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Endbericht zum Projekt
Lungenerkrankungen
von Biomastlämmern Institut für Veterinärmedizinische Untersuchungen Graz
Dr. H. Weinberger, (AGES); Dr. J. Frei (prakt. Tzt. Stein/Enns)
Dr. T. Urbanke (AGES); Dr. S. Richter (AGES);
Dr. F. Dieber (Stmk TGD); Dr. J. Spergser (VUW); Dr. J. Köfer (AGES)
2
1. Einleitung
Bio-Schaflämmer aus der Steiermark und den angrenzenden Bundesländern werden im
Schlachthof Tasch in Stein/Enns geschlachtet. Die steirischen Lämmer kommen bis zum
Schlachttermin in einen Sammelstall in Öblarn. Vom Abnehmer wird ein Mindestlebendgewicht
von 40 kg gefordert, somit stehen manche Lämmer mit verzögertem Wachstum Wochen bis
Monate im Sammelstall.
Im Jahr 2007 wurden bei ~15% von 1015 geschlachteten Lämmern Lungenveränderungen
festgestellt. Dr. Frei, 8961 Stein/Enns, hat aus diesem Grund gemeinsam mit dem TGD Steiermark
(Dr. F. Dieber) geplant, veränderte Schaflungen in einem Zeitraum von etwa 1 Jahr hinsichtlich der
Ätiologie und des Alters der pneumonischen Veränderungen untersuchen zu lassen. Im Rahmen
dieses Projektes wurden nur Bio Lämmer aus der Steiermark untersucht.
Bei gleichbleibendem Schlachtaufkommen wie im Jahr 2007 wurde ein Probenaufkommen von
etwa 150 Stück Lungen geschätzt. Da diese Zahl bereits im Februar 2009 erreicht war, wurde das
Projekt bis Juni 2009 verlängert um eine Aussage über den Verlauf bezüglich des Auftretens von
Lungenveränderungen über ein ganzes Jahr treffen zu können. Zusätzlich wurde eine
Differenzierung der isolierten Mykoplasmen an der Veterinärmedizinischen Universität Wien,
Institut für Bakteriologie, Dr. Spergser angeschlossen.
2. Zielsetzung
Abklärung pathologisch-anatomischer und -histologischer Organveränderungen, bakterieller
Erreger inklusive Mykoplasmen und viraler Erreger. Erstellung eines Antibiogramms bei
relevanten Keimen. Altersbestimmung pleuro-pneumonischer Veränderungen zur Abklärung ob
diese im Ursprungsbetrieb oder im Sammelstall entstanden sind.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sollen helfen den Gesundheitszustand der Lämmer zu
verbessern und damit die Qualität der Schlachtkörper bzw. Organe zu erhöhen.
3. Material und Methodik
Im Zeitraum von 11.6.2008 bis 30.6.2009 wurden im Rahmen der Schlachttier- und Fleisch-
untersuchung von Dr. Frei 1458 steirische Biolämmer beurteilt und davon 273 Lungen als
verändert registriert. 212 dieser veränderten Lungen wurden für weitere Untersuchungen am IVET
Graz ausgewählt.
Diese Lungen stammten von Biolämmern 54 verschiedener Betriebe, wobei zwischen 1 und 19 der
Proben aus einem Bestand stammten.
3
Grafik 1 zeigt eine Übersicht über Anzahl der geschlachteten Lämmer, der veränderten und der zur
Untersuchung ans IVET Graz gelangten Lungen im Projektzeitraum von 1 Jahr. Die Trendlinien
lassen ein Absinken sowohl von Schlachtungen als auch von veränderten Lungen in den
Wintermonaten erkennen.
In Grafik 2 sind die im Schlachtraum als verändert befundeten und die am Institut für
veterinärmedizinische Untersuchungen, AGES Graz untersuchten Lungen in Prozent der Anzahl
der geschlachteten Schafe dargestellt. Eine Abnahme des Anteils veränderter Lungen in den
Wintermonaten gegenüber den Sommermonaten ist zu erkennen (von ~30% auf 10-15%).
Anzahl von geschlachteten Lämmern, veränderten und untersuchten Lungen
0
10
20
30
40
50
60
70
09.06.2
008
23.06.2
008
07.07.2
008
21.07.2
008
04.08.2
008
18.08.2
008
01.09.2
008
22.09.2
008
06.10.2
008
20.10.2
008
03.11.2
008
17.11.2
008
01.12.2
008
15.12.2
008
12.01.2
009
26.01.2
009
09.02.2
009
23.02.2
009
09.03.2
009
23.03.2
009
06.04.2
009
20.04.2
009
04.05.2
009
18.05.2
009
02.06.2
009
15.06.2
009
29.06.2
009
geschlachtete Lämmer alle veränderten Lungen untersuchte Lungen
Polynomisch (untersuchte Lungen) Polynomisch (geschlachtete Lämmer) Polynomisch (alle veränderten Lungen)
Grafik 1: Anzahl der geschlachteten Lämmer, der bei der Schlachttier-/ Fleischuntersuchung
veränderten, und der zur Untersuchung ans IVET Graz gelangten Lungen über den Projektzeitraum
von 1 Jahr, mit polynomischen Trendlinien
4
Prozentueller Anteil veränderter und untersuchter Lungen an
geschlachteten Lämmern
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
09.0
6.200
8
30.0
6.200
8
21.0
7.200
8
11.0
8.200
8
01.0
9.200
8
29.0
9.200
8
20.1
0.200
8
10.1
1.200
8
01.1
2.200
8
29.1
2.200
8
26.0
1.200
9
16.0
2.200
9
09.0
3.200
9
30.0
3.200
9
20.0
4.200
9
11.0
5.200
9
02.0
6.200
9
22.0
6.200
9
untersuchte Lungen in % alle veränderten Lungen in %Polynomisch (alle veränderten Lungen in %) Polynomisch (untersuchte Lungen in %)
Grafik 2: Prozentueller Anteil am Schlachthof veränderter und zur Untersuchung ans IVET Graz
gelangter Lungen an der Gesamtanzahl aller geschlachteten Schafe im Projektzeitraum von 1 Jahr,
mit polynomischen Trendlinien
- Makropathologie
Organsektion mit pathologisch-anatomischer Beurteilung. Entnahme von Lungenteilen für die
histologische und elektronenmikroskopische Untersuchung. Weiterleitung von Proben zum
bakteriologischen Ansatz.
Beschreibung der Veränderungen an Lunge und Pleura nach Lokalisation ( Graphik 3 ), Qualität
(z.B. eitrige Pneumonie, Pleuritis, Lungenemphysem, Blutungen, Verwachsungen, Abszesse) und
Quantität (ggr./mgr./hgr.).
5
links rechts
HL Zwerchfelllappen lobus diaphragmaticus
ML Mittellappen (links eigentlich cd. Teil des Spitzenlappens, re
wirklich Mittellappen)
lobus medius
VL Spitzen(Vorder)lappen lobus apicalis
AL Anhangslappen lobus accessorius
Graphik 3: Anatomie der Lunge nach Nickel, Schummer, Seiferle, Anatomie der Haustiere, 1960,
2. Aufl.
- Histopathologie
Zur histologischen Untersuchung wurden je ein ca. 2x3x2cm großes Stück aus einem veränderten
und aus einem unverändertem Teil der Lunge entnommen und in 7% gepuffertem Formalin für
mindestens 24 Stunden fixiert; es erfolgte eine Einbettung der Proben in Paraffin, Anfertigung von
ca. 4-6µm dicken Schnitten und anschließender Hämatoxilin/Eosin-Färbung.
Die untersuchten Lungenproben zeigten unterschiedliche Veränderungen, welche z.T. auf die
Ätiologie hinweist (bakterielle/virale Ursache; Mykoplasmen, Stallklima).
6
Pleuritis adhäsiva: Fibröse Pleuritis mit Verwachsung von Pleura pulmonalis mit Pleura costalis;
eine Trennung der Lunge vom Brustkorb ist nur mit Substanzverlust möglich.
Pleuritis fibrinosa: Fibrinöses Exsudat überzieht die Pleura; eine Trennung der Lunge vom
Brustkorb ist ohne Substanzverlust möglich.
Pneumonien bestehen meist aus unterschiedlichen Anteilen:
Akut: Eitrig: überwiegend neutrophile Granulozyten im Alveolarlumen;
„Desquamativ“: Einwanderung von Alveolarmakrophagen, welche von Typ II
Pneumozyten vermehrt produzierten Surfactant phagozytieren. Typ II Pneumozyten
werden vermehrt produziert, wenn Typ I Pneumozyten, welche empfindlicher gegen
Noxen, z.B. Sauerstoffmangel sind, zugrunde gehen.
„Desquamativ“-eitrig: Alveolarmakrophagen und neutrophile Granulozyten im
Alveolarlumen.
Fibrinös: (früher kruppös): je nach Phase, Fibrin, Leukozyten, Blut oder tw.
nebeneinander.
Chronisch:
BALT: induzierbares Schleimhaut-assoziertes lymphatisches Gewebe (MALT) entsteht als
Reaktion auf eine lang anhaltende Immunstimulation (z.B. Mykoplasmen, Viren). Dieses
kann das Lumen der Bronchioli einengen.
Fibrose: Bindegewebszubildung als Ersatz von akut entzündlichem Gewebe (Vernarbung)
oder in den Alveolarwänden z.B. von Ödemflüssigkeit.
„Bronchiolo-alveoläre Hyperplasie“: im Bereich der Alveolen kommt es nach Schädigung
der Typ I Pneumozyten zu einer Hyperplasie von Typ II Pneumozyten, welche epihelartig
aufgereiht sind.
Abszesse: fokale Einschmelzung von Gewebe durch Granulozyten bzw. ihre Enzyme; je
nach Alter Ausbildung einer unterschiedlich starken Abszesskapsel.
Die Begriffe „desquamative Pneumonie“ und „bronchiolo-alveoläre Hyperplasie“ sind nicht mehr
aktuell und stehen daher unter Anführungszeichen; die Definitionen geben den aktuellen
Wissensstand wieder.
Zur Altersbestimmung wurden die Altersangaben von Lungenveränderungen und allgemeine
Richtlinien zur Altersbestimmung von Entzündungen nach Beteiligung unterschiedlicher Zelltypen
am Entzündungsprozess (nach Köhler, Kraft; Gerichtliche Veterinärmedizin, 1984) verwendet.
7
Katarrhalpneumonie 1-2 Tage, gegebenenfalls mit Hinzurechnen einer Inkubationsfrist,
welche bei bakteriell bedingten Pneumonien als sehr kurz (1-2) Tage
angegeben wird.
Katarrhalpneumonie mit Peribronchitis oder festen Verwachsungen zwischen Lunge und Pleura
costalis 10-14 Tage; die BALT-Hyperplasie wurde hier mit Peribronchitis
gleichgesetzt.
Bronchitis obliterans 7-9 Tage.
Kruppöse (fibrinöse) Pneumonie je nach Phase 1(-2) -7 Tage.
Zur Abschätzung des Alters wurden für dieses Projekt insbesondere folgende Kriterien
herangezogen:
1) Peribronchitis mit katarrhalischer („desquamativer“, eitriger oder „desquamativ“-eitriger )
Pneumonie, welcher eine Mindestentstehungsdauer von 10 Tagen zugeordnet wurde.
2) Fibröse Veränderungen, sowohl an Pleura als auch im inter- und intralobulären
Lungeninterstitium mit einer ebenso langen Mindestentstehungsdauer .
3) Für die Ausbildung von „bronchiolo-alveolären Hyperplasien“, für die es in der Literatur keine
Angaben über die Entstehungsdauer gab, wurde ein Zeitraum zwischen 5 und 10 Tagen
angenommen (Einwirkungsdauer einer Noxe, Verlust der Pneumonzyten TypI, Proliferation und
Aufreihung der Pneumonzyten TypII an der Alveolarbasalmembran).
- Bakteriologie
Bakteriologische Untersuchung mittels Direktausstrich eines veränderten Organstückes auf
Schafblutagar (Fa Biomerieux), McConkey-, Pasteurellen- und Mykoplasmen-Agar (hergestellt am
Institut für veterinärmedizinische Untersuchungen AGES Graz), und nachfolgender aerober bzw.
mikro-aerophiler (90% N; 10% CO2) Bebrütung bei 37° Celsius für 24 bzw. 72 Stunden.
Auswertung und bei Bedarf Differenzierung der Keime mit den biochemischen Systemen API
20NE, API Strep und API Staph der Fa. Biomerieux.
Die Erstellung eines Antibiogrammes auf Schafblutagar erfolgte mittels Agardiffusionstest für
Keime, welche als relevant für die Entstehung von Lungen- und Pleuraveränderungen eingestuft
wurden. Bei Isolierung desselben Keimes aus Lungen von Schafen aus dem gleichen Betrieb und
vom selben Schlachttag wurde nur einmal ein Antibiogramm erstellt. Eitererreger wie z.B.
Staphylokokken und Streptokokken wurden nicht getestet. Die untersuchten Antibiotika sind in der
nachfolgenden Tabelle 1 aufgelistet. Florfenicol und Tulathromycin wurden nach Rücksprache mit
Dr. Frei ab 8.7. 2008 getestet.
8
Amoxicillin
Ampicillin
Cefquinom
Colistin
Enrofloxacin
Florfenicol
Gentamicin
Kanamycin
Lincomycin /
Spectinomycin
Neomycin
Penicillin G
Streptomycin
Tetracyclin
Tilmicosin
Trimethoprim
Tulathromycin
Tab 1: Auflistung der Antibiotika gegen welche eine Resistenztestung erfolgte
- Elektronenmikroskopie
Zur routinemäßigen Untersuchung der Lämmerlungen wurde die Präparationsmethode des
„Negative Stainings“ mit anschließender Analyse im Transmissionselektronenmikroskop
angewandt. Beim „Negative Staining“ wurde aus einer Lungenprobe eine Suspension hergestellt.
Die Suspension wurde in der Folge durch Zentrifugieren (3000rpm/15min., 4600rpm/15min.) von
Zellresten befreit. Die Viren im gewonnenen Überstand wurden mittels Ultrazentrifuge (80000rpm,
20psi, 25min.) auf die Objektträgernetzchen zentrifugiert. Die Ultrazentrifugation und die kurz
zuvor angewandte chemische Behandlung der Objektträgernetzchen ermöglichte so eine
Anreicherung der Viren auf dem Objektträger. Nach der anschließenden Färbung („Negative
Staining“) der so mit Proben bestückten Objektträgernetzchen wurden diese im
Transmissionselektronenmikroskop analysiert.
- Mykoplasmendifferenzierung
Mykoplasmen wurden auf einem für Schafmykoplasmen geeigneten Mykoplasmen-Medium des
IVET Graz angezüchtet und aufgrund ihrer Morphologie vorerst als Mykoplasmen eingestuft; die
Differenzierung der Kulturen wurde am Institut für Bakteriologie, vetmeduni vienna von Dr.
Spergser durchgeführt.
Die Artdiagnose erfolgte mittels Mykoplasmen-spezifischer PCR der 16S-23S intergenischen
Spacer (IGS)-Region und anschließender Restriktionsenzym-Analyse der gewonnenen
9
Amplifikate. Hierfür wurden die übersandten Mykoplasmen-Agarkulturen in Friis-Flüssigmedium
überführt und bei 37°C und 5%iger CO2-Atmosphäre für 7 Tage bebrütet. Anschließend erfolgte
die DNA-Extraktion mit Hilfe des Gene Elute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kits (Sigma-
Aldrich, Wien) nach Herstellerangaben. Die mittels 16S-23S IGS-PCR gewonnenen Amplifikate
wurden schließlich mit Hilfe eines Restriktionsenzym-Cocktails (TaqI/VspI) enzymatisch
gespalten, gelelektrophoretisch aufgetrennt und die erhaltenen Bandenmuster mit Profilen von
ovinen Mykoplasmen-Typ- und Referenzstämmen verglichen.
4. Ergebnisse
Makropathologie:
Von 212 Lungen waren makroskopisch bei 207 Stück lobuläre pneumonischeVeränderungen
festzustellen; 4 Organe zeigten nur eine Pleuritis und eine Lunge einen solitären Abszess.
Verteilung in der Lunge bzw. Grad der Veränderungen in Bezug auf Lokalisation siehe Grafiken 4
und 5. In erster Linie war der rechte Spitzenlappen betroffen, gefolgt von annähernd gleicher
Anzahl von Veränderungen im rechten Mittellappen und im caudalen Anteil des linken
Spitzenlappen.
ggr.
mgr.
hgr.
re Spitzenlappen
re Mittellappen
re Hauptlappen
li Spitzenlappen cran
li Spitzenlappen caud
li Hauptlappen
Pleuritis
0
20
40
60
80
100
120
140
Anzahl
Grad der
Veränderung
Lokalisation
Verteilung der pneumonischen Veränderungen
Grafik 4: Verteilung der pneumonischen Veränderungen entsprechend Grad und Lokalisation
10
Grafik 5: Anzahl der Veränderungen entsprechend der Lokalisation. Gesamtanzahl der
untersuchten Lungen 212 Stück.
Histologische Befunde und Altersbestimmung:
Das Ergebnis der histologischen Untersuchung zeigt, dass eitrige bzw. „desquamativ“-eitrige
Pneumonien den überwiegenden Teil der Veränderungen darstellen. Am nächst häufigsten war die
Ausbildung von BALT-Hyperplasien und „bronchiolo-alveolären Hyperplasien“.
Nichtentzündliche Veränderungen, wie meist subpleural gelegene Dystelektasen sind bei knapp 30
Prozent der Lungen zu finden, vermutlich schlachtbedingte Blutungen und alveoläres Emphysem
bei etwa 2/3 des Untersuchungsgutes, wobei die Anzahl in grobsinnlich veränderten und
unveränderten Lungen differiert. Die mit für die Altersbestimmung herangezogenen Fibrosen
wurden in etwa 20 % der veränderten Lungenteile festgestellt (Tab. 2).
Bei 2 Lungen wurden Veränderungen festgestellt, welche als Beginn einer Lungenadenomatose
eingestuft wurden (Grafik 6).
makroskopisch veränderte Lungenteile
in % der Gesamtzahl von 212
makroskopisch unveränderte Lungenteile
in % der Gesamtzahl von 212
eitrige Broncho-Pneumonie 190 89,62 12 5,66
"desquamative" Pneumonie 187 88,21 4 1,89
BALT Hyperplasie 121 57,08 48 22,64
intralobuläre interst. Pneumonie 32 15,09 74 34,91
44 22
78
40 27
87
202
0
50
100
150
200
250
Anzahl der Veränderungen
re Spitzenlappen
re Mittellappen
re Hauptlappen li
Spitzenlappen
li Spitzenlappen
caud li
Hauptlappen
Pleuritis
Gesamtanzahl der Veränderungen nach Lokalisation
cran
11
"bronchio-alveoläre Hyperplasie" 54 25,47 2 0,94
Blutungen 54 25,47 131 61,79
Dystelektase 62 29,25 28 13,21
alv Emphysem 13 6,13 128 60,38
Ödem 22 10,38 6 2,83
Fibrose 42 19,81 7 3,30
Tab.2: Darstellung der histologischen Lungenveränderungen in den makroskopisch als verändert
bzw. unverändert beschriebenen Lokalisationen in absoluten Zahlen sowie Prozentangaben.
Grafik 6: 2 Lokalisationen einer Lunge in unterschiedlicher Vergrößerung: papilläre Strukturen
kubischer, epithelartig aneinander gereihten Zellen, teilweise mit gut ausgebildetem Stroma. In
zahlreichen Alveolen neutrophile Granulozyten und Makrophagen. Peribronchioläre plasma- und
lymphozytäre Infiltration.
Mikrobiologische / virologische Beurteilung:
Bakterien:
Mannheimia hämolytika (52%) und Pasteurella multocida (21%) waren die Erreger welche am
häufigsten aus den Proben isoliert werden konnten. In die Gruppe der unspezifischen Keime (15%)
wurden z.B. unterschiedliche Streptokokken, Staphylokokken, Histophilus (Hämophilus) somni
12
eingeordnet. Ein grafischer Überblick der isolierten bakteriellen Erreger ist in Grafik 7 zu sehen.
Zweifach- und Dreifachinfektionen sind in der Übersicht auch erfasst. Bei insgesamt 55 von 212
Lungen konnten keine Bakterien isoliert werden.
Die Summer aller isolierten Erreger (Bakterien, Viren, Mykoplasmen) sowie die Häufigkeit ihres
Vorkommens bezogen auf alle 212 untersuchten Lungen, ist in Grafik 8 ersichtlich.
Bakterielle Erreger
Past. multocida; 38
Past. Spec.; 6
Moraxella; 12
Arcanobacterium pyog.; 4
unspezifische Keime; 27 Mannheimia häm.; 91
Mannheimia häm. Past. multocida
Past. Spec. Moraxella
Arcanobacterium pyog. unspezifische Keime
Grafik 7: Anzahl der Lungen aus welchen bestimmte bakterielle Erreger isoliert wurden.
Mehrfachinfektionen:
Da aus zahlreichen Lungen nicht nur ein, sondern zwei oder drei Erreger isoliert wurden, sind in
Grafik 9 sowohl die unterschiedlichen Kombinationen bakteriellen Erreger und Mykoplasmen als
auch in wie vielen Proben diese festgestellt wurden dargestellt. An den Mehrfachinfektionen sind
am häufigsten Mannheimia hämolytica, Pasteurella multocida und Mykoplasmen beteiligt.
13
Erregerübersicht
6124
27
8 2 4
Retrovirus; 22
Past. multocida; 38
Mykoplasma; 69
Mannheimia häm.; 91
Mannheimia häm. Past. multocida Past. Spec. Moraxella Arcanobacterium pyog. unspezifische Keime
Mykoplasma Retrovirus Herpesvirus Adenovirus Mamm. Orthoreovirus
Grafik 8: Darstellung der festgestellten bakteriellen, viralen Erreger und Mykoplasmen und ihre
Häufigkeit im Bezug auf die Gesamtanzahl der untersuchten Lungen (212 Stück)
M = Manheimia hämolytika P = Pasteurella multocida
UK = unspezifische Keime Myk = Mykoplasmen
Grafik 9: Anzahl der Mehrfachinfektionen durch Bakterien und durch Bakterien und Mykoplasmen
gemeinsam
Überblick über die Gesamt-Resistenzlage der isolierten Keime
Grafik 10 und 11 zeigen den Aufbau des Diagramms am Beispiel der Sensibilität von Mannheimia
hämolytica und Pasteurella multocida, den am häufigsten isolierten Keimen. Während ein Großteil
der getesteten Antibiotika zu fast 100 Prozent sensibel ist gibt es bei Gentamycin, Kanamycin,
9
6
1
29
11
5
3 1
10
1 0
5
10
15
20
25
30
Anzahl
M, P, M, UK P,UK M, Myk P, Myk UK, Myk P,UK, Myk M, UK, Myk M, P, Myk M, P, UK
Erregerkombination
Doppel - und Dreifach - Infektionen
14
Linco-/Spectinomycin, Neomycin, Tetracyclin und Streptomycin/Trimethroprim-Sulfonamid
deutliche Resistenzen bzw. intermediäre Reaktion.
Die Besitzer – Keim – Antibiogramm – Relationen sind in einer interaktiven Darstellung einer(s)
Excell-Pivot-Tabelle/Diagramm dargestellt (absolute Zahlen):
AB_ Erreger_komplett_08022010
Durch Anklicken und gleichzeitiges Drücken der „STRG“ Taste öffnet sich die Pivot-Tabelle bzw.
das Pivot-Diagramm und man kann durch Anwählen der gewünschten Parameter (z.B.
Antibiotikum, Besitzer, Keim) betriebs- oder erregerspezifische Informationen darstellen (Link für
eigene Dateistrukturen aktualisieren – rechte Maustaste - Hyperlink bearbeiten).
Amoxicillin
Ampicillin
Cefquinom
Colistin
Enrofloxa
cin
Florfenico
l
Gentamicin
Kanamycin
Lincomycin/Spectinomycin
Marbofloxa
cin
Neomycin
Penicillin G
Streptomycin
Tetracyclin
Tilmicosin
Trimethoprim
Tulathromycin
RI
S
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Empfindlich-
keit (%)
Antibiotika
Antibiotika-Sensibilität für Mannheimia hämolytica
R
I
S
Graphik 10: Sensibilität von Mannheimia hämolytica. Angabe in Prozent der getesteten Keime.
S = Sensibel, R = Resistent, I = Intermediär.
15
Amoxicillin
Ampicillin
Cefquinom
Colistin
Enrofloxa
cin
Florfenico
l
Gentamicin
Kanamycin
Lincomycin/Spectinomycin
Neomycin
Penicillin G
Streptomycin
Tetracyclin
Trimethoprim
Tulathromycin
RI
S
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Empfindlich-
keit (%)
Antibiotika
Antibiotika-Sensibilität für Pasteurella multocida
R
I
S
Graphik 11: Sensibilität von Pasteurella multocida. Angaben in Prozent der getesten Keime.
S = Sensibel, R = Resistent, I = Intermediär.
Elektronenmikroskopische Ergebnisse – Virale Erreger:
Es konnten bei 36 von 212 Proben Viren festgestellt werden (Grafik 12). Die besitzer- und
probenbezogene Auflistung geht aus Tabelle 3 hervor. Mehr als die Hälfte der gefundenen Viren
waren Retroviren.
Tabelle_Viren_15_09_2010.xls (Verlinkung mit der Dokumentendatei des Projektberichtes)
ermöglicht als Pivot- bzw. als Autofilter-Tabelle Abfragen zu unterschiedlichen Parametern.
16
Elektronenmikroskopische Ergebnisse - Viren
Retrovirus; 22
Adenovirus; 2
Herpesvirus; 8
Mamm. Orthoreovirus ; 4
Grafik 12: Art und Anzahl der elektronenmikroskopisch identifizierten Viren
Tabelle Viren
Name Auftragsnr. Nr. ELMI Ergebnis
Ablasser Martin u. Auguste 8099937 2 Retrovirus 1
Aloisia Einwitschläger 9010857 1 Retrovirus 1
3 Retrovirus 1
Blasl Margarethe 8072911 3 Mamm. Orthoreovirus 1
8082154 5 Herpesvirus 1
6 Herpesvirus 1
Brandstätter Lisbeth 8072911 2 Retrovirus 1
Gassner Johann 8057993 7 Retrovirus 1
Göldner Josef 8092251 2 Retrovirus 1
Haberl Andrea 8054150 3 Retrovirus 1
5 Mamm. Orthoreovirus 1
Ilsinger Christian 8050535 3 Herpesvirus 1
9047872 3 Retrovirus 1
Lackner Rosswitha 9022532 6 Herpesvirus 1
Leitner Alfred jun. u. Monika 8050535 8 Retrovirus 1
8056345 4 Retrovirus 1
8087248 1 Retrovirus 1
Mali Ingeborg 8089705 9 Retrovirus 1
9017616 1 Retrovirus 1
9034652 1 Retrovirus 1
Moosbrugger Beate 8087248 5 Herpesvirus 1
17
Moosbrugger Gerlinde 8105242 4 Herpesvirus 1
Pircher Gertrude 9047872 5 Retrovirus 1
Promok Reinhard u. Veronika 9001919 1 Retrovirus 1
Prugger Peter 8089705 5 Retrovirus 1
Reiter Wolfgang 9022532 7 Adenovirus 1
Reiter Franz 8056345 11 Adenovirus 1
Rieger Gottfried u. Elfriede 8068889 5 Mamm. Orthoreovirus 1
8089705 4 Retrovirus 1
Schafbauernzentrum 8060355 5 Mamm. Orthoreovirus 1
6 Herpesvirus 1
Schmiedhofer Christine 8066923 4 Retrovirus 1
9017616 2 Herpesvirus 1
Schrempf Johann 8064686 5 Retrovirus 1
Seebacher Johann 8057993 8 Retrovirus 1
Trinker Adele 8077518 4 Retrovirus 1
Adenovirus Anzahl 2
Herpesvirus Anzahl 8
Mamm. Orthoreovirus Anzahl 4
Retrovirus Anzahl 22
Gesamtergebnis 36
Tab 3: Den Besitzern sowie Auftrags- und Probennummern zugeordnete Viren
Mykoplasmen:
Bei 72 Proben wurde ein für Mykoplasmen typisches Wachstum festgestellt. (4 Proben gingen am
Transport nach Mödling verloren, darum gab es keine eingefrorenen Teile zur Differenzierung, aus
8 Proben ließen sich Mykoplasmen nicht mehr anzüchten)
Differenzierung in Grafik 13 als Diagramm dargestellt:
26 M. arginini
3 M. bovigenitalium
1 M. ovipneumoniae
26 M. arginini und M. bovigenitalium
1 M. ovipneumoniae und M. bovigenitalium
3 Proben nicht als Mykoplasmen differenzierbar
18
Mykoplasmen-Differenzierung
M. arginini; 26
M. arginini und M.
bovigenitalium; 26
M. bovigenitalium; 3
M. ovipneumoniae und M.
bovigenitalium; 1
Proben nicht als Mykoplasmen
differenzierbar; 3
M. ovipneumoniae; 1
M. arginini
M. bovigenitalium
M. ovipneumoniae
M. arginini und M. bovigenitalium
M. ovipneumoniae und M. bovigenitalium
Proben nicht als Mykoplasmen differenzierbar
Grafik 13: Differenzierung der festgestellten Mykoplasmen; Einfach- und Mehrfachinfektionen
Diskussion:
Histologie und Altersbestimmung:
Da bei den eingesandten Proben die fragliche Dauer der pneumonischen Veränderung zwischen 1
und 131 Tagen liegt, erübrigt sich z.T. die Altersbestimmung.
Veränderungen wie Lungenadenomatose lassen auf eine lange Entstehungszeit schließen, da hier
großteils Inkubationszeiträume von mehreren Monaten angegeben werden. Allerdings findet man
in der Literatur auch die Angabe von Inkubationszeiten von Tagen bis Wochen bei experimentell
induzierter Infektion. In den Fällen von Lungenadenomatose ist aufgrund der langen
Inkubationszeit der Heimatbetrieb als Infektionsort anzunehmen.
„Bronchiolo-alveoläre Hyperplasien“ können nach einer Dissertation aus der Humanmedizin
(2002) eine Vorstufe für Tumore (Adenomatose/Adenokarzinom) bzw. die Reaktion auf die
Einwirkung von Noxen (z.B. Stallklima) sein. Eine Angabe über den Zeitraum, den solche
Veränderungen zu ihrer Entstehung brauchen, liegt nicht vor; es kann aber davon ausgegangen
werden, dass ihre Entstehung nicht innerhalb weniger Tage erfolgt.
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Generell muss erwähnt werden, dass eine Vorschädigung der Lunge durch Stallklima, virale
Erreger oder Mykoplasmen oft die Empfänglichkeit für eine bakterielle Infektion erhöht, welche
dann weiter begünstigt durch Transportstress und neues Erregerspektrum im Sammelstall die
akuten eitrigen Pneumonien auslösen. Eine klare Trennung an welchem Ort die Pneumonie (ohne
Unterscheidung der Qualität) entstanden ist, kann also auch durch eine Altersbestimmung nicht
immer getroffen werden. Grafik 14 zeigt, dass nach unserem Bewertungsschema mehr als die
Hälfte der bakteriellen Infektionen im Sammelstall erfolgte.
Vergleich Entzündungsalter mit Einstelldauer
35
122
31
24
Entzündung mind 10 Tage >Einstellzeitraum
Entzündung mind 10 Tage <Einstellzeitraum
Entzündung < 10 Tage, > Einstellzeitraum
keine Angaben
Grafik 14: Anzahl der Proben bei denen eine Datierung über/unter den angegebenen
Einstellzeitraum im Sammelstall möglich war; z.T. waren keine Angaben über den
Einstallungszeitpunkt vorhanden
Bakterien:
Bei Schaf und Ziege sind bakteriell bedingte Pneumonien überwiegend auf Infektionen mit
Mannheimia hämolytica bzw. Pasteurella trehalosi und Pasteurella multocida zurückzuführen.
Diese Keime sind im Nasopharynx und auf den Tonsillen gesunder Tiere zu finden und gelangen
infolge Resistenzminderung infolge der Einwirkung von Stressfakoren wie „Crowding“, Transport
oder klimatische Einflüsse in den unteren Respirationstrakt. Mittels API 20NE, Fa. Biomerieux
erfolgte keine Auftrennung der biochemisch eng verwandten Keime Mannheimia hämolytika und
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Pasteurella trehalosi. Während Mannheimia hämolytica überwiegend bei Lungenerkrankungen,
teilweise auch bei Mastitiden vorkommt, wird Pasteurella trehalosi vorwiegend für septikämische
und systemische Infektionen von Sauglämmern verantwortlich gemacht. Aus diesem Grund
wurden die Isolate alle als Mannheimia hämolytica eingestuft.
Elektronenmikroskopie
Gegenüber anderen, in der Regel aus einem spezifischen Erreger-Testkit bestehenden
mikrobiologischen Analysemethoden ermöglicht die diagnostische Elektronenmikroskopie einen
schnellen und detaillierten Blick auf die Gesamtheit der in einer Probe enthaltenen Erreger
(„Catch-it-all“ Prinzip). Die elektronenmikroskopische Untersuchungsmethode erlaubt nach einem
Testverfahren die im Präparat beobachteten Strukturen sehr schnell nach Größe und Form einer der
bekannten Viruserreger-Familien zuzuordnen; häufig führt sie auch dadurch schon in kurzer Zeit
zum Ausschluss bedeutsamer viraler Erreger. Gerade bei der Untersuchung von Routineproben wie
den Lämmerlungen ist die Präparationsmethode des „Negative Stainings“ mit anschließender
Analyse im Transmissionselektronenmikroskop zu empfehlen. Kostenintensive Tests auf
bestimmte Erreger (wie z.B. bei serologischen Methoden (ELISA) und molekularbiologischen
Methoden (PCR)) sind nicht nur wegen der Vielzahl an Testserien zeitintensiv sondern führen auch
selten zur Gewissheit, dass die Probe „virusfrei“ ist. Durch den unvoreingenommenen Blick auf
die Probe („Offener Blick“) und das „Catch-it-all“ Prinzip kann mittels Elektronenmikroskopie mit
einem Test beides gewährt werden. Eine der PCR ähnliche hohe Sensitivität wurde mittels
Anreicherung durch Ultrazentrifugation erreicht.
Meist sind virale Infektionen Wegbereiter für bakterielle Infektionen. Die beim Schaf
vorkommenden Retroviren bilden ein chronisches eigenständiges Krankheitsbild aus, welches
infolge der langen Inkubationszeit bei natürlicher Infektion erst ab einem Alter von 1-2 Jahren
klinische Erscheinungen zeigt, wobei morphologische Veränderungen laut Literatur wesentlich
früher auftreten können. Die übrigen elektronenoptisch festgestellten Viren sind nicht als primär
Lungen-pathogen beim Schaf beschrieben.
Retroviren sind die Erreger von Lungenadenomatose (Lungenkarzinomatose): abweichend vom
gebräuchlichen Namen Adenomatose wird sie als Adenokarzinom mit geringem
Differenzierungsgrad beschrieben, welches makroskopisch kleine graue Herde in der Lunge
verursacht; die Lunge ist schlecht oder gar nicht kollabiert; mit Zunahme der Veränderungen
verstärken sich die klinischen Erscheinungen. Histologisch fallen meist zahlreiche Herde auf,
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welche aus hyperplastischen kuboidalen Zellen bestehen und entweder entlang der Alveolarwand
oder in papillären Strängen angeordnet sind. Meist sind nur wenig interstitielle Entzündungszellen
nachzuweisen.
Maedi/Visna Komplex: die Lungenveränderung wird auch als ovine progressive Pneumonie
bezeichnet und zeigt als typische Veränderung eine lymphoide interstitielle (perivaskuläre und –
bronchioläre) Pneumonie und eine Hyperplasie der glatten Muskulatur in der Wand der terminalen
Bronchiolen. In der Folge kollabiert auch diese Lunge schlecht bis gar nicht und erreicht ein 2-3-
Faches des Normalgewichtes.
Bei keiner der 2 Lungen mit Adenomatose(karzinomatose)-Veränderungen konnten Retroviren
nachgewiesen werden.
Mamalian Orthoreovirus: nicht pathogen für Schafe; Meningitis/Enzephalitiserreger bei anderen
Tierarten; respiratorische Infektionen beim Menschen.
Adenovirus: ovines und bovines Adenovirus unterschiedlicher Typen werden teilweise ohne
klinische Erscheinungen isoliert; teilweise werden Enteritis, Pneumonie, Hepatitis im
anglikanischen Raum beschrieben.
Herpesvirus: ovines Herpesvirus Typ 2 als möglicher Erreger des bösartigen Katarrhalfiebers des
Rindes verursacht keine klinischen Symptome; bovines Herpesvirus Typ 5 konnte experimentell
ZNS Symptome hervorrufen.
Mykoplasmen:
M. ovipneumoniae gilt als Erreger atypischer Pneumonien beim Schaf und als Wegbereiter für
Pasteurellosen und Parainfluenza 3-bedingten Erkrankungen des ovinen Atmungstraktes.
Infektionen mit M. ovipneumoniae zeigen im Allgemeinen geringe Mortalität, jedoch variable
Morbidität (bis zu 20%), welche durch stammspezifische Virulenzunterschiede, Wirtsabwehr und
Koinfektionen bedingt ist. Die Art M. ovipneumoniae ist durch eine außerordentliche
Stammheteroginität gekennzeichnet. Verschiedene Pathogenitätsmechanismen werden von diesem
Erreger genutzt, Krankheiten zu verursachen und das Wirtimmunsystem zu umgehen. Vor allem
die Kapselformation und die damit in Verbindung stehende Adhäsion an das Flimmerepithel sowie
die assozierte Phagozytosehemmung tragen wesentlich zur Pathogenese der M. ovipneumoniae-
Infektion bei. Die Übertragung des Erregers erfolgt über Tröpfcheninfektion, wobei Lämmer in
den ersten Lebenstagen besonders empfänglich sind. Durch den meist chronischen Verlauf sind
klinische Symptome erst in der 5. bis 10. Lebenswoche zu beobachten. Untersuchungen konnten
aufzeigen, dass vor allem Koinfektionen von M. ovipneumoniae mit Mannheimia haemolytica
atypische Pneumonien bei Lämmern im Alter bis zu 12 Monaten hervorrufen können. Die Rolle
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von M. ovipneumoniae als Pneumonie-Erreger per se konnte jedoch durch experimentelle
Infektionen bestätigt werden. Neben chronischen Verlaufsformen mit milden klinischen
Krankheitsbildern können bei Stresssituationen oder klimatischen Veränderungen auch akute
fibrinöse Pneumonien, Abzeßbildung und Pleuritis beobachtet werden.
M. arginini wird häufig von Lämmern mit Erkrankungen des Respirationstraktes isoliert. Obwohl
M. arginini als schwach pathogen gilt, wird dieser Mykoplasmenart eine Verstärkung
pathologischer Veränderungen zugeschrieben.
M. bovigenitalium ist eine beim Rind vorkommende Mykoplasmenart, die mit Genitalinfektionen
und Fruchtbarkeitsstörungen sowie Mastitiden in Verbindung gebracht wird. Jüngste genetische
Untersuchungen konnten aufzeigen, daß Mycoplasma ovine/caprine serogroup 11, welche
vorwiegend vom ovinen Genitaltrakt isoliert werden, der Mykoplasmenart M. bovigenitalium
zuzuordnen sind. Wie auch beim Rind, wird M. bovigenitalium mit Genitalinfektionen beim Schaf
assoziiert. Die Rolle des Erregers bei Erkrankungen des ovinen Atmungstraktes ist nicht geklärt.
Eine eindeutiger Zusammenhang der BALT-Hyperplasie mit dem Nachweis von Viren und
Mykoplasmen konnte in dieser Untersuchung nicht getroffen werden. Alle drei Parameter wurden
sowohl einzelnen als auch in Kombination festgestellt. Es stellt sich die Frage ob hier dem
Stallklima und anderen Stressoren mehr Bedeutung in der Krankheitsentstehung zukommt.
Conclusio:
Fleischuntersuchungsrelevante Veränderungen sind fibrinös/ fibrös-adhäsive Pleuritiden;
katarrhalisch-eitrige und abszedierende sowie fibrinöse Pneumonien, sklerotische oder carnifizierte
Areale; die Diagnose von leichten peribronchialen/perivasalen interstitielle Entzündungen
erscheint makroskopisch schwierig zu sein.
Das Ziel sollte daher sein, alle Ursachen für das Auftreten von eher akuten und subakuten
(katarrhalisch-eitrigen, fibrinösen) Pneumonien zu minimieren. Die Erreger von Pneumonien sind
z.T. Schleimhautbewohner, welche nur in Stresssituationen eine pathogene Wirkung entfalten.
Es ist daher empfehlenswert:
- Keine Streuer (chronisch kranke, schlecht wachsende Tiere) im Sammelstall behalten, zu denen
immer wieder neue Tiere hinzugestallt werden.
- Genaue Altersangaben der Tiere von den Landwirten einfordern –ältere Tiere, welche im
Gewicht hinter dem Durchschnitt zurückliegen sind verdächtig für einen chronischen
Krankheitsprozess.
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- Als Konsequenz daraus: „all in - all out“ Prinzip.
- Stressfaktoren minimieren: Art des Transportes; Sammeltransporte; Haltung/Stallklima im
Sammelstall optimieren.
Danksagung: Zum Abschluss möchten wir uns gerne bei den Labormitarbeitern der AGES,
Institut für Veterinärmedizinische Untersuchungen Graz unter Leitung von Dr. H. Laßnig und für
die Unterstützung der Fa. Bayer Austria GmbH: Dr. Holger Uhlig und Fa. Intervet GmbH
Austria: Dr. Mario Ogris bedanken.
