der kernkodierte Faktoren: zur Rolle der plastidären ... · (PTK) in der chloroplastidären Genexpression in A. thaliana Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften

Regulation der plastidären Genexpression

durch kernkodierte Faktoren:

Untersuchungen zur Rolle der plastidären Transkriptionskinase

(PTK) in der chloroplastidären Genexpression in A. thaliana

Dissertation

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Biologie und Biotechnologie

an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften

der Ruhr‐Universität Bochum

angefertigt

in der Arbeitsgruppe

Pflanzliche Zellphysiologie und Molekularbiologie

vorgelegt von

Hacer Türkeri

aus Niğde/Türkei

Bochum

Februar, 2010

Regulation der plastidären Genexpression

durch kernkodierte Faktoren:

Untersuchungen zur Rolle der plastidären Transkriptionskinase

(PTK) in der chloroplastidären Genexpression in A. thaliana

Dissertation

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Biologie und Biotechnologie

an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften

der Ruhr‐Universität Bochum

angefertigt

in der Arbeitsgruppe

Pflanzliche Zellphysiologie und Molekularbiologie

vorgelegt von

Hacer Türkeri

aus Niğde/Türkei

Bochum

Februar, 2010

Erstgutachter: Prof. Dr. Gerhard Link

Zweitgutachter: Prof. Dr. Franz Narberhaus

Tag der mündlichen Prüfung: 13.04.2010

Regulation of Plastid Gene Expression by

Nucleus‐encoded Factors:

Role of the Plastid Transcription Kinase (PTK) in the Control of

Chloroplast Gene Expression in Arabidopsis thaliana

Dissertation

To obtain the degree Doctor Rerum Naturalium (Dr. rer. nat.)

at the Faculty of Biology and Biotechnology, Ruhr‐University Bochum

International Graduate School Biosciences

Ruhr‐University Bochum

Laboratory of

Plant Cell Physiology and Molecular Biology

submitted by

Hacer Türkeri

from Niğde, Türkei

Bochum

Februar, 2010

accepted on the recommendation of

Prof. Dr. Gerhard Link, first supervisor

Prof. Dr. Franz Narberhaus, second supervisor

Canım anneme ve babama..

Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Gerhard Link für die Bereitstellung des

Arbeitsplatzes, die Überlassung dieses interessanten Forschungsthemas und die exzellente

fachliche Betreuung. Seine hilfreichen Anregungen und motivierenden Worte haben

maßgeblich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen.

Bei Herrn Prof. Dr. Franz Narberhaus bedanke ich mich für die freundliche Übernahme des

Zweitgutachtens.

Allen derzeitigen und ehemaligen Mitgliedern der Arbeitsgruppe „Pflanzliche Zellphysiologie

und Molekularbiologie“, Dr. Jennifer Schweer, Dipl. Biol. Andrea Kolpack, Dipl. Biol. Sylvia

Bock, Thomas Pieta, Brigitte Link und Dr. Heike Loschelder möchte ich ganz herzlich für die

nette Arbeitsatmosphäre und die schöne Zeit im und außerhalb des Labors danken.

Ein besonderer Dank geht an Frau Brigitte Link für ihre exzellente technische Unterstützung,

die zum Gelingen dieser Arbeit von großer Bedeutung war.

Frau Dr. Jennifer Schweer danke ich für ihre stetige Hilfsbereitschaft und die Zusammen‐

arbeit bei den Phosphorylierungsstudien.

Für das freundliche Korrekturlesen bedanke ich mich ganz herzlich bei Frau Dr. Meriyem

Aktas.

Bei Dipl. Biol. Jan Gleichenhagen möchte ich mich für die freundliche Hilfe bei den CD‐

Messungen bedanken.

Bedanken möchte ich mich auch bei all meinen Freunden dafür, dass sie immer für mich da

waren.

Ve son olarak canım aileme, hayatım boyunca sevgilerini ve desteklerini benden

esirgemedikleri için sonsuz teşekkürler ediyorum.

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

ABBILDUNGS‐ UND TABELLENVERZEICHNIS V

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS VII

GENBEZEICHNUNGEN XI

1 EINLEITUNG 1

1.1 EVOLUTION, ENTWICKLUNG UND FUNKTION DER CHLOROPLASTEN 1

1.2 ORGANISATION UND EXPRESSION DES PLASTIDENGENOMS 2

1.3 TRANSKRIPTION BEI PROKARYOTEN UND EUKARYOTEN 4

1.4 PLASTIDÄRE TRANSKRIPTION 5

1.4.1 PLASTIDÄRE PROMOTORELEMENTE 5

1.4.2 PLASTIDÄRE RNA‐POLYMERASEN 6

1.4.3 PLASTIDÄRE SIGMAFAKTOREN 10

1.4.4 DIE PLASTIDÄRE TRANSKRIPTIONSKINASE‐PTK 10

1.5 CK2‐PROTEINKINASE IN PFLANZEN 12

2 ZIELSETZUNG 16

3 MATERIAL UND METHODEN 18

3.1 MATERIAL 18

3.1.1 CHEMIKALIEN UND VERBRAUCHSMATERIALIEN 18

3.1.2 ENZYME UND KONJUGATE 21

3.1.3 PUFFER UND LÖSUNGEN 24

3.1.4 PFLANZENMATERIAL 25

3.1.5 BAKTERIENSTÄMME 24

3.1.6 PLASMIDE UND KLONE 25

Inhaltsverzeichnis

II

3.1.7 NÄHRMEDIEN 28

3.1.8 OLIGONUKLEOTIDE 28

3.1.9 INTERNETADRESSEN 29

3.1.10 COMPUTERGESTÜTZTE BILDBEARBEITUNG 29

3.2 METHODEN 30

3.2.1 DNA‐ISOLIERUNG 33

3.2.1.1 ISOLIERUNG GEMOMISCHER DNA 30

3.2.1.2 ISOLIERUNG VON PLASMID‐DNA 30

3.2.2 RNA‐ISOLIERUNG 30

3.2.3 MARKIERUNG VON NUKLEINSÄUREN 30

3.2.3.1 MARKIERUNG DER 5´‐ENDE VON DNA‐FRAGMENTEN 30

3.2.3.2 DIG‐MARKIERUNG VON RNA DURCH IN VITRO‐TRANSKRIPTION 31

3.2.4 KAPILLAR‐TRANSFER VON RNA (NORTHERN‐BLOT) 31

3.2.5 RNA/RNA‐HYBRIDISIERUNG 31

3.2.6 AMPLIFIZIERUNG VON NUKLEINSÄUREN 31

3.2.6.1 POLYMERASE‐KETTENREAKTION (PCR) 31

3.2.6.2 REVERSE‐TRANSKRIPTION‐PCR (RT‐PCR) 32

3.2.7 ELUTION VON DNA‐FRAGMENTEN 32

3.2.8 IN VITRO‐MUTAGENESE 32

3.2.9 DNA‐SEQUENZIERUNG 32

3.2.10 FLORAL DIP 32

3.2.11 ANZUCHT UND SELEKTION VON PFLANZEN 33

3.2.12 EXPRESSION REKOMBINANTER PROTEINE 33

3.2.12.1 BAKTERIELLE ÜBEREXPRESSION MIT HILFE DES PQE‐SYSTEMS 33

3.2.12.2 BAKTERIELLE ÜBEREXPRESSION MIT HILFE DES PMAL‐SYSTEMS 34

3.2.13 REINIGUNG REKOMBINANTER PROTEINE 33

3.2.13.1 ISOLIERUNG UND RENATURIERUNG VON PROTEINEN AUS INCLUSION BODIES 34

Inhaltsverzeichnis

III

3.2.13.2 REINIGUNG NATIVER PROTEINE 34

3.2.14 BIS‐TRIS‐POLYACRYLAMID‐GELELEKTROPHORESE (BIS‐TRIS‐PAGE) 35

3.2.15 NATIVE‐PAGE 35

3.2.16 ELEKTROPHORETISCHER TRANSFER VON PROTEINEN AUF NITROCELLULOSE‐MEMBRANEN

(WESTERNBLOT) UND IMMUNODETEKTION 35

3.2.17 FÄRBUNG VON PROTEINEN 36

3.2.18 ZIRKULAR‐DICHROISMUS‐SPEKTROSKOPIE 36

3.2.19 GELBINDUNGSTEST (EMSA) 36

3.2.20 RADIOAKTIVER KINASETEST 37

4 ERGEBNISSE 38

4.1 KLONIERUNG DER CDNA FÜR DIE CHLOROPLASTIDÄRE CK2 AUS ARABIDOPSIS

THALIANA (ATCK2) 38

4.2 VERGLEICHENDE SEQUENZANALYSE DER CPCK2 AUS VERSCHIEDENEN PFLANZEN 39

4.3 BAKTERIELLE ÜBEREXPRESSION UND AUFREINIGUNG DER CPCK2‐PROTEINE 42

4.4 VERGLEICHENDE FUNKTIONSANALYSE DER CPCK2 AUS SENF UND ARABIDOPSIS 43

4.5 ÜBEREXPRESSION UND AUFREINIGUNG VON SIGMAFAKTOREN ZUR IN VITRO

PHOSPHORYLIERUNG DURCH CPCK2 44

4.6 IN VITRO PHOSPHORYLIERUNG DER REKOMBINANTEN SIGMAFAKTOREN DURCH CPCK2 46

4.7 FUNKTIONELLE KONSEQUENZEN DER SIGMAFAKTOR‐PHOSPHORYLIERUNG 48

4.8 REDOXREGULATION DER AKTIVITÄT VON CPCK2 AUS ARABIDOPSIS IN VITRO 51

4.9 ZIRKULAR‐DICHROISMUS‐SPEKTROSKOPIE 55

4.10 IN VIVO FUNKTIONSANALYSE DER CPCK2 AUS ARABIDOPSIS THALIANA 56

4.10.1 MOLEKULARE CHARAKTERISIERUNG DER T‐DNA‐INSERTIONSMUTANTE VON CPCK2 56

4.10.2 PHÄNOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG DER CPCK2 KONOCKOUT‐MUTANTE 58

4.11 ANALYSE DER TRANSKRIPTAKKUMULATION PLASTIDÄRER GENE IN DER CPCK2‐MUTANTE 61

4.12 IN VIVO ANALYSEN ZUR REDOXREGULATION DER CPCK2‐AKTIVITÄT 62

Inhaltsverzeichnis

IV

5 DISKUSSION 65

5.1 REKOMBINANTE CPCK2 (PTK) AUS ARABIDOPSIS THALIANA 65

5.2 AUTOPHOSPHORYLIERUNG DER ATCK2 67

5.3 EINFLUSS DER PHOSPHORYLIERUNG DURCH CPCK2 AUF DIE SIGMAFAKTOR‐AKTIVITÄT 69

5.4 IN VITRO ANALYSE ZUR REDOXREGULATION DER ATCK2‐AKTIVITÄT 71

5.5 IN VIVO FUNKTIONSANALYSE DER CPCK2 AUS ARABIDOPSIS THALIANA 74

5.6 IN VIVO ANALYSEN ZUR REDOXREGULATION DER CPCK2‐AKTIVITÄT 76

6 ZUSAMMENFASSUNG 78

7 SUMMARY 81

8 LITERATUR 84

WISSENSCHAFTLICHE PRÄSENTATIONEN 104

LEBENSLAUF 107

ERKLÄRUNG 108

Abbildungs‐ und Tabellenverzeichnis

V


Abb. 1.4.2 Plastidäre RNA‐Polymerasen und Promotorelemente

Abb. 1.5.1 Schematische Darstellung von CK2α

Abb. 1.5.2 Pflanzliche Substrate und Substratklassen der CK2

Abb. 1.5.3 Lokalisation der CK2‐Untereinheiten auf den Chromosomen von Arabidopsis

Abb. 4.1 Nukleotidsequenz (5´ 3´) der cDNA (TAIR‐Datenbank) und abgeleitete Aminosäuresequenz der ATCK2 (At2g23070)

Abb. 4.2 Multipler Vergleich der cpCK2‐Sequenzen aus verschiedenen Pflanzen

Abb. 4.3 Rekombinante cpCK2 (ohne TP) aus Arabidopsis

Abb. 4.4 Nachweis der Kinase‐Aktivität von ATCK2 im Vergleich zu SACK2

Abb. 4.5.1 Verwendete rekombinante Sigmafaktoren

Abb. 4.5.2 Expression und Reinigung rekombinanter Sigmafaktoren

Abb. 4.6 In vitro Phosphorylierung der rekombinanten Sigmafaktoren durch SACK2 und ATCK2

Abb. 4.7 EMSA‐Experimente mit rekombinanten Sigmafaktoren 1 und 6 aus Arabidopsis

Abb. 4.8.1 Schematische Darstellung des rekombinanten cpCK2‐Proteins aus Arabidopsis

Abb. 4.8.2 Aktivitätstest der Cystein‐Mutanten von ATCK2

Abb. 4.8.3 Einfluss von Redox‐Reagenzien auf die Aktivität von ATCK2 und ihrer Cystein‐Mutanten

Abb. 4.8.4 Analyse der Dimerisierung von ATCK2

Abb. 4.9 CD‐Spektren der rekombinanten ATCK2 und ihrer Cystein‐Mutanten

Abb. 4.10.1 Charakterisierung der T‐DNA‐Insertionsmutante für cpck2 aus Arabidopsis

Abb. 4.10.2.1 Phänotypen der Wildtyp‐ und knockout‐Pflanzen


VI

Abb. 4.10.2.2 Phänotyp der komplementierten Pflanzen

Abb. 4.10.2.3 Phänotypen der Pflanzen unter Langtagbedingungen

Abb. 4.11 Northern‐Blot‐Analysen der cpck2‐knockout‐Linie im Vergleich zu Wildtyp (Col‐0)‐ und komplementierten Pflanzen (P35S:cpCK2)

Abb.4.12.1 Phänotypen der cpCK2 Cystein‐Mutantenlinien

Abb.4.12.2 Northern‐Blot‐Analyse der cpCK2 Cystein‐Mutantenlinien

Abb. 5.1 Aminosäurensequenz‐Vergleich von ATCK2 und SACK2 ohne ihre Transitpeptide

Abb. 5.4 Strukturmodell plastidärer ATCK2

Tabelle 3.1.4 Zusammenfassung der in dieser Arbeit verwendeten/hergestellten Pflanzenlinien

Tabelle 3.1.6 In dieser Arbeit verwendete/erstellte Plasmide und Klone

Tabelle 3.1.8 Liste der verwendeten Oligonukleotide (bezogen von der Firma MWG‐Biotech)

Abkürzungsverzeichnis

VII


A Adenin

Abb. Abbildung

amp Ampicillin

AS Aminosäure

A. thaliana Arabidopsis thaliana

ATCK2 chloroplastidäre CK2α aus Arabidopsis

ATP Adenosintriphosphat

ATSIG Sigmafaktor aus Arabidopsis thaliana

bp Basenpaare

bzw. beziehungsweise

C Cytosin

C1 ATCK2 Cystein‐Mutante (1. Cystein gegen Serin ausgetauscht)




C2/3 ATCK2 Cystein‐Mutante (2. und 3. Cystein gleichzeitig gegen Serin

ausgetauscht)


ausgetauscht)


ausgetauscht)

cAMP cyklisches Adenosinmonophosphat

CD circular dichroism


VIII

cDNA copy DNA

CK2 Casein Kinase 2

CK2α Casein Kinase 2 alpha‐Untereinheit

CK2β Casein Kinase 2 beta‐Untereinheit

cpCK2α chloroplastidäre Casein Kinase 2 alpha

C‐terminal carboxyterminal

Cys Cystein

Da Dalton

d. h. das heißt

∆cpck2 cpck2α knockout‐Mutante

DNA Desoxyribonukleinsäure

DNase Desoxyribonuklease

dNTP Desoxynukleosidtriphosphat (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiaminotetraessigsäure

G Guanin

GTP Guanosintriphosphat

h Stunde

kan Kanamycin

kb Kilobasenpaare

kDa Kilodalton

M Molar

min Minute


IX

mRNA Boten (messenger)‐RNA

NADH NADH‐Dehydrogenase

nt Nukleotide

N‐terminal aminoterminal

NTP Nukleosidtriphosphat (ATP, CTP, GTP, UTP)

p.a. pro analysi

PCR Polymerase‐Kettenreaktion (polymerase chain reaction)

PEP plastidenkodierte RNA‐Polymerase (plastid‐encoded RNA Polymerase)

PTK plastidäre Transkriptionskinase

RNA Ribonukleinsäure

RNase Ribonuklease

rRNA ribosomale RNA

s. siehe

SACK2 chloroplastidäre CK2α aus Sinapis alba (Senf)

SASIG Sigmafaktor aus Sinapis alba

SIG Sigmafaktor

SLF Sigma‐ähnlicher‐Faktor (sigma like factor)

Sulf Sulfadiazin

T Thymin

TAC Membran‐gebundener PEP‐Polymerase Komplex (transcriptionally

active chromosome)

TP plastidäres Transitpeptid

tRNA Transfer‐RNA

WT Wildtyp


X

w/v Gewicht/Volumen

z. B. zum Beispiel

Genbezeichnungen

XI

Genbezeichnungen

actin2 Gen für das Protein Aktin2

Atcpck2α Gen für die chloroplasten‐lokalisierte CK2α‐Untereinheit aus Arabidopsis

thaliana

atpB Gen für die β‐Untereinheit der ATP‐Synthase

psaA Gen für die Untereinheit A des Photosystems I

psbA Gen für das D1‐Protein des Photosystems II

rpoA Gen für die α‐ Untereinheit der PEP

rpoB Gen für die β‐Untereinheit der PEP

rpoC1 Gen für die β´‐Untereinheit der PEP

rpoC2 Gen für die β´´‐Untereinheit der PEP

rpoT1 Gen für die mitochondrial‐lokalisierte NEP

rpoT2 Gen für die plastiden‐lokalisierte NEP

rpoT3 Gen für die NEP, die in Plastiden und Mitochondrien lokalisiert ist

trnK Gen für die tRNA für die Aminosäure Lysin

Einleitung

1

1 Einleitung

1.1 Evolution, Entwicklung und Funktion der Plastiden

Plastiden sind die charakteristischen Organellen pflanzlicher Zellen. Sie besitzen eine

doppelte Hüllmembran und ihre eigene DNA mit Proteinbiosyntheseapparat. Die

evolutionäre Herkunft der Plastiden lässt sich mit der Endosymbiontentheorie erklären.

Demnach stammen Plastiden wie auch Mitochondrien aus freilebenden Prokaryoten ab, die

durch Phagozytose in eine Ureukaryote aufgenommen wurden (Schimper, 1883;

Mereschkowsky, 1905; Gray, 1989). Durch die Aufnahme eines photoautotrophen

Cyanobakteriums in eine eukaryotische Urzelle entstand der Vorläufer heutiger

Pflanzenzellen (McFadden, 1999 und 2001). Im Laufe der Evolution ging ein Teil der Gene

des Endosymbionten verloren und ein Teil wurde in den Zellkern transferiert (Martin und

Herrmann, 1998; Martin et al., 2002). Aus diesem Grund sind die Plastiden trotz Besitz des

eigenen Genexpressionssystems genetisch semiautonom. Viele ihrer Proteine sind im

Zellkern kodiert und werden nach der Synthese im Cytoplasma durch eine spezielle

Importmaschinerie in der Chloroplastenhülle in das Organell importiert (Herrmann et al.,

1992; Heins et al., 1998; Soll, 2002; Schünemann, 2004). Die Vorläufer kernkodierter

plastidärer Proteine enthalten spezifische Signal‐Sequenzen in ihrem N‐terminalen Bereich,

die als Transitpeptid bezeichnet werden und über den Import ins Stroma oder noch weiter

ins Innere des Chloroplasten entscheiden (Soll und Tien, 1998).

Es gibt verschiedene Typen der Plastiden und abhängig von ihrem Entwicklungs‐ und

Funktionszustand besitzt eine pflanzliche Zelle jeweils nur einen Plastidentyp. Sie

differenzieren sich aus einem Plastiden‐Vorläufer, den so genannten Proplastiden, zu

gewebespezifischen Plastidenarten und erfüllen wichtige Funktionen. Beispiele hierfür sind

in Speichergeweben Amyloplasten, Proteinoplasten und Elaioplasten (allgemein

Leukoplasten), die zur Speicherung von Stärke, Proteinen und Fetten dienen. Chromoplasten

akkumulieren Carotinoide in Früchten und Blütenblättern und geben diesen ihre spezielle

Farbe. In den Zellen der grünen Gewebe befinden sich die bekanntesten und wichtigsten

Einleitung

2

Vertreter der Plastiden, die Chloroplasten. Sie sind die Orte der Photosynthese, in denen

energiereiche organische Substanzen aus Kohlendioxid und Wasser unter Verwendung von

Lichtenergie synthetisiert werden.

Abhängig von der Lichteinwirkung sowie entwicklungsbedingten Veränderungen können

Plastiden zum Teil ineinander umgewandelt werden. So können sich in Speichergeweben aus

farblosen Leukoplasten durch Lichteinwirkung Chloroplasten entwickeln. Weiterhin

entstehen z. B. während der Seneszenz aus Chloroplasten im Blattgewebe die

Chromoplasten oder Gerontoplasten.

1.2 Organisation und Expression des Plastidengenoms

Das genetische Material der Plastiden, das Plastom, ist je nach Art 120 bis 160 kb groß

(Palmer, 1985 und 1991; Whitfeld und Bottomley, 1993) und kodiert durchschnittlich ca. 130

Gene, davon kodieren etwa 100 für Proteine und der Rest setzt sich aus rRNA‐ und tRNA‐

Genen zusammen. Daneben existieren offene Leserahmen (ORFs: open reading frames), die

möglicherweise für bisher unbekannte Genprodukte kodieren (Sugiura, 1992 und 1995). Die

Kopienzahl der Plastiden‐DNA beträgt – abhängig von Entwicklungsstadium und Pflanzenart–

zwischen 10 und 300 pro Organell (Bendich, 1987; Sugiura, 1992).

Die Zustandsform des Plastoms wurde bisher immer als zirkulär beschrieben (Herrmann et

al., 1975; Bendich, 1987). Die Untersuchungen an Mais (Zea mays) haben jedoch gezeigt,

dass die plastidäre DNA auch in linearer und verzweigter Form vorliegen kann (Bendich,

2004; Oldenburg und Bendich, 2004). Das Plastiden‐Genom wird durch zwei gegenläufige

Sequenzwiederholungen (inverted repeats) in eine kleine (SSC, small single copy) und eine

große (LSC, large single copy) Einzelkopienregion aufgeteilt. Die Anordnung der Gene auf

dem Plastom ist zwar relativ konserviert, jedoch zeigen einige höhere Pflanzen, wie

Leguminosen und Koniferen, Ausnahmen von dieser Anordnung (zur Übersicht siehe: Link,

1996; Stern et al., 1997).

Der Anteil der plastomkodierten Proteine beträgt ca. 5% der Gesamtproteine, die in

Plastiden lokalisiert sind (Martin et al., 2002). Dazu gehören hauptsächlich Bestandteile des

Einleitung

3

Photosyntheseapparates sowie Komponenten der Transkriptions‐ und Translations‐

maschinerie (ribosomale Proteine, Untereinheiten der RNA‐Polymerase) sowie

Komponenten des NADH‐Dehydrogenase‐Komplexes. Wie bereits erwähnt, wird der

überwiegende Anteil der plastidären Proteine (etwa 95 %) vom Zellkern kodiert (Palmer,

1991; Sugiura, 1992; Tzudzuki et al., 1994).

Ein Großteil der plastidären Gene liegt, wie bei Prokaryoten, in polycistronischen

Transkriptionseinheiten vor (Sugita und Sugiura, 1996). Im Gegensatz zu Prokaryoten

besitzen sie jedoch nicht‐kodierende Bereiche, die so genannten Introns (Lambowitz et al.,

1999; Toro, 2003). Diese werden nach der RNA‐Synthese durch Spleißen herausgeschnitten

und die kodierenden Abschnitte, Exons, werden zusammengefügt (Goldschmidt‐Clermont et

al., 1990 und 1991).

Die Expression des Plastidengenoms wird abhängig von Umweltbedingungen und

Entwicklungszustand der Plastiden auf unterschiedlichen Ebenen reguliert; der trans‐

kriptionellen, der posttranskriptionellen und der translationellen (Krupinska, 1992; Krupinska

und Falk, 1994; Mayfield et al., 1995).

Die plastidären Gene besitzen unterschiedliche Promotorelemente, die sich in ihrer Stärke

und in der Art der RNA‐Polymerase, von der sie erkannt werden, unterscheiden (s. 1.4.1).

Diese Besonderheiten stellen wichtige Kontrollpunkte auf der transkriptionellen Ebene dar.

Außerdem können die Kopienzahl der Gene, die Topologie der Plastiden‐DNA und DNA‐

Methylierung die Bindungsaktivität der RNA‐Polymerasen an den Promotor beeinflussen und

somit die Transkription regulieren (Bendich, 1987; Stirdivant et al., 1985; Kobayashi et al.,

1990; Rapp und Mullet 1991). Es stellte sich heraus, dass es offenbar ganz überwiegend

kernkodierte Faktoren sind, die die Genexpression in Plastiden regulieren (Für weitere

Details zur Plastidentranskription, vgl. 1.3 bis 1.5)

Die RNA‐Stabilität (Rott et al., 1998; Schuster und Gruissem, 1991), Prozessierung von

polycistronischen Plastiden‐Transkripten (Westhoff und Herrmann, 1988), mRNA‐Edierung

(Bock et al., 1996; Kudla et al., 1992; Maier et al., 1996) und das Spleißen von Transkripten

(Barkan, 1989) stellen die wichtigsten posttranskriptionellen Regulationsmechanismen auf

Einleitung

4

RNA‐Ebene dar. Die Bildung einer „Stem/Loop“‐Struktur in der untranslatierten Region am

3´‐Ende der mRNA (3'UTR) spielt eine Rolle für die Stabilität der mRNA. Die 3´‐ und 5´‐UTR

Bereiche enthalten Erkennungssequenzen, sowohl für Endonukleasen als auch für die

kernkodierten RNA‐Bindeproteine, die dem Schutz der mRNA vor dem Abbau durch

Endonukleasen dienen (Klaff und Gruissem, 1991; Baginsky et al., 2007).

Auch für die Regulation auf der translationellen Ebene sind kernkodierte Faktoren von

großer Bedeutung (Danon, 1997). Die Initiation der plastidären Translation erfolgt auf zwei

verschiedenen Wegen: Zum einen durch Bindung der Ribosomen an die so genannte Shine

Dalgarno‐Sequenz, die innerhalb der ersten 20 Nukleotide vor dem Translationsstart

vorliegt. Jedoch besitzen nur ca. 40% der Plastidengene dieses für Prokaryoten typische

Sequenzelement (Sugiura et al., 1998). Zum anderen kann die Initiation durch Bindung an

weitere cis‐Elemente, die innerhalb der 5´‐UTR der Transkripte lokalisiert sind, erfolgen

(Danon, 1997; Choquet und Wollman, 2002). Einige kernkodierte RNA‐Bindeproteine binden

spezifisch an 5'‐UTR Sequenzen wie die des psbA‐Genes in Spinat (Alexander et al., 1998;

Baginsky und Link, 2005). Die Bindung zumindest einiger dieser Proteine wird durch ihren

Phosphorylierungsgrad reguliert (Danon und Mayfield, 1994). In Chlamydomonas reinhardtii

wurde ein psbA‐spezifischer Translationsfaktor, RB47, identifiziert, der die Translation des

Gens in Abhängigkeit vom plastidären Redoxzustand sowie von der Lichtqualität und ‐

quantität reguliert (Yohn et al., 1998b; Yohn et al., 1998a).

1.3 Transkription bei Prokaryoten und Eukaryoten

In Prokaryoten wird die Synthese aller RNA‐Spezies (mRNA, tRNA und rRNA) von einer

einzigen DNA‐abhängigen RNA‐Polymerase katalysiert, die aus mehreren Untereinheiten

besteht. Das RNA‐Polymerase Holoenzym aus E. coli ist ein 480 kDa großer Proteinkomplex

und setzt sich aus einem core‐Enzym (α2ββ´) und Sigmafaktor (σ) zusammen. Der Sigma‐

faktor sorgt für die hohe Affinität zu den Promotoren, den DNA‐Sequenzen vor der

Initiationsstelle von Transkriptionseinheiten, und ist entscheidend für die Transkriptions‐

initiation. Nach der Initiation dissoziiert der σ‐Faktor aus dem core‐Enzym und so beginnt die

Elongation der RNA‐Synthese.

Einleitung

5

Bakterielle Promotorregionen enthalten zwei konservierte Sequenzen (consensus sequence),

die aus 6 Nukleotiden bestehen; die – 10‐Region (TATAAT) und die – 35‐Region (TTGACA),

die 10 bzw. 35 bp stromaufwärts des Transkriptionsstartpunktes liegen (Pribnow, 1975a;

1975b; Schaller et al., 1975).

Weitere Arten von DNA‐abhängigen RNA‐Polymerasen kennt man aus Phagen. Dazu gehören

die T3‐, T7‐ und SP6‐Polymerasen. Diese Enzyme sind in den bakteriellen Wirten der Phagen

aktiv und bestehen aus einer einzigen Untereinheit. Sie erkennen spezifische Promotor‐

sequenzen und benötigen keinen Sigmafaktor (Allison et al., 1996; Kapoor et al., 1997).

In Eukaryoten erfolgt die Transkription von Kerngenen durch drei verschiedene RNA‐

Polymerasen. Die RNA‐Polymerase I und III übernehmen die Synthese von rRNA und tRNA.

Für die Transkription von proteinkodierenden Genen, also die Synthese von mRNA‐

Vorläufer, ist die RNA‐Polymerase II zuständig. Dieses Enzym ist ebenfalls für die Expression

kernkodierter Proteine verantwortlich, die in Plastiden bzw. in Mitochondrien lokalisiert

sind.

Die Promotoren der RNA‐Polymerase II weisen ein konserviertes Sequenzelement auf.

Dieses als TATA‐Box bezeichnete Element liegt bei ca. 30 bp stromaufwärts vom

Transkriptionsstart und dient der Promotorerkennung. Neben der TATA‐Box besitzen die

eukaryotischen Promotoren eine große Zahl von cis‐regulatorischen Sequenzelementen, die

entweder positiv (enhancer) oder negativ (silencer) wirken können (zur Übersicht siehe:

Roeder, 1996). Eine spezifische Transkriptionsinitiation und anschließende RNA‐Synthese

können nur durch die Bindung von speziellen Transkriptionsfaktoren an diesen Elementen

und RNA‐Polymerase II erfolgen.

1.4 Plastidäre Transkription

1.4.1 Plastidäre Promotorelemente

Als Konsequenz ihrer evolutionären Herkunft weisen viele plastidäre Promotoren

Ähnlichkeiten zu den prokaryotischen Promotorelementen aus (zur Übersicht siehe: Link,

1994). Diese „typisch“ bakteriellen Sequenzelemente (– 35‐ und – 10‐Region) im Plastom

Einleitung

6

werden als consensus type‐Promotor bezeichnet und von einer bakterien‐ähnlichen RNA‐

Polymerase erkannt (zur Übersicht siehe: Hess und Börner, 1999). Es existieren jedoch

plastidäre Gene, deren Promotorbereiche von diesem Konsensus‐Typ abweichen.

Beispielsweise konnte im 5´‐Bereich des rps16‐Gens aus Senf und des rpl32‐Gens aus Tabak

keine konservierte – 35‐Region identifiziert werden (Neuhaus et al., 1989; Vera et al., 1996).

Dem atpB‐Gen aus Spinat dagegen fehlt eine typische – 10‐Region (Gruissem und Zurawski,

1985). Zusätzlich zu den –10‐ und –35‐Elementen konnten in einigen plastidären Promotoren

eukaryotische cis‐Elemente gefunden werden. Die Promotorbereiche der Gene psbA und

rps16 aus Senf weisen Sequenzregionen auf, die der eukaryotischen TATA‐Box ähnlich sind

(Link und Langridge, 1984; Neuhaus et al., 1989) und zur spezifischen Promotorerkennung

benötigt werden (Eisermann et al., 1990). Neben den Prokaryoten‐ähnlichen consensus type‐

Promotoren existiert eine weitere Gruppe von Promotoren im Plastom, die in drei Klassen,

Typ Ia, Typ Ib und Typ II, unterteilt wird (Kapoor et al., 1997; Kapoor und Suguira, 1999; Liere

et al., 2004). Diese werden bevorzugt von einer Polymerase erkannt, die keine Ähnlichkeit

zum bakteriellen Enzym zeigt (zur Übersicht siehe Hess und Börner, 1999). Es wurden weiter

plastidäre Promotoren identifiziert, die von beiden Polymerasen genutzt werden können, da

sie die Promotormotive beider RNA‐Polymerasen besitzen. Zu diesen Genen zählen bspw.

das rps16‐Gen und das ycf3‐psaAB‐Cluster (Summer et al., 2000).

1.4.2 Plastidäre RNA‐Polymerasen

Wie bereits oben angedeutet, wird die plastidäre Transkription von mindestens zwei

unterschiedlichen RNA‐Polymerasen katalysiert; von einem Plastom‐kodierten Enzym, PEP

(plastid encoded polymerase), und einer kernkodierten Polymerase, NEP (nuclear encoded

polymerase). Strukturell stellt NEP ein T3‐/T7‐Phagen‐ähnliches Enzym mit einer einzigen

katalytischen Untereinheit dar, während PEP ein Enzym aus mehreren Untereinheiten,

ähnlich den bakteriellen Polymerasen ist (Abb. 1.4.2). Die PEP katalysiert die Transkription

der Gene für Komponenten des Photosyntheseapparates. Die „Haushaltsgene“ werden

dagegen von beiden RNA‐Polymerasen transkribiert (zur Übersicht siehe: Maliga, 1998; Hess

und Börner, 1999). Für die Synthese der rpo‐Gene (rpoA, rpoB, rpoC1 und rpoC2), die für

Untereinheiten der PEP kodieren, ist die NEP zuständig. Das bedeutet, PEP entsteht zeitlich

Einleitung

7

nach der NEP und ist später das dominierende Enzym in Chloroplasten (Serino und Maliga,

1998; Liere und Maliga, 1999; Hess und Börner, 1999). Es konnte gezeigt werden, dass in

Proplastiden hauptsächlich die NEP katalytisch aktiv ist, dagegen weist in Plastiden die PEP

eine höhere Aktivität auf (Emanuel et al., 2004 und 2006).

Die Existenz einer NEP wurde erstmals durch die Untersuchungen an einer parasitisch

lebenden Pflanze, Epifagus virginiana, nachgewiesen (dePamphilis und Palmer, 1990;

Morden et al., 1991; Wolfe et al., 1992; Krause et al., 2003). Obwohl dem Plastom dieser

Pflanze das komplette rpoBC‐Operon fehlt, konnten plastidäre Transkripte nachgewiesen

werden. Untersuchungen an Mutanten, bei denen verschiedene rpo‐Gene deletiert waren,

deuteten ebenfalls auf die Existenz einer weiteren RNA‐Polymerase, die möglicherweise vom

Kerngenom kodiert wird (Allison et al., 1996; Hajdukiewicz et al., 1997; Serino und Maliga,

1998; De Santis‐Maclossek et al., 1999; Krause et al., 2000).

Diese kernkodierte Polymerase konnte erstmals aus Spinatchloroplasten isoliert werden

(Lerbs‐Mache, 1993). Es handelte sich dabei um ein 110 kDa großes monomeres Polypeptid,

welches die Eigenschaften einer mitochondrialen RNA‐Polymerase aufwies. Diese wiederum

ist ebenfalls eine kernkodierte, aus einer einzigen Untereinheit bestehende RNA‐

Polymerase, die Homologie zu den RNA‐Polymerasen aus T3‐ und T7‐Bakteriophagen besitzt

(Schinkel und Tabak, 1989). Durch die Isolierung einer entsprechenden cDNA aus Arabidopsis

thaliana wurde die Annahme bestätigt, dass in Plastiden eine kernkodierte phagenähnliche

RNA‐Polymerase existiert. Für das abgeleitete, 113 kDa große Protein (RpoT3) konnte der

Import in Chloroplasten nachgewiesen werden (Hedtke et al., 1999). Eine cDNA für eine

plastiden‐lokaliesierte, T7‐ähnliche RNA‐Polymerase konnte auch aus Mais isoliert werden

(Chang et al., 1999). In A. thaliana wurde noch ein weiteres Gen (rpoT2) für eine

phagenähnliche RNA‐Polymerase gefunden, deren Transitpeptid den Import sowohl in

Chloroplasten als auch in Mitochondrien ermöglicht (Hedtke et al., 2000). Aus Nicotiana

tabacum wurden insgesamt sechs rpoT‐Gene identifiziert, deren Genprodukte in den

Mitochondrien bzw. Plastiden oder in beiden Organellen lokalisiert sind (Hedtke et al.,

2002).

Einleitung

8

NEP‐Promotoren vom Typ Ia sind vollständig definiert durch eine YRTA‐Box (hierbei Y = C

oder T, R = A oder G). Solche vom Typ Ib enthalten als zusätzliches cis‐Element die sog. GAA‐

Box, die weiter stromaufwärts des Transkriptionsstartpunktes liegt. Es gibt auch NEP‐

Promotoren, die keines dieser Elemente aufweisen und als nonconsensus beschrieben

werden (Typ II) (Kapoor et al., 1997; Sriraman et al., 1998) (s. Abb. 1.4.2 B).

Die plastiden‐kodierte RNA‐Polymerase, PEP, wurde viel früher als die NEP beschrieben und

charakterisiert. Aus Plastiden wurden durch unterschiedliche Reinigungsmethoden RNA‐

Polymerase‐Aktivitäten isoliert. Als erstes wurde ein hochmolekularer Protein‐DNA‐

Komplex, welcher die endogene DNA transkribieren kann, identifiziert. Dieser

membrangebundene Komplex wurde als TAC (transcriptionally active chromosome)

bezeichnet (Hallick et al., 1976; Briat et al., 1979; Reiss und Link, 1985; Bülow et al., 1987).

Weiterhin wurde eine „lösliche“ nicht an DNA gebundene RNA‐Polymerase isoliert, die in der

Lage ist, in vitro exogen zugegebene DNA zu transkribieren (zur Übersicht siehe: Igloi und

Kössel, 1992). Aus Senf‐Plastiden konnten sogar zwei verschiedene lösliche RNA‐Polymerase‐

Aktivitäten identifiziert werden (Pfannschmidt und Link, 1994 und 1997). Diese wurden als

Form A (PEP‐A) und Form B (PEP‐B) bezeichnet. Die beiden Formen unterscheiden sich

sowohl strukturell als auch funktionell voneinander. PEP‐A ist ein etwa 750 kDa großer

Proteinkomplex, der sich aus 13‐15 Untereinheiten zusammensetzt. PEP‐B ist dagegen ein

etwa 420 kDa großer Proteinkomplex und besteht aus fünf Untereinheiten. Während die

Aktivität von PEP‐A gegenüber Rifampicin, einem Hemmstoff prokaryotischer RNA‐

Polymerasen, resistent ist, lässt sich die PEP‐B‐Aktivität durch Rifampicin inhibieren. PEP‐B

überwiegt in Etioplasten, PEP‐A hingegen in Chloroplasten. Es konnte in vitro gezeigt

werden, dass die Form A durch Phosphorylierung teilweise in Form B umgewandelt werden

kann (Pfannschmidt et al., 2000). Im Folgenden wird die –mengenmäßig dominierende‐ PEP‐

A Form vereinfachend als PEP bezeichnet.

PEP ist ein multimerer Komplex mit den core‐Untereinheiten α2ββ´β´´. Ähnlich wie die

bakterielle RNA‐Polymerase, benötigt sie für eine spezifische Transkriptionsinitiation

Sigmafaktoren. Darüber hinaus enthält der PEP‐Komplex weitere kernkodierte

Komponenten mit regulatorischer Funktion, u. a. eine Ser‐/Thr‐Kinase, die als PTK (plastid

Einleitung

9

transcription kinase) bezeichnet wird (Baginsky et al., 1997) (Abb. 1.4.2 A). Um

Missverständnisse beim Leser zu vermeiden, sei hier darauf hingewiesen, dass die

„PEP/NEP“‐Nomenklatur (Maliga, 1998) sich auf das katalytische Grundgerüst (core) bezieht.

Regulatorische Komponenten waren zu diesem Zeitpunkt noch nicht hinsichtlich ihres

Codierungs‐ und Syntheseortes analysiert.

Abb. 1.4.2: Plastidäre RNA‐Polymerasen und Promotorelemente. (A) „Plastom‐kodierte“ RNA‐Polymerase, PEP, mit ihrem consensus type‐Promotor. PEP ist als multimerer Protein‐Komplex mit plastom‐kodierten Untereinheiten (grün) und kernkodierten Komponenten (rot) wie Sigmafaktor (σ) und plastidäre Transkriptions‐kinase (PTK) dargestellt. Die grau gezeichneten Komponenten stellen weitere kernkodierte Faktoren mit überwiegend noch unbekannten Funktionen dar, die mit der PEP assoziiert vorliegen und die Komplexität des PEP‐Enzyms unterstreichen. (B) Kern‐kodierte RNA‐Polymerase, NEP und ihre Promotoren. Nähere Erläuterungen finden sich im Text. Die Darstellungen sind nicht maßstabgetreu.

Einleitung

10

1.4.3 Plastidäre Sigmafaktoren

Erste Hinweise auf die Existenz „Sigma‐ähnlicher“ Faktor(en) in Plastiden lieferten bereits

Arbeiten von Surzycki und Schellenbarger (1976) an Chlamydomonas. Spätere Arbeiten

ergaben einen biochemisch gereinigten Transkriptionsfaktor (S‐Faktor), der sich jedoch nicht

als Sigma‐Faktor erwies (Jolly und Bogorad, 1980). Erst Untersuchungen an hochgereinigten

plastidären RNA‐Polymerase‐Präparationen mit Antikörpern gegen die Hauptsigmafaktoren

aus E. coli und Anabaena sp. (Lerbs et al., 1988; Troxler et al., 1994) lieferten direkte

Hinweise: In beiden Fällen zeigten die jeweiligen Antikörper Kreuzreaktionen mit

Polypeptiden der RNA‐Polymerasen.

Aus Senfplastiden konnten etwa gleichzeitig drei Proteine biochemisch gereinigt werden, die

in vitro mit dem core‐Enzym der RNA‐Polymerase aus E. coli zusammenwirken und

Promotorbindungs‐ und Initiationsspezifität verleihen (Bülow und Link, 1988; Tiller et al.,

1991). Diese Proteine wurden daher Sigma‐ähnliche Faktoren, kurz SLFs (sigma like factors),

genannt und entsprechend ihrer Molekulargewichte als SLF29, SLF52 und SLF67 bezeichnet.

Sie konnten sowohl aus Etioplasten, als auch aus Chloroplasten isoliert werden (Tiller et al.,

1991; Tiller und Link, 1993a).

Die Gene für die Sigmafaktoren befinden sich im Kerngenom der Pflanze und die

Genprodukte werden posttranslational in die Plastiden importiert (zur Übersicht siehe:

Allison, 2000). In A. thaliana konnten insgesamt sechs Sigmafaktoren identifiziert werden,

die als ATSIG1‐6 bezeichnet werden (Tanaka et al., 1997; Isono et al., 1997; Kanamaru et al.,

1999; Allison, 2000; Fujiwara et al., 2000; Hakimi et al., 2000). Aus Reis (Tozawa et al., 1998),

Weizen (Morikawa et al., 1999) und Mais (Lahiri et al., 1999; Tan und Troxler, 1999) konnten

ebenfalls Gene für die Sigmafaktoren identifiziert werden.

1.4.4 Die plastidäre Transkriptionskinase – PTK

Anhand der Untersuchungen an Senf‐Plastiden konnte gezeigt werden, dass der

Phosphorylierungszustand des plästidären Transkriptionsapparates die RNA‐Polymerase‐

Aktivität in Enzympräparaten aus Etioplasten bzw. Chloroplasten modulieren kann (Tiller und

Einleitung

11

Link, 1993b). Besonders die Sigmafaktoren scheinen dabei ein wichtiges Ziel für die

Modifikation durch Phoshorylierung zu sein. Biochemisch gereinigte PEP‐Präparationen aus

Senf‐Plastiden wiesen eine Kinaseaktivität auf, die in der Lage ist, Sigmafaktoren sowie auch

einige andere Komponenten des PEP‐Komplexes zu phosphorylieren. Diese Kinaseaktivität

wurde als plastidäre Transkriptionskinase, PTK, bezeichnet (Baginsky et al., 1997). Sie kann

entweder als „freier“ Kinase‐Komplex oder mit der PEP assoziiert vorkommen. Die

Phosphorylierung der PEP‐Komponenten, insbesonders der Sigmafaktoren, durch PTK führt

zu Reduktion der plastidären Transkriptionsaktivität (Baginsky et al., 1999). Die Aktivität der

PTK selbst wird über ihren Phosphorylierungs‐ und Redoxzustand reguliert. Reduziertes

Glutathion (GSH) inhibiert die PTK‐Aktivität. Andere Redoxreagenzien wie DTT, β‐

Mercaptoethanol und oxidiertes Glutathion (GSSG) haben dagegen keinen Einfluss auf die

Phosphorylierungsaktivität der PTK. Die Inaktivierung der PTK durch GSH führt dazu, dass

keine Komponenten der PEP phosphoryliert werden können und somit eine in vitro

Transkription möglich wird (Baginsky et al., 1999). Phosphorylierung der PTK durch eine

exogene Kinase wirkt ebenfalls inhibierend auf ihre Kinaseaktivität, was wiederum in vitro zu

einer ungehinderten Transkription durch PEP führt. Außerdem wurde beobachtet, dass GSH

auf die phosphorylierte und somit inaktivierte PTK eine reaktivierende Wirkung ausübt.

Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die PTK möglicherweise als ein Vermittler bei

der Regulation der plastidären Genexpression durch intrazelluläre Redoxsignale fungiert.

Aufgrund der biochemischen Charakterisierung (Baginsky et al., 1997 und 1999) wurde die

PTK in die Familie der Proteinkinase CK2 (aus der „Fehlbezeichnung“ Casein Kinase 2

abgeleitetes Akronym) eingeordnet (Ogrzewalla et al., 2002). Hierbei handelt es sich um

Serin‐/Threonin‐Kinasen, die zur CMGC‐Familien der eukaryotischen Proteinkinasen

gehören. Die CMGC‐Familie umfaßt neben der CK2 auch die CDKs, MAP‐Kinasen und GSK‐3

(zur Übersicht siehe: Hunter, 1991; Hanks und Quinn, 1991; Stone und Walker, 1995). Alle

Mitglieder dieser Gruppe sind Serin‐/Threonin‐Kinasen, die nicht durch second messenger‐

Moleküle wie Ca2+/Calmodulin oder zyklische Nukleotide reguliert werden und von großer

physiologischer Bedeutung sind.

Einleitung

12

1.5 CK2‐Proteinkinase in Pflanzen

Die CK2‐Proteinkinase ist ubiquitär im gesamten Eukaryotenreich verbreitet und das Enzym

kommt innerhalb vieler Zellen und Organellen ein und desselben Organismus vor (zur

Übersicht siehe: Faust und Montenarh, 2000). Sie besitzt in der Regel eine heterotetramere

Quartärstruktur und besteht aus zwei katalytischen α‐Untereinheiten (CK2α) und zwei

regulatorischen β‐Untereinheiten (CK2β). Die CK2α‐Untereinheit ist allein katalytisch aktiv

und kann auch als Monomer vorkommen (Pinna, 1990 und 1997; Espunya und Martinez,

1997). Die CK2‐Proteinkinase besitzt hoch konservierte Subdomänen (Abb. 1.5.1). Eine

Glycin‐reiche Region im N‐terminalen Bereich, die zuständig für die Nukleotid‐Bindung ist,

und eine katalytische Region sind typische Domänen aller eukaryotischen Proteinkinasen.

Abb. 1.5.1: Schematische Darstellung von CK2α. Die Sekundär‐Struktur der cpCK2 aus Arabidopsis wurde mittels PsiPred‐Programm (McGuffin et al., 2000) berechnet. Die konservierten Regionen wurden mit Hilfe von Motif Scan (Hulo et al., 2008) ermittelt.

Die CK2‐Proteinkinase phosphoryliert bevorzugt saure Substrate mit einer Konsensus‐

sequenz von S/TXXD/E (Kuenzel et al., 1987; Marchiori et al., 1988). Eine negativ geladene

Aminosäure an der (p+3)‐Position, d. h. der dritten Position C‐terminal von der

Phosphoakzeptorstelle, ist notwendig und gleichzeitig hinreichend für die CK2‐

Phosphorylierung. Die negativ geladene Seitenkette an der (p+3)‐Position kann auch ein

vorphosphoryliertes Serin oder Threonin sein. Die acidophile Substratspezifität der CK2α

Einleitung

13

wird mit dem sog. basischen Strang in Verbindung gebracht (Meisner et al., 1989), da diese

Region in keiner anderen eukaryotischen Proteinkinase vorhanden ist und nur für CK2α

typisch ist (vgl. Abb. 1.5.1).

Die CK2 ist eine konstitutiv aktive Protein‐Kinase und hat ein sehr breites Substratspektrum.

Bisher wurden mehr als 300 Substrate für CK2 beschrieben, die u. a. Enzyme der DNA‐

Replikation und der DNA‐Transkription, Transkriptionsfaktoren, Signaltransduktionsproteine

und Translationsfaktoren beinhalten (Meggio und Pinna, 2003).

Ein charakteristisches Merkmal der Proteinkinase CK2 ist, dass sie GTP genauso effektiv wie

ATP als Phosphatgruppendonor verwenden kann. Diese Eigenschaft wird als duale

Cosubstratspezifität bezeichnet und diagnostisch zur Identifizierung der CK2‐Aktivität

benutzt. Darüber hinaus inhibieren Polyanionen wie Heparin spezifisch die CK2‐Aktivität, da

sich eine polyanionische Substanz wegen ihres negativen und sauren Charakters kompetitiv

zum Substrat, jedoch nicht zu ATP verhält (Hathaway und Traugh, 1982).

In Pflanzen wurde die Proteinkinase CK2 erst Anfang der 90er Jahre intensiv hauptsächlich in

Mais und Arabidopsis erforscht. In beiden Pflanzen konnten mehrere cDNA‐Sequenzen für α‐

und β‐Untereinheiten isoliert werden (Dobrowolska et al., 1991; Mizoguchi et al., 1993;

Collinge und Walker, 1994; Riera et al., 2001). Funktionelle Untersuchungen der CK2 in

Pflanzen haben gezeigt, dass die CK2 u. a. eine Rolle bei der lichtregulierten Genexpression

spielt (Lee et al., 1999). Bisher wurde eine Reihe von pflanzlichen Substraten beschrieben;

z.B. Kern‐Transkriptionsfaktoren in Arabidopsis wie GBF1 (G‐Box bindender Faktor, Klimczak

et al., 1992 und 1995), HY5 (Hardtke et al., 2000) sowie das LHY (late elongated hypokotyl)‐

und CCA1 (circadian clock‐associated 1)‐Protein (Sugano et al., 1998 und 1999). Abbildung

1.5.2 gibt eine Übersicht über die Substrate und Substratklassen von CK2 in Pflanzen. MFP1

und die β‐Untereiheit der CF0CF1‐ATPase sind in Chloroplasten lokalisiert und werden

möglicherweise von der cpCK2 phosphoryliert.

Einleitung

14

Abb. 1.5.2: Pflanzliche Substrate und Substratklassen der CK2. CF0CF1: Die β‐Untereinheit der chloroplastidären ATP‐Synthase (Kanekatsu et al., 1998; Reiland et al., 2009). MFP1: coiled‐coil Protein in Chloroplasten (Samaniego et al., 2006), Calreticulin: Calcium‐Bindeprotein (Pinna und Meggio, 1997), eIF5: Translationsinitiationsfaktor aus A.thaliana (Dennis et al., 2009). GBF1, HY5, LHY und CCA1 wurden im Text erläutert.

Ein wichtiger Fortschritt in der CK2‐Forschung in Pflanzen war allerdings die Kristallisation

der CK2α‐Untereinheit aus Mais (Niefind et al., 1998; Battistutta et al., 2000). Dies

ermöglichte eine detaillierte Einsicht in die Gesamt‐Struktur des Proteins.

Eine CK2‐Aktivität in Chloroplasten wurde erstmals in Spinat detektiert (Kanekatsu et al.,

1995). Bald darauf wurde aus Senf‐Plastiden die PTK‐Aktivität, die ebenfalls eine CK2‐

typische Aktivität aufweist, isoliert und charakterisiert (Baginsky et al., 1997 und 1999).

Dabei konnten eine „freie“ und eine im PEP‐Transkriptionskomplex „gebundene“ Form der

plastidären Transkriptionskinase detektiert werden. Die Suche nach der cDNA für eine

chloroplasten‐lokalisierte CK2α hat eine vollständige cDNA ergeben, deren Genprodukt ein

putatives Transitpeptid für Chloroplasten‐Import aufweist (Ogrzewalla et al., 2002). Die

Funktionalität dieses Transitpeptides konnte in vitro bestätigt werden und das abgeleitete

Protein wurde als cpCK2α (chloroplastidäre CK2α) bezeichnet. Für funktionelle

Untersuchungen wurde die cpCK2α ohne Transitpeptid bakteriell überexprimiert. Das

rekombinante Protein zeigte Phosphorylierungsaktivität. Ein direkter Vergleich der

Aktivitäten von cpCK2α und PTK wies Ähnlichkeiten der beiden Enzyme zueinander und zu

anderen cytosolischen CK2‐Proteinkinasen auf, wie z.B. die duale Cosubstratspezifität und

Einleitung

15

Inhibierung durch Heparin. Das rekombinante Protein ließ sich wie die PTK auch durch GSH

inhibieren (Ogrzewalla et al., 2002).

Datenbank‐Analysen mit der Aminosäuresequenz von cpCK2α aus Senf haben gezeigt, dass

eine Reihe von Pflanzen ‐darunter Arabidopsis thaliana‐ cpCK2α‐Orthologe besitzen

(Loschelder et al., 2004). Laut Genomanalysen besitzt Arabidopsis vier Gene für CK2α‐ und

vier für die β‐Untereinheit. Abbildung 1.5.3 zeigt die Positionen dieser Untereinheiten auf

den Chromosomen von A. thaliana. Eine extensive in vivo Studie über CK2‐Untereinheiten

und ihre subzelluläre Lokalisierung in A. thaliana hat gezeigt, dass nur eine der vier CK2α‐

Untereinheiten, At2g23070, in Chloroplasten lokalisiert ist (Salinas et al., 2006). Die

restlichen drei α‐Untereinheiten befinden sich im Nukleus, während die β‐Untereinheiten im

Nukleus und/oder Cytosol lokalisiert sind. Es konnte keine CK2β in Arabidopsis‐

Chloroplasten detektiert werden (Salinas et al., 2006). Das Fehlen einer β‐Untereinheit wird

offenbar durch Interaktion des α‐Polypeptids mit anderen Bestandteilen des

Transkriptionskomplexes und/oder durch Vorhandensein anderer regulatorischer

Determinanten im Protein selbst kompensiert. In folgenden Kapiteln dieser Arbeit wird

vereinfachend von cpCK2, d. h. ohne α‐Spezifikation, gesprochen.

Abb. 1.5.3: Lokalisation der CK2‐Untereinheiten auf den Chromosomen von Arabidopsis. Die Abbildung wurde mittels Chromosom Map Tool (TAIR) erstellt (basiert auf Daten von Salinas et al., 2006). Das Gen für die Chloroplasten‐lokalisierte CK2α‐Untereinheit (At2g23070) liegt als Einzel‐Kopie auf Chromosom 2 vor.

Zielsetzung

16

2 Zielsetzung

Die Regulation der Genexpression in den Plastiden ist ein sehr komplexer Prozess, an dem

viele kern‐kodierte Faktoren beteiligt sind. Die Wechselwirkungen dieser Faktoren

miteinander und mit der basalen Transkriptionsmaschinerie stellen wichtige Aspekte der

Regulation der Organellen‐Genexpression dar. In Vorarbeiten wurde eine PEP‐assozierte Ser‐

/Thr‐Proteinkinase aus Senf‐Plastiden als zentraler Spieler der plastidären Genexpression

identifiziert (Baginsky et al., 1997 und 1999). Diese als PTK (plastidäre Transkriptionskinase)

bezeichnete Kinase ist in der Lage, durch Phosphorylierung von Sigmafaktoren und anderen

PEP‐Komponenten die Organellen‐RNA‐Synthese zu regulieren. In vitro Experimente zeigten,

dass PTK einer Redox‐Regulation durch reduziertes Glutathion (GSH) unterliegt und somit

auch in vivo als möglicher Vermittler zwischen zellulären Redoxsignalen und der plastidären

Genexpression in Frage kommen kann (Baginsky et al., 1999; Baena‐González et al., 2001).

Eine cDNA für diese Chloroplasten‐lokalisierte Proteinkinase aus Senf konnte isoliert werden

und das Genprodukt wurde wegen seiner Ähnlichkeit zu der nucleo‐/cytosolischen Casein

Kinase 2 (CK2) als cpCK2 (chloroplastidäre CK2) bezeichnet (Ogrzewalla et al., 2002). Das

rekombinante cpCK2‐Protein zeigte große Ähnlichkeiten zu PTK hinsichtlich seiner

biochemischen Eigenschaften und Empfindlichkeit gegenüber CK2‐spezifischen Inhibitoren

einschließlich der GSH‐Sensitivität (Ogrzewalla et al., 2002). Datenbank‐Analysen mit der

cpCK2 aus Senf zeigten, dass eine Reihe von Pflanzen einschließlich Arabidopsis thaliana ein

einzelnes Gen für die Chloroplasten‐lokalisierte CK2/PTK besitzen (Loschelder et al., 2004).

Die Modellpflanze A. thaliana bietet die Möglichkeit, die Funktion von Genen bzw.

Genprodukten mit Hilfe von Mutanten „klassisch‐“ oder „rückwärts‐“ genetisch zu

untersuchen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es diese Strategien und Techniken zur Klärung

der Funktion und Regulation der chloroplastidären CK2 in der Pflanze und in vitro zu

untersuchen.

In einem ersten experimentellen Schritt galt es, die cDNA für cpCK2 aus A. thaliana (ATCK2)

zu clonieren, zu analysieren und für bakterielle Überexpression einzusetzen. Das

rekombinante Protein aus A. thaliana sollte im Vergleich zu dem bereits vorhandenen

Zielsetzung

17

cpCK2‐Protein aus Sinapis alba (Senf) (SACK2) auf seine katalytische Aktivität und

biochemischen Eigenschaften untersucht werden. Dies gilt insbesondere für die „Benutzung“

von Sigmafaktoren als phosphorylierbare Substrate durch ATCK2 und die funktionellen

Konsequenzen für die Sigma‐Aktivität. Zur Klärung dieses Aspekts bieten sich Promotor‐

Bindungsstudien wie z. B. EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assays) an.

Nächstes Ziel der Arbeit war die Untersuchung der Redox‐Regulation der ATCK2‐Aktivität. Im

Vordergrund standen sowohl in vitro als auch in vivo mutationale Analysen mit ATCK2, um

regulatorische Cystein(e) zu identifizieren.

Ein zentraler Aspekt der Funktionsanalyse der chloroplastidären CK2 in planta betrifft die

Regulation der „Zielgene“. Zu diesem Zweck wurden die Expressionsmuster ausgewählter

Chloroplasten‐Gene in einer knockout‐Mutante, die eine T‐DNA‐Insertion im Exon 1 des

Atcpck2‐Gens aufweist, untersucht.

Material und Methoden

18

3 Material und Methoden

3.1 Materialien

3.1.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien

Acrylamid/Bisacrylamid (29:1) 40% Roth

Acrylamid/Bisacrylamid (37,5:1) 30% Roth

Agarose GERBU Biotechnik

Ampicillin Sigma‐Aldrich

Ammoniumpersulfat (APS) Sigma‐Aldrich

Amylose‐Resin New England Bioloabs

ATP Roche

γ‐32P‐ATP Hartmann Analytics

Bacto‐Agar Difco

Bacto‐Trypton Becton, Dickinson and Co.

BCIP Biomol

2‐β‐Mercaptoethanol Sigma‐Aldrich

Bromphenolblau Serva

α‐Casein Sigma‐Aldrich C8032 (lyophilisiert und

80 % dephosphoryliert)

Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs) Promega

Dialyse‐Membranen Biomol, Typ 8 und 20

Diamid Sigma‐Aldrich

DIG‐UTP Roche


19

DNeasy Plant Mini Kit Qiagen

Ficoll 400 Sigma‐Aldrich

γ‐32P‐GTP Hartmann Analytics

Gel Extraction Kit Qiagen

Heparin Sigma‐Aldrich H7005

Hefeextrakt Difco

Imidazol Sigma‐Aldrich

Isopropyl‐β,D‐thiogalactopyranosid (IPTG) GERBU Biotechnik

Kanamycin GERBU Biotechnik

Lambda (λ‐) DNA Invitrogen

Lysozym GERBU Biotechnik

Nitrocellulose‐Membran Porablot NCL, Macherey & Nagel

Ni‐NTA‐Agarose Qiagen

Nitroblue Tetrazolium (NBT) GERBU Biotechnik

N‐Lauroylsarcosin Novagen (Protein Refolding Kit)

PCR Purification Kit Qiagen

Poly d[(I‐C)] Roche

Positive geladene Nylonmembran Roche

ProbeQuant G‐50 Micro Columns GE Healthcare

Protein Refolding Kit Novagen

Protein‐Standards für SDS‐PAGE BioRad, Precission Protein Standards

QuikChange II Site‐Directed Mutagenesis Kit Stratagene

Random Primer Promega


20

Reduziertes DTT Sigma‐Aldrich, D9779

Reduziertes Glutathion (GSH) Sigma‐Aldrich, G4251

Rifampicin GERBU Biotechnik

RNA‐Marker Promega

Sulfadiazin GERBU Biotechnik

TBB (4,5,6,7‐Tetrabromobenzotriazol) Sigma‐Aldrich

TEMED Sigma‐Aldrich

Alle sonstigen Chemikalien wurden in p. a. Qualität von handelsüblichen Firmen bezogen.

3.1.2 Enzyme und Konjugate

AMV Reverse Transkriptase Stratagene

Anti‐CK2α (Monoclonal, mouse) Sigma, C5367

Anti‐Digoxigenin‐AP Roche

Anti‐Mouse IgG Alkaline Phosphatase Conjugate Promega

CIAP (calf intestinal alkaline phosphatase) Promega

CDP‐Star Roche

DNaseI Otto Nordwald KG

E. coli RNA core‐Polymerase Epicentre Biotechnologies

GoTaq® Flexi DNA Polymerase Promega

Pfu‐Polymerase Promega

PfuTurbo DNA Polymerase Promega

Proteinase K Merck

Protease Inhibitor Coctail Sigma, P8849

Recombinant RNasin® Ribunuclease Inhibitor Promega


21

Restriktionsendonukleasen Promega

SP6‐RNA‐Polymerase Promega

Taq‐DNA‐Polymerase Promega

T3‐RNA‐Polymerase Promega

T4‐DNA‐Ligase Promega

T4‐Polynucleotide Kinase Promega

T7‐RNA‐Polymerase Promega

3.1.3 Puffer und Lösungen

AP‐Puffer 100 mM Tris/HCl pH 8,0, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2

BCIP‐Lösung 5 % (w/v) BCIP in Dimethylformamid

Bis‐Tris‐Gel 8 bzw. 10 % Polyacrylamid (Stocklösung: 40 %, 29:1),

350 mM Bis‐Tris/HCl pH 6.6, 0,035 % APS und 0,12 %

TEMED

Blockierungslösung 2 % (w/v) Magermilchpulver in TBS‐Puffer

CD‐Puffer 25 mM Natriumphosphatpuffer pH 8.0

CK2‐Puffer (10X) 200 mM Tris/HCl pH 7,5, 500 mM KCl, 100 mM MgCl2

Coomassie‐Entfärber 20 % Methanol, 10 % Essigsäure

Coomassie‐Färbelösung 50 % Methanol, 12 % Essigsäure, 0,2 % Coomassie

Brilliant‐Blue G250

Dialyse‐Puffer mit Glycerin 50 mM Tris/HCl pH 8,0, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 5

mM β‐Mercaptoethanol, 50 % Glycerin

DNA‐Probenpuffer (5x) 25 % Ficoll, 0,5 % SDS, 0,1 % Xylencyanol, 0,1 % Brom‐

phenolblau, 10 mM EDTA

Elutionspuffer (pQE‐System) 50 mM Tris/HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol


22

Elutionspuffer (pMAL‐System) 10 mM Maltose in Säulenpuffer

EMSA‐Gel (4%) 4 % Acrylamid/Bisacrylamid (37,5:1), 1X TBE‐Puffer, 2 %

APS und 0,2 % TEMED

EMSA‐Laufpuffer 1X TBE‐Puffer

IB‐Waschpuffer 20 mM Tris/HCl pH 7,5, 10 mM EDTA, 1 % Triton‐X‐100

IB‐Solubilisierungspuffer 50 mM CAPS pH 11, 0,3 % N‐Lauroylsarcosin, 1mM DTT

Lysozym‐Lösung 10 mg Lysozym in 1 ml dH2O

NBT‐Lösung 5 % (w/v) NBT in 70 % (v/v) Dimethylformamid

Ponceau S‐Lösung 1 % Ponceau S, 5 % Essigsäure

Probenpuffer (5x, non‐red) 300 mM Tris/HCl, 10 % SDS, 0,2 % Bromphenolblau

Probenpuffer (5X, red) 300 mM Tris/HCl, 10 % SDS, 0,2 % Bromphenolblau,

250mM DTT

Retardationspuffer (1x) 30 mM Tris/HCl pH 7, 0,5 mM β‐Mercaptoethanol,

80mM (NH4)2SO4, 0,5 mM EDTA

RNA‐Gel (denaturierend) 1,2 % Agarose, 1X MOPS‐Puffer, 6,7 % Formaldehyd

(entionisiert)

RNA‐Ladepuffer 50 % Formamid, 6% Formaldehyd (entionisiert), 1X

MOPS‐Puffer, 10“ Glycerin, 0,05 % Bromphenolblau

Säulenpuffer 20 mM Tris/HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1mM DTT

SDS‐MOPS‐Laufpuffer (10X) 500 mM MOPS, 500 mM Tris/HCl, 10 mM EDTA, 1% SDS

SSC‐Puffer (20X) 3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat

TBE‐Puffer (5x) 500 mM Tris, 450 mM Borsäure, 5 mM EDTA, pH 8.3

TBS‐Puffer 50 mM Tris/HCl pH 8,0, 150 mM NaCl

TBS‐TT‐Puffer 50 mM Tris/HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,05 % Tween,

0,2 % Triton X‐100


23

Transferpuffer 25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20 % (v/v) Methanol

Waschpuffer (pQE‐System) 50 mM Tris/HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol

Waschpuffer (pMAL‐System) 0,1‐1 mM Maltose in Säulenpuffer

3.1.4 Pflanzenmaterial

Tabelle 3.1.4: Zusammenfassung der in dieser Arbeit verwendeten/hergestellten Pflanzenlinien

Pflanze Genotyp Referenz

Arabidopsis thaliana

L Heynh. Cv. Columbia Wildtyp

NASC European

Arabidopsis Stock Centre


cpck2‐Knockout‐

Mutante

T‐DNA‐Insertion in Exon 1 des

Atcpck2α (At2g23070) Gens

Linien‐ID: 615F11,

GABI‐Kat, Universität

Bielefeld


komplementierte

cpck2‐Knockout‐

Mutante



AtcpCK2 Wildtyp‐cDNA

im Genom inseriert

Transformation in die

cpck2‐knockout‐Linie,

diese Arbeit


cpck2 C1 Mutante



AtcpCK2 Cys158‐Ser Mutanten‐

konstrukt im Genom inseriert



diese Arbeit


cpck2 C2 Mutante







diese Arbeit


24


cpck2 C3 Mutante







diese Arbeit


cpck2 C4 Mutante







diese Arbeit

3.1.5 Bakterienstämme

Escherichia coli:

DH5α deoR, endA1, gyrA96, usdR17 (rk – mk+), recA1, supA1, supE44, thi‐1, Δ(lacZYA

argFV169), Φ80lacZ ΔM15, F– (Stratagene, Hanahan 1983)

M15 NalS, StrS, RifS, Lac –, Ara –, Gal –, Mtl –, F –, RecA+, Uvr+, Lon+, pREP5 (Qiagen)

TB1 F –ara Δ(lac‐proAB) [] rpsL(StrR) thi hsdR (New England Biolabs)

XL1Blue recA1, endA1, gyrA96, thi‐1, hsdR17, supE44, relA1, lac [F´ proAB lacIqZ ΔM15

Tn10 (Tet R )] (Stratagene, Bullock et al., 1987)

BL21RIL F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB‐ mB‐) λ(DE3 [lacI lacUV5‐T7 gene 1 ind1 sam7

nin5]) ( Stratagene)

Agrobacterium:

Agrobacterium tumefaciens GV3101::pMP90RK , genR, kanR (Koncz & Shell, 1986)


25

3.1.6 Plasmide und Klone

Tabelle 3.1.6: In dieser Arbeit verwendete/erstellte Plasmide und Klone

Plasmid/Klon Charakteristika Referenz

pBlueScript® KS(‐) Klonierungsvektor mit Blau/Weiss‐

Selektion, T3/T7‐Promotoren Stratagene

pQE30 Überexpressionsvektor, N‐terminale

Fusion mit sechs Histidinen Qiagen

pMALc2x

Überexpressionsvektor, N‐terminale

Fusion mit Maltose‐Bindeprotein

(MBP)

New England Biolabs

pGEMT‐easy Klonierungsvektor mit Blau/Weiss‐

Selektion, T7/SP6‐Promotoren Promega, Mannheim

pBinAR Pflanzentransformationsvektor, 35S ‐

Promotor, kan R Höfgen und Willmitzer,

1990

pBS/Hinf120 5´‐Ende des Cloroplast‐psbA‐Gens mit

Promotor (120 bp)

A. Homann,

Dissertation 2002

pSA364/B0,5 Intronfragment aus trnK‐Gen aus S.

alba (460 bp)

Neuhaus und Link,

1987

pUCE1.45 5´‐kodierende Region des trnK‐Gens

mit Promotor

Neuhaus, Dissertation

1987

pBlueScript/atpB 5´‐Ende des atpB‐Gens mit Promotor Schweer et al., 2009

pQE/Ck2a1000 cpCK2‐cDNA (ohne TP) aus S. alba in

pQE30

Ogrzewalla,

Dissertation 2001

pQE‐Sig1 Sig1‐cDNA (ohne TP) aus S. alba in

pQE30

Kreutzenbeck,

Diplomarbeit 2000


26

pQE‐Sig2 Sig2‐cDNA ( ohne TP) aus S. alba in

pQE30

Berndt, Diplomarbeit

2000

pMALc2x/ATSIG1 Sig1‐cDNA (ohne TP) aus A. thaliana

in pMALc2x

A. Kolpack,

Dissertation 2010

pBlueScript/ATSIG6 Sig6‐cDNA (ohne TP) aus A. thaliana H. Loschelder,

Dissertation, 2007

pMALc2x/ATSIG6 Sig6‐cDNA (ohne TP) aus A. thaliana

in pMALc2x diese Arbeit

pMALc2x/ATCK2 cpCK2‐cDNA (ohne TP) aus A. thaliana

in pMALc2x diese Arbeit

pMALc2x/ATCK2 C1 AtcpCK2‐cDNA (ohne TP) mit einer

Punktmutation an Cys158 diese Arbeit


Punktmutation an Cys182 diese Arbeit

pMALc2x/ATCK2 C3 AtcpCK2‐cDNA (‐TP) mit einer Punkt‐

mutation an Cys240 diese Arbeit


Punktmutation an Cys313 in diese Arbeit

pMALc2x/ATCK2 C2/3 AtcpCK2‐cDNA (ohne TP) mit einer

Doppelmutation an Cys182 und 240 diese Arbeit






27

pBinAR/ATCK2 + TP AtcpCK2‐cDNA (mit TP) in pBinAR diese Arbeit

pBinAR/ATCK2 + TP C1 AtcpCK2‐cDNA (mit TP) mit einer

Punktmutation an Cys158 in pBinAR diese Arbeit

pBinAR /ATCK2 + TP C2 AtcpCK2‐cDNA (mit TP) mit einer


pBinAR ATCK2α +TP C3 AtcpCK2‐cDNA (mit TP) mit einer


pBinAR ATCK2 + TP C4 AtcpCK2‐cDNA (mit TP) mit einer


pSPT‐452a (psbA) psbA‐Gen‐Sonde für Northern‐Blot‐

Hybridisierung

K. Liere, Dissertation

1995

pGEM‐T Easy/actin2 actin2‐Gen‐Sonde für Northern‐Blot‐

Hybridisierung Schweer et al., 2006

pGEM‐T Easy/atpB atpB‐Gen‐Sonde für Northern‐Blot‐

Hybridisierung Schweer et al., 2006

pGEM‐T Easy/psaA psaA‐Gen‐Sonde für Northern‐Blot‐

Hybridisierung

Loschelder,

Dissertation 2007

3.1.7 Nährmedien

LB‐Medium: 0,5 % NaCl, 0,5 % Hefe‐Extrakt, 1 % Pepton (Bertani et al., 1951)

LBamp‐Medium: LB‐Medium mit 50 µg/ml Ampicillin

LBkan‐Medium: LB‐Medium mit 50 µg/ml Kanamycin

LBamp,kan‐Medium: LB‐Medium mit 100 µg/ml Ampicillin und 50 µg/ml Kanamycin

LBamp,cam‐Medium: LB‐Medium mit 50 µg/ml Ampicillin und 34 µg/ml

Chloramphenicol


28

LBcam, kan, rif‐Medium: LB‐Medium, 50 μg/ml Ampicillin, 50 μg/ml Kanamycin, 50

µg/ml Rifampicin

LBpMAL‐Medium: LB‐Medium mit 0,2 % Glukose und 100 µg/ml Ampicillin

MS‐Medium: Murashige und Skoog, 1962

MS‐Medium mit Sulf: MS‐Medium mit 11,25 µg/ml Sulfadiazin

3.1.8 Oligonukleotide

Tabelle 3.1.8: Liste der verwendeten Oligonukleotide (bezogen von der Firma MWG‐Biotech). Schnittstellen für Restriktionsenzyme bzw. die ausgetauschten Sequenzen wurden unterstrichen.

Bezeichnung Sequenz (5´ 3´) Verwendung

ATCK2_VL1

ATCK2_VL2

ATGGCCTTAAGGCCTTGTACTGGA

CAAATGTTTTCGAGATCACTGGCTG

RT‐PCR, zur

Transkript‐

Detektion

ATCK2_VL_BamHI

ATCK2_VL_SalI

GAATTCGGATCCATGGCCTTAAGGCCTTGTACTGGA

CTGCAGGTCGACCAAATGTTTTCGAGATCACTGGCT

RT‐PCR, zur

Volllängen‐

Klonierung

ATCK2_BamHI_for

ATCK2_SalI_rev

GAATTCGGATCCGCTTCTCTTTACCGTCAACATCTCCGG

CTGCAGGTCGACTCACTGGCTGCGCGGCGTACGGCTGC

RT‐PCR, zur

Klonierung

(ohne TP)

AtCYS1_for1

AtCYS1_rev1

AtCYS2_for

AtCYS2_rev

AtCYS3_for

AtCYS3_rev

GCTACTGATAACGAGAAATCCGTTATCAAGATTTTGAAGCC

GGCTTCAAAATCTTGATAACGGATTTCTCGTTATCAGTAGC

GATTAAGATTCTGCAGAACCTCTCCGGTGGGCCG

CGGCCCACCGGAGAGGTTCTGCAGAATCTTAATC

GGCGTTGGATTTCTCCCATTCACGTGGAATCATGC

GCATGATTCCACGTGAATGGGAGAAATCCAACGCC

Mutagenese‐

PCR, zum

Austausch

der Cystein‐

Resten gegen

Serin


29

AtCYS4_for

AtCYS4_rev

GGAGTCTTGGGTCTATGTTTGCTGGAATGATATTCCGC

GCGGAATATCATTCCAGCAAACATAGACCCAAGACTCC

CK2HO2

CK2HO9

CK2HO10

CCATTGAACAGCAAGGGACT

TCGCCTTTTTCGTCCATTAG

GTGCGTTGTGCAGGATTAGA

Genomische

PCR, zum

Homozygotie‐

Test

3.1.9 Internetadressen

CPHmodels: http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/

CloroP: http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/

ExPASy tools: http://www.expasy.ch/tools/

PYMOL v. 0.99: http://pymol.sourceforge.net/

Predotar: http://urgi.versailles.inra.fr/predotar/predotar.html

ProtParam: http://www.expasy.ch/tools/protparam.html

SWISS‐MODEL: http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS‐MODEL.html

Restriction Mapper: http://www.restrictionmapper.org/

TAIR: http://www.arabidopsis.org

CLUSTALW2: http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index

BLAST: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

National Center for Biotechnology Information (NCBI): http://www.ncbi.nlm.nih.gov

3.1.10 Computergestützte Bildbearbeitung

Die Detektion radioaktiver Signale erfolgte mittels Phospho‐Imager. Die Daten wurden mit

FUJI FLA3000 RGB (auf IP stage) eingelesen und mit Hilfe des AIDA (v.4.04)‐Programms

bearbeitet. Eingescannte Röntgenbilder sowie alle Abbildungen in dieser Arbeit wurden mit


30

Hilfe der Programme Adobe Photoshop und Corel DrawX4 digital erstellt und inhaltsgetreu

bearbeitet.

3.2 Methoden

Alle nicht gesondert aufgeführten Methoden wurden nach Ausubel et al. (1989‐2001),

Maniatis et al. (1982) und Sambrook et al. (1989) oder nach den Angaben des jeweiligen

Produktherstellers durchgeführt.

3.2.1 DNA‐Isolierung

3.2.1.1 Isolierung genomischer DNA

Gesamt‐DNA‐Isolierung aus Arabidopsiskeimlingen wurde nach der CTAB‐Methode (Rogers

und Bendich, 1985) bzw. mit dem DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden) durchgeführt.

3.2.1.2 Isolierung von Plasmid‐DNA

Zur Isolierung von Plasmid‐DNA wurde entweder die Methode gemäß Birnboim und Doly

(1979) oder der NucleoSpinR‐Kit (Macherey und Nagel) verwendet.

3.2.2 RNA‐Isolierung

Gesamt‐RNA‐Isolierung aus der Pflanze erfolgte gemäß Chomczynski und Sacchi (1987). Für

die Northern‐Blot‐Untersuchungen wurden von jeder Mutantenlinien drei unabhängige

RNA‐Isolierungen durchgeführt.

3.2.3 Markierung von Nukleinsäuren

3.2.3.1 Markierung der 5´‐Ende von DNA‐Fragmenten

Die radioaktive Markierung der DNA‐Fragmente wurde unter Verwendung von T4‐

Polynukleotid‐Kinase (NEB) und γ‐32P‐ATP (Hartmann Analytics) nach Rao (1994)

durchgeführt. Nicht eingebaute Nukleotide wurden mittels ProbeQuant G‐50 Micro Columns

(GE Healthcare) abgetrennt.


31

3.2.3.2 DIG‐Markierung von RNA durch in vitro‐Transkription

Zur Herstellung von Sonden für Northern‐Analysen wurde zuerst das entsprechende Plasmid

durch Restriktion linearisiert. Unter Verwendung von T7‐ oder SP6‐RNA‐Polymerase und

Digoxigenin‐11‐UTP wurde die cRNA den Herstellerangaben entsprechend (DIG User´s

Manual, Roche Diagnostics) in vitro transkribiert. Anschließend wurde die DNA‐Matrize

durch DNaseI‐Behandlung (15 min, 37 °C) entfernt.

3.2.4 Kapillartransfer von RNA (Northern‐Blot)

Für Northern‐Blot‐Analyse wurde 1 µg Gesamt‐RNA pro Spur in denaturierenden

Agarosegelen (1,5%, s. 3.1.3) elektrophoretisch aufgetrennt und anschlißend durch Kapillar‐

Blot mit 10X‐SSC‐Puffer auf eine positiv geladene Nylonmembranen transferiert.

3.2.5 RNA/RNA Hybridisierung

Die Hybridisierung mit DIG‐markierten RNA‐Transkripten (über Nacht bei 68 °C) und

anschließender Chemilumineszenz‐Detektion erfolgte nach Herstellerangaben (DIG User’s

Manual, Roche Diagnostics). Zur Chemilumineszenz‐Detektion wurden Anti‐Digoxigenin‐AP

und CDP‐Star verwendet.

3.2.6 Amplifizierung von Nukleinsäuren

3.2.6.1 Polymerase‐Kettenreaktion (PCR)

PCR‐Amplifikation von DNA‐Fragmenten wurde in 50 μl‐Ansätze mit je 50 – 100 ng DNA

(Matrize), 1 U DNA‐Polymerase (Taq‐, Pfu‐, Pfu Ultra Polymerase), 0,75 mM MgCl2 im Falle

der Taq‐Polymerase, 50 pmol der entsprechenden Oligonukleotide, 50 mM KCl, 10 mM

Tris/HCl pH 9.0, 0,1 % Triton X‐100 und 1 mM dNTPs durchgeführt. Die Reaktionsansätze

wurden 30 sec auf 95 °C erhitzt, anschließend erfolgten 35 Zyklen des folgenden Programms:

30 sec 95 °C, 60 sec 55 – 65 °C, 90 sec 72 °C. Die Synthese im letzten Zyklus wurde bei 72 °C

auf 10 Minuten verlängert.


32

3.2.6.2 Reverse Transkription‐PCR (RT‐PCR)

Mit dieser Methode wurde die Gesamt‐RNA aus Arabidopsis thaliana mit dem Enzym AMV

(Avian Myeloblastosis Virus) Reverse Transcriptase (Promega, Mannheim) in cDNA

umgeschrieben. Durch anschließende PCR (3.2.6.1) wurde aus der cDNA doppelsträngige

DNA amplifiziert. Es wurde nach den Angaben des Herstellers verfahren.

3.2.7 Elution von DNA‐Fragmenten

Die Reinigung von Produkten aus Agarose‐Gelen erfolgte mit dem Gel Extraction Kit (Qiagen,

Hilden).

3.2.8 In vitro‐Mutagenese

Die Ortsgerichtete‐Mutagenese von Plasmid DNA mit dem Konstrukt wurde mit Hilfe des

QuickChange II Site‐Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, Heidelberg) durchgeführt. Es

wurde bei der Erstellung der Oligonukleotide, welche die entsprechende Mutation

enthielten, bei dem PCR‐Protokoll und anschließender Transformation in E. coli XL1Blue‐

Zellen nach Angaben des Herstellers verfahren.

3.2.9 DNA‐Sequenzierung

Alle Sequenzierungen wurden in Auftragsarbeiten an der Fakultät für Chemie (Ruhr‐

Universität Bochum; Lehrstuhl für molekulare Neurobiochemie) mit dem

Kapillarelektrophoresegerät 3130cl Genetic Analyser (Applied Biosystems, Darmstadt)

durchgeführt. Für die Auswertung wurde das Programm Sequence Scanner 1.0 (Applied

Biosystems, Darmstadt) verwendet.

3.2.10 Floral Dip

Für die Herstellung komplementierter ∆cpck2‐Pflanzen sowie der cpck2‐Cystein‐Mutanten

wurden die entsprechenden Konstrukte hinter dem CaMV 35S Promotor in den pBinAR

Vektor (Höfgen and Willmitzer, 1990) kloniert und in Rhizobium radiobacter (Agrobacterium

tumefaciens GV3101) transformiert. Die T‐DNA Konstrukte wurden über floral dip Methode


33

(Clough und Bent, 1998) in das Genom der Arabidopsis ∆cpck2‐Mutante eingebracht. Die

Selektion der transformierten Pflanzen erfolgte mit Kanamycin. Die Insertion wurde mit Hilfe

der PCR‐Analysen nachgewiesen. Von jeder transgenen Pflanze wurden drei unabhängige

Nachkommen‐Linien auf ihren visuellen und molekularen Phänotyp untersucht.

3.2.11 Anzucht und Selektion von Pflanzen

Zur Anzucht der A. thaliana Linien wurden zuerst die Samen für 3 min in 70% (v/v) Ethanol

und für weitere 5 min in 5% (v/v) Na‐Hypochlorit sterilisiert. Nach fünfmal Waschen mit

sterilem Wasser wurde das Saatgut in 0,1% (v/v) sterilem Agar aufgenommen und auf MS‐

Medium in Petri‐Schalen ausplattiert. Es folgte eine Stratifikation für zwei Tage bei 4 °C. Die

Petri‐Schalen mit Samen wurden anschließend im Phytotron unter Kurztag‐ (8h Licht, 100

µmol/m2s, 24°C, 16h Dunkelheit bei 20°C) oder Langtagbedingungen (16h Licht, 60

µmol/m2s, 24°C, 8h Dunkelheit bei 20°C) angezogen. Ab 14 Tage wurden die Pflanzen auf

Erde gesetzt

3.2.12 Expression rekombinanter Proteine

3.2.12.1 Bakterielle Überexpression mit Hilfe des pQE‐Systems

Die Expression von cpCK2 sowie Sigmafaktor 1 und 2 aus Senf (SACK2, SASIG1 und SASIG2)

erfolgte im E. coli‐Stamm M15 durch pQE‐Expressionsvektoren. Diese Vektoren ermöglichen

die Expression eines Fusionsproteins mit sechs aufeinanderfolgenden N‐terminalen

Histidinen. Die Überexpression der rekombinanten Proteine erfolgte in LB‐Medium

(+Antibiotika), das 1 % ig mit einer Übernachtkultur angeimpft und bei 37 °C bis zu einer

OD580 0,5‐0,7 angezogen wurde. Die Expression der Fusionsproteine wurde durch Zugabe

von 1 mM IPTG induziert. Die Expressionskulturen wurden anschließend entweder 3h bei

37°C (zur Isolierung der inclusion bodies) oder 2 h bei 25 °C (für Reinigung nativer Proteine)

inkubiert. Nach der Inkubation wurden die induzierten Bakterienzellen für 20 min bei 4 °C

und 8000 rpm geerntet. Pellets wurden bis zur weiteren Aufarbeitung bei – 80 °C gelagert.


34

3.2.12.2 Bakterielle Überexpression mit Hilfe des pMAL‐Systems

Zur Überexpression mittels pMAL‐Systems (New England Biolabs) wurden die cDNAs für das

cpCK2‐Protein (AtCK2) sowie für Sigmafaktor 1 und 6 aus Arabidopsis (AtSIG1 und AtSIG6) in

den pMALc2x‐Vektor kloniert. Dieses System bietet die Möglichkeit, das entsprechende

Protein als MBP‐Fusionsprotein zu synthetisieren. Überexpression wurde in E. coli TB1‐ bzw.

in BL21RIL‐Zellen durchgeführt. Die Überexpression und Aufreinigung der rekombinanten

Proteine erfolgten nach vorgegebenen Herstellerangaben (pMALTM Protein Fusion and

Purification System, NEB).

3.2.13 Reinigung rekombinanter Proteine

3.2.13.1 Isolierung und Renaturierung von Proteinen aus inclusion bodies

Die Reinigung von Proteinen aus inclusion bodies wurde mit Hilfe des Protein Refolding‐Kits

der Firma Novagen durchgeführt. Hierzu wurden die sedimentierten Bakterienzellen (s.

3.2.12.1) zunächst in 20 ml IB‐Waschpuffer resuspendiert. Der Zellaufschluss erfolgte mittels

Lysozym (Endkonzentration 100 µg/ml) und anschließende Ultraschall‐Behandlung (10‐mal

für 15 sec mit Kühlungspausen). Die inclusion bodies wurden über einen

Zentrifugationsschritt sedimentiert (10000 x g, 10 min, 4 °C) und mit 20 ml IB‐Waschpuffer

gewaschen. Nach erneuter Zentrifugation (10000 x g, 10 min, 4 °C) wurde die Konzentration

der inclusion bodies wurde mit IB‐Solubilisierungspuffer auf 10‐20 mg/ml eingestellt. Die

Protein‐Lösung wurde für 2‐mal 3 h gegen 50 Volumina Dialysepuffer mit DTT bei 4 °C

dialysiert. Nach der Dialyse mit Dialysepuffer mit Glycerin wurden die Proteinproben bei ‐

20°C gelagert.

3.2.13.2 Reinigung nativer Proteine

Die Isolierung nativer Proteine erfolgte mittels Qiaexpressionist‐Kit von Qiagen (Handbook

June 2003, Protokoll 9 und 12).


35

3.2.14 Bis‐Tris‐Polyacrylamid‐Gelelektrophorese (Bis‐Tris‐PAGE)

Zur Auftrennung der Proteine wurde das kontinuierliche Bis‐Tris‐Gelsystem (6‐10%

Acrylamid/Bisacrylamid in 1x Gel‐Puffer) verwendet (s. 3.1.3). Zur Herstellung der Mini‐Gele

(8 cm x 10 cm x 1 mm) wurde das Mini‐Gel‐System der Firma BioRad verwendet. Als

Laufpuffer wurde 1x SDS‐MOPS‐Laufpuffer verwendet (3.1.3). Die Proben wurden mit

Probenpuffer (mit oder ohne DTT) versetzt und aufgetragen.

3.2.15 Native‐PAGE

Zur Auftrennung der DNA‐Protein‐Komplexe bei der EMSA (3.2.18) wurden 4% ige native

TBE‐Gele mit 0,5X‐TBE‐Laufpuffer verwendet (s. 3.1.3).

3.2.16 Elektrophoretischer Transfer von Proteinen auf Nitrocellulose‐Membranen

(Westernblot) und Immunodetektion

Nach der Bis‐Tris‐PAGE wurden die Proteine mit Hilfe einer Transferapparatur der Firma

BioRad (Mini Trans‐Blot Electrophoretic Transfer Cell) elektrophoretisch unter Verwendung

von Transferpuffer (s. 3.1.3) auf eine Nitrocellulose‐Membran übertragen. Nach dem

Transfer konnten die rekombinanten Proteine mit Antikörper selektiv detektiert werden.

Dazu wurde die Membran zuerst in Blockierungslösung für 1h inkubiert. Anschließend

erfolgte eine Inkubation (1h) mit dem monoklonalen CK2α‐Antikörper (1:1000) in

Blockierungslösung. Durch 3‐maliges Waschen der Membran für je 10 min (2 x mit TBS‐TT‐

Puffer und 1 x mit TBS‐Puffer) wurde überschüssiger und ungebundener Antikörper entfernt.

Anschließend wurde die Membran für 1h in einer 1:5000‐Verdünnung des Sekundär‐

Antikörpers (Anti‐Mouse Alkaline Phosphatase) in Blockierungslösung inkubiert. Es folgten

erneut drei Waschschritte für jeweils 10 min mit 2 x TBS‐TT und 1 x mit TBS. Detektion

erfolgte bei RT im AP‐Puffer durch Zugabe von NBT (0,33 mg/ml) und BCIP (0,165 mg/ml).


36

3.2.17 Färbung von Proteinen

Zur Färbung von Proteinen in Bis‐Tris‐Gele wurde Coomassie‐Blau‐Färbung verwendet. Die

auf Nitrocellulose transferierten Proteine wurden durch eine reversible Färbung mit Ponceau

S sichtbar gemacht (Salinovich und Montelaro, 1986).

3.2.18 Zirkular‐Dichroismus‐Spektroskopie

Zur Überprüfung der Sekundärstrukturen der rekombinanten CK2‐Cysteinmutanten im

Vergleich zu Wildtyp‐CK2 wurde die Zirkular‐Dichroismus‐Spektroskopie (circular dichroism,

CD, Greenfield, 2006; Martin und Schilstra, 2007) mit Jasco J‐715 CD‐Spektrometer

durchgeführt. Dazu wurden die Proteinlösungen gegen CD‐Puffer (s. 3.1.3) dialysiert und auf

eine Konzentration von 150 μg/ml eingestellt. Die Messungen wurden mit einer 1 mm‐

Küvette bei 20 °C durchgeführt. Die Scanning‐Geschwindigkeit betrug 100 nm/min. Die

Daten von jeweils 10 Spektren pro Protein von 190 bis 320 nm wurden gemittelt. Dabei

wurde das Spektrum des CD‐Puffers (ebenfalls gemittelte aus 10 Spektren) als Hintergrund

abgezogen. Die Auswertungen erfolgten mittels Jasco Spectra Manager.

3.2.19 Gelbindungstest (EMSA)

Zur Untersuchung der Promotorbindung von RNA‐Polymerase‐Sigmafaktor‐Komplexen

wurden EMSA‐Analysen (electrophoretic mobility shift assay) durchgeführt (Fried und

Crothers, 1981; Garner und Revzin, 1981). Hierzu wurden zuerst die Promotorfragmente

radioaktiv markiert (3.2.3.1). Die Standard‐Reaktionsansätze (50 µl) enthielten 25 ng Sigma‐

Protein, 2,5 ng 5´‐radioaktiv‐markiertes psbA‐ oder atpB‐Promotorfragment, 100 ng E. coli

core‐RNA‐Polymerase und 3 μg Poly d[(I‐C)] als unspezifische Kompetitor‐DNA in 1X‐

Retardationspuffer (3.1.3). Zur Kompetition wurden nicht‐markierte psbA‐, atpB‐ und trnK‐

Promotorfragmente (50 ng) verwendet. Als nicht‐spezifischer Kompetitor wurde ein DNA‐

Fragment ohne Promotor, Bam0.5, (100 ng) eingesetzt. Nach 15‐minütiger Inkubation bei

Raumtemperatur wurden die Proben in 4% igen nativen Polyacrylamid‐Gelen (3.1.3)

getrennt. Die Gele wurden getrocknet und die freie DNA sowie die Protein‐DNA‐Komplexe

wurden mittels Phospho‐Imager sichtbar gemacht.


37

3.2.20 Radioaktiver Kinasetest

Zur radioaktiven Detektion der Kinase‐Aktivität wurde 32P‐markierte ATP oder GTP

verwendet. Ein Standard‐Reaktionsansatz (50 µl) enthielt 1 x CK2‐Puffer, 10 µM ATP, ca. 10

µCi/µmol γ‐32P‐ATP/GTP, 1 µg partiell dephosphoryliertes Casein oder 5 µg Sigmafaktoren als

Substrat und 2,5‐5 µg cpCK2 (modifiziert nach Baginsky et al., 1997). Nach einer Inkubation

von 15 min (für Casein‐Phosphorylierung) bzw. 30 min (für Sigmafaktor‐Phosphorylierung)

bei 30 °C wurden die Reaktionen durch Zugabe von SDS‐Probenpuffer gestoppt und die

Reaktionssansätze wurden nach 5 minütiger Inkubation bei 95 °C über Bis‐Tris‐PAGE (großes

Gel) aufgetrennt. Das Gel wurde ca. für 1 h auf einem Gel‐Trockner getrocknet und über

Nacht auf eine Phospho‐Imager‐Platte aufgelegt. Phosphorylierte Proteine wurden mittels

FUJI FLA3000 RGB sichtbar gemacht.

Ergebnisse

38

4 Ergebnisse

4.1 Klonierung der cDNA für die chloroplastidäre CK2 aus Arabidopsis thaliana (ATCK2)

In früheren Arbeiten wurde eine plastidäre CK2 aus der Crucifere Sinapis alba (Senf) kloniert

und als bakteriell exprimiertes, rekombinantes Enzym erfasst (Ogrzewalla et al., 2002). Ziel

der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle von cpCK2 in der Modellpflanze A. thaliana durch

kombinierte biochemische und molekular‐genetische Ansätze zu untersuchen. Zu diesem

Zweck sollte zuerst das homologe Gen/Protein isoliert werden. Für die bakterielle

Überexpression (s. 4.3) wurde die cDNA für die chloroplastidäre CK2 aus A. thaliana (Ecotyp

Columbia, Col‐0) ohne Transitpeptidsequenz mit den Primern ATCK2_BamHI_for und

ATCK2_SalI_rev (s. 3.1.8) amplifiziert. Die Amplifikation der Konstrukte für die in vivo

Mutanten‐Komplementation bei Arabidopsis (s. 4.9.2) erfolgte mit Transitpeptidsequenz

mittels Primer‐Paar ATCK2_VL_BamHI und ATCK2_VL_SalI (s. 3.1.8).

Abbildung 4.1 zeigt die cDNA‐Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz der

ATCK2 (Synonym: cpCK2). Die Volllängen‐cDNA hat eine Länge von 1523 bp und kodiert für

einen offenen Leserahmen mit 432 Aminosäuren. Das Genprodukt besitzt am N‐Terminus

ein 55 Aminosäuren langes Signalpeptid für den Import in den Chloroplasten. Die 5´‐ und 3´‐

nichtkodierenden Regionen sind 27 bp bzw. 197 bp lang. Das errechnete Molekulargewicht

des Proteins ohne Transitpeptid beträgt ca. 44 kDa.

1 ctgaataagagttaaaaaaagacattaatggccttaaggccttgtactggattcacaatc 1 M A L R P C T G F T I 61 tcctctcttcgcaacgcttccgccgccaacaacaatctcttctctctcctctccttctct 12 S S L R N A S A A N N N L F S L L S F S 121 tcgtcgtctccggcgaagaggaatcttcttctctcttcgctccaggacaatctccgtcgt 32 S S S P A K R N L L L S S L Q D N L R R 181 ttcgcatccagcgcttctctttaccgtcaacatctccggaatcaacaacaacaacatcag 52 F A S S A S L Y R Q H L R N Q Q Q Q H Q 241 caacaacagcaatcgcgcgtgaaagaaaaatcagaaacgctggctcagaagatcggtaaa 72 Q Q Q Q S R V K E K S E T L A Q K I G K 301 tctatccggcgtgccggtgcgccgtcgaaagctagggtttacgctgatgtcaacgttgtt 92 S I R R A G A P S K A R V Y A D V N V V 361 agacctaaggactattgggattacgagtcccttgctgttcaatggggtgtacaggatgat 112 R P K D Y W D Y E S L A V Q W G V Q D D 421 tatgaggtggtgaggaaggtaggaaggggaaaatacagtgaggtctttgaaggcattcat 132 Y E V V R K V G R G K Y S E V F E G I H

Ergebnisse

39

481 gctactgataacgagaaatgtgttatcaagattttgaagcctgtgaagaagaagaagatt 152 A T D N E K C V I K I L K P V K K K K I 541 aagagagagattaagattctgcagaacctctgcggtgggcctaatattgtaaaattgctc 172 K R E I K I L Q N L C G G P N I V K L L 601 gacattgttagagatcagcagtctaagacgcccagcttgatatttgaacatgtgaacaat 192 D I V R D Q Q S K T P S L I F E H V N N 661 aaagatttcaaagttctctatccaactctctcagactatgatgttcgatattacattttt 212 K D F K V L Y P T L S D Y D V R Y Y I F 721 gaacttctaaaggcgttggatttctgccattcacgtggaatcatgcacagagatgtgaaa 232 E L L K A L D F C H S R G I M H R D V K 781 ccacataatgtcatgattgatcacgagcagcgaaaacttcgtttaattgactggggtttg 252 P H N V M I D H E Q R K L R L I D W G L 841 gcagaattctatcatcctgggaaagaatacaatgtccgtgttgcttcaaggtactttaag 272 A E F Y H P G K E Y N V R V A S R Y F K 901 ggtccagagctgctggtggatttacaggactatgattattccttagacctatggagtctt 292 G P E L L V D L Q D Y D Y S L D L W S L 961 gggtgtatgtttgctggaatgatattccgcaaggagccgttcttttatggccatgacaac 312 G C M F A G M I F R K E P F F Y G H D N 1021 tatgatcaattggtcaaaattgcgaaggtgcttggcacagatgaactcaacgcctaccta 332 Y D Q L V K I A K V L G T D E L N A Y L 1081 aacaaataccgtatagagttggaccctaatctaacatccctcgtgggcagacatagccgg 352 N K Y R I E L D P N L T S L V G R H S R 1141 aagccatggacaaagttcatcaattctgaaaaccagcacttagcagttcctgaggctgtt 372 K P W T K F I N S E N Q H L A V P E A V 1201 gattttgtggacaagttgctgagatatgatcaccaagaaaggccaacagctaaagaagca 392 D F V D K L L R Y D H Q E R P T A K E A 1261 atggcgcatccatatttctatccgattagaaatgcagagagcagccgtacgccgcgcagc 412 M A H P Y F Y P I R N A E S S R T P R S 1321 cagtgatctcgaaaacatttgcttgttcaatcttctgatttttcatttctttacggattc 432 Q - 1381 aaatttgttataaatcgatctgtcattgtttcattctctcaagtgtgcgtgtgttactgt 1441 tttgctctttctcagtgtttcattcaactcatttgaattttattatataaaaaaaaatat 1501 ccacaagacgggtttcaaaaggt

Abb. 4.1: Nukleotidsequenz (5´ 3´) der cDNA (TAIR‐Datenbank) und abgeleitete Aminosäuresequenz der ATCK2 (At2g23070). Kleine Buchstaben stellen die cDNA‐Sequenz dar und die großen Buchstaben zeigen die Aminosäuresequenz. Die Transitpeptid‐Sequenz wurde unterstrichen. Start‐ und Stop‐Kodons sind fettgedruckt. Die 5´‐ und 3´‐UTRs sind kursiv dargestellt.

4.2 Vergleichende Sequenzanalyse der cpCK2 aus verschiedenen Pflanzen

Datenbank‐Analysen haben bereits gezeigt, dass eine Reihe von Pflanzen ein ATCK2/cpCK2‐

Orthologes Enzym besitzen (Loschelder et al., 2004). Inzwischen sind noch mehr Sequenzen

anderer Pflanzenspezies in der Datenbank für eine putative cpCK2 zu finden. Abbildung 4.2

zeigt ein multiples Sequenz‐Alignment von cpCK2‐Proteinen aus ausgewählten höheren

Pflanzen. Die Sequenzen wurden entsprechend ihrer Ähnlichkeit zu Arabidopsis cpCK2

Ergebnisse

40

geordnet. Die Längen der Transitpeptide wurden mit Hilfe des ChloroP‐Programms ermittelt

und in der Abbildung grün dargestellt. Die Sequenz‐Homologie ist im N‐terminalen Bereich,

d.h. im Bereich der Transitpeptide am geringsten.

Sequenz- identität(%) Ath 100 MALR-------PCTGFTISSLRNASAANNNLFSLLSFSSSSPAKRN----LLLSSLQD-- 47 Sal 88 MAFR-------PIG-YTISSLRKASAANDLRFSFLSIYSSFPAKKN----LLLS------ 42 Bna 87 -------------------------------------SSPSPAKKK----SLLS------ 13 Vvi 77 MAVR---------------PLRFIISHRRLLAFSLRLPSSSSSHLSQSPPSLLV------ 39 Ptr 76 MAIRPFLLQQKLTTILNRQRQKKKNNINKTLFSSLLFIRNNNNNNNNNNPFLFSSPQSSS 60 Mac 74 ------------MAFGPLGSLSLLSRHLQSLAPLLRLPSPPSP----------------- 31 Lpe 74 -------------------------------------MSAAPP----------------- 6 Sbi 74 -------------------------------------MIGAPPP---------------- 7 Hvu 73 -------------------------------------MSDAPP----------------- 6 Zma 73 -------------------------------------MIGASP----------------- 6 Osa 73 -------------------------------------MTDAPPP---------------- 7 Psi 71 -------------------------MAGRPLASHFHILQGATPSFYTSLGQYPLPPQLSP 35 Ath 100 ---NLRRFASSASLYRQHLRNQQQQHQQQQQSRVKE-------KSETLAQKIGKSIR--- 94 Sal 88 ---FLRGFSS---LHRRQQ----------QQSRVN--------KSETLAQKIGKSIR--- 75 Bna 87 ---FLRGFAS---LYR-------------QQPRVN--------KSETLAQKIGKSIR--- 43 Vvi 77 ----FHRLASSPAPLSHPQKSPPPPPPPPSHHRFALS-----SLPETLAQRIGKSVR--- 87 Ptr 76 ISTLLRQFASSTTAFSHQK-----QGQQEIQHRLPHRFRSLVPPPDTLAQKIGKSIR--- 112 Mac 74 -----HHLATYCLAGLHWISGAAGQGSSPSRLRPSAVA----AVAGALAQKIGKAVR--- 79 Lpe 74 ----SKRPP---AS--FVFSTAAAVLIAALASSLIAL------SPRQAPPAAALRP---- 47 Sbi 74 ----WNRLP---TGI-AKPAAAAAVVVAALASSFLALP----RPRAAAPPPAGSGP---- 51 Hvu 73 ----RKRPP---ASS-VARASAAAVVVAALASSFIAL------SPRCTPAAAGSGP---- 48 Zma 73 ----WNRLP---SGI-AKPAAAAAVVVAALASSFLALP----RPR-AAPPPAGSGP---- 49 Osa 73 ----RSRPHPPSSSV-AVPAAAAAVIAAALASSFLALL----QPPRRAPVAAGSRV---- 54 Psi 71 LTGLWSRLRICSASCGSKPKVSRTATVPARVSMVTAVE----ASPASKSAVAAAAAKLAQ 91 . . -----N-terminales Segment------------ Ath 100 -------RAGAPSKARVYADVNVVRPKDYWDYESLAVQWGVQDDYEVVRKVGRGKYSEVF 147 Sal 88 -------RAGAPSKARVYADVNVIKPKDYWDYESLAVQWGAQDDYEVVRKVGRGKYSEVF 128 Bna 87 -------RAGAPSKARVYADVNVIKPKDYWDYESLAVQWGSQDDYEVVRKVGRGKYSEVF 96 Vvi 77 -------RPGAPSKARVYADINVIRPKEYWDYESLTVQWGEQDDYEVVRKVGRGKYSEVF 140 Ptr 76 -------RPGAPSKARVYADINVIRPKDYWDYESLTVQWGEQDDYEVVKKVGRGKYSEVF 165 Mac 74 -------RPGAPSRARVYADINVHRPKDYWDYESLTVQWGEQDDYEVVRKVGRGKYSEVF 132 Lpe 74 ----------IMSKARVYTDVNVVRPKEYWDYEALTVQWGEQDDYEVVRKVGRGKYSEVF 97 Sbi 74 ----------LMSKARVYTDVNVLRPKEYWDYEALTVQWGEQDDYEVVRKVGRGKYSEVF 101 Hvu 73 ----------SMSKARVYTDVNVVRPKEYWDYEALTVQWGEQDDYEVVRKVGRGKYSEVF 98 Zma 73 ----------LMSKAKVYTDVNVLRPKEYWDYEALTVQWGEQDDYEVVRKVGRGKYSEVF 99 Osa 73 ----------GMSKARVYADVNVLRPKEYWDYEALTVQWGEQDDYEVVRKVGRGKYSEVF 104 Psi 71 KIGKSIRRPGVTSKARVYADVNVVRPKEYWDYEALTVQWGDQEDYEVVRKVGRGKYSEVF 151 *:*:**:*:** :**:*****:*:**** *:*****:*********** Ath 100 EGIHATDNEKCVIKILKPVKKKKIKREIKILQNLCGGPNIVKLLDIVRDQQSKTPSLIFE 207 Sal 88 EGIHATDNEKCVIKILKPVKKKKIKREIKILQNLCGGPNIVKLLDIVRDQQSKTPSLIFE 188 Bna 87 EGIHATDNEKCVIKILKPVKKKKIKREIKILQNLCGGPNIVKLLDIVRDQQSKTPSLIFE 156 Vvi 77 EGVHCTDNEKCIIKILKPVKKKKIK----ILQNLCGGPNIVKLLDIVRDQQSKTPSLIFE 196 Ptr 76 EGVHCTDNEKCIIKILKPVKKKKIKREIKILQNLCGGPNIVKLLDIVRDQQSKTPSLIFE 225 Mac 74 EGVHATNNEKCIIKILKPVKKKKIKREIKILQNLCGGPNIIKLLDIVRDQQSKTPSLIFE 192 Lpe 74 EGINVTNSEKCVIKILKPVKKKKIKREIKILQNICGGPNIIKLLDIVRDQHSKTPSLIFE 157 Sbi 74 EGINVNNNEKCIIKILKPVKKKKIKREIKILQNLCGGPNIVKLLDIVRDQHSKTPSLIFE 161 Hvu 73 EGFSVNNSEKCVIKILKPVKKKKIKREIKILQNLCGGPNIIKLLDIVRDQHSKTPSLIFE 158 Zma 73 EGINVNNYEKCIIKILKPVKKKKIKREIKILQNLCGGPNIVKLLDIVRDQHSKTPSLIFE 159 Osa 73 EGINVNNNEKCIIKILKPVKKKKIKREIKILQNLCGGPNIVKLLDIVRDQHSKTPSLIFE 164 Psi 71 EGVNSINNERCIIKILKPVKKKKIKREIKILQNLSEGPNIVKLLDIVRDQQSKTPSLIFE 211 **. : *:*:************* ****:. ****:*********:*********

Ergebnisse

41

Ath 100 HVNNKDFKVLYPTLSDYDVRYYIFELLKALDFCHSRGIMHRDVKPHNVMIDHEQRKLRLI 267 Sal 88 HVNNKDFKVLYPTLSDYDVRYYIYELLKALDFCHSRGIMHRDVKPHNVMIDHEQRKLRLI 248 Bna 87 HVNNKDFKVLYPTLSDYDVRYYIYELLKALDFCHSRGIMHRDVKPHNVMIDHEQRKLRLI 216 Vvi 77 YVNNTDFKVLYPTLSDYDIRYYIYELLKALDYCHSQGIMHRDVKPHNVMIDHEQRKLRLI 256 Ptr 76 YVNNTDFKVLYPTLSDFDIRYYIYELLKALDYCHSQGIMHRDVKPHNVMIDHEQRKLRLI 285 Mac 74 YVNNTDF--------------------KALDYCHSQGIMHRDVKPHNVMIDHQHRKLRLI 232 Lpe 74 YVNNTDFKVLYPTLTDYDIRYYLYELLKALDYCHSQGIMHRDVKPHNVMIDHELRKLRLI 217 Sbi 74 FVNNTDFKVLYPTLTDYDIRYYIYELLKALDYCHSQGIMHRDVKPHNVMIDHELRKLRLI 221 Hvu 73 YVNNTDFKVLYPTLTDYDIRYYLYELLKALDHCHSQGIMHRDVKPHNVMIDHDLRKLRLI 218 Zma 73 FVNNTDFKVLYPTLTDYDIRYYIYELLKALDYCHSQGIMHRDVKPHNVMIDHELRKLRLI 219 Osa 73 YVNNTDFKVLYPTLTDYDIRYYIYELLKALDYCHSQGIMHRDVKPHNVMIDHELRKLRLI 224 Psi 71 YVNNTDFKVLYPTLSDFDIRYYIYELLKALDYCHSQGIMHRDVKPHNVMIDHEHRKLRLI 271 .***.** ****.***:****************: ****** Ath 100 DWGLAEFYHPGKEYNVRVASRYFKGPELLVDLQDYDYSLDLWSLGCMFAGMIFRKEPFFY 327 Sal 88 DWGLAEFYHPGKEYNVRVASRYFKGPELLVDLMDYDYSLDLWSLGCMFAGMIFRKEPFFY 308 Bna 87 DWGLAEFYHPGKEYNVRVASRYFKGPELLVDLMDYDYSLDLWSLGCMFAGMIFRRNPSFM 276 Vvi 77 DWGLAEFYHPGKEYNVRVASRYFKGPELLVDLQDYDYSLDLWSLGCMFAGMIFRKEPFFY 316 Ptr 76 DWGLAEFYHPGKEYNVRVASRYFKGPELLVDLQDYDYSLDLWSLGCMFAGMIFRKEPFFY 345 Mac 74 DWGLAEFYHPGKEYNVRVASRYFKGPELLVDLQDYDYSLDMWSLGCMFAGMIFRKEPFFY 292 Lpe 74 DWGLAEFYHPGKEYNVRVASRYFKGPELLVDLQDYDYSLDMWSLGCMFAGMIFRKEPFFY 277 Sbi 74 DWGLAEFYHPGKEYNVRVASRYFKGPELLVDLQDYDYSLDMWSLGCMFAGMIFRKEPFFY 281 Hvu 73 DWGLAEFYHPGKEYNVRVASRYFKGPELLVDLQDYDYSLDMWSLGCMFAGMIFRKEPFFY 278 Zma 73 DWGLAEFYHPGKEYNVRVASRYFKGPELLVDLQDYDYSLDMWSLGCMFAGMIFRKEPFFY 279 Osa 73 DWGLAEFYHPGKEYNVRVASRYFKGPELLVDLQDYDYSLDMWSLGCMFAGMIFRKEPFFY 284 Psi 71 DWGLAEFYHPGKEYNVRVASRYFKGPELLVDLQDYDYSLDMWSLGCMFAGMIFRKEPFFY 331 ******************************** *******:*************::* * Ath 100 GHDNYDQLVKIAKVLGTDELNAYLNKYRIELDPNLTSLVGRHSRKPWTKFINSENQHLAV 387 Sal 88 GHDNYDQLVKIAKVLGTDELNTYLNRYRIELDPNLASLVGRHSRKPWSKFINSENQHLAV 368 Bna 87 ------------------DMTTMIN----------------------------------- 283 Vvi 77 GHDNYDQLVKIAKVLGTDELNAYLNKYRLELDPHLAALVGRHSRKPWTKFVNADNQHLAV 376 Ptr 76 GHDNYDQLVKIAKVLGTDELNAYLNRYRIELDLHLAALVGRHSRKPWSKFINVDNQHLAV 405 Mac 74 GHDNYDQLVKIAKVLGTDGLNTYLNKYRLELDPQLEALVGRHSRKPWTRFINGDNQHLAV 352 Lpe 74 GHDNHDQLVKIAKVLGTDGLNAYLKKYHIELDPHLEHLVGRHSRKPWSKFINADNQHLVS 337 Sbi 74 GHDNHDQLVKIAKVLGTDGLNAYLNKYHIELDPQLEALVGRHSRKPWAKFINADNQHLVS 341 Hvu 73 GHDNHDQLVKIAKVLGTDSLNAYLKKYHLELDPQLEHLVGRHSRKPWSKFINADNQHLVS 338 Zma 73 GHDNHDQLVKIAKVLGTDGLNAYLNKYHIELDPQLEALVGRHSRKPWSKFMNADNQHLVS 339 Osa 73 GHDNHDQLVKIAKVLGTEALNAYLNKYHIELDPQLEALVGRHSRKPWSKFINADNQHLVS 344 Psi 71 GHDNYDQLVKIAKVLGTDELNAYLNKYRIELDPHLEALVGRHSRKPWSKFINADNQHLVV 391 :.: :: Ath 100 PE-AVDFVDKLLRYDHQERPTAKEAMAHPYFYPIRNAESSR-TPRSQ 432 Sal 88 PE-AVDFVDKLLKYDHQERPTAKEAMAHPYFNPIRNAESSRSTPRAQ 414 Bna 87 ----------------------------------------------- Vvi 77 PE-SIDFLDKLLRYDHQERPTAKEAMAHPYFYPIRNAESSRSRAS-- 420 Ptr 76 PE-AVDFLDKLLRYDHQERPTAKEAMAHPYFYPIRNAESSRTRT--- 448 Mac 74 PEVAVDFVDKLLQYDHQDRPTAKEAMAHAYFIPVRNAESSGRART-- 397 Lpe 74 PE-AIDFLDKLLRYDHQDRLTAREAMAHPYFLQVKAAENSRSRPQ-- 381 Sbi 74 PE-AIDFLDKLLRYDHQDRLTAREAMAHPYFLQVRAVENSRSRPQ-- 385 Hvu 73 PE-AIDFLDKLLRYDHQDRLTAREAMAHPYFLQVRAAENSRARPQ-- 382 Zma 73 PE-AIDFLDKLLRYDHQDRLTAREAMAHPYFLQVRAVENSRTRPQ-- 383 Osa 73 PE-AVDFLDKLLRYDHQDRLTAREAMAHPYFLQVRAAENSRARPQ-- 388 Psi 71 PE-AVDFLDKLLRYDHQERPTAKEAMAHPYFYHVRSAEASRTRAQ-- 435

Abb. 4.2: Multipler Vergleich der cpCK2‐Sequenzen aus verschiedenen Pflanzen. Ath: Arabidopsis thaliana (Accession NP_179889), Sal: Sinapis alba (Accession CAD12663), Bna: Brassica napus (Accession EL590122), Vvi: Vitis vinifera (Accession XP_002284333), Ptr: Populus trichocarpa (Accession XP_002303393), Mac: Musa acuminata (Accession ABF70009), Lpe: Lolium perenne (Accession BAD98469), Sbi: Sorghum bicolor (Accession XP_002463842), Hvu: Hordeum vulgare (Accession BAF03601), Zma: Zea mays (Accession ACG36153), Osa: Oryza sativa (Accession EEC76225), Psi: Picea sitchensis

Ergebnisse

42

(Accession ABK24612). Das Alignment wurde mit ClustalW2 durchgeführt. Putative Transitpeptide sind grün dargestellt. Konservierte CK2α‐Subdomänen wie Nukleotid‐Binderegion (blau) und katalytische Region (rot) wurden ebenfalls hervorgehoben.

Die nukleo‐/cytosolischen CK2α‐Sequenzen besitzen keine Verlängerung am N‐Terminus

und beginnen mit dem CK2‐typischen SKARVY‐Motif (Pinna, 1997) im N‐terminalen Segment

(s. Abb. 4.2).

4.3 Bakterielle Überexpression und Aufreinigung der cpCK2‐Proteine

Um eine vergleichende biochemische und funktionelle Charakterisierung der

chloroplastidären CK2 aus Senf und Arabidosis durchführen zu können, mussten die Proteine

zuerst in ausreichender Menge aufgereinigt werden. Der Überexpressionsklon von cpCK2

aus Senf (SACK2) lag bereits aus Vorarbeiten vor. Die Expression und Aufreinigung des

rekombinanten SACK2‐Proteins erfolgte mittels PQE‐System wie in Ogrzewalla et al. (2002)

beschrieben. Zur bakteriellen Überexpression des Arabidopsis cpCK2‐Proteins (ATCK2)

wurde das pMAL‐Expressionssystem gewählt, da sich die ATCK2‐Expression im Gegensatz zu

SACK2 nicht im pQE‐System induzieren ließ (s. Abb. 4.3 A). Die cDNA von ATCK2 wurde ohne

Transitpeptid in den pMALc2x‐Vektor kloniert. Dieses System ermöglicht die Überexpression

rekombinanter Proteine mit einer N‐terminalen E. coli eigenen MBP (maltose binding

protein)‐Fusion. Die Überexpression in E. coli TB1‐Zellen wurde mit 0,3 mM IPTG induziert

und nach einer Inkubation für 2 h bei Raumtemperatur wurden die Zellen geerntet.

Abbildung 4.3 A zeigt den Induktionstest mit IPTG in pQE30 und pMALc2x. Die Induktion

erfolgte nur im pMAL‐System und die induzierte Probe zeigte bei ca. 85 kDa eine

Überexpressionsbande, welche der Größe des MBP:ATCK2‐Fusionsproteins entspricht. Das

Protein war löslich und konnte über Amylose‐Resin unter nativen Bedingungen in großer

Menge aufgereinigt werden (Abb. 4.3 B). Die Abspaltung des MBP‐Tags durch Faktor‐Xa‐

Protease wurde erfolgreich durchgeführt (Abb. 4.3 C). Dazu wurde das Fusions‐Protein ohne

und mit Faktor‐Xa (1 µg Faktor‐Xa pro 50 µg Protein) für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert.

Nach der SDS‐PAGE wurden die Proteine auf Nitrocellulose‐Membran transferiert und mit

einem monoklonalen CK2α‐Antikörper detektiert. Die Probe mit Faktor‐Xa zeigt zusätzlich zu

der 85 kDa‐Bande eine Bande bei ca. 44 kDa, welche dem cpCK2‐Protein ohne MBP‐Tag

Ergebnisse

43

entspricht. Ein Teil der Proteine lag unter diesen Bedingungen unverdaut vor. Durch

Verlängerung der Inkubationszeit war ein kompletter Verdau des Fusionsproteins durch

Faktor‐Xa möglich (Daten nicht gezeigt).

Abb. 4.3: Rekombinante cpCK2 (ohne TP) aus Arabidopsis. A) SDS‐PAGE mit Rohextrakten aus nicht‐induzierten bzw. induzierten E.coli M15‐ (pQE30) und TB1‐Zellen (pMALc2x) nach Coomassie‐Färbung. B) Fraktionen aus der Amylose‐Säule. Wasch‐Schritten wurden mit 0,2 mM Maltose im Säulenpuffer durchgeführt (jeweils 2 ml). Elution der gebundenen Proteine erfolgte mit 10 mM Maltose (jeweils 500 µl). C) Immunodetektion des unverdauten und durch Faktor‐Xa verdauten cpCK2‐Proteins mit dem monoklonalen CK2α‐Antikörper.

4.4 Vergleichende Funktionsanalyse der cpCK2 aus Senf und Arabidopsis

Die rekombinante cpCK2 aus Arabidopsis wurde zuerst auf ihre katalytische Aktivität, im

Vergleich zur bereits charakterisierten Senf‐cpCK2 (Ogrzewalla et al., 2002), hin überprüft.

Als nicht‐physiologisches Substrat wurde partiell‐dephosphoryliertes Casein verwendet. Die

duale Cosubstratspezifität der CK2α (Fähigkeit, neben ATP auch GTP als Phosphatgruppen‐

donor verwenden zu können) sowie die Hemmbarkeit durch Heparin und einen CK2‐

spezifischen Inhibitor TBB (4, 5, 6, 7‐tetrabromobenzotriazole) wurden getestet. Dazu

wurden Kinase‐Assays mit γ‐32P‐ATP und γ‐32P‐GTP durchgeführt (Abb. 4.4). Die ATCK2 zeigte

in beiden Fällen wie die Senf‐Kinase eine Casein‐Phosphorylierung (Abb. 4.4, vgl. Spur 3 und

4 mit 9 und 10). Die chloroplastidäre CK2 aus Arabidopsis besitzt demnach –wie das

nukleäre/cytosolische Enzym‐ auch eine duale Cosubstratspezifität. In Gegenwart von

Heparin und TBB wurden die Kinaseaktivitäten beider Enzyme vollständig gehemmt (Spur 5,

Ergebnisse

44

6, 11 und 12). Kontroll‐Ansätze mit beiden Kinasen allein (Spur 1 und 8) und mit Casein ohne

Kinase (Spur 2) zeigten keine Phosphorylierungssignale.

Abb. 4.4: Nachweis der Kinase‐Aktivität von ATCK2 im Vergleich zu SACK2. Dargestellt ist ein Autoradiogramm mit radioaktiv phosphoryliertem Casein. Jeweils 2,5 µg cpCK2 pro 50 µl Reaktionsansatz wurde für die Phosphorylierung von 1 µg Casein eingesetzt. Rekombinante Arabidopsis cpCK2 (rechts) kann wie Senf‐cpCK2 (links) Casein sowohl mit γ‐32P‐ATP (Spur 9) als auch mit γ‐32P‐GTP (Spur 10) phosphorylieren. Beide Kinasen lassen sich durch Heparin und TBB in den angegebenen Konzentrationen inhibieren.

Da das TBB‐Reagenz in DMSO gelöst war, wurde die Aktivität auch in Gegenwart von DMSO

allein getestet. Diese Kontrolle zeigte, dass das Lösungsmittel offenbar keinen Einfluss auf

die Kinase‐Aktivität hat (Spur 7). TBB ist wie Heparin ein effektiver CK2α‐Inhibitor. Die

Aktivität von ATCK2 wurde auch nach dem Abspalten des MBP‐Tags getestet (Spur 13).

Gemeinsam mit der Negativkontrolle (MBP allein, nicht gezeigt) zeigt dies, dass die

Kinaseaktivität des Fusionsproteins ausschließlich vom cpCK2‐Anteil stammt.

4.5 Überexpression und Aufreinigung von Sigmafaktoren zur in vitro Phosphorylierung

durch cpCK2

Nach der biochemischen Charakterisierung der ATCK2 waren bereits wichtige methodische

Voraussetzungen gegeben um zu klären, ob ATCK2 in der Lage ist, pflanzliche Sigmafaktoren

als Substrat zu erkennen und sie zu phosphorylieren. Zu diesem Zweck wurden homologe

Sigmafaktoren nach Umklonierung der cDNAs in geeignete bakterielle Expressionsvektoren

Ergebnisse

45

ebenfalls rekombinant hergestellt und aufgereinigt. Überexpressionsplasmide für SIG1 und

SIG2 aus Senf (SASIG1 und SASIG2) sowie SIG1 aus Arabidopsis (ATSIG1) standen bereits aus

anderen Arbeiten in unserer Arbeitsgruppe zur Verfügung (Kreutzenbeck, Diplomarbeit

2000; Berndt, Diplomarbeit 2000; Kolpack, Dissertation 2010). Die Überexpression der

SASIG1 und 2 erfolgte mittels pQE‐Expressionssystem in E. coli M15‐Zellen. Dieses System

ermöglicht eine N‐terminale His‐Tag‐Fusion an die entsprechenden Proteine. Die ATSIG1‐

Expression wurde in pMALc2x‐Vektor in E. coli BL21RIL‐Zellen durchgeführt. Im Rahmen der

vorliegenden Arbeit wurde der Sigmafaktor 6 aus Arabidopsis (ATSIG6) ohne Transitpeptid in

den pMAL2cx‐Vektor kloniert und zur Überexpression eingestzt. Dieses System erlaubt eine

N‐terminale MBP‐Fusion an die entsprechenden Proteine. In Abbildung 4.5.1 sind sämtliche

verwendete Rekombinant‐Faktoren schematisch dargestellt.

Abb. 4.5.1: Verwendete rekombinante Sigmafaktoren. SASIG1‐ und SASIG2‐Protein besitzen einen N‐terminalen 6x‐His‐Tag. ATSIG1 und ATSIG6 wurden dagegen als MBP‐Fusionsproteine exprimiert. Die Abspaltungsstelle für die Protease Faktor‐Xa ist abgebildet. Die Molekulargewichte der Proteine sind in Klammern angegeben. Das MBP‐Protein hat ein Molekulargewicht von 42 kDa.

Die Expression von ATSIG6 ließ sich in E. coli TB1‐Zellen nicht induzieren, jedoch war die

Induktion in BL21RIL‐Zellen möglich (Abb. 4.5.2 A). Die Aufreinigung des MBP‐

Fusionsproteins erfolgte mittels Amylose‐Resin (Abb. 4.5.2 B). Der rekombinante, gut

lösliche Faktor konnte für die weiteren Analysen in großer Menge isoliert werden.

Die aufgereinigten SASIG1‐, SASIG2‐ und ATSIG1‐Proteine wurden mittels SDS‐PAGE

überprüft (s. Abb. 4.5.2 C).

Ergebnisse

46

Abb. 4.5.2: Expression und Reinigung rekombinanter Sigmafaktoren. A) Induktionstest von ATSIG6 in E. coli TB1‐ und BL21RIL‐Zellen. Rohextrakte aus nicht‐induzierten (‐IPTG) und mit 0,3 mM IPTG induzierten Zellen (+IPTG) wurden im SDS‐Gel aufgetrennt und die Proteine wurden mit Coomassie‐Färbung visualisiert. B) SDS‐PAGE der Reinigung von ATSIG6 mittels Amylose‐Resin. Aufgetragen sind die Wasch‐ bzw. Elutionsfraktionen. C) Aufgereinigte SIG1 und SIG2 aus Senf (His:SASIG1 bzw. His:SASIG2) und SIG1 aus Arabidopsis (MBP:ATSIG1).

4.6 In vitro Phosphorylierung der rekombinanten Sigmafaktoren durch cpCK2

Aus Vorarbeiten war bereits bekannt, dass die Phosphorylierung der Sigmafaktoren durch

PTK eine regulatorische Wirkung auf die plastidäre Transkription ausübt (Baginsky et al.,

1997). Die in vitro Analysen zeigten, dass das rekombinante „Gegenstück“ der PTK aus Senf

(cpCK2) die clonierten Senf Sigmafaktoren 1‐3 phosphorylieren kann (Ogrzewalla et al.,

2002; Ogrzewalla, Dissertation 2001). Um zu überprüfen, ob die rekombinante cpCK2 aus

Arabidopsis ebenfalls in der Lage ist, die Sigmafaktoren zu phosphorylieren, wurden in vitro

Kinase‐Assays mit γ‐32P‐ATP durchgeführt. Die rekombinanten Faktoren, SASIG1, SASIG2,

ATSIG1 und ATSIG6, wurden als Substrat in einem Phosphorylierungsansatz mit cpCK2 aus

Senf bzw. aus Arabidopsis eingesetzt (Abb. 4.6). Als Kontrollen wurden SASIG1 (Spur 1) und

ATSIG6 (Spur 9) ohne cpCK2 unter Phosphorylierungsbedingungen inkubiert. Bei beiden

Ansätzen wurde kein Phosphorylierungssignal detektiert. Während der Reaktionsansatz mit

SACK2 allein ohne Substrat (Spur 2) kein Signal zeigte, war beim gleichen Ansatz mit ATCK2

eine Phosphorylierungsbande auf der Höhe der rekombinanten Kinase, bei ca. 87 kDa,

erkennbar (Spur 10). Diese Bande, die am ehesten als Autophosphorylierungssignal

Ergebnisse

47

interpretiert werden kann, war in allen Spuren mit ATCK2 zu finden. Dass die Senf

Sigmafaktoren 1 und 2 Substrate für SACK2 darstellen, war bereits bekannt (Spur 3 und 4).

Sie wurden ebenfalls von ATCK2 als Substrate erkannt und phosphoryliert (Spur 11 und 12)

und entsprechendes gilt für SIG1 und SIG6 aus Arabidopsis (Spur 13 und 14). Umgekehrt

ließen sich ATSIG1 und ATSIG6 auch von der Senf‐Kinase phosphorylieren (Spur 5 und 6). Um

sicher zu stellen, dass das Phosphorylierungssignal bei den MBP‐„getagten“ Faktoren nicht

auf das MBP‐Protein zurückzuführen ist, wurde das ATSIG6‐Protein nach dem Faktor‐Xa‐

Verdau zur Phosphorylierung sowohl durch SACK2 (Spur 7) als auch durch ATCK2 (Spur 15)

eingesetzt. In beiden Fällen war ein Signal bei ca. 56 kDa zu detektieren, welches der Größe

des ATSIG6‐Proteins ohne MBP‐Tag entspricht. Die Signale der Ansätze ohne MBP‐Tag

waren etwas schwächer, besonders bei der Phosphorylierung durch ATCK2. Dies könnte an

dem noch im Ansatz vorhandenen Faktor‐Xa liegen, es könnte jedoch auch auf eine leichte

Denaturierung der Kinasesubstrate im Verlaufe der längeren Reinigungsprozedur

zurückzuführen sein. Das MBP‐Protein allein wird nicht von der cpCK2 als Substrat erkannt

(Spur 8 und 16).

Abb. 4.6: In vitro Phosphorylierung der rekombinanten Sigmafaktoren durch SACK2 und ATCK2. Die Autoradiogramme zeigen die durch SACK2 (links) und ATCK2 (rechts) phosphorylierten Sigma‐Proteine. Es wurden jeweils 5 µg Kinase und 5 µg Sigmafaktor für ein 50 µl Ansatz eingesetzt. Kontroll‐Ansätze mit SASIG1 (Spur 1) und ATSIG6 (Spur 9) ohne Kinase sowie die beiden Kinasen ohne ein exogenes Substrat (Spur 2 und 10) wurden unter den gleichen Reaktionsbedingungen inkubiert. Alle getesteten Sigmafaktoren lassen sich von beiden Kinasen phosphorylieren (Spur 3‐6 und 11‐14). MBP‐Protein (New England Biolabs) zeigte kein Phosphorylierungssignal (Spur 8 und 16). ATSIG6 wurde nach der Abspaltung des MBP‐Tags mit beiden Kinasen phosphoryliert

Ergebnisse

48

(Spur 7 und 15). Sterne zeigen die Phosphorylierungsbanden der Sigmafaktoren. Pfeil deutet auf die Autophosphorylierungs‐bande der ATCK2 an.

Diese Ergebnisse zeigen, dass nicht nur die Senf Sigmafaktoren sondern auch die Sigma‐

Proteine aus Arabidopsis als Substrate für cpCK2 fungieren, unabhängig davon, aus welcher

der beiden Pflanzen die Rekombinant‐Kinase stammt.

4.7 Funktionelle Konsequenzen der Sigmafaktor‐Phosphorylierung

Nachdem gezeigt war, dass mehrere Sigmafaktoren in vitro Substrate der cpCK2 darstellen,

wurde als nächstes getestet, ob diese Phosphorylierung eine funktionelle Bedeutung für die

Aktivität der betreffenden Faktoren hat. Zu diesem Zweck wurden EMSA‐Experimente mit 32P‐markierten Promotorfragmenten und core‐Polymerase aus E. coli durchgeführt (Abb.

4.7). Zur Bildung einer bindungsfähigen RNA‐Polymerase (Holoenzym) wurden die

rekombinanten Sigmafaktoren 1 und 6 aus Arabidopsis eingesetzt. Die Faktoren wurden vor

der Inkubation mit dem core‐Enzym und den radioaktiv‐markierten Promotorfragmenten

durch ATCK2 in Gegenwart von ATP phosphoryliert (ATSIG1‐P/ATSIG6‐P). Die nicht‐

phosphorylierten Faktoren wurden ebenfalls mit ATCK2, jedoch ohne ATP, inkubiert

(ATSIG1/ATSIG6). Als Promotoren wurden psbA‐ (Homann und Link, 2003) und atpB‐

Fragmente (Schweer et al., 2010), die die 5´‐Region des jeweiligen Gens mit den Promotoren

enthalten, verwendet. Die nicht‐markierten psbA‐, atpB‐ sowie trnK‐Promotorfragmente

(Neuhaus und Link, 1987) wurden als Kompetitoren in 20‐fachem molaren Überschuss

eingesetzt. Ein 500 bp DNA‐Fragment aus dem Intronbereich des trnK‐Gens aus Senf

(Bam0.5; Neuhaus und Link, 1987) diente als nicht‐spezifischer Kompetitor. Um eine

unspezifische Bindung der RNA‐Polymerase an die DNA zu verhindern, wurde Poly d[(I‐C)]

(60 ng/µl) dem Ansatz zugegeben. Beide Sigmafaktoren zeigten für sich allein keine DNA‐

Bindungsaktivität (Spur A3, A14, B2 und B15), auch nicht im phosphorylierten Zustand (B9

und B16). Die core‐Polymerase allein war auch nicht in der Lage, spezifisch an die DNA zu

binden (Spur A2 und B3).

Ergebnisse

49

Abb. 4.7: EMSA‐Experimente mit rekombinanten Sigmafaktoren 1 und 6 aus Arabidopsis. Bindungsstudien mit radioaktiv‐markiertem psbA‐ (A) bzw. atpB‐Promotor‐fragmenten (B), E. coli core‐RNA‐Polymerase und nicht‐phosphorylierten (ATSIG1/ATSIG6) bzw. durch ATCK2 vorphosphorylierten (ATSIG1‐P/ATSIG6‐P) Sigmafaktoren. Dargestellt sind die Autoradiogramme der nativen Polyacrylamidgele. Die Kontrollen beinhalten die radioaktiv‐markierten Promotorfragmente allein (Spur A1 und B1), core‐Enzym ohne Sigmafaktor (Spur A2 und B3) sowie die Faktoren allein ohne core‐Polymerase (Spur A3, A14, B2, B9, B15 und B16). Nicht‐markierte psbA‐, atpB‐ und trnK‐Promotorfragmente wurden als Kompetitoren im vollständigen System (Promotor + core‐Polymerase + Sigmafaktor) eingesetzt (Spuren A5‐A7, A16‐A18, A21‐A23, B5‐B7, B11‐B13 und B19‐B21). Ein DNA‐Fragment ohne Promotor, Bam0.5, wurde als nicht‐spezifischer Kompetitor (SpurA8, A13, A19, A24, B8, B14 und B22) verwendet.

Die Rekonstitution des Holoenzyms sowohl mit nicht‐phosphoryliertem (Spur A4) als auch

mit phosphoryliertem ATSIG1‐Protein (Spur A9) führte zu einer Bindung des psbA‐

Promotorfragments. Die Phosphorylierung hatte keinen Einfluss auf die Bindungsaktivität

des ATSIG1‐Proteins an den psbA‐Promotor (vgl. Spur A4 mit A9). Die Spezifität der Bindung

wurde durch Kompetition mit nicht‐markiertem psbA‐Promotor und Bam0.5‐Fragment

analysiert (A5, A8, A10 und A13). Es zeigte sich im Falle des psbA‐Fragments eine deutliche

Abschwächung der Bindungssignale (A5 und A10), während das Bam0.5‐Fragment keine

Ergebnisse

50

kompetitive Wirkung aufwies (A8 und A13). Um die Präferenzen von ATSIG1 für andere

plastidäre Promotoren zu untersuchen, wurden Kompetition‐Experimente mit atpB‐ und

trnK‐Promotorfragmente durchgeführt (Spur A6, A7, A11 und A12). Im Falle von ATSIG1

wurden die Bindungssignale durch nicht‐markierte atpB‐ und trnK‐Promotorfragmente

deutlich abgeschwächt (Spur A6 und A7). Dies bedeutet, dass die core‐Polymerase mit

ATSIG1 an diese beiden Promotoren ebenfalls binden kann. Die Phosphorylierung des

ATSIG1‐Proteins ändert anscheinend seine Präferenz für den atpB‐Promotor, denn die

Bindung ließ sich hier nicht so effektiv mit nicht‐markiertem atpB‐Promotor kompetitieren

(Spur A11). Die Bindung von ATSIG1 an den trnK‐Promotor war durch Phosphorylierung

unbeeinflusst (vgl. Spur A7 mit A12).

Der Sigmafaktor 6 aus Arabidopsis war ebenfalls in der Lage, sowohl im nicht‐

phosphorylierten (ATSIG6) als auch im phosphorylierten Zustand (ATSIG6‐P) an den psbA‐

Promotor zu binden (vgl. Spur A15 mit A20). Während sich das Bindungssignal bei ATSIG6

nicht durch atpB‐ und trnK‐Promotoren schwächen ließ, war die Intensität im Falle von

ATSIG6‐P durch beide Promotorfragmente ersichtlich beeinträchtigt (vgl. Spur A17 und A18

mit A22 und A23). Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass das ATSIG6‐Protein nur im

phosphorylierten Zustand die atpB‐ und trnK‐Promotoren effizient binden kann.

Die oben beschriebenen Promotor‐Bindestudien wurden auch mit radioaktiv‐markiertem

atpB‐Promotorfragment durchgeführt (Abb. 4.7 B). Im Vergleich zu den Experimenten mit

dem psbA‐Promotor waren hier die Bindungssignale bei ATSIG1 und ATSIG1‐P ziemlich

schwach. Phosphoryliertes ATSIG6‐Protein wies eine stärkere Bindung an den atpB‐

Promotor auf als das nicht‐phosphorylierte Protein (vgl. Spur B17 und B18). Das

Bindungssignal ließ sich mit nicht‐markiertem atpB‐Promotor (Spur B20), ebenso wie mit

psbA‐ und trnK‐Fragmente (Spur B19 und B21), jedoch nicht mit Bam0.5, kompetitieren

(Spur B22).

Diese Experimente zeigen deutlich, dass die Phosphorylierung durch rekombinante cpCK2

aus Arabidopsis die Bindungsaktivität der Sigmafaktoren für unterschiedliche Promotoren

regulieren kann.

Ergebnisse

51

4.8 Redoxregulation der Aktivität von cpCK2 aus Arabidopsis in vitro

Frühere Arbeiten gaben Hinweise darauf, dass die Aktivität der plastidären

Transkriptionskinase und ihres rekombinanten Pendants, cpCK2, einer Redoxregulation

unterliegen (Baginsky et al., 1999, Baena‐González et al., 2001, Ogrzewalla et al., 2002). Für

diese Art von Regulation sind die SH‐Gruppen und somit die Cysteine in Proteinen von

großer Bedeutung.

Um die strukturellen und mechanistischen Determinanten, die in die Redoxregulation des

Enzyms involviert sind, zu untersuchen, wurden alle vier Cysteine von ATCK2 einzeln und

doppelt gegen Serin ausgetauscht. Dazu wurde die cDNA der ATCK2 ohne Transitpeptid‐

sequenz im pBSKS‐Vektor mit den entsprechenden Primern (s. 3.8.1) mutiert. Die Konstrukte

wurden anschließend zur bakteriellen Überexpression in den pMALc2x‐Vektor kloniert. Die

Abbildung 4.8.1 zeigt die Positionen der Cystein‐Reste im rekombinanten ATCK2‐Protein. Die

hochkonservierten funktionellen Subdomänen der CK2α‐Untereinheiten, wie

Nukleotidbindungs‐ (NB) und die katalytische Region (K), sind ebenfalls abgebildet. Die

Cystein‐Mutanten wurden je nach der Position des mutierten Cysteinrests als C1, C2, C3, C4,

C2/3, C3/4 und C2/4 bezeichnet.

Abb. 4.8.1: Schematische Darstellung des rekombinanten cpCK2‐Proteins aus Arabidopsis. Die Abbildung gibt eine Übersicht über die Positionen der mutierten Cystein‐Reste sowie die Subdomänen von ATCK2. Bei der Nummerierung der Aminosäuren wurde das 55 Aminosäuren lange Transitpeptid berücksichtigt. C: Cystein, K: katalytische Region, MBP: Maltose‐Bindeprotein, NB: Nukleotidbindungsregion.

Ergebnisse

52

Die Aktivität der Mutanten‐Proteine wurde im Vergleich zum Wildtyp‐Protein in einem

Standard‐Kinaseassay mit 32P‐ATP getestet. Als Substrat wurde Casein verwendet (Abb.

4.8.2). Die Mutanten C1 (Spur 2) und C4 (Spur 5) zeigten keine Kinase‐Aktivität, während die

Aktivität der Kinase durch die Mutation am zweiten (Spur 3) und dritten Cystein (Spur 4)

nicht beeinflusst war. Der gleichzeitige Austausch des zweiten und dritten Cysteins gegen

Serin hatte auch keine Auswirkung auf die Aktivität (Spur 6). Bei diesen Proben war eine

phosphorylierte Casein‐Bande bei 35 kDa zu detektieren. Außerdem wurde bei ca. 87 kDa

ein schwaches Phosphorylierungssignal detektiert, welches auf die Autophosphorylierung

der Kinase hindeutet. Die Doppelmutanten C3/4 und C2/4 wiesen ebenfalls keine Aktivität

auf. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass der erste und vierte Cystein‐Rest für die

Aktivität der Kinase essentiell sind, d. h. Blockierung eines oder beider dieser Reste führt zu

einem dramatischen Aktivitätsverlust, zumindest unter den hier verwendeten in vitro‐

Bedingungen.

Abb. 4.8.2: Aktivitätstest der Cystein‐Mutanten von ATCK2. Die Abbildung zeigt ein Autoradiogramm nach Auftrennung der Phosphorylierungsansätze des Wildtyp‐Proteins (WT) und seiner Derivate mittels SDS‐PAGE (10 %). Phosphoryliertes Substrat Casein zeigt ein Signal bei 35 kDa.

Um zu testen, ob die ATCK2 über ihren Redoxzustand reguliert wird, wurde der Einfluss der

Redox‐Reagenzien GSH, DTT und Diamid auf die Aktivität der Kinase und ihre Cys‐Mutanten‐

Derivate untersucht (Abb. 4.8.3). In Standard‐Reaktionsansätzen mit 32P‐ATP wurde Casein

mit rekombinanter Kinase in Gegenwart jeweils eines dieser Reagenzien inkubiert. Sowohl

Ergebnisse

53

Wildtyp‐ATCK2 (WT) als auch aktive Cystein‐Mutanten (C2, C3 und C2/3) ließen sich durch

GSH komplett inhibieren (Spur A2‐A5 in Abb. 4.8.3). Ein Kontrollansatz mit WT‐Kinase zeigt

die Aktivität ohne Redox‐Reagenzien (Spur A1). Obwohl DTT ebenso wie GSH ein Reduktant

ist, zeigt es keinen Einfluss auf die Kinase‐Aktivität (Spur A6‐A7). Diamid ist ein

Oxidationsmittel, welches die exponierten Cysteine in Proteinen oxidiert (Kosower und

Kosower, 1995). WT‐ und Mutanten‐Proteine reagieren unterschiedlich auf die Diamid‐

Behandlung (Abb. 4.8.3 B). Während das WT‐Protein schon bei 2 mM Diamid‐Konzentration

komplett inhibiert wurde (Spur B3), waren die Mutanten C2 und C2/3 noch aktiv bei dieser

Konzentration (Spur B5 und B8). Noch höhere Konzentrationen von Diamid hatten ebenfalls

keine Auswirkung auf die Aktivität bei diesen Mutanten (Spur B6, B7, B9 und B10). Im

Unterschied dazu war die C3‐Mutante wie WT sensitiv gegenüber Diamid (Spur B11‐B13).

Abb. 4.8.3: Einfluss von Redox‐Reagenzien auf die Aktivität von ATCK2 und ihrer Cystein‐Mutanten. A) Kinasetests mit rekombinanten Proteinen in Gegenwart von 10 mM GSH (links) und 40 mM DTT (rechts). Ein Ansatz mit WT‐ATCK2 ohne Redox‐Reagenzien dient als Kontrolle (Spur A1). B) Effekt von Diamid auf die Aktivität. Phosphorylierungsexperimente wurden in Gegenwart der angegebenen Diamid‐Konzentrationen durchgeführt.

Ergebnisse

54

Der Grund der Inaktivierung der Kinase‐Aktivität bei WT und CYS3 durch Diamid muss die

Oxidation des zweiten Cystein‐Rests sein, denn in denjenigen Mutanten, welchen das zweite

Cystein fehlt, kommt es nicht zur Inhibierung. Da es sich hier um die Oxidation eines einzigen

Cystein‐Rests im Protein handelt, könnte man vermuten, dass das zweite Cystein an einer

intermolekularen Disulfidbrückenbildung mit dem zweiten Cystein eines anderen Kinase‐

Moleküls beteiligt ist und somit zur Dimerisierung führt. Um dies zu testen, wurden die

Diamid‐behandelten WT, C2 und C2/3‐Proteine mittels nicht‐reduzierender PAGE auf

Dimerisierung hin untersucht (Abb. 4.8.4 A). Als Kontrolle wurde das WT‐Protein ohne

Diamid‐Behandlung in einem Probenpuffer ohne Reduktant aufgetragen (Abb. 4.8.4 A, erste

Spur). Die Protein‐Bande bei ca. 170 kDa in der zweiten Spur deutet auf die Dimerbildung

durch Diamid. C2 und C2/3 bilden kein Dimer, denn ihnen fehlt der zweite Cystein‐Rest.

Abb. 4.8.4: Analyse der Dimerisierung von ATCK2. A) Nicht‐reduzierende PAGE (10% Bis‐Tris‐Gel) der WT‐, C2‐ und C2/3‐Proteine. Protein‐Proben wurden vor der Elektrophorese mit Diamid (2 mM) behandelt und anschließend in einem Probenpuffer ohne ein reduzierendes Reagenz (s. 3.1.3, Probenpuffer non‐red) aufgenommen. Ohne vorherige Hitze‐Denaturierung wurden Proteine im Gel aufgetrennt und mit Coomassie‐Färbung sichtbar gemacht. B) Immuno‐Blot der rekombinanten Proteine mittels CK2α‐Antikörper (monoklonal). Die Proteine wurden ohne (‐) und mit (+) DTT im Probenpuffer auf ein 8% iges Bis‐Tris‐Gel aufgetrennt und anschließend auf Nitrocellulose‐Membran geblottet.

Ergebnisse

55

Western‐Blot‐Analysen verstärkten die Annahme, dass das zweite Cystein an einer

intermolekularen Disulfidbrückenbildung beteiligt sein könnte (Abb. 4.8.4 B). In diesem Fall

wurden WT und alle Cystein‐Mutanten nicht mit Diamid behandelt, sondern sie wurden zur

Reduktion möglicher intermolekularen Disulfidbrücken in Probenpuffer ohne und mit DTT

(50 mM) aufgenommen und anschließend im Bis‐Tris‐Gel (8 %) aufgetrennt. Nach dem

Blotten der Proteine auf eine Nitrocellulose‐Membran erfolgte die Immunodetektion mit

monoklonalem CK2α‐Antikörper. Auf dem Blot ist deutlich zu erkennen, dass DTT im

Probenpuffer zu Reduzierung der Dimer‐Bande (170 kDa) bei WT, C1, C3, C4 und C3/4 führt.

Bei den Mutanten C2, C2/3 und C2/4 kommt es nicht zu Dimerbildung, weil der zweite

Cystein‐Rest nicht mehr vorhanden ist.

Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass Cysteine der ATCK2 regulatorische

Funktionen haben können. Cys1 und Cys4 sind wichtig für die Aktivität (vgl. Abb 4.8.2) und

Cys2 ist an der Dimerisierung (intermolekularen Wechselwirkung) der Kinase beteiligt. Die

Dimerisierung führt in dem hier verwendeten in vitro System offenbar zur Inaktivierung der

Kinase (vgl. Abb. 4.8.3 B). Es kann davon ausgegangen werden, dass im authentischen

PEP/cpCK2‐Transkriptionskomplex in vivo andere Interaktionspartner für intermolekulare

(reversible) Disulfidbrückenbildung und Regulation zur Verfügung stehen.

4.9 Zirkular‐Dichroismus Spektroskopie der Cystein‐Mutanten von ATCK2

Mittels Zirkular‐Dichroismus (CD) Spektroskopie lässt sich überprüfen, ob die Cystein‐

Punkmutanten von ATCK2 in einer annäherend gleichen Faltung wie Wildtyp ATCK2

vorliegen. Mit Hilfe dieser Methode können Änderungen in der Sekundär‐ und

Tertiärstruktur eines Mutanten‐Proteins durch den Vergleich mit CD‐Spektren von Wildtyp‐

Protein verfolgt werden (zur Übersicht s. Kelly et al., 2005). Abb. 4.9 zeigt die CD‐Spektren

von rekombinanten C1‐, C2‐, C3‐, C4‐, C2/3‐ und C2/4‐Proteine im Vergleich zu Wildtyp‐

ATCK2 (WT). Die C1‐, C4‐ und C2/4‐Proteine zeigen Unterschiede in ihrer Spektren im

Vergleich zu WT‐ATCK2 und den restlichen Mutanten. Somit scheint die Mutation an Cys1

und Cys4 die Faltung dieser Proteine zu beeinflussen.

Ergebnisse

56

Abb. 4.9: CD‐Spektren der rekombinanten ATCK2 und ihrer Cystein‐Mutanten. Spektren mit jeweils 150 µg/ml Protein wurden in mdeg (millidegrees) als Funktion der Wellenlänge (nm) aufgetragen.

4.10 In vivo Funktionsanalyse der cpCK2 aus Arabidopsis thaliana

4.10.1 Molekulare Charakterisierung der T‐DNA‐Insertionsmutante von cpCK2

Die Möglichkeit zur Anwendung der reversen Genetik bei der Funktionsanalyse von Genen

und Proteinen ist einer der wichtigsten Vorteile der Modellpflanze A. thaliana. Durch die

Untersuchungen an so genannten knockout‐Mutanten, z. B. T‐DNA Insertionsmutanten,

kann die Gen‐/Protein‐Funktion aufgeklärt werden (zur Übersicht s. Krysan et al., 1999).

Zu Beginn dieser Arbeit stand eine A. thaliana T‐DNA‐Insertionsmutante für das cpck2‐Gen

(At2g23070) aus der GABI‐Kat‐Kollektion (Rosso et al., 2003) zur Verfügung (Linien‐

Bezeichnung: GK‐615F11). Anhand der Sequenzierungsdaten für diese Linie aus der GABI‐Kat

Datenbank (Li et al., 2006) wurde die T‐DNA‐Insertionsstelle verifiziiert. Abbildung 4.10.1 A

zeigt die schematische Darstellung des cpck2‐Gens aus Arabidopsis mit der T‐DNA‐Insertion.

Die Insertionsstelle befindet sich im ersten Exon, 6 bp stromabwärts vom Translationsstart.

Durch die T‐DNA‐Insertion ist bereits die Transkription des cpck2‐Gens nicht mehr möglich,

weil das Insert mindestens dreimal so groß ist als das Gen selbst ist (ca. 5000 bp) und

Ergebnisse

57

entsprechend ineffizient abgelesen wird. Es kommt weder zu „sinnvollem“ Spleißen noch zu

Bildung eines funktionellen Proteins.

Abb. 4.10.1: Charakterisierung der T‐DNA‐Insertionsmutante für cpck2 aus Arabidopsis. A) Position der T‐DNA‐Insertion (ganz oben) im Atcpck2‐Gen. Dargestellt ist die Exon/Intron‐Struktur des Gens mit den nummerierten Exon‐Bereichen (graue Kästen). Die Insertionsstelle ist (unterhalb des Gens) detailliert auf der Sequenz gezeigt. P1, P2 und P3 bezeichnen die Positionen von Primern, die für den Homozygotie‐Test verwendet wurden. B) Links: Genomische PCR mit P1, P2 und P3 (P1=CK2HO10, P2=CK2HO2 und P3=CK2HO9, s. 3.1.8). PCR‐Ansätze mit Wildtyp‐ (Col‐0) und Mutanten (∆cpck2)‐DNA enthalten alle drei Primer. Größen der PCR‐Produkte mit entsprechendem Primer‐Paar sind angegeben. Rechts: RT‐PCR mit der cDNA aus Wildtyp und Mutante. Als Primer‐Paar wurde AtCK2_VL1/VL2 (s. 3.1.8) verwendet. 1,3 kb entspricht der Größe des cpck2‐Volllängentranskripts. LB, RB: left border bzw. right border der T‐DNA; sul: Sulfadiazine‐Resistenzmarker.

Ergebnisse

58

Die Samen der 615F11‐Linie lagen als segregierende T1‐Population vor und daher mussten

einzelne Pflanzen aus dieser Population hinsichtlich des Segregationszustandes der T‐DNA

Insertion analysiert werden. Dies erfolgte mittels PCR unter Verwendung von Gen‐ und T‐

DNA‐spezifischer Primer in zwei parallelen PCR‐Ansätzen mit jeweils Wildtyp‐ (Col‐0) bzw.

Mutanten (∆cpck2)‐DNA (Abb. 4.10.1 B). In der PCR‐Reaktion mit der Wildtyp‐DNA entstand

eine 630 bp‐Bande, die der erwarteten Größe des Genom‐spezifischen Primer‐Paars P1/P2

entspricht. Der Ansatz mit der Mutanten‐DNA wies nur ein 850 bp großes P1/P3‐Produkt

und kein P1/P2‐Produkt auf. Das Fehlen des P1/P2‐Produktes im Mutanten‐Ansatz deutet

darauf hin, dass die Mutanten‐Linie homozygot für das mutierte cpck2‐Gen ist, d. h. das Gen

ist auf beiden Chromosomen ausgeschaltet. RT‐PCR‐Analysen mit der cDNA aus Wildtyp und

Mutante zeigten, dass in der Mutante kein cpck2‐Transkript gebildet wird und stellen somit

eine weitere Bestätigung der Homozygotie der Mutanten‐Linie dar.

4.10.2 Phänotypische Charakterisierung der cpck2 knockout‐Mutante

Die knockout‐Mutantenlinie wurde zunächst hinsichtlich morphologischer Auffälligkeiten

unter verschiedenen Bedingungen untersucht. Als erstes wurde getestet, ob die

Mutantenkeimlinge unter photoautotrophen Bedingungen (ohne Saccharose im MS‐

Medium) wachstumsfähig sind. Dazu wurden die Col‐0‐ und Mutanten‐Pflanzen auf MS‐

Medium mit und ohne Saccharose unter Kurztagbedingungen (8h Licht (100 µmol/m2s) / 16h

Dunkel) analysiert (Abb. 4.10.2.1).

Die Mutante zeigte ein verzögertes Wachstum unter mixotrophen Bedingungen (mit

Saccharose im Medium) und hatte wie der Wildtyp grüne Keim‐ und Folgeblätter (Abb.

4.10.2.1, das obere Bild). Photoautotrophe Wachstumsbedingungen waren dagegen letal für

die Mutanten‐Keimlinge (das untere Bild). Die Samen konnten zwar keimen, aber die

Keimlinge waren nicht in der Lage, ohne externe Kohlenstoffquelle weiter zu wachsen.

Ergebnisse

59

∆cpck2Col‐0

+ Saccharose

‐ Saccharose

Abb. 4.10.2.1: Phänotypen der Wildtyp‐ und knockout‐Pflanzen. Die dargestellten Wildtyp (Col‐0)‐ und Mutanten (∆cpck2)‐Pflanzen sind für 12 Tage unter Kurztag‐bedingungen (8h Licht (100 μmol/m2s) / 16h Dunkel) auf MS‐Medium mit 1 % Saccharose (oben) und ohne externe Kohlenstoffquelle (unten) gewachsen.

Um sicher zu stellen, dass der Grund dieses Phänotyps in der Mutante tatsächlich das

Ausschalten des cpck2‐Gens ist, wurde die Mutante mit der cpCK2‐cDNA genetisch

komplementiert. Die cDNA stand unter der Kontrolle des 35S Promotors (P35S) des

Cauliflower Mosaic Virus. Das entsprechende Konstrukt wurde durch Agrobacterium

tumefaciens‐vermittelte Transformation mittels der floral dip Methode in das Genom von A.

thaliana eingebracht. Die Transformanten wurden selektiert und mittels RT‐PCR auf die

Existenz von cpCK2‐Volllängentranskript untersucht. Zur Analyse wurden Pflanzen der T2‐

Generation verwendet. Die komplementierten Pflanzen waren vergleichbar mit den Wildtyp‐

Pflanzen. Sie waren in der Lage, ohne Saccharose im Medium zu wachsen (Abb. 4.10.2.2).

Ergebnisse

60

P35S:cpCK2

+ Saccharose ‐ Saccharose

Abb. 4.10.2.2: Phänotyp der komplementierten Pflanzen. Mit P35S:cpCK2‐Konstrukt komplementierte knockout‐Pflanzen sind für 12 Tage unter Kurztagbedingungen auf MS‐Medium mit 1 % Saccharose (links) und ohne Saccharose (rechts) angezogen.

Die knockout‐Mutante wies gelbliche Keim‐ und Folgeblätter unter Langtagbedingungen

(16h Licht (60 μmol/m2s) / 8h Dunkel) auf (Abb. 4.10.2.3). Dieser Phänotyp war bei 12 Tage

alten Pflanzen stärker ausgeprägt als bei 6 Tage. Die komplementierte knockout‐Pflanze

(P35S:cpCK2) zeigte wie Wildtyp grüne Kotyledonen und Folgeblätter unter gleichen

Bedingungen.

6d

12d

∆cpck2Col‐0 P35S:cpCK2

Abb. 4.10.2.3: Phänotypen der Pflanzen unter Langtagbedingungen. Dargestellt sind die 6 (6d) bzw. 12 Tage (12d) alten Wildtyp (Col‐0)‐, knockout (∆cpck2)‐ und komplementierte (P35S:cpCK2) Pflanzen, die unter Langtagbedingungen auf MS‐Medium mit 1 % Saccharose angezogen wurden.

Ergebnisse

61

4.11 Analyse der Transkriptakkumulation plastidärer Gene in der cpck2‐Mutante

Zur Untersuchung der in vivo Funktion der cpCK2 bei der plastidären Genexpression wurde

die Akkumulation der Transkripte für einige representative Chloroplasten‐Gene mittels

Northern‐Blot untersucht. Dazu wurde die Gesamt‐RNA aus 6 bzw. 12 Tage alten Pflanzen

isoliert und jeweils 1 µg pro Ansatz auf einem denaturierenden Agarosegel aufgetrennt.

Nach dem Blotten der RNA auf positiv geladene Nylonmembran erfolgte die Hybridisierung

mit DIG‐markierten Gen‐spezifischen Sonden.

Abbildung 4.11 zeigt die Ergebnisse der Northern‐Analysen mit Sonden für die plastidären

psbA‐, psaA‐ und atpB‐Gene. Als Kontrolle diente eine Kerngen‐Sonde (actin2). Um zu

überprüfen, ob in allen Spuren die gleiche RNA‐Menge aufgetragen ist, wurde das RNA‐Gel

mit Ethidiumbromid gefärbt (Abb. 4.11, unterste Reihe).

Abb. 4.11: Northern‐Blot‐Analysen der cpck2‐knockout‐Linie im Vergleich zu Wildtyp (Col‐0)‐ und komplementierten Pflanzen (P35S:cpCK2). Gesamt RNA (1 µg/Spur) des Wildtyps, der cpck2‐Mutante und der mit cpCK2‐cDNA retransformierten Linie wurden mit DIG‐markierten Gensonden für psbA, psaA, atpB und actin2 hybridisiert. Die RNAs

Ergebnisse

62

wurden aus 6 bzw. 12 Tage (6d bzw. 12d) alten Langtag‐Pflanzen isoliert. Signifikante Änderungen in der Intensität von Hybridisierungssignalen sind durch (*) markiert (s. Text). Transkriptgrößen der Gene sind links in kb angegeben. Als Beladungskontrolle diente ein Ethidiumbromid‐gefärbtes Gel, welches in allen Spuren die 25S rRNA in gleicher Intensität zeigt (ganz unten).

Die Mutante (∆cpck2) wies eine deutlich reduzierte psbA‐ und atpB‐Transkriptmenge nach

12 Tagen (Sterne) im Vergleich zum Wildtyp auf. Dieser Verlust ließ sich wieder

komplementieren (Abb. 4.11, s. P35S:cpCK2). Das Signal für das psaA‐Transkript war

hingegen in der komplementierten Pflanze (nicht aber in der ∆cpck2‐Mutante) schwächer als

im Wildtyp, sowohl bei 6 als auch bei 12 Tage alten Keimlingen. Umgekehrt scheint das

psbA‐Transkript in der komplementierten Linie sogar stärker als im Wildtyp vorzuliegen. Die

Transkriptmenge für actin2 war in allen Pflanzen unter diesen Bedingungen vergleichbar.

Dies zeigte, dass die T‐DNA‐Insertion und die Retransformation mit dem P35S:cpCK2‐

Konstrukt keinen Einfluss auf die Kern‐Transkription und/oder RNA‐Stabilität hatten.

4.12 In vivo Analysen zur Redoxregulation der cpCK2‐Aktivität

Die in vitro Experimente mit den Cystein‐Mutanten (s. 4.8) zeigten, dass die Cysteine von

cpCK2 regulatorische Funktionen besitzen. Um zu testen, wie sich die Mutationen an den

Cystein‐Resten auf die in vivo Funktion der Kinase auswirken, wurden cpCK2‐Konstrukte, die

jeweils an einem Cystein‐Rest mutagenisiert waren, mit Transitpeptid‐Sequenz in die cpck2‐

knockout‐Pflanzenlinie eingebracht. Die Nachkommen‐Population wurde mittels RT‐PCR auf

die cpCK2‐Volllängen‐cDNA untersucht. Um sicherzustellen, dass die Kandidaten‐Linien

tatsächlich die mutierten Konstrukte enthalten, wurden PCR‐Produkte sequenziert. Im

Ergebnis wurden homozygote Linien erhalten, die jeweils entweder an C1, C2, C3 oder C4

mutagenisierte cpCK2‐cDNA tragen. Abbildung 4.12.1 zeigt die Phänotypen der 6 bzw. 12

Tage alten Cystein‐Mutantenlinien unter Langtagbedingungen. Diejenigen, die C1‐ bzw. C4‐

Mutanten‐Konstrukte enthalten, hatten gelbe Keim‐ und Folgeblätter wie die parentale

knockout‐ Pflanzenlinie (vgl. Abb. 4.10.2.3).

Ergebnisse

63

P35S:cpCK2 C1

6d

12d

P35S:cpCK2 C2 P35S:cpCK2 C3 P35S:cpCK2 C4

Abb.4.12.1: Phänotypen der cpCK2 Cystein‐Mutantenlinien. Dargestellt sind die mit jeweils p35S:cpCK2 C1‐, C2‐, C3‐ oder C4‐Konstrukten retransformierten Pflanzen, die 6 bzw. 12 Tage unter Langtagbedingungen angezogen sind. Kontrolle mit dem Wildtyp‐Konstrukt (P35S:cpCK2) ist in der Abb. 4.10.2.3 zu sehen.

Die Akkumulation der plastidären psbA‐, psaA‐, atpB‐Transkripte in den Cystein‐

Mutantenlinien wurde mittels Northern‐Blot untersucht. Als Kontrolle diente wiederum das

Kerntranskript actin2. Abbildung 4.12.2 zeigt die Expressionsmuster der untersuchten Gene

bei 6 bzw. 12 Tage alten retransformierten Mutanten‐Linien unter Langtagbedingungen.

Ergebnisse

64

Abb.4.12.2: Northern‐Blot‐Analyse der cpCK2 Cystein‐Mutantenlinien. Gesamt RNA (1 µg/Spur) aus den 6 bzw. 12 Tage alten retransformierten Linien wurden mit DIG‐markierten psbA‐, psaA‐, atpB‐ und actin2‐Sonden hybridisiert. Die Pflanzen für die RNA‐Isolierung wurden unter Langtagbedingungen angezogen. Links: Transkriptgrößen der Gene in kb. Unten: Beladungskontrolle 25S rRNA im Ethidiumbromid‐gefärbten Gel.

Die Transkriptionssignale für psbA waren unabhängig vom Alter der Pflanzen in allen

Mutanten vergleichbar. Ebenfalls konnte das Kerntranskript actin2 überall gleichmäßig

detektiert werden. Unterschiede zeigten sich hingegen bei psaA‐ und atpB‐Transkripten: Die

C1‐Mutante (p35S:cpCK2 C1) wies die Transkripte dieser beiden Gene nur in geringer Menge

auf, sowohl bei 6 als auch bei 12 Tage alten Pflanzen. In den C2‐ und C3‐Mutanten waren die

psaA‐ und atpB‐Transkripte bei 6 Tage alten Keimlingen stark, bei 12 Tage alten Pflanzen

jedoch nur in sehr geringer Intensität detektierbar. In der C4‐Mutante schließlich war die

Transkriptmenge aller untersuchten Gene gegenüber dem Wildtyp unbeeinflusst (vgl. Abb.

4.11). Diese Ergebnisse scheinen einen Effekt des in vivo Redoxzustands der SH‐Gruppen von

cpCK2 auf die differentielle Transkription von Chloroplastengenen hinzudeuten. Allerdings

sind die Effekte nur teilweise vergleichbar mit der in vitro‐Situation.

Diskussion

65

5 Diskussion

5.1 Rekombinante cpCK2 (PTK) aus Arabidopsis thaliana

Das erste Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der rekombinanten Herstellung und

Charakterisierung der chloroplastidären CK2 aus Arabidopsis thaliana (ATCK2). Dazu wurde

die cDNA für ATCK2 ohne Transitpeptid (TP) zunächst in den pQE30‐Vektor kloniert, da die

Überexpression der cpCK2 aus Senf (SACK2) in Vorarbeiten erfolgreich in diesem System

durchgeführt werden konnte. Induktionstests in E. coli M15‐Zellen zeigten jedoch, dass eine

Überexpression der ATCK2 in diesem Expressionssystem nicht möglich ist (s. Abb. 4.3.1). Das

„reife“ ATCK2‐Protein (ohne TP) weist eine 95% ige Ähnlichkeit zu SACK2 auf. Diese Proteine

unterscheiden sich in der vorhergesagten Länge ihrer Transitpeptide. Laut dem Vorhersage‐

Programm ChloroP (Emanuelsson et al., 1999) besitzt ATCK2 ein 55 Aminosäure langes

Transitpeptid, während für SACK2 66 Aminosäuren vorhergesagt werden (s. Abb. 4.2). Die

rekombinante ATCK2 enthält eine 30 Aminosäure lange Verlängerung am N‐terminalen

Bereich (Abb. 5.1), die zum Teil Homologien zur Transitpeptidsequenz der SACK2 aufweist (s.

Abb. 5.1, grün markierte Sequenz). Auffällig ist, dass diese Extra‐Sequenz reich an Glutamin

(Q)‐Resten ist. Sie könnte somit die lokale Faltung am N‐Terminus beeinflussen, ohne dass

dies das CD‐Spektrum oder die biochemischen Parameter signifikant beeinflusst. Diese Q‐

reiche Extra‐Sequenz könnte der Grund sein, warum sich ATCK2 in Bezug auf ihre

Induzierbarkeit im pQE30‐System anders als SACK2 verhält.

Hingegen konnte die ATCK2 erfolgreich in dem pMALc2x‐Vektor in E. coli TB1‐Zellen

überexprimiert und in ausreichender Menge als MBP‐Fusion isoliert werden. Das pMAL‐

System ist dafür bekannt, dass es sich oft günstig auf die Löslichkeit und/oder Faltung sonst

"schwieriger" Fusionsproteine auswirkt (zur Übersicht s. Waugh, 2005).

Diskussion

66

ATCK2(ohne TP) ASLYRQHLRNQQQQHQQQQQSRVKEKSETLAQKIGKSIRRAGAPSKARVYADVNVVRPKD 60

SACK2(ohne TP) --LHRR----------QQQQSRVN-KSETLAQKIGKSIRRAGAPSKARVYADVNVIKPKD 47 *:*: *******: ******************************::*** Nukleotid-Bindung ATCK2(ohne TP) YWDYESLAVQWGVQDDYEVVRKVGRGKYSEVFEGIHATDNEKCVIKILKPVKKKKIKREI 120 SACK2(ohne TP) YWDYESLAVQWGAQDDYEVVRKVGRGKYSEVFEGIHATDNEKCVIKILKPVKKKKIKREI 107 ************.*********************************************** ATCK2(ohne TP) KILQNLCGGPNIVKLLDIVRDQQSKTPSLIFEHVNNKDFKVLYPTLSDYDVRYYIFELLK 180 SACK2(ohne TP) KILQNLCGGPNIVKLLDIVRDQQSKTPSLIFEHVNNKDFKVLYPTLSDYDVRYYIYELLK 167 *******************************************************:**** katalytische Region ATCK2(ohne TP) ALDFCHSRGIMHRDVKPHNVMIDHEQRKLRLIDWGLAEFYHPGKEYNVRVASRYFKGPEL 240 SACK2(ohne TP) ALDFCHSRGIMHRDVKPHNVMIDHEQRKLRLIDWGLAEFYHPGKEYNVRVASRYFKGPEL 227 ************************************************************ ATCK2(ohne TP) LVDLQDYDYSLDLWSLGCMFAGMIFRKEPFFYGHDNYDQLVKIAKVLGTDELNAYLNKYR 300 SACK2(ohne TP) LVDLMDYDYSLDLWSLGCMFAGMIFRKEPFFYGHDNYDQLVKIAKVLGTDELNTYLNRYR 287 **** ************************************************:***:** ATCK2(ohne TP) IELDPNLTSLVGRHSRKPWTKFINSENQHLAVPEAVDFVDKLLRYDHQERPTAKEAMAHP 360 SACK2(ohne TP) IELDPNLASLVGRHSRKPWSKFINSENQHLAVPEAVDFVDKLLKYDHQERPTAKEAMAHP 347 *******:***********:***********************:**************** ATCK2(ohne TP) YFYPIRNAESSR-TPRSQ 377 SACK2(ohne TP) YFNPIRNAESSRSTPRAQ 365 ** ********* ***:*

Abb. 5.1: Aminosäurensequenz‐Vergleich von ATCK2 und SACK2 ohne ihre Transitpeptide. Das Alignment wurde mit Hilfe von ClustalW (Larkin et al., 2007) durchgeführt. Identische Aminosäuren (*) sind grau markiert. Transitpeptid‐Anteil der SACK2 ist mit grünen Buchstaben dargestellt. Funktionelle Domänen sind fett gedruckt. TP: Transitpeptid, (:): konservierte und (.): schwach konservierte Aminosäureaustausche.

Die mittels unterschiedlicher Expressionssysteme hergestellte ATCK2 und SACK2 wurden auf

ihre katalytische Aktivität hin untersucht. Die rekombinante SACK2 wurde bereits funktionell

charakterisiert und weist die Eigenschaften der katalytischen α‐Untereinheit der CK2‐

Proteinkinase auf (Ogrzewalla et al., 2002). Sie wurde als das rekombinante „Gegenstück“

zur authentischen PTK (Baginsky et al., 1997 und 1999) verifiziert (Ogrzewalla et al., 2002).

Eine vergleichende Funktionsanalyse von ATCK2 mit SACK2 (s. Abb. 4.4) zeigte, dass ATCK2

genauso wie SACK2 katalytisch aktiv ist. Dass es sich bei dieser Aktivität um eine CK2‐

typische Proteinkinase‐Aktivität handelt, konnte durch Experimente mit ATP bzw. GTP als

Cosubstrat und CK2‐spezifischen Inhibitoren wie Heparin und TBB nachgewiesen werden.

Diese Eigenschaften sind charakteristisch für CK2 und werden zur Identifizierung der CK2‐

Diskussion

67

Aktivität benutzt (Niefind et al., 1999; Hathaway und Traugh, 1982; Sarno et al., 2001). Trotz

der N‐terminalen Verlängerung wies das rekombinante ATCK2‐Protein hinsichtlich seiner

biochemischen und funktionellen Eigenschaften keinen Unterschied zu SACK2 auf.

Ein weiterer Vergleich zwischen rekombinanter ATCK2 und SACK2 wurde bezüglich ihrer

Substraterkennung durchgeführt. Aus Vorarbeiten ist bekannt, dass die SACK2 die

rekombinanten Sigmafaktoren 1‐3 aus Senf phosphorylieren kann (Ogrzewalla et al., 2002;

Ogrzewalla, Dissertation 2001). Um die Frage zu klären, ob die Sigmafaktoren ebenfalls

Substrate für ATCK2 darstellen, wurde die Phosphorylierung der rekombinanten Senf‐

Sigmafaktoren 1 und 2 (SASIG1 und SASIG2) und Arabidopsis‐Sigmafaktoren 1 und 6 (ATSIG1

und ATSIG6) untersucht (s. Abb. 4.6). Dabei zeigte sich, dass alle Sigmafaktoren sich durch

beide Kinasen phosphorylieren lassen. Die CK2‐Phosphorylierungsstellen innerhalb von

ATSIG6 wurden sowohl in vivo als auch in vitro mittels Mutagenesestudien analysiert

(Schweer et al., 2010). Es stellte sich dabei heraus, dass in ATSIG6 mehrere

Posphoakzeptorstellen Ziele für cpCK2‐Phosphorylierung sind.

5.2 Autophosphorylierung der ATCK2

In vitro Phosphorylierungsexperimente mit Sigmafaktoren als Substrate zeigten, dass die

ATCK2 –im Gegensatz zu SACK2– eine Autophosphorylierung aufweist (vgl. Abb. 4.6). Die

Autophosphorylierungsbande der ATCK2 bei ca. 87 kDa war ebenfalls in den Experimenten

mit Casein als Substrat zu detektieren, jedoch unter anderen Expositionseinstellungen (vgl.

Abb. 4.4 und 4.8.2). Da in der Abb. 4.4 Casein stöchiometrisch ein viel stärkeres

Phosphorylierungssignal als die ATCK2 aufweist, ist die ATCK2‐Autophosphorylierungsbande

unter diesen Einstellungen nicht sichtbar.

Wo findet diese Autophosphorylierung in ATCK2 statt? Warum zeigt SACK2 keine

autokatalytische Phosphorylierung? Wie bereits in der Abb. 5.1.1 dargestellt wurde, ist die

Aminosäurezusammensetzung der beiden rekombinanten Kinasen bis auf die N‐terminale

Verlängerung der ATCK2 nahezu identisch. Die wenigen Aminosäureaustausche ergeben

auch keine zusätzlichen CK2‐Phosphorylierungsstellen in der ATCK2‐Sequenz. Daher ist es

denkbar, dass die Autophosphorylierungsstelle(n) entweder in der N‐terminalen

Diskussion

68

Verlängerung oder im MBP‐Tag lokalisiert sein könnte(n). Die Kontrollen unter Verwendung

des MBP‐Proteins (New England Biolabs) zeigten jedoch keine MBP‐Phosphorylierung (vgl.

Abb. 4.6). Phosphorylierung des mit Faktor‐Xa geschnittenen ATSIG6‐Proteins deutet

ebenfalls darauf hin, dass MBP nicht phosphoryliert wird. Obwohl einige Vorhersage‐

Programme mehrere potentielle CK2‐Phosphorylierungsstellen innerhalb des MBP‐Proteins

erkennen, werden diese anscheinend in vitro nicht benutzt. Die 30 Aminosäuren lange N‐

terminale Extra‐Sequenz der ATCK2 im Vergleich zu SACK2 wurde auf potentielle CK2‐

Phosphorylierungsstellen mittels der Vorhersage‐Programme NetPhosK (Blom et al., 2004)

und GPS 2.1 (Xue et al., 2008) untersucht. Aufgrund der Ergebnisse beider Programme

wurde Serin an Position 27 als potentielle Phosphoakzeptorstelle für CK2 erkannt (Daten

nicht gezeigt). Es befindet sich zwar an der (n+3)‐Stelle hinter diesem Serin keine saure

Aminosäure (D/E) wie bei einer "klassischen" CK2 Phosphorylierungsstelle; es ist jedoch

bekannt, dass auch die (n+1)‐Position mitentscheidend für die Substraterkennung durch

CK2‐Proteinkinasen sein kann (Meggio und Pinna, 2003).

Aus Vorarbeiten war bekannt, dass die in vitro Phosphorylierung der authentischen PTK aus

Senf‐Chloroplasten durch eine exogene Kinase (katalytische Untereinheit der Proteinkinase

A, PKA) zur Inaktivierung des Enzyms führt (Baginsky et al., 1999). Dies konnte mit der

rekombinanten SACK2 nicht gezeigt werden, da sich diese nicht durch PKA phosphorylieren

ließ (Ogrzewalla, nicht‐veröffentlichte Daten). Eine Autophosphorylierung der SACK2 war in

diesen früheren Arbeiten nicht detektierbar.

Für Präparate nukleärer/cytosolischer CK2 (Holoenzym, α2β2) wird von einer Auto‐

phosphorylierung an der CK2β‐Untereinheit berichtet (Dahmus und Natzle, 1977; Pinna,

1990). Eine regulatorische Funktion dieser Autophosphorylierung für CK2 konnte jedoch

nicht nachgewiesen werden –ebenso wenig wie eine Fremdphosphorylierung durch eine

andere Kinase– (Meggio et al., 1993). Innerhalb der CK2α‐Familie wurde bisher nur von einer

autokatalytischen Tyrosin‐Phosphorylierung berichtet, dessen funktionelle Bedeutung

ebenfalls ungewiss ist (Donella‐Deana et al., 2001).

Diskussion

69

Im Falle der ATCK2 zeigt die Autophosphorylierung auch keinen Einfluss auf ihre katalytische

Aktivität. Sie scheint keine physiologische Bedeutung für die Regulation der cpCK2 zu

besitzen. Aus diesem Grund wurde die Autophosphorylierung der rekombinanten ATCK2

nicht weiter untersucht.

5.3 Einfluss der Phosphorylierung durch cpCK2 auf die Sigmafaktor‐Aktivität

Phosphorylierung ist vielleicht die bestuntersuchte posttranslationale Modifikation, die

Protein‐Aktivitäten direkt regulieren kann. In vielen Signaltransduktionswegen spielt sie eine

wichtige Rolle bei der Regulation der eukaryotischen Genexpression und Zellfunktion (zur

Übersicht s. Brivanlou und Darnell, 2002). Dabei sind Transkriptionsfaktoren wichtige Ziele

für solche Modifikationen. Vielleicht nicht unerwartet, kommt dieser universelle

Regulationsmechanismus nicht zuletzt auch in Plastiden vor: So konnte gezeigt werden, dass

der Phosphorylierungszustand der Sigma‐Transkriptionsfaktoren in Senf‐Chloroplasten und

Etioplasten regulatorisch auf die plastidäre Transkription wirkt (Tiller und Link, 1993b;

Baginsky et al., 1997). Dabei spielt PTK/cpCK2 als terminale (endständige) Transkriptions‐

kinase, die ihrerseits einer Phosphorylierungskontrolle durch vorgeschaltete "Aufwärts"‐

Kinase(n) zu unterliegen scheint, eine wichtige Rolle (Baginsky et al., 1997; Ogrzewalla et al.,

2002).

Nachdem im ersten Schritt der vorliegenden Arbeit gezeigt wurde, dass die Sigmafaktoren

SASIG1, SASIG2, ATSIG1 und ATSIG6 durch cpCK2 aus Senf und Arabidopsis phosphoryliert

werden (vgl. Abb. 4.5.2), ging es im nächsten Schritt darum, den Einfluss dieser

Phosphorylierung auf die Promotorbindungsaktivität der rekombinanten Faktoren zu

studieren. Dies wurde am Beispiel von ATSIG1 und ATSIG6 untersucht. Beide Proteine

wurden durch ATCK2 phosphoryliert und anschließend in DNA‐Bindungsstudien eingesetzt.

Es konnte gezeigt werden, dass ATSIG1 und ATSIG6 durch die Phosphorylierung ihre

Präferenzen für die getesteten Promotoren ändern (vgl. Abb. 4.7). Im Falle von ATSIG1 führt

die Phosphorylierung zu Reduktion der Bindung des Faktors an den atpB‐Promotor. Die

ATSIG1‐Bindung an psbA‐ und trnK‐Promotoren ist jedoch nahezu unbeeinflusst durch

Phoshorylierung. Für Sigmafaktor 1 konnte bisher keine Promotor‐/Gen‐spezifische Funktion

Diskussion

70

zugeordnet werden. Verschiedene Daten deuten darauf hin, dass dieser Faktor eine

generelle Funktion in der plastidären Genexpression ausübt (Tanaka et al., 1997;

Kestermann et al., 1998; Tozawa et al., 1998; Kanamaru et al., 1999; Morikawa et al., 1999).

Die Aktivität dieses Proteins wird möglicherweise über ein Interaktionspartner, das sog.

sigma binding protein 1 (SIB1), reguliert (Morikawa et al., 2002).

Im Gegensatz zu ATSIG1 bindet der phosphorylierte ATSIG6 viel stärker als der nicht‐

phosphorylierte Faktor an den atpB‐Promotor (vgl. Abb. 4.7). Kompetitionsexperimente mit

dem trnK‐Promotor deuten darauf hin, dass die ATSIG6‐Bindung an den trnK‐Promotor

ebenfalls durch Phosphorylierung des Faktors begünstigt wird. Für die Bindung an den psbA‐

Promotor scheint der Phosphorylierungszustand hingegen nicht entscheidend zu sein. In vivo

Mutations‐Analysen mit ATSIG6 zeigen ebenfalls, dass die Phosphorylierung von ATSIG6 für

seine atpB‐spezifische Bindungsaktivität wichtig ist (Schweer et al., 2010).

Diskussion

71

5.4 In vitro Analyse zur Redoxregulation der ATCK2‐Aktivität

Sowohl in vitro als auch in vivo existieren Hinweise darauf, dass die Aktivität der PTK/cpCK2

über ihren Redoxzustand reguliert wird. Es wurde gezeigt, dass reduziertes Glutathion (GSH)

die cpCK2‐Aktivität inhibiert (Baginsky et al., 1999; Baena‐Gonzáles et al., 2001, Ogrzewalla

et al., 2002). Ziel der vorliegenden Arbeit war, den genauen Mechanismus dieser Regulation

zu analysieren. Es ist bekannt, dass bei der Redoxregulation von Proteinen die Cystein‐Reste

eine wichtige Rolle spielen. Deshalb wurden die Cysteine innerhalb der rekombinanten

ATCK2 einzeln bzw. paarweise mutiert und die Auswirkung dieser Mutation(en) auf die

Aktivität der entsprechenden Proteine untersucht (vgl. Abb. 4.8.1). Es zeigte sich, dass Cys1

und Cys4 für die Aktivität der rekombinanten Kinase essentiell sind. Dies könnte drauf

hinweisen, dass Cys1 und Cys4 möglicherweise an einer intermolekularen

Disulfidbrückenbildung beteiligt sind. CD‐spektroskopische Analysen mit den Cystein‐

Mutanten zeigen, dass Cys1‐, Cys4‐ und Cys2/4‐Mutanten eine im Vergeich zum Wildtyp‐

Protein veränderte Faltung aufweisen. Möglicherweise ist diese Änderung auf die Zerstörung

der intermolekularen Disulfidbrücke zurückzuführen. Der Einzel‐Austausch der Cys2‐ oder

Cys3‐Reste bzw. Austausch beider Cys Reste gleichzeitig, hatte hingegen keinen Einfluss auf

die Phosphorylierungsaktivität der Kinase. Somit scheinen diese Cysteinreste keine wichtige

Rolle für die Aktivität zu spielen.

Um weitere Einblicke in die Redoxregulation der ATCK2 zu bekommen, wurde die

Empfindlichkeit der Kinase und ihrer aktiven Cystein‐Mutanten gegenüber Redoxreagenzien

wie GSH, DTT und Diamid getestet (vgl. Abb. 4.8.3). GSH wirkte inhibierend auf Wildtyp‐ und

Mutanten‐Proteine, während DTT keinen Effekt zeigte. Der Effekt von GSH und DTT wurde in

Vorarbeiten ebenfalls mit PTK und rekombinanter cpCK2 aus Senf beobachtet (Baginsky et

al., 1999; Ogrzewalla et al., 2002). Beide Reagenzien sind Reduktanten, d.h. sie üben eine

reduzierende Wirkung auf die Proteine aus. GSH ist, anders als DTT, ein Monothiol‐

Reduktant. Es kann gemischte Disulfide mit den Cystein‐Resten der Zielproteine bilden und

ihre Aktivitäten modulieren (zur Übersicht s. Shelton et al., 2005). Diese Art von

posttranslationaler Modifikation wird als Glutathionylierung bezeichnet.

Diskussion

72

Es stellte sich die Frage, über welchen Mechanismus GSH die Kinase inaktiviert; durch

Reduktion der Disulfide innerhalb ATCK2 oder durch Glutathionylierung?

Die in vitro Analyse mit den Cys‐Mutanten lieferten Hinweise darauf, dass die Mutationen an

Cys1 und Cys4 möglicherweise aufgrund der Zerstörung einer intramolekularen

Disulfidbrücke zu einem Aktivitätsverlust führt. Sollte dies der Fall sein, müsste die Wildtyp‐

Kinase sowohl durch GSH als auch durch Dithiol‐Reduktant DTT (zerstört die Disulfidbrücken)

inaktiviert werden. Dies ist jedoch für DTT nicht der Fall. Eine mögliche Erklärung dafür wäre,

dass vielleicht die Disulfidbrücke innerhalb der ATCK2 zwar zugänglich für GSH, jedoch nicht

für DTT, ist. Monothiol‐ und Dithiol‐Reduktanten können sich in ihrer Wirkung

unterschiedlich verhalten (Trebitsh et al., 2000). Weiterhin ist möglich, dass der

Aktivitätsverlust der C1‐ und C4‐Mutanten nicht allein auf die Zerstörung der Disulfidbrücke

zurückzuführen ist, sondern gleichzeitig auf das Fehlen dieser hochkonservierten

Aminosäure‐Reste. Die Inaktivierung der Wildtyp‐Kinase durch GSH könnte man in diesem

Fall durch Bildung gemischter Disulfide zwischen GSH und ATCK2 erklären. Da die C2‐, C3‐

und C2/3‐Mutanten ebenfalls empfindlich gegenüber GSH reagieren, ist es denkbar, dass

GSH mit Cys1 und/oder Cys4 gemischte Disulfide bilden kann. Um diese These zu kräftigen,

sind jedoch weitere Untersuchungen nötig.

Ein unerwartetes, interessantes Ergebnis lieferten die Experimente mit dem Oxidationsmittel

Diamid. Es wirkte unterschiedlich auf die Aktivität der rekombinanten Proteine. Wildtyp und

C3‐Mutante ließen sich durch Diamid schon bei niedrigen Konzentrationen vollständig

inhibieren, während auch höhere Diamid‐Konzentrationen auf die Aktivität der C2‐ und

C2/3‐Mutanten keinen Einfluss hatten. Die Frage nach dem Grund der Diamid‐„Resistenz“

ließ sich durch einfache gelelektrophoretische und immunologische Analysen beantworten.

Es stellte sich dabei heraus, dass das Cys2 an einer intramolekularen Disulfidbrückenbildung

beteiligt ist (vgl. Abb. 4.8.4 A). Proteine, die eine Mutation am zweiten Cystein trugen,

bildeten keine Dimere. Aus nukleären/cytosolischen CK2‐Proteinkinasen bei Menschen ist

eine Dimerbildung nur für die CK2β‐Untereinheiten bekannt (Gietz et al., 1995; Kusk et al.,

1995; Boldyreff et al., 1996). Es wurden keine Dimere bei CK2α‐Untereinheiten aus Mensch

und Drosophila (Birnbaum et al., 1992) beobachtet. Dass die CK2α‐Untereinheiten Dimere

Diskussion

73

bilden können, wurde bisher ausschließlich für pflanzliche CK2αs beschrieben (Yan und Tao,

1982; Erdmann et al., 1982).

Anders als tierische CK2αs verfügen pflanzliche CK2α‐Untereinheiten, einschließlich ATCK2,

über vier Cysteine (vgl. Abb. 4.8.1). Die C‐terminal gelegenen Cysteine, Cys3 und Cys4, sind

innerhalb aller CK2α‐Untereinheiten aus tierischen und pflanzlichen Organismen hoch

konserviert, während die Cys1 und Cys2 lediglich in pflanzlichen CK2αs vorkommen. Dies

steht im Einklang mit der Dimerbildung der CK2α‐Untereinheiten aus pflanzlichen

Organismen, jedoch nicht aus tierischen.

Betrachtet man alle vier Cysteine der ATCK2 in der 3D‐Struktur, so sieht man, dass sich nur

das zweite Cystein an der Oberfläche des Proteins befindet (s. Abb. 5.4). Dies liefert ein

weiteres Argument dafür, dass am Cys2‐Rest eine Dimerbildung strukturell auch möglich ist.

Dimerisierung als ein Regulationsmechanismus konnte bereits durch zahlreiche Studien

gezeigt werden (Klemm et al., 1998; Williams et al., 2005; Yamaguchi et al., 2006;

Rajakulendran et al., 2009). Man könnte somit postulieren, dass die Aktivität der cpCK2 in

Plastiden durch Bildung von Homodimeren und/oder auch Heterodimeren mit anderen

regulatorischen Interaktionspartnern moduliert werden könnte. Angesichts der großen

Anzahl proteomisch identifizierter Komponenten des plastidären Transkriptionsapparats

(Ogrzewalla et al., 2002, Loschelder et al., 2004) ist diese Erklärung plausibel, wenn auch

nicht experimentell leicht nachprüfbar.

Diskussion

74

Abb. 5.4: Strukturmodell plastidärer ATCK2. Die Abbildung zeigt die Lage der Cysteine innerhalb ATCK2. Die Oberflächen‐Darstellung (rechts) präsentiert den exponiert vorliegenden Cys2‐Rest. Die konservierten Subdomänen sind ebenfalls im gleichen Farbcode wie links dargestellt. Die Struktur wurde unter Verwendung von CPHmodels (Lund et al., 2002) berechnet. Die graphische Darstellung erfolgte mit Hilfe des PyMOL‐Programms (DeLano, 1998). Als Grundlage für die Berechnungen diente die nucleo‐/cytosolische CK2α‐Untereinheit aus Mais (Niefind et al., 1998).

5.5 In vivo Funktionsanalyse der cpCK2 aus Arabidopsis thaliana

Zum Verständnis der Funktion der cpCK2 in der plastidären Genexpresion waren die in

planta Untersuchungen von großem Interesse. Diese Möglichkeit bot die cpck2‐T‐DNA‐

Insertionsmutante aus Arabidopsis thaliana (GABI‐Kat‐Linie). Durch PCR‐Analysen wurde die

Homozygotie der Mutanten‐Linie sowie die Abwesenheit der cpck2‐Transkript in der

Homozygoten‐Pflanze nachgewiesen. Der Effekt dieser Mutation auf den visuellen und

molekularen Phänotyp wurde untersucht. Die Analysen hinsichtlich des visuellen Phänotyps

der cpck2‐Mutante zeigten, dass die Mutantenlinien unter photoautotrophen Bedingungen

keimlingsletal sind (vgl. Abb. 4.10.2.1). Sie waren nicht in der Lage, Photosynthese zu

treiben, daher waren sie auf eine externe Kohlenstoff‐Quelle angewiesen. Dieser Phänotyp

wird durch Retransformation der knockout‐Linie mit dem P35S:cpCK2‐Konstrukt, Wildtyp‐

cDNA hinter dem 35S‐Promotor, wieder kuriert (vgl. Abb. 4.10.2.2), was darauf hindeutet,

dass der letale Phänotyp auf das Fehlen der cpCK2 zurückzuführen ist. Es ist denkbar, dass

Diskussion

75

die cpCK2 eine Funktion in der Entwicklung der Chloroplasten besitzt. Da die Keimlinge kurz

nach der Keimung abstarben, könnte man denken, dass bei ihnen ein Wechsel vom

heterotrophen zum photoautotrophen Wachstum nicht mehr möglich war.

Unter mixotrophen Bedingungen zeigten die Mutanten‐Keimlinge ein leicht verzögertes

Wachstum bei einem Alter von 6 Tagen (vgl. Abb. 4.10.2.3). Nach 12 Tagen waren sie in ihrer

Größe vergleichbar mit dem Wildtyp, hatten jedoch gelbe Keim‐ und Folgeblätter unter

Langtagbedingungen. Dies könnte auf eine Störung in der Synthese oder Anreicherung von

Chlorophyll in den Mutanten hindeuten.

Der Effekt der cpck2‐Mutation auf die plastidären RNA‐Muster für die psbA‐ (codiert für D1‐

Protein von Photosystems II (PSII)), psaA‐ (codiert für A‐Untereinheit von PSI) und atpB‐Gene

(codiert für die β‐Untereinheit der ATP‐Synthase) wurde mittels Northern‐Blot unter

Verwendung von DIG‐markierten Gensonden untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass die

knockout‐Mutante eine starke Reduktion in der psbA‐ und atpB‐Transkriptmenge bei 12

Tage alten Pflanzen aufweist. Unter gleichen Bedingungen weist die komplementierte Linie

eine Erhöhung in der psbA‐Transkriptmenge auf, während das psaA‐Transkript durch die

Komplementation reduziert wird. Ein solcher Effekt, d.h. entgegengesetzte Veränderungen

in den Transkriptmengen der plastidären psbA‐ und psaA‐Genen wird oft mit den

Änderungen in der Photosystem‐Stöchiometrie korreliert (zur Übersicht s. Pfannschmidt und

Liere, 2005). Dies erfolgt als eine Langzeit‐Antwort auf die wechselnden Lichtqualitäten an

beiden Photosystemen. D. h. wird PSI bevorzugt belichtet, ändert sich die PS‐Stöchiometrie

zugunsten von PSII und die Expression der PSII‐Gene wird hochreguliert. Unter PSII‐

Belichtung passiert das Umgekehrte. Diese Fein‐Regulation wird über den Redoxstatus des

Plastoquinon‐Pools kontrolliert. Im Falle der komplementierten ∆cpck2‐Linie könnte man

diesen Effekt auf die transiente Expression der cpCK2‐Volllängen‐cDNA unter der Kontrolle

des P35S‐Promotors zurückführen. Möglicherweise ist die starke cpCK2‐Expression in der

komplementierten Linie unter diesen Bedingungen durch einen PSI/PSII‐Shift zu

kompensieren.

Diskussion

76

5.6 In vivo Analysen zur Redoxregulation der cpCK2‐Aktivität

Die Redoxregulation der plastidären Genexpression erfolgt durch redoxaktive Komponenten,

die als Sensor für zelluläre Redoxsignale fungieren, welche z.B. während der Photosynthese

generiert werden. Die Frage, wie diese Signale auf der Ebene der Genexpression übermittelt

werden, bleibt noch ungeklärt. Es ist sehr wahrscheinlich, dass sie in ein anderes Signal

umgewandelt werden, wie z.B. in ein Phosphorylierungssignal durch eine redoxaktive Kinase

(Baginsky et al., 1999, Baena‐Gonzáles et al., 2001; Puthiyaveetil et al., 2008).

Um die Frage näher zu untersuchen, ob die Cysteine der cpCK2 auch in vivo regulatorische

Funktionen ausüben, wurde die ∆cpck2‐Mutantenlinie mit jeweils an einem Cystein

mutierten cpCK2‐Konstrukt (P35S:cpCK2 C1 bis C4) transformiert. Mittels RT‐PCR und

anschließende Sequenzierung der PCR‐Produkte wurde nachgewiesen, dass die

retransformierten Linien nur das jeweilige mutierte cpCK2‐Konstrukt enthalten. Die Analyse

bezüglich des visuellen Phänotyps zeigten, dass C1‐ und C4‐Mutantenlinien – wie die

parentale knockout‐Linie – eine Chlorophylldefizienz aufweisen. Die in vitro Funktions‐

analyse mit den rekombinanten C1‐ und C4‐Mutante hatte bereits gezeigt, dass das Fehlen

eines der beiden Cystein‐Reste zur Inaktivierung der Kinase führt (vgl. Abb 5.4). Der somit

„erwartete“ Befund, dass die mit C1‐ bzw. C4‐Konstrukten retransformierten Linien immer

noch den (defekten) Phänotyp der parentalen ∆cpck2‐Linie zeigen, belegt, dass offenbar in

vivo die gleichen Regulationsmechanismen wie in vitro wirken. Diese Schlussfolgerung gilt

umso mehr, als die C2‐ und C3‐Mutantenlinien übereinstimmend mit den in vitro Analysen

wie Wildtyp grüne Keim‐ und Folgeblätter aufwiesen.

Untersuchungen zur Transkriptakkumulation der plastidären psbA‐, psaA‐ und atpB‐Gene

zeigten, dass die Cys‐Mutantenlinien sogar einen stärkeren molekularen Phänotyp im

Vergleich zu Wildtyp‐, ∆cpck2‐ und komplementierter Linie aufwiesen. Die C1‐Mutantenlinie

zeigte eine starke Reduktion der psaA‐ und atpB‐Transkripte sowohl bei 6 als auch 12 Tage

alten Pflanzen. Die psbA‐Transkriptmenge war dagegen erhöht im Vergleich zum Wildtyp.

Das Cys1 scheint auch in vivo wichtig für die Aktivität/Regulation der cpCK2 zu sein. Dieses

Cystein ist ein hochkonservierter Rest und spezifisch für die pflanzlichen CK2αs. Vielleicht

Diskussion

77

kommt dem Cys1 eine Funktion in der pflanzenspezifischen Regulation des Enzyms zu. C2‐

und C3‐Linien zeigen einen ähnlichen molekularen Phänotyp wie die C1‐Mutantenlinie,

jedoch nur bei 12 Tage alten Pflanzen. Dass der molekulare Phänotyp in den „Fehl“‐

komplementierten Linien stärker ausfällt als in der ∆cpck2‐Linie, könnte man dadurch

erklären, dass die –durch den vorgeschalteten 35S‐Promotor stark exprimierte– nicht‐

funktionelle cpCK2 auf andere Regulationsmechanismen in den Chloroplasten blockierend

wirken könnte.

Im Falle des atpB‐Experiments war nicht nur das 2.6 kb PEP‐Transkript sondern auch das 2.0

kb NEP Transkript betroffen. Dieser z. B. bei einer Sigmafaktor 6‐Mutante nicht beobachtete

gekoppelte Effekt (Schweer et al., 2006) lässt sich am einfachsten dadurch erklären, dass

cpCK2 primär auf das PEP‐System zu wirken scheint (Baginsky und Link, 2005). Das Fehlen

dieses Master‐Regulators in der Mutante könnte jedoch auch als Signal an NEP

weitergeleitet werden und diese zum „Verzicht“ auf die sonst durchgeführte SOS‐

Transkription (Schweer et al., 2006) veranlassen.

Analysen des Chloroplasten‐Phosphoproteoms zeigten, dass die (cp)CK2 eine dominierende

Kinase in den Organellen ist (Rheiland et al., 2009). Als potentielle plastidäre Substrate

wurden TAC (transcriptionally active chromosom)‐Untereinheiten und RNA‐Bindungs‐

proteine beschrieben. Außerdem wurde gezeigt, dass die Substrate der (cp)CK2 nicht auf

eine Rolle in der Genexpression beschränkt sind, sondern dass auch metabolische Enzyme

einschließlich der photosynthetischen ATP‐Synthase ebenfalls Substrate für (cp)CK2

darstellen. Für weitere Untersuchungen wäre es interessant, das Phosphoproteom der

Chloroplasten in der ∆cpck2‐Mutante zu untersuchen.

Zusammenfassung

78

6 Zusammenfassung

Die plastidäre Transkription wird durch mindestens zwei RNA‐Polymerasen katalysiert; die

sog. NEP (nuclear encoded polymerase) und PEP (plastid encoded polymerase). NEP ist

homolog zu den T3‐/T7‐Phagen‐Polymerasen und kommt als funktionelles Monomer vor.

PEP dagegen ähnelt den bakteriellen RNA‐Polymerasen und besteht aus plastidenkodierten

core‐Untereinheiten (α2ββ´β´´) sowie weiteren akzessorischen Proteinen, die vom Kern

kodiert werden und posttranslational in den Plastiden importiert werden. Zu Letzteren

gehören u. a. Sigmafaktoren, die der PEP die Fähigkeit der spezifischen Promotorbindung

und Transkription verleihen. Es gibt Hinweise darauf, dass die Aktivität dieser Faktoren über

ihren Phosphorylierungsgrad reguliert wird. In Vorarbeiten wurde eine Ser‐/Thr‐Kinase, die

ebenfalls als eine Komponente der PEP vorliegen kann, als die vorgeschaltete Proteinkinase

aus Senf‐Plastiden identifiziert und plastidäre Transkriptionskinase (PTK) genannt. Eine

biochemische und molekulare Charakterisierung der PTK zeigte, dass dieses Enzym

äquivalent zur katalytischen α‐Untereinheit der nucleo‐/cytosolischen CK2‐Proteinkinase ist.

Allerdings unterliegt die PTK (cpCK2) im Unterschied zu CK2 einer Redoxregulation durch

reduziertes Glutathion (GSH) und wurde somit als ein potentieller Vermittler zwischen

zellulären Redoxsignalen und plastidärer Genexpression angesehen. In weiteren Vorarbeiten

gelang es, die cDNA für die PTK/cpCK2 aus Senf zu klonieren und bakteriell zu exprimieren.

Anhand von Datenbank‐Analysen zeichnete sich darüber hinaus ab, dass auch andere

Pflanzen, einschließlich Arabidopsis thaliana, ein Gen für die Chloroplasten‐lokalisierte

Transkriptionskinase (cpck2) besitzen.

Um die Hinweise aus Vor‐Untersuchungen experimentell zu erhärten, konzentrierte sich die

vorliegende Arbeit auf die cpCK2 aus der Modellpflanze Arabidopsis (ATCK2). Im

experimentellen Fokus stand dabei die Frage einer "universellen" Rolle dieses

Chloroplastenproteins. Sollte dies zutreffen, wäre das Protein aus Arabidopsis für weitere

Funktionsstudien besonders geeignet. Als Strategie zur Klärung dieser Frage wurde das

betreffende Gen als cDNA kloniert und bakteriell überexprimiert. Ein Vergleich der

Zusammenfassung

79

rekombinanten cpCK2‐Proteine aus Senf und A. thaliana zeigte, dass beide Präparate

tatsächlich in vitro sehr ähnliche, CK2‐typische, Eigenschaften aufweisen.

Eine zentrale Rolle spielten im nächsten experimentellen Schritt die pflanzlichen

Sigmafaktoren als physiologische Substrate der Transkriptionskinase. Es konnte gezeigt

werden, dass die ATCK2 die rekombinanten Sigmafaktoren SASIG1, SASIG2, ATSIG1 und

ATSIG6 in vitro phosphorylieren kann. Durch DNA‐Bindungsstudien konnten die

funktionellen Konsequenzen dieser Phosphorylierung auf die Sigma‐Aktivität am Beispiel von

ATSIG1 und ATSIG6 exemplarisch geklärt werden. Besonders auffällig war dabei die

phosphorylierungsabhängige Bindung von ATSIG6 an den atpB‐Promotor. Dieser Faktor wies

im phosphorylierten Zustand eine stärkere Bindungsaktivität auf als im nicht‐

phosphorylierten Zustand. Somit liefert dieses System ein klares Beispiel für die Bedeutung

der Sigmafaktor‐Phosphorylierung für die Aktivität dieser Enzyme.

Ein weiterer Punkt war die Untersuchung der ATCK2 hinsichtlich ihrer Redoxregulation.

Dabei zeigte sich, dass die Aktivität der ATCK2 –ebenso wie das authentische bzw. klonierte

Enzym aus Senf– einer Redoxregulation durch reduziertes Glutathion unterliegt. Durch

Mutagenesestudien bezüglich der Cystein‐Reste konnte weiterhin erstmals ein neuer

Regulationsmechanismus für cpCK2 durch Disulfidbrückenbildung demonstriert werden. Der

zweite Cystein‐Rest war in vitro für eine Dimerisierung, und damit verbundene Inaktivierung,

von ATCK2 verantwortlich. Eine solche Disulfidbrückenbildung kann in vivo womöglich mit

anderen Komponenten des plastidären Transkriptionsapparats erfolgen.

Um Rückschlüsse auf die in vivo Funktion der cpCK2 zu bekommen, wurde eine T‐DNA‐

Insertionsmutante der ATCK2 (∆cpck2) charakterisiert. Phänotypische Analysen mit der

∆cpck2‐Mutante zeigten, dass die Mutanten‐Nachkommenlinien unter photoauthotrophen

Bedingungen keimlingsletal sind. Transkripte ausgewählter Gene (psbA, psaA und atpB)

zeigten im Vergleich zu Wildtyp signifikante Änderungen in der ∆cpck2‐Mutante, aber auch

in der komplementierten Linie. Diese Ergebnisse unterstreichen die grundsätzliche

Bedeutung der cpCK2 und deuten u. U. auch auf noch weiter vorgelagerte Regulatoren der

Redox‐ und Phosphorylierungsnetzwerke im Chloroplasten.

Zusammenfassung

80

Für die Untersuchungen zur in vivo Redoxregulation der cpCK2 wurden die ∆cpck2‐Linien mit

cpCK2‐Konstrukten, die jeweils an einem der vier Cysteine mutiert wurden, retransformiert.

Dabei zeigte sich, dass die Cysteine auch in vivo eine regulatorische Rolle spielen. Diese

gezielte "Fehl"‐Komplementation führte bei den mit C1‐, C2‐ und C3‐Konstrukten

komplementierten Linien zu dramatischen Veränderungen im plastidären RNA‐Muster.

Summary

81

7 Summary

Transcription of the plastid genes is driven by at least two RNA polymerases, the so‐called

NEP (nuclear encoded polymerase) and PEP (plastid encoded polymerase). NEP is a single

subunit enzyme homologous to the T3/T7 phage polymerases. In contrast, PEP is a bacterial‐

type RNA polymerase composed of multiple plastid encoded core subunits (α, β, β´, β´´). In

addition, it contains a number of accessory proteins that are encoded by the nucleus and

imported posttranslationally into the plastids. The latter include sigma factors which confer

on PEP the ability of specific promoter binding and transcription initiation. Evidence suggests

that the activity of these factors is regulated by their phosphorylation state. In previous

work, a PEP associated Ser‐/Thr‐Kinase was identified as the cognate protein kinase from

mustard plastids and called the plastid transcription kinase (PTK). A biochemical and

molecular characterization of PTK showed that this enzyme is equivalent to the catalytic α‐

subunit of nucleo/cytosolic CK2. However, in contrast to the nucleo/cytosolic enzyme, PTK

(cpCK2) is subject to redox regulation by reduced glutathione (GSH). Therefore, this kinase

can be considered as a potential mediator between cellular redox signals and plastid gene

expression. In other previous work, the cDNA for PTK/cpCK2 from mustard was cloned and

bacterially overexpressed. Database analysis revealed the existence of several orthologs for

mustard chloroplast cpCK2 in other plants including the model plant Arabidopsis thaliana.

The present work has concentrated on the physical and functional characterisation of cpCK2

from Arabidopsis (ATCK2). Initial experimental efforts focused on the question of a

"universal" role of this chloroplast enzym. If this were the case, then the cpCK2 from

Arabidopsis would be particularly suitable for the further functional studies. As a strategy to

clarify this question, the corresponding cDNA was cloned and bacterially overexpressed. A

functional comparison of the recombinant cpCK2 proteins from mustard and A. thaliana

showed that both enzym have in vitro substantially the same CK2‐typical characteristics.

In the next experimental step, the role of plant sigma factors as physiological substrates for

the transcription kinase was adressed. It was shown that indeed ATCK2 can in vitro

Summary

82

phosphorylate the recombinant sigma factors SASIG1, SASIG2, ATSIG1 and ATSIG6. Using

DNA binding studies, the functional consequences of this phosphorylation on the sigma

activity were tested with ATSIG1 and ATSIG6. A particularly notable effect was the

phosphorylation‐dependent binding of ATSIG6 to the atpB promoter. This factor revealed

strong binding activity in its phosphorylated form but not so in its unphosphorylated form.

Thus, this system provides clear evidence for the importance of sigma factor

phosphorylation as a determinant of enzymatic activity of these enzymes.

Another aim of this thesis work was the examination of the redox regulation of ATCK2. It was

shown that the activity of ATCK2 responds to reduced glutathione in much the same way as

does the authentic and recombinant enzyme from mustard. A mutational analysis of the

cysteine residues revealed a –previously not recognized– regulatory mechanism for cpCK2

(ATCK2) via disulfide bond formation. The second cysteine residue was found responsible for

dimerization, and in this way inactivation, of ATCK2 in vitro. It seems conceivable, that

hetero dimerization could occur with other components of the plastid transcription

apparatus in vivo.

To investigate the in vivo function of cpCK2, a T‐DNA insertion mutant of ATCK2 (∆cpck2)

was characterized. The phenotypic analysis of the ∆cpck2 mutant showed that the progeny

of the mutant line are seedling lethal under photoauthotrophic conditions. Compared to

wild type, transcripts of the plastid genes psaA and atpB showed significant changes in the

∆cpck2 mutant, and, furthermore also in a re‐transformed complemented line. Together

these results point to the fundamental importance of cpCK2 and may also help define

further upstream regulators of redox and phosphorylation networks in chloroplasts.

To further investigate the in vivo redox regulation of cpCK2, the ∆cpck2 line was also re‐

transformed with cpCK2 constructs that were each mutated in one of the four cysteines. It

was found that the cysteines indeed play a regulatory role in vivo. These experiments

involving directed mis‐complementation resulted in dramatic changes of the plastid RNA

patterns in the retransformed C1, C2 and C3 lines.

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Wissenschaftliche Präsentationen

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Publikationen

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reveals functional impact of cpCK2 phosphorylation. Plant J [Epub ahead of print]

Vorträge

H Türkeri, H Loschelder, J Schweer, A Kolpack, B Link and G Link (2006). “Redoxregulation

der Chloroplastentranskription: Funktionsanalyse der rekombinanten chloroplastidären

Transkriptionskinase cpCK2α“. Forschergruppentreffen (FOR 387), Bielefeld.

H Türkeri, H Loschelder, J Schweer, A Kolpack, B Link and G Link (2007). “Redox Regulation of

Chloroplast Transcription: The Plastid Transcription Kinase”. German‐Japanese Workshop at

the University of Konstanz. Evolutionary and Functional Aspects of Redox Regulation in

Photosynthetic Organisms.

H Türkeri, H Loschelder, J Schweer, A Kolpack, B Link and G Link (2007). “Redox Regulation of

Chloroplast Transcription: The Plastid Transcription Kinase (PTK)”. Redox Signal Integration:

From Stimulus to Networks and Genes, Bielefeld.

H Türkeri, J Schweer, A Kolpack, H Loschelder, B Link and G Link (2008). „Regulation of

Chloroplast Transcription: Functional Characterization of the Plastid Transcription Kinase

(PTK) in Arabidopsis thaliana”. 1 international PhD Student Symposium of the SFB 480 Ruhr‐

University, Bochum.

Poster‐Präsentationen

H Loschelder, J Schweer, H Türkeri, B Link, S Rattay, A Kolpack und G Link (2006). Functional

Role of Plastid Sigma Factors: A Sigma 6 Knock‐out from Arabidopsis. Interne Tagung SFB

480, Duisburg.


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H Loschelder, H Türkeri, J Schweer, B Link, S Rattay, A Kolpack und G Link (2006).

Funktionsanalyse der Transkription in den Plastiden: Licht‐, Redox‐ und Entwicklungs‐

Regulation. 19. Tagung „Molekularbiologie der Pflanzen“, Dabringhausen.

H Loschelder, J Schweer, H Türkeri, B Link, S Rattay und G Link (2006). Dual temporal Role of

Plastid Sigma Factor 6 in Arabidopsis Development. 3rd International PhD Student

Symposium “Horizons in Molecular Biology”, Göttingen.

J Schweer, H Loschelder, H Türkeri, B Link und G Link (2006). A plant sigma factor, ATSIG6,

mutant may be rescued by a promoter switch during development. 3rd International PhD

Student Symposium “Horizons in Molecular Biology”, Göttingen.

J Schweer, H Loschelder, H Türkeri, B Link, S Rattay, A Kolpack und G Link (2006). Rolle

plastidärer Transkriptionsfaktoren: Ergebnisse und Strategien mit Arabidopsis

Sigmamutanten. Interne Tagung SFB 480, Bochum.

J Schweer, H Loschelder, H Türkeri, B Link, A Kolpack und G Link (2007). A Promotor Switch

that can rescue a Plant Sigma Factor Mutant. FEBS Advanced Lecture Course „Origin and

Evolution of Mitochondria and Chloroplasts”, Acquafredda di Maratea, Italien.

H Türkeri, H Loschelder, A Kolpack, J Schweer, B Link und G Link (2007). Redox Regulation of

Chloroplast Transcription: The Plastid Transcription Kinase“. German‐Japanese Workshop

“Evolutionary and Functional Aspects of Redox Regulation in Photosynthetic Organisms”, in

Konstanz.

H Loschelder, J Schweer, H Türkeri, A Kolpack, B Link und G Link (2007). Dual temporal Role

of Plastid Sigma Factor 6 in Arabidopsis Development. 17. Tagung der Gesellschaft für

Entwicklungsbiologie, Marburg.

A Kolpack, H Türkeri, H Loschelder, J Schweer und G Link (2007). Developmentally regulated

plastid transcription in plants: Interaction partners and signalling mechanisms. 17. Tagung

der Gesellschaft für Entwicklungsbiologie, Marburg.


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A Kolpack, H Türkeri, J Schweer, H Loschelder und G Link (2007). Regulation of Chloroplast

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H Türkeri, J Schweer, A Kolpack, H Loschelder, B Link und G Link (2008). Analyse zur Funktion

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“Thiol‐based Redox Regulation & Signaling”, 25‐30.05.2008, Italien.

J Schweer, H Türkeri, A Kolpack, H Loschelder und G Link (2008). Multi‐facetted controls in

chloroplast gene regulation: impact of multiple sigma factors and their master regulator.

FESPB 2008 Congress, XVI Congress of the Federation of the European Societies of the Plant

Biology, Tampere, Finnland.

A Kolpack, H Türkeri, J Schweer und G Link (2009). Protein‐Protein Interaktionen in der

plastidären Genexpression: Sigma Faktoren und ihre Interaktoren. 22. Tagung

„Molekularbiologie der Pflanzen“, Dabringhausen.

Workshop‐Teilnahme

Einführung in die Proteinkristallisation (SFB Workshop, 2005).

Massenspektrometrie in der Proteinanalytik (Update) (SFB Workshop, 2005).

GatewayTM‐Technologie: Potenzial und Anwendungen in der molekularen Pflanzenforschung

(SFB Workshop, 2008)

Lebenslauf

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Lebenslauf

Persönliche Daten

Name Hacer Türkeri

Geburtsdatum 5. Oktober 1976

Geburtsort Niğde/Türkei

Familienstand ledig

Schulausbildung

09/1982–06/1987 Grundschule „Gazi İlkögretim Okulu“, Niğde/Türkei

09/1987–06/1990 Mittelschule „Bahceli Ortaokulu“, Niğde/Türkei

09/1990–06/1993 Lyzeum „Niğde Lisesi“, Niğde/Türkei

Studium

09/1994–07/1998 Biologie‐Studium an der Erciyes Universität in Kayseri/Türkei

Abschluss: Bachelor of Science (mit zusätlicher pädagogischen

Fortbildung)

07/1998–09/2000 Deutschkurs an der Universität Essen (Abschluss: DSH‐Prüfung)

10/1998 Einstufung in das 5. Semester in der Fakultät für Biologie an der Ruhr‐

Universität Bochum

09/2000–05/2006 Biologie‐Studium an der Ruhr‐Universität Bochum

Abschluss mit der Diplomarbeit „Redoxregulation der Chloroplasten‐

Transkription: Funktionsuntersuchungen der clonierten

chloroplastidären Transkriptionskinase (PTK) / cpCK2α"

seit Juni 2006 Doktorandin und Wissenschaftliche Mitarbeiterin in der Arbeitsgruppe

„Pflanzliche Zellphysiologie und Molekularbiologie“

Anfertigung der Dissertation: „Regulation der plastidären

Genexpression durch kernkodierte Faktoren: Untersuchungen zur

Rolle der Plastiden‐Transkriptionskinase (PTK) in der chloroplastidären

Genexpression in A. thaliana“ unter der Betreuung von Prof. Dr. G.

Link

Bochum, den 25.01.2010

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Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbstständig verfasst und bei keiner anderen Fakultät

eingereicht und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel verwendet habe. Es

handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um fünf in Wort und Bild völlig

übereinstimmende Exemplare. Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die

originalen Daten enthalten und in keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung

vorgenommen wurde.

Bochum, den

(Hacer Türkeri)

Documents

der kernkodierte Faktoren: zur Rolle der plastidären ... · (PTK) in der chloroplastidären Genexpression in A. thaliana Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften