert. Nichtlösliche

Zellbestandteile wurden anschließend durch Zentrifugation bei 14000 rpm für 10 min bei 4°C

(Eppendorf-Tischzentrifuge) entfernt. Die Bestimmung der Proteinkonzentration in den

Zellysaten erfolgte mit Hilfe des „Micro BCA™ Protein Assay Reagent Kit“ (Pierce). Hierbei

wird BCA („bicinchoninic acid“) zur Detektion von Cu+1 genutzt, das entsteht, wenn Cu+2 in

Anwesenheit von alkalischen Reagenzien durch Proteine reduziert wird. Es entsteht ein

purpurroter, wasserlöslicher Komplex aus BCA und Cu+1, der eine hohe Absorption bei 562

nm aufweist, die linear mit steigender Proteinkonzentration zunimmt. Die Reaktionslösung

WR („working reagent“) wurde durch Mischung der Lösungen MA, MB und MC im Verhältnis

25:24:1 („Micro BCA™ Protein Assay Reagent Kit“, Pierce) hergestellt. Nach Verdünnung der

Proben mit Wasser (1:100, 1 ml) wurden diese mit 1 ml der Reaktionslösung WR versetzt,

für 1 Std. bei 60°C inkubiert und dann auf Raumtemperatur gebracht. Die Messung der

Absorption erfolgte bei 562 nm gegen einen Wasserabgleich im Spektrophotometer

(Beckman). Unter Verwendung von BSA als Eichprotein wurde eine Standardkurve erstellt

und die Proteinkonzentrationen bestimmt.

RIPA-Puffer: 50 mM Tris/HCl (pH 7,4)

150 mM NaCl 1 mM EDTA

frisch dazu: 0,5 % SDS

1 % Nonidet P-40 0,5 % Na-Deoxycholat

je 1/50 ml „Protease inhibitor cocktail tablet”

3.5.2 Fällung von Proteinen

Bei zu geringen Proteinkonzentrationen wurden 20 µg der Zellysate mit dem 3fachen

Volumen eiskaltes Aceton bei -20°C ü.N. gefällt. Die ausgefallenen Proteine wurden durch

Zentrifugation bei 14000 rpm für 30 min (4°C) pelletiert, mit 500 µl eiskaltem Aceton

gewaschen und erneut zentrifugiert (14000 rpm, 20 min, 4°C). In einer SpeedVac (Savant)

wurden die Pellets anschließend getrocknet.

32


3.5.3 SDS-Gelelektrophorese

Die analytische Auftrennung von Proteinen wurde unter denaturierenden Bedingungen in der

Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS) nach Laemmli (Laemmli, 1970) durchgeführt.

Der Gellauf erfolgte in einer Gelkammer der Firma Biorad bei einer maximalen Spannung

von 150 V und einer durchschnittlichen Stromstärke von 30-40 mA. Vor dem Auftragen auf

die 10 %igen Polyacrylamidgele (50 mm x 80 mm x 1 mm) wurden die Proteinproben mit 25

µl SDS-Probenpuffer versetzt und für 5-10 min bei 100°C im Heizblock denaturiert.

Sammelgelpuffer: 0,5 M Tris/HCl (pH 6,8) 0,4 % SDS

Trenngelpuffer:

1,5 M Tris/HCl (pH 8,8) 0,4 % SDS

SDS-Probenpuffer (2X): 62,5 mM Tris/HCl, pH 6,8

10 % Glycerin 2,3 % SDS

0,002 % Bromphenolblau 3 % β-ME (frisch dazu)

Laufpuffer:

25 mM Tris/HCl (pH 8,8) 95 mM Glycin 0,1 % SDS

3.5.4 Western Blot

Für den Nachweis von Proteinen durch Antikörper wurden die Proteine mit Hilfe der Blotting-

Technik von einem SDS-Gel auf eine Nitrocellulose-Membran (Amersham Lifescience)

übertragen. Western Blots wurden in einer Elektroblotkammer von Biorad durchgeführt.

20 µg Proteinlysat wurden auf ein 10 %iges SDS-Gel aufgetragen und elektrophoretisch

aufgetrennt (s. 3.5.3). Die in Blot-Puffer äquilibrierte Nitrocellulose-Membran wurde

luftblasenfrei auf das Gel aufgebracht, Membran und Gel mit je 3 Lagen Whatman-

Filterpapier (Schleicher und Schuell) und Vlies bedeckt und in die mit Eis gekühlter

Elektroblotkammer eingespannt. Der Blotvorgang erfolgte bei RT für 2 Std. bei 60 mA unter

ständigem Rühren. Anschließend wurde das Gel zur Kontrolle für 20 min in einer

Coomassie-Lösung (Lowry et al., 1951) gefärbt und ü.N. entfärbt. Die Membran wurde zur

Sichtbarkeit der Proteine für 5 min in einer 0,2 %igen Ponceau S-Lösung (Sigma) inkubiert,

kurz in H2O gewaschen und anschließend in 5 %igem Milchpulver (Biorad) ü.N. bei 4°C und

33


am nächsten Morgen für 1 Std. bei RT zur Absättigung unspezifischer Bindungsstellen

geblockt. Nach einem kurzen Waschschritt mit TBS-T erfolgte die Inkubation des

Primärantikörpers für 1 Std. bei RT. Vor und nach der anschließenden einstündigen

Inkubation des Sekundärantikörpers bei RT wurde die Membran mit TBS-T für 5 min, TBS-T-

S für 5 min und erneut mit TBS-T für 15 min gewaschen. Die Entwicklung der Blots erfolgte

mit Hilfe des ECL+Plus Kits von AmershamPharmacia unter Verwendung eines

Röntgenfilms.

Blot-Puffer (pH 8,2-8,8): 50 mM Tris 50 mM Borsäure

TBS-T:

20 mM Tris/HCl (pH 7,6) 137 mM NaCl 0,15 % Tween 20

TBS-T-S:

TBS-T mit 0,015 % SDS

Primärantikörper rabbit anti-Cyr61 antiserum (Labor für Molekulare Experimentelle Orthopädie, Orthopädische Universitätsklinik, Würzburg), 1:2000 Sekundärantikörper goat anti-rabbit, HRP-gekoppelt, sc-2030 (SantaCruz), 1:15000

34


3.6 Untersuchungen im Nacktmausmodell

3.6.1 Aufarbeitung des Gewebes

Insgesamt wurden 16 verschiedene endometriale Gewebe für Versuche im

Nacktmausmodell verwendet. Von diesen 16 Geweben stammten 10 von Frauen ohne

Endometriose und 6 von Frauen, bei denen Endometriose diagnostiziert wurde.

Das Endometrium wurde zunächst steril mit Moscona-Lösung gewaschen, um

Verunreinigungen durch Blut zu entfernen. Anschließend wurde es mit einem Skalpell in

Fragmente von 1-2 mm Durchmesser zerschnitten und bis zur Transplantation in die

Nacktmaus in Nährmedium bei 37°C und 5 % CO2 gelagert. Von jedem Gewebe wurde als

Kontrolle zur RNA-Isolierung ein Fragment in flüssigem Stickstoff (-196°C) schockgefroren

und bei -80°C bis zum Ende des Versuchs gelagert. Die Transplantation des übrigen

Gewebes in die Nacktmaus erfolgte meist sofort, spätestens jedoch nach drei Stunden.

Moscona-Lösung: 140 mM NaCl

4 mM KCl 12 mM NaHCO3

0,2 mM KH2PO4 0,4 mM NaH2PO4xH2O,

9 mM D-Glucose Monohydrat

Nährmedium: 500 ml Dulbecco´s modifiziertes Eagle Medium 500 ml Ham´s F12

100 IU/ml Penicillin 100 µg/ml Streptomycin

3.6.2 Versuchstiere

Für die Versuche wurden weibliche zyklische Nacktmäuse (Han: NMRI nu/nu) aus der Zucht

des zentralen Tierlaboratoriums der Universitätsklinik Essen unter der Leitung von Prof. Dr.

Militzer verwendet. Bei Versuchsbeginn hatten die Nacktmäuse ein Alter von mind. fünf

Wochen. Die Nacktmäuse wurden in einer keimfreien Umgebung unter kontrollierten

Umweltbedingungen und regulierten Tag- / Nachtzyklen (je 12 Stunden) gehalten. Futter,

Einstreu und alle in den Raum gebrachten und verwendeten Geräte wurden autoklaviert.

35


Es wurden insgesamt 57 Tiere für die folgenden Versuche verwendet. 12 Nacktmäusen

wurden endometriale Fragmente ohne weitere Behandlung implantiert, 4 Tieren wurde

zusätzlich ein VEGF-Antagonist (Schering, ZK 202650) appliziert. 10 Tiere wurden mit einem

reinen Anti-Östrogen (Schering, ZK 191703), 9 mit 17β-Östradiol (Sigma) behandelt.

Weiteren 9 Nacktmäusen wurde ein selektiver Östrogenrezeptor-Modulator (SERM;

Schering, ZK 186619) appliziert. Als Kontrolle wurde in jeder Versuchsreihe einer Maus die

entsprechende Lösungssubstanz, das Vehikel, verabreicht (13 Tiere).

3.6.3 Transplantation der endometrialen Fragmente

Das Endometrium wurde wie unter Punkt 3.6.1 beschrieben vorbereitet.

Die Nacktmäuse wurden mit einer intraperitonealen Injektion von 17 µl 2,5 % Avertin/g

Körpergewicht betäubt und unter sterilen Bedingungen laparatomiert. Ein endometriales

Fragment wurde in einer Schlinge aus Nahtmaterial (Ethicon, Vicryl, 6/0) befestigt und an der

inneren Seite der Bauchwand angenäht. Insgesamt wurden in jede Nacktmaus 3-6

Fragmente transplantiert. Es wurde darauf geachtet, keine unnötigen Reizungen und

Verletzungen zu verursachen. Anschließend wurde zunächst die Bauchwand, dann die Haut

mit Einzelknopfnähten (Ethicon, Vicryl, 5/0) verschlossen und die Wunde einer täglichen

Kontrolle unterzogen.

100 % Avertin: 10 g 2,2,2 tribromethylalkohol (Aldrich)

10 ml tert-amylalkohol (Sigma)

3.6.4 Behandlung der Nacktmäuse

In drei Versuchsreihen mit Geweben von verschiedenen Patientinnen wurden die

Nacktmäuse keiner weiteren Behandlung unterzogen. Die endometrialen Fragmente einer

Patientin wurden jeweils auf vier Mäuse verteilt und in einer Zeitreihe wurde jeweils nach 2,

4, 7 und 14 Tagen eine Maus getötet, die Fragmente entnommen und auf Angiogenese

untersucht.

In drei weiteren Versuchsreihen mit ebenfalls unterschiedlichen Geweben wurde das

endometriale Gewebe einer Patientin jeweils auf zwei bzw. in einer Versuchsreihe auf drei

Mäuse verteilt und den Nacktmäusen zusätzlich täglich 1,5 mg (50 mg/kg) eines VEGF-

Antagonisten (Schering, ZK 202650) verabreicht. Die Substanz wurde in einem Gemisch aus

DMSO und 100 % Ethanol (1:1) gelöst. Als Trägersubstanz wurde eine 0,9 %ige NaCl-

Lösung mit 0,085 % Myrj (Schering) versetzt, der angelöste VEGF-Antagonist zugegeben

und das Ganze mit Hilfe von einigen sterilen Glaskugeln im Reagenzglas für 15 min im

Ultraschallbad („Ultrasonic cleaner“, Sino) suspendiert. Diese Suspension wurde den

36


Nacktmäusen einen Tag nach der Transplantation der endometrialen Fragmente das erste

Mal und von da an täglich für einen Zeitraum von 14 Tagen p.o. mit einer Sonde appliziert.

Je einer Maus pro Versuchsreihe wurde als Kontrolle zeitlich parallel und ebenfalls p.o. das

Vehikel (DMSO/EtOH, 1:1 in 0,9 % NaCl mit 0,085 % Myrj) verabreicht.

Für Untersuchungen zur Hormonregulation wurde das endometriale Gewebe 10

verschiedener Patientinnen jeweils auf bis zu vier Mäuse verteilt. Je einer Maus wurde

zusätzlich entweder ein reines Anti-Östrogen (1 mg/kg, Schering, ZK 191703), 17β-Östradiol

(3 µg/kg, Sigma) oder ein selektiver Östrogenrezeptor-Modulator (SERM; 1 mg/kg, Schering,

ZK 186619) appliziert. Alle Substanzen wurden in 100 % Ethanol gelöst und mit Arachisöl

(Henry Lamotte GmbH) in einem Verhältnis von 1:10 versetzt. Die Substanzen wurden

erstmalig direkt nach der Transplantation der endometrialen Fragmente und von da an

täglich für einen Zeitraum von 14 Tagen s.c. appliziert. Je einer Maus pro Versuchsreihe

wurde das Vehikel (EtOH/Arachisöl, 1:10) zeitlich parallel und ebenfalls s.c. verabreicht.

getestete Substanz Applikation Konz./

Maus/d Dauer n Gewebe

n Fragmente

VEGF-Antagonist ZK 202650 p.o. 1,5 mg 14 Tage 3 24

Anti-Östrogen ZK 191703 s.c. 30 µg 14 Tage 10 47

17β-Östradiol Sigma s.c. 90 ng 14 Tage 9 41

SERM ZK 186619 s.c. 30 µg 14 Tage 9 42

3.6.5 Entnahme der transplantierten endometrialen Fragmente

Nach Beendigung der Versuche wurden die Versuchstiere durch zervikale Dislokation

getötet. Den Tieren wurde die Bauchhöhle durch einen Bauchschnitt eröffnet und die

endometrialen Fragmente anhand der Fixierungsnähte lokalisiert. Die makroskopisch

sichtbaren Fragmente wurden herauspräpariert und zur Isolierung von RNA sofort in

flüssigem Stickstoff (-196°C) gefroren. Für morphologische und immunhistochemische

Untersuchungen wurden die Fragmente entweder in 10 % Formalin fixiert oder in Tissue Tek

(Sakura O.C.T.TM Compound) in flüssigem Stickstoff (-196°C) eingefroren.

Für Versuche zur Hormonregulation wurde zusätzlich das Körpergewicht des Versuchstieres,

sowie das Gewicht des Uterus und der Ovarien bestimmt. Die Uteri wurden anschließend in

10 % Formalin fixiert und für morphologische und immunhistochemische Untersuchungen in

Paraffin eingebettet.

37


3.6.6 Histologische Aufarbeitung der Fragmente

Die in 10 % Formalin fixierten Fragmente wurden nach einer Fixierungszeit von 24 Std. (4°C)

mit Hilfe eines Einbettautomaten (Shandon) zunächst in einer aufsteigenden Alkoholreihe

entwässert und anschließend in Paraffin eingebettet. Die Herstellung der Paraffinblöckchen

erfolgte in einem „Histocentre“ (Shandon). Von den Paraffinblöckchen wurden dann mit

einem Mikrotom (Jung AG) 7 µm dicke Schnitte abgenommen und diese für morphologische

Untersuchungen mit Hämatoxylin und Eosin (HE) angefärbt.

Von den in Tissue Tek (Sakura O.C.T.TM Compound) eingefrorenen Fragmenten wurden in

einem Kryostaten (Leitz) bei -20°C ebenfalls 7 µm dicke Schnitte abgenommen. Diese

wurden entweder zur morphologischen Untersuchung mit Toluidin angefärbt oder für

immunhistochemische Untersuchungen genutzt.

In Kooperation mit der Schering AG (Berlin) wurden in den dortigen Laboratorien ebenfalls

HE-Färbungen durchgeführt. Paraffinblöckchen der humanen endometrialen Fragmente aus

den Nacktmaus-Versuchen wurden nach Beendigung der morphologischen Untersuchungen

im Institut für Anatomie der Schering AG übergeben. Dort wurden Schnitte abgenommen,

HE-Färbungen durchgeführt und in diesen Präparaten die Epithelhöhe des Drüsengewebes

bestimmt. Zusätzlich wurden Paraffinblöckchen der Nacktmaus-Uteri ebenfalls nach Berlin

geschickt, dort histologisch aufgearbeitet und die Uterusepithel-Höhe bestimmt.

3.7 Immunhistochemische Untersuchungen

Die Immunhistochemie wurde dazu genutzt, durch eine Antikörper-Reaktion spezifisch

Proteine in Gewebeschnitten nachzuweisen. Der Gewebeschnitt wurde hierbei zunächst mit

einem Primärantikörper gegen ein im Schnitt vorhandenes nachzuweisendes Protein

inkubiert. Der bei der Antigen-Antikörper-Reaktion im Gewebeschnitt entstandene Komplex

wurde durch indirekte Nachweismethoden sichtbar gemacht. Gegen den unmarkierten

Primärantikörper wurde ein entweder mit Biotin oder mit einem Fluoreszenzfarbstoff

markierter Sekundärantikörper eingesetzt, der spezifisch gegen den im Antigen-Antikörper-

Komplex im Gewebe gebunden Primärantikörper gerichtet ist. Nach Zugabe des

Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelten Sekundärantikörpers konnte der markierte Komplex sofort

fluoreszenzmikroskopisch untersucht werden. Biotin-markierte Sekundärantikörper wurden

durch StreptAB-Komplexe, lösliche Komplexe aus Streptavidin und biotinylierter Meerrettich-

Peroxidase, nachgewiesen. Durch Zugabe des Substrats Diaminobenzidin (DAB) entstand

ein braunes Reaktionsprodukt, das lichtmikroskopisch nachgewiesen werden konnte.

38


3.7.1 Immunhistochemischer Nachweis mit 3,3´-Diaminobenzidin (DAB)

In einem Kryostaten wurden 7 µm dicke Gefrierschnitte abgenommen, auf Deckgläschen (15

mm) aufgezogen und auf einer Heizplatte (42°C) für 15-30 min getrocknet. Die Schnitte

wurden in eine 12er well-Platte (Beckton Dickinson) überführt und für 5 min in eiskaltem 96

%igem Ethanol fixiert. Nach einem Waschschritt mit PBS für 5 min wurden die Schnitte für

10 min in 3 %iger H2O2-Lösung inkubiert, um endogene Peroxidase-Aktivität zu blockieren.

Nach einem erneuten Waschen mit PBS (5 min) wurden für mind. 30 min (maximal ü.N.)

unspezifische Bindungsstellen durch Inkubation mit PBS/BSA (0,5 %) abgesättigt.

Anschließend wurden die Schnitte für 1 Std. in einer feuchten Kammer mit dem in

Antikörperverdünnung (Dako) angesetzten Primärantikörper inkubiert. Nach weiteren

Waschschritten erfolgte die Inkubation mit einem Biotin-gekoppelten Sekundärantikörper für

30 min, ebenfalls in einer feuchten Kammer. Unter Verwendung eines Detektionssystems

(StreptABComplex/HRP, Dako) wurden die Schnitte erst für 30 min mit einem Strept. A/B-

Komplex, dann für 5 min mit dem chromogenen Substrat für die Peroxidase (DAB) inkubiert,

in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert und mit Histomount eingedeckt. Die

Auswertung erfolgte an einem Zeiss Axiophot.

Primärantikörper rat anti-mouse panendothelial Antigen (PAN), 09921D (Pharmingen), 1:100 Sekundärantikörper rabbit anti-rat, biotinyliert, E 0468 (Dako), 1:400 Detektion StreptABComplex/HRP (biotinylated horse radish peroxidase), Z 0113 (Dako)

3.7.2 Immunhistochemischer Nachweis durch Fluoreszenz

An humanen endometrialen Fragmenten aus den Nacktmausversuchen wurden

immunhistochemische Untersuchungen an Kryostatschnitten durchgeführt. In einem

Kryostaten wurden 7 µm dicke Schnitte abgenommen, auf Deckgläschen aufgezogen und

auf einer Heizplatte bei 42°C für 15-30 min getrocknet. Die Schnitte wurden in eine 12er well-

Platte (Beckton Dickinson) überführt, für 5 min mit eiskaltem Ethanol fixiert, 10 min in PBS

gewaschen und für mind. 30 min in PBS/BSA (0,5 %) zur Absättigung unspezifischer

Bindungsstellen inkubiert. Nach der Inkubation des Primärantikörpers für 1,5 Std. folgten drei

Waschschritte für je 10 min in PBS/BSA. Die Schnitte wurden anschließend für 45 min mit

einem Fluoreszenzfarbstoff- (FITC-) gekoppelten Sekundärantikörper inkubiert. Für diesen

und alle weiteren Inkubationsschritte wurde die well-Platte wegen der Lichtempfindlichkeit

des Antikörpers mit Alufolie bedeckt. Die Schnitte wurden anschließend 3x für 10 Minuten

mit PBS/BSA und 3x für 5 Minuten mit A.bidest gewaschen und anschließend mit dem

39


fluoreszenzverstärkenden Eindeckmittel Vectashield (Vector, Kat. No. H- 1000) eingedeckt.

Die Auswertung erfolgte an einem Zeiss Axiophot.

Primärantikörper goat (polyklonal) anti-Cyr61, sc-8561 (SantaCruz), 1:100 Sekundärantikörper swine anti-rabbit, FITC konjugated, F 0205 (Dako), 1:40

In Kooperation mit dem „Labor für Molekulare Experimentelle Orthopädie“ der

Orthopädischen Universitätsklinik in Würzburg wurden dort zusätzliche

Immunhistochemische Untersuchungen an 7 µm dicken Paraffinschnitten durchgeführt.

Eutope Endometrium sowie endometriotischen Läsionen wurden auf Super Frost

Objektträger (Menzel) aufgezogen und nach Würzburg geschickt. Dort wurde mit Hilfe der

APAAP-Färbung nach Verwendung des Primärantikörpers (anti mouse CYR antibody, Munin

Corp, Chicago, USA, 1:100) Cyr61 nachgewiesen.

3.7.3 Immunhistochemischer Nachweis von Ki67

In Kooperation mit der Schering AG (Berlin) wurde in den Uteri der hormonbehandelten

Nacktmäuse der Proliferationsmarker Ki67 immunhistochemisch nachgewiesen. Ki67 ist im

Zellkern lokalisiert und wird in der späten G1-, S-, M- und G2-Phase des Zellzyklus exprimiert.

In der G0-Phase ist dieser Marker hingegen nicht detektierbar (Schlüter et al., 1993).

3.8 Statistische Auswertung

Die Signifikanz der Expressionsunterschiede zwischen Endometrien von Frauen mit und

ohne Endometriose sowie zwischen den Endometrien aus den einzelnen Zyklusphasen, die

mittels real-time RT-PCR ermittelt wurden, wurde mit dem Einstichproben-Median-Test nach

Wilcoxon berechnet. Der Median-Test prüft die Nullhypothese, die davon ausgeht, daß zwei

zu vergleichende Stichproben aus Messungen mit identischem Median stammen. Wird der

Median-Test signifikant (p≤0,05), ist davon auszugehen, daß sich die Mediane der

zugrundeliegenden Messungen unterscheiden.

Die Signifikanz der Expressionsunterschiede zwischen Endometrien von Frauen mit und

ohne Endometriose, zwischen eutopen Endometrien und endometriotischen Läsionen oder

zwischen endometrialen Fragmenten aus den Nacktmaus-Versuchen, die mittels RT-PCR

ermittelt wurden, wurde mit dem (Studentischen) t-Test berechnet. Bei einem p-Wert kleiner

als 0,05 (p≤0,05) wurden statistisch signifikante Unterschiede angenommen.

40

Ergebnisse

4 Ergebnisse

4.1 Genexpressionsanalysen der Endometrien von Frauen mit und ohne Endometriose

Durch Genexpressionsanalysen mit Hilfe von „Gene-Arrays“ der Firma Affymetrix (U95A)

konnten insgesamt 95 Gene identifiziert werden, die in den Endometrien von

Endometriosepatientinnen einen signifikant verschiedenen Expressionslevel aufwiesen als in

den Endometrien von gesunden Frauen (s. Anhang). In die Auswertung mit einbezogen

wurden alle Gene, die sich in der Expression mindestens um den Faktor 1,5 unterschieden.

Von diesen 95 Genen konnte bei insgesamt 64 Genen eine reduzierte Expression gezeigt

werden, wobei 35 (55 %) dieser Gene in der Sekretionsphase herunterreguliert waren. Vor

allem extrazelluläre Matrixproteine wie Fibronektin, Nidogen oder Kollagen IV zeigten in den

Endometrien von Frauen mit Endometriose in der Sekretionsphase eine herunterregulierte

Expression (Tab. 2).

Die übrigen 31 der 95 unterschiedlich regulierten Gene wurden in den Endometrien von

Endometriosepatientinnen mindestens 1,5fach stärker exprimiert als in den Endometrien

gesunder Frauen (s. Anhang). Diese Expressionsunterschiede zeigten sich vor allem in der

Sekretionsphase. Unter den 23 (74 %) in der Sekretionsphase hochregulierten Genen

wurden insbesondere östrogenabhängig exprimierte Gene gefunden wie der TR3 Orphan-

Rezeptor, ein Mitglied der Hormonrezeptor-Superfamilie (Uemura et al., 1995) oder das

„early growth response protein“ EGR-1, das in der Literatur ebenso wie die

Transkriptionsfaktoren c-fos und jun-B als östrogenreguliertes Gen beschrieben wurde

(Thompson et al., 2002; Duan et al., 2002; Cicatiello et al., 1992) (Tab. 3). Die deutlichsten

Expressionsunterschiede zwischen den Endometrien von Frauen mit und ohne

Endometriose konnten für Cyr61 detektiert werden, ein Gen der CCN-Familie. Das Cyr61-

Gen war in 18 von 20 Vergleichen in Endometrien der Sekretionsphase von

Endometriosepatientinnen im Mittel 5fach stärker exprimiert als in Endometrien von

gesunden Frauen.

41

Ergebnisse

4.1.1 Validierung der Ergebnisse der „Gene-Array“ Analysen

4.1.1.1 Herunterregulierte Gene

Tab. 2: In den Endometrien von Endometriosepatientinnen aus der Sekretionsphase herunterregulierte Gene

42

Ergebnisse

An jeweils fünf Endometrien von Frauen mit und ohne Endometriose aus der

Sekretionsphase wurde überprüft, ob sich die mit Hilfe der Array-Analysen ermittelten

Veränderungen im Expressionsmuster der Gene Nidogen, p27, Fibronektin, Elastin und

Kollagen IV verifizieren lassen.

Für die semiquantitative RT-PCR wurde aus den Geweben die Gesamt-RNA isoliert und

mittels Reverser Transkription cDNA synthetisiert (s. 3.3.4). In der anschließenden PCR, die

für jedes Gen zweimal mit jeder Gewebeprobe im Thermocycler durchgeführt wurde, wurde

in einem Reaktionsansatz gleichzeitig das zu untersuchende Gen und β-Aktin amplifiziert.

Die hierfür verwendeten Primer sowie die PCR-Bedingungen für die einzelnen Gene sind in

Tab. 1 angegeben. Nach elektrophoretischer Auftrennung in einem 2 %igen Agarosegel

wurde die Bandenstärke der PCR-Produkte densitometrisch mit Hilfe des Programms

Gelscan Professional V4.0 bestimmt. Die Signalstärke des zu untersuchenden Gens konnte

nach Abzug des Hintergrunds in Relation zum β-Aktin-Signal derselben Probe gesetzt

werden. Die relativen Expressionswerte des zu untersuchenden Gens wurden jeweils für die

Endometrien von Frauen mit und ohne Endometriose zusammengefaßt. Der mittlere

Expressionslevel der normalen Endometrien wurde als Kontrollwert genommen und 1

gesetzt. Der Expressionslevel der Endometrien von Endometriosepatientinnen wurde

entsprechend berechnet und als xfache Expression bezogen auf das normale Endometrium

dargestellt (Abb. 5).

43

Ergebnisse

Abb. 5, A-F: Validierung der Ergebnisse der herunterregulierten Gene Nidogen (A und B), p27 (C), Fibronektin (D), Elastin (E) und Kollagen IV (F) aus den Array Analysen mittels RT-PCR. Der mittlere Expressionslevel der Endometrien von Endometriosepatientinnen wurde als xfache Expression bezogen auf das normale Endometrium plus Standardabweichung dargestellt. In den getesteten Gewebeproben aus der Sekretionsphase konnten anders als in den Array-Analysen keine Unterschiede in der Expression der Gene zwischen den Kontrollendometrien und den Endometrien von Endometriosepatientinnen detektiert werden. A: Agarosegel, Spur 1: 100 bp Marker, Spur 2, 4, 6, 8, 10: normale Endometrien, Spur 3, 5, 7, 9, 11: Endometrien von Endometriosepatientinnen. Die Positionen der Transkripte β-Aktin (214 bp) und Nidogen (534 bp) wurden gekennzeichnet. B-F: Excel-Diagramme.

Die Ergebnisse der Array-Analyse konnten für die Gene Nidogen, p27, Fibronektin, Elastin

und Kollagen IV nicht bestätigt werden. Nach Auswertung der „Gene-Arrays“ zeigte die

Expression der hier untersuchten Gene in den Endometrien von Endometriosepatientinnen in

der Sekretionsphase in 10-16 von 20 Fällen eine Herunterregulation (Tab. 2). In den von uns

mittels RT-PCR untersuchten Gewebeproben konnte kein signifikanter Unterschied in der

Expression der Gene zwischen den Kontrollendometrien (n=5) und den Endometrien von

Endometriosepatientinnen (n=5) detektiert werden (Abb. 5). Während in der Expression von

p27 und Fibronektin kein Unterschied zwischen den Geweben festgestellt werden konnte

(Abb. 5C und D), war der Expressionslevel von Kollagen IV in den Endometrien der

Endometriosepatientinnen leicht, aber nicht signifikant, reduziert (Abb. 5F). Die Nidogen- und

die Elastin-Expression dagegen waren in den Endometriosepatientinnen sogar leicht erhöht

44

Ergebnisse

(Abb. 5B und E). Weitere Untersuchungen zur Regulation von Nidogen, p27, Fibronektin,

Elastin und Kollagen IV wurden aufgrund dieser Ergebnisse nicht durchgeführt.

4.1.1.2 Hochregulierte Gene

Tab. 3: In den Endometrien von Endometriosepatientinnen aus der Sekretionsphase hochregulierte Gene

45

Ergebnisse

PAC-1

Es wurde überprüft, ob sich der mit Hilfe der Array-Analysen ermittelte Anstieg der

Expression von PAC-1 im Endometrium von Frauen mit Endometriose in weiteren

Gewebeproben verifizieren läßt. PAC-1 ist ein Gen, das für eine Proteinkinase-Phosphatase

kodiert und ursprünglich in aktivierten T-Zellen identifiziert wurde (Rohan et al., 1993).

Von jeweils fünf Endometrien von Frauen mit und ohne Endometriose aus der

Sekretionsphase sowie jeweils zehn Endometrien von Frauen mit und ohne Endometriose

aus der Proliferationsphase wurde Gesamt-RNA isoliert und mittels Reverser Transkription

cDNA synthetisiert (s. 3.3.4). Die anschließende PCR wurde dreimal mit jeder Gewebeprobe

im Thermocycler durchgeführt (Primer und PCR-Bedingungen, s. Tab. 1), und die

Bandenstärke der PCR-Produkte wurde densitometrisch mit Hilfe des Programms Gelscan

Professional V4.0 bestimmt. Die Signalstärke von PAC-1 konnte nach Abzug des

Hintergrunds in Relation zum β-Aktin-Signal derselben Probe gesetzt werden. Die relativen

Expressionswerte wurden jeweils für die Endometrien von Frauen mit und ohne

Endometriose der jeweiligen Zyklusphase als Mittelwerte zusammengefaßt (Abb. 6).

Abb. 6, A-C: Überprüfung der in den Array Analysen ermittelten Hochregulation von PAC-1 mittels RT-PCR. Die relativen Expressionswerte wurden als Mittelwerte plus Standardabweichungen dargestellt (A und B). In der Proliferationsphase (A) wurde ebenso wie in der Sekretionsphase (B) ein 1,3facher Expressionsanstieg in den Endometrien von Endometriosepatientinnen verglichen mit normalen Endometrien detektiert, eine signifikante Hochregulation von PAC-1 konnte jedoch nicht bestätigt werden. C: Agarosegel, Spur 1: 100 bp Marker, Spur 2, 4, 6, 8, 10: normale Endometrien (Sekretionsphase), Spur 3, 5, 7, 9, 11: Endometrien von Endometriosepatientinnen (Sekretionsphase). Die Positionen der Transkripte β-Aktin (698 bp) und PAC-1 (300 bp) wurden gekennzeichnet. A und B: Excel-Diagramme.

46

Ergebnisse

Aus den Array-Analysen ergab sich, daß die PAC-1-Expression in den Endometrien von

Endometriosepatientinnen in der Sekretionsphase in 13 von 20 Vergleichen höher war als in

den normalen Endometrien (Tab. 3). Auch in der Proliferationsphase zeigte sich eine

Regulation, in 10 von 30 Fällen war PAC-1 im Endometrium von Endometriosepatientinnen

stärker exprimiert (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse konnten mit Hilfe der RT-PCR nur

zum Teil bestätigt werden. Sowohl in der Proliferationsphase (Abb. 6A) als auch in der

Sekretionsphase (Abb. 6B) wurde in den Endometrien von Endometriosepatientinnen eine im

Mittel 1,3fach höhere Expression von PAC-1 beobachtet als in den normalen Endometrien.

Diese Hochregulation war allerdings statistisch nicht signifikant. In den untersuchten

Gewebeproben konnten zwischen den Endometrien von Frauen mit und ohne Endometriose

nur tendenzielle Expressionsunterschiede detektiert werden, so daß keine weiteren

Untersuchungen bezüglich der PAC-1-Expression durchgeführt wurden.

CTGF

In den Array-Analysen wurde ein Anstieg der Expression von CTGF, einem Mitglied der

CCN-Familie, in den Endometrien von Endometriosepatientinnen in der Sekretionsphase

gefunden. Diese Expressionsunterschiede zwischen den Endometrien von Frauen mit und

ohne Endometriose wurden in weiteren Gewebeproben mittels RT-PCR überprüft.

Aus Endometrien von Frauen mit und ohne Endometriose aus der Proliferationsphase und

der Sekretionsphase wurde Gesamt-RNA isoliert und mittels Reverser Transkription cDNA

synthetisiert (s. 3.3.4). Die anschließende PCR wurde dreimal mit jeder Gewebeprobe im

Thermocycler durchgeführt (Primer und PCR-Bedingungen, s. Tab. 1), und die Bandenstärke

der PCR-Produkte wurde densitometrisch mit Hilfe des Programms Gelscan Professional

V4.0 bestimmt. Die Signalstärke von CTGF konnte nach Abzug des Hintergrunds in Relation

zum β-Aktin-Signal derselben Probe gesetzt werden. Die relativen Expressionswerte wurden

jeweils für die Endometrien von Frauen mit und ohne Endometriose der jeweiligen

Zyklusphase als Mittelwerte zusammengefaßt (Abb. 7).

47

Ergebnisse

Abb. 7, A-C: Validierung der Resultate der Gene-Array Analysen für CTGF mittels RT-PCR. Die relativen Expressionswerte wurden als Mittelwerte plus Standardabweichungen dargestellt (A und B). In der Proliferationsphase (A) konnten ebenso wie in der Sekretionsphase (B) keine Expressionsunterschiede in den Endometrien von Endometriosepatientinnen verglichen mit normalen Endometrien nachgewiesen werden. Es zeigte sich allerdings in den endometriotischen Läsionen beider Zyklusphasen eine stärkere Expression verglichen mit den eutopen Endometrien. C: Agarosegel mit Geweben aus der Sekretionsphase, Spur 1: 100 bp Marker, Spur 2-5: normale Endometrien, Spur 6-10: Endometrien von Endometriosepatientinnen, Spur 11 und 12: endometriotische Läsionen. Die Positionen der Transkripte β-Aktin (698 bp) und CTGF (451 bp) wurden gekennzeichnet. A und B: Excel-Diagramme.

Nach Auswertung der Array-Analysen wurde CTGF in den Endometrien von

Endometriosepatientinnen in der Sekretionsphase in 13 von 20 Vergleichen stärker

exprimiert als in den normalen Endometrien der gleichen Zyklusphase (Tab. 3). In der

Proliferationsphase dagegen zeigte sich keine Regulation (Daten nicht gezeigt). Diese

Ergebnisse konnten mit Hilfe der RT-PCR nur zum Teil bestätigt werden. In den zusätzlich

untersuchten Gewebeproben sowohl aus der Proliferationsphase (Abb. 7A) als auch aus der

Sekretionsphase (Abb. 7B) konnten zwischen den Endometrien von Frauen mit

(Proliferationsphase: n=4, Sekretionsphase: n=5) und ohne Endometriose

(Proliferationsphase: n=4, Sekretionsphase: n=4) keine Expressionsunterschiede detektiert

werden. In beiden Zyklusphasen wurde in den Endometrien von Endometriosepatientinnen

die gleiche Expressionsstärke nachgewiesen wie in den normalen Endometrien (Abb. 7A und

B). In den zusätzlich untersuchten endometriotischen Läsionen (Proliferationsphase: n=3,

Sekretionsphase: n=3) dagegen wurde sowohl in der Proliferationsphase als auch in der

Sekretionsphase mehr CTGF exprimiert als in den eutopen Endometrien (Abb. 7A und B). Im

Mittel konnte in beiden Zyklusphasen ein 1,7facher Anstieg der CTGF-Expression in den

endometriotischen Läsionen im Vergleich zum eutopen Endometrium beobachtet werden.

Aufgrund größerer Schwankungen im Expressionsniveau der einzelnen Versuche ergaben

sich allerdings keine signifikanten Expressionsunterschiede.

48

Ergebnisse

Cyr61

Um die in den Array-Analysen ermittelten Expressionsunterschiede von Cyr61 in den

Endometrien von Frauen mit Endometriose verglichen mit normalen Endometrien zu

verifizieren, wurden zusätzliche Gewebeproben mittels real-time RT-PCR untersucht. Bei

dieser Methode erfolgte der Nachweis des PCR-Produktes durch einen fluoreszierenden

Farbstoff, SYBR Green I, der sich in die entstehende doppelsträngige DNA einlagert (Abb.

8A). Wegen der unspezifischen Bindung von SYBR Green I an jede doppelsträngige DNA

mußten Cyr61 und β-Aktin in getrennten Ansätzen amplifiziert werden. Zusätzlich wurden die

Proben nach dem PCR-Lauf in einem 2 %igen Agarosegel aufgetrennt und es konnte

gezeigt werden, daß keine unspezifischen Amplifikationen stattgefunden haben (Abb. 8B). In

allen PCR-Ansätzen wurde nur ein einziges Fragment amplifiziert, das der Größe nach

entweder Cyr61 oder β-Aktin zugeordnet werden konnte.

Abb. 8: A: Schematische Darstellung der Nachweismethode durch SYBR Green I - - bei der real-time RT-PCR, übernommen aus „Der Experimentator: Molekularbiologie/Genomics“ (Mülhardt, 2002). B: Agarosegel nach der real-time RT-PCR. Es konnte gezeigt werden, daß keine unspezifischen Amplifikationen stattgefunden haben. In den untereinander liegenden Spuren wurden jeweils die gleichen Proben aufgetragen. Spur 1: 100 bp-Marker, Spur 2, 4, 6, 8, 10: normale Endometrien (Proliferationsphase), Spur 3, 5, 7, 9, 11: Endometrien von Endometriosepatientinnen (Proliferationsphase), Spur 12, 14, 16: normale Endometrien (Sekretionsphase), Spur 13, 15, 17: Endometrien von Endometriosepatientinnen (Sekretionsphase). Die Positionen der Transkripte von β-Aktin (214 bp) und Cyr61 (223 bp) wurden gekennzeichnet.

Bei der real-time RT-PCR wurden die CT-Werte der einzelnen Proben ermittelt und für die

Auswertung herangezogen. Der CT-Wert ist der PCR-Zyklus, an dem sich das

Fluoreszenzsignal gerade vom Hintergrund abhebt, zu diesem Zeitpunkt ist die Vermehrung

des PCR-Produktes noch exponentiell. Von dem CT-Wert lassen sich Rückschlüsse ziehen

auf die ursprünglich vorhandene cDNA-Menge. Je geringer der CT-Wert ist, desto größer

muß die Menge an cDNA gewesen sein. Die relative Quantifizierung erfolgte wie unter

49

Ergebnisse

3.4.2.2 beschrieben nach der vergleichenden CT-Methode. Zunächst wurden durch

Subtraktion der CT-Werte die Expressionsstärken der einzelnen Proben für Cyr61 gegen β-

Aktin abgeglichen und auf diese Weise relativiert. Diese relativierten Werte wurden jeweils

für die normalen Endometrien und die Endometrien von Endometriosepatientinnen aus jeder

Zyklusphase als Mittelwerte zusammengefaßt. Die normalen Endometrien wurden als

Calibrator genutzt, daher wurde der ermittelte Expressionslevel als 1 gesetzt. Der xfache

Expressionslevel der Endometrien von Endometriosepatientinnen bezogen auf das normale

Endometrium wurde durch Subtraktion des Calibrators und Einsetzen des erhaltenen Wertes

in die Formel 2-∆∆CT berechnet.

In den Array-Analysen war Cyr61 in 18 von 20 Vergleichen in den Endometrien von

Endometriosepatientinnen in der Sekretionsphase im Mittel 5fach stärker exprimiert als in

den normalen Endometrien der gleichen Zyklusphase (Tab. 3). Diese Regulation konnte in

weiteren Gewebeproben mittels real-time RT-PCR bestätigt werden. In der Sekretionsphase

wurde hier eine im Mittel 3fach stärkere Expression (maximal 15fach) von Cyr61 in den

Endometrien von Frauen mit Endometriose (n=10) im Vergleich zu normalen Endometrien

(n=8) detektiert (Abb. 9B). Abweichend von den Array-Analysen konnte in den mit Hilfe der

real-time RT-PCR untersuchten Geweben auch in der Proliferationsphase eine signifikant

stärkere Cyr61-Expression nachgewiesen werden. In den Endometrien von

Endometriosepatientinnen aus der Proliferationsphase (n=15) war der Expressionslevel von

Cyr61 im Mittel 2fach höher (maximal 6fach) als in den Endometrien von Frauen ohne

Endometriose (n=16) (Abb. 9A). Wegen dieser signifikanten Hochregulation von Cyr61 in

beiden Zyklusphasen fokussierten sich die weiteren Versuche auf das Cyr61-Gen.

Abb. 9, A und B: Validierung der Resultate der Array Analysen für Cyr61 mittels real-time RT-PCR. Der mittlere Expressionslevel der Endometrien von Endometriosepatientinnen bezogen auf normale Endometrien wurde ohne Standardabweichung dargestellt. In der Proliferationsphase (A) wurde ebenso wie in der Sekretionsphase (B) ein signifikanter Expressionsanstieg von Cyr61 in den Endometrien von Endometriosepatientinnen verglichen mit normalen Endometrien detektiert. A und B: Excel-Diagramme, *p≤0,05.

50

Ergebnisse

4.1.2 Cyr61-Expression in den endometriotischen Läsionen

Die Expression von Cyr61 wurde zusätzlich in den endometriotischen peritonealen Läsionen

der Proliferationsphase und der Sekretionsphase im Vergleich zum eutopen Endometrium

von Endometriosepatientinnen untersucht. Diese Versuche wurden ebenfalls mit Hilfe der

real-time RT-PCR durchgeführt. Wie für die endometrialen Gewebe beschrieben (s. 3.4.2.2

und 4.1.1.2) wurde die relative Expressionsstärke von Cyr61 in den endometriotischen

Läsionen gegen β-Aktin der jeweils gleichen Probe abgeglichen und die relativierten CT-

Werte anschließend für die einzelnen Zyklusphasen als Mittelwerte zusammengefaßt. Als

Calibrator wurde die bereits ermittelte mittlere Expression der Endometrien von

Endometriosepatientinnen genutzt (s. 4.1.1.2) und hier als 1 gesetzt.

Obwohl Cyr61 im Endometrium von Endometriosepatientinnen im Vergleich zum normalen

Endometrium bereits sehr viel stärker exprimiert war, konnte in den endometriotischen

Läsionen ein zusätzlicher Anstieg in der Expression von Cyr61 gezeigt werden (Abb. 10). In

der Sekretionsphase wurde in den Läsionen (n=4) eine im Mittel 20fach (maximal 70fach)

stärkere Expression detektiert als in den eutopen Endometrien (n=10) (Abb. 10B). Auch in

der Proliferationsphase war Cyr61 in den endometriotischen Läsionen (n=5) zusätzlich

signifikant hochreguliert, hier wurde eine im Mittel 4fach (maximal 10fach) höhere Expression

beobachtet als in den eutopen Endometrien (n=15) (Abb. 10A).

Abb. 10, A und B: Expression von Cyr61 in endometriotischen Läsionen, ermittelt mit Hilfe von real-time RT-PCR. Der mittlere Expressionslevel der endometriotischen Läsionen bezogen auf das Endometrium von Frauen mit Endometriose wurde ohne Standardabweichung dargestellt. In der Sekretionsphase wurde in den ektopen Läsionen eine im Mittel 20fach stärkere Expression detektiert als in den eutopen Endometrien (B). In der Proliferationsphase wurde in den Läsionen eine im Mittel 4fach höhere Cyr61-Expression detektiert als in den eutopen Endometrien (A). A und B: Excel-Diagramme, *p≤0,05.

51

Ergebnisse

4.1.3 Cyr61-Expression im Verlauf des Menstruationszyklus

Neben den Expressionsunterschieden zwischen den Endometrien von gesunden Frauen und

Endometriosepatientinnen zeigte sich, daß Cyr61 in den einzelnen Phasen des

Menstruationszyklus im Endometrium unterschiedlich stark exprimiert wird.

Dies ergab sich aus den Untersuchungen mit Hilfe der real-time RT-PCR. Die unter 4.1.1.2

für Cyr61 erhaltenen Ergebnisse der normalen Endometrien und der Endometrien von

Endometriosepatientinnen wurden hier den Zyklusphasen entsprechend verglichen. So

konnte festgestellt werden, daß sich die Cyr61-Expression im Laufe des Menstruationszyklus

veränderte, sowohl in Endometrien von Frauen mit als auch ohne Endometriose. Für diese

Vergleiche wurden die Endometrien aus der Proliferationsphase jeweils von gesunden

Frauen und von Endometriosepatientinnen als Calibrator genutzt und der hierfür ermittelte

mittlere Expressionslevel als 1 gesetzt.

In der Proliferationsphase wurde sowohl im normalen Endometrium als auch im

Endometrium von Endometriosepatientinnen eine stärkere Expression detektiert als in der

Sekretionsphase (Abb. 11). In den Endometrien von gesunden Frauen wurde in der

Sekretionsphase (n=8) im Mittel 3fach weniger Cyr61 exprimiert als in der

Proliferationsphase (n=16) (Abb. 11A). In den Endometrien von Endometriosepatientinnen

aus der Sekretionsphase (n=10) war der Expressionslevel von Cyr61 im Mittel 2fach geringer

als in den Endometrien aus der Proliferationsphase (n=15) (Abb. 11B). Allerdings konnte nur

in den Endometrien von gesunden Frauen eine statistisch signifikante Reduktion detektiert

werden, in den Endometrien von Frauen mit Endometriose war die Herunterregulation des

Cyr61-Gens statistisch nicht signifikant.

Abb. 11, A und B: Veränderungen der Cyr61-Expression während des Menstruationszyklus. Die mittels real-time RT-PCR ermittelten relativierten Expressionsstärken für die normalen Endometrien und die Endometrien von Endometriosepatientinnen wurden für jede Zyklusphase zusammengefaßt. Der mittlere Expressionslevel der Endometrien aus der Sekretionsphase jeweils von Frauen mit und ohne Endometriose bezogen auf das jeweilige Endometrium aus der Proliferationsphase wurde ohne Standardabweichung dargestellt. Sowohl im normalen Endometrium (A) als auch im Endometrium von Frauen mit Endometriose (B) wurde Cyr61 in der Proliferationsphase stärker exprimiert als in der Sekretionsphase. Dieser Expressionsunterschied war jedoch nur in den normalen Endometrien signifikant. A und B: Excel-Diagramme, *p≤0,05.

52

Ergebnisse

4.2 Expression von Cyr61 auf Proteinebene

4.2.1 Western Blot

Das für den Western Blot verwendete Antiserum wurde freundlicherweise vom „Labor für

Molekulare Experimentelle Orthopädie“ der orthopädischen Universitätsklinik in Würzburg

zur Verfügung gestellt. Mit Hilfe dieses Western Blots konnte Cyr61 auch auf Proteinebene

im eutopen Endometrium von Frauen mit und ohne Endometriose detektiert werden (Abb.

12). Als Kontrolle wurde humanes Myometrium und Brustdrüsengewebe verwendet, in denen

Cyr61 mittels Western Blot bereits nachgewiesen werden konnte (Sampath et al., 2001a, b)

(Abb. 12, Spur 2 und 3). Der verwendete Sekundärantikörper reagierte mit den einzelnen

Banden des Markers, so daß es möglich war, die Größe der erhaltenen Banden direkt am

Blot zu bestimmen. In Übereinstimmung mit der Studie von Sampath et al. (2001a) wurde

nach der Antikörperreaktion eine einzelne Bande auf der Höhe von 42 kDa detektiert, was

dem Molekulargewicht von Cyr61 entspricht (Abb. 12). Das verwendete Antiserum scheint

zusätzlich eine unspezifische Reaktion einzugehen, da eine weitere schwächere Bande auf

der Höhe von 110 kDa in einigen Spuren nachgewiesen wurde. Über posttranslationale

Modifikationen des Cyr61-Proteins ist bis heute nichts bekannt.

Abb. 12: Western Blot zum Nachweis von Cyr61 in eutopen Endometrien von Frauen mit und ohne Endometriose aus der Proliferationsphase. Spur 1: Marker, Spur 2: humanes Myometrium, Spur 3: humanes Brustdrüsengewebe, Spur 4+5: normale Endometrien, Spur 6-8: Endometrien von Endometriosepatientinnen. Die Position des Cyr61-Proteins (42 kDa) wurde gekennzeichnet.

Es war nicht möglich, einen Abgleich des nachgewiesenen Proteins gegen β-Aktin

durchzuführen, um eine gleichmäßige Auftragung der Proteine in den einzelnen Spuren

nachzuweisen. Dadurch war es auch nicht möglich, eine Aussage über die tatsächlichen

Bandenstärken und damit über Expressionsunterschiede zwischen normalen Endometrien

(Proliferationsphase: n=2) und Endometrien von Endometriosepatientinnen

(Proliferationsphase: n=3) zu treffen. Unter der Annahme, daß die gleichen Proteinmengen in

jeder Spur aufgetragen wurden, war jedoch erkennbar, daß in den Endometrien gesunder

Frauen weniger Cyr61 exprimiert wurde als in den Endometrien von

Endometriosepatientinnen (Abb. 12, Spur 4-8). Es zeigte sich dann allerdings auch eine

53

Ergebnisse

ungewöhnlich starke Expression im humanen Brustdrüsengewebe (Sampath et al., 2001b)

(Abb. 12, Spur 3).

4.2.2 Immunhistochemie

Nach dem Nachweis des Cyr61-Proteins mittels Western Blot (s. 4.2.1) sollten die Zelltypen

identifiziert werden, in denen Cyr61 im humanen Endometrium sowie in endometriotischen

Läsionen auf Proteinebene exprimiert wird. Hierfür wurden in Kooperation mit dem „Labor für

Molekulare Experimentelle Orthopädie“ der Orthopädischen Universitätsklinik in Würzburg

immunhistochemische Untersuchungen durchgeführt. Da es sich bei Cyr61 um ein

sekretorisches Protein handelt, wurde es vorwiegend im apikalen Bereich der endometrialen

Drüsenepithelzellen sowohl im eutopen Endometrium (Abb. 13A) als auch in

endometriotischen Läsionen detektiert (Abb. 13B). Zusätzliche Immunlokalisationen wurden

auch im Drüsensekret beobachtet. In den stromalen Kompartimenten war keine eindeutige

Immunreaktion zu finden.

Abb. 13, A und B: Immunhistochemischer Nachweis von Cyr61 im Endometrium einer Endometriosepatientin (A) und in einer endometriotischen Läsion (B). Das Protein wurde vorwiegend im apikalen Bereich der endometrialen Drüsenepithelzellen sowie im Drüsensekret nachgewiesen (Pfeil). Balken: 50 µm.

4.3 Untersuchungen zur hormonellen Regulation von Cyr61

Um den hormonellen Einfluß auf Cyr61 zu untersuchen, wurden humane endometriale

Fragmente in einem Nacktmausmodell untersucht. Dieses Modell ist im Institut für Anatomie

in der Arbeitsgruppe von Frau Prof. Winterhager entwickelt worden (Grümmer et al., 2001).

Hierbei wurde das humane endometriale Gewebe sofort nach der Entnahme in Fragmente

von 1-2 mm zerschnitten und mit Hilfe von Nahtmaterial an der inneren Seite der Bauchwand

von weiblichen zyklischen Nacktmäusen fixiert (s. 3.6.3). Für die Untersuchungen zur

hormonellen Regulation wurde das Gewebe von 10 unterschiedlichen Patientinnen jeweils

auf bis zu vier Nacktmäuse verteilt. Je einer Maus wurde zusätzlich entweder ein reines Anti-

Östrogen (1 mg/kg, Schering, ZK 191703), 17β-Östradiol (3 µg/kg, Sigma), ein selektiver

Östrogenrezeptor-Modulator (SERM, 1 mg/kg, Schering, ZK 186619) oder das Vehikel

(Ethanol/Arachisöl im Verhältnis 1:10) täglich über einen Zeitraum von 14 Tagen s.c.

54

Ergebnisse

appliziert. Insgesamt wurden 7 normale Endometrien und 3 Endometrien von

Endometriosepatientinnen transplantiert. Nach Beendigung der Versuche stellte sich heraus,

daß ein normales Endometrium einer postmenopausalen Frau verwendet wurden, weitere

zwei normale Endometrien stammten von Frauen, die zur Zeit der OP die Pille einnahmen.

Diese Gewebe wurden dennoch in die Auswertung mit einbezogen, da sich keine

Abweichungen zeigten.

4.3.1 Validierung des Nacktmausmodells

4.3.1.1 Uterus- und Ovargewichte der Nacktmäuse

Zur Kontrolle, ob die s.c. verabreichten Hormone und Anti-Hormone ihre Zielorgane

erreichten, wurden der Uterus und die Ovarien der Nacktmäuse entnommen und das

Gewicht der Organe bestimmt (Lan und Katzenellenbogen, 1976). Die Organgewichte

wurden jeweils auf das Körpergewicht der Maus bezogen und anschließend für die einzelnen

Behandlungen als Mittelwerte zusammengefaßt (Abb. 14).

Abb. 14, A und B: Ovar- und Uterusgewichte der hormonbehandelten Nacktmäuse. Die mittleren Organgewichte plus Standardabweichungen wurden dargestellt. Die Gewichte der Ovarien wurden durch die verabreichten Substanzen nicht beeinflußt (A). Die Uterusgewichte dagegen nahmen nach Applikation des Anti-Östrogens signifikant ab und nach Behandlung mit Östradiol signifikant zu (B). C: Die Effekte der applizierten Hormone war auch makroskopisch erkennbar, die Uteri der mit Anti-Östrogen behandelten Tiere waren sehr viel dünner als die Uteri der Tiere, denen Östradiol verabreicht wurde. A und B: Excel-Diagramme, *p≤0,05, C: Photo.

Es zeigte sich, daß das Gewicht der Ovarien in den unterschiedlich behandelten Tieren nicht

variierte (Abb. 14A), die verabreichten Hormone zeigten also keine Nebenwirkungen. Das

Uterusgewicht dagegen wurde entsprechend von den verabreichten Hormonen beeinflußt.

Mäuse, denen ein Anti-Östrogen appliziert wurde, hatten ein signifikant geringeres

Uterusgewicht als die Kontrolltiere, das Organgewicht wurde fast um die Hälfte reduziert

(Abb. 14B). Durch die Applikation von Östradiol wurde das Uterusgewicht im Vergleich zum

55

Ergebnisse

Vehikel signifikant gesteigert (Abb. 14B). Die Uterusgewichte der Tiere, denen das SERM

verabreicht wurde, zeigten eine 20 %ige Reduktion gegenüber den Kontrolltieren, diese

Reduktion war jedoch nicht signifikant (Abb. 14B). Die Effekte der applizierten Hormone war

auch makroskopisch erkennbar, die Uteri der mit Anti-Östrogen behandelten Tiere waren

sehr viel dünner als die Uteri der Tiere, denen Östradiol verabreicht wurde (Abb. 14C). Nach

Applikation des SERM zeigten sich makroskopisch dickere Uteri als in den mit Anti-Östrogen

behandelten Tieren aber dünnere Uteri als in den der mit Östradiol behandelten Tieren (Abb.

14C). Die applizierten Hormone hatten damit das Zielorgan, den Uterus, entsprechend

beeinflußt und so die lokale Wirkung bestätigt.

4.3.1.2 Zellhöhe und Proliferation des Uterusepithels der behandelten Nacktmäuse

Epithelhöhen

In Kooperation mit der Schering AG (Berlin) wurden die Epithelhöhen der Maus-Uteri

bestimmt, denn ein weiterer Parameter für östrogene Wirkung ist die Höhe des

Uterusepithels. An Paraffin-Schnitten der Maus-Uteri 6 verschiedener Versuchsreihen

wurden die Höhen der Uterusepithelien ermittelt und für die einzelnen Behandlungen als

Mittelwerte zusammengefaßt. Durch die Bestimmung der Uterusgewichte konnte bereits

demonstriert werden, daß die den Nacktmäusen applizierten Hormone das Zielorgan, den

Uterus, erreichen und beeinflussen (s. 4.3.1.1).

Diese Ergebnisse bestätigten sich nur teilweise in den gemessenen Epithelhöhen. Durch die

Applikation des Anti-Östrogens wurden die Uterusepithel-Höhen in diesen Tieren signifikant

um durchschnittlich 35 % reduziert (Abb. 15). Der Entzug von Östrogen wirkte sich also auch

auf die Höhe des Uterusepithels aus. Allerdings konnte durch die Behandlung der zyklischen

Tiere mit zusätzlichen Mengen Östradiol kein entsprechender Effekt erzeugt werden. In den

Tieren, denen Östradiol appliziert wurde, zeigte sich ebenfalls eine leichte aber nicht

signifikante Reduktion der Epithelhöhen gegenüber dem Vehikel (Abb. 15). Im Durchschnitt

waren die Uterusepithelien der mit SERM behandelten Tiere knapp 30 % niedriger

verglichen mit den Kontrolltieren, bedingt durch hohe Schwankungen in den einzelnen

Versuchsreihen war diese Reduktion jedoch nicht signifikant (Abb. 15).

Die durch die Gewichtsbestimmung der Uteri ermittelten Einflüsse der verabreichten

Hormone ließen sich für die Epithelhöhen nur tendenziell bestätigen. Es konnte zwar durch

die Applikation des Anti-Östrogens die erwartete signifikante Reduktion erzielt werden, die

Behandlung mit Östradiol hatte jedoch auf das Uterusepithel keinen Effekt. Auffällig waren

die starken Schwankungen zwischen den einzelnen Versuchsreihen.

56

Ergebnisse

Abb. 15: Epithelhöhen der Maus-Uteri nach hormoneller Behandlung. Die Epithelhöhen aus 6 verschiedenen Versuchsreihen wurden als Mittelwerte plus Standardabweichungen dargestellt. Die Uterusepithel-Höhen der mit Anti-Östrogen behandelten Tiere wurden signifikant reduziert. In den Tieren, die mit Östradiol oder SERM behandelt wurden, konnten keine signifikanten Änderungen der Epithelhöhen verglichen mit dem Vehikel detektiert werden. Excel-Diagramm, *p≤0,05.

Proliferation

Zusätzlich wurde in den Uteri der hormonbehandelten Mäuse 5 verschiedener

Versuchsreihen mittels immunhistochemischer Färbung die Expression des

Proliferationsmarkers Ki67 untersucht, der in allen Phasen der Mitose exprimiert wird, mit

Ausnahme der G0-Phase (Schlüter et al., 1993). In allen Fällen wurde Ki67 hauptsächlich im

Uterusepithel nachgewiesen, Proliferation im Stroma konnte nur sehr selten beobachtet

werden (Abb. 16). Eindeutige Effekte der applizierten Hormone konnten nicht detektiert

werden, da sich die Ergebnisse der einzelnen Versuchsreihen sehr stark voneinander

unterschieden. In der ersten Versuchsreihe zeigte das Uterusepithel der mit Vehikel

behandelten Maus etwa eine gleich starke Proliferation wie das Uterusepithel der Maus,

denen Östradiol verabreicht wurde (Abb. 16A). In der mit Anti-Östrogen behandelten Maus

konnte dagegen keine Ki67-Färbung nachgewiesen werden (Abb. 16A). In dem Uterus der

Maus, der das SERM appliziert wurde, wurde nur geringe Proliferationsaktivität detektiert

(Abb. 16A). Die Ki67-Färbung war hier deutlicher als in dem mit Anti-Östrogen behandelten

Tier, jedoch nicht so stark wie in den Mäusen, denen das Vehikel bzw. Östradiol verabreicht

wurde.

In einer weiteren Versuchsreihe war die Proliferationsaktivität genau umgekehrt verteilt. In

diesem Fall wurde die stärkste Ki67-Färbung im Uterus der mit Anti-Östrogen behandelten

Maus detektiert (Abb. 16B). In den mit Vehikel oder SERM behandelten Tieren zeigte sich

eine schwächere Proliferationsaktivität, während im Uterus der mit Östradiol behandelten

Maus kein Ki67 nachgewiesen werden konnte (Abb. 16B). Auch in den drei übrigen

Versuchsreihen konnte die Proliferationsaktivität im Uterusepithel nicht den applizierten

Substanzen zugeordnet werden (Daten nicht gezeigt). Obwohl nach der Messung der

Uterusepithel-Höhen eine statistisch signifikante Reduktion in den mit Anti-Östrogen

behandelten Tieren im Vergleich zum Vehikel detektiert wurde (Abb. 15), wurde die

57

Ergebnisse

Proliferationsrate im Uterusepithel der Mäuse durch die applizierten Substanzen nicht

beeinflußt (Abb. 16) und stellte damit keinen Marker für östrogene Wirkung dar.

Abb. 16, A und B: Immunhistochemischer Nachweis von Ki67 in den Nacktmaus-Uteri nach hormoneller Behandlung zur Darstellung der Proliferationsaktivität. A: In der dargestellten

len Behandlung auf die transplantierten Fragmente

bb. 17A: Photo einer weiblichen Nacktmaus, der humane endometriale Fragmente an der

inneren Bauchwandseite fixiert wurden. B: Die Fragmente konnten anhand der Fixierungsnähte am

Versuchsreihe wurde die deutlichste Proliferationsaktivität in den Uterusepithelien der mit Vehikel und Östradiol behandelten Tiere nachgewiesen. B: In dieser Versuchsreihe zeigte sich eine umgekehrte Verteilung. Die deutlichste Proliferationsaktivität wurde hier in den mit Anti-Östrogen behandelten Tieren detektiert. Balken: 300 µm.

4.3.2 Einfluß der hormonel

Die an die Bauchwand angenähten humanen endometrialen Fragmente wurden anhand der

Fixierungsnähte lokalisiert (Abb. 17B). Für morphologische Untersuchungen wurden die

Fragmente zusammen mit einem Teil der Bauchwand entnommen, in Formalin fixiert und in

Paraffin eingebettet (s. 3.6.6).

A

Ende des Versuchs lokalisiert und entnommen werden. Die Pfeile weisen auf die vier transplantierten Fragmente.

58

Ergebnisse

Zur Untersuchung der Genexpression wurden die Fragmente direkt in flüssigem Stickstoff

gefroren. Bei der Entnahme der Fragmente wurde darauf geachtet, daß kein

Bauchwandgewebe der Nacktmaus mit entfernt wurde (3.6.5). Aus den Fragmenten wurde

Gesamt-RNA isoliert, der komplette Ansatz einem DNase-Verdau unterzogen und in die RT-

Reaktion eingesetzt. Die anschließende PCR wurde wegen der geringen Ausbeute an RNA

nur einmal mit jedem Fragment im Thermocycler durchgeführt (Primer und PCR-

Bedingungen, s. Tab. 1), und die Bandenstärke der PCR-Produkte wurde densitometrisch

mit Hilfe des Programms Gelscan Professional V4.0 bestimmt. Die Signalstärke des Zielgens

konnte nach Abzug des Hintergrunds in Relation zum β-Aktin-Signal derselben Probe

gesetzt werden. Die relativen Expressionswerte der Fragmente aus den Nacktmäusen,

denen das Vehikel appliziert wurde, wurden für jede Versuchsreihe als Kontrolle genutzt und

1 gesetzt. Die Expressionslevel in den Fragmenten der mit Östradiol, Anti-Östrogen und

SERM behandelten Tiere wurden in jeder Versuchsreihe gegen das jeweilige Vehikel der

gleichen Versuchsreiche abgeglichen, anschließend für jede Substanz als Mittelwert

zusammengefaßt und als xfache Expression bezogen auf das Vehikel dargestellt.

In einigen Versuchsreihen konnte wegen zu geringer Ausbeute an RNA aus den Fragmenten

des mit Vehikel behandelten Tieres keine PCR durchgeführt werden. Dann wurde der

Expressionslevel in den Fragmenten der mit Östradiol, Anti-Östrogen oder SERM

behandelten Tiere der entsprechenden Versuchsreihe gegen den Mittelwert der relativen

Expressionswerte aus den mit Vehikel behandelten Tiere der übrigen Versuchsreihen

abgeglichen und in die weiteren Berechnungen mit einbezogen. Es war aufgrund der

geringen Ausbeute an RNA auch nicht möglich, die Expression jedes Gens in jeder der 10

Versuchsreihen zu untersuchen.

4.3.2.1 Expression der Östrogenrezeptoren ERα und ERβ

ERα

Die Expression eines Östrogenrezeptors ist Voraussetzung für die Wirkung der applizierten

Substanzen, daher wurde untersucht, ob in den humanen endometrialen Fragmenten nach

Transplantation in die Nacktmaus die Östrogenrezeptoren ERα und ERβ exprimiert werden.

Der Östrogenrezeptor ERα konnte in allen untersuchten humanen endometrialen

Fragmenten, die in die Nacktmaus transplantiert wurden, nachgewiesen werden (Abb. 18A).

Durch die applizierten Substanzen wurde die Menge des exprimierten Gens allerdings nicht

beeinflußt (Abb. 18B). In den Fragmenten der Tiere, die mit Östradiol behandelt wurden,

zeigte sich im Mittel eine gleich starke Expression wie in den Fragmenten der Tiere, denen

das Vehikel verabreicht wurde (Abb. 18B). Durch die Applikation des Anti-Östrogens wurde

die Expression von ERα verglichen mit den Fragmenten der Kontrolltiere reduziert, allerdings

59

Ergebnisse

nicht signifikant (Abb. 18B). Nach Behandlung der Tiere mit dem SERM, zeigte sich eine im

Durchschnitt um den Faktor 1,3 erhöhte Expression verglichen mit dem Vehikel. In den

einzelnen Versuchsreihen wurde ERα in den mit SERM behandelten Tieren sehr

unterschiedlich stark exprimiert, woraus eine hohe Standardabweichung resultierte (Abb.

18B). Eine signifikante Änderung der Expression von ERα konnte daher auch in diesen

Fragmenten nicht nachgewiesen werden.

Der Östrogenrezeptor ERα wurde in allen transplantierten Fragmenten nachgewiesen, eine

Wirkung der östrogenwirksamen Substanzen auf die transplantierten Fragmente war daher

möglich. Signifikante Änderungen des Rezeptors ERα durch die verabreichten Hormone

konnten nicht beobachtet werden.

Abb. 18, A und B: Expression des Östrogenrezeptors ERα in humanen endometrialen Fragmenten nach Kultivierung in der Nacktmaus. Die mit Hilfe von RT-PCR ermittelten mittleren Expressionswerte der hormonell behandelten Tiere wurden als xfache Expression bezogen auf das Vehikel plus Standardabweichungen dargestellt (B). Der Östrogenrezeptor ERα konnte in allen untersuchten Fragmenten nachgewiesen werden (A), eine signifikante Beeinflussung des Expressionslevels durch die applizierten Substanzen wurde allerdings nicht beobachtet (B). A: Agarosegel, Spur 1: 100 bp-Marker, Spur 2: nicht transplantiertes Kontrollendometrium, Spur 3: Fragment aus einem mit Vehikel behandelten Tier, Spur 4: Fragment aus einem mit Anti-Östrogen behandelten Tier, Spur 5: Fragment aus einem mit Östradiol behandelten Tier, Spur 6: Fragment aus einem mit SERM behandelten Tier. Die Positionen der Transkripte von β-Aktin (698 bp) und ERα (227 bp) wurden gekennzeichnet. B: Excel-Diagramm.

60

Ergebnisse

ERβ

Der Östrogenrezeptor ERβ konnte unabhängig von den applizierten Substanzen (Abb. 19,

Spur 3-6) nicht in den transplantierten endometrialen Fragmenten nachgewiesen werden.

Nur in den Kontrollendometrien, die nicht transplantiert wurden, wurde ERβ schwach

exprimiert (Abb. 19, Spur 2).

Abb. 19: Expression des Östrogenrezeptors ERβ in humanen endometrialen Fragmenten nach Kultivierung in der Nacktmaus. Nur im Kontrollendometrium, das nicht transplantiert wurde, konnte eine schwache ERβ-Expression nachgewiesen werden (Spur 2). In den Fragmenten aus den Tieren, die mit Vehikel (Spur 3), Anti-Östrogen (Spur 4), Östradiol (Spur 5) oder SERM (Spur 6) behandelt wurden, konnte ERβ nicht detektiert werden. Spur 1: 100 bp-Marker. Die Positionen der Transkripte von β-Aktin (698 bp) und ERβ (279 bp) wurden gekennzeichnet.

4.3.2.2 Morphologie

Trotz der Behandlung der Nacktmäuse mit Östradiol, einem Anti-Östrogen oder einem

SERM zeigten sich keine Veränderungen in der Morphologie der transplantierten humanen

endometrialen Fragmente.

In den meisten der untersuchten Fragmente wurden endometriale Drüsen und stromales

Gewebe identifiziert (Abb. 20). Weiterhin adhärierte in allen untersuchten Fragmenten das

stromale Gewebe an die anliegende Bauchwand der Nacktmaus, nie das Drüsenepithel

(Abb. 20B). In den Fragmenten der Kontrolltiere wurden sowohl englumige Drüsen mit

zylindrischem bis hohem Epithel gefunden als auch weitlumige zystenartige Drüsen mit

flachem Epithel (Abb. 20A, Ausschnittsvergrößerung), das Stroma war meist zellreich und

von Lymphozyten durchsetzt. Die Fragmente aus den mit Östradiol behandelten Tieren

zeigten ein ähnliches Bild (Abb. 20E, Ausschnittsvergrößerung).

Andererseits zeigte sich eine sehr hohe Varianz zwischen den untersuchten Fragmenten, die

jedoch in keinem Zusammenhang stand mit der verabreichten Substanz. Wurden mehrere

Fragmente aus einer Maus histologisch aufgearbeitet, konnten zwischen diesen

morphologische Unterschiede detektiert werden. Die zwei in Abbildung 20C und 20D

gezeigten Fragmente stammten beide aus der gleichen mit Anti-Östrogen behandelten

Maus. Während das eine Fragment sehr klein war und hier nur eine weitlumige dilatierte

61

Ergebnisse

Drüse vorhanden war (Abb. 20C, Ausschnittsvergrößerung), war das andere Fragment sehr

viel größer, und es konnten mehrere auch englumige Drüsen mit zylindrischem Epithel

beobachtet werden (Abb. 20D, Ausschnittsvergrößerung). Charakteristisch für die mit dem

SERM behandelten Fragmente waren langgezogene englumige Drüsen mit einem hohen

Epithel (Abb. 20F, Ausschnittsvergrößerung). Diese Drüsen, die dem Querschnitt eines

Maus-Uterus glichen, wurden nur in den mit SERM behandelten Fragmenten beobachtet,

allerdings nicht in allen.

Abb. 20, A-F: Morphologie der humanen endometrialen Fragmente nach Kultivierung in der Nacktmaus und unterschiedlicher hormoneller Behandlung. Die Fragmente aus den Tieren, denen das Vehikel (A und B), Anti-Östrogen (C und D), Östradiol (E) oder SERM (F) appliziert wurde, wiesen keine morphologischen Unterschiede auf. B: Invasion der Stromazellen (S) in die anliegende Bauchwand der Nacktmaus. BW: Bauchwand der Nacktmaus, F: transplantiertes humanes Fragment, N: Fixierungsnaht. Balken: in A und C-F: 160 µm, in B: 25 µm, in den Ausschnittsvergrößerungen A-E: 100 µm, in der Ausschnittsvergrößerung F: 80 µm.

62

Ergebnisse

Durch die morphologischen Untersuchungen der humanen Fragmente konnten daher keine

Rückschlüsse auf die Behandlung der Nacktmäuse gezogen werden, Veränderungen

zwischen den Fragmenten aus den unterschiedlich behandelten Tieren konnten nicht

nachgewiesen werden.

Epithelzellhöhen in den transplantierten Fragmenten

In Kooperation mit der Schering AG wurden die Höhen der Epithelzellen in den

endometrialen Drüsen der transplantierten Fragmente bestimmt. Als meßbar galten die

Drüsen, bei denen eine deutliche Zellschicht zu erkennen war. Große Drüsen wurden an

verschiedenen Stellen vermessen und die Ergebnisse gemittelt. Auch wenn mehrere Drüsen

in einem Schnitt vorhanden waren, wurde aus den erhaltenen Werten der Mittelwert

berechnet. Aus 4 verschiedenen Versuchsreihen wurden die gemessenen Epithelzellhöhen

für die verabreichten Substanzen als Mittelwerte zusammengefaßt.

In den transplantierten Fragmenten konnten in Abhängigkeit der Substanzen, die den

Nacktmäusen appliziert wurden, keine signifikanten Unterschiede in den Epithelhöhen der

endometrialen Drüsen detektiert werden (Abb. 21). Die geringsten Epithelhöhen wurden in

den Fragmenten der Tiere gemessen, die mit dem Vehikel oder mit Östradiol behandelt

wurden. Eine leichte Zunahme in der Höhe der Drüsenepithelzellen im Vergleich zu den

Kontrolltieren wurde in den Fragmenten detektiert, denen Anti-Östrogen oder SERM

appliziert wurde. In diesen Fragmenten zeigten sich allerdings auch sehr hohe

Schwankungen zwischen den einzelnen Messungen, so daß keine signifikante Veränderung

vorlag. Wie bereits in den morphologischen Untersuchungen festgestellt (Abb. 20) zeigten

sich keine Veränderungen in den transplantierten Fragmenten nach unterschiedlicher

Behandlung der Nacktmäuse. Dies traf auch auf die Höhe der Drüsenepithelzellen zu (Abb.

21).

Abb. 21: Epithelzellhöhen der endometrialen Drüsen aus den transplantierten humanen Fragmenten nach hormoneller Behandlung der Nacktmäuse. Die Epithelzellhöhen aus 4 verschiedenen Versuchsreihen wurden als Mittelwerte plus Standardabweichungen dargestellt. Es konnten keine signifikanten Veränderungen im Vergleich zum Vehikel detektiert werden. Excel-Diagramm.

63

Ergebnisse

4.3.2.3 Genexpression

Das Modell wurde zusätzlich genutzt, um eine mögliche Östrogenregulation der Gene Cyr61,

CTGF, Cx43, Cx26, bFGF und VEGF zu untersuchen (s. 4.3.2).

Cyr61

Es zeigte sich, daß die Behandlung der Nacktmäuse mit unterschiedlichen Hormonen

starken Einfluß hatte auf die Cyr61-Expression in den kultivierten humanen endometrialen

Fragmenten. Durch die Verabreichung des reinen Anti-Östrogens, das eine ähnliche Wirkung

hat wie ICI und die durch den Östrogenrezeptor induzierte Transkriptionsaktivität blockiert

(Hermenegildo und Cano, 2000), konnte die Expression des Cyr61 signifikant inhibiert

werden (Abb. 22A, Spur 4 und Abb. 22B). In sieben von zehn Versuchsreihen wurde in den

Fragmenten aus den mit Anti-Östrogen behandelten Tieren eine 2-6fach reduzierte

Expression im Vergleich zum Vehikel detektiert. In zwei Versuchsreihen dagegen war die

Expression in den mit Anti-Östrogen behandelten Fragmenten etwa vergleichbar mit der

Expression des Vehikels, in einer weiteren Versuchsreihe zeigte sich sogar eine 2fach

erhöhte Expression des Cyr61 im Anti-Östrogen behandelten Tier (Abb. 22C und D).

Durch die Applikation des Anti-Östrogens war es allerdings nicht möglich, die Expression von

Cyr61 vollständig zu inhibieren, eine schwache Genexpression war in den Fragmenten

immer nachweisbar (Abb. 22A, Spur 4). Auch konnte die den zyklischen Nacktmäusen

zusätzlich applizierte Menge an Östradiol die Expression von Cyr61 in den humanen

Fragmenten im Vergleich zum Vehikel nur in einem Fall um den Faktor 2,5 steigern, in den

übrigen Versuchsreihen entsprach sie in etwa dem Vehikel. Die Schwankungen der Cyr61-

Expression in den mit Östradiol behandelten Fragmenten waren vergleichsweise hoch (Abb.

22B).

Durch die Applikation des SERM wurde die Expression von Cyr61 in den humanen

Fragmenten ebenfalls signifikant reduziert. In den einzelnen Versuchen zeigte sich eine bis

zu 4fach geringere Expression in den mit SERM behandelten Fragmenten verglichen mit den

Kontrolltieren. Der Expressionslevel von Cyr61 war daher in den mit SERM behandelten

Fragmenten erniedrigt gegenüber dem Vehikel, jedoch leicht erhöht gegenüber den mit Anti-

Östrogen behandelten Fragmenten (Abb. 22B).

64

Ergebnisse

Abb. 22, A-F: Beeinflussung der Expression der CCN-Proteine Cyr61 (A-D) und CTGF (E und F)

von RT-PCR ermittelten mittleren Expressionswerte der hormonell behandelten Tiere wurden als

E und F: Die Expression von CTGF wurde in den transplantierten endometrialen Fragmenten durch

nt aus einem mit SERM behandelten Tier. Die Positionen der Transkripte von β-Aktin (698 bp), 197 bp) und CTGF (451 bp) wurden gekennzeichnet. B, D, F: Excel-Diagramme, *p≤0,05.

ehikel behandelten Fragmente ein ähnliches

Expressionsmuster von Cyr61 wie die eutopen Endometrien (Abb. 23A). Cyr61 wurde auch

hier im apikalen Bereich der endometrialen Drüsenepithelien detektiert, zusätzlich zeigte sich

allerdings auch eine schwache Expression im Stroma. Nach Behandlung der Nacktmäuse

mit einem Anti-Östrogen konnte Cyr61 dagegen kaum nachgewiesen werden (Abb. 23B).

in den transplantierten Fragmenten durch die Applikation verschiedener Hormone. Die mit Hilfe

xfache Expression bezogen auf das Vehikel plus Standardabweichungen dargestellt. A-D: Die Cyr61-Expression in den transplantierten Fragmenten wurde nach Applikation des Anti-Östrogens signifikant reduziert (A und B). In drei weiteren Versuchsreihen konnten diese Resultate nicht bestätigt werden (C und D).

die hormonelle Behandlung nicht verändert. A, C, E: Agarosegele, Spur 1: 100 bp-Marker, Spur 2: nicht transplantiertes Kontrollendometrium, Spur 3: Fragment aus einem mit Vehikel behandelten Tier, Spur 4: Fragment aus einem mit Anti-Östrogen behandelten Tier, Spur 5: Fragment aus einem mit Östradiol behandelten Tier, Spur 6: FragmeCyr61 (

Cyr61 schien in den transplantierten endometrialen Fragmenten trotz zwei Ausreißern

östrogenabhängig exprimiert zu werden, durch Behandlung der Nacktmäuse mit einem Anti-

Östrogen oder SERM wurde die Expression signifikant reduziert. Diese Reduktion konnte

auch immunhistochemisch nachgewiesen werden. Nach Behandlung der Fragmente mit

einem gegen Cyr61 gerichteten Antikörper und Nachweis durch einen Fluoreszenzfarbstoff-

markierten Sekundärantikörper zeigten die mit V

65

Ergebnisse

66

Abb. 23, A und B: Immunhistochemischer Nachweis von Cyr61 in transplantierten humanen Fragmenten nach hormoneller Behandlung der Nacktmäuse. In den mit Vehikel behandelten Tieren zeigte Cyr61 in den transplantierten Fragmenten ein ähnliches Expressionsmuster wie im eutopen Endometrium (A). In den Tieren, denen das Anti-Östrogen appliziert wurde, konnte Cyr61 kaum detektiert werden (B). A und B: Fluoreszenz. Balken: 50 µm.

CTGF

In den humanen endometrialen Fragmenten, die für 14 Tage in der Nacktmaus kultiviert

wurden, konnte CTGF nachgewiesen werden (Abb. 22E), eine Beeinflussung der Expression

durch die verabreichten Hormone war jedoch nicht gegeben. Keine der den Nacktmäusen

applizierten Substanzen konnte die Expression von CTGF in den endometrialen Fragmenten

verändern (Abb. 22F). Im Mittel entsprachen die Expressionswerte in den Fragmenten der

Transplantation in die Nacktmaus durch hormonelle Behandlung der Tiere beeinflußt

er

weiteren Versuchsreihe war Cx43 in den mit Östradiol behandelten Tieren stark

herunterreguliert (Abb. 24C und D). In diesen Fragmenten der beiden Versuchsreihen wurde

mit Anti-Östrogen, Östradiol oder SERM behandelten Tiere denen der Kontrolltiere. In den

einzelnen Versuchsreihen wurden bezüglich der CTGF-Expression kaum Schwankungen

beobachtet. Eine Regulation von CTGF im Endometrium durch Östrogen konnte nicht


Cx43

Die Expression des östrogensensitiven Gap Junction-Proteins Connexin 43 (Cx43)

(Grümmer et al., 1999) konnte in den humanen endometrialen Fragmenten nach

werden. Es zeigte sich ein ähnliches Expressionsmuster wie bei Cyr61. In den Fragmenten

der mit Anti-Östrogen behandelten Nacktmäuse war die Expression des Cx43 in 7 von 9

Versuchsreihen bezogen auf die Expression in den Fragmenten der mit Vehikel behandelten

Tiere reduziert (Abb. 24A und B). In zwei dieser Versuchsreihen war Cx43 in den mit Anti-

Östrogen behandelten Tieren kaum nachweisbar, hier zeigte sich gegenüber dem Vehikel

eine bis zu 20fache Reduktion. Bedingt durch größere Schwankungen war die Reduktion

durch das Anti-Östrogen jedoch nicht signifikant (Abb. 24B).

In einem Fall wurde eine 2fach höhere Cx43-Expression in den mit Anti-Östrogen

behandelten Fragmenten detektiert als in den mit Vehikel behandelten Fragmenten, in ein

Ergebnisse

auch Cyr61 anders exprimiert als erwartet (Abb. 22D), d.h. es bleibt zu klären, wie diese

paradoxe Genexpression in zwei Versuchsreihen zustande kommen konnte.

Die den zyklischen Nacktmäusen zusätzlich applizierte Menge an Östradiol konnte auch die

Expression von Cx43 in den humanen Fragmenten im Vergleich zum Vehikel nicht signifikant

steigern (Abb. 24B). Ähnlich der Expression des Cyr61 wurde auch das Cx43 in den

Fragmenten der mit Östradiol behandelten Tiere in den einzelnen Versuchsreihen

zeigten sich unterschiedlich hohe Cx43-Expressionswerte in den mit SERM behandelten

nten, auch hier ergab sich dadurch eine sehr hohe Standardabweichung. Im Mittel

unterschiedlich stark exprimiert.

Die Behandlung der Nacktmäuse mit dem SERM hatte auf die Cx43-Expression in den

humanen endometrialen Fragmenten keinen Einfluß (Abb. 24B). In den einzelnen Versuchen

Fragme

entsprach die Expression von Cx43 in den mit SERM behandelten Fragmenten in etwa dem

Vehikel (Abb. 24B).

67

Ergebnisse

Abb. 24, A-F: Beeinflussung der Expression der Gap Junction-Proteine Cx43 (A-D) und Cx26 (E und F) in den transplantierten humanen Fragmenten durch die Applikation verschiedener Hormone. Die mit Hilfe von RT-PCR ermittelten mittleren Expressionswerte der hormonell behandelten Tiere wurden als xfache Expression bezogen auf das Vehikel plus Standardabweichungen dargestellt. A-D: Die Expression von Cx43 war in den Fragmenten der mit Anti-Östrogen behandelten Tiere am geringsten (A und B). In zwei weiteren Versuchsreihen konnten diese Resultate nicht bestätigt werden (C und D). E und F: Die Expression von Cx26 wurde in den transplantierten Fragmenten nicht durch die verabreichten Hormone beeinflußt. A, C, E: Agarosegele, Spur 1: 100 bp-Marker, Spur 2: nicht transplantiertes Kontrollendometrium, Spur 3: Fragment aus einem mit Vehikel behandelten Tier, Spur 4: Fragment aus einem mit Anti-Östrogen behandelten Tier, Spur 5: Fragment aus einem mit Östradiol behandelten Tier, Spur 6: Fragment aus einem mit SERM behandelten Tier. Die Positionen der Transkripte von β-Aktin (214 bp), Cx43 (811 bp) und Cx26 (556 bp) wurden gekennzeichnet. B, D, F: Excel-Diagramme.

Cx26

Obwohl bekannt ist, daß das Gap Junction-Protein Connexin 26 (Cx26) durch Östrogene

reguliert wird (Grümmer et al., 1999), konnten die den Nacktmäusen verabreichten Hormone

die Expression von Cx26 in den humanen endometrialen Fragmenten nicht beeinflussen

(Abb. 24E und F). Cx26 wurde in den Fragmenten der einzelnen Versuchsreihen unabhängig

von der verabreichten Substanz sehr unterschiedlich stark exprimiert. Dadurch entstanden

hohe Standardabweichungen, eine durch die applizierten Hormone verursachte Regulation

des Cx26 konnte nicht nachgewiesen werden (Abb. 24F). Im Mittel entsprachen die

Expressionslevel in den Fragmenten der mit Östradiol und Anti-Östrogen behandelten Tiere

dem der Kontrollfragmente. In den Fragmenten der Tiere, denen SERM appliziert wurde,

konnte eine 1,7fache Reduktion der Cx26-Expression detektiert werden, die statistisch

jedoch nicht signifikant war (Abb. 24F).

68

Ergebnisse

4.4 Lokale Östrogensynthese in ektopen endometriotischen Läsionen?

Durch real-time RT-PCR Analysen konnte gezeigt werden, daß Cyr61 im Laufe des

Menstruationszyklus in Abhängigkeit der auf das Endometrium einwirkenden Hormone

Östrogen und Progesteron unterschiedlich stark exprimiert wird (Abb. 11). Auch mit Hilfe des

Nacktmausmodells konnten Expressionsunterschiede nach Applikation eines reinen Anti-

Östrogens nachgewiesen werden (Abb. 22B). Zusätzlich wurde festgestellt, daß Cyr61 in

endometriotischen Läsionen sehr viel stärker exprimiert wird als im eutopen Endometrium

(Abb. 10). Diese Regulation war möglicherweise unabhängig von den im Ovar synthetisierten

Steroidhormonen. Zudem wird von Zeitoun und Bulun (1999) eine lokale Östrogensynthese

in den endometriotischen Läsionen durch eine abweichende Expression von Aromatase und

ein Ungleichgewicht der ebenfalls an der Östrogensynthese beteiligten Enzyme 17β-HSD1

und 17β-HSD2 postuliert. Zur Überprüfung dieser Theorie wurde die Expression von

Aromatase sowie von 17β-HSD1 und 17β-HSD2 in den Endometrien von Frauen mit und

ohne Endometriose und in endometriotischen Läsionen untersucht.

Aus Endometrien von Frauen mit und ohne Endometriose sowie aus endometriotischen

isten (Enantone-Gyn, Takeda) behandelt wurden. Die

gungen im Thermocycler durchgeführt, und die Bandenstärke der PCR-Produkte

(Gelscan Professional V4.0). Die Signalstärke der Zielgene

jeweiligen

Zyklusphase als Mittelwerte zusammengefaßt.

Läsionen wurde Gesamt-RNA isoliert und mittels reverser Transkription cDNA synthetisiert

(s. 3.3.4). Zusätzlich wurden 3 endometriotische Läsionen von Frauen untersucht, die über 6

Monate mit einem GnRH-Agon

anschließende PCR wurde dreimal mit jeder Gewebeprobe nach den in Tab. 1 angegebenen

PCR-Bedin

wurde densitometrisch bestimmt

konnte nach Abzug des Hintergrunds in Relation zum β-Aktin-Signal derselben Probe

gesetzt werden. Die relativen Expressionswerte wurden jeweils für die Endometrien von

Frauen mit und ohne Endometriose sowie für die endometriotischen Läsionen der

4.4.1 Aromatase-Expression

Transkripte der Aromatase konnten in keinem der untersuchten Gewebe gezeigt werden

(Abb. 25). Insgesamt wurden jeweils 4 Endometrien von Frauen mit und ohne Endometriose

sowie 3 endometriotische Läsionen aus der Proliferationsphase und jeweils 4 Endometrien

von Frauen mit und ohne Endometriose sowie 4 endometriotische Läsionen aus der

Sekretionsphase untersucht. Nur im Ovar, das als Kontrollgewebe genutzt wurde, wurde

Aromatase exprimiert, in den untersuchten Endometrien und endometriotischen Läsionen

konnte keine Aromatase-Expression detektiert werden (Abb. 25). Die Abb. 25 zeigt als

Beispiel die Resultate einiger getesteter Gewebe.

69

Ergebnisse

Abb. 25: Durch RT-PCR ermittelte Expression von Aromatase, dargestellt als Agarosegel. Nur im Ovar-Gewebe (Spur 2) konnte Aromatase nachgewiesen werden. In normalen Endometrien (Spur

endometriotischen Läsionen (Spur 11: Sekretionsphase, Spur 12-14: Proliferationsphase) konnte keine Aromatase-Expression detektiert werden. Spur 1: 100 bp-Marker. Die Positionen der Transkripte von β-Aktin (698 bp) und Aromatase (376 bp) wurden gekennzeichnet.

4.4.2 Expression von 17β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Typ 1

17β-HSD1 wird in der Proliferationsphase in den Endometrien von normalen Frauen (n=4) in

etwa gleich stark exprimiert wie in den Endometrien von Endometriosepatientinnen der

gleichen Zyklusphase (n=4) (Abb. 26A). Es konnten also keine

3-6, Sekretionsphase), Endometrien von Endometriosepatientinnen (Spur 7-10, Sekretionsphase) und

endometriosebedingten

SD1 in den endometriotischen Läsionen der

Sekretionsphase (n=3) allerdings im Mittel um den Faktor 2 stärker exprimiert als in den

eutopen Endometrien von Endometriosepatientinnen (Abb. 26B). Diese Hochregulation war

Die Expression von 17β-HSD1 war also in den Endometrien sowohl von gesunden Frauen

als auch von Frauen mit Endometriose zyklusabhängig exprimiert. Die im allgemeinen

geringe Expression wurde in den Endometrien der Sekretionsphase zusätzlich

herunterreguliert. In den endometriotischen Läsionen dagegen war 17β-HSD1 in der

Sekretionsphase sehr viel stärker exprimiert als in den endometriotischen Läsionen aus der

Proliferationsphase. Die zusätzlich untersuchten endometriotischen Läsionen der

Patientinnen, deren ovarielle Östrogensynthese durch einen GnRH-Agonisten für 6 Monate

blockiert wurde, zeigten ein ähnliches Expressionsmuster wie die endometriotischen

Unterschiede in der Expression von 17β-HSD1 detektiert werden. In den endometriotischen

Läsionen der Proliferationsphase (n=5) dagegen war das Enzym sehr schwach exprimiert,

verglichen mit dem eutopen Endometrium von Endometriosepatientinnen war die Expression

signifikant um den Faktor 3,5 reduziert (Abb. 26A).

Obwohl in allen untersuchten Geweben die Expression von 17β-HSD1 nur sehr gering war,

war die Expression des Enzyms in den Endometrien aus der Sekretionsphase im Mittel

weiter um den Faktor 2 reduziert, verglichen mit den Endometrien aus der

Proliferationsphase (Abb. 26A und B). Auch in den Geweben aus der Sekretionsphase

konnte kein Unterschied in der 17β-HSD1-Expression zwischen normalen Endometrien (n=6)

und den Endometrien von Frauen mit Endometriose (n=6) detektiert werden (Abb. 26B).

Anders als in der Proliferationsphase war 17β-H

jedoch statistisch nicht signifikant.

70

Ergebnisse

Läsionen aus der Proliferationsphase. Auch hier wurde das Enzym 17β-HSD1 nur sehr

schwach exprimiert (Abb. 26C).

und endometriotischen Läsionen aus der Proliferationsphase (A und D) und der

Läsionen von Patientinnen, die über 6 Monate mit einem GnRH-Agonisten behandelt wurden, konnten

Abb. 26, A-F: Expression von 17β-HSD1 (A-C) und 17β-HSD2 (D-F) in endometrialen Geweben

Sekretionsphase (B und E). Mittels RT-PCR konnten keine Expressionsunterschiede zwischen normalen Endometrien und Endometrien von Endometriosepatientinnen detektiert werden, weder für 17β-HSD1 noch für 17β-HSD2. In den endometriotischen Läsionen der Sekretionsphase zeigte sich eine Unregelmäßigkeit in der Expression der beiden Enzyme (B und E). In endometriotischen

beide Enzyme kaum detektiert werden (C und F). A-F: Die mittleren Expressionslevel plus Standardabweichungen wurden als Excel-Diagramme dargestellt, *p≤0,05.

71

Ergebnisse

4.4.3 Expression von 17β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Typ 2

17β-HSD2 ist ein weiteres Enzym, das an der Synthese von Östradiol beteiligt ist. Auch

bezogen auf die Expression von 17β-HSD2 konnten keine signifikanten Unterschiede

zwischen den Endometrien von Frauen mit und ohne Endometriose detektiert werden, weder

in der Proliferationsphase (jeweils n=4) (Abb. 26D) noch in der Sekretionsphase (jeweils

n=6) (Abb. 26E). Allerdings wurde das Enzym erwartungsgemäß im Laufe des

Menstruationszyklus unterschiedlich stark exprimiert. In der Sekretionsphase war der

Expressionslevel im Mittel um den Faktor 1,5 höher als in der Proliferationsphase.

In den endometriotischen Läsionen beider Zyklusphasen (Proliferationsphase: n=7,

Sekretionsphase: n=3) konnte 17β-HSD2 kaum nachgewiesen werden und war bezogen auf

das eutope Endometrium von Frauen mit Endometriose signifikant herunterreguliert (26D

und E). Vergleiche der Expressionsstärke von 17β-HSD2 in endometriotischen Läsionen der

Proliferationsphase und der Sekretionsphase unbehandelter Frauen mit der Expression in

den endometriotischen Läsionen von Frauen, die mit einem GnRH-Agonisten behandelt

wurden, ergaben, daß 17β-HSD2 in den Läsionen der GnRH behandelten Frauen fast nicht

detektierbar war (Abb. 26F).

Durch diese Untersuchungen wurde ein Ungleichgewicht der beiden Enzyme 17β-HSD1 und

17β-HSD2 in den endometriotischen Läsionen der Sekretionsphase detektiert. Während 17β-

HSD1 in den Läsionen exprimiert wurde, war 17β-HSD2 kaum detektierbar (Abb. 26B und

D). Das Enzym Aromatase konnte in keinem der untersuchten Gewebe nachgewiesen

werden (Abb. 25).

4.4.4 Expression von Cyr61 in GnRH behandelten endometriotischen Läsionen

Es sollte zudem überprüft werden, ob sich die Expression von Cyr61 in endometriotischen

Läsionen verändert, wenn die Frauen über einen Zeitraum von 6 Monaten mit einem GnRH-

Agonisten behandelt wurden, der die ovarielle Östrogensynthese inhibiert. Es wurde daher

die Expression von Cyr61 in endometriotischen Läsionen aus GnRH behandelten Frauen mit

er Expression in hormonell unbehandelten endometriotischen Läsionen aus der

Proliferationsphase und der Sekretionsphase verglichen. Diese Versuche wurden mit Hilfe

für die behandelten

Läsionen (n=3) als Mittelwerte zusammengefaßt. Als Calibrator wurde der Expressionslevel

d

der real-time RT-PCR durchgeführt. Wie für die endometrialen Gewebe beschrieben (s.

3.4.2.2 und 4.1.1.2) wurde die relative Expressionsstärke von Cyr61 in den

endometriotischen Läsionen gegen β-Aktin der jeweils gleichen Probe abgeglichen und die

relativierten CT-Werte anschließend für die unbehandelten Läsionen aus der

Proliferationsphase (n=5) und der Sekretionsphase (n=4) sowie

72

Ergebnisse

der hormonell unbehandelten endometriotischen Läsionen aus der Proliferationsphase

genutzt und hier als 1 gesetzt. Der xfache Expressionslevel der unbehandelten Läsionen aus

der Sekretionsphase und der GnRH behandelten endometriotischen Läsionen bezogen auf

die unbehandelten Läsionen aus der Proliferationsphase wurde durch Subtraktion des

Calibrators und Einsetzen des erhaltenen Wertes in die Formel 2 T berechnet.

Läsionen

beobachtet werden (Abb. 27). Auch nach der Blockierung der ovariellen Östrogensynthese

war das östrogenabhängige Gen Cyr61 in diesen Läsionen genauso stark exprimiert wie in

den unbehandelten Läsionen aus der Proliferationsphase. Nur in den unbehandelten

Abb. 27: Expression von Cyr61 in endometriotischen Läsionen von Patientinnen, deren

Unterschied in der Expression von Cyr61 verglichen mit hormonell unbehandelten endometriotischen

-∆∆C

Obwohl Cyr61 in den unbehandelten endometriotischen Läsionen sehr viel stärker exprimiert

war als in den eutopen Endometrien (Abb. 10), konnte in den GnRH behandelten

endometriotischen Läsionen kein signifikanter Unterschied zu den unbehandelten

endometriotischen Läsionen aus der Sekretionsphase wurde Cyr61 um den Faktor 2,5

stärker exprimiert (Abb. 27), hier wurde aber auch ein sehr viel stärkerer Anstieg in der

Expression verglichen mit den eutopen Endometrien detektiert als in der Proliferationsphase

(Abb. 10). Obwohl kein Östrogen durch die Ovarien produziert wurde, zeigte sich auch in den

GnRH behandelten endometriotischen Läsionen eine hohe Cyr61-Expression (Abb. 27).

ovarielle Östrogensynthese für 6 Monate durch einen GnRH-Agonisten blockiert wurde. Der mittlere Expressionslevel der unbehandelten Läsionen aus der Sekretionsphase sowie der GnRH-behandelten Läsionen bezogen auf die unbehandelten Läsionen aus der Proliferationsphase wurde ohne Standardabweichung dargestellt. In den GnRH-behandelten Läsionen zeigte sich kein

Läsionen aus der Proliferationsphase. In den unbehandelten Läsionen aus der Sekretionsphase wurde Cyr61 dagegen sehr viel stärker exprimiert. Excel-Diagramm.

73

Ergebnisse

4.5 Angiogenese

In „Gene-Array“ Analysen wurde VEGF im Endometrium von Endometriosepatientinnen der

Sekretionsphase als hochreguliertes Gen identifiziert (Tab. 3). Daher wurde die

4.5.1 Expression angiogenetischer Faktoren im eutopen Endometrium

Expression

der angiogenetischen Faktoren VEGF und bFGF im humanen eutopen Endometrium von

Frauen mit und ohne Endometriose untersucht.

die

Bandenstärke der PCR-Produkte wurde densitometrisch bestimmt (Gelscan Professional

V4.0). Die Signalstärke von bFGF und VEGF konnte nach Abzug des Hintergrunds in

Relation zum β-Aktin-Signal derselben Probe gesetzt werden. Die relativen

Expressionswerte wurden jeweils für die Endometrien von Frauen mit und ohne

Endometriose der jeweiligen Zyklusphase als Mittelwerte zusammengefaßt.

Aus den „Gene-Array“ Analysen ergab sich, daß VEGF in 10 von 20 Fällen in den

Endometrien von Endometriosepatientinnen in der Sekretionsphase hochreguliert war. Diese

Ergebnisse konnten nicht bestätigt werden. In den von uns mittels RT-PCR untersuchten

ewebeproben konnte kein signifikanter Unterschied in der Expression von VEGF zwischen

wurde in den Endometrien von Endometriosepatientinnen aus der Sekretionsphase (n=5)

ebenfalls nicht stärker exprimiert als in den Endometrien von Frauen ohne Endometriose der

gleichen Zyklusphase (n=5) (Abb. 28D). In der Proliferationsphase konnten ebenfalls keine

Unterschiede in der bFGF-Expression zwischen den verschiedenen Geweben (jeweils 9

Endometrien von Frauen mit und ohne Endometriose) festgestellt werden (Abb. 28C).

Allerdings wurden im Verlauf des Menstruationszyklus Expressionsunterschiede der beiden

Angiogenese-Faktoren im Endometrium detektiert. Sowohl VEGF (Abb. 28A, B) als auch

Jeweils 5 Endometrien von normalen Frauen und Endometriosepatientinnen aus der

Sekretionsphase wurden auf die Expression von VEGF und bFGF mittels RT-PCR getestet.

Aus der Proliferationsphase wurde der Expressionslevel von VEGF in jeweils 10

unterschiedlichen Endometrien von Frauen mit und ohne Endometriose untersucht, die

Expression von bFGF wurde in jeweils 9 verschiedenen Endometrien von gesunden Frauen

und Endometriosepatientinnen aus der Proliferationsphase getestet. Aus den einzelnen

Geweben wurde Gesamt-RNA isoliert und mittels Reverser Transkription in cDNA

umgeschrieben (s. 3.3.4). Die anschließenden PCR wurde dreimal mit jeder Gewebeprobe

im Thermocycler durchgeführt (Primer und PCR-Bedingungen, s. Tab. 1), und

G

den Kontrollendometrien (n=5) und den Endometrien von Endometriosepatientinnen (n=5) in

der Sekretionsphase detektiert werden (Abb. 28B). Auch in Geweben aus der

Proliferationsphase entsprach die VEGF-Expression in den Endometrien von

Endometriosepatientinnen (n=10) der Expression in den Kontrollendometrien (n=10) (Abb.

28A). Ähnliche Resultate wurden auch in bezug auf die bFGF-Expression erzielt. bFGF

74

Ergebnisse

bFGF (Abb. 28C, D) wurden tendenziell in der Proliferationsphase stärker exprimiert als in

der Sekretionsphase, diese Veränderungen konnten in den Kontrollendometrien und auch in

den Endometrien von Endometriosepatientinnen detektiert werden. Es handelte sich hierbei

Endometriale Fragmente, die an Orten außerhalb des Uterus wachsen, sind neben einer

hormonellen Versorgung vor allem auf eine ausreichende Vaskularisierung angewiesen

(Taylor et al., 2002a). In dem bereits beschriebenen Nacktmausmodell konnte nachgewiesen

werden, daß die transplantierten humanen endometrialen Fragmente, die an

unterschiedlichen Organen der Tiere lokalisiert wurden, durch neu entstandene Mausgefäße

ernährt werden (Grümmer et al., 2001). Darauf aufbauend sollten angiogenetische Faktoren

identifiziert werden, die bei dieser Gefäßneubildung eine Rolle spielen könnten, vor allem

unter dem Gesichtspunkt, daß Cyr61 ein proangiogenetischer Faktor ist (Lau und Lam,

1999).

on 1-2

mm zerschnitten und mit Hilfe von Nahtmaterial an der inneren Seite der Bauchwand von

weiblichen zyklischen Nacktmäusen fixiert (s. 3.6.3). Zur Kontrolle wurde ein Fragment des

jedoch nur um Tendenzen, eine statistisch signifikante Regulation konnte nicht


Abb. 28, A-D: Expression von VEGF (A und B) und bFGF (C und D) in eutopen Proliferationsphase (A und C) und der Sekretionsphase (B und D). Mittels RT-P

Endometrien der CR konnte weder

in der VEGF-Expression noch in der bFGF-Expression ein Unterschied zwischen den Kontrollendometrien und den Endometrien von Endometriosepatientinnen detektiert werden. Dargestellt sind die mittleren Expressionslevel plus Standardabweichungen als Excel-Diagramme.

4.5.2 Untersuchungen zur Angiogenese im Nacktmausmodell

Das humane endometriale Gewebe wurde sofort nach der Entnahme in Fragmente v

75

Ergebnisse

Ausgangsgewebes direkt in flüssigem Stickstoff gefroren und bis zum Ende des Versuchs

bei -80°C gelagert. Für die Untersuchungen zur Angiogenese wurde das Gewebe von 3

unterschiedlichen Endometriosepatientinnen jeweils auf 4 Nacktmäuse verteilt, pro Tier

wurden 4-6 endometriale Fragmente transplantiert. Die Mäuse blieben während des

Versuchszeitraums unbehandelt. In einer Zeitreihe wurde jeweils 2, 4, 7 und 14 Tage nach

Transplantation der humanen endometrialen Fragmente eine Maus getötet. Die Fragmente

wurden entnommen und entweder zur Isolierung von Gesamt-RNA direkt in flüssigem

Stickstoff gefroren oder für immunhistochemische Untersuchungen in Tissue Tek (OCT

Compound Sakura) in flüssigem Stickstoff gefroren.

4.5.2.1 Zeitlicher Verlauf der Angiogenese

Zur Untersuchung, nach welcher Zeit das Einwachsen neu gebildeter Mausgefäße von der

Bauchwand in die hier fixierten humanen endometrialen Fragmente beginnt, wurden Maus-

Endothelzellen immunhistochemisch nachgewiesen (s. 3.7.1).

Zwei Tage nach der Transplantation konnten noch keine von der Bauchwand der Nacktmaus

ausgehenden Blutgefäße in den humanen Fragmenten nachgewiesen werden (Abb. 29B,

Ausschnittsvergrößerung). Im Wirtsgewebe allerdings, das dem transplantierten Fragment

anliegt, wurden zahlreiche Gefäße detektiert. Bereits nach 4 Tagen konnten dann auch im

Transplantat Maus-Endothelzellen in einwachsenden Gefäßen beobachtet werden (Abb.

9D, Ausschnittsvergrößerung). Abhängig von der Größe des transplantierten Fragments

Anteil eingewachsene Mausgefäße detektiert werden (Abb. 29H, Ausschnittsvergrößerung).

2

invadierten die Gefäße 7 Tage nach Versuchsbeginn zunächst den Transplantatanteil, der

der Bauchwand anlag, oder sie durchsetzten bereits das ganze Fragment (Abb. 29F,

Ausschnittsvergrößerung). Nach 14 Tagen konnten in allen Fragmenten auch im innersten

76

Ergebnisse

Abb. 29: Immunhistochemischer Nachweis von Maus-Endothelzellen in transplantierten humanen endometrialen Fragmenten nach 2 Tagen (A und B), 4 Tagen (C und D), 7 Tagen (E und F) und 14 Tagen (G und H). Erst nach 4 Tagen konnten Mausgefäße in den humanen Fragmenten nachgewiesen werden (D, Ausschnitt), nach 7 Tagen waren die Fragmente bereits vollständig mit Gefäßen durchsetzt (F, Ausschnitt). A, C, E, G: Toluidinblau-Färbung; B, D, F, H: immunhistochemische Färbung. BW: Bauchwand der Nacktmaus, F: transplantiertes humanes Fragment, N: Fixierungsnaht. Balken: in A-H: 160 µm, in den Ausschnittsvergrößerungen von B, D und H: 200 µm, in der Ausschnittsvergrößerung von F: 50 µm.

77

Ergebnisse

4.5.2.2 Angiogenetische Faktoren im Nacktmausmodell

Zusätzlich sollten in diesen Versuchsansätzen die wichtigsten angiogenetischen Faktoren

untersucht werden, die bei der Gefäßneubildung in den transplantierten endometrialen

Fragmenten eine Rolle spielen könnten. Mittels RT-PCR wurde die Expression von bFGF,

VEGF, Cyr61 und die Expression je einer der Rezeptoren für bFGF und VEGF (bFGF-R-1

und KDR) in den Fragmenten in einer Zeitreihe untersucht. Nach Beendigung der Versuche

wurden die Fragmente entnommen und sofort in flüssigem Stickstoff gefroren. Dabei wurde

darauf geachtet, daß kein Bauchwandgewebe der Nacktmaus mit entfernt wurde.

Aus den transplantierten Fragmenten und dem Ausgangsgewebe, das nicht transplantiert

worden ist, wurde Gesamt-RNA isoliert, der komplette Ansatz einem DNase-Verdau

unterzogen und in die RT-Reaktion eingesetzt. Die anschließende PCR wurde wegen der

geringen Ausbeute an RNA nur einmal mit jedem Fragment im Thermocycler durchgeführt

(Primer und PCR-Bedingungen, s. Tab. 1), und die Bandenstärke der PCR-Produkte wurde

densitometrisch mit Hilfe des Programms Gelscan Professional V4.0 bestimmt. Die

Signalstärke des Zielgens konnte nach Abzug des Hintergrunds in Relation zum β-Aktin-

Signal derselben Probe gesetzt werden. Die relativen Expressionswerte des

Ausgangsgewebes wurden für jede der drei Versuchsreihen als Kontrolle genutzt und als 1

gesetzt (Tag 0). Die relativen Expressionswerte in den Fragmenten der Tiere, die nach 2, 4,

7 oder 14 Tagen getötet wurden, wurden in jeder Versuchsreihe gegen das jeweilige

Ausgangsgewebe der gleichen Versuchsreiche abgeglichen. Da in der ersten Versuchsreihe

die Expression aller Gene im Ausgangsgewebe sehr gering war, erfolgte der Abgleich hier

gegen den Mittelwert aller drei Ausgangsgewebe. Die Expressionslevel der Gene wurden

nach Abgleich gegen das Ausgangsgewebe für die drei Versuchsreihen als Mittelwerte

zusammengefaßt und als xfache Expression bezogen auf das Ausgangsgewebe dargestellt.

Cyr61/bFGF/VEGF

Alle drei angiogenetischen Faktoren, Cyr61, bFGF und VEGF, konnten sowohl im humanen

Endometrium, das als Ausgangsgewebe für die Versuche im Nacktmausmodell diente (Tag

0), als auch in den transplantierten endometrialen Fragmenten nachgewiesen werden (Abb.

30A). Die Neubildung der Blutgefäße in der Bauchwand der Nacktmaus beginnt vermutlich

am zweiten Tag nach der Transplantation der endometrialen Fragmente (Abb. 29B und D).

Zur gleichen Zeit veränderte sich auch die Expression der getesteten Angiogenese-Faktoren

). Cyr61 wurde im Mittel 1,6fach

in den endometrialen Fragmenten. Bei einsetzender Angiogenese in den humanen

Fragmenten in der Nacktmaus wurden vermehrt die angiogenetischen Faktoren Cyr61 und

bFGF exprimiert. Ein deutlicher Anstieg der Expression beider Faktoren konnte am Tag 2

nach der Transplantation in den endometrialen Fragmenten verglichen mit dem

Ausgangsgewebe (Tag 0) detektiert werden (Abb. 30A

78

Ergebnisse

stärker exprimiert verglichen mit dem Ausgangsgewebe, die Expression von bFGF stieg im

geringsten

auch die der Rezeptoren. Die Expression der Gene nach 2, 4, 7 und 14 Tagen wurden als xfache

Mittel um den Faktor 1,5 an. Auch im weiteren Versuchsverlauf blieb Cyr61 von den drei

getesteten angiogenetischen Faktoren der am stärksten exprimierte. Die Expression von

Cyr61 nahm im weiteren Versuchsverlauf ab und war an Tag 14 auf den Wert des

Ausgangsgewebes abgefallen (Abb. 30A). Im Vergleich dazu hatte die bFGF-Expression

bereits nach 7 Tagen den gleichen Level erreicht wie das Ausgangsgewebe, an Tag 14

wurde eine 1,4fach reduzierte Expression verglichen mit Tag 0 nachgewiesen (Abb. 30A).

Die Expression von VEGF zeigte dagegen in den endometrialen Fragmenten die

Veränderungen der getesteten Faktoren. Eine stärkere Expression von VEGF verglichen mit

dem Ausgangsgewebe konnte weder zu Beginn noch während des weiteren

Versuchsverlaufs beobachtet werden. Am Tag 2 wurde die gleiche Expressionsstärke

detektiert wie an Tag 0, im weiteren Verlauf nahm die Expression ab, bis an Tag 14 1,5fach

weniger VEGF exprimiert wurde als im Ausgangsgewebe (Abb. 30A). Wegen hoher

Schwankungen in den einzelnen Versuchsreihen konnten keine statistisch signifikanten

Expressionsänderungen nachgewiesen werden.

Während der Neubildung von Maus-Blutgefäßen und dem Einwachsen dieser Gefäße in die

transplantierten humanen endometrialen Fragmente wurde in diesen Fragmenten eine

Zunahme der angiogenetischen Faktoren Cyr61 und bFGF detektiert. Im weiteren

Kultivierungsverlauf zeigte Cyr61 eine verstärkte Expression bis zu 14 Tagen.

Abb. 30: Expression der angiogenetischen Faktoren bFGF, VEGF und Cyr61 (A) sowie der Rezeptoren bFGF-R-1 und KDR (B) in transplantierten humanen endometrialen Fragmenten nach 2, 4, 7 und 14 Tagen Kultivierung in der Nacktmaus. Zu Beginn der Angiogenese an Tag 2 nach der Transplantation veränderte sich sowohl die Expression der angiogenetischen Faktoren als

Expression bezogen auf das Ausgangsgewebe (Tag 0) plus Standardabweichungen dargestellt. A und B: Excel-Diagramme.

bFGF-R/VEGF-R

Die Expression der Rezeptoren bFGF-R-1 für bFGF und KDR für VEGF wurde in diesen

Versuchsansätzen ebenfalls untersucht. Auch bFGF-R-1 und KDR konnten sowohl im

humanen endometrialen Ausgangsgewebe (Tag 0) als auch in den transplantierten

endometrialen Fragmenten nachgewiesen werden (Abb. 30B). Am Tag 2 veränderten sich

79

Ergebnisse

neben den Expressionswerten der getesteten Angiogenese-Faktoren auch die

Expressionswerte der entsprechenden Rezeptoren. Bei beginnender Angiogenese in den

humanen Fragmenten in der Nacktmaus wurde vermehrt der untersuchte Rezeptor für VEGF

exprimiert. Ein deutlicher Anstieg der Expression von KDR konnte am Tag 2 nach der

Transplantation verglichen mit dem Ausgangsgewebe (Tag 0) nachgewiesen werden (Abb.

30B). KDR wurde in den Fragmenten im Mittel 2fach stärker exprimiert als im

Ausgangsgewebe. Im Versuchsverlauf reduzierte sich zwar die Expression des Rezeptors,

4.5.2.3 Hormonelle Regulation von VEGF und bFGF

Da Cyr61 als proangiogenetischer Faktor bekannt ist und durch bFGF induziert wird, wurde

in diesem Modell auch die hormonelle Regulation von VEGF und bFGF in den kultivierten

endometrialen Fragmenten untersucht (s. 4.3.2).

Die Expression von VEGF in den humanen endometrialen Fragmenten konnte durch die

Applikation des Östradiols im Mittel um den Faktor 1,5 gegenüber den Kontrollfragmenten

duziert werden (Abb. 31B), diese Reduktion war statistisch jedoch nicht signifikant. Die

s VEGF-Expressionslevels war wegen hoher Schwankungen in den

sreihen jedoch statistisch nicht signifikant. Zusammengefaßt bewirkten die

den Nacktmäusen applizierten östrogenen und anti-östrogenen Hormone nur tendenziell

eine Veränderung der VEGF-Expression in den humanen endometrialen Fragmenten.

in drei Versuchsreihen eine bis zu 2fache Erhöhung der bFGF-Expression in den

an Tag 14 konnte jedoch noch die gleiche Expressionsmenge nachgewiesen werden wie an

Tag 0 (Abb. 30B). Die Expression des untersuchten Rezeptors für bFGF wurde dagegen in

den endometrialen Fragmenten nach der Transplantation kaum verändert. An Tag 2 konnte

keine Steigerung der Expression von bFGF-R-1 gefunden werden, im Mittel entsprach dieser

dem Ausgangsgewebe. Auch im weiteren Versuchsverlauf zeigte sich keine wesentliche

Veränderung im Vergleich zum Ausgangsgewebe (Abb. 30B). Wegen hoher Schwankungen

in den einzelnen Versuchsreihen konnten keine statistisch signifikanten

Expressionsänderungen detektiert werden.

Wie für die angiogenetischen Faktoren bFGF und VEGF konnten bei einsetzender

Angiogenese auch Veränderungen in der Expression der Rezeptoren bFGF-R-1 und KDR

detektiert werden. Es zeigte sich, daß im weiteren Versuchsverlauf vor allem der untersuchte

Rezeptor für VEGF stark exprimiert wurde.

re

Verabreichung von Anti-Östrogen führte zu keiner Beeinflussung der VEGF-Expression im

Vergleich zum Vehikel (Abb. 31B). Die Behandlung der Nacktmäuse mit dem SERM bewirkte

dagegen in den vier einzelnen Versuchsreihen eine bis zu 4fache Herunterregulation der

VEGF-Expression in den endometrialen Fragmenten verglichen mit dem Vehikel (Abb. 31B).

Diese Reduktion de

einzelnen Versuch

Die Behandlung der zyklischen Nacktmäuse mit einer zusätzlichen Menge Östradiol bewirkte

80

Ergebnisse

endometrialen Fragmenten verglichen mit dem Vehikel, in den übrigen vier Fällen konnte

keine Beeinflussung nachgewiesen werden, die Änderung des Expressionslevels war

statistisch nicht signifikant. In den Fragmenten der mit Anti-Östrogen behandelten Tiere war

die Expression von bFGF im Mittel knapp 1,5fach reduziert verglichen mit den

Kontrollfragmenten (Abb. 31D). Auch diese Expressionsänderung war nicht signifikant, es

konnte jedoch in fünf von sechs Versuchsreihen eine Reduktion der bFGF-Expression

nachgewiesen werden. Durch die Applikation des SERM wurde die Expression von bFGF in

den endometrialen Fragmenten nicht beeinflußt, im Mittel entsprach sie der Expression in

den mit Vehikel behandelten Fragmenten (Abb. 31D). Zusammenfassend läßt sich sagen,

daß die Expression von bFGF in den humanen endometrialen Fragmenten durch die

Behandlung der Nacktmäuse mit Hormonen nicht signifikant verändert wurde. Eine

Regulation durch Östrogen war zu erkennen, da in fast allen Versuchsreihen nach

Applikation des Anti-Östrogens die bFGF-Expression leicht reduziert war. Die zusätzliche

Östradiol-Gabe konnte die bFGF-Expression in den Fragmenten verglichen mit dem Vehikel

dagegen leicht steigern. Diese Resultate konnten statistisch nicht abgesichert werden, da

hohe Schwankungen in den einzelnen Versuchsreihen vorhanden waren.

und bFGF (C und D) in den transplantierten Fragmenten durch Applikation verschiedener

signifikant verändert.

Östrogen behandelten Tier, Spur 5: Fragment aus einem mit Östradiol behandelten Tier, Spur 6:

Abb. 31, A-D: Beeinflussung der Expression der angiogenetischen Faktoren VEGF (A und B)

Hormone. Die mit Hilfe von RT-PCR ermittelten mittleren Expressionswerte der hormonell behandelten Tiere wurden als xfache Expression bezogen auf das Vehikel plus Standardabweichungen dargestellt. A und B: Die VEGF-Expression wurde in den Fragmenten durch die Behandlung der Tiere nicht

C und D: In den mit Anti-Östrogen behandelten Tieren zeigte sich eine Reduktion der bFGF-Expression gegenüber dem Vehikel. A und C: Agarosegele, Spur 1: 100 bp-Marker, Spur 2: nicht transplantiertes Kontrollendometrium, Spur 3: Fragment aus einem mit Vehikel behandelten Tier, Spur 4: Fragment aus einem mit Anti-

Fragment aus einem mit SERM behandelten Tier. Die Positionen der Transkripte von β-Aktin (698 bp), VEGF (341 bp) und bFGF (313 bp) wurden gekennzeichnet. B und D: Excel-Diagramme.

81

Ergebnisse

4.5.2.4 Behandlung der Nacktmäuse mit einem VEGF-Antagonisten

Da die Vaskularisierung für die Persistenz der transplantierten humanen endometrialen

Fragmente eine große Rolle zu spielen scheint, sollten nach Inhibition der Angiogenese die

Auswirkungen auf die Adhäsion und die Morphologie der Fragmente untersucht werden. Bei

dem den Nacktmäusen applizierten VEGF-Antagonisten handelte es sich um einen Inhibitor

der Tyrosinkinase-Aktivität der beiden VEGF-Rezeptoren flt und KDR. Durch diese Inhibition

sollte exprimiertes VEGF keine Rolle bei der Bildung neuer Blutgefäße spielen können.

Das endometriale Gewebe wurde sofort nach der Entnahme in Fragmente von 1-2 mm

zerschnitten und mit Hilfe von Nahtmaterial an der inneren Seite der Bauchwand von

weiblichen zyklischen Nacktmäusen fixiert (s. 3.6.3). Zur Inhibition der Angiogenese wurde

das Gewebe von 3 unterschiedlichen Patientinnen ohne Endometriose in zwei

Versuchsreihen auf 2 Nacktmäuse, in einem Fall auf drei Nacktmäuse, verteilt, pro Tier

wurden 6 endometriale Fragmente transplantiert. Über einen Zeitraum von 14 Tagen wurde

den Mäusen täglich 1,5 mg eines VEGF-Antagonisten (Schering, ZK 202650) p.o.

verabreicht. In jeder Versuchsreihe wurde einer Maus zeitlich parallel das Vehikel (s. 3.6.4)

appliziert. Die Fragmente wurden nach Beendigung des Versuchs entnommen und für

immunhistochemische Färbungen in Tissue Tek (OCT Compound Sakura) in flüssigem

Stickstoff gefroren oder für morphologische Untersuchungen in 10 % Formalin fixiert und in

Paraffin eingebettet.

Morphologie

Durch diese Untersuchungen sollten mögliche morphologische Veränderungen in den

Fragmenten der mit dem VEGF-Antagonisten behandelten Tiere detektiert werden. Durch

die Behandlung der Nacktmäuse mit dem VEGF-Antagonisten wurden in diesen Fragmenten

allerdings in keiner der drei Versuchsreihen derartige morphologische Veränderungen im

Vergleich zu den Kontrolltieren beobachtet. Die Abbildung 32 zeigt als Beispiel jeweils ein

Fragment aus den mit dem VEGF-Antagonisten behandelten Tieren (C) und ein Fragment

aus den Kontrolltieren (A). Das Drüsenepithel des behandelten Fragments war abgeflacht,

ie Drüsen insgesamt waren zystisch vergrößert (Abb. 32C). Ein ähnliches Bild zeigte sich

wurden.

d

auch in den Kontrollfragmenten (Abb. 32A), zusätzlich konnten zahlreiche Blutgefäße

nachgewiesen werden (Abb. 32A, Ausschnittsvergrößerung, Pfeile). Sowohl in den

behandelten Fragmenten als auch in den Fragmenten aus den Kontrolltieren adhärierte das

Stroma an die Bauchwand der Nacktmaus, nicht das Drüsenepithel. Es konnten keine

morphologischen Veränderungen beobachtet werden, die durch die Behandlung mit dem

VEGF-Antagonisten hervorgerufen

82

Ergebnisse

Abb. 32, A-D: Morphologie (A und C) und immunhistochemischer Nachweis (B und D) von Maus-Endothelzellen in transplantierten humanen endometrialen Fragmenten nach Behandlung mit dem Vehikel (A und B) oder einem VEGF-Antagonisten (C und D). Trotz der Inhibition von VEGF konnten keine morphologischen Unterschiede in den behandelten Fragmenten (C) im Vergleich zur Kontrolle (A) detektiert werden. Auch auf die Menge der eingewachsenen Maus-Blutgefäße (Pfeil in Ausschnittsvergrößerung A) hatte die Inhibition von VEGF keinen Einfluß (B und

-Färbung, B und D: immunhistochemische Färbung. Balken: in A, C, D: 160 µm, in B: 50 µm, in der Ausschnittsvergrößerung von A: 100 µm. D). A und C: HE

Angiogenese in den transplantierten Fragmenten

Die Wirkung des VEGF-Antagonisten wurde auch durch die Menge der neu gebildeten und

in die Fragmente eingewachsenen Maus-Blutgefäße durch immunhistochemischen

Nachweis von Maus-Endothelzellen untersucht (s. 3.7.1).

Durch den immunhistochemischen Nachweis von Maus-Endothelzellen konnte in den

Kontrollfragmenten gezeigt werden, daß die transplantierten humanen endometrialen

Fragmente von Blutgefäßen der Maus durchsetzt sind (Abb. 32B). Auch in den Fragmenten

der mit dem VEGF-Antagonisten behandelten Tiere wurden Mausgefäße detektiert (Abb.

32D). Trotz Inhibition von VEGF konnte Angiogenese stattfinden und die behandelten

Fragmente waren ebenso durchdrungen mit eingewachsenen Blutgefäßen wie die

Fragmente aus den Vehikel-Tieren. In keinem der untersuchten Fragmente aus den drei

Versuchsreihen konnte nach Applikation des VEGF-Antagonisten eine Reduktion der

83

Ergebnisse

Angiogenese detektiert werden. Auffällige Unterschiede zu den Fragmenten der mit Vehikel

behandelten Tiere wurden nicht beobachtet.

84

Diskussion

5 Diskussion

5.1 Veränderung des Genmusters der Endometrien der Sekretionsphase von Endometriosepatientinnen

Die molekularen Mechanismen der Pathogenese von Endometriose sind bis heute ungeklärt.

Viele Hinweise wie die hohe Rezidivrate der Krankheit (Wheeler und Malinak, 1983) oder die

Korrelation zwischen Endometriose und Infertilität (Ledger, 1999) sprechen allerdings dafür,

daß die Ursachen der Entstehung endometriotischer Läsionen in einem nicht adäquat

differenzierten Endometrium liegen. Daher wurden Genexpressionsprofile der Endometrien

von Frauen mit und ohne Endometriose erstellt, um Gene zu identifizieren, die im

Endometrium von Endometriosepatientinnen abweichend vom normalen Endometrium

exprimiert werden. Mit Hilfe dieser Gene könnte es möglich sein, Einblicke in den

Entstehungsmechanismus der Krankheit zu bekommen und mögliche Kandidatengene für

therapeutische Ansätze zu identifizieren. Für diese Versuche wurden „Gene-Arrays“ der

Firma Affymetrix benutzt, mit denen es möglich ist, gleichzeitig über 12000 Gene zu

untersuchen. Es zeigte sich, daß einige Gene, von denen bekannt ist, daß ihre Transkription

durch Östrogen reguliert wird, im Endometrium von Endometriosepatientinnen aus der

Sekretionsphase stärker exprimiert waren als im Endometrium von gesunden Frauen der

gleichen Zyklusphase. Zu den in der Sekretionsphase hochregulierten östrogenabhängigen

Genen gehörten der TR3 Orphan-Rezeptor (Uemura et al., 1995), das „early growth

response protein“ EGR-1 (Thompson et al., 2002), sowie die Transkriptionsfaktoren c-fos

(Duan et al., 2002) und jun-B (Cicatiello et al., 1992). Ähnliche Ergebnisse wurden auch in

der Studie von Lundeen et al. (2002, eingereicht) erzielt. Mittels „Differential Display“-PCR

wurde auch hier das „early growth response-1 gene“ (EGR-1) im Endometrium von

Endometriosepatientinnen als hochreguliertes Gen identifiziert, diese

Expressionsunterschiede wurden allerdings für die Proliferationsphase nachgewiesen.

Zudem konnte in ektopen endometriotischen Läsionen ein zusätzlicher Expressionsanstieg

des untersuchten Gens verglichen mit dem eutopen Endometrium detektiert werden

(Lundeen et al., 2002, eingereicht).

In den Studien von Taylor et al. (2002b) zeigten wie in unserer Studie hormonregulierte

Gene ein abweichendes Expressionsmuster in den Endometrien von

Endometriosepatientinnen. Mittels „subtractive cDNA hybridization“ wurde Glycodelin-A als

ein spezifisches Genprodukt des sekretorischen Endometriums identifiziert (Vaisse et al.,

1990), was durch spätere „Gene-Array“ Analysen bestätigt werden konnte (Giudice et al.,

2001; Kao et al., 2002). Es zeigte sich, daß Glycodelin-A im gesunden Endometrium in der

Sekretionsphase am stärksten exprimiert wird, im Endometrium von

Endometriosepatientinnen dagegen war die Expression von Glycodelin-A im sekretorischen

Endometrium verglichen mit normalen Endometrien reduziert (Giudice et al., 2001; Kao et

85

Diskussion

al., 2002). Die genaue Funktion des Glycodelin-A ist nicht bekannt, es wird jedoch postuliert,

daß dieses Protein für die Rezeptivität des Endometriums bei der Implantation eine wichtige

Genexpression bei der Entstehung von endometrialen Karzinomen wurde beobachtet, daß

liferationsphase nachgewiesen. Die Ursache dafür liegt

Rolle spielt (Mueller et al., 2000). Auch in Untersuchungen zur Veränderung der

Gene, die im normalen Endometrium hormonabhängig exprimiert werden, in endometrialen

Adenokarzinomen ein abweichendes Expressionsprofil aufwiesen (Mutter et al., 2001). Die

Genmuster der Tumore glichen eher dem des normalen Endometriums aus der

Proliferationsphase als dem Endometrium aus der Sekretionsphase (Mutter et al., 2001).

Das normale Endometrium ist ein sehr dynamisches Gewebe, dessen Phänotyp sich

während des Menstruationszyklus in Abhängigkeit der zirkulierenden Hormone Östrogen und

Progesteron ständig ändert. Diese zyklischen Veränderungen unterliegen der direkten

hormonellen Steuerung durch das Ovar. Da sich die Serumhormonwerte von Frauen mit und

ohne Endometriose nicht unterscheiden, scheint es, als ob das Endometrium von

Endometriosepatientinnen nicht adäquat auf vorhandenes Östrogen reagieren würde.

Dadurch wäre es auch nicht möglich, im Endometrium die Voraussetzungen für die

Implantation eines Keims zu schaffen, wodurch sowohl die verminderte Fertilität von

Endometriosepatientinnen (Garrido et al., 2002) als auch die geringe Implantationsrate von

Endometriosepatientinnen nach in vitro Fertilization (Barnhart et al., 2002) erklärt werden

könnte. Des weiteren könnte das Menstruationssekret durch den Einfluß von Östrogen in der

Sekretionsphase vitale Zellen enthalten, die nach retrograder Menstruation an das

umgebende Peritoneum adhärieren und Läsionen bilden könnten (Ridley und Edwards,

1958).

Das in den Array-Analysen am stärksten regulierte Gen war Cyr61, das in den Endometrien

von Endometriosepatientinnen der Sekretionsphase in 90 % der Fälle im Mittel 5fach

hochreguliert war. Durch Validierung der Array-Analysen mittels real-time RT-PCR konnten

diese Ergebnisse bestätigt werden. Abweichend von den Array-Analysen wurde in diesen

Versuchen aber auch eine signifikant höhere Expression von Cyr61 in den Endometrien von

Endometriosepatientinnen in der Pro

möglicherweise in der Auswertung der verwendeten Arrays. Um die Anzahl falsch-positiver

und falsch-negativer Resultate möglichst gering zu halten, wurde jede einzelne

Gewebeprobe auf einem separaten Array untersucht. Dadurch sollte sichergestellt werden,

daß gemessene Unterschiede zwischen den einzelnen Arrays tatsächlich durch

Unterschiede in den Genexpressionsmustern hervorgerufen werden, nicht durch

verschiedene Hintergrundsignale. Dennoch können falsche Ergebnisse nicht vollständig

ausgeschlossen werden, so daß es immer nötig ist, die identifizierten Regulationen in

weiteren Proben zu verifizieren (Cook und Rosenzweig, 2002). Zudem wurde bekannt, daß

die spezifischen Sequenzen der untersuchten Gene auf den Arrays teilweise fehlerhaft sind.

86

Diskussion

In einer Charge von Arrays zur Untersuchung von mausspezifischen Genen waren bis zu 30

% der Sequenzen falsch, durchschnittlich sind auf einem Array zwischen 1 % und 5 % der

verwendeten Sequenzen nicht korrekt (Knight, 2001). Auch aus diesen Gründen ist es

notwendig, die durch die Array-Analysen erhaltenen Resultate zu überprüfen. Dies zeigte

sich auch bei einigen Genen, die nach den Array-Analysen im Endometrium von

Endometriosepatientinnen aus der Sekretionsphase herunterreguliert waren. Mittels RT-PCR

konnten die Ergebnisse für die Gene Nidogen, p27, Fibronektin, Elastin und Kollagen IV in

zusätzlichen Geweben nicht verifiziert werden, abweichend von den Array-Analysen konnten

Expressionsstärke von Cyr61 im Laufe des Menstruationszyklus verändert. Während

der Proliferationsphase, wenn vorwiegend Östrogen im Endometrium vorhanden ist, wurden

höhere Expressionswerte von Cyr61 detektiert als in der Sekretionsphase, wenn vor allem

Progesteron auf das Endometrium wirkt. Nur in normalen Endometrien war diese Regulation

signifikant, in Endometrien von Endometriosepatientinnen dagegen konnte nur eine Tendenz

beobachtet werden, keine signifikante Reduktion. Dies ist ein weiterer Hinweis darauf, daß

das Endometrium von Endometriosepatientinnen möglicherweise nicht adäquat auf

zirkulierendes Östrogen reagiert. Derartige Expressionsunterschiede während des Zyklus

konnten in Untersuchungen des Myometriums dagegen nicht beobachtet werden (Sampath

et al., 2001a). Zwar wurde in myometrialen Fragmenten, die ex vivo mit Östrogen behandelt

wurden, bereits innerhalb einer Stunde die Cyr61-Expression als „immediate early gene“ um

den Faktor 2 gesteigert, Unterschiede zwischen Geweben aus der Proliferationsphase und

der Sekretionsphase wurden dagegen nicht nachgewiesen (Sampath et al., 2001a). Im

Endometrium wurde im Rahmen dieser Studie eine umgekehrte Reaktion beobachtet. In

endometrialen Fragmenten ex vivo konnte innerhalb einer Stunde keine Steigerung der

Cyr61-Expression durch Zugabe von Östrogen induziert werden (Daten nicht gezeigt),

keine Expressionsunterschiede zwischen normalen Endometrien und Endometrien von

Endometriosepatientinnen nachgewiesen werden. Ähnliche Beobachtungen wurden auch in

anderen Studien gemacht, nicht immer ließen sich alle durch Array-Analysen identifizierten

Genregulationen mit Hilfe anderer Methoden verifizieren (Cook et al., 2002).

5.2 Regulation der Cyr61-Expression im Endometrium durch Östrogen

In früheren Studien wurde bereits gezeigt, daß es sich bei Cyr61 um ein östrogenreguliertes

Gen handelt. In den Uteri von ovariektomierten Ratten wurde Cyr61 innerhalb kürzester Zeit

nach Zugabe von 17β-Östradiol bis zu 10fach stärker exprimiert (Rivera-Gonzales et al.,

1989). Auch im Myometrium sowie in humanen Brustkrebszellen wurde Cyr61 als ein Gen

identifiziert, das östrogenabhängig exprimiert wird (Sampath et al., 2001a, b). Im Rahmen

dieser Doktorarbeit konnte gezeigt werden, daß die Expression von Cyr61 auch im humanen

Endometrium durch Östrogen reguliert wird. Erste Hinweise lieferte die Beobachtung, daß

sich die

87

Diskussion

während sich im Laufe des Menstruationszyklus in Abhängigkeit der zirkulierenden Hormone

die Expression änderte. Möglicherweise wird Cyr61 daher im Endometrium anders reguliert

als im Myometrium, die genauen Regulationsmechanismen von Cyr61 im Endometrium oder

im Myometrium sind nicht bekannt.

Cyr61 scheint wegen des erhöhten Expressionslevels in den Endometrien von

Endometriosepatientinnen zum einen ein Markergen für Endometriose zu sein, zum anderen

könnte es auch eine Rolle bei der Pathogenese spielen. Darauf deutet die zusätzliche

signifikante Hochregulation der Expression von Cyr61 die in den endometriotischen Läsionen

beider Zyklusphasen hin. In der Sekretionsphase war der Expressionslevel in den

endometriotischen Läsionen im Mittel 20fach erhöht gegenüber den eutopen Endometrien, in

der Proliferationsphase wurde im Mittel ein 4facher Anstieg detektiert. Da es sich bei Cyr61,

wie bereits erwähnt, um ein östrogenreguliertes Gen handelt, könnte dieser zusätzliche

e

in diesen Geweben zusammenhängen. In früheren Studien wurde beschrieben, daß in den

Drüsenepithelzellen von endometriotischen Läsionen dagegen konnte 17 -HSD2 nicht

nachgewiesen werden (Zeitoun et al., 1998). Diese Fehlregulation in den endometriotischen

Läsionen soll zusammen mit der sonst im Endometrium nicht vorhandenen Aromatase lokal

zur Synthese von Östrogen führen (Zeitoun und Bulun, 1999).

daß ein methodischer Fehler ausgeschlossen werden konnte. Eine lokale Synthese von

Expressionsanstieg in den endometriotischen Läsionen mit einer lokalen Östrogensynthes

endometriotischen Läsionen aufgrund der abweichenden Expression von Aromatase lokal

Östrogen synthetisiert wird (Zeitoun und Bulun, 1999). Das Enzym Aromatase, das die

Umwandlung von C19-Steroiden zu Östrogen katalysiert, wird in verschiedenen Geweben

exprimiert wie im Ovar, in der Plazenta, im Fettgewebe, in der Haut oder auch im Gehirn

(Simpson et al., 1994). Im eutopen Endometrium dagegen ist Aromatase nur sehr schwach

exprimiert oder in den meisten Fällen nicht detektierbar (Noble et al., 1996, 1997). 17β-HSD

1 und 2 sind zwei weitere Enzyme, die an der Synthese von Östrogen beteiligt sind. 17β-

HSD1 katalysiert die Umwandlung des nur sehr schwach östrogen wirkenden Östron zum

wirksamen Östradiol in den Granulosazellen des Ovars. Die Expression von 17β-HSD1

konnte sowohl im eutopen Endometrium als auch in endometriotischen Läsionen während

der Proliferationsphase und der Sekretionsphase nachgewiesen werden (Zeitoun et al.,

1998). 17β-HSD2 wurde in den Drüsenepithelzellen des eutopen Endometriums verstärkt

während der Sekretionsphase detektiert und spielt vermutlich eine Rolle bei der Inaktivierung

des Östradiols in dieser Phase (Casey et al., 1994, Mustonen et al., 1998). In den

β

Diese Resultate konnten im Rahmen dieser Studie nur teilweise bestätigt werden. Die

Expression von Aromatase wurde weder in eutopen Endometrien von Frauen mit und ohne

Endometriose noch in ektopen endometriotischen Läsionen nachgewiesen. Nur im humanen

Ovar-Gewebe, das als Kontrolle verwendet wurde, konnte Aromatase detektiert werden, so

88

Diskussion

Östrogen wäre daher in den endometriotischen Läsionen nicht möglich, da aufgrund der

fehlenden Aromatase-Expression zirkulierendes Androstendion nicht zu Östron umgewandelt

werden könnte. Allerdings wurde in unserer Studie wie bei Zeitoun et al. (1998) eine

unausgewogene Expression der Enzyme 17β-HSD 1 und 2 in den endometriotischen

utopen Endometrien von

Läsionen der Sekretionsphase beobachtet. Während 17β-HSD1 in den endometriotischen

Läsionen nachgewiesen werden konnte, war es kaum möglich, das Enzym 17β-HSD2 zu

detektieren. Zirkulierendes Östron könnte also in den Läsionen durch 17β-HSD1 zu

wirksamem Östradiol umgewandelt werden, der Abbau des Östradiol durch 17β-HSD2

dagegen wäre kaum effektiv. Diese abweichende Enzym-Expression könnte die Synthese

von Östradiol lokal in den endometriotischen Läsionen der Sekretionsphase begünstigen und

damit eine Ursache für die extrem starke Expression des östrogenregulierten Gens Cyr61

sein. In den endometriotischen Läsionen aus der Proliferationsphase dagegen konnte eine

derart abweichende Expression von Enzymen, die an der Östrogensynthese beteiligt sind,

nicht beobachtet werden. Zwar wurde auch in den endometriotischen Läsionen aus der

Proliferationsphase 17β-HSD2 nicht exprimiert, allerdings konnte auch nur eine sehr

schwache Expression von 17β-HSD1 nachgewiesen werden. Zirkulierendes Östron könnte

also in den endometriotischen Läsionen der Proliferationsphase kaum zu wirksamem

Östradiol umgewandelt werden, so daß das Fehlen der 17β-HSD2 hier kaum eine Rolle

spielt. Dennoch ist auch in endometriotischen Läsionen der Proliferationsphase Cyr61

stärker, wenn auch schwächer als in der Sekretionsphase, exprimiert als in den eutopen

Endometrien von Endometriosepatientinnen der gleichen Zyklusphase. Möglicherweise sind

neben der hormonellen Regulation weitere Faktoren wie die Wachstumsfaktoren bFGF oder

TGF-β ausschlaggebend für die höhere Expression des Gens in diesem Gewebe (Lau und

Lam, 1999) (s. 5.5). Dafür würde auch das Expressionsmuster sprechen in

endometriotischen Läsionen aus Patientinnen, deren ovarielle Östrogensynthese für 6

Monate durch Behandlung mit einem GnRH-Agonisten blockiert wurde. Vergleicht man die

Expression von Cyr61 in diesen Läsionen mit der Expression in hormonell unbehandelten

endometriotischen Läsionen, zeigt sich, daß die ektopen Läsionen der Frauen, die mit dem

GnRH-Agonisten behandelt wurden, den gleichen Expressionslevel von Cyr61 aufweisen wie

unbehandelte ektope Läsionen aus der Proliferationsphase. Unabhängig davon, daß die

ovarielle Östrogensynthese blockiert wurde, wurde in diesen Läsionen dennoch eine starke

Cyr61-Expression beobachtet, stärker als in den e

Endometriosepatientinnen. Diese Expressionsrate wurde vermutlich jedoch sowohl in den

unbehandelten Läsionen der Proliferationsphase als auch in den mit GnRH behandelten

Läsionen nicht durch eine lokale Östrogensynthese hervorgerufen. Denn die

Enzymausstattung der mit GnRH behandelten Läsionen war ähnlich wie die der Läsionen

aus der Proliferationsphase. Sowohl 17β-HSD1 als auch 17β-HSD2 konnten in den

89

Diskussion

behandelten Läsionen kaum nachgewiesen werden. Daher wäre es auch in den mit GnRH

behandelten Läsionen nicht möglich, zirkulierendes Östron in wirksames Östradiol

umzuwandeln. Auch hier könnte eine Regulation durch Wachstumsfaktoren für die starke

Expression von Cyr61 verantwortlich sein (s. 5.5).

Mit Hilfe eines etablierten Nacktmausmodells (Grümmer et al., 2001) sollte der Einfluß von

Östrogen auf die Expression des Cyr61 und die Entwicklung endometriotischer Läsionen

näher untersucht werden. Für einen Zeitraum von 14 Tagen bietet dieses Modell die

Möglichkeit verschiedene Aspekte der Endometriose zu untersuchen, da die transplantierten

humanen endometrialen Fragmente ihre morphologischen Charakteristika und

Differenzierungsparameter beibehalten (Grümmer et al., 2001). Weiterhin ist es in diesem

Modell möglich, den Einfluß von Hormonen auf die transplantierten Fragmente und deren

Genexpressionsmuster zu untersuchen. Daher wurde den Nacktmäusen nach der

Transplantation der Fragmente entweder ein reines Anti-Östrogen, Östradiol oder ein

selektiver Östrogenrezeptor-Modulator (SERM) appliziert und die Effekte der Substanzen auf

die Morphologie der Fragmente und die Genexpression, vor allem der Expression des Cyr61,

ermittelt.

Anti-Östrogene sind Substanzen, die die Funktion des Östrogens blockieren können. Nach

MacGregor und Jordan (1998) werden zwei verschiedene Typen von Anti-Östrogenen

unterschieden, Typ I und Typ II. Das in dieser Studie verabreichte SERM gehört zu den Anti-

Östrogenen des Typ I, die gewebespezifisch und speziesspezifisch sowohl östrogene als

auch anti-östrogene Wirkung haben können. Typ I Anti-Östrogene sind kompetetive

Inhibitoren der Östrogenbindung an seinen Rezeptor. Für Raloxifen konnte bereits gezeigt

werden, daß diese Verbindungen scheinbar einen Komplex mit dem Östrogenrezeptor

eingehen, wodurch dieser durch unvollendete Konformationsänderungen des Komplexes

teilweise aktiviert bleibt (Brzozowski et al., 1997). Die biologischen Funktionen dieser

Substanzen sind abhängig von der Spezies, dem Gewebe oder den untersuchten Zielgenen

(Bryant und Dere, 1998). Die zweite Gruppe der Anti-Östrogene, zu denen auch das in

dieser Studie verabreichte Anti-Östrogen zählt, sind die reinen Anti-Östrogene (Typ II). Reine

Anti-Östrogene wurden bereits Mitte der 1980er Jahre entdeckt (Wakeling und Bowler,

1987), sie besitzen keinerlei östrogene Eigenschaften. Auch die Typ II Anti-Östrogene

agieren als kompetetive Inhibitoren des Östrogen/Rezeptor-Komplexes, und es konnte

gezeigt werden, daß beide Östrogenrezeptoren ERα und ERβ inhibiert werden (Barkhem et

al., 1998; Tremblay et al., 1998). Weiterhin wurde für das reine Anti-Östrogen ICI 182780

nachgewiesen, daß es in der Lage ist, neu synthetisierten Östrogenrezeptor im Zytoplasma

zu binden und damit dessen Transport in den Nukleus zu verhindern. Der unwirksame

5.3 Validierung des Nacktmausmodells für funktionelle Untersuchungen

90

Diskussion

Rezeptor wird dann wahrscheinlich durch Lysosomen zerstört (Davois et al., 1993). Der

Unterschied zwischen reinen Anti-Östrogenen und SERMs liegt also darin, daß SERMs die

Menge an Östrogenrezeptor im Nukleus anhäufen, während reine Anti-Östrogene sie

verringern (Devin-Leclerc et al., 1998).

Voraussetzung für den Einfluß der applizierten Hormone auf die transplantierten humanen

endometrialen Fragmente war die Expression von Östrogenrezeptoren auch nach der

In allen endometrialen Fragmenten konnte auch nach 14 Tagen Kultivierung in der

Nacktmaus der Östrogenrezeptor ERα nachgewiesen werden, ERβ dagegen wurde nur in

den nicht-transplantierten Ausgangsgeweben detektiert. Es zeigte sich allerdings keine

Regulation des Rezeptors in Abhängigkeit der verabreichten Hormone. Grümmer et al.

gegen konnten den Östrogenrezeptor ERα immunhistochemisch nur in zyklischen

Nacktmäusen nachweisen. Auch nach 14 Tagen wurde ERα sowohl in Drüsenepithelzellen

Expression und der Regulation der Östrogenrezeptoren ER und ER zwischen eutopem

Endometrium und ektopischen Läsionen wurden schon in anderen Studien beschrieben.

Matsuzaki et al. (2000a) konnten mittels in situ Hybridisierung und RT-PCR in allen

untersuchten endometriotischen Läsionen des Ovars ERα detektieren, ERβ dagegen nur in

63 % bzw. in Abhängigkeit der Methode nur in 47 % der untersuchten Läsionen. In allen

eutopen Endometrien dagegen wurden beide Östrogenrezeptoren nachgewiesen, wobei ein

höherer Expressionslevel von ERα detektiert wurde als von ERβ (Matsuzaki et al., 2000a, b).

et al.

Sekretionsphase. Eine solche Veränderung in Abhängigkeit des hormonellen Status konnte

in den endometriotischen Läsionen des Ovars dagegen nicht beobachtet werden (Matsuzaki

et al., 2000b). Die genaue Funktion beider Östrogenrezeptoren ist bis heute nicht vollständig

geklärt, es konnte allerdings gezeigt werden, daß beide Isoformen verschiedene

Transplantation in die Nacktmaus. Die Hauptaufgabe der Östrogenrezeptoren ist die

Aktivierung der Expression bestimmter Gene (Dhingra 1999). Nach der Bindung von

Östrogen an den Rezeptor kommt es zur Phosphorylierung und Dimerisierung des

Rezeptors (Lieberman, 1997; Fawell et al., 1990). Dieses Rezeptor-Dimer bindet an

„estrogen response elements“, eine Palindrome Sequenz aus 13 bp, die sich upstream des

Transkriptionsstarts von östrogenregulierten Genen befindet (Klein-Hitpass et al., 1986).

(2001) da

als auch in Stromazellen exprimiert. In ovariektomierten Mäusen konnten dagegen keine

Östrogenrezeptoren nachgewiesen werden (Grümmer et al., 2001). Unterschiede in der

α β

Diese Ergebnisse konnten in einer weiteren Studie, in der die Expression der

Östrogenrezeptoren mittels real-time RT-PCR untersucht wurden, bestätigt werden

(Matsuzaki , 2000b). Zudem wurde nachgewiesen, daß sich nur im eutopen

Endometrium die Expression beider Östrogenrezeptoren während des Menstruationszyklus

änderte, in der Proliferationsphase wurde eine stärkere Expression nachgewiesen als in der

91

Diskussion

Expressionsmuster in fetalen Organen, einschließlich des Uterus und der Ovarien, aufweisen

und möglicherweise unterschiedliche, organspezifische Funktionen erfüllen (Brandenberger

et al., 1998). Zudem wurde nachgewiesen, daß ERα und ERβ in den einzelnen Organen

sowohl zusammen als auch gegeneinander wirken können, abhängig von der Bildung von

rus

Homodimeren und/oder Heterodimeren zwischen den Rezeptor-Isoformen (Paech et al.,

1997; Ogawa et al., 1998; Watanabe et al., 1998). Die genaue Rolle von ERβ oder einer

Fehlregulation des Rezeptors bei der Entstehung endometriotischer Läsionen ist bis heute

nicht geklärt (Matsuzaki et al., 2000a).

Durch den Nachweis des Östrogenrezeptors ERα konnte gewährleistet werden, daß die

verschiedenen Hormone und Anti-Hormone auf die transplantierten Fragmente einwirken

können. Zusätzlich sollte in verschiedenen Vorversuchen sichergestellt werden, daß die den

Nacktmäusen s.c. verabreichten Substanzen tatsächlich das Zielorgan, nämlich den Ute

erreichen und entsprechend beeinflussen. Dafür wurden zum einen die Ovar- und

Uterusgewichte der Nacktmäuse bestimmt (Lan und Katzenellenbogen, 1976), zum anderen

wurden die Zellhöhe und die Proliferationsaktivität des Uterusepithels der Mäuse untersucht.

Es konnte gezeigt werden, daß das Uterusgewicht durch das applizierte Östrogen signifikant

gesteigert und durch das Anti-Östrogen signifikant reduziert wurde. Nebenwirkungen wurden

nicht beobachtet, da das Gewicht der Ovarien durch die Hormone nicht verändert wurde. Die

den Tieren verabreichten Substanzen gelangten also ins System der Nacktmaus und zeigten

die erwarteten Effekte am Zielorgan, dem Uterus.

Diese Resultate konnten durch die Messungen der Uterusepithel-Höhen allerdings nur

teilweise bestätigt werden. Nach Applikation des Anti-Östrogens zeigte sich eine signifikante

Reduktion der Zellhöhe des Uterusepithels im Vergleich zu den mit Vehikel behandelten

Tieren. Allerdings konnte in den Uteri der zyklischen Tiere durch die Verabreichung

zusätzlicher Mengen Östradiol keine Steigerung der Zellhöhe erreicht werden. Statt dessen

zeigte sich auch in den mit Östradiol behandelten Tieren eine leichte, nicht signifikante

Reduktion der Uterusepithel-Höhen. Ähnliche Beobachtungen wurden auch bei der

Bestimmung der Proliferationsraten nach immunhistochemischem Nachweis von Ki67 in den

Uterusepithelien der hormonell behandelten Nacktmäuse gemacht, hier zeigten sich

ebenfalls keine einheitlichen Ergebnisse. In einer Versuchsreihe wurde erwartungsgemäß

die stärkste Proliferation im Uterus der mit Östradiol behandelten Nacktmaus und keine Ki67-

Färbung im Uterus des mit Anti-Östrogen behandelten Tieres detektiert. In einer weiteren

Versuchsreihe allerdings zeigte sich keine Proliferationsaktivität im Uterusepithel der mit

Östradiol behandelten Nacktmaus, die stärkste Ki67-Färbung wurde in diesem Fall im Uterus

der mit Anti-Östrogen behandelten Maus beobachtet. In diesem Modell war daher weder die

Höhe noch die Proliferationsaktivität der Uterusepithelien ein zuverlässiger östrogener

92

Diskussion

Marker. Wie diese entgegengesetzten Ergebnisse zustande kamen, konnte nicht geklärt

werden. Möglicherweise war die Verwendung von zyklischen Nacktmäusen verantwortlich für

diese Resultate, mögliche Ursachen werden im folgenden näher diskutiert.

In diesem Nacktmausmodell wurde auch die Genexpression in den transplantierten

humanen endometrialen Fragmenten bezüglich der Östrogenregulation untersucht. Zur

Kontrolle wurde die Expression der beiden Gap Junction-Proteine Cx43 und Cx26 in

Abhängigkeit der applizierten Hormone getestet, die als östrogenregulierte Markergene des

humanen Endometriums bekannt sind (Jahn et al., 1995). In den meisten Geweben zeigen

Beeinflussung der Cx43-Expression durch SERMs konnte zudem nicht nachgewiesen

werden (Heikaus et al., 2002). In unserer Studie konnten diese Beobachtungen nur teilweise

bestätigt werden. Die Expression von Cx43 wurde in 7 von 9 Versuchsreihen in den

transplantierten humanen endometrialen Fragmenten durch das den Nacktmäusen

verabreichte Anti-Östrogen im Mittel um den Faktor 2 im Vergleich zum Vehikel

herunterreguliert. Allerdings wurden in den einzelnen Versuchsreihen starke Schwankungen

Im Gegensatz zu anderen Studien war es zudem nicht möglich, morphologische

Unterschiede in den kultivierten Fragmenten nachzuweisen, die auf die applizierten Hormone

zurückzuführen waren. Bereits 1985 untersuchten Bergquist et al. den Einfluß von

Steroidhormonen auf die Morphologie subkutan transplantierter humaner endometrialer

Fragmente in der Nacktmaus und wiesen nach, daß keines der Fragmente histologisch mit

dem Ausgangsgewebe übereinstimmte. Veränderungen des Stromas und des

Drüsenepithels in den Fragmenten ließen darauf schließen, daß diese auf eine hormonelle

Behandlung ähnlich wie eutopes Endometrium reagierten (Bergquist et al., 1985). Auch

Nisolle et al (2000a) konnten histologische Veränderungen der endometrialen Fragmente

nach Transplantation in die Nacktmaus beobachten. In allen Fragmenten zeigten sich nach

der Transplantation morphologische Charakteristika der Proliferationsphase, unabhängig

Cx-Gene eine wenig regulierte Expression, im Uterus allerdings, insbesondere im

Myometrium (Petrocelli und Lye, 1993; Lye et al., 1993) aber auch im Endometrium

(Grümmer und Winterhager, 1998), werden sie durch Steroidhormone reguliert. In früheren

Studien konnte bereits für das Ratten-Endometrium gezeigt werden, daß die Expression von

Cx26 sehr sensitiv durch Östrogen beeinflußt wird (Grümmer et al., 1999). Auch nach

Zugabe von SERMs veränderte sich der Expressionslevel von Cx26 (Heikaus et al., 2002).

Die Regulation von Cx43 durch Östrogen ist weniger sensitiv (Grümmer et al., 1999), eine

in der Cx43-Expression beobachtet, so daß keine signifikante Regulation vorhanden war.

Cx43 konnte durch das applizierte SERM nicht beeinflußt werden. Die Expression des Cx26

wurde in den transplantierten endometrialen Fragmenten durch keine der applizierten

Substanzen beeinflußt. Es war daher nicht möglich, eine eindeutige Östrogenregulation der

Gene Cx43 und Cx26 in den kultivierten endometrialen Fragmenten nachzuweisen.

93

Diskussion

davon, aus welcher Zyklusphase das verwendete Ausgangsmaterial stammte. Diese

Ergebnisse konnten in unserer Studie nicht bestätigt werden. Es wurden weder einheitliche

morphologische Charakteristika beobachtet, die einer bestimmten Zyklusphase zugeordnet

d in das

Gewebe invadierten. Zellen des Drüsenepithels konnten dagegen nie in direktem Kontakt mit

werden konnten, noch wurden Unterschiede zwischen transplantierten Geweben aus der

Proliferationsphase und der Sekretionsphase nachgewiesen. Die transplantierten Fragmente

waren unabhängig von den applizierten Substanzen morphologisch gut erhalten, fast immer

konnten endometriale Drüsen detektiert werden, die von zellreichem Stroma umgeben

waren. Allerdings wurden in den meisten Fragmenten auch Drüsen gesehen, die zystisch

vergrößert waren und ein sehr flaches Epithel aufwiesen. Das Vorkommen solcher Drüsen

korrelierte jedoch nicht mit der Behandlung der Nacktmäuse. Es war daher auch in den

transplantierten Fragmenten wie im Uterusepithel der Nacktmäuse nicht möglich, die Höhe

der Drüsenepithelzellen als diagnostischen Marker zu nutzen, im Mittel unterschieden sich

die Epithelzellhöhen der Drüsen aus den Fragmente der behandelten Tiere nicht von

Fragmenten aus den Kontrolltieren. In anderen Studien wurde ebenfalls das Vorkommen

zystisch vergrößerter Drüsen in transplantierten endometrialen Fragmenten beschrieben.

Nisolle et al. (2000b) beobachteten bereits 5 Tage nach der Transplantation von

Endometrium, das während der Menstruation entnommen wurde, daß das Epithel der

vorhandenen Drüsen abflachte und die Drüsen ein dilatiertes Aussehen annahmen. Auch

Grümmer et al. (2001) beschrieben eine derartige Veränderung der endometrialen Drüsen

nach Transplantation der Fragmente in die Nacktmaus unabhängig von der hormonellen

Behandlung der Tiere oder der Lokalisation der Fragmente. Für die zystische Vergrößerung

der Drüsen mit zunehmender Versuchsdauer könnte die fehlende Abflußmöglichkeit der

weiterhin sekretorisch aktiven endometrialen Drüsen verantwortlich sein (Awaad et al.,

1999). In Übereinstimmung mit der Studie von Nisolle et al. (2000b) konnte im Rahmen

dieser Studie gezeigt werden, daß einheitlich in allen untersuchten Fragmenten die

Stromazellen an das anliegende Bauchwandgewebe der Nacktmaus adhärierten un

dem tierischen Gewebe beobachtet werden. Das endometriale Stroma scheint bei der

Adhäsion des endometrialen Gewebes in diesem Modell und möglicherweise auch bei der

Entstehung der Endometriose im Peritoneum eine große Rolle zu spielen (Nisolle et al.,

2000b, Witz et al., 1999).

Obwohl morphologisch keine Veränderungen in den transplantierten Fragmenten beobachtet

werden konnten und keine signifikante Regulation der östrogensensitiven Gene Cx43 und

Cx26 nachgewiesen werden konnte, war es dennoch möglich, Unterschiede in der

Genexpression von Cyr61 in den transplantierten humanen endometrialen Fragmenten nach

Behandlung der Tiere mit verschiedenen Hormonen zu beobachten. Die Expression des

Gens Cyr61 wurde in den Fragmenten der Tiere, die mit Anti-Östrogen behandelt wurden,

94

Diskussion

signifikant reduziert. In 7 von 10 Versuchsreihen mit verschiedenen Geweben wurde die

Cyr61-Expression im Mittel 3fach herunterreguliert. Auch nach Applikation des SERM wurde

die Expression von Cyr61 signifikant herunterreguliert, im Mittel konnte eine 2fach geringere

Expression detektiert werden. Es war allerdings nicht möglich, die Transkription des Gens

vollständig zu inhibieren, eine schwache Expression war in allen Versuchsreihen

detektierbar. Des weiteren zeigte sich nur in einem Fall eine Steigerung des

Expressionslevels nach der Applikation von zusätzlichen Mengen Östradiol. Im Mittel

entsprach die Expression von Cyr61 in den Fragmenten der mit Östradiol behandelten Tiere

der Expression in den Kontrollfragmenten, in den einzelnen Versuchsreihen wurden jedoch

hohe Schwankungen beobachtet. Diese Ergebnisse konnten allerdings in drei

Versuchsreihen nicht bestätigt werden. In zwei Fällen entsprach die Expressionsstärke des

Cyr61 in den Fragmenten der mit Anti-Östrogen und SERM behandelten Tiere dem der

Kontrolltiere, in einem Fall zeigte sich nach Applikation des Anti-Östrogens sogar ein 2facher

Anstieg der Expression. Dieser Effekt kann nicht durch das Fehlen des Östrogenrezeptors

erklärt werden, da ERα in allen untersuchten Fragmenten exprimiert wurde. Auch in den für

diese Versuchsreihen verwendeten unbehandelten Ausgangsgeweben von Frauen ohne

Endometriose konnte auf mRNA-Ebene sowohl eine starke Expression des

Östrogenrezeptors ERα als auch des Cyr61 nachgewiesen werden.

Für zukünftige Hormon-Versuche sollte dieses Nacktmausmodell weiter entwickelt und unter

anderem die Serumwerte der Nacktmäuse bestimmt werden. Zur Untersuchung der

Hormonregulation bestim

Die Ursache für die starken Schwankungen in den einzelnen Versuchsreihen scheint die

Verwendung zyklischer Nacktmäuse gewesen zu sein. Der Zyklus einer Nacktmaus dauert

im Durchschnitt 4-5 Tage, so daß die Tiere während der Versuchsdauer von 14 Tagen bis zu

drei Zyklen durchlaufen. Es wurden keine Hormonwerte im Serum der Nacktmäuse

bestimmt, so daß nicht geklärt werden konnte, in welchem Zyklusstadium sich die einzelnen

Mäuse zu Versuchsbeginn befanden. Die möglicherweise unterschiedlichen

Serumhormonwerte der Tiere könnten die Ursache für die starken Schwankungen in den

einzelnen Versuchsreihen sein, denn die endogen produzierten Hormone schienen die

Wirkung der exogen zugeführten Hormone zu beeinflussen.

mter Gene könnte es von Vorteil sein, die Nacktmäuse zu

ovariektomieren, um den endogenen Zyklus auszuschalten. Gleichzeitig wäre es jedoch

nötig, die Tiere hormonell zu substituieren, zumindest dann, wenn die Effekte eines Anti-

Östrogens untersucht werden sollen. Damit könnten die Schwankungen der endogenen

Zyklen, die bereits hormonelle Unterschiede zwischen den einzelnen Mäusen hervorrufen,

vermieden werden.

95

Diskussion

Dennoch konnte mit Hilfe des Nacktmausmodells demonstriert werden, daß Cyr61 auch im

Endometrium östrogenabhängig exprimiert wird. Diese Regulation zeigte sich nicht nur auf

mRNA-Ebene, sondern auch auf Proteinebene. Ebenso wie im eutopen Endometrium und in

endometriotischen Läsionen war Cyr61 in Fragmenten aus Nacktmäusen, die mit dem

Vehikel behandelt wurden, vor allem apikal in den Drüsenepithelzellen exprimiert. Diese

Lokalisation läßt sich vor allem dadurch erklären, daß es sich bei Cyr61 um ein sekretiertes

Protein handelt, das mit der extrazellulären Matrix assoziiert ist (Yang und Lau, 1991). Es

handelt sich hierbei um eine nicht-kovalente Bindung, die wahrscheinlich durch Interaktionen

mit Heparan-Proteoglykanen zustande kommt (Lau und Lam, 1999). In transplantierten

humanen endometrialen Fragmenten nach Behandlung mit Anti-Östrogen ist es dagegen

kaum möglich, Cyr61 zu detektieren. Die auf mRNA-Ebene detektierte Regulation von Cyr61

durch zirkulierendes Östrogen konnte damit auch auf Proteinebene bestätigt werden.

5.4 Validierung des Nacktmausmodells für die Angiogenese

Neben dem hormonellen Status ist auch eine ausreichende Versorgung mit Blutgefäßen

Voraussetzung für das Anwachsen von endometrialem Gewebe außerhalb des Uterus

(Taylor et al., 2002a). Bei der durch die endometrialen Fragmente induzierte Angiogenese

(Shaw, 1983) scheinen die angiogenetischen Faktoren bFGF und VEGF eine große Rolle zu

weist darauf hin, daß VEGF und

bFGF eine Rolle bei der Angiogenese während der Entstehung und der Persistenz

von Endometriosepatientinnen gefunden werden (Halme et al., 1983). In

neuesten Studien konnte zudem gezeigt werden, daß lösliches VEGF auch im Serum von

spielen. Beide Faktoren konnten sowohl im eutopen Endometrium als auch in

endometriotischen Läsionen nachgewiesen werden (Donnez et al., 1998; Ferriani et al.,

1993). In dieser Studie wurde mittels „Gene-Array“ Analysen VEGF in den Endometrien von

Endometriosepatientinnen aus der Sekretionsphase in 10 von 20 Fällen stärker exprimiert

als in den normalen Endometrien. Zwar war es nicht möglich, diese Ergebnisse mittels RT-

PCR in weiteren Geweben zu verifizieren, dennoch wurden sowohl für VEGF als auch für

bFGF in den Endometrien von Endometriosepatientinnen hohe Expressionswerte

beobachtet. Zudem konnte die Expression beider Faktoren in ektopen endometriotischen

Läsionen nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Dies

endometriotischer Läsionen spielen könnten. Des weiteren wurde VEGF in der

Peritonealflüssigkeit von Frauen mit Endometriose zyklusabhängig exprimiert, die höchste

Konzentration wurde während der Proliferationsphase gemessen, wenn das Peritoneum

endometrialen Fragmenten durch retrograde Menstruation ausgesetzt ist (McLaren et al.,

1996a). Das in der Peritonealflüssigkeit detektierte VEGF wird zusammen mit anderen

Wachstumsfaktoren vor allem von aktivierten Makrophagen produziert, (Olive et al., 1991;

Chao et al., 1995; McLaren et al., 1996a), von denen bekannt ist, daß sie vermehrt in der

Peritonealflüssigkeit

96

Diskussion

Endometriosepatientinnen im Vergleich zu gesunden Frauen signifikant erhöht ist

(Metalliotakis et al., 2003). Nach 6 Monaten Behandlung mit Danazol konnte der Level von

VEGF signifikant reduziert werden (Metalliotakis et al., 2003). Das von aktivierten

Makrophagen in die Peritonealflüssigkeit sekretierte VEGF könnte daher direkten Einfluß

haben auf die Angiogenese in entstehenden endometriotischen Läsionen (Fujimoto et al.,

1999).

Es ist schon länger bekannt, daß das Wachstum von Tumoren und die Bildung von

Metastasen abhängig sind von Angiogenese (Folkman, 1990; Fidler und Ellis, 1994). Schon

früh wurde zudem die Möglichkeit erkannt, durch Inhibition von Angiogenese das

Tumorwachstum zu stoppen (Folkman, 1971). Eine solche anti-angiogenetische Therapie

könnte einige Vorteile gegenüber konventionellen Therapien haben. Zum einen herrscht in

vielen Tumoren ein starker Innendruck, der das Eindringen chemotherapeutischer

gegen wirken

hauptsächlich auf die Endothelzellen, die die Gefäße auskleiden, so daß der Tumor-

Substanzen in den Tumor behindert. Anti-angiogenetische Substanzen da

Innendruck hier keine Barriere darstellt (Jain, 1987). Zum anderen ist es unwahrscheinlich,

daß sich eine genetisch bedingte Resistenz gegen diese Art der Therapie entwickelt (Kerbel,

1997). Weiterhin sollten bei der entsprechenden Spezifikation die Nebenwirkungen einer

anti-angiogenetischen Therapie gering sein, da im adulten Körper Angiogenese

physiologisch nur bei der Wundheilung und während des menstruellen Zyklus im Uterus und

im Ovar stattfindet. Während der letzten Jahre wurden unterschiedliche anti-angiogenetische

Therapien entwickelt, die entweder die vorhandene Gefäßversorgung des Tumors durch

Toxine attackieren oder verschiedene Prozesse der Angiogenese inhibieren, um so die

Entstehung neuer Gefäße zu verhindern (Westphal et al., 2000). Zur Inhibition der

Entstehung neuer Gefäße wurden vor allem Therapien entwickelt, die die Synthese, die

Verfügbarkeit oder die Rezeptorbindung von VEGF verhindern (McLaren, 2000), da VEGF

wahrscheinlich eine wichtige Funktion bei der Tumorangiogenese hat. In vielen Studien

konnte bereits die Wirksamkeit von Antikörpern gegen VEGF bewiesen werden, die das

Tumorwachstum reduzieren (Kim et al., 1993; Asano et al., 1995; Brogstrom et al., 1996;

Leenders, 1998), so daß einige dieser Substanzen in klinischen Studien untersucht werden

(Kim et al., 1993). Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die Tyrosinkinase-Rezeptoren zu

blockieren und damit die Signalkaskade von VEGF zu unterbrechen. Es konnte bereits

gezeigt werden, daß durch Inhibition der VEGF-Rezeptoren flt und KDR in einem

Mausmodell das Tumorwachstum reduziert wurde (Millauer et al., 1996), so daß Rezeptor-

Antagonisten effektive anti-angiogenetische Substanzen darstellen könnten. Die Substanz

SU5416 blockiert beispielsweise die durch VEGF induzierte Phosphorylierung des

Rezeptors. Hierbei handelt es sich um einen selektiven Inhibitor, dessen Wirksamkeit bereits

97

Diskussion

in Tiermodellen bewiesen wurde und der nun in klinischen Studien getestet wird (Fong et al.,

1999).

Wie bereits erwähnt spielt Angiogenese auch beim Wachstum endometrialer Fragmente

außerhalb des Uterus eine große Rolle. Daher sollte im Rahmen dieser Studie mit Hilfe des

Nacktmausmodells untersucht werden, ob es durch die Inhibition von VEGF auch möglich

ist, die Angiogenese in den transplantierten humanen endometrialen Fragmenten zu

außerhalb des Uterus wachsen, wurden ebenfalls mit Hilfe des Nacktmausmodells

inhibieren und damit die Morphologie und die Persistenz der Fragmente zu beeinflussen.

Nach der Transplantation der Fragmente wurden dafür die weiblichen zyklischen

Nacktmäuse mit einem Inhibitor der Tyrosinkinase-Aktivität der beiden humanen VEGF-

Rezeptoren flt und KDR behandelt. Dieser VEGF-Inhibitor der Firma Schering wurde dort

bereits in einem Mausmodell getestet und war in der Lage, die ovarielle Angiogenese zu

unterdrücken. Auch im Rahmen dieser Studie sollte die Signalkaskade des VEGF blockiert

und Angiogenese verhindert werden. Nach einer Versuchsdauer von 14 Tagen konnten

jedoch keine Unterschiede in den Fragmenten detektiert werden, unabhängig davon, ob die

Tiere mit dem VEGF-Antagonisten oder dem Vehikel behandelt wurden. Alle untersuchten

Fragmente wiesen neu gebildete Mausgefäße auf. Anders als beim Tumorwachstum

scheinen bei der Entstehung endometriotischer Läsionen auch andere Faktoren als VEGF

eine große Rolle zu spielen. Anti-angiogenetische Therapien bergen daher die Gefahr, daß

nach der Inhibition eines einzelnen angiogenetischen Faktors das Gewebe alternative

Faktoren synthetisiert, die dessen Funktionen erfüllen (Giavazzi und Taraboletti, 1999). Dies

sollte bei der Entwicklung einer möglichen anti-angiogenetischen Therapie gegen die

Endometriose ebenso berücksichtigt werden wie mögliche Nebenwirkungen. Das

ursprünglich gegen Übelkeit und Kopfschmerzen während der Schwangerschaft entwickelte

Medikament Thalidomid hat ebenfalls anti-angiogenetische Eigenschaften. Es inhibiert die

Proliferation von Endothelzellen und Tumorzellen in vitro und besitzt damit reduzierende

Wirkungen auf das Tumorwachstum und die Metastasenbildung (Moreira et al., 1999;

Minchinton et al., 1996). In klinischen Studien konnte die Wirksamkeit von Thalidomid in der

Therapie gegen multiple Myelome bestätigt werden (Juliusson et al., 2000; Zomas et al.,

2000). Dennoch muß berücksichtigt werden, daß diese anti-angiogenetischen Eigenschaften

nach der Einnahme von Schwangeren zu Fehlbildungen des Embryos führten, die durch die

Inhibition der embryonalen Gefäßentwicklung erklärt werden können (D´Amato et al., 1994).

Es muß daher überprüft werden, ob die für die Tumortherapie entwickelten anti-

angiogenetischen Substanzen auch in der Behandlung der Endometriose eingesetzt werden

können, da viele Endometriosepatientinnen unter Infertilität leiden und eine Therapie gegen

die Endometriose mit einer möglichen Schwangerschaft vereinbar sein muß.

Weitere Untersuchungen zur Angiogenese in endometrialen Fragmenten, die an Stellen

98

Diskussion

durchgeführt. Humane endometriale Fragmente wurden in weibliche zyklische Nacktmäuse

transplantiert und nach 2, 4, 7 und 14 Tagen wurde je eines der unbehandelt belassenen

lauf der VEGF-

Tiere getötet. Grümmer et al. (2001) hatten bereits den zeitlichen Verlauf der Entstehung

neuer Blutgefäße in der Nacktmaus und das Einwachsen dieser Gefäße in die

transplantierten humanen Fragmente an verschiedenen Organen untersucht. Am Tag 4 nach

der Transplantation konnten neu gebildete Blutgefäße der Maus in den humanen

endometrialen Fragmenten detektiert werden, die an der Leber, am Fettgewebe oder am

Darm der Nacktmaus angewachsen waren. Eine Korrelation zwischen der Anzahl der

detektierten Blutgefäße und der Lokalisation der Fragmente bestand dabei nicht. Durch

immunhistochemische Färbung des von-Willebrand Faktors konnte zusätzlich bestätigt

werden, daß die Anzahl der Gefäße humanen Ursprungs mit zunehmender

Kultivierungsdauer abnahm, so daß nach 12 Tagen keine humanen Gefäße mehr

nachgewiesen werden konnten (Grümmer et al., 2001). Im Rahmen dieser Doktorarbeit

konnten diese Ergebnisse bestätigt werden. Auch in humanen endometrialen Fragmenten,

die an der Bauchwand weiblicher zyklischer Nacktmäuse fixiert wurden, konnten die ersten

einwachsenden Blutgefäße der Maus nach 4 Tagen in den Fragmenten detektiert werden.

Bereits nach 7 Tagen waren kleinere Fragmente vollständig mit neu entstandenen

Mausgefäßen durchsetzt. Um nachzuweisen, welche Faktoren hierbei eine Rolle spielen

könnten, wurde in dieser Studie zusätzlich die Expression der bekannten angiogenetischen

Faktoren VEGF und bFGF sowie von Cyr61, das als proangiogenetischer Faktor

beschrieben wurde (Lau und Lam, 1999), untersucht. Alle drei angiogenetischen Faktoren

wurden sowohl im endometrialen Ausgangsgewebe exprimiert, das nicht transplantiert

wurde, als auch in den kultivierten endometrialen Fragmenten. In Übereinstimmung mit dem

zeitlichen Verlauf der Angiogenese wurde ein Anstieg der Expressionslevel der

angiogenetischen Faktoren bFGF und Cyr61 ebenfalls an Tag 2 beobachtet. Vor allem

Cyr61 wurde auch im weiteren Versuchsverlauf stark exprimiert. Die Expression von VEGF

dagegen zeigte keinen Anstieg in den transplantierten endometrialen Fragmenten im

Vergleich zum Ausgangsgewebe, statt dessen sank der Expressionslevel im Versuchsverlauf

um den Faktor 1,5.

Nisolle et al. (2000a) dagegen konnten zeigen, daß nach immunhistochemischer Färbung

große Mengen an VEGF sowohl in den Drüsenepithelzellen als auch im Stroma humaner

endometrialer Fragmente nach 3 Wochen Kultivierung in der Nacktmaus exprimiert wurden.

Im Drüsenepithel zeigte sich dabei eine stärkere Expression als im Stroma. Dennoch

müssen diese Ergebnisse nicht zwangsläufig denen unserer Studie widersprechen. Es muß

berücksichtigt werden, daß von Nisolle et al. (2000a) nicht der zeitliche Ver

Expression untersucht wurde und zudem die exprimierte VEGF-Menge nicht quantifiziert

oder mit der Expressionsmenge des Ausgangsgewebes verglichen wurde. Des weiteren

99

Diskussion

wurde VEGF in unserer Studie auch an Tag 14 noch in den transplantierten endometrialen

Fragmenten exprimiert, unklar bleibt, ob der Expressionslevel der von Nisolle et al. (2000a)

detektierten Menge entspricht.

Diese Ergebnisse machen deutlich, daß bei der Angiogenese der endometrialen Fragmente

im Nacktmausmodell und möglicherweise auch bei der Angiogenese der endometriotischen

Läsionen im humanen Peritoneum neben VEGF weitere angiogenetische Faktoren wie bFGF

und Cyr61 eine Rolle spielen könnten. Die in dieser Studie nicht untersuchten

angiogenetischen Faktoren Angiopoietin 1 und 2 (Ang1 und Ang2) könnten ebenfalls beteiligt

sein. Bei Ang1 und Ang2 handelt es sich um sekretierte Wachstumsfaktoren, die an den

Tyrosinkinase-Rezeptor Tie2 binden, der auf Endothelzellen sowohl im embryonalen als

auch im adulten Gefäßsystem exprimiert wird (Breier, 2000). Bei der möglichen Entwicklung

anti-angiogenetischer Therapien gegen die Endometriose sollte die Vielfalt der

angiogenetischen Faktoren berücksichtigt werden. Möglicherweise wäre eine Kombination

mehrerer Strategien zur Inhibition verschiedener Faktoren eine Alternative zur alleinigen

Inhibition von VEGF (Giavazzi und Taraboletti, 1999).

5.5 Mögliche Funktionen von Cyr61 in der Pathogenese der Endometriose

Diese Studie ergab, daß Cyr61 in endometriotischen Läsionen sowohl aus der

Proliferationsphase als auch aus der Sekretionsphase sehr stark exprimiert wird und zudem

in diesen Geweben einen höheren Expressionslevel aufweist als in den eutopen

Endometrien. Des weiteren konnte gezeigt werden, daß Cyr61 in der induzierten

Endometriose im Tiermodell bei der Angiogenese eine wichtige Rolle spielen könnte. Daher

könnte Cyr61 auch eine wichtige Funktion bei der Angiogenese in den endometriotischen

Läsionen im humanen Peritoneum haben. Daß Cyr61 ein wichtiger angiogenetischer Faktor

ist, konnten zuletzt Mo et al., (2002) zeigen, die das Cyr61-Gen in der Maus ausknockten.

Alle Cyr61 KO-Mäuse starben, 70 % von ihnen, weil durch das Fehlen von Cyr61 die

Gefäßverzweigung in der sich entwickelnden Plazenta gestört war (Mo et al., 2002). Cyr61

induziert zudem Adhäsion, Chemotaxis und DNA-Synthese in Endothelzellen (Kireeva et al.,

6 1

Adhäsion, Migration, das Überleben der Zellen und die Gefäßbildung durch das Integrin v 3

induziert (Leu et al., 2002). Einige Mitglieder der Integrin-Familie wie die Integrine α1, α4 und

β3 werden im Laufe des Menstruationszyklus im Drüsenepithel des Endometriums exprimiert

1996, 1997). Es konnte gezeigt werden, daß diese angiogenetischen Funktionen durch

verschiedene Integrine vermittelt werden. Cyr61 induziert Zell-Adhäsion und die Bildung

lumenhaltiger Gefäße durch das Integrin α β in humanen Endothelzellen aus der

Umbilicalvene (HUVEC) aus frühen Passagen. In Endothelzellen, in denen die Integrine

durch Phorbolester oder VEGF aktiviert wurden, werden die durch Cyr61 geförderte

α β

100

Diskussion

(Lessey et al., 1992; Tabibzadeh, 1992). Die Integrin-Untereinheit β3, die mit αv und gpIIIa

interagiert (Fitzgerald et al., 1987), konnte beispielsweise ab dem Tag 20 und während der

gesamten Sekretionsphase im humanen Endometrium nachgewiesen werden. Über die

eine Rolle bei der Entstehung von Endometriose. CTGF besitzt den gleichen strukturellen

Aufba Mitglieder der CCN-Familie, das humane Gen besteht aus 349

weitere Expression der Integrine herrschen kontroverse Ansichten. Während Lessey et al.

(1994b) eine Herunterregulation des Integrins αvβ3 beschrieben, detektierten Hii und Rogers

(1998) in den endometrialen Gefäßen von Endometriosepatientinnen signifikant höhere

Expressionsmengen des Integrins αvβ3 als in den Kontrollendometrien. Bisher war es nicht

möglich, einen spezifischen Rezeptor für Cyr61 zu identifizieren, dennoch kann nicht

ausgeschlossen werden, daß ein solcher Rezeptor existiert. Alle zellulären und

physiologischen Funktionen von Cyr61 könnten jedoch auch durch die Interaktion mit

Integrinen vermittelt werden (Lau und Lam, 1999, Leu et al., 2002). Dies würde bedeuten,

daß durch die stärkere Expression des Cyr61 in den Endometrien von

Endometriosepatientinnen verglichen mit normalen Endometrien die Entwicklung

endometriotischer Läsionen durch vermehrte Zelladhäsion und Angiogenese, vermittelt

durch das Integrin αvβ3, begünstigt werden könnte.

Möglicherweise spielen neben Cyr61 auch weitere Mitglieder der CCN-Familie wie CTGF

u wie die übrigen

Aminosäuren und besitzt alle 38 konservierten Cysteine (Brunner et al., 1991; Ryseck et al.,

1991; Brigstock et al., 1997). CTGF wurde bisher auf mRNA-Ebene unter anderem in

Fibroblasten, Endothelzellen, Gefäßmuskelzellen und Epithelzellen detektiert (zur Übersicht

s. Brigstock, 1999). Wie Cyr61 wird auch CTGF von einem „immediate early gene“ kodiert. In

ruhenden Fibroblastenzellen wird CTGF nur sehr schwach exprimiert (Lin et al., 1998;

Steffen et al., 1998), ein Anstieg der CTGF-Transkription kann jedoch innerhalb kurzer Zeit

nach Induktion der Zellproliferation durch Zugabe von Serum oder TGF-β beobachtet werden

(Ryseck et al., 1991; Igarashi et al., 1993). In Untersuchungen zur Mausentwicklung wurde

zudem nachgewiesen, daß CTGF und Cyr61 in verschiedenen Organen wie dem

kardiovaskulären System, in der Haut und in der Plazenta zusammen exprimiert werden

(Kireeva et al., 1997).

Aus den Array-Analysen im Rahmen dieser Studie ergab sich, daß neben Cyr61 auch CTGF

in den Endometrien von Endometriosepatientinnen der Sekretionsphase stärker exprimiert

wird als in normalen Endometrien, während in der Proliferationsphase keine Veränderungen

im Expressionslevel von CTGF zwischen Endometrien von Frauen mit und ohne

Endometriose detektiert werden konnten. Obwohl es nur teilweise möglich war, diese

Resultate in RT-PCR Experimenten zu verifizieren, zeigte sich hier eine tendenziell stärkere

Expression von CTGF in den endometriotischen Läsionen beider Zyklusphasen im Vergleich

zum eutopen Endometrien. Eine signifikante Hochregulation von CTGF konnte anders als

101

Diskussion

bei Cyr61 in den Läsionen allerdings nicht gezeigt werden, ein Grund hierfür könnte die

geringere Anzahl getesteter Gewebe oder die weniger sensitive Methode der RT-PCR

gegenüber der real-time RT-PCR sein. Dennoch könnte CTGF in den endometriotischen

Läsionen eine Rolle bei der Entstehung und der Persistenz dieser Läsionen spielen. In

früheren Studien konnte CTGF bereits im Endometrium der Maus, des Schweins und des

Menschen nachgewiesen werden (zur Übersicht s. Brigstock, 1999). Möglicherweise spielt

CTGF eine Rolle bei der Dezidualisierung und der Implantation, denn zu diesem Zeitpunkt

zeigten sich in der Maus Veränderungen in der Expression von CTGF. Zunächst wurde

CTGF im Uterusepithel stark reduziert, während sich in den nächsten zwei Tagen nach der

Implantation dann aber eine deutliche CTGF-Expression in den dezidualisierenden

Stromazellen zeigte (Surveyor et al., 1998). Immunhistochemisch wurde CTGF im humanen

Endometrium der Proliferationsphase im Drüsenepithel und in Endothelzellen lokalisiert, im

Stroma dagegen konnte CTGF kaum nachgewiesen werden (Uzumcu et al., 2000). Während

des Zyklus und zu Beginn der Schwangerschaft allerdings zeigten sich auch hier

Veränderungen sowohl in der Expressionsstärke als auch in der Lokalisation. CTGF konnte

auch im Endometrium der Sekretionsphase in Drüsenepithelzellen und Endothelzellen

splantierten humanen endometrialen Fragmenten im Vergleich zum

v 3

deren Transkription durch Wachstumsfaktoren wie bFGF oder TGF induziert wird (zur

nachgewiesen werden, in der späten Sekretionsphase und während der Schwangerschaft

wurde CTGF aber zusätzlich in dezidualisierten Stromazellen detektiert (Uzumcu et al.,

2000). Dies ist ein Hinweis dafür, daß CTGF auch bei Veränderungen des humanen

Endometriums eine Rolle spielen könnte. Fehlregulation von CTGF im Endometrium von

Endometriosepatientinnen könnte auch hier die Dezidualisierung des Endometriums und

damit auch die Implantation beeinflussen. Zur genauen Expression von CTGF im

Endometrium und seiner möglichen Funktion in der Endometriose müssen weitere

Untersuchungen erfolgen. Auch der genaue Regulationsmechanismus der CTGF-Expression

ist bis heute nicht geklärt und müßte näher untersucht werden, möglicherweise spielen

Glukokortikoide bei der Induktion des CTGF eine Rolle (Dammeier et al., 1998). Eine

Regulation durch Östrogen konnte im Rahmen dieser Studie durch Untersuchungen mit Hilfe

des Nacktmausmodells ausgeschlossen werden. Hier zeigte sich nach Behandlung der Tiere

mit einem reinen Anti-Östrogen, Östradiol oder einem SERM keine Veränderung der CTGF-

Expression in den tran

Vehikel.

Möglicherweise erfüllt CTGF zusammen mit Cyr61 eine Funktion in der Angiogenese

endometriotischer Läsionen. In früheren Studien konnte gezeigt werden, daß neben Cyr61

auch CTGF Zelladhäsion und Migration in „human microvascular endothelial cells“ (HMVEC)

induziert und auf diese Zellen ebenfalls durch das Integrin α β wirkt (Babic et al., 1998,

1999). Zudem wurden sowohl Cyr61 als auch CTGF als „immediate early genes“ identifiziert,

β

102

Diskussion

Übersicht, s. Lau und Lam, 1999), von denen bekannt ist, daß sie Angiogenese in vivo

induzieren (Klein et al., 1997; Roberts und Sporn, 1989). Ein hypothetisches Modell

postuliert daher, daß Wachstumsfaktoren ihre angiogenetische Wirkung zumindest zum Teil

durch die Induktion von Cyr61 und CTGF entfalten (Lau und Lam, 1999). bFGF und TGFβ

könnten demnach entweder eine direkte Wirkung auf die Endothelzellen ausüben oder in

Fibroblasten die Expression von Cyr61 und CTGF stimulieren. Die freigesetzten Proteine

Cyr61 und CTGF könnten dann durch das Integrin αvβ3 verschiedene Funktionen in den

Endothelzellen induzieren (Lau und Lam, 1999).

Dadurch wird deutlich, daß im humanen Endometrium und in endometriotischen Läsionen

neben Östrogen möglicherweise auch verschiedene Wachstumsfaktoren an der Regulation

der Cyr61- und CTGF-Expression beteiligt sind. Weitere Untersuchungen müssen erfolgen,

um die genauen Regulationsmechanismen dieser Proteine im Endometrium und ihrer

möglichen Funktion bei der Pathogenese der Endometriose zu klären.

103

Ausblick

6 Ausblick

In zukünftigen Experimenten soll die Funktion von Cyr61 in der Entstehung der

Endometriose geklärt werden. Dazu steht zum einen die endometriale Ishikawa-Zellinie zur

Verfügung, zum anderen die Kultivierung endometrialer Fragmente in der Nacktmaus. In

angiogenetischen Assays wird der mögliche Einfluß von Cyr61 auf die Bildung endometrialer

Blutgefäße näher untersucht. Nach Induktion des Cyr61 durch z.B. bFGF oder nach

Repression des Cyr61 durch z.B. Anti-Östrogene werden die Auswirkungen auf kultivierte

endometriale Fragmente in der Nacktmaus getestet. Eventuell nachgewiesene

Allerdings muß das Nacktmausmodell dahingehend validiert werden, daß sich die

hormonellen Schwankungen der Maus nicht auf die humanen endometrialen Fragmente

auswirken. Weitere Substanzen sollen zudem untersucht werden, die die Entstehung und die

Persistenz endometriotischer Läsionen beeinflussen könnten.

Die Expression weiterer Gene, die nach den Array-Analysen in Endometrien von

Endometriosepatientinnen unterschiedlich reguliert wurden, werden in zusätzlichen

Gewebeproben mit anderen Methoden untersucht. Vor allem soll geklärt werden, welche

Rolle CTGF oder bFGF zusammen mit Cyr61 in der Entstehung von Endometriose spielen.

angiogenetische Wirkungen des Cyr61 sollen zur möglichen Entwicklung anti-

angiogenetischer Strategien gegen die Endometriose genutzt werden.

104

Zusammenfassung

7 Zusammenfassung

sion im Vergleich zu

. In diesen Versuchen wurde

allerdings nicht nur in den Endometrien von Endometriosepatientinnen der Sekretionsphase

exprimiert wird. In Endometrien von gesunden Frauen wurde Cyr61 in der

roliferationsphase signifikant stärker exprimiert als in der Sekretionsphase. In Endometrien

von Endometriosepatientinnen zeigte sich ebenfalls diese Tendenz, hier konnte jedoch keine

signifikante Regulation nachgewiesen werden. Weitere Hinweise ergaben Untersuchungen,

die mit Hilfe eines etablierten Nacktmausmodells durchgeführt wurden. Auch in humanen

endometrialen Fragmenten, die an die innere Bauchwand weiblicher zyklischer Nacktmäuse

transplantiert wurden, wurde die Cyr61-Expression nach Behandlung der Mäuse mit einem

reinen Anti-Östrogen oder einem SERM signifikant reduziert. Allerdings war es nicht möglich,

einen Anstieg des Expressionslevels in den Fragmenten der mit zusätzlichen Mengen

Östradiol behandelten Tiere gegenüber den mit Vehikel behandelten Tieren zu erzielen.

Damit scheint Cyr61 nicht nur ein Markergen für Endometriose zu sein, möglicherweise spielt

es auch eine Rolle bei der Entstehung der endometriotischen Läsionen. Denn in den ektopen

Läsionen beider Zyklusphasen wurde ein signifikant höherer Expressionslevel von Cyr61

detektiert als in den eutopen Endometrien von Endometriosepatientinnen. Diese

Hochregulation in den endometriotischen Läsionen der Sekretionsphase könnte durch eine

lokale Östrogensynthese in diesem Gewebe begünstigt werden, da eine Fehlregulation der

an der Östrogensynthese beteiligten Enzyme 17β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Typ1 und

2 detektiert wurde. In den endometriotischen Läsionen der Proliferationsphase und in

Obwohl die molekularen Mechanismen, die zur Entstehung endometriotischer Läsionen

führen, bis heute nicht vollständig geklärt sind, existieren mehrere Hinweise darauf, daß

bereits das Endometrium von Endometriosepatientinnen Dedifferenzierungen aufweist. Ein

Ziel dieser Arbeit war es daher, mit Hilfe der Array-Technologie Gene zu identifizieren, die im

Endometrium von Endometriosepatientinnen abweichend vom normalen Endometrium

exprimiert werden. Aus diesen Analysen wurde ersichtlich, daß die hormonelle

Ansprechbarkeit des Endometriums von Frauen mit Endometriose gegenüber der von

gesunden Frauen verschoben ist. Östrogenregulierte Gene zeigten in den Endometrien von

Endometriosepatientinnen der Sekretionsphase eine stärkere Expres

normalen Endometrien der gleichen Zyklusphase. Eines dieser Gene war Cyr61, ein

sekretiertes Protein der CCN-Familie, das bei der Zelladhäsion, der Zellmigration aber auch

bei der Angiogenese eine Rolle spielt. Die Ergebnisse der Array-Analysen konnten in

weiteren Geweben mittels real-time RT-PCR bestätigt werden

eine signifikante Hochregulation der Expression von Cyr61 detektiert, sondern zusätzlich

auch in den Endometrien von Endometriosepatientinnen der Proliferationsphase.

Zudem konnte nachgewiesen werden, daß Cyr61 im Endometrium östrogenabhängig

P

105

Zusammenfassung

endometriotischen Läsionen von Frauen, deren ovarielle Östrogensynthese über einen

Zeitraum von sechs Monaten blockiert wurde, konnten ebenfalls hohe Expressionslevel von

Cyr61 nachgewiesen werden. Hier scheinen allerdings andere Regulationsmechanismen als

Östrogen eine Rolle zu spielen, denn die Enzyme 17β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Typ1

und 2 konnten in beiden Gewebetypen kaum nachgewiesen werden.

tehung und

der Persistenz endometriotischer Läsionen spielen. Die genauen zellbiologischen Funktionen

dieser Faktoren für die Pathogenese der Endometriose müssen an endometrialen Zellinien

und mit Hilfe der Kultivierung endometrialer Fragmente in der Nacktmaus weiter geklärt

werden.

Möglicherweise spielt Cyr61 eine Rolle bei der Angiogenese der endometriotischen

Läsionen, da für deren Persistenz die Bildung neuer Blutgefäße von großer Bedeutung ist.

Mit Hilfe des Nacktmausmodells konnte gezeigt werden, daß neben VEGF und bFGF auch

Cyr61 in den transplantierten endometrialen Fragmenten mit einsetzender Angiogenese

induziert wird. Zudem war es nicht möglich, nach der Inhibition von VEGF die Angiogenese

in diesem Modell zu blockieren und damit die Morphologie oder die Persistenz der

transplantierten Fragmente zu beeinflussen. Dies könnte ein weiterer Hinweis dafür sein,

daß nicht nur VEGF in der Angiogenese der endometriotischen Läsionen eine Rolle spielt,

sondern auch bFGF und Cyr61. Möglicherweise sind weitere Proteine der CCN-Familie wie

CTGF an der Entstehung von Endometriose beteiligt. Es wurden höhere

Expressionsmengen von CTGF in den endometriotischen Läsionen beider Zyklusphasen

nachgewiesen. CTGF könnte daher zusammen mit Cyr61 eine Rolle bei der Ents

106

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124

Anhang

9 Anhang

9.1 Primer-Sequenzen

125

Anhang

9.2 Ergebnisse der „Gene-Array“ Analysen

126

Anhang

127

Anhang

128

Lebenslauf

Name: Yvonne Janßen

Anschrift: Löhrerlen 28 42279 Wuppertal Geburtsdatum: 15.03.1976

Geburtsort: Wuppertal

Staatsangehörigkeit: deutsch

Familienstand: ledig

Konfession: evangelisch

Schulbildung: 1982-1986 Grundschule Kratzkopfstraße, Wuppertal

1986-1995 Städt. Gymnasium an der Siegesstraße, Wuppertal

Schulabschluß: Abitur

Studium: 1995-2000 Ruhr-Universität Bochum Diplomstudiengang Biologie

Thema der Diplomarbeit:

„Strukturelle und funktionelle Charakterisierung von Konformationsänderungen der cAMP- abhängigen Proteinkinase“

Studienabschluß: Diplom-Biologin

Doktorarbeit: seit Mai 2000 Biologie-Doktorandin am Institut für Anatomie, Universitätsklinikum Essen bei Frau Prof. Dr. Elke Winterhager

Titel der Dissertationsschrift: „Cyr61: Ein durch Östrogen reguliertes Markergen der Endometriose“ Wuppertal, 08. April 2003 Yvonne Janßen

Erklärung:

Hiermit erkläre ich, gem. §6 Abs. 2, Nr. 7 der Promotionsordnung der Fachbereiche 6 bis 9 Thema „Cyr61: Ein durch

Östrogen reguliertes Markergen der Endometriose“ zuzuordnen ist, in Forschung und Lehre

Prof. Dr. Elke Winterhager

mich keiner anderen als der angegebenen Hilfsmittel bedient habe.

Yvonne Janßen

is 9

e Arbeit von keiner anderen Fakultät abgelehnt worden ist.

en

zur Erlangung des Dr. rer. nat., daß ich das Arbeitsgebiet, dem das

vertrete und den Antrag von Frau Yvonne Janßen befürworte.

Essen, 08. April 2003

Erklärung:

Hiermit erkläre ich, gem. §6 Abs. 2, Nr. 6 der Promotionsordnung der Fachbereiche 6 bis 9 zur Erlangung des Dr. rer. nat., daß ich die vorliegende Dissertation selbständig verfaßt und

Essen, 08. April 2003

Erklärung:

Hiermit erkläre ich, gem. §6 Abs. 2, Nr. 8 de Promotionsordnung der Fachbereiche 6 btionen bzw.

r zur Erlangung des Dr. rer. nat., daß ich keine anderen PromoPromotionsversuche in der Vergangenheit durchgeführt habe und daß dies

Essen, 08. April 2003 Yvonne Janß

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Cyr61: Ein durch Östrogen reguliertes Markergen der ... · Endometrioseherde in der Pleura könnten auch dadurch erklärt werden, daß endometriale Zellen und Fragmente über die