Untersuchungen zur tryptophanabhängigen Indol-3-essigsäure-

Biosynthese in Arabidopsis thaliana (L.) HEYNH.

Dissertation zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Biologie

der Ruhr-Universität Bochum

angefertigt am

Lehrstuhl für Pflanzenphysiologie

von

Stephan Pollmann

aus

Gelsenkirchen

Bochum 2002

Für Maria

Gutachter:

Prof. Dr. E.W. Weiler

PD. Dr. J.-D. Schwenn

Tag der Abgabe der Arbeit: 07.10.2002

Tag der mündlichen Prüfung: 29.11.2002

Inhalt

I

Inhaltsverzeichnis I

Abbildungsverzeichnis VI

Tabellenverzeichnis VIII

Abkürzungsverzeichnis IX

1 Einleitung 1

2 Material und Methoden 10 2.1 Liste der verwendeten Geräte und Feinchemikalien 10

2.1.1 Geräte 10

2.1.2 Verbrauchsmaterialien 12

2.1.3 Fein- und Radiochemikalien 13

2.2 Enzyme und Antikörper 15

2.2.1 Enzyme 15

2.2.2 Antikörper 15

2.3 Nukleinsäuren 16

2.3.1 Oligonukleotide 16

2.3.2 Plasmid-Vektoren 17

2.4 Biologisches Material 17

2.4.1 Bakterienstämme 17

2.4.2 Pflanzenmaterial 18

2.5 Anzucht und Lagerung des biologischen Materials 18

2.5.1 Anzucht, Transformation und Lagerung von Bakterien 18

2.5.2 Anzucht von Escherichia coli zur heterologen Überexpression von Proteinen 18

2.5.3 Anzucht nicht steriler Pflanzen 19

2.5.4 Sterilisation des Saatguts 19

2.5.5 Aussaat und Anzucht auf Festmedium 19

2.6 Molekularbiologische Methoden 20

2.6.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli 20

2.6.2 Isolierung von Gesamt-RNA aus Pflanzen 20

2.6.3 Enzymatische Manipulation von Nukleinsäuren 20

2.6.4 Erzeugung von komplementärer DNA 21

2.6.5 Polymerase-Kettenreaktion 21

2.6.6 Gelelektrophoretische Trennung von Nukleinsäuren 21

2.6.7 Sequenzierung doppelsträngiger DNA 21

2.7 Biochemische Methoden 22

2.7.1 Kopplung von 5-Hydroxy-L-tryptophan an Rinderserumalbumin 22

Inhalt

II

2.7.2 Synthese von [3H]3-6-Azido-L-tryptophan 22

2.7.3 Synthese von [3H]2-6-Azidoindol-3-acetamid 23

2.7.4 Synthese von [2H]5-Indol-3-acetamid 24

2.7.5 Kopplung von Immunglobulin G an Sepharose 25

2.8 Präparationsmethoden 25

2.8.1 Gewinnung bakteriell überexprimierter Strep-tag-II- und (His)6-Fusions-proteine 25

2.8.2 Präparation einer bakteriellen Tryptophan-2-Monooxygenase 26

2.8.3 Reinigung der Tryptophan-Synthase von Salmonella typhimurium 27

2.8.4 Präparation pflanzlicher Enzymrohextrakte 27

2.8.5 Extraktion indolischer Verbindungen aus Pflanzengewebe 27

2.9 Enzymatische Analysen 28

2.9.1 Photometrische Bestimmung der Aktivität heterolog exprimierter Ami- dase 28

2.9.2 Bestimmung der Aktivität bakteriell exprimierter Amidase mittels Hoch-leistungsflüssigkeitschromatographie 28

2.9.3 Nachweis des Indol-3-acetamid-Umsatzes in pflanzlichen Protein- extrakten 29

2.9.4 Aktivitätsbestimmung der Nitrilasen 29

2.9.5 Bestimmung der Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität 30

2.9.6 Analyse der Tryptophanmetabolisierung in pflanzlichen Proteinextrakten mittels gekoppelter HPLC/GC-MS/MS-Technik 30

2.10 Chromatographische Trenntechniken 31

2.10.1 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie 31

2.10.1.1 Präparative Reinigung von [3H]3-6-Azido-L-tryptophan 31

2.10.1.2 Isolierung indolischer Komponenten aus komplexen Substanzgemischen 31

2.10.2 Flüssigkeitschromatographie 31

2.10.2.1 Präparative Ionenaustauschchromatographie an Hydroxyapatit 32

2.10.2.2 High Q-Anionenaustauschchromatographie 32

2.10.2.3 Hochdruckgelpermeationschromatographie 32

2.10.2.4 Affinitätschromatographie an Strep-Tactin-Sepharose 33

2.10.2.5 Affinitätschromatographische Reinigung von (His)6-Fusionsproteinen 33

2.10.2.6 Immunaffinitätschromatographie 33

2.11 Massenspektrometrie 34

2.11.1 Darstellung des Indol-3-essigsäuremethylesters 34

2.11.2 Synthese von Diazomethan 34

Inhalt

III

2.11.3 Trifluoracetylierung des Indol-3-acetamid 34

2.11.4 Gaschromatographisch-massenspektrometrische Darstellung von Indol-3-essigsäure 34

2.11.5 Analyse indolischer Verbindungen mittels gaschromatographisch-massen-spektrometrischer Methoden 35

2.11.6 Peptidsequenzierung mittels ESI-QTOF-Massenspektrometrie 36

2.12 Elektrophoretische Trenntechniken 36

2.12.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 36

2.12.2 Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese 37

2.12.3 Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese 37

2.12.4 „Blau-Native“ Polyacrylamid-Gelelektrophorese 38

2.12.5 Elektrophoretische Elution geladener Makromoleküle 38

2.13 Immunologische Methoden 39

2.13.1 Elektrophoretischer Transfer von Proteinen auf Nitrocellulose 39

2.13.2 Immunologischer Nachweis immobilisierter Proteine 39

2.13.3 Immunisierung von Kaninchen und Gewinnung von Antiseren 40

2.13.4 Nachweis Strep-tag-II-markierter Fusionsproteine 40

2.13.5 Reinigung spezifischer Antikörper 40

2.14 Photoaffinitätsmarkierung von Proteinen unter Einsatz der Radioliganden [3H]3-6-Azido-L-tryptophan und [3H]2-6-Azidoindol-3-acetamid 41

2.15 Proteinbestimmung 41

2.16 Radioaktivitätsbestimmung 41

2.17 Rechnergestützte Sequenzanalysen 42

2.18 Auswertung 42

3 Ergebnisse 43 3.1 Vergleich der Aktivität der IES-Synthase in unterschiedlichen Pflanzen-

spezies 43

3.2 Anreicherung der tryptophanmetabolisierenden Proteinfraktion aus Arabidopsis thaliana 44

3.2.1 Anreicherung der Indol-3-essigsäure-Synthase mittels Chromatographie an Hydroxyapatit 45

3.2.2 Anreicherung der Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität mittels High Q-Anionenaustauschchromatographie 46

3.2.3 Molekulargewichtsbestimmung und Anreicherung des Indol-3-essigsäure-Synthase-Komplexes durch Hochdruckgelpermeationschromatographie 47

3.2.4 Chromatographie an einer Tryptophanaffinitätsmatrix zur Reinigung des Indol-3-essigsäure-Synthase-Komplexes 48

Inhalt

IV

3.3 Trennung angereicherter Indol-3-essigsäure-Synthase-Fraktionen durch native Gelelektrophorese 49

3.3.1 Separation von Proteinkomplexen über exponentielle Gradientengele 49

3.3.2 Molekulargewichtsbestimmung und Anreicherung der Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität mittels „Blau-Nativer“ Gelelektrophorese 51

3.4 Beteiligung einer Flavin-Monooxygenase (YUCCA) an der tryptophan-abhängigen Indol-3-essigsäure-Biosynthese 54

3.4.1 Konstruktion und Überprüfung eines Expressionssystems zur heterologen Expression eines (His)6-YUCCA-Fusionsproteins 55

3.4.2 Gewinnung polyklonaler Antikörper gegen YUCCA-Proteine 58

3.4.3 Immunologischer Nachweis von YUCCA im Pflanzenrohextrakt 59

3.4.4 Immunpräzipitation der Indol-3-essigsäure-Synthase unter Verwendung von α-YUCCA-Antikörpern 60

3.5 Analyse potentieller Metaboliten und Inhibitoren der Indol-3-essigsäure-Biosynthese 62

3.5.1 Wirkung von Indol-3-essigsäurehydrazid auf die Indol-3-essigsäure-Syn- thase-Aktivität 62

3.5.2 Tryptamin als putative Zwischenstufe der Indol-3-essigsäure-Biosynthese 63

3.5.3 Verdünnung der Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität durch Indol-3- acetamid 64

3.5.4 Tryptophan als biosynthetische Vorstufe von Indol-3-acetamid 65

3.5.5 Einfluß von Tryptophan auf den in-vitro-Umsatz von Indol-3-acetamid zur Indol-3-essigsäure 68

3.5.6 Stereoselektivität der Indol-3-acetamid Synthese 70

3.6 Vorkommen und Bildung von Indol-3-acetamid in Arabidopsis thaliana 72

3.6.1 Endogener Indol-3-acetamid-Gehalt in sterilen Arabidopsis thaliana-Keim-lingen 72

3.6.2 Indol-3-acetamid als zweites Endprodukt der Nitrilasereaktion 74

3.7 Untersuchungen zur Metabolisierung von Indol-3-acetamid in Arabidopsis thaliana 76

3.7.1 Analyse abgeleiteter Aminosäuresequenzen für Indol-3-acetamid-Hydro- lasen aus pflanzenpathogenen Bakterien 77

3.7.2 Analyse der Aminosäuresequenzen der vier putativen Amidasen aus Arabidopsis thaliana 78

3.7.3 Konstruktion und Verifikation von Plasmid-Vektoren zur heterologen Expression von Amidase-Proteinen 80

3.8 Enzymatische Charakterisierung der heterolog exprimierten Amidasen aus Arabidopsis thaliana 84

3.8.1 Substratspezifität der bakteriell exprimierten Amidase-Fusionsproteine 85

Inhalt

V

3.8.2 Ermittlung enzymatischer Parameter der Amidase 1 87

3.8.3 Untersuchungen zur Tertiärstruktur des Strep-Amidase 1-Fusionsproteins 88

3.8.4 Immunologischer Nachweis der Amidase 1 und 2 aus Arabidopsis thaliana 90

3.8.5 Bestimmung der Amidaseaktivität im Pflanzenrohextrakt und Anreicherung der Enzymaktivität durch Chromatographie an Hydroxyapatit 92

3.9 Amidasen als Bestandteil des Indol-3-essigsäure-Synthase-Komplexes 92

3.9.1 Immunpräzipitation der Indol-3-essigsäure-Synthase unter Verwendung der α-AMI-Seren 93

3.9.2 Versuche zur immunaffinitätschromatographischen Anreicherung des Indol-3-essigsäure-Synthase-Komplexes 95

3.10 Versuche zur Photoaffinitätsmarkierung der Indol-3-essigsäure-Synthase 97

3.10.1 Markierung der Indol-3-essigsäure-Synthase mit [3H]3-6-Azido- L-tryptophan 97

3.10.2 Photoaffinitätsmarkierung unter Verwendung von [3H]2-6-Azido- indol-3-acetamid 98

4 Diskussion 101

5 Zusammenfassung 121

6 Literaturverzeichnis 124

Anhang 141

Danksagung 145

Lebenslauf 146

Abbildungen

VI

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1.1: Vereinfachtes Modell der Indol-3-essigsäure-Homöostase 2

Abb. 1.2: Mögliche Reaktionssequenzen zur tryptophan-abhängigen Indol-3- essigsäure-Biosynthese 5

Abb. 3.1: Spezifische Aktivität der IES-Synthase in unterschiedlichen Pflanzen- spezies 44

Abb. 3.2: Chromatographie von Arabidopsis thaliana-Proteinextrakten an einer Hydroxyapatit-Matrix 45

Abb. 3.3: Anionenaustauschchromatographie an High Q-Matrix 46

Abb. 3.4: Molekulargewichtsbestimmung und Anreicherung der IES-Synthase-Komplexes mittels Hochdruckgelpermeationschromatographie 48

Abb. 3.5: Strukturformel des synthetisierten Tryptophan-Konjugates 49

Abb. 3.6: Gelelektrophoretische Trennung von Proteinen einer angereicherten Indol-3-essigsäure-Synthase-Fraktion 50

Abb. 3.7: Gelelektrophoretische Präparation einer angereicherten Enzymfraktion zur Mikrosequenzierung putativer Indol-3-essigsäure-Synthase-Komponenten 52

Abb. 3.8: Aminosäuresequenzvergleich der putativen Auxinbindestelle (BoxA) 54

Abb. 3.9: Strategie zur Klonierung (His)6-markierter YUCCA-Fusionsproteine 55

Abb. 3.10: Proteolytischer Abbau rekombinanter YUCCA-Proteine 56

Abb. 3.11: Affinitätschromatographische Reinigung bakteriell exprimierter, N-terminal (His)6-markierter YUCCA-Proteine an Ni-NTA-Agarose 57

Abb. 3.12: Reinigung von des bakteriell exprimierten YUCCA-Proteins zur Herstel- lung polyklonaler Antikörper 58

Abb. 3.13: Immunologischer Nachweis von YUCCA im Pflanzenrohextrakt 60

Abb. 3.14: Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität im Überstand nach Immun- präzipitation mit spezifisch gereinigten α-YUCCA-Antikörpern 61

Abb. 3.15: Wirkung von Indol-3-essigsäurehydrazid auf die Indol-3-essigsäure- Synthase-Aktivität 63

Abb. 3.16: Einfluß von Indol-3-acetamid auf die in-vitro-Umsetzung von [2H]5-L- Tryptophan zu [2H]5-Indol-3-essigsäure 65

Abb. 3.17: Hochleistungsflüssigkeitschromatographische Trennung indolischer Verbindungen 66

Abb. 3.18: Massenspektrometrischer Nachweis der enzymatischen [2H]5-Indol-3- acetamid-Synthese durch Arabidopsis thaliana-Proteinextrakte 68

Abb. 3.19: Massenspektrometrische Analyse des enzymatisch synthetisierten [2H]5- Indol-3-acetamids 69

Abb. 3.20: Verdünnung des in-vitro-Umsatzes von markiertem Indol-3-acetamid zu [2H]5-Indol-3-essigsäure durch Tryptophan 70

Abbildungen

VII

Abb. 3.21: Untersuchungen zur Stereoselektivität der Indol-3-acetamid-Synthese 71

Abb. 3.22: Detektion endogener Indol-3-essigsäure- und Indol-3-acetamid-Gehalte in sterilen Arabidopsis thaliana-Keimlingen 73

Abb. 3.23: Umsatz von Indol-3-acetonitril durch die Nitrilasen 1 – 3 aus Arabidopsis thaliana 75

Abb. 3.24: Aminosäuresequenzvergleich von fünf Indol-3-acetamid-Hydrolasen pflan- zenpathogener Bakterien 77

Abb. 3.25: Aminosäuresequenzvergleich des katalytischen Zentrums der Amido- hydrolase aus Rhodococcus sp. mit den putativen Amidasen aus Arabidopsis thaliana 78

Abb. 3.26: Lokalisation und genomische Organisation des AMI1- und AMI2-Gens auf den Chromosomen I bzw. V von Arabidopsis thaliana 79

Abb. 3.27: Amplifikation der AMI1 und AMI2 cDNA mittels RT-PCR 81

Abb. 3.28: Klonierungsstrategie zur Herstellung C- bzw. N-terminal markierter Ami- dasen aus Arabidopsis thaliana 83

Abb. 3.29: Bakterielle Überexpression und affinitätschromatographische Reinigung Strep-markierter Amidasen aus Arabidopsis thaliana 84

Abb. 3.30: Substratspezifität der rekombinanten Amidase 1 aus Arabidopsis thaliana 86

Abb. 3.31: Amidase 1-Aktivität in Abhängigkeit von Substrat, pH-Wert, Temperatur und Proteingehalt 87

Abb. 3.32: „Blau-Native“ Polyacrylamid-Gelelektrophorese des bakteriell exprimier- ten Strep-AMI1-Fusionsproteins 89

Abb. 3.33: Präparation von Antigenen zur Gewinnung eines polyklonalen Antikörpers gegen die putative Amidase 2 aus Arabidopsis thaliana 90

Abb. 3.34: Immunologischer Nachweis der putativen Amidasen in Proteinextrakten aus Arabidopsis thaliana 91

Abb. 3.35: Immunpräzipitation der Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität mittels polyklonaler Amidase-Antikörper 94

Abb. 3.36: Versuche zur Immunpräzipitation der Indol-3-essigsäure-Synthase unter Verwendung spezifischer α-AMI1-Immunglobuline 95

Abb. 3.37: Gelelektrophoretische Darstellung der immunaffinitätschromatographisch isolierten Proteine aus Arabidopsis thaliana 96

Abb. 3.38: Photoaffinitätsmarkierung löslicher Proteine mit [3H]3-6-Azido- L-tryptophan 97

Abb. 3.39: Photoaffinitätsmarkierung Indol-3-acetamid-bindender Proteine unter Einsatz des Radioliganden [3H]2-6-Azidoindol-3-acetamid 99

Abb. 4.1: Massenspektrometrische Analyse des Sauerstoffeinbaus im Zuge von Indol-3-essigsäure-Synthase katalysierter Indol-3-essigsäure-Biogenese 119

Abb. 4.2: Vorgeschlagener katalytischer Mechanismus bakterieller Amidasen 120

Tabellen

VIII

Tabellenverzeichnis

Tab. 3.1: Massenspektrometrische Identifizierung gelelektrophoretisch isolierter Proteine aus Arabidopsis thaliana 53

Tab. 3.2: Produktverhältnisse der Nitrilase 1 – 3 katalysierten Indol-3-acetonitril-Umsetzung 76

Tab. 3.3: Biochemische Charakterisierung der heterolog exprimierten Amidase 1 aus Arabidopsis thaliana 88

Tab. 3.4: Massenspektrometrische Identifizierung [3H]3-6-Azido-L-tryptophan- markierter Proteine aus Arabidopsis thaliana 98

Abkürzungen

IX

Abkürzungsverzeichnis

Bezüglich der Standardmaßeinheiten, sowie der Vorsilben für dezimale Vielfache und

Teile von Einheiten gelten die Konventionen der IUPAC. Daneben gelten, soweit im Text

nicht anders angegeben, die folgenden Abkürzungskonventionen:

A Ampere

Accession Datenbankeintrag (“Accession number”)

AMV “Avian Myeloblastosis Virus”

A. thaliana Arabidopsis thaliana

(d)ATP (Desoxy-)Adenosin-5’-triphosphat

bzw. beziehungsweise

Bq Becquerel

°C Grad Celsius; T(°C) = T(K) + 273.16 K

ca. circa

CaMV Blumenkohl-Mosaikvirus („Cauliflower mosaic virus“)

cDNA zur Boten-RNA komplementäre DNA („complementary DNA“)

CI chemische Ionisation

(d)CTP (Desoxy-)Cytidin-5’-triphosphat

Da Dalton, Maßeinheit für die Molmasse eines Proteins

DC Dünnschichtchromatographie

d.Th. der Theorie

DTT Dithiothreitol

E Einstein

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamin-tetraessigsäure

EGTA Ethylenglykol-bis-(β-aminoethylether)-tetraessigsäure

Fg Frischgewicht

FPLC Mitteldruck-Flüssigkeitschromatographie

g Gramm

x g Vielfaches der Erdbeschleunigung g = 9.81 2smkg ⋅

GC-MS Gaschromatographie-Massenspektrometrie

GC-MS/MS Gaschromatographie-Tandemmassenspektrometrie

Abkürzungen

X

(d)GTP (Desoxy-)Guanosin-5’-triphosphat

h Stunde

HPLC Hochleistungsflüssigchromatographie („High Performance Liquid Chromatography“)

IAM Indol-3-acetamid

IAN Indol-3-acetonitril

IAOx Indol-3-acetaldoxim

IES Indol-3-essigsäure

IgG Immunglobulin G

IPTG Isopropylthiogalaktosid

IUPAC International Union for Pure and Applied Chemistry

kbp Kilobasenpaare

KD Dissoziationskonstante

KPi-Puffer Kaliumphosphat-Puffer (K2HPO4 und KH2PO4)

L-Trp L-Tryptophan

M Molar

m Meter

m/z Masse:Ladungs-Verhältnis eines Ionenfragmentes; relative Massenangabe bei der Massenspektrometrie

M+1 Masse des Molekülions +1 bei der Massenspektrometrie

mbar Millibar; 1 mbar = 10² Pa

min Minute

mRNA Boten-RNA („messenger RNA“)

nt Nukleotide

OD600 optische Dichte bei der Wellenlänge 600 nm

p.A. pro analysis; Bezeichnung einer Substanz mit analytischem Reinheitsgrad

PCR Polymerase-Kettenreaktion

pH Logarithmus der H3O+-Ionenkonzentration in mol/l

pkat picokatal; 1 pkat = 1 s

pmol

PVP Polyvinylpyrrolidon

Rf relative Wanderungsgeschwindigkeit einer Fraktion bei einer Dünnschichtchromatographie bezogen auf die Laufmittelfront

RSA Rinderserumalbumin

RT Raumtemperatur

Abkürzungen

XI

Rt Retentionszeit einer Fraktion auf einer Chromatographiesäule

RT-PCR Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion

SDS Natriumdodecylsulfat

SDS-PAGE SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

s Sekunde

s.o. siehe oben

s.u. siehe unten

TAM Tryptamin

TBS Tris-gepufferte Kochsalzlösung

TFAA Trifluoressigsäureanhydrid

Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminoethan

Triton X Octylphenol-polyethylenglykolether

(d)TTP (Desoxy-)Thymidin-5’-triphosphat

u.a. unter anderem

üN über Nacht

upm Umdrehungen pro Minute

UV-VIS Spektralbereich ultravioletter und sichtbarer elektromagnetischer Strahlung

v/v Volumen pro Volumen

vgl. vergleiche

W Watt

w/v Gewicht pro Volumen

z.B. zum Beispiel

Einleitung

1

1 Einleitung

Pflanzen sind, als sessile Lebewesen, standortgebunden und somit darauf angewiesen,

Wachstum und Differenzierung interaktiv an gegebene Umweltbedingungen anzupassen.

Die besondere Anpassungsfähigkeit Höherer Pflanzen beruht neben dem Erhalt toti-

potenter Zellen auf der hohen physiologischen Variabilität ihres Stoffwechsels, welcher

durch das komplexe Zusammenspiel chemischer Botenstoffe reguliert wird. Diese als

Phytohormone bezeichneten pflanzlichen Signalstoffe entsprechen nicht in allen Belangen

der allgemeinen Definition für Hormone. Im Gegensatz zu tierischen Hormonen ist ihr

Syntheseort nicht zwangsläufig vom Wirkort getrennt. Zudem besitzen Phytohormone eine

weitaus geringere Spezifität als ihre tierischen Pendants. Die Wirkung dieser hormon-

ähnlichen Substanzen wird vielmehr durch ihre Konzentration, die Kompetenz des

reagierenden Gewebes und durch ihre Interaktion mit Wirkstoffen anderer Phytohormon-

gruppen bestimmt. Zu den klassischen Gruppen der Phytohormone werden Auxine,

Cytokinine, Gibberelline, Abscisinsäure und Ethylen gezählt. Hinzu kommen einige neue

Gruppen von pflanzlichen Signalstoffen, wie die Jasmonsäure und ihre Biosynthese-

vorstufen, die Brassinosteroide sowie einige Peptide, welche Analogien zu tierischen

Hormonen aufweisen (FARMER & RYAN, 1992; YOKOTA, 1997; BISSELING, 1999). Die

Phytohormone werden gruppenspezifisch nach ihren wachstumsfördernden bzw. wachs-

tumshemmenden Eigenschaften unterteilt (MOORE, 1989).

Der erste chemische Signalstoff, welcher in Höheren Pflanzen identifiziert werden konnte,

ist die Indol-3-essigsäure (IES), die zu den wachstumsfördernden Auxinen gezählt wird.

Die IES, als Hauptvertreter dieser Gruppe, hat eine zentrale Funktion bei der Regulation

nahezu aller pflanzlicher Wachstums- und Differenzierungsprozesse. Hierzu zählen die

Förderung von Streckungswachstum, kambialer Zellteilungsaktivität, Adventiv- und

Seitenwurzelbildung und apikaler Dominanz. Darüber hinaus beeinflussen die Auxine

photo- wie auch gravitrope Bewegungen, die Fruchtentwicklung sowie die Seneszenz

(THIMANN, 1977).

Neben diesen substanzspezifischen Eigenschaften zeigen sich Auxine in Interaktion mit

anderen Phytohormongruppen wie den Cytokininen (EKLÖF et al., 1997), der

Abscisinsäure (DUNLAP & BINZEL, 1996) oder Ethylen (ROMANO et al., 1993) für ein

weites Spektrum pflanzlicher Entwicklungsprozesse verantwortlich.

Einleitung

2

Auxine bewirken Veränderungen, die Zellteilungen, Zellelongationen oder Zell-

differenzierungen nach sich ziehen. Diese Veränderungen werden durch die Verschiebung

von Plasmamembranpotentialen, bewirkt durch die Regulation von H+-ATPasen und

Ionenkanälen, oder durch die Induktion von Transkriptionsfaktoren und damit verbundener

Genregulation realisiert (MACDONALD, 1997). Entscheidend für den Verlauf der einzelnen

Prozesse ist der jeweilige Hormonstatus der Zelle.

Diese zelluläre IES-Homöostase wird durch ein komplexes Reaktionsgefüge in Balance

gehalten, wobei der IES-Gehalt mittels unterschiedlichster biochemischer und

physiologischer Faktoren moduliert wird (siehe Abb. 1.1).

Abb. 1.1: Vereinfachtes Modell der Indol-3-essigsäure-Homöostase Die Pfeile verweisen auf regulatorische Reaktionen, welche entwicklungsbiologischer oder aber gewebespezifischer Natur sein können (verändert nach NORMANLY, 1997).

Neben der de-novo-Synthese und dem Abbau der IES stellen Transport, Kompartimen-

tierung, Konjugation und Dekonjugation entscheidende Regelgrößen dar, welche die

Konzentration physiologisch wirksamer, freier IES auf zellulärer Ebene regulieren.

In den vergangenen Jahren wurde sehr intensiv an der Aufklärung der IES-Biosynthese

gearbeitet, wobei unterschiedliche Pflanzenspezies sowie pflanzenassoziierte Mikro-

organismen als Untersuchungsobjekte dienten. Obgleich verschiedenste methodische

Ansätze verfolgt wurden, führten diese Versuche bis heute nicht zu einem ganzheitlichen

Verständnis der Auxinbiosynthese. So konnten zwar einige relevante Reaktionsschritte in-

vitro aufgezeigt, sowie wichtige Hinweise auf putative Metaboliten, welche durch in-vivo-

Einleitung

3

Analysen, unter Erhalt der zellulären Kompartimentierung, geliefert werden, ohne aber ein

einheitliches und umfassendes Modell für die Biosynthese aufzuzeigen (BARTEL, 1997).

Obgleich der spontane Zerfall der Aminosäure L-Tryptophan (L-Trp) zu Indol-3-

essigsäure in wäßrigen Medien schon früh beschrieben wurde, und Doppel-

markierungsexperimente von ERDMANN & SCHIEWER (1971) sowie Fütterungsexperimente

mit deuteriertem L-Trp (BIALEK et al., 1992), welche eine IES-Synthese aus L-Trp

belegten, darauf verwiesen, daß hier das Bindeglied zwischen Hormonbiosynthese und

dem Primärstoffwechsel zu suchen ist, stellte eine Reihe weiterer Befunde L-Trp als

ausschließliche Vorstufe der IES-Synthese in Frage. Erste Hinweise für eine tryptophan-

unabhängige IES-Biosynthese lieferten Isotopenmarkierungsexperimente an IES über-

produzierenden Lemna gibba-Mutanten. Nach Fütterung dieser zu den Wasserlinsen-

gewächsen zählenden Pflanzen mit [15N]-Trp zeigten BALDI et al. (1991), daß nur ein

Bruchteil des zu 98 % isotopenmarkierten Trps zur IES umgesetzt wurde

(20 – 30 %), was auf eine alternative IES-Vorstufe verwies. Diese Schlußfolgerung wurde

durch Analysen an tryptophanauxotrophen Mutanten von Zea mays (WRIGHT et al., 1991)

und Arabidopsis thaliana (NORMANLY et al., 1993) untermauert. Diese Mutanten (orange

pericarp (orp) beim Mais; trp2-1 und trp3-1 bei A. thaliana) zeichnen sich durch

Mutationen in den Proteinen des Tryptophan-Synthase-Komplexes aus (RADWANSKI et al.,

1996), was zu stark herabgesetzten endogenen Trp-Gehalten führt. Dennoch ließ sich für

diese Mutanten eine starke Akkumulation von IES-Konjugaten und Indol-3-acetonitril

(IAN), einem putativen Metaboliten der IES-Biosynthese, aufzeigen (CHEN et al., 1988).

Die Konjugation der freien IES wurde hier als Indiz für einen tryptophanunabhängigen

Biosyntheseweg gewertet, da eine Verminderung des Substratgehaltes die Steigerung der

Produktsynthese unwahrscheinlich erscheinen ließ. Nachfolgend durchgeführte Revisionen

dieser Experimente konnten hingegen weder für Z. mays (GLAWISCHNIG et al., 2000), noch

für A. thaliana (MÜLLER & WEILER, 2000b) Belege für einen tryptophanunabhängigen

Biosyntheseweg der IES liefern. Vielmehr verdeutlichten die Experimente an der

A. thaliana trp3-1 Mutante, daß nicht IES-Konjugate, sondern die L-Trp-Vorstufe Indol-3-

glycerophosphat akkumuliert, welche durch die, von CHEN et al. (1988) verwendete,

alkalische Hydrolyse zur IES zerfällt. Die beschriebene Akkumulation von IES-

Konjugaten in den A. thaliana-Mutanten muß demnach als apparentes Artefakt erachtet

werden, was sowohl die Verwendbarkeit der Mutanten für die Aufklärung der IES-

Synthese, als auch generell das Vorhandensein einer tryptophanunabhängigen IES-

Einleitung

4

Biosynthese in Frage stellt. Zudem ließen sich bis heute ausschließlich Gene identifizieren,

welche für Proteine von tryptophanabhängigen Reaktionswegen codieren (LJUNG et al.,

2002), was L-Trp als einzige Ausgangssubstanz der IES-Biosynthese erscheinen läßt.

Einleitung

5

Abb. 1.2: (Vorherige Seite) Mögliche Reaktionssequenzen zur tryptophan-abhängigen Indol-3-essigsäure-Biosynthese

Die gezeigten Biosynthesewege beschreiben sowohl pflanzliche als auch mikrobielle Reaktionssequenzen der IES-Biosynthese. Mögliche Reaktionsschritte, für die bisher noch keine pflanzlichen Enzyme gefunden werden konnten, sind durch gestrichelte Linien hervorgehoben. Einige Orte negativer Regulation sind durch stumpfe Pfeile (rot) gekennzeichnet: CYP83B1 wird durch Tryptamin inhibiert (BAK et al., 2001), die TDC Transkription wird durch IES inhibiert (GOODDIJN et al., 1992; PASQUALI et al., 1992), und die AAO1-Gehalte sind in der A. thaliana rty Mutante erhöht (SEKIMOTO et al., 1998; SEO et al., 1998). (AAO1: Indol-3-acetaldehyd-Oxidase; IAMH: Indol-3-acetamid-Hydrolase; IAOx N-oxid: Indol-3-acetaldoxim-N-oxid; IES: Indol-3-essigsäure; IPAD: Indol-3-pyruvat-Decarboxylase; MYR: Myrosinase; NIT: Nitrilase; RTY: rty Mutante (A. thaliana); TAM: Tryptamin; TDC: Tryptophan-Decarboxylase; TMO: Tryptophan-2-Monooxygenase; TRPA: Tryptophan- Aminotransferase).

Ausgehend vom L-Trp sind in den vergangen drei Dekaden unterschiedliche

Reaktionssequenzen für die IES-Bildung postuliert und kontrovers diskutiert worden,

wobei viele Befunde, und hier insbesondere die Unzugänglichkeit IES-defizienter

Mutanten, auf mehr als einen Biosyntheseweg hindeuten (ECKHARDT, 2001).

Eine Reihe dieser tryptophanabhängigen Biosynthesewege sind in Abbildung 1.2

zusammengefaßt dargestellt und werden nachfolgend diskutiert. Tryptamin wurde

aufgrund seiner charakteristischen Auxinwirkung im klassischen Avena-Koleoptilen-

Krümmungstest (WINTER, 1966) schon früh als mögliche biosynthetische Vorstufe der IES

betrachtet. Eine putative Reaktionssequenz über Tryptamin wurde von PHELPS &

SEQUERIA (1967) für Tabak vorgestellt. Durch eine einleitende Decarboxylierung und

anschließende Hydroxylierung des intermediären Tryptamins erfolgt die Umsetzung des

Tryptophans zu Indol-3-acetaldehyd. Das für eine Tryptophan-Decarboxylase [1]

codierende Gen konnte von DE LUCA et al. (1989) aus Catharanthus roseus kloniert und

die Tryptamin-Bildung im bakteriellen System (SONGSTAD et al. 1990) gezeigt werden.

Des weiteren konnte für die Tryptophan-Decarboxylase (TDC) eine Inhibierung der

Transkription durch exogen appliziertes Auxin (GOODDIJN et al., 1992; PASQUALI et al.,

1992) beobachtet werden. Da Tryptamin bislang nur in Lycopersicon esculentum

identifiziert wurde (COONEY & NONHEBEL, 1991), und somit nicht ubiquitär in Pflanzen

verbreitet zu sein scheint, wurde dieser Reaktionsweg lange als wenig relevant erachtet.

Neuerliches Interesse für diesen Biosyntheseweg weckte aber die Identifikation von

YUCCA [2], einer Flavin-Monooxygenase aus A. thaliana (ZHAO et al., 2001), welche in-

vitro Tryptamin zu N-Hydroxytryptamin umsetzt. YUCCA überexprimierende Pflanzen

zeigen einen signifikanten Auxinphänotyp, mit verlängerten Hypocotylen, epinastischen

Einleitung

6

Kotyledonen und Blättern, verlängerten Blattstielen sowie erhöhter apikaler Dominanz.

Zudem weisen diese Mutanten einen um 50 % gesteigerten IES-Gehalt und eine erhöhte

Resistenz gegen phytotoxische Trp-Analoga auf, was darauf hinweist, daß die

akkumulierte IES in diesen Pflanzen aus L-Trp stammt. TDC überexprimierende

Tabakpflanzen akkumulieren zwar Tryptamin, aber weisen keinen Auxinphänotyp auf

(CHAVADEJ et al., 1994; GUILLET et al., 2000). Dies legt nahe, daß YUCCA den

geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in dieser Reaktionssequenz katalysiert. Da in

biochemischen Untersuchungen aber weder endogenes Tryptamin noch der Umsatz von

Tryptamin zu N-Hydroxytryptamin in A. thaliana beobachtet werden konnte, und

YUCCA-defiziente Mutanten keinen signifikanten Phänotyp zeigen, ist der Stellenwert

dieses Biosyntheseweges noch unklar.

Unbekannt ist zudem, ob diese Reaktionssequenz Indol-3-aldoxim (IAOx) als Zwischen-

stufe beinhaltet. IAOx wird als mögliche Verzweigungsstelle innerhalb der IES-Synthese

diskutiert, da IAOx das Substrat für die Biosynthese von Indol-Glucosinolaten darstellt

(BAK et al., 2001). Diverse Studien, unter anderem an A. thaliana-Mutanten (superroot2

(sur2)), verweisen auf den Umsatz von IAOx zu Indol-3-aldoxim-N-oxid durch ein

cytosolisches Cytochrom P450 Protein, CYP83B1 [7] (DELARUE et al., 1998; WINKLER et

al., 1998), und eine Funktion des IAOx, als Intermediat, bei der Bildung der IES. Die

Überexpression einer Tryptophan-Decarboxylase in Brassica napus führte, neben der oben

schon erwähnten Akkumulation von Tryptamin, zu einer drastischen Reduktion des Indol-

Glucosinolat-Gehaltes (CHAVADEJ et al., 1994), was auf eine Inhibierung von CYP83B1

durch Tryptamin schließen läßt. Alternativ könnte IAOx hingegen auch direkt aus L-Trp

gebildet werden. In Chloroplasten konnten zwei weitere Cytochrom-P450-Mono-

oxygenasen (CYP79B2, CYP79B3 [6]) identifiziert werden, welche den in-vitro-Umsatz

von Trp zu IAOx katalysieren (HULL et al., 2000), was auf eine eher indirekte Verbindung

zur IES-Biosynthese, über eine Substrat-Kompetition, hindeuten würde.

Eine weitere mögliche Reaktionssequenz führt vom L-Trp über Indol-3-pyruvat zum Indol-

3-acetaldehyd. Hier erfolgt die Modifikation der L-Trp-Seitenkette sukzessiv durch Trans-

aminierung und Decarboxylierung. Entsprechende Transaminase- [3] als auch Decarboxy-

lase-Aktivitäten konnten für eine Vielzahl pflanzlicher (TRUELSEN, 1973; NONHEBEL et al.,

1993) sowie mikrobieller Organismen nachgewiesen werden. Gene, die für eine Indol-3-

pyruvat-Decarboxylase [4], das Schlüsselenzym dieser Reaktionsfolge, codieren, ließen

sich aus Enterobacter cloacae (KOGA et al., 1994) sowie Azospirillium brasilense

Einleitung

7

(COSTACURTA et al., 1994), nicht aber aus Pflanzen isolieren. Die abschließende Reaktion

vom Indol-3-acetaldehyd zur IES kann durch die Katalyse einer Indol-3-acetaldehyd-

Oxidase [5] vermittelt werden. Entsprechende Gene für zwei Isoformen dieses Enzyms

sind aus A. thaliana isoliert und charakterisiert worden (SEKIMOTO et al., 1997; SEO et al.,

1998). Für die A. thaliana-Mutante rooty (rty) (SEO et al., 1998), auch als sur1 (BOERJAN

et al., 1995), hookless3 (LEHMAN et al., 1996) und alf1 (CELENZA et al., 1995) bekannt,

konnte neben der Akkumulation der Indol-3-acetaldehyd-Oxidase Isoform AAO1 ein

deutlicher Auxinphänotyp beschrieben werden. Die rty-Mutante zeichnet sich durch eine

rezessive Mutation in einem Tyrosintransaminase-ähnlichen Protein (GOPALRAJ et al.,

1996) aus und zeigt erheblich gesteigerte Gehalte an freier und konjugierter IES (BOERJAN

et al., 1995; KING et al., 1995; LEHMAN et al., 1996). Dies deutete CELENZA (2001) als

eine putative Blockade einer Verzweigung der IES-Biosynthese. Da bisher keine Hinweise

auf pflanzliche Analoga der bakteriellen Indol-3-pyruvat-Decarboxylasen gefunden

werden konnten, schließen COSTACURTA & VANDERLEYDEN (1995) und NORMANLY et al.

(1995), daß diese Variante der IES-Biosynthese auf pflanzenassoziierte Mikroorganismen

zurückgeführt werden muß. Eine solche mikrobielle Komponente der Hormonbiosynthese

konnte bereits von LIBBERT et al. (1970) aufgezeigt werden.

Eine eher untergeordnete Rolle in der IES-Biosynthese spielt der Umsatz von Indol-3-

acetonitril (IAN) zur IES durch die Proteine NIT1 – 3 der Nitrilase-Familie [9] aus

A. thaliana (BARTLING et al., 1992; BARTEL & FINK, 1994), deren Aktivität in-vitro und in-

vivo aufgezeigt werden konnte (SCHMIDT et al., 1996; NORMANLY et al., 1997; VORWERK

et al., 2001; KUTZ et al., 2002). Der Umsatz von IAN konnte bereits früh durch THIMANN

& MAHADEVAN (1958) an Gerste demonstriert werden. Allerdings zeigten von 21

untersuchten Familien Höherer Pflanzen nur Poaceen, Brassicaceen und Musaceen diese

enzymatische Aktivität (THIMANN & MAHADEVAN, 1964a, b), was diese Art der de-novo-

Biosynthese auf wenige Pflanzenfamilien limitiert. Nach heutigem Stand der Wissenschaft

wird davon ausgegangen, daß Nitrilasen für die Umsetzung von IAN zu IES verantwortlich

sind, welches hydrolytisch, durch Myrosinasen [8], aus Indol-Glucosinolaten, insbesondere

aus Glucobrassicin, freigesetzt wird (BARTEL et al., 2001). Die Funktion der Nitrilasen

besteht wohl vornehmlich darin, in Abhängigkeit von unterschiedlichen biotischen wie

abiotischen Faktoren, zusätzliche IES-Pools zu aktivieren. So konnte beispielsweise für

NIT2 eine Induktion durch Pathogenbefall (BARTEL & FINK, 1994) bzw. für NIT3 eine

Einleitung

8

Induktion durch Sulphatmangel (KUTZ et al., 2002) beschrieben werden, welche mit einer

drastischen Abnahme des Glucobrassicin-Gehaltes einhergeht.

Der einzige bisher vollständig aufgedeckte IES-Syntheseweg ist der Indol-3-acetamid-

Weg. Dieser Syntheseweg ist aus Mikroorganismen der Gattungen Agrobacterium

(SCHRÖDER et al., 1984), Azospirillium (BAR & OKON, 1993), Pseudomonas (MAGIE et al.,

1963) sowie Streptomyces (MANULIS et al., 1994) bekannt, und wird durch das

Zusammenspiel einer Tryptophan-2-Monooxygenase [10], einem 62 kDa Flavoprotein

(HUTCHESON & KOSUGE, 1985), und einer etwa 49 kDa großen Indol-3-acetamid-

Hydrolase [11] vermittelt. Diese beiden Enzyme vermögen L-Trp zu Indol-3-acetamid

(IAM) zu oxidieren und dieses weiter zur IES zu hydrolysieren. Obgleich endogenes IAM

in einigen Pflanzen, wie z.B. Oryza sativa (KAWAGUCHI et al., 1991), Poncirus trifoliata

(KAWAGUCHI et al., 1993), Prunus jamasakura (SAOTOME et al., 1993) und Citrus unshiu

(IGOSHI et al., 1971; TAKAHASHI et al., 1975) nachgewiesen werden konnte, wird dieser

Biosyntheseweg als bakterienspezifisch angesehen, da die präsentierten Studien bakterielle

Kontaminationen nicht ausschließen konnten. Bestärkt wird diese Einschätzung dadurch,

daß bis dato keine spezifischen Tryptophan-2-Monooxygenasen respektive Indol-3-

acetamid-Hydrolasen in Pflanzen ausgemacht werden konnten.

Neben den oben angeführten Reaktionswegen beschreiben MÜLLER & WEILER (2000a)

einen Enzymkomplex (IES-Synthase) aus A. thaliana, der in-vitro eine vollständige

Umsetzung von Trp zu IES ermöglicht. Dieser etwa 160 – 180 kDa große, lösliche

Synthase-Komplex zeichnet sich durch seine Stereoselektivität für L-Trp und strikte

Sauerstoffabhängigkeit aus, ohne von weiteren Kofaktoren abhängig zu sein. Isotopen-

markierungsexperimente zeigten, daß sich beide Sauerstoffatome der entstehenden IES,

unter Verwendung von H218O, markieren ließen. Zusammen mit immunologischen

Befunden deutet dieses Ergebnis auf die Beteiligung einer Nitrilase bzw. eines nitrilase-

ähnlichen Enzyms hin. Unklar blieb indes die genaue enzymatische Zusammensetzung der

IES-Synthase, wie auch der biochemische Verlauf der Trp-Umsetzung, da keine inter-

mediären Metabolite identifiziert wurden, was darauf hindeutet, daß es sich hier um einen

enzymatisch kanalisierten Reaktionsverlauf handelt, wie er beispielsweise für den

Tryptophan-Synthase-Bienzymkomplex (α2β2) von Salmonella tryphimurium gezeigt

werden konnte (PAN et al., 1996).

Einleitung

9

Die Regulation der Auxinhomöostase stellt ein äußerst komplexes Netzwerk pflanzlicher

Entwicklungssteuerung dar, für deren Verständnis ein umfassendes Wissen aller

metabolischer Vorgänge und deren Regulation unverzichtbar ist. Aus diesem Grund sollte

im Rahmen dieser Arbeit versucht werden, enzymatische wie auch biochemische

Charakteristika der tryptophanabhängigen IES-Biosynthese in A. thaliana im Detail zu

untersuchen. Basierend auf der Arbeit von MÜLLER & WEILER (2000a) bestand das Ziel

darin, den IES-Synthase-Komplex aus A. thaliana proteinbiochemisch hoch anzureichern,

um so die massenspektrometrische Identifikation enzymatischer Bestandteile des Multi-

enzymkomplexes zu ermöglichen. Darüber hinaus wurde die Identifikation von Intermedi-

aten der IES-Synthase-katalysierten Trp-Umsetzung angestrebt.

Material & Methoden

10

2 Material und Methoden

2.1 Liste der verwendeten Geräte und Feinchemikalien

2.1.1 Geräte

Autoklav Vapoklav Typ 500 H+P Labortechnik, Oberschleißheim

Brutschrank UM 660 Memmert, Schwabach

Elektroporationsgerät

Capacitance Extender II, BioRad, München

Puls Controller II, Gene Pulser II

Flüssigkeits-Szintillationszähler LS 6000 TA Beckman, München

Elektro-Eluter Modell 422 Bio-Rad, München

FPLC-System

Peristaltikpumpe P 1 Pharmacia Biotech, Freiburg

Pumpen P 500

Programmgeber GP 250

Fraktionskollektor Frac-100

Leersäulen

Econo UV-Detektor Bio-Rad, München

GC- und GC-MS-Systeme

GC 3400 Gaschromatograph Varian, Darmstadt

MAT Magnum Massenspektrometer Finnigan MAT, Bremen

Varian Saturn 2000 Varian, Darmstadt

GC-Säulen:

DB-17 (0.25 mm x 30 m, stat. Phase 0.25 µm) Supelco, Bellefonte, USA

ZB-50 (0.25 mm x 30 m, stat. Phase 0.25 µm) Phenomenex, Aschaffenburg

Gelelektrophoresezubehör

Flachbettkammern für Agarosegele Universitätswerkstatt Bochum

Polyacrylamid Minigelkammern

Glasplatten und Zubehör für Minigele Biometra, Göttingen

Elektroblotkammer EB10 BiocomDirect, Bridge of Weir, UK

2D Gel-System Protean XL II BioRad, München

Elektroblotkammer Trans-Blot Cell

Gradientenformer Modell 385

Material & Methoden

11

Geltrockner Savant SGD 4050 Savant, München

HPLC-Systeme

Varian Dynamax SD-200 Varian, Darmstadt

Varian Dynamax UV-1

Waters 600E System Controller Waters, Milford, USA

Spektrophotometer Lambda Max 481

Waters 510 HPLC-Pumpen

HPLC-Säulen

ZorbaxSil (4 mm x 250 mm, stat. Phase 5 µm) Knauer, Bad Homburg

Luna C18 (4 mm x 250 mm, stat. Phase 5 µm) Phenomenex, Aschaffenburg

Inkubationsschüttler Modell G25 New Brunswick, Edison, USA

Netzgeräte

PS 304 Gibco BRL, Neu-Isenburg

PS 3002

EPS 3501 Pharmacia Biotech, Freiburg

PCR-Thermoblock Triblock Biometra, Göttingen

Perfusionschromatographieanlage BioCAD Sprint Perceptive BioSystems, Weiterstadt

mit Gelfiltrationssäule Bio-Silect SEC 125-5 Bio-Rad, München

Photoaffinitätsmarkierungsbedarf

Quecksilberhochdrucklampe HBO 500 W/2 Oriel, Darmstadt

mit Stromgeber und Quarzkollektor

Kühlaggregat FT 800 Fryka-Kühltechnik, Esslingen

Photometer

DU 7400 Beckman, München

ELISA-Photometer Easyreader EAR 400 AT SLT, Laborinstrumente, Overath

GeneQuant II Pharmacia Biotech, Freiburg

NovaSpec II

Uvikon 810 Kontron, Echingen

Phospho-Imager BAS-1500 mit Eraser und Raytest, Sprockhövel

Tina 2.09 Computerprogramm

Rotationsverdampfer Rotavapor RE III Büchi, Schweiz

Sterilbänke

Gelaire BSB3 Flow Laboratories, Meckenheim

danLAV VFR1206 GS Claus Damm, Lobebaek, Dänemark

Material & Methoden

12

Ultraschallgeräte

Sonorex RK 510 S Bandelin, Berlin

Sonifier B-17 Branson, Banburry, USA

Ultrazentrifugen

Tischultrazentrifuge TL 100 mit Rotor TLA 45 Beckman, München

OTD Kombi mit Rotor T 8.65 DuPont GmbH, Bad Homburg

UV-Handlampe HL-6-MK Bachofer, Reutlingen

UV-Stratalinker 1800 Stratagene, Heidelberg

Vakuumpumpe PC 5 Vakuubrand, Wertheim

Vakuumtrockner Speedvac Univapo 100H Uniequip, Martinsried

Zentrifugen

Sorvall RC-5B Plus DuPont, Bad Homburg

Rotoren: SS34, GSA Kontron, Neufahrn

Biofuge fresco Heraeus Sepatech, Hanau

Biofuge pico

Alle weiteren verwendeten Geräte entsprachen den üblichen Laborstandards.

2.1.2 Verbrauchsmaterialien

Chromatographiematrizes

C18-Säulen (Bond-Elut) ITC-Handels-GmbH

CNBr-aktivierte Sepharose Pharmacia Biotech, Freiburg

Protein G Sepharose Pharmacia Biotech, Freiburg

Macro-Prep Ceramic Hydroxyapatit Typ II; 20 µm

Bio-Rad, München

Macro-Prep High Q

Nitrilotriessigsäure-Agarose, Ni2+ beladen (Ni-NTA)

Qiagen, Hilden

PD-10 Entsalzungsäulen Pharmacia Biotech, Freiburg

Strep-Tactin-Sepharose IBA, Göttingen

Dialysemembran Typ 20, 12-16 kDa, 25 Å Biomol, Hamburg

Gel-Blotting-Papier GB 002 Schleicher & Schuell, Dassel

Glasfaserfilter GF 6 (25 mm Ø) Schleicher & Schuell, Dassel

Nitrocellulose, BA85, 0.45 µm Schleicher & Schuell, Dassel

Sterilfilter, 0.22 µM Millipore, Eschborn

Material & Methoden

13

Zentrifugen-Filtereinheiten

Centriprep YM-10, 10 kDa Millipore, Eschborn

Centriprep YM-30, 30 kDa

Centriprep YM-50, 50 kDa

Centricon YM-10, 10 kDa

2.1.3 Fein- und Radiochemikalien

Acetanilid Aldrich, München

Acrylamid Serva, Heidelberg; BioRad, München

Agar-Agar Merck, Darmstadt

Agarose Seakem LE, Rockland, USA

Ampicillin Serva, Heidelberg

Amino-n-capronsäure Sigma, München

Anhydrotetracyclin IBA, Göttingen

L-Asparagin Sigma, München

Bacto-Agar Difco, Hamburg

Bacto-Trypton Difco, Hamburg

Bacto-Hefeextrakt Difco, Hamburg

Bis-(2-hydroxyethyl)-imino-tris-(hydroxy- methyl-)methan (Bis-Tris)

Biomol, Hamburg

5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosid (X-Gal)

Biomol, Hamburg

5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat (BCIP) Biomol, Hamburg

Bromphenolblau Merck, Darmstadt

L-Canavanin Sigma, München

L-Citrullin Sigma, München

Desthiobiotin Sigma, München

Desoxynukleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Roche Diagnostics, Mannheim

1,4-Dithiothreitol (DTT) Biomol, Hamburg

λ DNA-HindIII + ΦX174 DNA-HaeIII Mix DNA Standard

Finnzymes OY, Espoo, Finnland

Ethidiumbromid Sigma, München

Ethylendiamin-N,N,N’,N’-tetraessigsäure (EDTA) Roche Diagnostics, Mannheim

Freundsches Adjuvans, inkomplett Sigma, München

Gelrite Nordwald, Schweizerhall

Material & Methoden

14

L-Glutamin Lancaster Synthesis, UK

Glycylglycin Sigma, München

Guanidinthiocyanat Applichem, Darmstadt

Hydantoinsäure Sigma, München

Hydroluma Szintillator Baker, Deventer, Niederlande

4-Hydroxyazobenzen-2-carboxylsäure (HABA) Sigma, München

N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES)

Biomol, Hambrg

5-Hydroxy-L-tryptophan Sigma, München

Indol-3-acetamid Aldrich, München

Indol-3-acethydrazid Aldrich, München

Indol-3-acetonitril Sigma, München

Indol-3-essigsäure Sigma, München

N-Lauroylsarcosin Sigma, München

Molekulargewichtsmarker LMW, HMW-nativ Pharmacia Biotech, Freiburg

3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure (MOPS) Biomol, Hamburg

Natriumdodecylsulfat (SDS) Serva, Heidelberg

Nikotinsäureamid Sigma, München

p-Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT) Biomol, Hamburg

Octylphenol-polyethylenglycolether (Triton X-100)

Sigma, München

Polyvinylpyrrolidon (Polyklar AT) Serva, Heidelberg

Ponceau S Sigma, München

Powerplay Proteinpulver Wander, Celle

Salicylsäureamid Aldrich, München

Serva-Blue G, Serva-Blue R Serva, Heidelberg

N, N, N’, N’-Tetramethylethylendiamin (TEMED) Sigma, München

N-Tris-(hydroxymethyl)-methylglycin (Tricin) Biomol, Hamburg

[2H]2-Indol-3-essigsäure 98 % Promochem, Wesel

[2H]5-Indol-3-essigsäure 98 % Promochem, Wesel

[3H]3-L-Serin 98 % Promochem, Wesel

[2H]5-L-Tryptophan 98 % Promochem, Wesel

Alle hier nicht aufgeführten Chemikalien wurden in Analyse-Qualität von den Firmen

Biomol, Roche Diagnostics, Difco, Riedel de Haën, Serva und Sigma bezogen.

Material & Methoden

15

2.2 Enzyme und Antikörper

2.2.1 Enzyme

Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm Roche Diagnostics, Mannheim

AMV reverse Transkriptase Promega, Madison, USA

Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I Roche Diagnostics, Mannheim

Lysozym Serva, Heidelberg

Restriktionsendonukleasen Roche Diagnostics, Mannheim

MBI Fermentas, St. Leon-Rot

Takara, Taufkirchen

New England Biolabs, Frankfurt

RNase A Serva, Heidelberg

T4-DNA-Ligase Roche Diagnostics, Mannheim

Taq-Polymerase (DyNAzyme) Finnzymes OY, Espoo, Finnland

Taq-Polymerase (DyNAzyme EXT) Finnzymes OY, Espoo, Finnland

Strep-Tactin alkalische Phosphatase Konjugat IBA, Göttingen

2.2.2 Antikörper

Antikörper Antigen Herkunft/Referenz

α-NIT1 Kaninchenserum (602) denaturiertes Nitrilase 1 Protein

SCHMIDT et al., 1996

α-NIT4 Kaninchenserum (641) natives Nitrilase 4 Protein Lehrstuhlbestand, unveröffentlicht

α-AMI1 Kaninchenserum (645) natives Amidase 1 Protein diese Arbeit

α-AMI2 Kaninchenserum (644) denaturiertes Amidase 2 Protein

diese Arbeit

α-YUC Kaninchenserum (643) denaturiertes YUCCA Protein diese Arbeit

α-RGS-(His)4 Maus-IgG XRGSH(4-6)X Epitop Qiagen, Hilden

Ziege-α-Maus-IgG gekoppelt an alkalische Phosphatase

schwere und leichte Ketten von Maus Immunglobulinen

Serva, Heidelberg

Ziege-α-Kaninchen-IgG gekop-pelt an alkalische Phosphatase

Fc-Abschnitte von Kaninchen Immunglobulinen

Serva, Heidelberg

Material & Methoden

16

2.3 Nukleinsäuren

2.3.1 Oligonukleotide

Die verwendeten Oligonukleotide wurden von der Firma Invitrogen synthetisiert.

Vorhandene Restriktionsschnittstellen sind markiert. Die Abkürzungen entsprechen der

IUPAC-Nomenklatur für Nukleinsäuren.

Name Sequenz Schnittstelle

NIT1-Strt 5’-TATACTAGTATGTCTAGTACTAAAGAT-3’ SpeI, ScaI

NIT1-IBA3-Rev 5’-TTATTACGTCTCTGCGCTTTTGTTTGAGTCATCCTCAG-3’ Esp3I

AMI1-IBA5-Start 5’-TATCGTGGTCTCGGCGCCGCGACCAATAATGATTTTGG-3’ Eco31I

AMI1-IBA5-Rev 5’-TATCGTGGTCTCGTATCATCAAATAAATGCAGCAAGGG-3’ Eco31I

AMI2-Eco31I 5’-GCTATAGGTCTCGAATGAGCGTTCTTGAACTC-3’ Eco31I

AMI2-Rev 5’-TTCTGAGGTCTCGGCGCTAATGTGTAACCTACGGGGAG-3’ Eco31I

AMI2-SphI 5’-TATAGTGCATGCAGCGTTCTTGAACTC-3’ SphI

AMI2-SalI 5’-TATATAGTCGACTCAAATGTGTAACCTACCGGG-3’ SalI

YUCCA-BamHI 5’-TAGTCCGGATCCATGGAGTCTCATCCTCAC-3’ BamHI

YUCCA-HindIII 5’-TATGGAAAGCTTTTAGGATTTAGAGGTAAAGAC-3’ HindIII

pASK-IBA-Forw 5’-GAGTTATTTTACCACTCCCT-3’

pASK-IBA-Rev 5’-CGCAGTAGCGGTAAACG-3’

Material & Methoden

17

2.3.2 Plasmid-Vektoren

Plasmid Herkunft/Referenz

pASK-IBA 3 IBA, Göttingen

pASK-IBA 5 IBA, Göttingen

pBluescript SK+ (pBS-SK+) Stratagene, Heidelberg

pET-NIT1 VORWERK et al., 2001

pET-NIT2 VORWERK et al., 2001

pET-NIT3 VORWERK et al., 2001

pLUT5 EMANUELE et al., 1995

pSTB7 MILES et al., 1989

pQE 30 Qiagen, Hilden

Einige dieser Plasmide wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von: Dr. Ilme

Schlichting, Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie, Dortmund (CB 149/pSTB7),

Prof. Dr. P.F. Fitzpatrick, Texas A&M Universität, College Station, USA (pLUT5).

2.4 Biologisches Material

2.4.1 Bakterienstämme

Stamm Genotyp Herkunft/Referenz

BL21 (DE3) F-, ompT, hsdSB (rB– mB–), gal, dcm (DE3)

pLysS (cmr)

Novagen, Madison, USA

CB 149 ∆trpEDCBA2, hsdR514 MILES el al., 1989

XL-1 Blue recA1, endA1, gyrA96, thi1, hsdR17 (rK-,

mK+), supE44, relA1, λ-, lac-, [F’, proAB,

lacIq, Z∆M15, Tn10 (tetr)]

BULLOCK et al., 1987

Material & Methoden

18

2.4.2 Pflanzenmaterial

Als Untersuchungsobjekt dieser Arbeit diente Arabidopsis thaliana (L.) HEYNH. C24.

Entsprechendes Saatgut wurde freundlicherweise von Prof. Dr. L. Willmitzer, Max-

Planck-Institut für molekulare Pflanzenphysiologie, Golm, zur Verfügung gestellt.

2.5 Anzucht und Lagerung des biologischen Materials

2.5.1 Anzucht, Transformation und Lagerung von Bakterien

Die Anzucht von Escherichia coli erfolgte in 2YT-Flüssigkultur (AUSUBEL et al., 1995) in

einem Inkubationsschüttler bei 220 upm oder auf Festmedium (LB-Agarplatten, AUSUBEL

et al., 1995) im Brutschrank bei einer Standardtemperatur von 37 °C. Die Transformation

der Bakterien mit Plasmid-DNA erfolgte mittels Elektroporation (AUSUBEL et al., 1995).

Transformanden wurden unter Selektionsdruck mit Ampicillin (Amp, 100 µg/ml) ange-

zogen. Zur längerfristigen Aufbewahrung wurden die verwendeten Bakterienstämme in

Lagermedium [65% (v/v) Glycerin, 0.1 M MgSO4, 0.025 M Tris/HCl, pH 8.0] bei

- 20 °C verwahrt.

2.5.2 Anzucht von Escherichia coli zur heterologen Überexpression von

Proteinen

Die Anzucht von N-terminalen bzw. C-terminalen Strep-Fusionsproteinen erfolgte mittels

pASK-IBA Derivaten in Anlehnung an das Protokoll des Herstellers (IBA, Göttingen). Die

Überexpression wurde, wenn nicht gesondert ausgewiesen, durch die Gabe von 0.2 µg/ml

Anhydrotetracyclin induziert.

Zur Überexpression von Proteinen mittels pQE-30- (Qiagen, Hilden) bzw. pET21-b-

Derivaten (Novagen, Madison, USA) in E. coli wurden 30 ml 2YT-Medium (mit

100 µg/ml Ampicillin) 1:3000 aus einer Stammkultur inokuliert und über Nacht bei 37 °C

im Inkubationsschüttler inkubiert. Aus dieser Übernachtkultur wurden 300 ml 2YT-

Medium 1:10 unter entsprechendem Selektionsdruck beimpft. Nach zweistündiger

Inkubation bei 37 °C erfolgte die Induktion der (His)6-markierten Proteine durch die

Zugabe von IPTG (0.5 mM Endkonzentration). Nach weiteren 4 Stunden Inkubation

wurden die Bakterien durch Sedimentation geerntet und die überexprimierten Proteine

isoliert.

Material & Methoden

19

Die Expression einer bakteriellen Tryptophan-2-Monooxygenase aus Pseudomonas

savastanoi erfolgte mittels des Konstruktes pLUT5 im E. coli Stamm XL-1 Blue in

Anlehnung an EMANUELE et al. (1995). Zu diesem Zweck wurden 300 ml 2YT-Medium

(mit 100 µg/ml Ampicillin) 1:25 aus einer Übernacht-Kultur angeimpft. Nach 18 stündiger

Inkubation bei 37°C wurden die Bakterien durch Zentrifugation (30 min, 5000 upm, 4°C)

geerntet und die Sedimente bei - 80 °C eingefroren.

Der Tryptophan-Synthase-Komplex von Salmonella typhimurium wurde unter Kontrolle

des Tryptophanoperons im Escherichia coli Stamm CB 149/pSTB7 überexprimiert. Die

Anzucht der Bakterien erfolgte nach MILES et al. (1989), wobei dem Medium jeweils

50 mg/l Ampicillin und dem Induktionsmedium zusätzlich 5 g/l Tryptophan zugegeben

wurden. Die geernteten Bakterien wurden bei - 80 °C gelagert.

2.5.3 Anzucht nicht steriler Pflanzen

Die Anzucht der Pflanzen erfolgte unter Gewächshausbedingungen bei einer

Lichtintensität von 150 µE m-2s-1 auf einer Mischung aus gesiebter Standarderde und Sand

im Verhältnis 2:1. In den ersten 4 – 5 Wochen wurden die Pflanzen unter

Kurztagbedingungen (8 h) gehalten, danach wurden sie in den Langtag (16 h) gesetzt. Das

Gewächshaus wurde auf eine konstante Temperatur von 22 – 24 °C am Tag bzw.

18 – 20 °C in der Nacht eingeregelt.

2.5.4 Sterilisation des Saatguts

Saatgut wurde für 2 min mit 70 % (v/v) Ethanol behandelt und anschließend für 5 min mit

5% (v/v) Natriumhypochlorid sterilisiert. Das Hypochlorid wurde durch fünfmaliges

Waschen mit sterilem Wasser entfernt und die Samen in sterilem Wasser mit 0.1% Agar

aufgenommen.

2.5.5 Aussaat und Anzucht auf Festmedium

Sterilisiertes Saatgut wurde auf festem MS-Medium (MURASHIGE & SKOOG, 1962) mit

2 % Saccharose unter sterilen Bedingungen ausgesät. Die Platten wurden mit Parafilm

verschlossen. Das Saatgut wurde bei 4 °C für 2 Tage stratifiziert. Die Anzucht erfolgte in

einer Phytokammer unter kontrollierten Bedingungen (8 h Photoperiode bei 24 °C und

105 µE s-1m-2, 16 h Dunkelheit bei 20 °C, 70 % relative Luftfeuchtigkeit). Nach 4 Wochen

wurden die Pflanzen in sterilisierte Weckgläser mit MS-Festmedium umgesetzt, erneut mit

Material & Methoden

20

Parafilm verschlossen und für weitere 4 – 6 Wochen unter den oben angeführten

Bedingungen kultiviert.

2.6 Molekularbiologische Methoden

2.6.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli

Die schnelle Isolierung von Plasmiden aus E. coli erfolgte mittels alkalischer Lyse nach

BIRNBOIM & DOLY (1979) aus 1.5 ml einer über Nacht gewachsenen 4 ml 2YT-Kultur

(2.5.1).

2.6.2 Isolierung von Gesamt-RNA aus Pflanzen

Zur Gewinnung von Gesamt-RNA aus A. thaliana wurden 0.5 g Pflanzenmaterial geerntet

und nach BARKAN (1989) aufgearbeitet. Diese Methode beruht auf dem Aufschluß

pflanzlichen Materials unter proteindenaturierenden Bedingungen in Guanidinthiocyanat.

Die nach abschließender, selektiver Fällung mittels Lithiumchlorid erhaltene RNA wurde

in 60 µl nukleasefreiem Wasser resuspendiert und bei -80 °C gelagert. Die Quantifizierung

erfolgte photometrisch bei einer Wellenlänge von 254 nm. Die Qualität der gewonnenen

RNA wurde anhand der Unversehrtheit der ribosomalen RNAs mittels denaturierender

Agarosegelelektrophorese (2.6.6) kontrolliert.

2.6.3 Enzymatische Manipulation von Nukleinsäuren

Alle verwendeten Techniken, Puffer und Medien entsprachen den Standardprotokollen und

wurden nach AUSUBEL et al. (1995), bzw. SAMBROCK et al. (1989) durchgeführt oder

hergestellt.

Zur in-vitro-Rekombination wurde die DNA unter Verwendung von Typ II Restriktions-

endonukleasen nach den Herstellerempfehlungen restringiert und die DNA-Fragmente über

Horizontalgelelektrophorese (2.6.6) in Agarosematrizes separiert. Die gewünschten

Fragmente wurden mit Hilfe des NucleoSpin Extract Kits (Macherey & Nagel, Düren)

eluiert. Die Ligation von DNA-Fragmenten in kompatible Enden von Plasmid-Vektoren

erfolgte nach AUSUBEL et al. (1995). Zur Klonierung von Fragmenten mit kohäsiven,

inkompatiblen Enden wurden 5’- bzw. 3’-überhängende Enden unter Verwendung des

Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I aufgefüllt bzw. verdaut (AUSUBEL et al., 1995).

Material & Methoden

21

2.6.4 Erzeugung von komplementärer DNA

Komplementäre DNA wurde durch reverse Transkription gewonnen. Dazu wurde RNA

(2 µg) aus Wurzeln oder grünen Blättern von A. thaliana-Pflanzen in cDNA umge-

schrieben. Die reverse Transkription erfolgte unter Verwendung eines AMV-RT Kits

(Promega, Madison, USA) und Oligo-d(T)25-Starteroligonukleotiden (Sigma, München)

nach den Vorgaben des Herstellers. Ein Aliquot (7 µl) der gewonnenen DNA-RNA-

Hybride wurde anschließend in einer Polymerase-Kettenreaktion (2.6.5) eingesetzt.

2.6.5 Polymerase-Kettenreaktion

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde mit der DyNAzyme DNA-Polymerase

(Finnzymes OY, Espoo, Finnland) in 50 µl DyNAzyme-Puffer und je 200 µM

Didesoxynukleotiden (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) durchgeführt. Die jeweils eingesetzte

Menge an DNA-Matrize und Oligonukleotiden sowie die verwendeten Reaktions-

bedingungen sind bei entsprechend aufgeführten Experimenten angegeben.

2.6.6 Gelelektrophoretische Trennung von Nukleinsäuren

Die Trennung von DNA-Fragmenten erfolgte unter Verwendung von TA-Puffer [40 mM

Tris/Na-Acetat, pH 7.5, 20 mM Na-Acetat, 1 mM EDTA, 0.5 µg/ml Ethidiumbromid] in

Agarosegelen (0.8 % - 1.8 % (w/v) Agarose in TA-Puffer). Als Größenstandard diente ein

λ DNA - HindIII und ΦX174 DNA - HaeIII Mix der Firma Finnzymes OY (Espoo,

Finnland).

Gesamt-RNA wurde unter denaturierenden Bedingungen in Agarosegelen (1.8 % (w/v)

Agarose in MOPS-Puffer [0.2 M MOPS, pH 8.0, 50 mM Na-Acetat, 10 mM EDTA] mit

6 % (v/v) Formaldehyd) unter Verwendung von MOPS-Puffer (pH 7.0) als Laufpuffer,

aufgetrennt.

2.6.7 Sequenzierung doppelsträngiger DNA

Alle Sequenzierungen, welche in dieser Arbeit dargelegt werden, wurden von der Firma

Qiagen, Hilden durchgeführt.

Material & Methoden

22

2.7 Biochemische Methoden

2.7.1 Kopplung von 5-Hydroxy-L-tryptophan an Rinderserumalbumin

Das 5-Hydroxy-L-tryptophan wurde durch Diazokopplung über eine Brücke aus

p-Aminohippursäure an Rinderserumalbumin (RSA) kovalent gebunden (WEILER, 1980).

Dazu wurden 200 mg p-Aminohippursäure in 120 ml H2O gelöst und 200 mg RSA

hinzugefügt. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 8.2 eingestellt. Die Lösung wurde unter

Rühren für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend mit 200 mg 1-Ethyl-3-(3-

Dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDAC) versetzt, und der pH-Wert auf 6.8 eingestellt.

Der Reaktionsansatz wurde darauf für 6 h in Dunkelheit unter Rühren bei Raumtemperatur

inkubiert und anschließend mit zusätzlichen 100 mg EDAC versetzt. Nach einer weiteren

Inkubation über 15 h wurde der Ansatz gegen Wasser dialysiert (12 h) und lyophilisiert.

Zur Kopplung des substituierten RSAs an 5-Hydroxy-L-tryptophan wurden 30 mg des

gefriergetrockneten Proteins in 5 ml H2O gelöst, mit konzentrierter Salzsäure angesäuert

(pH 1.5), und im Eis / Kochsalzbad auf 0 °C abgekühlt. Sodann wurde dem Reaktions-

ansatz nacheinander eiskalte NaNO2- (60 mg in 0.5 ml H2O) und NH4SO3NH2-Lösung

(30 mg in 0.5 ml H2O) tropfenweise zugefügt, wobei sich der Ansatz gelblich färbte.

Abschließend wurde der gesamte, diazotierte Ansatz tropfenweise in 10 ml 0.1 M

Boratpuffer, pH 9.0, in dem 10 mg 5-Hydroxy-L-tryptophan gelöst waren, gegeben,

worauf sich die Farbe der Lösung schlagartig von gelb nach blutrot änderte. Der Ansatz

wurde über Nacht bei 4 °C gegen Wasser dialysiert und darauf in 2 ml Aliquots bei -20 °C

gelagert.

2.7.2 Synthese von [3H]3-6-Azido-L-tryptophan

Die Synthese von [3H]3-6-Azido-L-tryptophan erfolgte in Anlehnung an MELHADO et al.

(1982), hierzu wurden 50 mg 6-Nitroindol in ethanolischer Lösung an wasserfreiem

Raney-Nickel unter Rühren und ständiger H2-Zugabe (45 min) in 6-Aminoindol überführt.

Das Reaktionsprodukt wurde über Watte von dem Raney-Nickel befreit und unter N2

getrocknet. Anschließend wurden 40 mg des 6-Aminoindols in 3.2 ml 80 %-iger Essig-

säure gelöst und auf 0 °C (Eis / Kochsalzbad) abgekühlt. Dem Reaktionsansatz wurde

unter Rühren eiskalte NaNO2-Lösung (23 mg in 0.8 ml H2O) tropfenweise hinzugefügt.

Nach einer Inkubation von 5 min wurde der Ansatz tropfenweise mit eiskalter NaN3-

Material & Methoden

23

Lösung (21.7 mg in 0.8 ml H2O) versetzt und für weitere 2.5 h im Dunkeln unter Stickstoff

bei 0 °C inkubiert.

Die resultierende schwarzbraune Lösung wurde bei 30 °C Wasserbadtemperatur im

Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der ölige Rückstand wurde in 5 ml Ethanol p.A.

aufgenommen und mit zwei Spatelspitzen Aktivkohle versetzt. Die Lösung wurde gut

durchmischt und auf eine Kieselgur-Säule (0.3 – 0.4 mm Korngröße, Länge: 6 cm,

Ø: 1 cm) gegeben. Das 6-Azidoindol wurde mit 10 ml heißem Ethanol p.A. von der Säule

eluiert und im Vakuum zur Trockne gebracht.

Abschließend wurde das 6-Azidoindol enzymatisch, unter Verwendung einer heterolog

exprimierten Tryptophan-Synthase aus Salmonella typhimurium (MILES et al., 1989), zum

6-Azido-L-tryptophan umgesetzt. Hierzu wurden 37 MBq (50 nmol) [3H]3-L-Serin

(spezifische Aktivität: 740 TBq/mmol) und 15.8 µg 6-Azidoindol in 10 µl Ethanol p.A.

gelöst und mit 190 µl 100 mM Tris/HCl, pH 8.0 versetzt. Der Ansatz wurde mit ca. 5 mg

Tryptophan-Synthase (2.8.3) in 100 µl Puffer T [50 mM Tris/HCl, pH 7.8, 5 mM EDTA,

10 mM β-Mercaptoethanol, 0.1 mM Pyridoxalphosphat] versetzt, gut gemischt und für

4.5 h unter N2 in Dunkelheit bei Raumtemperatur belassen. Anschließend wurden dem

Reaktionsansatz, zur Fällung der Proteine, 1.5 ml eiskaltes Methanol p.A. zugegeben,

worauf eine Inkubation bei 4 °C über Nacht folgte.

Die trübe Lösung wurde 3 min bei 13000 upm zentrifugiert und das Sediment dreimal mit

je 0.5 ml Methanol nachgewaschen. Die vereinigten Überstände wurden unter Stickstoff

bis zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in 200 µl HPLC-Laufmittel

(50 % Methanol (v/v)) aufgenommen und über eine Luna C18-Säule (Phenomenex,

Aschaffenburg) gereinigt (2.10.1.1), wobei der Chromatographieverlauf über einen

Durchflußszintillationszähler verfolgt und die radioaktive Fraktion manuell gesammelt

wurde. Die Authentizität der photolabilen Azidogruppe wurde durch den Vergleich von

UV-Spektren des Reaktionsproduktes vor und nach Belichtung (305 nm) nachgehalten

(ohne Abbildung).

2.7.3 Synthese von [3H]2-6-Azidoindol-3-acetamid

Ausgehend vom [3H]3-6-Azido-L-tryptophan konnte das [3H]2-6-Azidoindol-3-acetamid

enzymatisch dargestellt werden. Hierzu wurden 9.25 MBq [3H]3-6-Azido-L-tryptophan in

1 ml 100 mM Tris/HCl, pH 8.3 aufgenommen. Der Ansatz wurde mit 2 ml einer

Material & Methoden

24

Tryptophan-2-Monooxygenase (TMO) Präparation (14 – 15 mg Protein/ml) (2.8.2) ver-

setzt und über 3 h bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Der Reaktionsansatz wurde darauf mit

konzentrierter Salzsäure angesäuert (pH 2.0) und zweimal mit je 5 ml Ethylacetat

extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden getrocknet, in 200 µl HPLC-

Laufmittel ([60 % iso-Hexan, 40 % Ethylacetat gesättigt mit 0.5 M Ameisensäure], 10 %

(v/v) Methanol) aufgenommen und über eine ZorbaxSil-Säule (5 µm, 4.0 x 250 mm)

gereinigt. Der Chromatographieverlauf konnte über einen Durchflußszintillationszähler

nachgehalten und die [3H]2-6-Azidoindol-3-acetamid Fraktion gesammelt werden. Wie

schon beim [3H]3-6-Azido-L-tryptophan (2.7.2) wurde die Photoaktivierbarkeit der

Azidogruppe durch den Vergleich der UV-Spektren vor und nach Belichtung mit UV-Licht

(305 nm) überprüft (ohne Abbildung).

2.7.4 Synthese von [2H]5-Indol-3-acetamid

Neben dem radioaktiven 6-Azidoindol-3-acetamid wurde auch pentadeuteriertes [2H]5-

Indol-3-acetamid als interner Standard für GC-MS-Analysen bzw. als markiertes Substrat

für enzymatische Untersuchungen dargestellt. Für die Synthese wurde 1 mmol [2H]5-L-

Tryptophan mit einer Isotopenreinheit von 98 % (Cambridge Isotope Laboratories,

Andover, MS, USA) in Wasser aufgenommen und, wie in Kap. 2.7.3 beschrieben, mit

Hilfe einer Tryptophan-2-Monooxygenase enzymatisch zu [2H]5-Indol-3-acetamid

umgesetzt und extrahiert. Nach Entfernen des Lösungsmittels am Rotationsverdampfer

wurde der Rückstand in 1 ml Chloroform aufgenommen, zentrifugiert und das [2H]5-Indol-

3-acetamid auf Kieselgel mit dem oben angeführten Laufmittel (2.7.3) dünnschicht-

chromatograpisch vorgereinigt. Die UV-positive, indolische Lauffront (Rf = 0,19) wurde

mit 20 ml Methanol extrahiert und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Abschließend

wurde der Extrakt mittels HPLC an einer ZorbaxSil-Säule (siehe 2.10.1.2) ein weiteres

Mal gereinigt. Produkt- und Isotopenreinheit wurden nach Trifluoracetylierung mit Tri-

fluoressigsäureanhydrid gaschromatographisch-massenspektrometrisch anhand der Signal-

flächen der Fragmentionen m/z = 344, 328, 247 und 231 (chemische Ionisierung,

Rt = 8.70 min) (2.11.5) überprüft und die Stoffmenge photometrisch in Methanol (ε281 =

7.36 x 106 cm2 mol-1) bestimmt.

Material & Methoden

25

2.7.5 Kopplung von Immunglobulin G an Sepharose

Für die Kopplung von Antikörpern an CNBr-aktivierter Sepharose wurden ausschließlich

spezifisch gereinigte IgG-Fraktionen (2.13.5) verwendet. Dazu wurden 0.5 g CNBr-

aktivierte Sepharose 4 Fast Flow nach Angaben des Herstellers durch Säurebehandlung

aktiviert. Die Flüssigkeit wurde nach Absetzen der Matrix dekantiert, diese mit 2 x 50 ml

H2O bidest. gewaschen, und anschließend in Kopplungs-Puffer [0.1 M NaHCO3, pH 8.3,

0.5 M NaCl] aufgenommen. Die Kopplung erfolgte nach Zugabe von 5 ml IgG-Lösung

über Nacht bei 4 °C im Überkopfschüttler. Freie Bindestellen wurden durch Inkubation

(2 h) in 0.1 M Tris, pH 8.0 abgesättigt. Abschließend wurde die Matrix in 5 Zyklen mit

alternierendem pH-Wert gewaschen (Waschpuffer I [0.1 M NaAc, pH 4.0, 0.5 M NaCl],

Waschpuffer II [0.1 M Tris, pH 8.0, 0.5 M NaCl]).

2.8 Präparationsmethoden

2.8.1 Gewinnung bakteriell überexprimierter Strep-tag-II- und (His)6-

Fusionsproteine

Die Reinigung bakteriell überexprimierter Strep-tag-II-AMI1- und (His)6-NIT1-3-Fusions-

proteine erfolgte unter nativen Bedingungen durch Affinitätschromatographie unter

Verwendung von Strep-Tactin-Sepharose (AMI1), bzw. einer Ni2+-beladenen Nitrilotri-

essigsäure (Ni-NTA)-Agarose (NIT1-NIT3) nach Angaben der Hersteller (IBA, Göttingen

bzw. Qiagen, Hilden).

Strep-tag-II-AMI2-Fusionsproteine wurde in Anlehnung an KOBAYASHI et al. (1997) unter

denaturierenden Bedingungen aus Einschlußkörpern gewonnen. Dazu wurden die

Bakterien durch Ultraschallbehandlung (6 x 10 s) aufgeschlossen, zentrifugiert (12000 x g,

4 °C, 30 min) und die präzipitierten Zelltrümmer und Einschlußkörper in Lysis-Puffer

[50 mM Tris/HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 % (v/v) Triton X-100]

resuspendiert. Auf diese Weise ließen sich solubilisierte Membranfragmente durch

Zentrifugation (17000 x g, 4 °C, 15 min) abtrennen. Das resultierende Sediment wurde in

5 ml Dialyse-Puffer [30 mM Tris/HCl, pH 7.5, 30 mM NaCl, 1 mM DTT] mit 8 M

Harnstoff resuspendiert und für 12 h bei 4 °C gegen Dialyse-Puffer mit 4 M Harnstoff

dialysiert. Anschließend folgte eine Dialyse gegen harnstofffreien Dialyse-Puffer (24 h,

4 °C). Die auf diese Weise renaturierten Proteine konnten nach Herstellerangaben (IBA,

Göttingen) über Strep-Tactin-Sepharose affinitätschromatographisch dargestellt werden.

Material & Methoden

26

Alternativ wurden (His)6-markierte Amidase-2-Proteine, welche angereichert in Einschluß-

körpern vorlagen, mit Hilfe präparativer Gelelektrophorese gereinigt. Hierzu wurden die

Bakteriensedimente fünfmal mit Lysispuffer [50 mM Tris/HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl,

1 mM EDTA, 0.5 % (v/v) Triton X-100] gewaschen und zentrifugiert (20 min, 15000 upm,

4 °C). Das resultierende Sediment wurde in 5 ml 50 mM Tris/HCl, pH 8.0 aufgenommen

und die Proteine über präparative SDS-Polyacrylamid-Gele nach SCHARF & NOVER (1984)

aufgetrennt. Das (His)6-AMI2-Fusionsprotein wurde abschließend mittels Elektroelution

(2.12.5) aus dem Gel eluiert.

Die Reinigung bakteriell exprimierter (His)6-YUCCA-Fusionsproteine erfolgte unter

nativen Bedingungen nach Herstellerangaben (Qiagen, Hilden) unter Verwendung von Ni-

NTA-Agarose als Affinitätschromatographiematrix. Zur homogenen Darstellung des

rekombinanten YUCCA-Proteins wurde die affinitätschromatographisch angereicherte

Proteinfraktion über denaturierende SDS-Polyacrylamidgele (2.12.1) separiert und das

YUCCA-Protein durch Elektroelution (Electo-Eluter Modell 422, Bio-Rad, München)

nach Protokoll des Herstellers isoliert.

2.8.2 Präparation einer bakteriellen Tryptophan-2-Monooxygenase

Die Anreicherung der heterolog exprimierten Tryptophan-2-Monooxygenase (TMO) aus

Pseudomonas savastanoi erfolgte in Anlehnung an EMANUELE et al. (1995). Das gefrorene

Bakteriensediment (2.5.2) wurde auf Eis aufgetaut, in 1/10 Volumen Lysis-Puffer

[100 mM Tris/HCl, pH 8.3, 12 mM β-Mercaptoethanol, 1 mM EDTA] resuspendiert und

mittels Ultraschallbehandlung (6 x 10 s) aufgeschlossen. Das Lysat wurde zentrifugiert

(20 min, 17000 upm, 4 °C), der Überstand dekantiert und tropfenweise ad 0.55 % (w/v)

mit Polyethylenimin (0.1 g/l) in 100 mM Tris/HCl, pH 8.3 versetzt. Nach einer 60 min

Inkubation unter Rühren wurde der Ansatz zentrifugiert (20 min, 17000 upm, 4 °C) und

das Sediment verworfen. Der Überstand wurde portionsweise mit gepulvertem Ammoni-

umsulfat bis zu einer Sättigung von 60 % versetzt und für 60 min unter Rühren inkubiert.

Gefällte Proteine wurden sedimentiert (15 min, 15000 upm, 4 °C), in einem möglichst

geringen Volumen 100 mM Tris/HCl, pH 8.3 aufgenommen, und über Nacht gegen

800 Volumen 100 mM Tris/HCl, pH 8.3 dialysiert. Die gewonnene TMO Präparation

(14 – 15 mg Protein/ml) wurde aliquotiert und bis zu ihrer Verwendung bei - 20 °C ge-

lagert.

Material & Methoden

27

2.8.3 Reinigung der Tryptophan-Synthase von Salmonella typhimurium

Zur Gewinnung der Tryptophan-Synthase aus Salmonella typhimurium wurden die

gefrorenen Bakteriensedimente (2.5.2) auf Eis aufgetaut, in 1/10 Volumen Puffer T

[50 mM Tris/HCl, pH 7.8, 5 mM EDTA, 10 mM β-Mercaptoethanol, 0.1 mM

Pyridoxalphosphat] resuspendiert und unter Verwendung von Ultraschall (6 x 10 s)

aufgeschlossen. Der Enzymkomplex wurde, wie bei MILES et al. (1989) beschrieben, durch

sequentielle Kristallisation mit Polyethylenglykol 8000 angereichert. Die resultierenden

Kristalle wurden in 20 ml Puffer T resuspendiert, die Proteine mit Ammoniumsulfat

(85 g/l) über 60 min unter Rühren präzipitiert und sedimentiert (20 min, 17000 upm,

4 °C). Die isolierten Proteine wurden in 5 ml Puffer T aufgenommen und über PD-10

Einheiten (Pharmacia Biotech) entsalzt. Bis zur Verwendung konnten die Enzyme bei

- 20 °C gelagert werden.

2.8.4 Präparation pflanzlicher Enzymrohextrakte

Zur Gewinnung von Proteinextrakten wurde, wenn nicht anders angeführt, ausschließlich

Pflanzenmaterial verwendet, welches zuvor in Flüssigstickstoff zerstoßen wurde. Die

Homogenisierung des Pflanzenmaterials erfolgte entweder durch Mörsern mit Seesand

oder durch Mixen im „Waring blendor“ in Homogenisierungspuffer [50 mM HEPES,

pH 7.5, 200 mM Saccharose, 3 mM DTT, 3 mM EDTA, 5 g/l Polyvinylpyrrolidon]. Nach

Filtration des Extraktes über Verbandmull wurden Zelltrümmer, Seesand und Zellwände

durch Zentrifugation (10000 x g, 30 min, 4°C) sedimentiert und verworfen. Eine

Anreicherung der Proteine des Überstandes erfolgte durch Ammoniumsulfatfällung (AS-

Fällung), bei der den Proteinextrakten unter Rühren bei 4 °C gepulvertes Ammoniumsulfat

(AS) portionsweise zugefügt wurde, bis die gewünschte AS-Sättigung (70 %) erreicht war.

Präzipitierte Proteine wurden nach 1 h Inkubation sedimentiert (12000 x g, 20 min, 4 °C),

in Puffer aufgenommen und mittels Dialyse oder Gelfiltration (PD-10, Pharmacia Biotech)

entsalzt. Wenn nicht anders angegeben, wurde die gesamte Dialyse-Fraktion bei

100000 x g zentrifugiert, und der Überstand für anschließende Experimente gewonnen.

2.8.5 Extraktion indolischer Verbindungen aus Pflanzengewebe

Zur qualitativen und quantitativen Analyse indolischer Verbindungen in Arabidopsis

thaliana wurde sowohl unter Gewächshausbedingungen (2.5.3), als auch steril

angezogenes Pflanzenmaterial (2.5.5) herangezogen. Für die Analyse wurden je 0.5 g

Material & Methoden

28

gequollene Samen oder ganze Pflanzen (Blatt und Wurzelgewebe) verwendet. Das Gewebe

wurde unverzüglich nach der Ernte in siedendes Methanol, welches 10 – 50 pmol [2H]5-

Indol-3-acetamid und 100 – 150 pmol [2H]2-Indol-3-essigsäure als interne Standards

enthielt, gegeben und für 10 min gekocht. Anschließend wurde das Gewebe zweimal mit je

20 ml Methanol bei Raumtemperatur reextrahiert (20 min) und die vereinigten Extrakte

filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum zur Trockne gebracht, in HPLC-Laufmittel ([60 %

iso-Hexan, 40 % Ethylacetat gesättigt mit 0.5 M Ameisensäure], 10 % (v/v) Methanol)

aufgenommen und mittels HPLC (2.10.1.2) separiert. Die indolischen Komponenten

wurden isoliert (2.10.1.2), getrocknet und mittels GC-MS/MS (2.11.5) nach

entsprechender Derivatisierung analysiert. Bei ausschließlicher Analyse von Indol-3-

acetamid wurde der Extrakt, wie unter Kap. 2.8.5 beschrieben, dünnschicht-

chromatographisch vorgereinigt.

2.9 Enzymatische Analysen

2.9.1 Photometrische Bestimmung der Aktivität heterolog exprimierter

Amidase

Die Bestimmung der Amidase-Aktivität erfolgte nach der Methode von HILLER & VAN

SLYKE (1933) durch die Analyse des gebildeten Ammoniaks. In dieser sogenannten

Berthelot-Reaktion wird der Ammoniak zu Chloramin umgesetzt, welches mit Phenol eine

blaue Indophenol-Verbindung bildet (BOLLETER et al., 1961). Die Reaktion erfolgte, wenn

nicht gesondert angegeben, in 1 ml Ansätzen [100 mM KPi-Puffer, pH 8.0] mit je 5 µg

gereinigtem Protein und 10 mM Indol-3-acetamid (IAM). Die enzymatische Reaktion

wurde nach 4 h durch die Zugabe von je 0.33 M Natriumphenolat, 0.02 M

Natriumhypochlorid und 0.01 % (w/v) Natriumpentacyanonitrosylferrat (III) gestoppt, und

für 2 min bei 95 °C erhitzt. Nach Abkühlen konnte der Substratumsatz photometrisch bei

640 nm ermittelt werden.

2.9.2 Bestimmung der Aktivität bakteriell exprimierter Amidase mittels

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

Bei erwarteten Substratumsätzen von weniger als 50 µM, oder bei Substraten, die bei ihrer

Hydrolyse kein Ammoniak freisetzten, erfolgte die Quantifizierung der Reaktions-

produkte der Amidase-Reaktion mittels HPLC. Zu diesem Zweck wurden

Material & Methoden

29

Reaktionsansätze, wie unter Kap. 2.9.1 beschrieben, nach 4 h mit 50 µl konzentrierter

Salzsäure versetzt, mit einem Volumen Ethylacetat extrahiert und am Rotationsverdampfer

zur Trockne gebracht. Der Niederschlag wurde in HPLC-Laufmittel ([60 % iso-Hexan,

40 % Ethylacetat gesättigt mit 0.5 M Ameisensäure], 10 % (v/v) Methanol) aufgenommen

und über eine ZorbaxSil-Säule getrennt (2.10.1.2). Der Chromatographieverlauf ließ sich

anhand des UV280-Signals darstellen. Die Quantifizierung der Indol-3-essigsäure

(Rt = 2.65 min) erfolgte nach externer Standardisierung durch die Analyse der UV-

Signalflächen.

2.9.3 Nachweis des Indol-3-acetamid-Umsatzes in pflanzlichen Protein-

extrakten

Zur Untersuchung des Indol-3-acetamid-Umsatzes in pflanzlichen Proteinextrakten wurde

die Umsetzung von [2H]5-Indol-3-acetamid zu [2H]5-Indol-3-essigsäure untersucht, um das

gebildete Reaktionsprodukt von endogen vorhandener Indol-3-essigsäure unterscheiden zu

können. Der Standardreaktionsansatz (300 µl) enthielt in 50 mM KPi-Puffer, pH 8.0, 1 mM

[2H]5-Indol-3-acetamid und 200 µl Proteinrohextrakt (2.8.4) bzw. 100 µl einer

chromatographisch angereicherten Proteinfraktion (2.10.2.1). Die Reaktionsprodukte

wurden nach einer vierstündigen Inkubation bei 30 °C nach Ansäuern auf pH 2.0 (HCl) mit

Ethylacetat extrahiert, die organische Phase getrocknet und mit Diazomethan methyliert

(WEILER, 1981). Nach Aufnahme in Chloroform und GC-MS-Analyse (2.11.4) konnte der

Substratumsatz anhand interner Standardisierung mit 250 pmol [2H]2-Indol-3-essigsäure

errechnet werden.

2.9.4 Aktivitätsbestimmung der Nitrilasen

Zur qualitativen wie auch quantitativen Analyse der Nitrilase-Aktivität wurden 500 µg

Proteinrohextrakt bzw. 1 µg affinitätschromatographisch gereinigtes Protein mit 5 µl 1 M

Indol-3-acetonitril Lösung versetzt und mit 100 mM KPi-Puffer, pH 8.0 ad 1 ml aufgefüllt.

Nach 12 h Inkubation bei 30 °C wurde der Ansatz mit konzentrierter Salzsäure (50 µl)

versetzt und mit einem Volumen Ethylacetat ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde

abgenommen, im Vakuum zur Trockne gebracht, in HPLC-Laufmittel ([60 % iso-Hexan,

40 % Ethylacetat gesättigt mit 0.5 M Ameisensäure], 10 % (v/v) Methanol) aufgenommen

und über eine ZorbaxSil-Säule chromatographiert (2.10.1.2). Die Trennung der indolischen

Komponenten wurde anhand des UV280-Signals verfolgt, und aus der Fläche der UV-

Material & Methoden

30

Signale wurde nach externer Standardisierung die Menge an Indol-3-essigsäure

(Rt = 2.65 min) bzw. Indol-3-acetamid (Rt = 5.28 min) abgeleitet.

2.9.5 Bestimmung der Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität

Wenn nicht anders angegeben, wurde ein auf pH 8.0 gepufferter Proteinextrakt ad 10 mM

Tryptophan mit wäßriger Tryptophan-Lösung (20 mM) versetzt und über 12 h bei 30 °C

inkubiert. Nach Ansäuern des Ansatzes mit 35 µl 12 M HCl wurde die Probe mit einem

halben Volumen Ethylacetat extrahiert. Ein Aliquot der organischen Oberphase (ca. 65 %

des Ausgangsvolumens an Ethylacetat) wurde abgenommen und unter Stickstoff vom

Lösungsmittel befreit. Die getrockneten Proben wurden mit Hilfe von Diazomethan

derivatisiert (WEILER, 1981), erneut eingeengt und in 35 µl Chloroform p.A. resuspendiert.

Der durch die Derivatisierung gebildete Indol-3-essigsäuremethylester konnte

anschließend gaschromatographisch-massenspektrometrisch dargestellt werden, wobei die

Menge an enthaltener Indol-3-essigsäure (IES) entweder anhand externer Kalibrierung aus

dem Massensignal (m/z) 190, oder durch interne Standardisierung mit 100 pmol [2H]2-

Indol-3-essigsäure abgeleitet wurde.

2.9.6 Analyse der Tryptophanmetabolisierung in pflanzlichen Protein-

extrakten mittels gekoppelter HPLC/GC-MS/MS-Technik

Die Identifizierung indolischer Metaboliten der Tryptophanumsetzung in pflanzlichen

Proteinextrakten erfolgte unter Verwendung einer hochauflösenden und zugleich sehr

sensitiven Technik, welche auf einer Kopplung von Hochleistungsflüssigkeits-

chromatographie und GC-MS/MS-Analytik beruht. Zur Analyse wurden je 400 µl

unterschiedlich stark angereicherte, und auf pH 8.0 gepufferte Proteinfraktionen (2.8.4,

2.10.2.1, 2.10.2.2) mit [2H]5-L-Tryptophan (5 mM Endkonzentration) versetzt, und für 5 h

bei 37 °C inkubiert. Die Ansätze wurden daraufhin auf pH 2.0 (HCl) eingestellt, mit einem

Volumen Ethylacetat extrahiert, und die organische Phase im Vakuum zur Trockne

gebracht. Der Rückstand wurde in 400 µl HPLC-Laufmittel ([60 % iso-Hexan, 40 %

Ethylacetat gesättigt mit 0.5 M Ameisensäure], 10 % (v/v) Methanol) aufgenommen und

nach Zentrifugation in 100 µl Aliquoten chromatographiert (Flußrate 1.5 ml; UV-Vis

280 nm). Die indolderivathaltigen Fraktionen (vgl. Abb. 3.17) wurden isoliert und

getrocknet. Die IES-Fraktion wurde mit Diazomethan, die IAM-Fraktion mit Diazomethan

Material & Methoden

31

und anschließend mit Trifluoressigsäureanhydrid derivatisiert, in 10 µl Chloroform aufge-

nommen und gaschromatographisch-massenspektrometrisch untersucht (2.11.5).

2.10 Chromatographische Trenntechniken

2.10.1 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) stellt eine hochauflösende

Methode dar, um komplexe Stoffgemische voneinander zu trennen. Sie wurde hier zum

einen zur präparativen Produktaufreinigung der [3H]3-6-Azido-L-tryptophan- (2.7.2),

[3H]2-6-Azidoindol-3-acetamid- (2.7.3) bzw. [2H]5-Indol-3-acetamid-Synthese (2.7.4)

genutzt, und zum anderen, um indolische Substanzgemische aus enzymatischen

Umsetzungen oder nach Extraktion aus pflanzlichen Geweben zu isolieren.

2.10.1.1 Präparative Reinigung von [3H]3-6-Azido-L-tryptophan

Die Reinigung des synthetisierten [3H]3-6-Azido-L-tryptophans (Rt = 2.3 min) erfolgte

über eine Luna C18-Säule (4 mm x 250 mm, stat. Phase 5 µm) mit einer Flußrate von

1.5 ml/min in einem Laufmittel aus 50 % (v/v) Methanol. Der Chromatographieverlauf

konnte mit Hilfe eines Durchflußszintillationszählers verfolgt werden.

2.10.1.2 Isolierung indolischer Komponenten aus komplexen Substanz-

gemischen

Die Verwendung von Kieselgelsäulen stellt eine adäquate Methode dar, indolische

Verbindungen voneinander zu trennen, um sie isolieren (2.8.5, 2.9.6) oder aber

quantifizieren (2.9.2, 2.9.4) zu können. In den Experimenten wurde eine ZorbaxSil-Säule

(4 mm x 250 mm, stat. Phase 5 µm) mit einer Flußrate von 1.5 ml/min verwendet. Die

Chromatographie erfolgte isokratisch in einem Laufmittel aus [60 % iso-Hexan, 40 %

Ethylacetat gesättigt mit 0.5 M Ameisensäure], 10 % (v/v) Methanol. Die Retentionszeiten

der untersuchten indolischen Verbindungen können Abb. 3.17 entnommen werden. Die

Absorption der indolischen Komponenten wurde bei λ = 280 nm verfolgt.

2.10.2 Flüssigkeitschromatographie

Zur Trennung komplexer Proteingemische bzw. zur Reinigung von Fusionsproteinen

wurde eine Reihe unterschiedlicher Chromatographieverfahren eingesetzt. Der Chromato-

graphieverlauf wurde anhand der Absorptionsänderung bei 280 nm verfolgt. Abgesehen

Material & Methoden

32

von der Hochdruckgelpermeationschromatographie und den Affinitätschromatographien

wurde für die angeführten Chromatographien ein FPLC-System (P 500 mit GP 250,

Pharmacia Biotech) benutzt.

2.10.2.1 Präparative Ionenaustauschchromatographie an Hydroxyapatit

Die Hydroxyapatit-Matrix (MacroPrep Ceramic Hydroxyapatit, Bio-Rad) wurde in einer

Trennsäule (30 x 1.6 cm ∅) mit 10 mM Tris/HCl, pH 8.0 äquilibriert. Der gewonnene

Proteinrohextrakt (2.8.4) wurde bei 100000 x g zentrifugiert und der Überstand

(40 – 50 ml) über die Hydroxyapatit-Matrix chromatographiert. Darauf wurde die Säule

mit 70 ml 5 mM KPi-Puffer, pH 8.0 gespült, und anschließend gebundene Proteine mit

Hilfe eines Stufengradienten mit ansteigender KPi-Puffer Konzentration

(60 ml 50 mM KPi-Puffer, pH 8.0; 60 ml 200 mM KPi-Puffer, pH 8.0; 60 ml 400 mM KPi-

Puffer, pH 8.0) eluiert. Die gesamte Chromatographie erfolgte bei 4 °C mit einer Flußrate

von 0.5 ml/min.

2.10.2.2 High Q-Anionenaustauschchromatographie

Zur weiteren Trennung enzymatisch aktiver Proteinfraktionen der Hydroxyapatit-

chromatographie (2.10.2.1) wurden diese schnellstmöglich über eine, in 50 mM Tris/HCl,

pH 8.0 äquilibrierte, High Q-Säule (15 x 1.0 cm ∅, MacroPrep High Q, Bio-Rad)

chromatographiert. Nicht gebundene Proteine wurden mit 70 ml 50 mM Tris/HCl, pH 8.0

von der Säule gewaschen. Anschließend erfolgte die Elution spezifisch gebundener

Proteine unter Verwendung eines Stufengradienten mit ansteigender Ionenkonzentration

(60 ml 50 mM Tris/HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl; 60 ml 50 mM Tris/HCl, pH 8.0, 200 mM

NaCl; 60 ml 50 mM Tris/HCl, pH 8.0, 400 mM NaCl).

2.10.2.3 Hochdruckgelpermeationschromatographie

Als abschließender chromatographischer Reinigungsschritt zur Anreicherung der Indol-3-

essigsäure-Synthase aus Arabidopsis thaliana wurde eine Gelpermeationschromatographie

durchgeführt. Um die Chromatographie so schnell und schonend wie möglich durch-

zuführen, fand ein Perfusionschromatographiesystem (Perseptive Biosystems) in

Kombination mit einer Bio-Silect SEC-125-5 Säule (7.8 x 300 mm, Bio-Rad)

Verwendung. Die Chromatographie erfolgte isokratisch über 25 min in 50 mM Tris/HCl,

pH 8.0, 200 mM NaCl mit einer konstanten Flußrate von 1 ml/min (90 – 105 bar).

Enzymatisch aktive Proteinfraktionen der High Q-Chromatographie (2.10.2.2) wurden bei

Material & Methoden

33

100000 x g zentrifugiert und in 400 µl Aliquoten (0.75 mg Protein) chromatographiert.

Neben der Anreicherung der Indol-3-essigsäure-Synthase diente diese Technik zudem

dazu, das Molekulargewicht des Komplexes in erster Näherung zu bestimmen. Dazu

wurden je 100 µl der 1 ml Fraktionen mit 200 µl 20 mM L-Tryptophan und 100 µl 50 mM

Tris/HCl, pH 8.0 versetzt, unter Standardbedingungen inkubiert (2.9.5) und

gaschromatographisch-massenspektrometrisch analysiert. Die Größenkalibrierung der

Säule erfolgte mittels eines Proteinstandardmixes (Gel Filtration Standard, Bio-Rad).

2.10.2.4 Affinitätschromatographie an Strep-Tactin-Sepharose

Die Reinigung Strep-tag-II-markierter Proteine erfolgte, wenn nicht anders angegeben,

unter nativen Bedingungen. Bakterieller Rohextrakt (2.5.2) wurde, wenn nötig mittels

Ultrafiltration, auf ein Volumen von 10 ml eingeengt (Centriprep, Millipore) und

zirkulierend über 30 min mit einer Flußrate von 1 ml/min auf die Affinitätsmatrix (Strep-

Tactin-Sepharose, 1 ml Bettvolumen) aufgebracht. Nach dem Waschen der Säule mit

5 – 10 Volumen Waschpuffer [100 mM KPi-Puffer, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA]

wurden spezifisch gebundene Proteine mit 20 ml Elutionspuffer [100 mM KPi-Puffer,

pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM Desthiobiotin] eluiert.

2.10.2.5 Affinitätschromatographische Reinigung von (His)6-Fusionsproteinen

Die Reinigung bakteriell exprimierter (His)6-Fusionsproteine erfolgte unter nativen

Bedingungen durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Ni2+-beladenen

Nitrilotriessigsäure (Ni-NTA)-Agarose nach Angaben des Herstellers (Qiagen, Hilden).

2.10.2.6 Immunaffinitätschromatographie

Zur immunaffinitätschromatographischen Reinigung von Proteinen wurden Antikörper-

beladene Sepharosematrizes hergestellt (2.7.5). Die Säulen wurden mit 100 ml Laufpuffer

[100 mM Tris/HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl] äquilibriert und anschließend mit maximal

30 mg Protein beladen, wobei die Aufgabe der Proben zirkulierend über 1 h mit konstanten

Flußraten von circa 0.5 ml/min erfolgte. Unspezifisch gebundene Proteine wurden

anschließend mit 10 – 20 Säulenvolumen Laufpuffer von der Säule gewaschen. Die

Elution spezifisch gebundener Proteine wurde durch einen pH-Wechsel (Elutionspuffer

[200 mM Glycin, pH 2.8, 200 mM NaCl]) erzielt. Wenn nicht anders angeführt, wurden

die ersten 10 ml des Eluates aufgefangen und mit 1/10 Volumen 10 x PBS [1.4 M NaCl,

27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4] versetzt. Nachdem der pH-Wert der

Material & Methoden

34

Lösung auf pH 7.5 eingestellt wurde, konnte die Lösung durch Ultrafiltration (Centriprep

30 Einheiten, Millipore) konzentriert werden.

2.11 Massenspektrometrie

2.11.1 Darstellung des Indol-3-essigsäuremethylesters

Die quantitative GC-MS- und GC-MS/MS-Analyse der Indol-3-essigsäure erforderte die

Derivatisierung der Säure in ihren Methylester, da sich die freie Säure gaschromato-

graphisch nicht darstellen läßt. Die Methylierung erfolgte nach WEILER (1981) unter

Verwendung von Diazomethan, welches durch alkalische Hydrolyse aus N-Methyl-N-

nitroso-harnstoff synthetisiert wurde.

2.11.2 Synthese von Diazomethan

Zur Synthese des Diazomethans wurden pro ml Diethylether 0.3 ml 40 % (w/v) KOH im

Eisbad unter Rühren gemischt. N-Methyl-N-nitroso-harnstoff (ca. 100 mg) wurde

portionsweise zugefügt, bis die Diethyletherphase intensiv gelb erschien. Nach der

Reaktion wurde die organische Phase dekantiert und über KOH getrocknet.

2.11.3 Trifluoracetylierung des Indol-3-acetamid

Die Analyse des Indol-3-acetamids erfolgte nach Trifluoracetylierung mit Trifluor-

essigsäureanhydrid, da das Amid gaschromatographisch nur schlecht darstellbar ist. Zur

Derivatisierung wurden getrocknete Proben über 1 min mit 50 µl Trifluoressigsäure-

anhydrid behandelt und anschließend im Stickstoffstrom zur Trockne gebracht.

2.11.4 Gaschromatographisch-massenspektrometrische Darstellung von

Indol-3-essigsäure

Zur Untersuchung der Indol-3-essigsäure-Synthase- und der Amidase-Enzymaktivitäten

wurden gaschromatographisch-massenspektrometrische-Analysen (GC-MS-Analyse) ein-

gesetzt. Die zu untersuchende Probe wurde methyliert (2.11.1), getrocknet und in 30 µl

Chloroform aufgenommen. Die Messung erfolgte mittels eines Varian GC 3400

Gaschromatographen in Verbindung mit einem Massendetektor der Firma Finnigan MAT

(Bremen, Modell Magnum). Die GC-MS-Analyse erfolge mit maschineller Aufgabe der

Proben bei einem Injektionsvolumen von 1 µl unter nachfolgend aufgeführten

Chromatographie- und Detektionsbedingungen:

Material & Methoden

35

Splitlos, Injektor-Temperatur 260 °C; Helium als Trägergas (Vordruck 80 kPa);

Trennsäule DB-17 (0.25 mm x 30 m, stat. Phase 0.25 µm); Temperaturprogramm: 1 min

80 °C, 30 °C / min auf 200 °C, 5 °C / min auf 250 °C; Transferline-Temperatur 260 °C;

Scanbereich 50 – 400 u, 1 scan / s; chemische Ionisierung mit Methanol.

2.11.5 Analyse indolischer Verbindungen mittels gaschromatographisch-

massenspektrometrischer Methoden

Die Spurenanalyse indolischer Verbindungen aus pflanzlichen Extrakten (2.8.5) erforderte

eine besonders sensitive, gaschromatographisch-massenspektrometrische Analyse (GC-

MS/MS-Analyse). Zu diesem Zweck wurden die zu analysierenden Proben im Vakuum

getrocknet, in 20 µl Methanol aufgenommen und mit 100 µl etherischem Diazomethan

versetzt. Für die Analyse von Indol-3-acetamid (IAM) wurden die Proben erneut

getrocknet, mit 50 µl Trifluoressigsäureanhydrid versetzt, nach einminütiger Inkubations-

zeit im Stickstoffstrom getrocknet und in 10 µl Chloroform resuspendiert. Die Analysen

erfolgten an einem Varian Saturn 2000 Ionenfallen-Massenspektrometer, welches mit

einem Gaschromatographen (CP 3800) der Firma Varian, sowie einem CombiPal

Autoinjektor (Varian, Darmstadt) verbunden war. Das Massenspektrometer wurde im CI-

MRM Modus mit Methanol als gasförmigem Reaktionspartner und Detektion positiver

Ionen betrieben. Die Analyse erfolgte nach maschineller Probenaufgabe (1 µl) unter den

nachfolgenden Chromatographie- und Detektionsbedingungen:

Splitlos, Injektor-Temperatur 260 °C; Helium als Trägergas (1 ml / min); Trennsäule ZB-

50 (0.25 mm x 30 m, stat. Phase 0.25 µm); Temperaturprogramm: 1 min 50 °C,

20 °C / min auf 250 °C; Transferline-Temperatur 260 °C; Scanbereich 100 – 380 u,

3 scan / s; chemische Ionisierung mit Methanol.

Mutterionen ([M+H]+)

Trifluoracetyliertes IAM: [1H]-IAM m/z 367

[2H]5-IAM m/z 372

Methylierte IES: [1H]-IES m/z 190

[2H]2-IES m/z 192

Material & Methoden

36

Unmarkiertes IAM (Rt = 8.75 min) wurde durch die Fragmentionen m/z: 339, 323, 242 und

226, pentadeuteriertes IAM (Rt = 8.70 min, [2H]5-IAM) durch die Fragmentionen m/z: 344,

328, 247 und 231 charakterisiert. Die Indol-3-essigsäure konnten durch die Fragmentionen

m/z 130 (Rt = 11.85 min) und m/z 132 (Rt = 11.83 min, [2H]2-IES) identifiziert werden.

Die Quantifizierung endogener Verbindungen erfolgte über das Signalflächenverhältnis der

unmarkierten zu den markierten Verbindungen.

2.11.6 Peptidsequenzierung mittels ESI-QTOF-Massenspektrometrie

Coomassie-gefärbte Proteinbanden wurden nach SDS-PAGE gemäß JENSEN et al. (1998)

mit Trypsin (sequencing grade modified, Promega) im Gel verdaut. Nach Extraktion der

Peptidfragmente aus dem Gelstück wurde die Probe mittels ZipTips C18 (Millipore)

entsalzt. Die anschließenden massenspektrometrischen Untersuchungen wurden unter

Verwendung eines „quadrupole/time-of-flight“ Hybrid-Massenspektrometers (Q-TOF2,

Micromass) von Herrn Dr. Piotrowski (Lehrstuhl für Pflanzenphysiologie) durchgeführt.

Die Ionisierung der Peptide erfolgte mittels Nano-Elektrospray. Die Messungen wurden im

Positiv-Modus durchgeführt und die Spektren im m/z-Bereich von 400 – 1600 mit 2.4 s

Integrationszeit aufgezeichnet. Doppelt oder dreifach geladene Moleküle wurden für eine

Fragmentierung im MS/MS-Modus ausgewählt. Die Interpretation der MS/MS-Daten

wurde durch den MaxEnt3 Algorithmus und das BioLynx Programm aus dem MassLynx

3.4 Software-Paket (Micromass) unterstützt.

2.12 Elektrophoretische Trenntechniken

2.12.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die Trennung von Proteingemischen unter denaturierenden Bedingungen erfolgte über

SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) in Apparaturen nach STUDIER (1973)

mit diskontinuierlichen Gelsystemen nach LAEMMLI (1970) mittels 12.5 %-iger (w/v)

Trenngele, bzw. in exponentiellen Gradientengelen (10 – 20 % (w/v)) nach SCHARF &

NOVER (1982). Als Molekulargewichtsstandard diente der LMW („Low molecular weight-

Standard“) der Firma Pharmacia Biotech. Zur Detektion der Proteine wurden die Gele mit

Coomassie-Brilliantblau oder mittels Silber nach BLUM et al. (1987) gefärbt.

Material & Methoden

37

2.12.2 Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die isoelektrische Fokussierung (IEF) als erste Dimension einer zweidimensionalen

Elektrophorese wurde, wie bei O’FARRELL (1975) beschrieben, in 4 %-igen Polyacryl-

amid-Röhrchengelen (130 mm x 1.5 mm) unter Zusatz von 4 % (v/v) Ampholythen

pH 5 – 8 und 2 % Nonidet P-40 durchgeführt. Die Proteinproben (250 – 350 µg) wurden

mit drei Volumen eiskaltem Methanol versetzt und über 12 h bei -20 °C inkubiert.

Präzipitierte Proteine wurden durch Zentrifugation (13000 upm, 15 min, 4 °C) gewonnen

und im Vakuum getrocknet. Das Sediment wurde anschließend in 65 µl IEF-Probenpuffer

[30 % (v/v) Glycerol, 5 % Nonidet P-40, 2.5 % (w/v) SDS, 5 % (v/v) Ampholyte, 5 %

(v/v) β-Mercaptoethanol, 85 mM Tris, 9 M Harnstoff] resuspendiert. Die isoelektrische

Fokussierung fand in einer IEF-Kammer mit 20 mM NaOH (Anodenpuffer) und 5 mM

Phosphorsäure als Kathodenpuffer nach folgendem Programm statt:

Zeit Spannung

30 min 350 V

14 h 500 V

1 h 600 V

Anschließend wurde das Gel aus den silanisierten Röhrchen gespült, für 20 min in

Äquilibrierungspuffer [62.5 mM Tris/HCl, pH 6.8, 1 % (w/v) SDS, 1 % (v/v) Glycerin,

5 % (v/v) β-Mercaptoethanol, 0.002 % (w/v) Bromphenolblau] inkubiert, und in der

zweiten Dimension über ein 10 – 20 %-iges Gradientengel (exponentieller Gradient)

getrennt (2.12.1). Die so erhaltenen Gele wurden gefärbt oder für Western-Analysen

geblottet (2.13.1).

2.12.3 Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die Auftrennung von nativen Polypeptiden erfolgte in exponentiellen Gradientengelen

(10 – 20 % (w/v)) in Anlehnung an SCHARF & NOVER (1982). Die Elektrophorese der

SDS-freien Polyacrylamid-Gele (160 mm x 200 mm x 1 mm) erfolgte bei 4 °C und einer

konstanten Stromstärke von 8 mA über einen Zeitraum von etwa 14 h. Die Proteinproben

wurden mit 1/5 Volumen 87 %-igem Glycerin sowie etwas Bromphenolblau versetzt und

als konzentrierte Lösung direkt auf das Gel aufgebracht.

Material & Methoden

38

Zur Darstellung von Proteinen in einer zweiten Dimension wurden entsprechende Spuren

des nativen Gels ausgeschnitten und für 20 min in Denaturierungspuffer [125 mM

Tris/HCl, pH 6.8, 1 % (w/v) SDS, 20 % (v/v) Glycerin, 2 % (v/v) β-Mercaptoethanol,

0.002 % (w/v) Bromphenolblau] inkubiert. Die Trennung in der zweiten Dimension

erfolgte unter denaturierenden Bedingungen (2.12.1).

2.12.4 „Blau-Native“ Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die „Blau-Native“ Elektrophorese erfolgte in Anlehnung an SCHÄGGER et al. (1994) in

einem 0 – 20 %-igen Glycerin, 8 – 18 %-igen Acrlyamidgradientengel mit 500 mM

Amino-n-capronsäure, 50 mM Bis-tris/HCl, pH 7.0 in einem Zweipuffersystem aus

50 mM Tricin, 15 mM Bis-tris, 0.002 % (w/v) Serva Blau G250 (Kathode) und 50 mM

Bis-Tris/HCl, pH 7.0 (Anode) bei einer konstanten Spannung von 125 V. Der Gellauf

erfolgte bei 4 °C in einem Zeitintervall von 14 – 16 h.

Zur Darstellung der getrennten Proteine in einer zweiten, denaturierenden Dimension

wurden auch hier entsprechende Gelstreifen ausgeschnitten und, wie unter 2.12.3

beschrieben, weiterverarbeitet.

2.12.5 Elektrophoretische Elution geladener Makromoleküle

Die Elution geladener Polypeptide aus nativen wie auch aus SDS-Polyacrylamid-Gelen

erfolgte unter Verwendung eines Membranfallensystems (Electro-Eluter Modell 422, Bio-

Rad) nach Herstellerangaben. Die quantitative Elektroelution nicht fixierter Proteine

erfolgte in nativem Elektroelutionspuffer [25 mM Tris/HCl, pH 8.8, 192 mM Glycin] mit

einer konstanten Spannung von 8 mM pro Membranfalleneinheit über einen Zeitraum von

14 h bei 4 °C. Bei der Elution fixierter bzw. Coomassie-gefärbter Proteine wurde ein SDS-

haltiger Elektroelutionspuffer [25 mM Tris/HCl, pH 8.8, 192 mM Glycin, 0.1 % (w/v)

SDS] verwendet. Vor der Entnahme der Proteinlösung wurde die Apparatur für 10 s bei

einer angelegten Spannung von 200 V umgepolt, um die Polypeptide von der

Membranoberfläche zu lösen.

Material & Methoden

39

2.13 Immunologische Methoden

2.13.1 Elektrophoretischer Transfer von Proteinen auf Nitrocellulose

Die Überführung der mittels SDS-PAGE (2.12.1) aufgetrennten Proteine auf Nitrocellulose

(Western-Blot) erfolgte nach TOBWIN et al. (1979). Der elektrophoretische Transfer auf die

Nitrocellulose (Schleicher & Schuell, BA 85, Porenweite 0.45 µm) erfolgte in Blotpuffer

[20 mM Tris/HCl, 150 mM Glycin, 20 % (v/v) Methanol, 0.1 % (w/v) SDS] bei einer

Temperatur von 4 °C über Nacht bei 60 mA oder alternativ für 2 h bei 200 mA und RT.

Eine reversible Färbung transferierter Proteine auf der Nitrocellulose wurde mittels

Ponceau-S-Färbung [1 % (w/v) Ponceau-S, 2 % (v/v) Essigsäure] erzielt.

2.13.2 Immunologischer Nachweis immobilisierter Proteine

Zur immunologischen Detektion spezifischer Proteine nach Immobilisierung auf

Nitrocellulose (2.13.1) wurden zunächst unspezifische Bindestellen durch eine einstündige

Inkubation in TBSP [50 mM Tris/HCl, pH 7.8, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 2 % (w/v)

Proteinpulver] abgesättigt. Die Bindung der spezifischen Antikörper erfolgte im gleichen

Puffer für 2 h oder alternativ über Nacht bei 4 °C; die Konzentrationen der eingesetzten

Antikörper sind nachfolgend angeführt. Unspezifisch gebundene Antikörper wurden durch

Waschen mit TBST [50 mM Tris/HCl, pH 7.8, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0.5 % (v/v)

Triton X-100] entfernt, darauf folgte eine einstündige Inkubation mit, an alkalischer

Phosphatase konjugiertem, Ziege-α-Maus- oder Ziege-α-Kaninchen-Immunglobulin-

Antikörper (1:10.000 verdünnt) in TBSP. Nach Entfernung unspezifisch gebundener

Antikörper (2 x 10 min mit TBST, 1 x 10 min TBS [50 mM Tris/HCl, pH 7.8, 150 mM

NaCl, 1 mM MgCl2]) wurde die alkalische Phosphatase mit 330 µg/ml p-Nitroblautetra-

zoliumchlorid und 165 µg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat in AP-Puffer [100 mM

Tris/HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2] nachgewiesen.

Material & Methoden

40

Antikörper Spendertier Verdünnung

α-NIT1, Serum (602) Kaninchen 1:13000

α-AMI1, Serum (645) Kaninchen 1:1000

α-AMI2, Serum (644) Kaninchen 1:1000

α-YUCCA, Serum (643) Kaninchen 1:1000

α-RGS-His, Zellkulturüberstand Maus 1:2500

2.13.3 Immunisierung von Kaninchen und Gewinnung von Antiseren

Für die Gewinnung von polyklonalen Antikörpern gegen die native Amidase 1 aus

A. thaliana bzw. gegen denaturiertes Amidase 2- und YUCCA-Protein aus A. thaliana

wurde bakteriell überexprimierte Proteine (2.8.1) als Antigen verwendet. Die Immuni-

sierung der Kaninchen mit den gereinigten Proteinen sowie die Gewinnung der Antiseren

erfolgte nach WEILER (1986). Die Vorimmunisierung bestand aus vier intradermalen

Injektionen von je 200 µg, in inkomplettem Freundschen Adjuvans emulgiertem,

gereinigtem Protein im Abstand von je einer Woche. Nach weiteren zwei Wochen erfolgte

die Immunisierung durch intramuskuläre Injektion der gleichen Menge an Protein in

inkomplettem Freundschen Adjuvans. Die Blutabnahme erfolgte an einer Ohrenvene

10 Tage nach der Injektion. Nach Absonderung des Blutkuchens (12 h, 4 °C) konnte das

Serum gewonnen und bei - 20 °C gelagert werden.

2.13.4 Nachweis Strep-tag-II-markierter Fusionsproteine

Strep-tag II-markierte Fusionsproteine ließen sich nach SDS-PAGE und Transfer auf

Nitrocellulose unter Verwendung eines Strep-Tactin-alkalische-Phosphatase-Konjugates

(Strep-Tactin-AP, IBA, Göttingen) nach Vorgaben des Herstellers detektieren.

2.13.5 Reinigung spezifischer Antikörper

Die Isolierung von Immunglobulinen aus den gewonnenen Seren (2.13.3) erfolgte nach

MCKINNEY & PARKINSON (1987) durch kombinierte Ammoniumsulfat-/Carpryl-

säurefällung. Immunospezifische Antikörper wurden anschließend unter Verwendung von

Nitrocellulose gereinigt. Hierzu wurden etwa 400 µl einer gereinigten Antigenfraktion auf

ein 4 – 5 cm2 großes Stück Nitrocellulose getropft. Nachdem die Lösung auf der Membran

Material & Methoden

41

getrocknet war, wurde diese mit 5 ml TBSP [50 mM Tris/HCl, pH 7.8, 150 mM NaCl,

1 mM MgCl2, 2 % (w/v) Proteinpulver] gesättigt. Die Inkubation der Antikörper mit den

immobilisierten Antigenen erfolgte über 16 h bei 4 °C. Anschließend wurde die Membran

gewaschen (2 x 20 min TBST [50 mM Tris/HCl, pH 7.8, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2,

0.5 % (v/v) Triton X-100], 1 x 20 min TBS [50 mM Tris/HCl, pH 7.8, 150 mM NaCl,

1 mM MgCl2]) und gebundene Antikörper durch eine 10 minütige Inkubation in 2.5 ml

Elutionspuffer [200 mM Glycin, pH 2.8, 1 mM EGTA] von den Antigenen gelöst. Der

Elutionspuffer wurde darauf mit 250 µl 1 M Tris versetzt und der pH-Wert der Lösung auf

pH 7.5 eingestellt. Abschließend wurde der Antikörperlösung 1/10 Volumen 10 x PBS

[1.4 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4] hinzugefügt. Im Falle

längerer Lagerung der Lösung bei 4 °C wurden 0.02 % (w/v) Natriumazid zugesetzt.

2.14 Photoaffinitätsmarkierung von Proteinen unter Einsatz der

Radioliganden [3H]3-6-Azido-L-tryptophan und [3H]2-6-Azido-

indol-3-acetamid

Die Photoaffinitätsmarkierung von cytosolischen Proteinen erfolgte in Anlehnung an

FEYERABEND & WEILER (1989) mit dem photosensitiven L-Trp-Derivat [3H]3-6-Azido-L-

tryptophan bzw. dem photosensitiven IAM-Derivat [3H]2-6-Azidoindol-3-acetamid. Dazu

wurde, wenn nicht anders angegeben, auf pH 8.0 gepufferte Proteinlösung in einem

Gesamtvolumen von 300 µl mit 63 kBq [3H]3-6-Azido-L-tryptophan bzw. 80.9 kBq [3H]2-

6-Azidoindol-3-acetamid für 45 min im Dunkeln auf Eis inkubiert. Anschließend wurde

der Ansatz in einer Quarzküvette 10 s bei 8 °C belichtet (Quecksilberhochdrucklampe

HBO 500 W/2, Filter 305 nm, ca. 400 W).

2.15 Proteinbestimmung

Die Proteinbestimmung erfolgte nach BRADFORD (1976) gegen Rinderserumalbumin als

Proteinstandard.

2.16 Radioaktivitätsbestimmung

Für die Radioaktivitätsbestimmung wurde ein Flüssigkeits-Szintillationszähler (LS 6000

TA, Beckman) verwendet. Gelstückchen oder wäßrige Proben wurden dazu mit 4.5 ml

Szintillator (Hydroluma) versetzt.

Material & Methoden

42

2.17 Rechnergestützte Sequenzanalysen

Alle DNA- wie auch Aminosäuresequenzanalysen wurden mit der DNAMAN Software

(Version 5.2.2, Lynnon BioSoft, Vaudreuil, Quebec, Kanada) durchgeführt.

2.18 Auswertung

Die präsentierten Ergebnisse stammen, wenn nicht anders ausgewiesen, aus mindestens

zwei unabhängigen Versuchen, wobei jeder Meßpunkt als Mittelwert einer

Dreifachbestimmung ermittelt wurde.

Ergebnisse

43

3 Ergebnisse

Die Indol-3-essigsäure (IES), eines der wichtigsten pflanzlichen Wachstumshormone, ist

an der Regulation beinahe aller pflanzlicher Wachstums- und Entwicklungsprozesse

beteiligt. Obgleich in den vergangenen Jahren intensiv an der Aufklärung der IES-

Homöostase gearbeitet wurde, ist das Verständnis der IES-Biosynthese noch unvollständig.

Viele Hinweise, unter anderem die Unzugänglichkeit IES-defizienter Mutanten,

implizieren, daß mehr als ein Reaktionsweg an der IES-Synthese beteiligt ist (ECKHARDT,

2001).

Für die Modellpflanze Arabidopsis thaliana konnte in der Vergangenheit ein Enzym-

komplex (IES-Synthase) beschrieben werden (MÜLLER & WEILER, 2000a), welcher

spezifisch L-Tryptophan (L-Trp) zur IES umsetzt. Die enzymatische Zusammensetzung

dieses Komplexes und putative Metabolite der L-Trp-Umsetzung konnten aber nicht bis

ins Detail aufgeschlüsselt werden.

Im folgenden sind Versuche zur Charakterisierung der enzymatischen Komponenten der

IES-Synthase und zur Identifikation putativer Metabolite des Reaktionswegs dargestellt.

Weiterhin wird ein bisher nur von pflanzenpathogenen Bakterien bekannter

Biosyntheseweg über Indol-3-acetamid (IAM) für A. thaliana vorgestellt.

3.1 Vergleich der Aktivität der IES-Synthase in unterschiedlichen

Pflanzenspezies

Um den IES-Synthase-Komplex aus pflanzlichem Gewebe anzureichern, wurde zunächst

nach einer Pflanzenspezies gesucht, die eine hohe Enzymaktivität aufweist. Besonderes

Augenmerk galt dabei Pflanzen, welche bereits genetisch gut charakterisiert waren, um

mittels reverser Genetik putative Bestandteile der IES-Synthase möglichst leicht isolieren

zu können.

Der Umsatz von L-Trp zur IES konnte in allen untersuchten Pflanzenspezies sowohl im

Rohextrakt als auch nach Konzentrierung der Proteine mittels Ammoniumsulfat

nachgewiesen werden (Abb. 3.1). Die höchsten spezifischen Aktivitäten ließen sich, nach

Konzentrierung der Proteine, bei Spinat (Spinacia oleracea), Buchweizen (Fagopyrum

esculentum) und der Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana) nachweisen.

Ergebnisse

44

Abb. 3.1: Spezifische Aktivität der IES-Synthase in unterschiedlichen Pflanzen-spezies

Die Messung der Enzymaktivität erfolgte über Produktquantifizierung mittels GC-MS (2.11.4). : Rohextrakt (12000 x g Überstand); : Aktivität nach Ammoniumsulfat-präzipitation (0 – 70 % Sättigung).

Als Ausgangsmaterial für die Untersuchung der IES-Synthase wurde A. thaliana-Pflanzen-

material gewählt, da die Enzymaktivität in dieser Spezies vergleichsweise hoch ist und das

Genom von A. thaliana, im Gegensatz zum Buchweizen und dem Spinat, bereits

vollständig sequenziert ist.

3.2 Anreicherung der tryptophanmetabolisierenden Protein-

fraktion aus Arabidopsis thaliana

Im Vorfeld dieser Arbeit beschrieben MÜLLER & WEILER (2000a) den enzymatischen

Umsatz von L-Trp zur IES in zellfreien Systemen (Proteinextrakte steril angezogener

Pflanzen, sowie steriler A. thaliana-Zellkulturen). Es konnte ein Proteinkomplex von

160 – 180 kDa Größe identifiziert werden, welcher selektiv das L-Enantiomer des

Tryptophans zur IES umsetzt. Weiterhin konnte die vorgeschlagene Methode zur

Anreicherung der IES-Synthase optimiert werden (POLLMANN, 1999). Basierend auf diesen

Ergebnisse

45

Daten sollte ein schonendes und schnelles Trennverfahren erarbeitet werden, um die IES-

Synthase weiter anzureichern.

3.2.1 Anreicherung der Indol-3-essigsäure-Synthase mittels Chromato-

graphie an Hydroxyapatit

Zur Vorreinigung der IES-Synthase wurde eine Ionenaustauschchromatographie an einer

Hydroxyapatit-Matrix verwendet. Zu diesem Zweck wurde ein Proteinrohextrakt aus

2 – 3 kg Pflanzenmaterial gewonnen (2.8.4) und mit Ammoniumsulfat gefällt (0 – 70 %

Sättigung). Nach Entsalzung wurde der Extrakt im präparativen Maßstab (50 ml) über

Hydroxyapatit chromatographiert (2.10.2.1).

Abb. 3.2: Chromatographie von Arabidopsis thaliana-Proteinextrakten an einer Hydroxyapatit-Matrix

Ammoniumsulfatgefällte Proteine wurden mittels Dialyse entsalzt und über 45 min bei 100000 x g zentrifugiert. Der lösliche Überstand (50 ml) wurde über eine HR 16/20 Hydroxyapatit-Säule mit einer konstanten Flußrate von 0.5 ml/min chromatographiert (2.10.2.1). 200 µl Aliquots der 5 ml Fraktionen wurden mit je 200 µl 20 mM Tryptophan-Lösung versetzt und über 12 h bei 30 °C inkubiert. Die gebildete IES wurde mittels GC-MS-Analysen nachgewiesen (2.11.4). (( ): UV280-Signal; ( ): Relative Enzymaktivität).

Die spezifische IES-Synthase-Aktivität in der vereinigten Elutionsfraktion (80 – 120 ml)

betrug 1.7 pkat/mg. Die nachfolgenden Proteinfraktionen wurden verworfen. Die

spezifische Aktivität konnte auf diese Weise bei einer Ausbeute von 89 % um einen Faktor

1.6 angereichert werden.

Ergebnisse

46

3.2.2 Anreicherung der Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität mittels

High Q-Anionenaustauschchromatographie

Um die mittels Hydroxyapatitchromatographie (HYC) vorgereinigte Proteinfraktion

(80 – 120 ml Elutionsvolumen) weiter anzureichern, wurde die Proteinlösung über eine

starke Anionenaustauschmatix (Macro-Prep High Q, Bio-Rad) chromatographiert

(2.10.2.2). Unter den gewählten Parametern konnte die tryptophanmetabolisierende

Aktivität auf der Säule gebunden, und bei einer Ionenkonzentration von 200 mM Cl-

spezifisch eluiert werden.

Abb. 3.3: Anionenaustauschchromatographie an High Q-Matrix Die über HYC vorgereinigte Proteinlösung (35 – 40 ml) wurde auf eine HR 10/10 Macro-Prep High Q-Säule aufgebracht und anschließend mit 50 mM Tris/HCl, pH 8.0 gespült. Die Elution gebundener Proteine erfolgte unter Verwendung eines Stufen-gradienten mit ansteigender Ionenkonzentration. Je 200 µl der 5 ml Fraktionen wurden in einem IES-Synthase-Aktivitätstest (2.9.5) eingesetzt, und die Menge der gebildeten IES mittels GC-MS-Analysen untersucht (2.11.4). ( ( ): UV280-Signal; ( ): Relative Enzymaktivität).

Die spezifische Aktivität der IES-Synthase ließ sich in der Elutionsfraktion (120 – 160 ml)

durch die beschriebene Ionenaustauschchromatographie auf 5.6 pkat/mg steigern; die

Ausbeute gegenüber der Ausgangsaktivität lag bei nur 33 %. Alle anderen Protein-

fraktionen wurden verworfen.

Ergebnisse

47

3.2.3 Molekulargewichtsbestimmung und Anreicherung des Indol-3-

essigsäure-Synthase-Komplexes durch Hochdruckgelpermeations-

chromatographie

Die klassische Gelpermeationschromatographie erwies sich als wenig effektiv (POLLMANN,

1999; MÜLLER, 1999), da geringe Flußraten (0.2 ml/min) und hohe Bettvolumen (280 –

560 ml) zu sehr langen Chromatographiezeiten führten. Daraus resultierten Gesamt-

aktivitätsverluste, die zwischen 50 - 80 % lagen. Die Verwendung einer Hochdruckgel-

filtrationssäule (BioSilect SEC 125-5, Bio-Rad) erlaubte eine deutlich höhere Flußrate

(1 ml/min, bei 90 – 105 bar), und somit eine, bezogen auf die Enzymaktivität,

verlustfreiere Trennung der Proteine. Durch diese Hochdruckgelpermeation konnte eine

weitere Anreicherung des Proteinkomplexes erzielt werden. Weiterhin ließ sich mit Hilfe

dieser Methode das genäherte Molekulargewicht des IES-Synthase Komplexes von

160 kDa (MÜLLER & WEILER, 2000a) über einen Standardproteinmix (Thyroglobulin, 670

kDa; IgG, 158 kDa; Ovalbumin, 44 kDa; Myoglobin, 17 kDa, Vitamin B-12, 1.35 kDa;

Bio-Rad) bestätigen.

Proteine der Hauptaktivitätsfraktion (120 – 160 ml) der High Q-Anionenaustausch-

chromatographie wurden 100000 x g zentrifugiert und anschließend in 400 – 500 µl

Aliquoten (max.0.75 mg/Lauf) isokratisch in 50 mM Tris/HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl über

eine SEC 125-5 Säule (300 mm x 7.8 mm) getrennt (2.10.2.3). Es wurden jeweils 1 ml

Fraktionen gesammelt, wobei die entsprechenden Fraktionen der nacheinander

durchgeführten Chromatographien vereinigt wurden. Wie Abbildung 3.2 zu entnehmen ist,

eluierte das Aktivitätsmaximum in einem Massenbereich von 180 – 160 kDa (8 – 9 ml

Elutionsvolumen). Dieses Resultat deckt sich mit den bereits publizierten Daten (MÜLLER

& WEILER, 2000a). Im Zuge dieser Chromatographie konnte der Komplex um einen Faktor

von 150 – 180 angereichert werden. Die errechnete spezifische Aktivität der IES-Synthase

betrug 46.6 pkat/mg, wobei die Ausbeute bei 7 % der Ausgangsaktivität lag.

Ergebnisse

48

Abb. 3.4: Molekulargewichtsbestimmung und Anreicherung der IES-Synthase-Komplexes mittels Hochdruckgelpermeationschromatographie

Maximal 0.75 mg der Hauptaktivitätsfraktion der High Q-Chromatographie wurden nach 100000 x g Zentrifugation ihrer Größe nach getrennt. Die Chromatographie wurde isokratisch mit einer konstanten Flußrate von 1 ml/min durchgeführt, als Laufmittel diente ein Puffer aus 50 mM Tris/HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl. Zur Ermittlung der enzymatischen Aktivität wurden je 200 µl der einzelnen Fraktionen unter Standardbedingungen (2.9.5, 2.11.4) gaschromatogaphisch-massenspektro-metrisch untersucht. (( ): UV280-Signal; ( ): Relative Enzymaktivität).

3.2.4 Chromatographie an einer Tryptophanaffinitätsmatrix zur

Reinigung des Indol-3-essigsäure-Synthase-Komplexes

Durch das oben angeführte Chromatographieverfahren ließ sich der IES-Synthase-

Komplex anreichern, jedoch nicht homogen darstellen. Eine affinitätschromatographische

Reinigung könnte einen entscheidenden Schritt zur homogenen Darstellung bedeuten. Eine

direkte Kopplung des Tryptophans an eine Säulenmatrix erbracht keinen Reinigungserfolg

(MÜLLER, 1999), weitere Versuche zeigten, daß eine Substitution an der Seitenkette des

Indolgerüstes ebenfalls zu unwirksamen Indolderivaten führte (POLLMANN, 1999). Daher

sollte hier das Substratanalogon 5-Hydroxy-L-tryptophan über einen möglichst langen und

beweglichen Abstandhalter („Spacer“) an eine Säulenmatrix gekoppelt werden. Zu diesem

Zweck wurde 5-Hydroxy-L-tryptophan über die 6-Position des Indolgerüstes mittels

Diazokopplung mit p-Aminohippursäure konjugiert, welche ihrerseits an Rinderserum-

albumin (RSA) substituiert vorlag (2.7.1).

Ergebnisse

49

Abb. 3.5: Strukturformel des synthetisierten Tryptophan-Konjugates Zur Konjugation des, mit p-Aminohippursäure substituierten, Rinderserumalbumins wurden 30 mg Protein in 5 ml H2O gelöst und mit 60 mg NaNO2 und 30 mg NH4SO2NH2 umgesetzt. Das diazotierte Reaktionsprodukt wurde anschließend in 10 ml 0.1 M Boratpuffer, pH 9.0 mit 10 mg 5 Hydroxy-L-tryptophan konjugiert und mittels Dialyse von niedermolekularen Bestandteilen befreit.

Ein Aktivitätstest unter Zusatz aufsteigender Mengen des Syntheseproduktes sollte

Auskunft über die Verwendbarkeit der Substanz als Affinitätsligand in einer

anschließenden Säulenchromatographie geben. Dazu wurden 200 µl einer High Q-Fraktion

(2.10.2.2) mit 200 µl 20 mM L-Trp sowie unterschiedlichen Mengen des RSA-5-Hydroxy-

L-tryptophan-Konjugates (0.25 µg – 20 µg) über 3 h bei 37 °C inkubiert, und anschließend

die enzymatisch gebildete Menge an IES gaschromatographisch-massenspektrometrisch

quantifiziert. Im Vergleich zu den mitgeführten Positivkontrollen (ohne Affinitätsligand)

konnte keine signifikante Hemmung der IES-Synthase-Aktivität ermittelt werden (ohne

Abbildung). Daher scheint das Tryptophan-Konjugat von der IES-Synthase als Substrat

nicht erkannt zu werden. Auch nach Bindung des Konjugates an eine Protein G-Matrix

(Pharmacia Biotech) konnte die Aktivität weder nachweislich gebunden werden noch

konnte die enzymatische Aktivität verzögert eluiert werden (nicht dargestellt). Bezüglich

dieser Resultate muß davon ausgegangen werden, daß das synthetisierte Konjugat als

Affinitätsligand nicht zu gebrauchen ist.

3.3 Trennung angereicherter Indol-3-essigsäure-Synthase-Frak-

tionen durch native Gelelektrophorese

3.3.1 Separation von Proteinkomplexen über exponentielle Gradienten-

gele

Durch native Gelelektrophorese in Anlehnung an SCHARF & NOVER (1982) ließ sich die

tryptophanumsetzende Enzymaktivität im Gel darstellen. Nach elektrophoretischer

Trennung wurden die Gele horizontal in 1 cm Streifen geteilt, und ein Aktivitätsnachweis

Ergebnisse

50

im Gel durchgeführt. Abschließend wurde der [2H]5-Indol-3-essigsäure-Gehalt mittels GC-

MS-Analyse (2.11.4) quantifiziert.

Abb. 3.6: Gelelektrophoretische Trennung von Proteinen einer angereicherten Indol-3-essigsäure-Synthase-Fraktion

Eine flüssigkeitschromatographisch (2.10.2.3) angereicherte IES-Synthase-Fraktion (5 mg) wurde über native Polyacrylamid-Gele (160 mm x 200 mm x 1 mm) aufgetrennt. Darauf wurden die Gele in 1 cm Streifen horizontal geschnitten. Zur Bestimmung der Enzymaktivität wurden die Gelstreifen in jeweils 5 ml Puffer [50 mM Tris/HCl, pH 8.0, 1 mM [2H]5-L-Tryptophan] 16 h bei 30 °C im Schüttler inkubiert und anschließend der [2H]5-IES Gehalt bestimmt (2.11.4). Aus einem identischen Gel wurde der Bereich höchster Aktivität scharf ausgeschnitten und die Proteine aus dem Gelstreifen eluiert (2.12.5). Das Eluat wurde mit Centriprep 10 Konzentratoren auf ein Volumen von 50 µl eingeengt und in einer zweiten Dimension über ein 12.5 % SDS-Gel getrennt. (A): Coomassie-gefärbter Gelstreifen der ersten elektrophoretischen Dimension; (B): Enzymaktivität in Gelsegmenten der ersten elektrophoretischen Dimension; (C): Coomassie-gefärbter Gelstreifen der zweiten elektrophoretischen Dimension. Die Pfeile markieren Proteine, die für eine Mikrosequenzierung eingesetzt wurden.

Aus einem zweiten, simultan erstellten, Gel wurden die Proteine im Bereich der höchsten

Enzymaktivität isoliert und in einer zweiten Dimension über ein 12.5 % SDS-Polacryl-

amidgel separiert. Detektierbare Proteinbanden wurden im Gel verdaut, eluiert und

anschließend mikrosequenziert (2.11.6). Es konnten zwei Proteine identifiziert werden,

wobei in Bande (1) ein Protein mit Ähnlichkeit zum NADP-Malat-Enzym (Accession

NP_196728) und in Bande (3) die kleine Untereinheit der RubisCO (Accession P10798)

Ergebnisse

51

gefunden werden konnte. Beide Enzyme sind ihrer enzymatischen Natur nach nicht an der

IES-Biosynthese beteiligt.

3.3.2 Molekulargewichtsbestimmung und Anreicherung der Indol-3-

essigsäure-Synthase-Aktivität mittels „Blau-Nativer“ Gelelektro-

phorese

Nach MÜLLER & WEILER (2000a) ließ sich die IES-Synthase durch native

Gelelektrophorese nach SCHÄGGER et al. (1994) darstellen. Die isolierte Proteinfraktion

war enzymatisch aktiv und wies ein Molekulargewicht von etwa 180 kDa auf. Ausgehend

von diesen Resultaten wurde eine hoch angereicherte Proteinfraktion (2.10.2.3) mittels

„Blau-Nativer“ Gelelektrophorese getrennt und Proteine des entsprechenden Molekular-

gewichtsbereiches isoliert. In einer zweiten Dimension wurden die isolierten Proteine über

denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (12.5 %) weiter aufgetrennt.

Ergebnisse

52

Abb. 3.7: (vorherige Seite) Gelelektrophoretische Präparation einer ange-reicherten Enzymfraktion zur Mikrosequenzierung putativer Indol-3-essigsäure-Synthase-Komponenten

Eine enzymatisch aktive Proteinfraktion (2.10.2.3) wurde über präparative „Blau-Native“ Gele (160 mm x 200 mm x 1 mm) aufgetrennt. Die Proteine des Molekulargewichtsbereiches von 150 kDa – 180 kDa wurden eluiert (2.12.5), und mit drei Volumen eiskaltem Methanol gefällt. In einer zweiten Dimension wurden die eluierten Proteine mittels SDS-PAGE (12.5 %) unter denaturierenden Bedingungen aufgetrennt. Eine Auswahl von Banden wurde ausgeschnitten, tryptisch verdaut und nach Elution der Peptidfragmente massenspektrometrisch analysiert (2.11.6). (A): Coomassie-gefärbter Gelstreifen eines „Blau-Nativen“-Gels (erste Dimension). Der zur Elution ausgewählte Molekulargewichtsbereich ist markiert. (B): Coomassie-gefärbter Gelstreifen der zweiten, denaturierenden Dimension (SDS-PAGE, 12.5 %). (C): Auswahl von Proteinbanden zur Mikrosequenzierung.

Die anschließende massenspektrometrische Analyse der Proteinbanden (2.11.6) der

zweiten elektrophoretischen Dimension lieferte keine Hinweise auf Proteine, welche direkt

mit der IES-Biosynthese in Verbindung stehen, wie beispielsweise Flavin-

Monooxygenasen (ZHAO et al., 2001) oder Cytochrom P450 Proteine (HULL et al., 2000).

Bei einem Großteil der identifizierten Proteine handelte es sich um Enzyme des

Primärstoffwechsels, wie beispielsweise Proteine mit großer Ähnlichkeit zu Komponenten

des Glycin-Decarboxylase-Komplexes (Accession AAC31228 putative Glycin-

Dehydrogenase [decarboxylierend], Accession AAL24244 P-Protein ähnliches Enzym,

Accession NM_119455 P-Protein ähnliches Enzym), welche im Zuge der Photorespiration

an der Rückgewinnung von Ribulose-1,5-bisphosphat aus 2-Phosphoglycolat beteiligt sind.

Bei den beiden unbekannten Proteinen in Bande 2 (Accession NP_176869) und Bande 5

(Accession AAF98209) handelt es sich mit großer Wahrscheinlichkeit um identische

Proteine. Eine BLASTP-Suche unter Verwendung der vollständigen Proteinsequenzen der

beiden Enzyme erbrachte eine Homologie zu bakteriellen Glycerophosphoryldiester-

Phosphodiesterasen.

Ergebnisse

53

Tab. 3.1: Massenspektrometrische Identifizierung gelelektrophoretisch isolierter Proteine aus Arabidopsis thaliana

Bande Protein errechnetes

Molekulargewicht [kDa]

Datenbankeintrag (Accession)

1 putative Glycin-Dehydrogenase [decarboxylierend]

113 AAC31228

2 unbekanntes Protein 83.8 NP_176869

3 P-Protein ähnliches Enzym 75 AAL24244

4 Adenosylhomocysteinase 53.4 NP_193130

5 unbekanntes Protein 83.8 AAF98209

6 Alanin-Glyoxylat Aminotransferase

44.2 NP_178969

7 putative Fructose-bisphosphat Aldolase

42.9 NM_127705

P-Protein ähnliches Enzym 112.9 NM_119455

8 Germin-ähnliches Protein 21.8 NM_122070

Besonderes Interesse weckte das 21.8 kDa große Germin-ähnliche Protein (Accession

NM_122070), da eine BLASTP-Suche für dieses Protein eine sehr hohe Homologie zu den

Auxinbindeproteinen ABP19 (77 %) und ABP20 (78 %) aus Prunus persica (Pfirsich)

erbrachte. Die von OHMIYA et al. (1998) beschriebenen Auxinbindeproteine ABP19/20

zeigen in einer Region ihrer Aminosäuresequenz (Aminosäuren vom N-Terminus: 98 –

115) 40 % Homologie zu den Auxinbindeproteinen ABP1 aus Zea mays (INOHARA et al.,

1989) und ABP1 aus Arabidopsis thaliana (PALME et al., 1992). Dieser Bereich deckt sich

mit der putativen Auxinbindestelle (BoxA), welche durch immunologische Unter-

suchungen von VENIS et al. (1992) eingegrenzt werden konnte. Wie die Proteine

ABP19/20, zeigt auch das identifizierte Germin-ähnliche Protein in dieser Region

Homologien zu den Bindeproteinen aus Mais und A. thaliana.

Ergebnisse

54

Abb. 3.8: Aminosäuresequenzvergleich der putativen Auxinbindestelle (BoxA) Zum Vergleich der potentiellen Auxinbindestelle im Germin-ähnlichen Protein (Accession NM_122070) aus A. thaliana (GLP) wurden die korrespondierenden Sequenzen der Auxinbindeproteine aus Prunus persica (ABP19, ABP20) (OHMIYA et al., 1998), A. thaliana (AABP1) (PALME et al., 1992) und Zea mays (MABP1) (INOHARA et al., 1989) herangezogen. Die putative Auxinbindestelle (BoxA) ist unterstrichen.

Auf eingehendere Untersuchungen des identifizierten Germin-ähnlichen Proteins wurde im

Rahmen dieser Arbeit verzichtet, da kein direkter Bezug zur Auxinbiosynthese in

A. thaliana zu ersehen war.

3.4 Beteiligung einer Flavin-Monooxygenase (YUCCA) an der

tryptophanabhängigen Indol-3-essigsäure-Biosynthese

Im Rahmen einer Mutantenanalyse gelang es ZHAO et al. (2001) mittels „Aktivierungs-

markierung“ eine A. thaliana-Mutante (yucca) zu finden, welche einen Auxinüber-

produktionsphänotyp (verlängerte Hypocotyle, epinastische Blätter) zeigte. Weiterhin

wurde gezeigt, daß dieser Auxinphänotyp aus der 35S-Promotor induzierten Über-

expression einer Flavin-Monooxygenase (YUCCA, Accession CAB79971) resultierte.

Pflanzenlinien, welche die YUCCA-mRNA überexprimieren, beinhalten bis zu 50 % mehr

freie IES und sind resistent gegen phytotoxische Tryptophan-Analoga, wie 5-Methyl-

tryptophan. Dies impliziert eine Beteiligung von YUCCA an der tryptophanabhängigen

IES-Biosynthese. Eine enzymatische Analyse der, durch das YUCCA-Gen kodierten,

Flavin-Monooxygenase (FMO) verwies auf einen in-vitro-Umsatz von Tryptamin zu

N-Hydroxytryptamin. Da Tryptamin in A. thaliana nicht nachgewiesen werden konnte und

Markierungsexperimente bei Tomaten, welche endogenes Tryptamin enthalten, keinen

Hinweis auf eine Beteiligung dieses Intermediates bei der Umsetzung von L-Trp gaben

(COONEY & NONHEBEL, 1991), bleibt die in-vivo-Funktion des YUCCA-Proteins ungeklärt.

Aufgrund dessen ist YUCCA als Komponente des IES-Synthase-Komplexes durchaus

Ergebnisse

55

denkbar. Um dieser Hypothese nachzugehen, sollte die YUCCA-cDNA kloniert und als

Fusionsprotein überexprimiert werden, um mittels immunologischer Methoden eine

Integration von YUCCA im IES-Synthase-Komplex zu überprüfen.

3.4.1 Konstruktion und Überprüfung eines Expressionssystems zur

heterologen Expression eines (His)6-YUCCA-Fusionsproteins

Die Klonierungsstrategie zur Erstellung N-terminal (His)6-markierter YUCCA-Proteine ist

in Abbildung 3.9 dargestellt.

Abb. 3.9: Strategie zur Klonierung (His)6-markierter YUCCA-Fusionsproteine Die YUCCA-cDNA wurde über RT-PCR mit den Oligonukleotiden YUCCA-BamHI und YUCCA-HindIII (2.6.4) amplifiziert und nach Restriktion gerichtet in den Klonierungsvektor pBS-SK+ eingebracht. Anschließend wurde das entsprechende BamHI/HindIII Fragment mit der (His)6-Sequenz im Expressionsvektor pQE-30 (Qiagen) fusioniert. Die mittels RT-PCR erhaltenen Fragmente wurden durch DNA-Sequenzierung auf ihre korrekte Sequenz hin überprüft.

Im Zuge der Klonierung des N-terminalen Fusionskonstruktes wurden die zusätzlichen

Aminosäuren MRGSHHHHHHGS (der Ni-NTA bindende Abschnitt ist unterstrichen)

Ergebnisse

56

hinzugefügt, ohne das eigene Startcodon der YUCCA-cDNA zu deletieren. Das entstandene

Plasmid erlaubte die Expression des Fusionsproteins in Escherichia coli. Der erstellte

Überexpressionsvektor pQE-YUC wurde in den E. coli Stamm XL1-blue transfiziert, und

die Proteinexpression durch Zugabe von 0.1 – 2 mM IPTG zu logarithmisch wachsenden

Bakterien bei Temperaturen von 18 – 37 °C über einen Zeitraum von 0.5 – 24 h induziert.

Zur Kontrolle wurden Bakterien mit dem Expressionsvektor (pQE-30) ohne klonierte

cDNA transformiert. Trotz dieser variablen Bedingungen konnte im Vergleich zum

Kontrollvektor keine, im SDS-PAGE erkennbare, Überexpression des Fusionsproteins

detektiert werden (ohne Abbildung). Immunologische Analysen unter Verwendung des

α-RGS-(His)4-Antikörpers, welcher spezifisch gegen den Fusionsanteil des rekombinanten

Proteins gerichtet ist, zeigten, daß das überexprimierte YUCCA-Protein in den Wirtszellen

proteolytischem Abbau unterworfen ist (Abb. 3.10).

Abb. 3.10: Proteolytischer Abbau rekombinanter YUCCA-Proteine Die Expression des (His)6-markierten YUCCA-Proteins wurde durch die Gabe von 0.5 mM IPTG induziert. In bestimmten Zeitintervallen wurden je 500 µl Bakterien-suspension entnommen und die Bakterien durch Zentrifugation geerntet (13000 upm, 1 min, RT). Die Bakteriensedimente wurden in je 50 µl SDS-Probenpuffer resuspendiert und für 20 min auf 95 °C erhitzt. Von dem bakteriellen Rohextrakt wurden 10 µl Aliquots über ein SDS-Gel (12.5 %) getrennt und die Proteine auf Nitrocellulose transferiert. Die Detektion der markierten Proteine erfolgte unter Verwendung eines α-RGS-(His)4-Antikörpers.

Im Anschluß an eine native Reinigung des putativen YUCCA-Proteins aus der Fraktion

löslicher Proteine mittels einer Ni2+-Nitrilotriessigsäure-Chromatographie über den, aus

dem Vektor stammenden, Fusionsanteil („(His)6-tag“) ließen sich geringe Mengen an

YUCCA-Protein reinigen. Immunologische und massenspektrometrische Analysen

erlaubten eine zweifelsfreie Identifizierung des YUCCA-Proteins. Wie in Abbildung 3.11

Ergebnisse

57

zu erkennen ist, führte die affinitätschromatographische Reinigung nicht zu einer

vollständig homogenen Darstellung des Fusionsproteins.

Abb. 3.11: Affinitätschromatographische Reinigung bakteriell exprimierter,

N-terminal (His)6-markierter YUCCA-Proteine an Ni-NTA-Agarose Nach Induktion der Proteinexpression (pQE-YUC) mit 0.5 mM IPTG und einer einstündigen Inkubation bei 30 °C wurde die lösliche Proteinfraktion aus einer 100 ml Bakteriensuspension gewonnen (2.5.2). Die löslichen Proteine wurden nach Herstellerangaben über eine Ni2+-beladene Nitrilotriessigsäure-Agarose-Säule chromatographiert. Dargestellt ist ein Coomassie-gefärbtes SDS-Gel (12.5 %). (1: 5 µl Proteinrohextrakt; 2: 7.5 µl Durchlauf; 3: 7.5 µl Waschfraktion; 4 – 9: Je 10 µl der Elutionsfraktionen 1 – 6)

Mit dem 47.3 kDa großen rekombinanten YUCCA-Protein koeluierte ein weiteres, etwa

60 kDa großes, Protein. Mittels Proteinsequenzierung ließ sich dieses Protein als ein

57 kDa großes bakterielles Hsp60-Protein (Accession 1OEL_A) identifizieren. Es handelt

sich hierbei um Proteine der Chaperon-Familie, welche an der Faltung von Proteinen

beteiligt sind (Übersicht siehe MARTIN & HARTL, 1997). Die angereicherte YUCCA-

Elutionsfraktion zeigte weder enzymatische Aktivität, noch die für Flavoproteine typisch

gelbliche Färbung, die beispielsweise bei der heterolog exprimierten OPR1 aus A. thaliana

(SCHALLER & WEILER, 1997) beobachtet werden kann. Aufgrund dieser Resultate kann

geschlußfolgert werden, daß rekombinante YUCCA-Proteine in dem erstellten

prokaryotischen Expressionssystem nicht korrekt gefalten werden, was dazu führt, daß

kein Flavin eingebaut wird. Weiterhin wird deutlich, daß die fehlgefaltenen Proteine sehr

schnell wieder abgebaut werden (Abb. 3.10).

Ergebnisse

58

3.4.2 Gewinnung polyklonaler Antikörper gegen YUCCA-Proteine

Obgleich mit dem oben beschriebenen Expressionssystem keine funktionelle Analyse des

YUCCA-Proteins möglich war, ließen sich doch ausreichende Mengen an denaturiertem

Protein präparieren, um einen polyklonalen Antikörper gegen das Protein herzustellen. Da

das koeluierende, bakterielle Hsp60 Homologien von über 60 % mit mitochondrialen

Chaperonen aus A. thaliana aufwies, war eine weitere Reinigung des Antigens über SDS-

PAGE erforderlich, um spätere Kreuzreaktionen des Antikörpers zu minimieren. Zu

diesem Zweck wurde das markierte YUCCA-Protein in sechs 300 ml Kulturansätzen über

eine Stunde exprimiert und die löslichen Proteinfraktionen gewonnen (2.8.1).

Anschließend wurden die markierten Proteine mittels „Immobilisierter-Metall-

Affinitätschromatographie“ (IMAC) gereinigt. Die Elutionsfraktionen wurden durch SDS-

Gelelektrophorese ermittelt, vereinigt, und zur Konzentrierung gefriergetrocknet. Mittels

nachfolgender präparativer Gelelektrophorese nach SCHARF & NOVER (1984) und

Elektroelution der Proteine konnte das Antigen in ausreichender Menge und Reinheit

präpariert werden (Abb. 3.12).

Abb. 3.12: Reinigung von des bakteriell exprimierten YUCCA-Proteins zur Her-stellung polyklonaler Antikörper

Dargestellt sind Coomassie-gefärbte 12.5 % SDS-Gele (A, B) bzw. Western-Blot Analysen (C). A: Zur Mengenabschätzung wurden bekannte Mengen Rinderserum-albumin (RSA) mitgeführt. B: Nach Anreicherung des Antigens über Affinitäts-chromatographie (IMAC) und präparative Gelelektrophorese wurden zwei prominente Banden aus dem Gel eluiert. Je 10 µl der Gelelutionsfraktionen wurden über SDS-Polyacrylamidgele getrennt. Die Fraktionen 1 und 2 bzw. 3 und 4 entstammen jeweils einer Bande des präparativen Gels. C: Western-Blot Analyse der gereinigten Proteine nach Transfer auf Nitrocellulose (α-RGS-(His)4-Antikörper).

Ergebnisse

59

Das stark angereicherte YUCCA-Protein (Abb. 3.12 B, Spur 1 und 2) wurde zur

Immunisierung eines Kaninchens eingesetzt (2.13.3). Unter Verwendung des Antiserums

konnte bakteriell exprimiertes YUCCA-Protein im bakteriellen Rohextrakt, sowie nach

affinitätschromatographischer Reinigung, bei einer Verdünnung des Serums von bis zu

1:20000 detektiert werden. Nach Trennung von 50 µg pflanzlichen Proteinrohextraktes und

Transfer der Proteine auf Nitrocellulose konnte auch bei Serumverdünnungen von 1:1000

kein Signal beobachtet werden (ohne Abbildung).

3.4.3 Immunologischer Nachweis von YUCCA im Pflanzenrohextrakt

Endogenes YUCCA-Protein ließ sich mit dem α-YUCCA-Serum (643) im

Pflanzenrohextrakt nicht ohne weiteres nachweisen, obgleich der Antikörper bakteriell

exprimiertes YUCCA-Protein in pflanzlichem Proteinrohextrakt detektierte (ohne

Abbildung). Da schon im Zuge der RT-PCR beobachtet wurde, daß nur äußerst geringe

Mengen an YUCCA-mRNA in den Pflanzen vorliegen, muß davon ausgegangen werden,

daß die Expressionsrate des endogenen YUCCA-Proteins sehr gering ist. Um das Protein

immunologisch nachweisen zu können wurden zweidimensionale Gele (2.12.2)

angefertigt, die, im Vergleich zu konventionellen SDS-Polyacrylamidgelen, eine deutlich

höhere Trennschärfe und stärkere Fokussierung der Proteine ermöglichten. Ein

repräsentatives, zweidimensionales Gel ist in Abbildung 3.13 dargestellt. In Abb. 3.13 B

ist die Vergrößerung eines Teiles des Western-Blots dargestellt, auf dem drei

Proteinbanden auf Höhe von 45 kDa beobachtet werden können. Hierbei handelt es sich

mit großer Wahrscheinlichkeit um die von ZHAO et al. (2001) beschriebenen Proteine

YUCCA, YUCCA2 (Accession CAB4936) und YUCCA3 (Accession AAB80641).

YUCCA2 und YUCCA3 zeigen 53 % respektive 51 % Homologie zu dem zuvor

angeführten YUCCA-Protein. Die Überexpression aller drei Proteine in Pflanzen führt zu

vergleichbaren Phänotypen, was auf eine redundante Funktion der Proteine verweist.

Neben den drei Signalen bei 45 kDa läßt sich zudem noch eine Kreuzreaktion des Serums

gegen ein Protein bei etwa 62 kDa beobachten.

Ergebnisse

60

Abb. 3.13: Immunologischer Nachweis von YUCCA im Pflanzenrohextrakt Für die zweidimensionale gelelektophoretische Darstellung von YUCCA wurden 250 µg Proteinextrakt 14 Tage alter Keimlinge verwendet. Die isoelektrische Fokussierung erfolgte in Röhrchengelen unter Verwendung einer Ampholytlösung, welche den pH-Bereich von pH 5.0 bis pH 8.0 abdeckte. A: Coomassie-gefärbtes, exponentielles Gradientengel (20 – 10 % Polyacrylamid).B: Western-Blot Analyse von (A). Unter Verwendung des α-YUCCA-Serums (643, 1:1000) als erstem Antikörper, ließen sich spezifische Signale auf Höhe von 44 kDa detektieren. Dargestellt ist ein Ausschnitt des Blots. Der dargestellte Bereich ist in Teil A markiert.

3.4.4 Immunpräzipitation der Indol-3-essigsäure-Synthase unter

Verwendung von α-YUCCA-Antikörpern

Geeignete molare Konzentrationsverhältnisse von bivalenten Antikörpern zu multivalenten

Antigenen führen in Lösung zu einer Vernetzung der Antikörper mit ihren Antigenen.

Diese Komplexe lassen sich durch Nephelometrie bzw. Turbidimetrie quantitativ erfassen

oder mittels Zentrifugation präzipitieren. Die Immunpräzipitation unter Verwendung

spezifisch gereinigter α-YUCCA-Antikörper wurde eingesetzt, um zu untersuchen, ob

YUCCA eine Komponente des IES-Synthase-Komplexes darstellt. Um Serumeffekte im

Vorfeld ausschließen zu können, wurden die spezifischen Antikörper zuvor über

Nitrocellulose isoliert (2.13.5), und vor ihrer Verwendung auf ihre Funktionalität hin

überprüft. Je 200 µl einer angereicherten Proteinfraktion (2.10.2.2) wurden, bei einem

Gesamtansatzvolumen von 400 µl, mit aufsteigenden Volumina (50 µl, 100 µl und 150 µl)

Ergebnisse

61

der Antikörperlösung sowie 50 mM Tris/HCl, pH 8.0 versetzt und über Nacht bei 4°C

inkubiert. Als Kontrolle dienten Reaktionsansätze, denen anstatt der Antikörperlösung

gleiche Volumen an 50 mM Tris/HCl, pH 8.0 zugefügt wurden. Nach der Inkubation

wurden die Proben zentrifugiert (13000 upm, 30 min, 4 °C) und die Überstände von den

Sedimenten getrennt. Die Überstände wurden mit je 200 µl 20 mM L-Trp versetzt und für

5 h bei 37 °C inkubiert. Im Anschluß wurde die gebildete Menge an IES mittels GC-MS-

Analyse bestimmt.

Bei einer Beteiligung von YUCCA an dem IES-Synthase-Enzymkomplex sollte eine

solche Immunpräzipitation zur Abnahme der IES-Synthase-Aktivität im Überstand führen.

Abb. 3.14: Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität im Überstand nach Immun-präzipitation mit spezifisch gereinigten α-YUCCA-Antikörpern

Nach Vernetzung der Antikörper-Antigenkomplexe über Nacht (4 °C) und Präzipita-tion der Komplexe mittels Zentrifugation (13000 upm, 30 min, 4 °C) wurde die verbliebene IES-Synthase-Aktivität im Überstand mittels gaschromatographisch-massenspektrometrischen Analysen untersucht. Die Daten verstehen sich als Mittel-werte ± Standardabweichung von n = 2 unabhängigen Experimenten.

Entgegen den Erwartungen konnte die Aktivität der IES-Synthase im Überstand

geringfügig gesteigert werden (52 %) (Abb. 3.14), was darauf hinweist, daß die Proteine

der YUCCA-Familie keine integralen Bestandteile des IES-Synthase-Komplexes sind.

Ergebnisse

62

Diese Ergebnisse konnten auch durch Immunaffinitätschromatographien bestätigt werden,

in denen die IES-Synthase-Aktivität weder auf der Säule zurückgehalten, noch retardiert

eluiert wurde.

3.5 Analyse potentieller Metaboliten und Inhibitoren der Indol-3-

essigsäure-Biosynthese

Die Arbeit von MÜLLER & WEILER (2000a) lieferte Hinweise auf die Beteiligung einer

Nitrilase an der tryptophanabhängigen IES-Biosynthese. So konnte beispielsweise über

Markierungsexperimente gezeigt werden, daß beide Sauerstoffmoleküle der Carboxy-

gruppe der IES aus Wasser stammen, was für eine nitrilasekatalysierte Reaktion spricht. In

dieser einstufigen Reaktion wird Indol-3-acetonitril (IAN) unter Verbrauch von zwei

Molekülen Wasser zur korrespondierenden Säure hydratisiert. In weiterführenden

Untersuchungen konnte allerdings nicht gezeigt werden, daß aus markiertem Trp

sequentiell auch markiertes IAN entsteht. Detaillierte Kenntnisse hinsichtlich wirkungs-

voller Inhibitoren der IES-Synthase-katalysierten L-Trp Umsetzung bzw. der Nachweis

intermediär entstehender Metabolite könnten von großer Hilfe bei der näheren

Charakterisierung des IES-Synthase-Komplexes sein.

3.5.1 Wirkung von Indol-3-essigsäurehydrazid auf die Indol-3-

essigsäure-Synthase-Aktivität

Indol-3-essigsäurehydrazid (IESH) ist ein äußerst wirksamer Inhibitor der Auxinbio-

synthese bei pflanzenpathogenen Bakterien, wie z.B. Agrobacterium tumefaciens

(persönliche Mitteilung WEILER). Um die Wirkung dieses Indolderivates auf die IES-

Synthase zu überprüfen, wurden je 200 µl einer angereicherten IES-Synthase-Fraktion

(2.10.2.2) ad 10 mM mit 20 mM L-Trp-Lösung und aufsteigenden Mengen an Indol-3-

essigsäurehydrazid versetzt. Nach Inkubation der Ansätze wurde die gebildete IES

extrahiert und mittels GC-MS-Analysen quantitativ erfaßt.

Ergebnisse

63

Abb. 3.15: Wirkung von Indol-3-essigsäurehydrazid auf die Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität

Dargestellt sind gaschromatographisch-massenspekrometrische Daten zur Wirkung von Indol-3-essigsäurehydrazid (IESH) auf die IES-Synthase-Aktivität. Nach Inkuba-tion (6 h, 37 °C) der Reaktionsansätze mit unterschiedlichen Mengen an IESH erfolgte die Quantifizierung der gebildeten IES mittels interner Standardisierung der Ansätze mit [2H]2-Indol-3-essigsäure (2.11.4). Die experimentellen Daten repräsentieren die Mittelwerte ± Standardabweichung aus n = 2 unabhängigen Experimenten.

In den durchgeführten Experimenten konnte für das IESH keine inhibitorische Wirkung

auf die in-vitro-Biosynthese der IES beobachtet werden (Abb. 3.15).

3.5.2 Tryptamin als putative Zwischenstufe der Indol-3-essigsäure-

Biosynthese

Die immunologischen Befunde deuteten darauf hin, daß YUCCA keine integrierte

Komponente des IES-Synthase-Komplexes darstellt. Dieses Resultat sollte durch

Verdünnungsexperimente mit Tryptamin (TAM) verifiziert werden. Nach ZHAO et al.

(2001) stellt TAM das native Substrat für die YUCCA-Proteine dar. Sollte TAM, obgleich

es für A. thaliana bisher nicht als endogenes Indolderivat beschrieben wurde, Intermediat

der IES-Synthase-katalysierten Trp-Umsetzung sein, müßte sich der L-Trp-Umsatz in-vitro

durch Zugabe von TAM verdünnen (reduzieren) lassen. Um die Wirkung von TAM

zweifelsfrei beurteilen zu können, wurde konzentrierter Proteinrohextrakt (2.8.4) mit

ansteigenden TAM-Mengen versetzt, und der Umsatz von [2H]5-L-Trp zu [2H]5-IES

Ergebnisse

64

verfolgt. Im Falle einer Umsetzung von TAM zur IES sollte der Gehalt an markierter

[2H]5-IES sinken.

Die Analyse der gebildeten Menge an [2H]5-IES bestätigte den immunologischen Befund

(ohne Abbildung). TAM zeigte im verwendeten in-vitro-System bei Konzentrationen von

bis zu 1 mM keinerlei Einfluß auf die Umsetzung von [2H]5-L-Trp und stellt somit kein

Intermediat der IES-Synthase-Reaktion dar.

3.5.3 Verdünnung der Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität durch

Indol-3-acetamid

Der einzige bisher vollständig aufgeklärte IES-Biosyntheseweg ist der sogenannte Indol-3-

acetamid-Weg, welcher für viele Bakteriengattungen wie beispielsweise Agrobacterium

(WEILER & SCHRÖDER, 1987), Azospirillium (BAR & OKON, 1993), Pseudomonas (MAGIE

et al., 1963) und Streptomyces (MANULIS et al., 1994) beschrieben wurde. Im Zuge dieser

zweistufigen Reaktionssequenz wird L-Trp von einer Tryptophan-2-Monooxygenase

(TMO) zu Indol-3-acetamid (IAM) umgesetzt, welches abschließend durch eine Indol-3-

acetamid-Hydrolase zur IES metabolisiert wird. Obgleich diese Reaktionssequenz für

bakterienspezifisch erachtet wird, ließ sich in einigen Pflanzenspezies, wie beispielsweise

Oryza sativa (KAWAGUCHI et al., 1991) und Poncirus trifoliata (KAWAGUCHI et al., 1993),

eine IAM-Hydrolase-Aktivität nachweisen. Des weiteren konnte in Prunus jamasakura

(SAOTOME et al., 1993) und Citrus unshiu (IGOSHI et al., 1971; TAKAHASHI et al., 1975)

IAM als endogene Substanz detektiert werden. Basierend auf diesen Hinweisen erschien es

von besonderem Interesse, die Wirkung von IAM auf die IES-Synthase näher zu

untersuchen. Zu diesem Zweck wurde, wie schon zuvor beschrieben (3.5.2), der Umsatz

von [2H]5-L-Trp zu [2H]5-IES in pflanzlichen Proteinextrakten, diesmal unter Zusatz von

IAM analysiert. Wie in Abbildung 3.16 dargestellt ist, konnte für IAM ein deutlicher

Einfluß auf die [2H]5-L-Trp-Umsetzung gemessen werden. Bei gleichen molaren

Verhältnissen (1 mM) von IAM zu [2H]5-L-Trp ließ sich die in-vitro-Synthese von [2H]5-

IES aus markiertem L-Trp auf 63.3 % senken. Ein 10-facher Überschuß von IAM (10 mM)

führte zu einer Senkung des [2H]5-L-Trp-Umsatzes auf 21.5 %.

Ergebnisse

65

Abb. 3.16: Einfluß von Indol-3-acetamid auf die in-vitro-Umsetzung von [2H]5-L-Tryptophan zu [2H]5-Indol-3-essigsäure

Pflanzlicher Proteinrohextrakt (2.8.4) wurde unter Zusatz aufsteigender IAM-Mengen und [2H]5-L-Trp als markiertem Substrat über 6 h bei 37 °C inkubiert. Nach Ansäuerung (pH 2.0) der Ansätze wurden die indolischen Komponenten mit einem Volumen Ethylacetat extrahiert, die enthaltenen Carbonsäuren mit Diazomethan methyliert und die IES-Gehalte mittels GC-MS-Analysen quantitativ erfaßt. Die Menge an enzymatisch gebildeter [2H]5-IES ließ sich anhand interner Standardisierung der Proben mit bekannten Mengen an [2H]2-IES errechnen. Die gezeigten Daten sind als Mittelwerte ± Standardabweichung aus n = 3 unabhängigen Versuchen zu verstehen.

Die dargelegten Ergebnisse implizierten eine Beteiligung von IAM als Intermediat der

IES-Biosynthese. Eine inhibitorische Wirkung des IAM kann hingegen ausgeschlossen

werden, da die benötigten Konzentrationen zur effektiven Reduktion der IES-Synthese für

spezifische Inhibitoren untypisch hoch wären.

3.5.4 Tryptophan als biosynthetische Vorstufe von Indol-3-acetamid

Die Resultate der IAM-Verdünnungsexperimente (3.5.3) verwiesen auf eine intermediäre

Beteiligung von IAM an der IES-Biosynthese. Folglich müßte aus der biosynthetischen

Vorstufe, dem L-Trp, IAM gebildet werden. Für weiterführende Untersuchungen zur Rolle

von IAM als Intermediat der IES-Synthese mußte zunächst eine Methode erarbeitet

werden, die eine sensitive Analyse von IAM ermöglichte.

Ergebnisse

66

Da das Amid gaschromatographisch nur äußerst diffizil darstellbar ist, erfordert die

gaschromatographisch-massenspektrometrische Analyse eine Derivatisierung mit Trifluor-

essigsäureanhydrid (TFAA). Eine Trifluoracetylierung unter Verwendung von TFAA

(2.11.3) liefert allerdings für IAM und IES identische Produkte. Daher ist eine Trennung

der entsprechenden indolischen Verbindungen im Vorfeld erforderlich. Eine, der GC-

MS/MS-Analyse (2.11.5) vorgeschaltete, hochleistungsflüssigkeitschromatographische

Trennung (2.10.1.2) ermöglichte die Separierung, und damit die selektive Derivatisierung

der indolischen Komponenten.

Abb. 3.17: Hochleistungsflüssigkeitschromatographische Trennung indolischer Verbindungen

Dargestellt ist das Elutionsverhalten von drei analysierten indolischen Verbindungen (je 100 ng) im Verlauf der HPLC-Trennung. Gezeigt sind relative Absorptions-einheiten, wobei das Peakmaximum gleich 100 % gesetzt wurde.

Durch externe Standardisierung der HPLC mit Referenzsubstanzen konnten die

Retentionszeiten von IES und IAM ermittelt werden (vgl. Abb. 3.17). Auf diese Weise

ließen sich die indolischen Komponenten manuell fraktionieren und die IAM-Fraktion

selektiv trifluoracetylieren. Zur Untersuchung des IAM wurde eine GC-Tandem-MS

Technik (2.11.5) erarbeitet, welche auf der Analyse der Fragmentionen m/z = 226, 242,

323 und 339 für IAM bzw. m/z = 231, 247, 328 und 344 für [2H]5-IAM beruhte (siehe

Abb. 3.18). Diese gekoppelte HPLC/GC-MS/MS-Methode ermöglichte eine außer-

ordentlich sensitive Darstellung von IAM.

Ergebnisse

67

Ergebnisse

68

Abb. 3.18: (vorherige Seite) Massenspektrometrischer Nachweis der enzymatischen [2H]5-Indol-3-acetamid-Synthese durch Arabidopsis thaliana-Proteinextrakte

Pentadeuteriertes L-Trp wurde von Proteinrohextrakten (2.8.4) bzw. angereicherten Proteinextrakten (2.10.2.2) aus A. thaliana in [2H]5-IAM umgesetzt. MS/MS Analysen der charakteristischen Mutterionen (m/z = 367 für unmarkiertes IAM (3.18.A.I) bzw. m/z = 372 für [2H]5-IAM (3.18.A.II)) erbrachten die spezifischen Fragmentierungs-muster, welche in (A) gezeigt sind. (B): Dargestellt sind die Chromatogramme für die unmarkierte IAM-Referenzprobe (3.18.B.I), das enzymatisch im Proteinrohextrakt gebildete [2H]5-IAM (3.18.B.II) und das durch eine angereicherte Proteinfraktion gebildete [2H]5-IAM (3.18.B.III). (C): Vorgeschlagene Fragmentierung und Struktur des trifluoracetylierten IAM.

Zur Analyse der IAM-Synthese durch pflanzliche Proteinextrakte wurden 400 µl der

entsprechenden Proteinfraktionen (Proteinrohextrakt (2.8.4) bzw. High Q-angereicherte

Fraktion (2.10.2.2)) mit [2H]5-L-Trp (5 mM Endkonzentration) versetzt und über

mindestens 6 h bei 37 °C inkubiert. Nach Extraktion der Ansätze mit Ethylacetat ließen

sich die indolischen Komponenten, wie oben angeführt, mittels HPLC trennen (2.10.1.2).

Die anschließende GC-MS/MS-Analyse (2.11.5) der Ansätze belegte zweifelsfrei die

enzymatische Bildung von [2H]5-IAM aus dem markierten [2H]5-L-Trp. In hitzein-

aktivierten Kontrollreaktionen wurde kein [2H]5-IAM detektiert. Wie aus Abbildung 3.18

abgeleitet werden kann, konnte für die angereicherte Proteinfraktion ein etwa 120-fach

höherer [2H]5-IAM-Gehalt ermittelt werden (Abb. 3.18.A.I, II). Dieses Ergebnis korreliert

mit den Anreicherungsdaten für die IES-Synthase.

3.5.5 Einfluß von Tryptophan auf den in-vitro-Umsatz von Indol-3-

acetamid zur Indol-3-essigsäure

Die unter 3.5.4 präsentierten Daten können als Beleg für eine intermediäre Beteiligung von

IAM bei der IES-Biosynthese in A. thaliana gewertet werden. Für den vorgeschlagenen

Mechanismus müßte das IAM in einem letzten amidohydrolasekatalysierten Reaktions-

schritt zur IES umgesetzt werden. Für den eindeutigen Nachweis dieser Reaktion wurde

markiertes IAM als Substrat hergestellt. Unter Verwendung einer bakteriellen Tryptophan-

2-Monooxygenase (freundlicherweise von Prof. Fitzpatrick (Universität Texas A&M,

USA) zur Verfügung gestellt) ließ sich, wie in Kap. 2.7.4 beschrieben, [2H]5-IAM

enzymatisch aus [2H]5-L-Trp synthetisieren. Das [2H]5-IAM wurde mittels Dünnschicht-

chromatographie und anschließender HPLC-Reinigung, bei einer Ausbeute von 91 %

d.Th., homogen dargestellt. Dieses Resultat konnte durch GC-MS/MS-Analysen (Abb.

3.19) belegt werden.

Ergebnisse

69

Abb. 3.19: Massenspektrometrische Analyse des enzymatisch synthetisierten [2H]5-Indol-3-acetamids

[2H]5-L-Trp konnte mit hoher Ausbeute, unter Verwendung einer heterolog exprimierten Tryptophan-2-Monooxygenase aus Pseudomonas savastanoi, zu [2H]5-IAM umgesetzt werden. (A): Spezifisches Fragmentierungsmuster der MS/MS-Analyse (2.11.5) der charakteristischen Mutterionen (m/z = 367 für IAM; m/z = 372 für [2H]5-IAM). (B): Den Gaschromatogrammen kann entnommen werden, daß das Reaktionsprodukt, [2H]5-IAM, nach Rt = 525 s bzw. das unmarkiertes IAM nach Rt = 527 s eluiert.

Mit Hilfe des synthetisierten [2H]5-IAM ließ sich der in-vitro-Umsatz zur IES aufzeigen

(ohne Abbildung). Durch Supplementation der Reaktionsansätze mit L-Trp wurde

Ergebnisse

70

weiterhin untersucht, ob sich die endständige Amidohydrolasereaktion verdünnen läßt.

Wie in Abbildung 3.20 dargestellt ist, konnte durch aufsteigende Mengen an L-Trp der

Umsatz von [2H]5-IAM zu markiertem IES beeinflußt werden.

Abb. 3.20: Verdünnung des in-vitro-Umsatzes von markiertem Indol-3-acetamid zu [2H]5-Indol-3-essigsäure durch Tryptophan

Zur Analyse der Trp-Wirkung auf die IAM-Umsetzung wurden in in-vitro-Ansätzen je 400 µl einer angereicherten Proteinfraktion (2.10.2.2) mit 1 mM [2H]5-IAM (Endkonzentration) und aufsteigenden Mengen an L-Trp versetzt. Nach Inkubation der Reaktionsansätze über 6 h bei 37 °C wurden die enzymatisch entstandenen Carbon-säuren mittels Ethylacetat extrahiert und gaschromatographisch-massenspektro-metrisch untersucht (2.11.4). Dargestellt sind typische Ergebnisse, je eines von mindestens zwei unabhängigen Experimenten. ( : Aus L-Trp gebildete, nicht markierte IES; : markierte, aus [2H]5-IAM entstandene IES; : Kontrollreaktion, ohne [2H]5-IAM)

Der Einsatz gleicher Mengen von L-Trp und [2H]5-IAM führte zu einer Verringerung des

IAM-Umsatzes auf etwa 53.7 %. Vergleicht man dieses Resultat mit den Ergebnissen der

oben angeführten Verdünnungsexperimente (3.5.3), welche eine Reduktion des in-vitro-

[2H]5-L-Trp-Umsatzes auf 63.3 % nach Gabe aquimolarer Mengen an IAM und L-Trp

zeigten, so kann auf ein Zusammenhang dieser Reaktionen geschlossen werden.

3.5.6 Stereoselektivität der Indol-3-acetamid-Synthese

Der IES-Synthase-Komplex setzt, wie von MÜLLER & WEILER (2000a) beschrieben,

stereoselektiv das L-Enantiomer des Tryptophans zur IES um. Um zu untersuchen, ob die

IAM-Synthese ebenfalls strikt stereoselektiv verläuft, wurde der Umsatz von [2H]5-L-Trp

Ergebnisse

71

bzw. D-Trp durch angereicherte Proteinextrakte (2.10.2.2) näher charakterisiert. In parallel

durchgeführten Experimenten wurden je 400 µl einer High Q-gereinigten Proteinfraktion

(2.10.2.2) mit 5 mM [2H]5-L-Trp, bzw. mit 5 mM [2H]5-L-Trp und 5 mM D-Trp versetzt,

und über 6 h bei 37 °C inkubiert. Nach Extraktion der indolischen Komponenten wurden

die IAM-Fraktionen manuell mittels HPLC isoliert (2.10.1.2) und durch GC-MS/MS-

Analysen (2.11.5) weiterführend untersucht. Abbildung 3.21 kann entnommen werden, daß

in dem angereicherten Proteinextrakt sowohl [2H]5-L-Trp, als auch D-Trp zu IAM

metabolisiert werden.

Abb. 3.21: Untersuchungen zur Stereoselektivität der Indol-3-acetamid-Synthe-se

Dargestellt sind die, mittels GC-MS/MS-Analyse, ermittelten Gehalte an IAM und [2H]5-IAM aus Reaktionsansätzen, welche mit [2H]5-L-Trp oder [2H]5-L-Trp und D-Trp inkubiert wurden. Die weißen Balken ( ) zeigen den Umsatz von [2H]5-IAM zu IAM in den Reaktionsansätzen ohne D-Trp. Die grauen Balken ( ) stellen die Bildung von [2H]5-IAM- bzw. IAM in Ansätzen mit [2H]5-L-Trp und D-Trp dar. Die Abbildung zeigt die Mittelwerte ± Standardabweichung von n = 3 unabhängigen Experimenten.

Da bei Anwesenheit von D-Trp eine gesteigerte IAM-Synthese beobachtet werden kann,

scheint diese Reaktion nicht stereoselektiv zu sein. In den Reaktionsansätzen, die neben

dem markierten L-Trp noch D-Trp enthielten, wurde in Summe doppelt soviel IAM

gebildet ([2H]5-IAM + IAM).

Da es sich bei den verwendeten Proteinfraktionen nicht um homogene IES-Synthase-

Präparationen handelte, könnte eine kontaminierende Nebenreaktion eine Ursache für die

Ergebnisse

72

fehlende Stereoselektivität darstellen, wobei aber zumindest eine unspezifische,

peroxidasekatalysierte Umsetzung des Tryptophans ausgeschlossen werden kann, da unter

den gewählten Reaktionsbedingungen (50 mM Tris/HCl, pH 8.0, 37 °C) auch mit sehr

sensitiven photometrischen Methoden (GALLATI & PRACHT, 1985) keine Peroxidase-

aktivität detektiert wurde (ohne Abbildung).

3.6 Vorkommen und Bildung von Indol-3-acetamid in Arabidopsis

thaliana

Basierend auf den Resultaten der in-vitro durchgeführten Experimente stellt IAM eine

putative IES-Vorstufe dar. Wie bereits erwähnt, konnte das endogene Vorkommen von

IAM in Höheren Pflanzen bislang nicht eindeutig gezeigt werden, da in allen bisher

veröffentlichten Studien zum Vorkommen von IAM (TAKAHASHI et al., 1975; SAOTOME et

al., 1993) eine bakterielle Kontaminationen des Pflanzenmaterials nicht ausgeschlossen

werden konnte. Bei der Analyse von IAM in Lösung muß zudem extrem sorgfältig auf die

Analysebedingungen geachtet werden, da in ammoniakhaltigen Lösungen IES-

Glykosylester spontan zu IAM zerfallen (ZENK, 1961).

Die Verwendung der, im Rahmen dieser Arbeit, etablierten HPLC/GC-Tandem-MS-

Analysetechnik (3.5.4, 3.5.5) lieferte, in Kombination mit steril angezogenem Pflanzen-

material, die Möglichkeit das Vorkommen von IAM in Höheren Pflanzen präzise

nachzuweisen. Im folgenden Kapitel werden Versuche zum Nachweis von IAM in

A. thaliana und eine mögliche Biosynthese aus IAN näher erörtert.

3.6.1 Endogener Indol-3-acetamid Gehalt in sterilen Arabidopsis

thaliana-Keimlingen

Zum quantitativen Nachweis von IAM in A. thaliana wurde ausschließlich steril angezoge-

nes Pflanzenmaterial eingesetzt, um bakterielle Kontaminationen ausschließen zu können.

Keimlinge verschiedenen Alters wurden geerntet und die indolischen Verbindungen me-

thanolisch extrahiert (2.8.5). Im Zuge der HPLC/GC-MS/MS-Analyse der Extrakte

konnten sehr geringe Mengen an IAM detektiert werden. Der Gehalt an IAM in 14 Tage

alten Pflanzen sank von 3.5 ng g-1 Frischgewicht auf etwa 130 pg g-1 Frischgewicht in

ausgewachsenen Rosettenpflanzen. Der höchste IAM-Gehalt wurde, wie in Abbildung 3.22

dargestellt, in gequollenen Samen gefunden, wobei die IAM-Menge im Verlauf von vier

Tagen sehr rasch abnimmt.

Ergebnisse

73

Abb. 3.22: Detektion endogener Indol-3-essigsäure- und Indol-3-acetamid-Gehalte in sterilen Arabidopsis thaliana-Keimlingen

Steril angezogene Keimlinge wurden geerntet und indolische Verbindungen isoliert (2.8.5). Die quantitative Analyse erfolgte mittels der unter 2.11.5 beschriebenen GC-MS/MS-Technik. Als interner Standard wurde den Extrakten zu Beginn der Aufarbeitung [2H]5-IAM (10 – 50 pmol) und [2H]2-IES (100 – 150 pmol) zugefügt. Die Zeitachse gibt Auskunft über die Wachstumsdauer unter Kurztagbedingungen. Für den Zeitpunkt t = 0 wurden die IES- und IAM-Gehalte in gequollenen und stratifizierten Samen vermessen. (A): Darstellung der IES- und IAM-Gehalte pro Gramm Frischgewicht. (B): IES- und IAM-Gehalte bezogen auf die Anzahl der untersuchten Individuen. Dargestellt sind die Mittelwerte ± Standardabweichungen aus n = 5 unabhängigen Experimenten.

Der IAM-Gehalt in unsteril angezogenen Pflanzen (30.9 ± 5.0 pmol g-1 Fg) ist, verglichen

mit steril gezogenem Pflanzenmaterial (20.5 ± 9.1 pmol g-1 Fg), geringfügig höher. Diese

Diskrepanz könnte durch die unterschiedlichen Wachstumsbedingungen begründet sein.

Daß die erhöhten IAM-Gehalte der nicht steril angezogenen Pflanzen nicht auf eine

bakterielle Kontamination zurückzuführen ist, scheint wahrscheinlich, da der IAM-Gehalt

in ausgewachsenen, unsterilen Rosettenpflanzen (5 – 7 cm Durchmesser) weiter absank

(0.74 ± 0.03 pmol g-1 Fg). Dieser Befund wäre bei einer bakteriellen Kontamination nicht

zu erwarten.

Ergebnisse

74

Gequollenen Samen zeigen, verglichen mit den 14 Tage alten Keimlingen, etwa 40-fach

höhere IAM- bzw. circa 270-fach höhere IES-Gehalte, wobei die Mengen beider

Substanzen besonders in den ersten 24 h nach der Keimung drastisch abnimmt. Dies

verweist auf eine Freisetzung aus möglichen Speicherstoffen, wie beispielsweise

Glucosinolaten, während der Keimung.

3.6.2 Indol-3-acetamid als zweites Endprodukt der Nitrilasereaktion

Nitrilasen (EC 3.5.5.1) katalysieren die Hydrolyse organischer Nitrile indem sie, in einer

einstufigen Reaktion, sukzessive zwei Moleküle Wasser anlagern. Die Nitrilasen sind aus

Bakterien (KOBAYASHI & SHIMIZU, 1994) und einigen Höheren Pflanzen (THIMANN &

MAHADEVAN, 1964a, b) bekannt. In A. thaliana besteht die Familie der Nitrilasen aus vier

Isogenen, von denen NIT1 – NIT3 tandemartig auf Chromosom III lokalisiert sind

(HILLEBRAND et al., 1998). NIT1 – NIT3 repräsentieren eine äußerst homologe Subfamilie,

deren Mitglieder den Umsatz von IAN zu IES in-vitro und in-vivo katalysieren können

(BARTLING et al., 1992; BARTLING et al., 1994; SCHMIDT et al., 1996; DOHMOTO et al.,

2000). NIT4 wird hingegen zu einer zweiten Subfamilie gezählt und codiert für eine β-

Cyano-L-alanin-Hydratase, welche an der Cyanidentgiftung der Zelle beteiligt ist

(PIOTROWSKI et al., 2000). Obgleich Nitrilasen vermutlich keine generelle Rolle in der

Auxinversorgung der Pflanzen spielen, verweisen eine Reihe von Belegen (Vorwerk et al.,

2001; KUTZ et al., 2002) auf ihre Funktion bei der IES-Synthese während bestimmter

Entwicklungsstadien. Anhand von Reportergen-Expressionsstudien ließ sich belegen, daß

NIT2 vornehmlich während der Keimung in den Samen exprimiert wird, wohingegen NIT3

vorwiegend während der ersten zwei Wochen nach der Keimung zu detektieren war.

Demzufolge werden diese Isoformen mit der Umsetzung von Nitrilen aus Glucosinolaten,

im besonderen aus Glucobrassicin, und der IES-Biogenese in Verbindung gebracht.

Weitere Untersuchungen lieferten Hinweise auf eine Bifunktionalität der Nitrilasen. So

zeigten KOBAYASHI et al. (1998a), daß die untersuchte bakterielle Nitrilase aus

Rhodococcus rhodochrous sowohl IAN als auch IAM als Substrat akzeptierte, wohingegen

PIOTROWSKI et al. (2000) beschrieben, daß Nitrilase 4 aus A. thaliana sowohl über eine

Nitrilase- als auch eine Nitrilhydratase-Funktion verfügt, was zu zwei echten Endproduk-

ten (Asparagin und Aspartat) der β-Cyano-L-alanin-Umsetzung führt. Um zu untersuchen,

ob die Nitrilasen 1 – 3 aus A. thaliana ebenfalls eine solche enzymatische Bifunktionalität

aufweisen und neben dem bekannten Endprodukt, der IES, auch IAM liefern, wurden die

Ergebnisse

75

Nitrilasen 1 – 3 im heterologen System überexprimiert und ihre enzymatische Aktivität

mittels HPLC analysiert.

Abb. 3.23: Umsatz von Indol-3-acetonitril durch die Nitrilasen 1 – 3 aus Arabi-dopsis thaliana

Jeweils 1 µg der affinitätschromatographisch gereinigten (His)6-Nitrilasefusions-proteine (2.8.2) wurden in gepufferter Lösung (50 mM Tris/HCl, pH 8.0) ad 5 mM mit IAN versetzt und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Die Quantifizierung der Re-aktionsprodukte erfolgte nach externer Standardisierung photometrisch (λ = 280 nm) mittels HPLC. Die Balken repräsentieren die Mittelwerte aus n = 3 unabhängigen Exprimenten ± Standardabweichung. ( : IAM; : IES)

Die Analyse der enzymatischen Aktivität der affinitätschromatographisch dargestellten

(His)6-Nitrilasefusionsproteine zeigt, daß die drei untersuchten Nitrilasen IAN sowohl zu

IES als auch zu IAM umsetzen. Die Verhältnisse von IAM- zu IES-Synthese können

Tabelle 3.2 entnommen werden. Da zusätzliche Experimente belegten, daß IAM von den

Nitrilasen nicht umgesetzt wird (ohne Abbildung), muß davon ausgegangen werden, daß es

sich in diesem Fall um zwei wirkliche Endprodukte der Nitrilasereaktion handelt. Alle drei

Nitrilasen zeigten ein nahezu konstantes Produktverhältnis (IES:IAM), wobei alle drei

Enzyme IAN bevorzugt zu IES umsetzen.

Ergebnisse

76

Tab. 3.2: Produktverhältnisse der Nitrilase 1 – 3 katalysierten Indol-3-aceto-

nitril-Umsetzung

IAM:IES

(His)6-NIT1 1:5.4

(His)6-NIT2 1:3.2

(His)6-NIT3 1:1.9

Die Ergebnisse zeigen eindeutig, daß Indol-3-acetonitril als biosynthetische Vorstufe des

IAM, insbesondere während der Keimlingsentwicklung, nicht ausgeschlossen werden

kann.

3.7 Untersuchungen zur Metabolisierung von Indol-3-acetamid in

Arabidopsis thaliana

Eine wachstumsfördernde Wirkung des IAM (WIGHTMAN, 1962) wird schon seit langem

kontrovers diskutiert, konnte aber bislang nicht eindeutig belegt werden. Da der in-vitro-

Umsatz von [2H]5-IAM zu [2H]5-IES nachgewiesen werden konnte (3.5.5) und die in-vivo-

Daten der IAM-Gehalte in Keimlingen (Abb. 3.22 B) auf eine Dynamik des IAM-Spiegels

hinweisen, muß davon ausgegangen werden, daß IAM ein biosynthetisches Intermediat

darstellt. Amidohydrolasen (Amidasen), welche eine Umsetzung von IAM zu IES

vermitteln, konnten aber bisher nur aus einigen Prokaryoten, wie beispielsweise

Agrobacterium tumefaciens (WEILER & SCHRÖDER, 1987), isoliert werden.

Um zu überprüfen, ob ähnlich Proteine auch in Pflanzen gefunden werden können, wurden

in-silico-Analysen durchgeführt. Unter Verwendung der heute verfügbaren Protein-

datenbanken bietet sich die Möglichkeit, bei entsprechender Homologie, funktions-

verwandte Enzyme in verschiedenen Spezies zu identifizieren. Bei der nachfolgend

beschriebenen Identifikation und funktionellen Analyse einiger putativer Amidohydrolasen

aus A. thaliana konnte die hohe Sequenzhomologie bakterieller Indol-3-acetamid-

Hydrolasen (IaaH) ausgenutzt werden.

Ergebnisse

77

3.7.1 Analyse abgeleiteter Aminosäuresequenzen für Indol-3-acetamid-

Hydrolasen aus pflanzenpathogenen Bakterien

Zur Identifikation putativer Amidohydrolasen aus A. thaliana, wurden fünf bekannte Indol-

3-acetamid-Hydrolasen (Amidohydrolasen) aus pflanzenpathogenen Bakterien miteinander

verglichen. Auf diese Weise ließ sich auf Aminosäureebene ein Bereich von etwa 118

Aminosäuren ausmachen, welcher eine Homologie von etwa 73 % aufwies (Abb. 3.24).

Dieser Sequenzbereich wurde zur BLASTP-Suche in der TAIR BLAST Datenbank

(www.arabidopsis.org) verwendet.

Abb. 3.24: Aminosäuresequenzvergleich von fünf Indol-3-acetamid-Hydrolasen pflanzenpathogener Bakterien

Dargestellt ist ein Ausschnitt eines Aminosäuresequenzvergleiches von fünf Indol-3-acetamid Hydrolasen aus unterschiedlichen Bakterien. Die Schattierung gibt Auskunft über die Homologie innerhalb der Gruppe: schwarz: 100 %, grau: 75 %. Bei den verglichenen Proteinen handelt es sich um: Atum: Agrobacterium tumefaciens (Accession P25016); Avit: Agrobacterium vitis (Accession Q04557); Eher: Erwinia herbicola (Accession Q47860); Psav: Pseudomonas savastanoi (Accession P06618) und Psyr: Pseudomonas syringae (Accession P52831).

Die Datenbankrecherche lieferte vier unterschiedliche putative A. thaliana Amidasen

(Accession: AAG35612, CAA71371, NP_196504, BAB02718) mit einer Sequenz-

homologie von 39.1 % bis 60.4 % (identische plus ähnliche Aminosäuren) zu dem

eingesetzen Aminosäuresequenzabschnitt bakterieller Amidase-Proteine, welche im

folgenden mit AMI1 – AMI4 bezeichnet werden.

Ergebnisse

78

3.7.2 Analyse der Aminosäuresequenzen der vier putativen Amidasen

aus Arabidopsis thaliana

Das katalytische Zentrum bakterieller Amidasen ist bereits eingehend untersucht worden

(KOBAYASHI et al., 1997). Experimente an der Rhodococcus sp. Amidohydrolase

(EC 3.5.1.4, Accession M74531) verwiesen auf eine, in allen untersuchten Amidasen

hochkonservierte, katalytische Triade (Asp-170, Ser-174, Cys-182) im aktiven Zentrum

des Enzyms. Im Gegensatz zu der, von den Nitrilasen bekannten katalytischen Triade,

erwies sich das Cystein im Zentrum der Amidasen als weniger essentiell, was auf einen

anders gearteten Reaktionsmechanismus hindeutete.

Ein Vergleich der identifizierten Proteine aus A. thaliana (AMI1 – AMI4) mit der Amino-

säuresequenz der Amidohydrolase aus Rhodococcus sp. wurde durchgeführt, um die

pflanzlichen Proteine näher zu analysieren und innerhalb der Gruppe putative Amidasen zu

identifizieren.

Abb. 3.25: Aminosäuresequenzvergleich des katalytischen Zentrums der Amido-hydrolase aus Rhodococcus sp. mit den putativen Amidasen aus Arabidopsis thaliana

Die homologen, Glycin-Serin-reichen Teile der Aminosäuresequenz der identifizierten Proteine aus A. thaliana wurden mit dem katalytischen Zentrum der Amidohydrolase aus Rhodococcus sp. verglichen. Die Aminosäuren des aktiven Zentrums (Asp-170), Ser-174) und zudem das Cystein-182 sind durch Pfeile markiert. Rho: Amidohydrolase Rhodococcus sp., Accession M74531) (KOBAYASHI et al., 1997); AMI1: Accession AAG35612; AMI2: Accession CAA71371; AMI3: Accession NP_196504; AMI4: Accession BAB02718.

Nur die AMI1-Sequenz beinhaltetet alle essentiellen Aminosäuren des katalytischen

Zentrums (Asp und Ser), wohingegen allen anderen putativen Amidasen aus A. thaliana

zumindest eine dieser katalytisch essentiellen Aminosäuren fehlte. In der AMI2-Sequenz

ist das katalytisch relevante L-Aspartat (Asp-133, AMI1) gegen das funktionell

vergleichbare L-Glutamat (Glu-166, AMI2) ausgetauscht. Da es sich hier um einen

Ergebnisse

79

konservativen Aminosäureaustausch handelt, wurden die Proteine AMI1 und AMI2 für

weitergehende Analysen ausgewählt.

Abb. 3.26: Lokalisation und genomische Organisation des AMI1- und AMI2-Gens auf den Chromosomen I bzw. V von Arabidopsis thaliana

Die Lokalisation der beiden Gene erfolgte mit Hilfe der AGI (Arabidopsis Genomic Initiative) Chromosomenkarten unter Verwendung der TAIR Datenbank (www.arabidopsis.org). Die mit ATG überschriebenen Pfeile markieren die 5’ – 3’ Richtung und den Transkriptionsstartpunkt der Gene. Introne sind in weiß, Exone in schwarz dargestellt. Folgende Gene umgeben AMI1 (A) (At1g08980): At1g8900, putatives Zuckertransportprotein, ERD6 (Accession BAA25989); At1g08910, hypothetisches Protein (genefinder); At1g08920 putatives Zuckertransportprotein, ERD6 (Accession BAA25989); At1g08930, Zink-Finger Protein ATZF1, putativ; At1g08940, Ähnlichkeit zu Saccharomyces hypothetischem Protein YDR051c (Accession Z49209) [hypothetischer ORF]; At1g08950, t-RNA Pro; At1g08960, Ähnlichkeit zu Caenorhabditis hypothetischem Protein CO7A9 11 (Accession Z29094) [Na/Ca, K Antiporter]; At1g08970, Ähnlichkeit mit Schizosaccharomyces

Ergebnisse

80

CCAAT Bindefaktor (Accession U88525); At1g08990, unbekanntes Protein; At1g09000, Ähnlichkeit mit Nicotiana Proteinkinase-2 (NPK-1); At1g09010, Ähnlichkeit zu Bos ß-Mannosidase (Accession U46067) [Capra hircus ß-Mannosidase]. Die nachfolgenden Gene umgeben das AMI2 Gen (B) (At5g07360): At5g07300, Copin-ähnliches Protein; At5g07310, putativer Transkriptions-faktor: At5g07320, Ähnlichkeit zu einem löslichen Ca-abhängigen Carrier-Protein aus Oryctolagus cuniculus (Accession AF004161); At5g07330, putatives Protein; At5g07340, Calnexin homologes Protein; At5g07350, putatives Protein; At5g07370, putatives Protein; At5g07380, hypothetisches Protein; At5g07390, putatives Oxidase A Protein; At5g07400, hypothetisches Protein; At5g07410, Ähnlichkeit zu Pektin- Methylesterase Protein aus Medicago truncatula (Accession AJ249611).

Das AMI1-Gen ist auf dem linken Arm von Chromosom I in der Annotationseinheit

F7G19, in einem Abstand von 2.884 Mbp vom Telomer, lokalisiert. Das AMI2-Gen findet

sich in der Annotationseinheit T2I1 auf dem linken Arm von Chromosom V in einem

Abstand von etwa 2.1 Mbp zum Telomer. Die Intron-Exon-Struktur beider Gene kann

Abbildung 3.26 entnommen werden. Die Untersuchung der umgebenden Genregionen

zeigte, daß weder AMI1 noch AMI2 eine funktionelle Verwandtschaft zu den umgebenden

Genen aufweisen. Hieraus wurde geschlossen, daß die Gene AMI1 und AMI2 nicht in

Genfamilien organisiert sind.

3.7.3 Konstruktion und Verifikation von Plasmid-Vektoren zur

heterologen Expression von Amidase-Proteinen

Bakterielle Amidasen setzen neben ihrem eigentlichen Substrat auch Fettsäureamide

(CRAVATT et al., 1996) und möglicherweise auch Aminosäuren mit Amidfunktionen, wie

Asparagin und Glutamin um. Dies könnte, bedingt durch eine Ansäuerung des

Cytoplasmas, zu Vergiftungen der Zellen, bzw. zur Störung der Proteinbiosynthese führen.

Um größtmögliche Kontrolle über die heterologe Expression der pflanzlichen cDNA in

den Wirtsbakterien zu erhalten, wurde das pASK-IBA Expressionssystem (IBA,

Göttingen) verwendet. Dieses System verfügt über ein hochdichtes tet-Promotor/Operator

System (SKERRA, 1994), was die, von T5-Promotor-Systemen (z.B. pQE, Qiagen)

bekannte, nichtinduzierte Basalexpression der Fusionsproteine verhindert.

Unter Verwendung der TAIR-Datenbank (www.arabidopsis.org) ließen sich die cDNA-

Sequenzen für die Proteine AMI1 und AMI2 ermitteln und entsprechende Starter-

oligonukleotide zur Amplifikation der cDNAs mittels RT-PCR erstellen. Für beide Gene

ließen sich cDNA-Fragmente aus A. thaliana-Blattmaterial, jedoch nicht aus Wurzel-

gewebe (nicht dargestellt), isolieren.

Ergebnisse

81

Abb. 3.27: Amplifikation der AMI1 und AMI2 cDNA mittels RT-PCR Zur Amplifikation der Amidase cDNAs wurden je 2 µg Gesamt-RNA in RNA-DNA-Hybride überführt (2.6.4). Von diesen Ansätzen wurden jeweils 7 µl in einer nachfolgenden PCR (2.6.5) mit je 50 pmol der sequenzspezifischen Starter-oligonukleotidepaare AMI1-IBA5-Start, AMI1-IBA5-Rev (AMI1) und AMI2-Eco31I, AMI2-Rev (AMI2) eingesetzt. Als interne Kontrolle diente das, in Blättern konstitutiv exprimierte, NIT1-Gen (Oligonukleotide: NIT1-Strt und NIT1-IBA3-Rev).

Aus dem Vergleich der AMI1- und AMI2-Transkriptmenge mit der konstitutiv exprimierten

NIT1-cDNA (HILLEBRAND et al., 1998) als internen Marker geht hevor, daß beide

putativen Amidase-Gene in Blattgewebe ebenfalls konstitutiv exprimiert werden. In beiden

Fällen wurde, verglichen mit NIT1, eine deutlich geringere Expressionsstärke beobachtet.

Das AMI1-PCR-Fragment konnte, nach Restriktion mit der Restriktionsendonuklease

Eco31I, direkt in den Expressionsvektor pASK-IBA5 (ebenfalls Eco31I-geschnitten)

inseriert werden. Für die N-terminale Strep-Fusion wurde das AMI1-Startcodon deletiert

und eine Nukleinsäuresequenz, welche für die zusätzlichen Aminosäuren

MASWSHPQFEKGA (der bindungsvermittelnde Bereich ist unterstrichen) codiert,

hinzugefügt. Positive Transformanden wurden über ihre Antibiotikaresistenz selektioniert

und mit Hilfe der Sequenzierungsoligonukleotide pASK-IBA-Forw und pASK-IBA-Rev

(IBA, Göttingen) mittels DNA-Sequenzierung auf ihre korrekte Nukleinsäuresequenz hin

überprüft. Die AMI2-cDNA wurde zunächst in Standardklonierungsvektoren (pBS-SK+)

eingefügt. Mit Hilfe dieser Konstrukte wurden zwei verschiedene Überexpressionssysteme

erstellt. Für die Klonierung eines C-terminalen AMI2-Fusionskonstruktes wurde, vermittelt

durch den Expressionsvektor pASK-IBA3, die Nukleinsäuresequenzinformation für die

zusätzlichen Aminosäuren SAWSHPQFEK (der Strep-Tactin bindende Abschnitt ist

unterstrichen) direkt der letzten Base der AMI2-cDNA angefügt. Zusätzlich wurde ein N-

terminales (His)6-AMI2-Fusionskonstrukt hergestellt. Wie bei der N-terminalen AMI1-

Fusion wurde auch hier das eigene Startcodon der AMI2-cDNA deletiert und gegen eine

Ergebnisse

82

DNA-Sequenz ersetzt, die die N-terminale Verlängerung des AMI2-Polypeptides um die

Aminosäuren MRGSHHHHHHGSAC (der Ni-NTA bindende Teil ist unterstrichen)

vermittelt.

Eine Übersicht der Klonierungsstrategie, die der Klonierung C- und N-terminal markierter

Amidasen aus A. thaliana zu Grunde liegt, ist in der nachfolgenden Graphik dargestellt.

Ergebnisse

83

Abb. 3.28: (vorherige Seite) Klonierungsstrategie zur Herstellung C- bzw. N-terminal markierter Amidasen aus Arabidopsis thaliana

Dargelegt ist die Herstellung von Vektoren zur Expression von C- bzw. N-terminal markierten Amidasen im bakteriellen System. Die AMI1 cDNA wurde über RT-PCR (2.6.4) unter Verwendung der Oligonukleotide AMI1-IBA5-Start und AMI1-IBA5-Rev amplifiziert, mit Eco31I restringiert und direkt mit der linearisierten DNA (Eco31I) des pASK-IBA5 Vektors fusioniert (N-term. Strep-AMI1 Fusion: pASK-AMI1). Die AMI2 cDNA wurde mit den Oligonukleotidpaaren AMI2-Eco31I, AMI2-Rev und AMI2-SphI, AMI2-SalI ebenfalls mittels RT-PCR amplifiziert und zunächst in den Klonierungsvektor pBS-SK+ (SmaI-geschnitten) eingefügt. Anschließend wurden die entsprechenden cDNA-Fragmente herausgeschnitten und mit den komplementären Enden der gewünschten Expressionsvektoren fusioniert (C-term. Strep-AMI2 Fusion: pASK-AMI2; N-term. (His)6-AMI2 Fusion: pQE-AMI2). Alle mittels RT-PCR gewonnenen Fragmente wurden durch DNA-Sequenzierung auf ihre korrekte Basenfolge hin überprüft. Die kommerziellen Vektoren, die im Verlauf der Klonierungen benutzt wurden, sind gelblich unterlegt.

Die erstellten Plasmid-Vektoren (pASK-AMI1, pASK-AMI2 und pQE-AMI2) sollten die

Expression der rekombinanten Amidasen aus A. thaliana im bakteriellen System (E. coli)

und deren Aufreinigung ermöglichen.

Die Expression der Strep-markierten AMI1-Proteine erfolgte im E. coli Stamm XL1-blue

nach Induktion logarithmisch wachsender Bakterien mit 0.04 µg/ml Anhydrotetracyclin

über 6 h bei 30 °C (2.8.1). Wie in Abbildung 3.29A dargestellt, ließen sich die bakteriell

exprimierten AMI1-Fusionsproteine aus der Fraktion löslicher Proteine mittels Affinitäts-

chromatographie (Strep-Tactin-Sepharose, IBA, Göttingen) isolieren. Im Gegensatz dazu

ließen sich die AMI2-Konstrukte unter nativen Bedingungen nicht darstellen. Sowohl die

Expression der AMI2-cDNA als C-terminal Strep-markiertes, als auch als N-terminal

(His)6-markiertes Fusionsprotein lieferten ausschließlich Proteine, welche in

Einschlußkörpern („inclusion bodies“) eingelagert waren. Zur Gewinnung von Antikörpern

gegen das denaturierte AMI2-Protein wurden die Einschlußkörper einer (His)6-AMI2-

Präparation isoliert (2.8.1) und die markierten Proteine mittels SDS-PAGE gereinigt

(2.12.5). Um Aussagen über die enzymatische Aktivität der putativen Amidase 2 machen

zu können, wurden Einschlußkörper einer Strep-AMI2-Präparation gereinigt und die

enthaltenen Proteine unter Einsatz vom 8 M Harnstoff denaturiert. In Anlehnung an

KOBAYASHI et al. (1997) folgte darauf eine stufenweise durchgeführte Renaturierung der

Proteine mittels sequentieller Dialyse (2.8.1). Aus den Dialysaten ließen sich geringe

Mengen an rekonstituiertem AMI2-Protein, wie in Abbildung 3.29B dargestellt,

affinitätschromatographisch isolieren.

Ergebnisse

84

Abb. 3.29: Bakterielle Überexpression und affinitätschromatographische Reini-gung Strep-markierter Amidasen aus Arabidopsis thaliana

Dargestellt sind Coomassie-gefärbte, 12.5 %-ige SDS-Gele (A.I, B.I). Aufgetragen sind Fraktionen der affinitätschromatographischen Reinigung der Strep-markierten Proteine AMI1(A) und AMI2 (B). Die Isolierung der AMI1-Polypeptide erfolgte, wie unter 2.8.1 beschrieben, nach Herstellerangaben (IBA, Göttingen) aus der löslichen Proteinfraktion. Die markierten AMI2 Proteine wurden aus Einschlußkörpern gewonnen und erst nach Denaturierung/Renaturierung über Strep-Tactin-Sepharose angereichert. A.II und B.II zeigen Western-Blot Analysen der durchgeführten Reinigung. Die Detektion erfolgte unter Verwendung eines Strep-AP Konjugates. Beladung der Gele: 1: Rohextrakt (5 µl); 2: Säulendurchlauf (5 µl); 3: Waschfraktion (7.5 µl); 4 – 9: Elutionsfraktionen (10 µl) 1 – 6 (2 ml Fraktionen).

3.8 Enzymatische Charakterisierung der heterolog exprimierten

Amidasen aus Arabidopsis thaliana

Obgleich die, auf Sequenzvergleichen zu bakteriellen Indol-3-acetamid-Hydrolasen (3.7.1)

basierende, Identifikation der putativen Amidasen Hinweise auf eine Funktions-

verwandtschaft der Enzyme zu den bakteriellen IAM-Hydrolasen hindeutet, konnte nur

eine detaillierte Analyse der enzymatischen Charakteristika der klonierten Fusionsproteine

einen Nachweis ihrer Funktionalität erbringen. Nachfolgend sind Experimente zur

Bestimmung der enzymatischen Parameter der Amidase-Fusionsproteine dargelegt.

Ergebnisse

85

3.8.1 Substratspezifität der bakteriell exprimierten Amidase-Fusions-

proteine

Um die Substratspezifität der affinitätschromatographisch gereinigten Amidasen (Abb.

3.29) zu analysieren, wurde der Umsatz einer Reihe möglicher Substrate durch die

Amidasen 1 und 2 untersucht.

Ergebnisse

86

Abb. 3.30: (vorherige Seite) Substratspezifität der rekombinanten Amidase 1 aus Arabidopsis thaliana

Dargestellt ist der relative Umsatz von 13 unterschiedlichen Substraten durch je 5 µg der gereinigten Amidase 1 (2.10.2.4). Die Reaktionsansätze wurden bei pH 8.0 und 30 °C über einen Zeitraum von 4 h mit jeweils 10 mM Substrat inkubiert. Abgesehen vom Indol-3-acetyl-L-aspartat erfolgte die Bestimmung des enzymatischen Umsatzes aller anderen Substrate photometrisch bei 640 nm durch Quantifizierung des freigesetzten Ammoniaks nach Kopplung an einen Indophenol-Komplex (2.9.1). Da bei der Hydrolyse des Indol-3-acetyl-L-aspartats keine Ammoniakfreisetzung zu erwarten war, wurde die enzymatische Aktivität in diesem Fall mittels HPLC-Analyse untersucht. Der Umsatz des am besten umgesetzten Substrates (IAM) wurde gleich 100 % gesetzt und alle anderen Substratumsätze als prozentuale Anteile dargestellt. Alle Umsätze wurden durch Subtraktion der nicht enzymatischen Umsätze in abgekochten Kontrollen korrigiert. Die abgebildeten Daten verstehen sich als Mittelwerte von n = 4 unabhängigen Messungen ± Standardabweichung.

AMI2 setzte nach der Rekonstitution aus Einschlußkörpern und Reinigung über Strep-

Tactin-Sepharose keines der untersuchten Substrate um. Dies legt den Schluß nahe, daß

das rekombinante Protein seine enzymatische Aktivität verloren hat, oder ein anderes

Substrat bevorzugt. Abbildung 3.30 zeigt die Aktivität der AMI1 in Bezug auf 13

unterschiedliche Substrate.

Die Amidase 1 setzte unter den untersuchten Substraten bevorzugt IAM um. Eine

deutliche, wenn auch geringere Umsetzung konnte auch für die Substrate L-Asparagin

(41.5 %) und 1-Naphthylacetamid (25.5 %) ermittelt werden. Letzteres wurde zu

1-Naphthylessigsäure (1-NAA), einem nicht natürlich vorkommenden Auxin umgesetzt.

Von den Aminosäuren L-Glutamin und L-Asparagin wurde L-Asparagin deutlich besser

umgesetzt, jedoch konnte eine Kontamination der AMI1-Präparation durch eine bakterielle

Asparaginase ausgeschlossen werden. In identisch durchgeführten Aufarbeitungen von

Bakterien, welche den Leervektor pASK-IBA5 enthielten konnte, nach Affinitäts-

chromatographie keinerlei Amidase- bzw. Asparaginase-Aktivität detektiert werden.

Da die Amidase 1 sowohl die Aminosäure L-Asparagin, als auch IAM als Substrat

akzeptierte, bestand die Möglichkeit, daß AMI1 auch die Hydrolyse von IES-Aminosäure-

konjugaten, wie beispielsweise Indol-3-acetyl-L-aspartat (IES-L-aspartat) katalysiert.

Diese Auxin-Konjugate sind in Pflanzen weit verbreitet und fungieren in

A. thaliana als IES-Speicher (ANDERSSON & SANDBERG, 1982; ÖSTIN et al., 1998). Wie

aus der Graphik 3.30 abgeleitet werden kann, konnte für das Substrat IES-L-aspartat keine

hydrolytische Spaltung in IES und L-Aspartat gefunden werden. In Übereinstimmung mit

der fehlenden Hydrolyse-Aktivität zeigte die Aminosäuresequenz der AMI1 keine

Verwandtschaft zu den bekannten IES-Amidkonjugat-Hydrolasen aus Enterobacter

Ergebnisse

87

agglomerans (CHOU et al., 1998) und A. thaliana (DAVIES et al., 1999; LECLERE et al.,

2002) (nicht dargestellt).

3.8.2 Ermittlung enzymatischer Parameter der Amidase 1

Die Untersuchung zur Substratspezifität der Amidase 1 aus A. thaliana zeigte, daß es sich

bei diesem Enzym um eine spezifische IAM-Amidohydrolase handelt. Aus diesem Grund

wurde in allen weiterführenden Experimenten IAM als Substrat verwendet.

Abb. 3.31: Amidase 1-Aktivität in Abhängigkeit von Substrat, pH-Wert, Tempe-ratur und Proteingehalt

Die Messung der Aktivität des Strep-AMI1-Fusionsproteins erfolgte wie unter 2.9.1 beschrieben. Wenn nicht anders angegeben, wurden die Experimente mit je 5 µg gereinigtem Protein (2.10.2.4) und 10 mM IAM als Substrat durchgeführt. (A): Substratabhängigkeit. Die enzymatischen Reaktionen wurden nach 3 h gestoppt und die gebildete Menge an IES mittels HPLC analysiert. Die Quantifizierung erfolgte

Ergebnisse

88

anhand externer Standardisierung mit bekannten Mengen an IES. (B): pH-Abhängigkeit. Für die Bestimmung der pH-Abhängigkeit wurden folgende Puffersysteme verwendet: Citratpuffer ( ) pH 3.0 – 6.0; Natriumphosphatpuffer ( ) pH 6.0 – 8.0; Natriumcarbonatpuffer ( ) pH 8.0 – 10.5; Natriumphosphatpuffer ( ) pH 11.0 – 12.0. (C): Temperaturabhängigkeit. (D): Abhängigkeit der AMI1-Aktivität von der eingesetzten Proteinmenge. Dargestellt ist der Umsatz von IAM durch aufsteigende Mengen an gereinigtem AMI1-Protein. Angegeben sind die Mittelwerte ± Standardabweichung von n = 3 unabhängigen Experimenten.

Aus doppelt-reziproken Darstellungen konnte für die AMI1 ein apparentes Michaelis-

Menten-Verhalten für IAM-Konzentrationen zwischen 0 und 1 mM abgeleitet werden.

Eine Sättigung der Reaktion auch bei Konzentrationen von 25 mM IAM wurde nicht

erzielt. Aufgrund des schlechten Lösungsverhaltes von IAM ließen sich höhere Substrat-

konzentrationen nicht realisieren. Eine Übersicht der Ergebnisse der enzymatischen

Charakterisierung der AMI1 ist in Tabelle 3.3 zusammengestellt.

Tab. 3.3: Biochemische Charakterisierung der heterolog exprimierten Ami-

dase 1 aus Arabidopsis thaliana

Parameter Wert

Spezifische Aktivität bei 25 mM IAM [nkat mg-1 Protein] 7.5

Apparentes Molekulargewicht [kDa] 46.2

pH-Optimum 7.0

Temperatur-Optimum [°C] 35 - 37

IAM (0 – 1 mM)

Km [µM] 972

Vmax [nkat mg-1 Protein] 10.5

3.8.3 Untersuchungen zur Tertiärstruktur des Strep-Amidase 1-

Fusionsproteins

Bakterielle Amidasen, wie beispielsweise die Amidase aus Rhodococcus rhodochrous J1,

fungieren obligat als Homodimere, wobei jedes Monomer ein apparentes Molekular-

gewicht von 55 kDa besitzt (KOBAYASHI et al., 1993). Um einen Vergleich der heterolog

Ergebnisse

89

exprimierten Amidase 1 aus A. thaliana mit den bakteriellen Enzymen diesbezüglich zu

ermöglichen, wurde 1 µg des affinitätschromatographisch angereicherten Proteins mittels

„Blau-Nativer“ Gelelektrophorese (2.12.4) untersucht. Die native Gelelektrophorese sollte

eine Einschätzung des Oligomerisierungsgrades über die Bestimmung des apparenten

Molekulargewichtes ermöglichen, da unter den gewählten Bedingungen die native

Tertiärstruktur von Proteinkomplexen erhalten bleibt.

Abb. 3.32: „Blau-Native“ Polyacrylamid-Gelelektrophorese des bakteriell expri-mierten Strep-AMI1-Fusionsproteins

Strep-markierte Amidase 1 wurde im E. coli Stamm XL1-blue exprimiert (2.8.1) und mittels Chromatographie an Strep-Tactin-Sepharose gereinigt (2.10.2.4). Die gelelektrophoretische Darstellung erfolgte unter Verwendung eines „Blau-Nativen“ Gradientengelsystems (linear, 8 – 18 %) (2.12.4). Dargestellt ist ein Coomassie-gefärbtes Gel, über das 1 µg gereinigtes Protein getrennt wurde.

Im Gegensatz zu der oben angeführten Amidohydrolase aus Rhodococcus rhodochrous J1

zeigt das markierte AMI1-Protein keine Dimerisierung. Das apparente Molekulargewicht

von circa 45 kDa entspricht in etwa dem errechneten Molekulargewicht des Monomers von

46.2 kDa. Eine Dimerisierung der Amidase in-vivo kann allerdings nicht ausgeschlossen

werden, da die heterolog gereinigte Amidase über einen Strep-Fusionsanteil verfügt,

welcher durchaus Einfluß auf das Oligomerisierungsverhalten des Enzyms nehmen kann.

Ergebnisse

90

3.8.4 Immunologischer Nachweis der Amidase 1 und 2 aus Arabidopsis

thaliana

Zur intrazellulären Lokalisation der pflanzlichen Amidasen war es von besonderem

Interesse, polyklonale Antikörper gegen die bakteriell überexprimierten Amidase-Proteine

zu gewinnen. Zudem würden diese Antikörper Versuche erlauben, die mögliche

Beteiligung der beiden putativen Amidasen am IES-Synthase-Komplex zu studieren.

Die Expression von AMI1 und AMI2 erfolgte im E. coli Stamm XL1-blue. Zellen, die mit

dem Plasmid pASK-AMI1 (Abb. 3.28) transformiert waren, exprimierten, nach Induktion

mit 0.04 µg/ml Anhydrotetracyclin, geringe Mengen des markierten AMI1-Proteins, das

anschließend affinitätschromatographisch gereinigt (Abb. 3.29 A) und mittels Gefrier-

trocknung konzentriert wurde. Die Proteine wurden in Wasser aufgenommen und zur

Immunisierung eines Kaninchens verwendet. Bakterien, die über das Ampicillinresistenz-

vermittelnde Plasmid pQE-AMI2 (Abb. 3.28) verfügten, lieferten nach Induktion der

Expression mit 0.5 mM IPTG große Menge des Fusionsproteins, das angereichert in

Einschlußkörpern vorlag und nachfolgend, mittels präparativer Gelelektrophorese der

Einschlußkörper, in ausreichender Menge und Reinheit (Abb. 3.33) isoliert werden konnte.

Abb. 3.33: Präparation von Antigenen zur Gewinnung eines polyklonalen Anti-körpers gegen die putative Amidase 2 aus Arabidopsis thaliana

Die heterolog exprimierte Amidase 2 aus A. thaliana wurden über präparative Gelelektrophorese, aus Einschlußkörpern isoliert (2.8.1) und aus dem Gel isoliert. (A) Coomassieblau-gefärbtes SDS-Gel (12.5 %), auf das verschiedene Volumina der gewonnenen Gelelutionsfraktion aufgetragen wurden (1, 5 und 7.5 µl). Zur

Ergebnisse

91

Mengenabschätzung wurden bekannte Mengen Rinderserumalbumin mitgeführt. (B) Immundetektion des SDS-Polyacrylamid Gels (A) unter Verwendung von α-RGS-His4-IgG.

Die Immunisierung der Kaninchen erfolgte nach WEILER (1984) mit Antigenmengen von

etwa 200 µg Protein pro Injektion. Die gewonnenen Seren (643: AMI1; 644: AMI2)

erlaubten die Detektion von 0.5 µg gereinigtem Protein bis zu einer Verdünnung der Seren

von 1:20000. Für die intrazelluläre Immunlokalisation der beiden Proteine wurde

pflanzlicher Proteinrohextrakt gewonnen (2.8.4), und durch 100000 x g Zentrifugation

lösliche bzw. membranständige und membranassoziierte Proteine voneinander getrennt.

Nach Resuspendierung der Sedimente in 50 mM Tris/HCl, pH 8.0 wurden je 150 µg

Protein mittels SDS-PAGE gelelektrophoretisch separiert und auf Nitrocellulose

übertragen. Die immunologische Detektion der putativen Amidasen erfolgte unter

Verwendung der gewonnenen Seren, wobei die Inkubation mit den primären Antikörpern

über Nacht bei 4 °C und Serumverdünnungen von 1:1000 erfolgte.

Abb. 3.34: Immunologischer Nachweis der putativen Amidasen in Protein-extrakten aus Arabidopsis thaliana

Die Enzyme eines Proteinrohextraktes (2.8.4) aus A. thaliana wurde mittels 100000 x g Zentrifugation in lösliche und membranständige Fraktionen getrennt. Die Sedimente wurden in 50 mM Tris/HCl, pH 8.0 aufgenommen und jeweils 150 µg Protein über SDS-Gele nach SCHARF & NOVER (1984) gelelektrophoretisch getrennt.

Ergebnisse

92

Die Proteine wurden auf Nitrocellulose transferiert und anschließend immunologisch analysiert. (A): Coomassie-gefärbtes SDS-Gel (20 – 10 %); (B): Western-Blot Analyse der transferierten Proteine unter Verwendung der gewonnenen Seren 643 (α-AMI1) und 644 (α-AMI2). (C: Cytosolische Fraktion; M: Membranständige Fraktion).

AMI1 und AMI2 konnten auf der erwarteten Höhe von 44.8 kDa bzw. 50.2 kDa nur in der

löslichen Proteinfraktion detektiert werden. Aufgrund der schwachen Signale kann

gefolgert werden, daß beide Proteine nur gering exprimiert werden. Für Enzyme, welche

möglicherweise an der Auxinhomöostase beteiligt sind, wäre eine solch geringe Abundanz

(„low abundant protein“) zu erwarten, da auch das Auxin nur in Spuren in der Zelle zu

finden ist.

3.8.5 Bestimmung der Amidaseaktivität im Pflanzenrohextrakt und

Anreicherung der Enzymaktivität durch Chromatographie an

Hydroxyapatit

Wie unter Kapitel 3.5.5 bereits dargelegt, setzten Proteinextrakte aus A. thaliana IAM zu

IES um. Mittels GC-MS-Analyse konnte für diesen Umsatz eine spezifische Aktivität von

0.14 ± 0.01 pkat mg-1 Protein ermittelt werden, wobei [2H]5-IAM als Substrat verwendet

wurde, um artifizielle Produkteinträge ausschliessen zu können.

Versuche zur flüssigkeitschromatischen Anreicherung der Amidaseaktivität zeigten, daß

sowohl AMI1 als auch AMI2 an Hydroxyapatit (2.10.2.1) gebunden werden konnten,

wobei das Elutionsprofil der Proteine immunologisch verfolgt wurde (nicht dargestellt).

Die putativen Amidasen eluierten spezifisch bei einer KPi-Konzentration von 50 mM.

Nach Vereinigung der entsprechenden Elutionsfraktionen (80 – 120 ml) belegte eine GC-

MS-analytische Aktivitätsbestimmung des [2H]5-IAM-Umsatzes die Anreicherung der

spezifischen Aktivität auf 2.22 ± 0.71 pkat mg-1 Protein.

Hervorzuheben ist in diesem Zusammenhang, daß beide putativen Amidasen gemeinsam

mit der IES-Synthase-Aktivität koeluieren und die ermittelten spezifischen Enzym-

aktivitäten (IES-Synthase 1.7 pkat mg-1 Protein) vergleichbar hoch sind.

3.9 Amidasen als Bestandteil des Indol-3-essigsäure-Synthase-

Komplexes

Aus den biochemischen Untersuchungen der tryptophanabhängigen IES-Biosynthese ging

hervor, daß IAM mit großer Wahrscheinlichkeit ein Intermediat dieser Reaktionssequenz

Ergebnisse

93

darstellt (3.5.3 ff.), was die Beteiligung einer Amidase als integrale Komponente des IES-

Synthase-Enzymkomplexes nahelegt.

Nach heutigem Wissensstand ist die, im Rahmen dieser Arbeit vorgestellte, Amidase 1 aus

A. thaliana das bisher einzige pflanzliche Enzym mit nachweislicher IAM-Hydrolase-

Aktivität (3.8.2). Vor diesem Hintergrund erschien es denkbar, daß es sich bei dem AMI1-

Protein um eine putative Komponente des IES-Synthase-Komplexes handelt. Um diese

Fragestellung weiterführend zu untersuchen, wurden immunologische Analysen

durchgeführt, welche nachfolgend dargelegt sind.

3.9.1 Immunpräzipitation der Indol-3-essigsäure-Synthase unter

Verwendung der α-AMI-Seren

Wie schon unter 3.4.4 beschrieben, wurde auch im Falle der Amidasen die präzipitierende

Wirkung der α-AMI-Seren (643, 644) in Bezug auf die IES-Synthase-Aktivität untersucht.

Zu diesem Zweck wurden angereicherte IES-Synthase-Proteinpräparationen (2.10.2.2) mit

Antiserum versetzt und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach Sedimentation (13000 upm,

30 min, 4 °C) der vernetzten Antikörper-Antigen-Komplexe wurde die in-vitro-Synthese

der IES im Überstand analysiert. Als Kontrolle dienten Ansätze, denen Präimmunserum

anstelle der α-AMI-Seren hinzugefügt wurde.

Ergebnisse

94

Abb. 3.35: (vorherige Seite) Immunpräzipitation der Indol-3-essigsäure-Synth-ase-Aktivität mittels polyklonaler Amidase-Antikörper

Zur Ermittlung der IES-Synthase-präzipitierenden Wirkung der gewonnenen α-AMI-Seren 643 (α-AMI1) und 644 (α-AMI2) wurden je 200 µl einer flüssigkeits-chromatographisch angereicherten IES-Synthase-Fraktion (2.10.2.2) mit 50 bzw. 100 µl Antiserum versetzt, und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach Zentrifugation der Ansätze (13000 upm, 30 min, 4 °C) wurde der Überstand abgenommen und mit 300 µl 20 mM L-Trp versetzt. Darauf wurden die Reaktionsansätze für 4 h bei 37 °C inkubiert und die enzymatisch gebildete IES bestimmt (2.11.4). Als Kontrolle dienten Ansätze mit identischen Volumen an Präimmunserum. (A): Immunpräzipitation durch α-AMI1 Serum. (B): Immunpräzipitation durch α-AMI2 Serum. Angegeben sind die Mittelwerte ± Standardabweichung aus n = 2 unabhängigen Versuchen. ( : Antiserum; : Präimmunserum)

Das α-AMI2-Serum zeigte in den Versuchen keinen signifikanten Einfluß auf die IES-

Synthase-Aktivität (Abb. 3.35B). Im Gegensatz dazu ließ sich die in-vitro-Synthese der

IES durch die Gabe des α-AMI1-Serums um durchschnittlich 48.7 % reduzieren, was auf

eine Beteiligung des AMI1-Proteins am IES-Synthase-Komplex hinweist. Um sicher zu

stellen, daß es sich hier um eine spezifische Wirkung der AMI1-Antikörper handelt, wurde

die Immunglobulin-Fraktion mittels kombinierter Ammoniumsulfat-/Caprylsäurefällung

vom Serum befreit und die spezifischen α-AMI1-Antikörper isoliert (2.13.5). Die so

gereinigte α-AMI1-IgG-Fraktion wurde anschließend in aufsteigender Konzentration zur

Präzipitation der IES-Synthase-Aktivität in angereicherten Proteinpräparationen (2.10.2.2)

verwendet.

Ergebnisse

95

Abb. 3.36: (vorherige Seite) Versuche zur Immunpräzipitation der Indol-3-essig-säure-Synthase unter Verwendung spezifischer α-AMI1-Immunglo-buline

Spezifische α-AMI1-Immunglobuline wurden aus dem Serum isoliert (2.13.5) und zur Präzipitation des IES-Synthase-Komplexes in High Q-angereicherten Proteinfrak-tionen (2.10.2.2) verwendet. Hierzu wurden jeweils 200 µl der Proteinfraktion mit aufsteigenden Volumina der α-AMI1-IgG-Lösung versetzt, ad 400 µl mit 50 mM Tris/HCl, pH 8.0 aufgefüllt und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurden die Reaktionsansätze zentrifugiert (13000 upm, 30 min, 4 °C), die Überstände abgenommen und die Sedimente in 200 µl 50 mM Tris/HCl, pH 8.0 resuspendiert. Die enzymatische Reaktion erfolgte nach Zugabe von je 200 µl 20 mM L-Trp über einen Zeitraum von 16 h bei einer Temperatur von 37 °C. Die gebildete IES wurde mittels GC-MS-Analyse quantifiziert. Die Enzymaktivität in den Kontrollreaktionen ohne Antikörperlösung wurde gleich 100 % gesetzt. Alle Werte wurden um die entsprechenden, nicht enzymatischen Umsätze in den mitgeführten hitzedenaturierten Kontrollen korrigiert. Die Graphik zeigt die Mittelwerte ± Standardabweichung aus n = 2 unabhängigen Experimenten. : Kontrolle Überstand; : Kontrolle Sediment; : Enzymaktivität im Überstand; : Enzymaktivitäten im Sediment.

Für die gereinigten α-AMI1-Immunglobuline konnte keine präzipitierende Wirkung

nachgewiesen werden (Abb 3.36). Entgegen den Erwartungen steigerte die Gabe der

spezifischen Immunglobuline die IES-Synthese im Überstand um bis zu 700 %. In den

untersuchten Sedimenten konnte hingegen mit steigenden Antikörpermengen eine

Reduktion der IES-Synthase-Aktivität beobachtet werden.

Die enorme Steigerung der IES-Synthese in den in-vitro-Reaktionsansätzen (Abb. 3.36,

hellgraue Balken) belegt, daß eine Interaktion der α-AMI1-Antikörper mit der

tryptophanumsetzenden Enzymaktivität besteht, obgleich diese Interaktion nicht zu der

erwarteten Präzipitation der IES-Synthase-Aktivität führte. Möglicherweise vermögen die

α-AMI1-IgGs die IES-Synthase-Aktivität über einen längeren Zeitraum zu stabilisieren.

Offensichtlich steigern die Antikörper die Löslichkeit der IES-bildenden Enzymaktivität,

da mit steigenden Antikörpermengen immer weniger IES-Synthase-Aktivität in den

Sedimenten detektiert wurde.

3.9.2 Versuche zur immunaffinitätschromatographischen Anreicher-

ung des Indol-3-essigsäure-Synthase-Komplexes

Eine Immunaffinitätschromatographie unter Einsatz der gereinigten α-AMI1-Antikörper

erschien aufgrund der starken Interaktion zwischen den α-AMI1-Immunglobulinen und der

IES-synthetisierenden Enzymaktivität ein geeignetes Mittel zu sein, um den IES-Synthase-

Komplex weiter anzureichern.

Ergebnisse

96

Zu diesem Zweck wurde ein Aliquot der bereits im Vorfeld gereinigten Antikörper an 1 ml

CNBr-aktivierte Sepharose gekoppelt (2.7.5), und 15 mg einer vorgereinigten IES-

Synthase-Fraktion (2.10.2.3) an der hergestellten Säulenmatrix chromatographisch getrennt

(2.10.2.6). Die ersten 6 ml des Eluates wurden vereinigt und mit 1/10 Volumen 10 x PBS

versetzt, mit Centriprep 30 Einheiten konzentriert und abschließend über ein 12.5 %-iges

SDS-Polyacrylamidgel separiert.

Abb. 3.37: Gelelektrophoretische Darstellung der immunaffinitätschromatogra-phisch isolierten Proteine aus Arabidopsis thaliana

Dargestellt ist ein Coomassie-gefärbtes SDS-Polyacrylamidgel (12.5 %), über welches das konzentrierte Eluat einer Immunaffinitätschromatographie getrennt wurde. Als Affinitätsliganden dienten hier gereinigte α-AMI1-Antikörper, welche vor der Kopplung an die CNBr-aktivierte Sepharose auf ihre Funktionalität hin untersucht wurden. Die Pfeile markieren die beiden Proteinbanden, welche für eine Protein-mikrosequenzierung ausgewählt wurden.

Nach gelelektrophoretischer Trennung der Proteine konnten zwei prominente

Proteinbanden detektiert werden, wobei eine massenspektrometrische Analyse zeigte, daß

es sich bei diesen Proteinen jeweils um die große Untereinheit der Ribulose-1,5-

bisphosphat Carboxylase/Oxygenase handelte (Bande 1: RubisCO, Accession NP_051067;

Bande 2: N-term. verkürzte RubisCO, Accession NP_051067). Alle weiteren erkennbaren

Proteinbanden ließen sich nicht eindeutig massenspektrometrisch untersuchen, da ihre

Proteinkonzentrationen für eine Mikrosequenzierung zu gering waren.

Ergebnisse

97

3.10 Versuche zur Photoaffinitätsmarkierung der Indol-3-essig-

säure-Synthase

Die Photoaffinitätsmarkierung erlaubt den autoradiographischen Nachweis markierter

Proteine nach SDS-PAGE. Unter Einsatz der photolabilen Radioliganden [3H]3-6-Azido-L-

tryptophan (2.7.2) und [3H]2-6-Azidoindol-3-acetamid (2.7.3) sollten in Anlehnung an

FEYERABEND & WEILER (1989) Proteine des IES-Synthase-Komplexes aus A. thaliana

selektiv kovalent markiert werden.

3.10.1 Markierung der Indol-3-essigsäure-Synthase mit [3H]3-6-Azido-L-

tryptophan

Durch die Photoaffinitätsmarkierung mit [3H]3-6-Azido-L-tryptophan (2.14) ließen sich

einige radioaktivmarkierte Proteine mit einem Molekulargewicht von etwa 30 kDa

nachweisen.

Abb. 3.38: Photoaffinitätsmarkierung löslicher Proteine mit [3H]3-6-Azido-L-tryptophan

Je 100 µg einer High Q-angereicherten IES-Synthase-Fraktion (2.10.2.2) wurden mit 63 kBq [3H]3-6-Azido-L-tryptophan photoaffinitätsmarkiert. Anschließend wurden je 50 µg Protein mittels SDS-PAGE getrennt. (A) Radioaktivitätsverteilung innerhalb der SDS-Polyacrylamid Gelspur. Die Detektion der Strahlung erfolgte am Flüssigkeits-Szintillationszähler. (B) Polypeptidprofil der Proteine (50 µg, Coomassie-gefärbt). (C) Autoradiographie der SDS-Polyacrylamid Gelspur aus (B). Der massenspektrometrisch untersuchte Molekulargewichtsbereich ist markiert.

Ergebnisse

98

Die massenspektrometrische Analyse der Proteine in dem markierten Molekulargewichts-

bereich führte zur Identifikation der in Tabelle 3.4 aufgelisteten Proteine. Für die vier

aufgeführten Proteine ließ sich kein Zusammenhang mit der Tryptophan-Umsetzung in

A. thaliana erkennen, zudem ließ sich die radioaktive Markierung im Bereich von 30 kDa

nicht durch eine Kompetition von [3H]3-6-Azido-L-tryptophan mit einem Überschuß an

L-Trp (150 µM) aufheben, und muß daher als unspezifisch erachtet werden.

Tab. 3.4: Massenspektrometrische Identifizierung [3H]3-6-Azido-L-tryptophan-

markierter Proteine aus Arabidopsis thaliana

Protein errechnetes

Molekulargewicht [kDa]

Datenbankeintrag

(Accession)

Sedoheptulose-1,7-bisphosphatase 42.4 S74719

Superoxid-Dismutase 26.5 CAB36752

Triosephosphat-Isomerase 27.2 2009415A

putative Carboxymethylenbutenolidase 25.9 AAC25934

Nachfolgend durchgeführte Versuche zur Markierung eines angereicherten Tryptophan-

Synthase-Komplexes (2 µg) aus Salmonella typhimurium (2.8.3) in Proteinextrakten aus

A. thaliana (50 µg) führten nicht zu einer spezifischen Markierung (ohne Abbildung) der

tryptophanbindenden β-Untereinheit des Tryptophan-Synthase-Komplexes. Da hier eine

spezifische Makrierung zu erwarten gewesen wäre, wurde auf weitere Versuche zur

Photoaffinitätsmarkierung von Proteinen mit dem radioaktiven Azidoderivat des

Tryptophans verzichtet.

3.10.2 Photoaffinitätsmarkierung unter Verwendung von [3H]2-6-Azido-

indol-3-acetamid

In Ergänzung zu den oben dargestellten Versuchen zur Photoaffinitätsmarkierung von

Proteinen mit [3H]3-6-Azido-L-tryptophan wurde radioaktiv markiertes 6-Azidoindol-3-

acetamid als weiterer möglicher Photoaffinitätsligand hergestellt (2.7.3). Wie Abbildung

3.39 A, B entnommen werden kann, konnte, in Vorversuchen, unter Verwendung dieses

Ergebnisse

99

Radioliganden die heterolog exprimierte Amidase 1 in bakteriellem Rohextrakt spezifisch

markiert werden. Die Spezifität dieser Markierung ließ sich anhand der Abnahme des

radioaktiven Signals nach Kompetition von [3H]2-6-Azidoindol-3-acetamid ([3H]2-6-Az-

IAM) mit einem Überschuß an IAM (100 µM) nachweisen.

Wie weiterführende Untersuchungen zeigten, konnten Proteinmengen unterhalb von

0.75 µg auch mit erhöhten [3H]2-6-Az-IAM Mengen nicht detektiert werden (nicht

dargestellt).

Abb. 3.39: Photoaffinitätsmarkierung Indol-3-acetamid-bindender Proteine unter Einsatz des Radioliganden [3H]2-6-Azidoindol-3-acetamid

Zur Photoaffinitätsmarkierung IAM-bindender Proteine wurden jeweils 80.9 kBq [3H]2-6-Az-IAM eingesetzt. (A) SDS-PAGE (12.5 %) heterolog exprimierter Strep-AMI1-Proteine. (B) Autoradiogramm des dargestellten SDS-Gels (A). Es ist lediglich der Bereich zwischen 66.0 und 30.0 kDa abgebildet. Folgende Ansätze wurden über das Gel getrennt: 1: 2 µg AMI1, 30 µg Protein (Bakterienrohextrakt); 2: 2 µg AMI1, 30 µg Protein (Bakterienrohextrakt), 100 µM IAM; 3: 4 µg AMI1, 30 µg Protein (Bakterienrohextrakt); 4: 4 µg AMI1, 30 µg Protein (Bakterienrohextrakt), 100 µM IAM; 5: 2 µg AMI1; 6: 2 µg AMI1, 100 µM IAM. (C) SDS-PAGE (20 – 10 %) einer High Q-angereicherten Proteinfraktion (175 µg). In den Spuren 7 und 8 sind jeweils identische Proben aufgetragen. (D) Autoradiogramm zu Abbildungsteil C.

Versuche zur Photoaffinitätsmarkierung löslicher Proteine aus A. thaliana unter

Verwendung von [3H]2-6-Az-IAM führte nicht zur Identifikation IAM-bindender Proteine.

Bei den autoradiographischen Signalen (Abb. 3.39 D) handelte es sich lediglich um

Ergebnisse

100

unspezifische Bindungen des Radioliganden an Massenproteinen. Die Gabe von geringen

Mengen an IAM (50 µM) vor Belichtung des Ansatzes resultierte in der Auslöschung der

unspezifischen radioaktiven Signale (ohne Abbildung). Daraus wurde geschlossen, daß der

Gehalt IAM-bindender Proteine in den verwendeten Proteinpräparationen unterhalb der

Detektionsgrenze lag. Demzufolge ist für eine spezifische Markierung von IAM-bindenden

Proteinen eine deutlich höhere Anreicherung der Proteinpräparate notwendig.

Diskussion

101

4 Diskussion

Der pflanzliche Lebenszyklus wird, von der Keimung bis zur Reproduktion, durch das

komplexe Zusammenspiel chemischer Botenstoffe reguliert. Die Existenz solcher

Signalstoffe wurde schon vor mehr als 120 Jahren von den Pflanzenphysiologen DARWIN

(1880) und SACHS (1887) postuliert, da nach ihrem Dafürhalten die koordinierte

Morphogenese und Funktionalität multizellulärer Organismen die Kommunikation von

Zellverbänden, aber auch einzelnen Zellen untereinander, voraussetzt. Es dauerte weitere

50 Jahre, bis WENT & THIMANN (1937) die erste dieser Signalsubstanzen, welche sie

aufgrund der wachstumsfördernden Eigenschaften als Auxin (von griech. auxano,

wachsen) bezeichneten, identifizieren und den Einfluß dieser Substanz auf die pflanzliche

Entwicklung beschreiben konnten. Seit dem konnte eine ganze Reihe solcher pflanzlicher

Signalmoleküle gefunden werden (LETHAM et al., 1978; KENDE & ZEEVAART, 1997).

Diese als Phytohormone bezeichneten Signalsubstanzen sind für den koordinierten Ablauf

pflanzlicher Entwicklungs- und Differenzierungsprozesse verantwortlich, und werden,

nach ihren unterschiedlichen Eigenschaften, in sieben Klassen unterteilt: Auxine,

Cytokinine, Gibberelline, Abscisinsäure, Ethylen, Jasmonate und Brassinosteroide

(MOORE, 1987, YOKOTA, 1997). Hinzu kommen einige niedermolekulare

Peptidverbindungen, wie z.B. CLAVATA3 (CLV3), welche ebenfalls Signal-

molekülcharakter zeigen (BISSELING, 1999; ROJO et al., 2002). Phytohormone sind bereits

bei äußerst geringen Konzentrationen (10-6 bis 10-8 M) wirksam. Ihre Wirkung ist aber

nicht ausschließlich konzentrationsabhängig, sondern wird vielmehr über ein komplexes

Regelwerk gesteuert, welches sich aus der Interaktion mit Substanzen anderer Phyto-

hormonklassen sowie der Kompetenz betreffender Gewebe zur Beantwortung dieser

chemischen Signale konstituiert.

Unter dem Sammelbegriff Auxine werden neben der Indol-3-essigsäure (IES), als

wichtigstem natürlichen Vertreter dieser Gruppe, zahlreiche natürlich vorkommende wie

auch synthetische Verbindungen zusammengefaßt, wobei allen Auxinen wachstums-

fördernde Eigenschaften gemein sind. Auxine induzieren unter anderem pflanzliches

Streckungswachstum und kambiale Zellteilungsaktivität. Darüber hinaus zeigen sie im

Verbund mit Substanzen anderer Phytohormonklassen multiple Wirksamkeit (SWARUP et

al., 2002). So wird beispielsweise die Proliferation von Markzellen beim Tabak

synergistisch durch den Auxin- und Cytokinin-Gehalt reguliert (SKOOG & TSUI, 1948;

Diskussion

102

MILLER et al., 1956). In Interaktion mit Gibberellinen fördern Auxine das Sproßwachstum

bei Erbsen (ROSS et al., 2000), während Auxin und Ethylen kooperativ an der

Wurzelhaardifferenzierung beteiligt sind (MASUCCI & SCHIEFELBEIN, 1994).

In den vergangenen Jahren ließ sich ein umfangreiches Wissen in Bezug auf die

physiologische Rolle und den Stellenwert der Auxine für die pflanzliche

Entwicklungssteuerung zusammentragen. Dennoch ist das Verständnis der gewebe-

spezifischen Regulation endogener IES-Gehalte sowie dem Zusammenhang dieser

Hormonhomöostase und den dadurch bedingten zellulären Reaktionen noch rudimentär.

Obgleich mikrobielle Systeme Hinweise auf mögliche IES-Synthesewege in Pflanzen

lieferten (BANDURSKI et al., 1995, BARTEL, 1997), läßt sich, nach heutigem Stand der

Wissenschaft, kein einheitliches Modell zur de-novo-Biosynthese der IES in Pflanzen

aufzeigen, was möglicherweise darauf zurückzuführen ist, daß multiple Synthesewege,

unter der Beteiligung funktionell redundanter Enzyme, existieren (NORMANLY & BARTEL,

1999). Untermauert wird diese Theorie durch die Unzugänglichkeit auxinauxotropher

Mutanten.

Bereits die Frage nach dem Edukt der IES-Biosynthese führte in der Vergangenheit zu

äußerst kontrovers geführten Diskussionen. Auf Mutantenanalysen basierende Arbeiten

(NORMANLY et al., 1993) etablierten, neben einer tryptophanabhängigen Biogenese, eine

tryptophanunabhängige Variante der IES-Synthese, welche ihren Ursprung in Tryptophan-

Vorstufen, wie Indol oder Indol-3-glycerophosphat haben sollte. In der Zwischenzeit

konnten allerdings Belege dafür gesammelt werden, daß es sich hier um artifizielle

Ergebnisse handelte, welche zu Fehlinterpretationen in Bezug auf die Ausgangssubstanz

der IES-Biosynthese führten (MÜLLER & WEILER, 2000b). Vergleichbare Resultate lieferte

die Arbeit von GLAWISCHNIG et al. (2000). Auch hier ließen sich in dem untersuchten

Mais-Endosperm keine Anzeichen für eine tryptophanunabhängige Variante der IES-

Biosynthese finden, was Tryptophan, als einziges Edukt der IES-Bildung, in den

Mittelpunkt rückt. Ungeachtet dieser Ergebnisse kann ein tryptophanunabhängiger

Reaktionsverlauf nicht kategorisch ausgeschlossen werden. MICHALCZUK et al. (1992)

konnten eine tryptophanabhängige Auxinbiosynthese als primäre IES-Quelle in Daucus

carota Zellkulturen nachweisen. Nach Aufhebung der Supplementation des Nährmediums

mit 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, welches zur Induktion der Embryobildung eingesetzt

wurde, erwies sich eine tryptophanunabhängige Biosynthesevariante als dominierend. In

Anbetracht dieser metabolischen Varianz erscheint eine Regulation der unterschiedlichen

Diskussion

103

Biosynthesewege, in Abhängigkeit von entwicklungsbiologischen Faktoren, durchaus

möglich.

Vor Beginn dieser Arbeit konnte bereits ein breites Spektrum an Daten zusammengetragen

werden, welche Belege für die Existenz einer sauerstoff- und tryptophanabhängigen IES-

Biogenese in Arabidopsis thaliana lieferten (MÜLLER et al., 1998; MÜLLER, 1999;

POLLMANN, 1999). So ließ sich ein Proteinkomplex (IES-Synthase) aus zellfreien

A. thaliana-Proteinextrakten identifizieren, um einen Faktor 15 – 20 anreichern, und in

Ansätzen biochemisch charakterisieren. Dieser etwa 160 – 180 kDa große IES-Synthase-

Komplex katalysiert den stereoselektiven Umsatz von L-Tryptophan zur IES, wobei

Isotopenmarkierungsexperimente aufzeigten, daß beide Sauerstoffmoleküle der Carboxyl-

funktion der IES überwiegend aus zwei Molekülen H2O inkorporiert werden (s.u.).

Bestärkt durch immunologische Befunde legte ein solcher Reaktionsverlauf die

Beteiligung einer Nitrilase bzw. eines nitrilaseähnlichen Enzyms an der Umsetzung des

Tryptophans nahe, da diese Enzyme dazu befähigt sind, ausgehend von Indol-3-acetonitril

(IAN) unter Abspaltung von Ammoniak, zwei Moleküle Wasser anzulagern (MÜLLER &

WEILER, 2000a). IAN, wie auch andere denkbare Intermediate dieser Reaktionssequenz

wie z.B. Indol-3-acetaldoxim, ließen sich aber, trotz Einsatz hochsensitiver massenspektro-

metrischer Techniken, nicht detektieren, was vor diesem Hintergrund als ein Indiz für

einen enzymatisch kanalisierten Reaktionsverlauf erachtet wurde. In weiterführenden

Untersuchungen ließ sich die Beteiligung einer Nitrilase allerdings nicht bestätigen. Gegen

die Beteiligung der Nitrilase-Isoformen 1 – 3 an der IES-Biosynthese sprachen Immun-

präzipitationsversuche unter Verwendung von α-Nitrilase-Antikörpern, welche nicht zu

der erwarteten Präzipitation der tryptophanmetabolisierenden Enzymaktivität führten

(PIOTROWSKI & MÜLLER, persönliche Mitteilung). Des weiteren konnte, in deutlich höher

angereicherten Enzympräparationen (~ 120-fach), nach zweidimensionaler Gelelektro-

phorese, keine Nitrilase-Immunreaktivität nachgewiesen werden (POLLMANN, 1999). Diese

Befunde schließen die generelle Beteiligung einer Nitrilase indes nicht aus, da die

Integration von bisher noch nicht beschriebenen Nitrilase-ähnlichen Proteinen im IES-

Synthase-Komplex in Betracht gezogen werden muß.

Der Umsatz von Tryptophan (Trp) zu IES war, wie bereits erwähnt, aus einigen

Pflanzenspezies wie beispielsweise A. thaliana und Zea mays bekannt, doch wurden diese

Enzymaktivitäten bisher nicht quantitativ miteinander verglichen. Aufgrund dessen

erschien es von besonderem Interesse, die enzymatischen Aktivitäten verschiedener

Diskussion

104

Pflanzenspezies quantitativ zu erfassen, um sie gegenüberstellen zu können. Darüber

hinaus sollten diese Experimente Aufschluß darüber geben, ob es sich bei zellfreien

Systemen aus A. thaliana um geeignetes Ausgangsmaterial für eine proteinbiochemische

Reinigung handelt.

Die tryptophanmetabolisierende Aktivität konnte in allen untersuchten Pflanzenspezies

nachgewiesen werden (3.1). Durch die Verwendung eines isotopenmarkierten Substrates

konnte zudem ein artifizieller Produkteintrag aus dem Pflanzenextrakt ausgeschlossen

werden. Hierbei zeigte sich eine deutliche Varianz der spezifischen Enzymaktivitäten

(Abb. 3.1), welche in den einzelnen untersuchten Pflanzenextrakten bis zu einem Faktor

von 18 schwankten. Es kann demnach davon ausgegangen werden, daß die Enzymaktivität,

welche den Umsatz von Trp zur IES vermittelt, eine ubiquitäre Komponente im

metabolischen Repertoire von Pflanzen darstellt. Obwohl bei der Analyse der spezifischen

Aktivitäten einige Spezies, wie z.B. Spinacia oleracea, positiv herausstachen, wurden für

alle weiteren Versuche Proteinextrakte aus A. thaliana verwendet, da diese „Modellpflanze

der Botanik“ genetisch bereits vollständig charakterisiert ist und zudem eine

vergleichsweise hohe enzymatische Aktivität zeigt.

Die IES-Synthase aus A. thaliana-Proteinextrakten konnte in drei aufeinanderfolgenden

flüssigkeitschromatographischen Reinigungsschritten um einen Faktor von etwa 180

angereichert werden. Hierbei erwies sich eine schnelle Hochdruckgelpermeations-

chromatographie als besonders effektiv (3.2.3). Neben der deutlichen Trennung der

enzymatischen Aktivität von der Massenproteinfraktion (Abb. 3.4) erlaubte diese Technik

eine angenäherte Molekulargewichtsbestimmung des IES-Synthase-Komplexes. Wie schon

von MÜLLER & WEILER (2000a) beschrieben, eluierte die IES-Synthase-Aktivität in einem

Molekulargewichtsbereich von 160 – 180 kDa. Die angereicherte Enzymaktivität ließ sich

weiterführend mittels nativer Gelelektrophorese darstellen, wobei sich „Blau-Native“

Gelsysteme nach SCHÄGGER et al. (1994) bzw. exponentielle Gradientengele in Anlehnung

an SCHARF & NOVER (1982) als besonders geeignet erwiesen. Obwohl sich nach der

nativen Trennung der Proteine eine distinkte Aktivitätsverteilung im Gel zeigte (Abb. 3.6),

ließ sich der IES-Synthase-Komplex nicht in funktioneller Form aus dem Gel eluieren

(3.2.5). In Folge dessen wurden die Proteine aus den Bereichen höchster Aktivität aus dem

Gel gewonnen, in einer zweiten Dimension mittels SDS-PAGE separiert, und nachfolgend

mikrosequenziert. Als integrale Komponenten des IES-Synthase-Komplexes sind,

biochemisch betrachtet, nur wenige Enzymklassen denkbar. Im Zuge der Proteinmikro-

Diskussion

105

sequenzierung wurde vor allem nach flavinhaltigen Monooxygenasen (FITZPATRICK,

2001), Cytochrom P450-abhängigen Monooxygenasen (CHAPPLE, 1998), Dioxygenasen

(PRESCOTT & JOHN, 1996), Tryptophan-Decarboxylasen und Transaminasen gesucht, da

diese Enzyme die einleitende Reaktion der Trp-Umsetzung katalysieren könnten. Die

Mikrosequenzierung der isolierten Polypeptide lieferte keine direkten Hinweise auf

mögliche Komponenten des IES-Synthase-Komplexes. Bei den identifizierten Proteinen

handelte es sich überwiegend um Proteine des pflanzlichen Primärstoffwechsels, wie

beispielsweise Proteine mit großer Ähnlichkeit zu Komponenten des Glycin-

Decarboxylase-Komplexes, welche an der Regeneration von Produkten der Photorespira-

tion beteiligt sind (VAUCLARE et al., 1996; DOUCE et al., 2001). Die erzielte Anreicherung

des IES-Synthase-Komplexes reicht demnach nicht aus, um Informationen bezüglich

integraler Bestandteile des Komplexes mittels massenspektrometrischer Methoden zu

erhalten, da trotz der erzielten Anreicherung Kontaminationen mit Massenproteinen

vorliegen. Möglicherweise müssen große Mengen an Gelen erstellt und entsprechende

Proteinbanden vereinigt werden, um massenspektrometrische Aussagen bezüglich

unterrepräsentierter Proteine treffen zu können. Neben den Primärstoffwechselproteinen

konnte ein 21.8 kDa großes, Germin-ähnliches Protein identifiziert werden, welches

signifikante Homologien (77 % bzw. 78 %) zu auxinbindenden Proteinen aus Prunus

persica (Pfirsich) zeigte (3.3.2). Die Auxinbindeproteine ABP19/20 aus Pfirsich (OHMIYA

et al, 1998) verfügen über eine konservierte, als BoxA bezeichnete Auxinbindedomäne

(JONES, 1994), und weisen für IES eine Dissoziationskonstante von 4.1 x 10-5 M auf. Auf

Proteinebene zeigen sie allerdings deutlich höhere Verwandtschaft zu Proteinen der Cupin-

Superfamilie, als zu bekannten Auxinbindeproteinen aus A. thaliana (PALME et al., 1992)

bzw. Zea mays (INOHARA et al., 1989). Die Cupine, zu denen auch die Germine zu rechnen

sind, werden mit einer ganzen Reihe von entwicklungsbiologischen Funktionen in

Verbindung gebracht. So sollen sie unter anderem an der Embryogenese und der Keim-

lingsentwicklung beteiligt sein (DUNWELL et al., 2000). Obgleich im Rahmen dieser Arbeit

auf eine eingehendere Untersuchung dieses Proteins verzichtet wurde, da kein direkter

Zusammenhang mit der IES-Biosynthese zu erkennen war, kann eine funktionelle Analyse

dieses Germin-ähnlichen Proteins von großem Interesse sein, da es sich hier möglicher-

weise um eine bisher nicht identifizierte Komponente in der Auxinsignaltransduktionskette

handeln könnte.

Diskussion

106

In der Vergangenheit sind eine Reihe von Proteinen beschrieben worden, welche mit hoher

Wahrscheinlichkeit Einfluß auf die Auxinbiosynthese in A. thaliana nehmen, wobei die

Identifikation eines Flavin-Monooxygenase-ähnlichen Proteins (YUCCA) besonderes

Interesse weckte (BARTEL et al., 2001). Abgesehen von YUCCA handelt es sich hierbei

um Cytochrom P450 Enzyme bzw. Indol-3-acetaldehyd-Oxidasen. Eine Integration dieser

Enzyme im IES-Synthase-Komplex kann anhand der nachfolgend aufgeführten Gründe

jedoch ausgeschlossen werden. Die Indol-3-acetaldehyd-Oxidasen fungieren obligat als

Homo- bzw. Heterodimere, wobei die Monomere Molekulargewichte von 145 kDa und

150 kDa aufweisen (SEKIMOTO et al., 1997; SEKIMOTO et al., 1998; SEO et al., 1998). Da

das Molekulargewicht der IES-Synthase nur 160 – 180 kDa beträgt, können diese Enzyme

schon aufgrund ihrer Größe nicht beteiligt sein. Diese theoretische Überlegung ließ sich

durch immunologische Analysen unter Verwendung der Antikörper atAO-1 und atAO-2

(AKABA et al., 1999), welche gegen die zwei Aldehydoxidasemonomere aus A. thaliana

gerichtet sind, bestätigen, da keine Immunreaktivität beobachtet werden konnte (MÜLLER,

1999; POLLMANN, 1999).

Die Cytochrom P450-abhängigen Monooxygenasen CYP79B2 und CYP79B3 setzten zwar

in-vitro Trp effektiv zu Indol-3-acetaldoxim um, können aber nicht integrale Bestandteile

der IES-Synthase sein, da sie im Gegensatz zur IES-Synthase ausschließlich in

Chloroplasten zu finden sind (HULL et al., 2000; MIKKELSEN et al., 2000). Neben diesen

beiden Monooxygenasen ließen sich weitere Mitglieder dieser Proteinfamilie, CYP83B1

(BARLIER et al., 2000), CYP79F1 und CYP79F2, identifizieren, welche ebenfalls mit der

Modulation der IES-Biosynthese in Verbindung gebracht wurden. Inzwischen konnte

diesen Cytochrom P450-Isoformen aber eine eindeutige Funktion in der Indol-

Glucosinolat-Biosynthese zugeordnet werden (BAK et al., 2001; REINTANZ et al., 2001).

Daneben benötigen Cytochrom P450-abhängige Monooxygenasen, im Gegensatz zur IES-

Synthase, im allgemeinen Kofaktoren wie NADPH oder NADH, um ihre enzymatische

Aktivität zu entfalten, daher ist eine Beteiligung von Proteinen dieser Superfamilie am

IES-Synthase-Komplex als unwahrscheinlich zu erachten.

Im Rahmen eines Mutageneseprojektes identifizierten ZHAO et al. (2001), nach

ungerichteter Integration von CaMV 35S-Promotoren in das A. thaliana-Genom, eine

Mutante mit stark ausgeprägtem Auxinphänotyp, welche sie, bedingt durch eine auffällig

an Yucca-Pflanzen (Agave sp.) erinnernde Blattmorphologie, als yucca bezeichneten.

Neben den phänologischen Anzeichen für einen erhöhten Auxinpegel, wie beispielsweise

Diskussion

107

verlängerte Hypocotyle, epinastische Kotyledonen und kürzere, mit deutlich mehr

Wurzelhaaren besetzte Wurzeln, zeigten die yucca-Mutanten eine gesteigerte Resistenz

gegen toxische Trp-Derivate, wie 5-Methyltryptophan. Gaschromatographisch-massen-

spektrometrische Analysen konnten die phänologischen Befunde verifizieren. In den

Mutanten konnte ein um 50 % erhöhter Gehalt an freier IES gemessen werden. Als

genetische Ursache der Auxinüberproduktion ließ sich eine deutliche Expressions-

steigerung eines Gens ausmachen, das für ein Flavin-Monooxygenase-ähnliches Protein

(YUCCA) codiert. Nach Rekombination der YUCCA-cDNA in ein Maltose-Bindeprotein

(MBP) Expressionssystem und heterologer Expression der YUCCA-MBP-Fusionsproteine

verwiesen in-vitro-Experimente auf eine enzymatische Beteiligung von YUCCA bei der

NADPH-abhängigen Hydroxylierung von Tryptamin zu N-Hydroxytryptamin. Zusammen-

gefaßt verdeutlichten diese Resultate eine funktionelle Beteiligung von YUCCA an der

tryptophanabhängigen IES-Biosynthese in-vivo. Aufgrund der wenig überzeugenden

enzymatischen Daten (pro Reaktion wurden 350 µg gereinigtes YUCCA-MBP-

Fusionsprotein eingesetzt) und der Tatsache, daß Tryptamin als endogene Komponente in

A. thaliana bisher nicht beschrieben wurde, muß die in-vivo-Funktion von YUCCA als

spezifische Tryptamin-Hydroxylase in Frage gestellt werden. Basierend auf den Arbeiten

von UMHAU et al. (2000) und PAWELEK et al. (2000), die einen Kofaktor-unabhängigen

Reaktionsmechanismus für flavinhaltige L- und D-Aminosäure Oxidasen aufzeigten, er-

schien die Integration von YUCCA in dem IES-Synthase-Komplex denkbar. Zur Über-

prüfung dieser Hypothese wurde ein (His)6-YUCCA-Expressionssystem erstellt (3.3.1),

um potentielle Enzymaktivitätsverluste aufgrund des Fusionsanteiles des Maltose-

Bindeproteins (42.5 kDa) vorab ausschließen zu können. Hierbei erwies sich sowohl die

Klonierung der cDNA, als auch die heterologe Expression des rekombinanten Proteins als

schwierig. In der verwendeten Gesamt-RNA-Fraktion aus Blattmaterial unterschiedlich

alter A. thaliana-Pflanzen fanden sich nur sehr geringe Mengen reifer YUCCA-mRNA. Die

geringe Transkriptionsrate von YUCCA in dem untersuchten Blattmaterial ließ sich mittels

immunologischer Analysen erwartungsgemäß auch auf Translationsebene (3.4.3)

demonstrieren. Für Proteine, die die zelluläre Hormonhomöostase maßgeblich

beeinflussen, ist ein solches Expressionsmuster nicht grundlegend auszuschließen, doch

weisen die Expressionsdaten auf eine gewebe- bzw. entwicklungsspezifische Funktion

dieses Proteins hin. Die Expression des rekombinanten Fusionskonstruktes ermöglichte

keine funktionelle Analyse des Proteins, da im bakteriellen Expressionssystem kein Einbau

Diskussion

108

von Riboflavin in das Enzym erzielt werden konnte (3.4.1). Eine Koelution von YUCCA

mit einem bakteriellen Hitzeschockprotein (Hsp60) verwies zudem auf einen möglichen,

Chaperon-vermittelten Einbaumechanismus für das Flavinmolekül. Ungeachtet dieser

Resultate ließen sich ausreichende Mengen an gereinigtem Protein präparieren (3.4.2), um

einen polyklonalen Antikörper (Serum 645) gegen das YUCCA-Protein herzustellen.

Entgegen den Erwartungen führte die Verwendung einer YUCCA-spezifischen

Antikörperfraktion (3.4.4) nicht zu einer Immunpräzipitation der IES-Synthase-Aktivität.

Die Versuche zur Immunpräzipitation der IES-Synthase zeigten lediglich einen geringen

Einfluß der gereinigten IgG-Fraktion auf die IES-Synthase-Aktivität im Überstand der

Reaktionsansätze. Darüber hinaus führten Versuche zur immunaffinitätschromatogra-

phischen Reinigung der IES-Synthase unter Verwendung der spezifischen

α-YUCCA-Antikörper nicht zu einer spezifischen Bindung der IES-Synthase-Aktivität auf

der Säulenmatix. Daher muß eine Integration von YUCCA in dem Synthasekomplex

ausgeschlossen werden. Bestärkt wird diese Aussage durch Substratverdünnungsexperi-

mente, bei denen für Tryptamin kein Einfluß auf den Umsatz von isotopenmarkiertem Trp

demonstriert werden konnte (3.5.2). Daneben gelang es TOBEÑA-SANTAMARIA et al.

(2002) die Funktion eines, zu YUCCA orthologen, Gens (FZY (FLOOZY)) aus Petunien

(Petunia miliflora) aufzudecken. Anhand von Mutantenanalysen und in-situ-Lokalisation

der FZY-mRNA demonstrierten die Autoren die funktionelle Beteiligung von FLOOZY bei

der Initiation der Blütenbildung, und der Regulation der Entwicklung vasculären Gewebes

in Blättern. Die hier präsentierten Daten legen in Verbindung mit der Beobachtung, daß

YUCCA-defiziente Mutanten einen Wildtyp-Phänotyp aufweisen, nahe, daß YUCCA nicht

ubiquitär in allen Zellen an der de-novo-Biosynthese der IES beteiligt ist. Vielmehr kann

davon ausgegangen werden, daß YUCCA, wie auch FLOOZY, zu der gewebespezifischen

Synthese zusätzlicher Auxin-Pools beiträgt, die, einem genetischem Programm folgend,

gezielt entwicklungsbiologische Prozesse steuern.

Versuche zur affinitätschromatographischen Reinigung des IES-Synthase-Komplexes unter

Verwendung eines, an Rinderserumalbumin gekoppelten, Trp-Derivates (5-Hydroxy-L-

tryptophan) führten zu keiner spezifischen Anreicherung der Enzymaktivität (3.2.4). Die

Substratbindestelle der IES-Synthase scheint demnach schwer zugänglich zu sein.

Weiterhin scheint eine Substitution an der 6-Position des Indolringes in Bezug auf die

Substratbindung nicht toleriert zu werden. Da neben Substraten oftmals auch Inhibitoren

bzw. Intermediate enzymatischer Reaktionen geeignete Liganden für affinitätschromato-

Diskussion

109

graphische Trennungen komplexer Proteingemische darstellen, wurde zur weiterführenden

biochemischen Charakterisierung der angereicherten IES-Synthase die Wirkung eines

putativen Inhibitors sowie verschiedenster, denkbarer Intermediate der Trp-Umsetzung

untersucht. Indol-3-essigsäurehydrazid (IESH) stellt in-vitro einen äußerst effektiven

Inhibitor der bakteriellen, Agrobacterium tumefaciens vermittelten, IES-Synthese dar

(persönliche Mitteilung WEILER). Unter der Prämisse, daß bei der pflanzlichen IES-

Biosynthese ein vergleichbarer enzymatischer Reaktionsmechanismus Verwendung findet,

könnte das IESH auch hier inhibitorische Wirkung zeigen. Gaschromatographisch-

massenspektrometrische Analysen zum Einfluß von IESH auf die Synthase-Aktivität in

angereicherten Proteinfraktionen belegten indes, wie schon für das Tryptamin (s.o.), keinen

Einfluß dieses IES-Derivates auf den in-vitro-Umsatz von Trp zur IES (3.5.1). Das Fehlen

des inhibitorischen Einflusses kann in diesem Zusammenhang nicht in direkter Linie als

Beleg für einen generell anders gearteten Reaktionsmechanismus gewertet werden, da

insbesondere allosterische Inhibitor-Enzym-Interaktionen einen hochaffinen Charakter

haben können, welche allein durch geringfügige Modifikationen in der Proteintertiär-

struktur unterbunden werden können.

Für die tryptophanabhängige IES-Biosynthese in A. thaliana wird ein Indol-3-acetonitril-

Biosyntheseweg favorisiert, bei dem Trp sukzessiv über Indol-3-acetaldoxim (IAOx) zu

IAN, und in einer endständigen, nitrilasekatalysierten Reaktion weiter zur IES, umgesetzt

wird. Bei einem solchen Reaktionsverlauf sollte sich die Umsetzung von

isotopenmarkiertem Trp sowohl durch die Gabe von IAOx, als auch von IAN nachhaltig

verdünnen lassen, bzw. sollten sich isotopenmarkierte Zwischenstufen detektieren lassen.

Wie vorstehend schon angeführt, konnte beides in Bezug auf IAOx und IAN nicht

beobachtet werden (MÜLLER, 1999), was dazu anregte, diese Reaktionssequenz kritisch zu

hinterfragen. Die einzige bis dato vollständig verstandene Reaktionssequenz zur IES-

Biogenese ist der bakterielle Indol-3-acetamid-Biosyntheseweg. Hierbei wird das Trp

einleitend durch eine Tryptophan-2-Monooxygenase zum Indol-3-acetamid (IAM), und

weiter, katalysiert durch eine Indol-3-acetamid-Hydrolase, zur IES umgesetzt. Das

Vorkommen von IAM, als mögliche Vorstufe der IES-Synthese in Höheren Pflanzen,

wurde aber lange Zeit nicht untersucht. Frühe Arbeiten zu diesem Thema zweifelten die

Existenz von in-vivo-gebildetem IAM an, da beobachtet werden konnte, daß pflanzliche

Sekundärmetaboliten wie z.B. IES-Glykosylester in-vitro in ammoniakhaltigen Lösungen

zur Ammonolyse neigen und dementsprechend spontan zu IAM zerfallen (ZENK, 1961).

Diskussion

110

Spätere Arbeiten konnten endogenes IAM in jungen Früchten von Citrus unshiu

(TAKAHASHI et al., 1975) und Hypocotylen von japanischer Kirsche (Prunus jamasakura)

(SAOTOME et al., 1993) nachweisen, doch wurde hier nicht strikt auf die Verwendung

sterilen Pflanzenmaterials geachtet, wodurch das Auftreten des IAMs durch bakterielle

Kontaminationen nicht eindeutig ausgeschlossen werden konnten. Basierend auf diesen

Arbeiten, und der Beschreibung von IAM-Hydrolase-Aktivitäten in Oryza sativa

(KAWAGUCHI et al., 1991) und Poncirus trifoliata (KAWAGUCHI et al., 1993), wurde hier

der Einfluß von IAM, als putative IES-Vorstufe, auf die IES-Synthese in

Verdünnungsexperimenten in-vitro untersucht. Unter Einsatz massenspektrometrischer

Methoden ließ sich hierbei erstmalig eine signifikante Wirkung eines Indol-Derivates auf

den Trp-Umsatz nachweisen. Insbesonders bei [2H]5-L-Trp:IAM Verhältnissen von 1:1

bzw. 1:10 konnte mit Hilfe der Quantifizierung der, enzymatisch aus [2H]5-L-Trp

entstandenen, [2H]5-IES eine eindeutige Verdünnung der enzymatischen Umsetzung um

36.7 % respektive 78.5 % beobachtet werden (Abb. 3.16), was als Beleg für eine

intermediäre Beteiligung des Amids an der IES-Bildung erachtet werden muß. Um das

IAM als Intermediat der IES-Biosynthese nachweisen zu können, wurde ein Analyse-

verfahren zum qualitativen Nachweis von IAM etabliert. Da zur gaschromatographischen

Darstellung des IAMs eine Derivatisierung mit Trifluoressigsäureanhydrid nötig ist, diese

aber für die IES ein identisches Endprodukt (siehe Abb. 3.18 C) liefert, bestand das

primäre Ziel darin, die betreffenden Indolderivate vorab voneinander zu trennen, was

durch den Einsatz einer geeigneten hochleistungsflüssigkeitschromatographischen

Trennung gewährleistet werden konnte (Abb. 3.17). Im Anschluß an die Isolation der

Indolderivate ließen sich die einzelnen Fraktionen selektiv derivatisieren, und mittels einer

hochsensiblen gaschromatographisch-tandemmassenspektrometrischen Technik (3.5.4)

analysieren. Die durchgeführten Experimente vermochten den enzymatischen Umsatz von

Trp zu IAM, als auch die Steigerung dieser enzymatischen Aktivität im Zuge der

proteinbiochemischen Anreicherung des IES-Synthase-Komplexes zweifelsfrei zu belegen

(Abb. 3.18 B). Im Rahmen dieser Arbeit wurde zudem die Identifikation markierten IANs

angestrebt. Unter Einsatz der hier präsentierten Analysetechnik hätte sich intermediär

entstehendes IAN selektiv nachweisen lassen müssen, doch konnte unter keinen

Umständen isotopenmarkiertes IAN detektiert werden, was zu dem Schluß führt, daß IAN

kein direktes Intermediat der IES-Synthase-Reaktion darstellt. Darüber hinaus konnte unter

Verwendung von isotopenmarkiertem IAM, welches, im Rahmen dieser Arbeit, mit Hilfe

Diskussion

111

einer Tryptophan-2-Monooxygenase aus Pseudomonas savastanoi synthetisiert und

gereinigt wurde (2.7.4), sowohl der enzymatische Umsatz von IAM zur IES in pflanzlichen

Proteinpräparationen, als auch die Verdünnung dieses Umsatzes durch die Gabe von L-Trp

demonstriert werden, wobei bei einem Verhältnis von 1:1 an L-Trp zu [2H]5-IAM eine

Reduktion des IAM-Umsatzes auf 53.7 % beobachtet werden konnte (3.5.5). De-facto

lassen diese Resultate einen Zusammenhang von IAM-Synthese und Umsatz, sowie der

IES-Synthase-katalysierter IES-Biosynthese erkennen.

Zur weitergehenden Charakterisierung der hier vorgestellten IAM-Hydrolase-Aktivität aus

A. thaliana wurde versucht, die Stereoselektivität dieser Reaktion eingehender zu

untersuchen. Die IES-Synthase zeigt, wie von MÜLLER & WEILER (2000a) beschrieben,

eine strikte Stereoselektivität für ihr bevorzugtes Substrat, das L-Trp. Folgerichtig sollte

sich, für den Fall eine Beteiligung einer Amidasereaktion an der IES-Biosynthese, eine

solche Selektivität auch für die IAM-Synthese aus Trp finden lassen. Die Untersuchungen

ließen diesbezüglich aber keine eindeutige Schlußfolgerung zu. Im Gegensatz zu der IES-

Synthase-katalysierten IES-Biosynthese wurde bei der Bildung des IAMs auch D-Trp als

Substrat akzeptiert, wobei der Zusatz von unmarkiertem D-Trp jedoch nicht zu einer

Reduktion des [2H]5-L-Trp-Umsatzes führte, sondern vielmehr zu einer nachweislichen

Verdoppelung des IAM-Gehaltes ([2H]5-IAM + IAM), was wiederum auf eine

enzymatische Nebenreaktion hindeutet (3.5.6). In diesem Kontext könnte eine Peroxidase-

katalysierte Decarboxylierung von Trp zu IAM eine denkbare Nebenreaktion darstellen.

Eine solche, von RIDDLE & MAZELIS (1964, 1965) bereits früh postulierte, Reaktion ließ

sich in den untersuchten Ansätzen allerdings mit großer Wahrscheinlichkeit ausschließen,

da unter den gewählten Reaktionsparametern keine Peroxidaseaktivität detektiert werden

konnte (Daten nicht gezeigt).

Da die in-vitro-Experimente konsistent auf die intermediäre Beteiligung von IAM an der

IES-Biosynthese hinwiesen, sollte im folgenden untersucht werden, ob IAM in-vivo in

A. thaliana nachzuweisen ist. Unter Verwendung der hier präsentierten, gekoppelten

HPLC/GC-MS/MS-Technik, in Verbindung mit pentadeuteriertem IAM als internem

Standard, konnte endogen enthaltenes IAM in strikt steril angezogenen A. thaliana-

Pflanzen zweifelsfrei quantifiziert werden (3.6.1). Der Gehalt an IAM in 14 Tage alten

Rosettenpflanzen erwies sich als äußerst gering (3.5 ng g-1 Frischgewicht), und sank im

weiteren Verlauf der Entwicklung auf etwa 130 pg g-1 Frischgewicht in ausgewachsenen

Pflanzen ab. Tendenziell war der IAM-Gehalt in nicht steril gezogenen Pflanzen

Diskussion

112

(30.9 ± 5.0 pmol g-1 Fg), im Vergleich zu sterilem Pflanzenmaterial gleichen Alters

(20.5 ± 9.1 pmol g-1 Fg), geringfügig höher. Von einer bakteriellen Kontamination des

Pflanzenmaterials kann aber abgesehen werden, da die IAM-Gehalte in den nicht steril

gezogenen Pflanzen mit dem Alter nicht konstant blieben oder anstiegen, sondern vielmehr

mit der Zeit auf 0.74 ± 0.03 pmol g-1 Fg (vegetative Pflanzen mit 5 – 7 cm Rosetten-

durchmesser) absanken. Diese Ergebnisse belegen, daß IAM als endogener Metabolit in

A. thaliana angesehen werden muß.

In weiteren Untersuchungen wurden die endogenen Gehalte an IES und IAM in steril

angezogenen Keimlingen innerhalb der ersten 14 Tage der Keimlingsentwicklung

analysiert. Die höchsten Meßwerte für IES sowie IAM konnten in gequollenen Samen

aufgezeigt werden (Abb. 3.22 A), wobei, verglichen mit 14 Tage alten Keimlingen, hier

270-fach höhere IES- bzw. 40-fach höhere IAM-Mengen detektiert wurden. Die Zeitprofile

des Auftretens beider indolischer Komponenten zeigen klare Analogien, so sinken

beispielsweise die endogenen Gehalte von IAM und IES innerhalb der ersten 3 – 5 Tage

der Keimung parallel ab.

Die Wirkung und Herkunft von Auxinen im Verlauf der Keimlingsentwicklung wird

bereits seit langem untersucht (GOODWIN, 1978). Nach heutigem Wissensstand wird davon

ausgegangen, daß in den ersten Tagen der Keimung Auxine aus zuvor angelegten

Speichern freigesetzt werden (ELLIOT & STOWE, 1971; BODNARYK & PALANISWAMY,

1990). Mit der Freisetzung von IES aus sekundären Metaboliten, wie z.B. Glucobrassicin

(PETERSEN et al., 2002), während der Keimung werden, in A. thaliana, zwei Nitrilase-

Isoformen (NIT2, NIT3) in Verbindung gebracht (VORWERK et al., 2001; KUTZ et al.,

2002), da sie ausschließlich während der Embryo- (NIT2) und frühen

Keimlingsentwicklung (NIT3) exprimiert werden. Der parallele Verlauf der Indolderivat-

Profile läßt einen Zusammenhang der IAM-Synthese mit der Aktivität dieser Nitrilase-

Isoformen vermuten. Darüber hinaus lieferten Arbeiten von KOBAYASHI et al. (1998a),

PIOTROWSKI et al. (2000) und OSSWALD et al. (2002) Hinweise auf eine enzymatische

Bifunktionalität der Nitrilasen. Die Nitrilase 4 aus A. thaliana setzt beispielsweise ihr

Substrat β-Cyano-L-alanin nicht ausschließlich zu Aspartat um, sondern liefert, wenn auch

nur in geringerem Maße, zudem Asparagin als zweites Endprodukt der enzymatischen

Reaktion. Um zu überprüfen, ob eine nitrilasekatalysierte Reaktion womöglich die Ursache

für die hohen IAM-Mengen in den ersten drei Tagen der Keimlingsentwicklung sein

könnte, wurden die Nitrilase-Isoformen 1 – 3 heterolog überexprimiert, über ihren (His)6-

Diskussion

113

Fusionsanteil gereinigt, und die Produkte der enzymatischen Umsetzungen, nach

Inkubation mit IAN als Edukt, analysiert. Für alle drei untersuchten Isoformen konnte

neben der erwartungsgemäßen Bildung von IES auch die Synthese von IAM gezeigt

werden (3.6.2). Da in zusätzlichen Experimenten keine detektierbarer Umsatz von IAM

durch die rekombinanten Nitrilasen gemessen werden konnte, deutet alles darauf hin, daß

es sich hier um ein zweites Endprodukt der Nitrilasereaktion handelt. Zusammengefaßt

implizieren die Resultate der in-vitro-Analysen die Hypothese, daß zumindest ein Teil des

während der Keimlingsentwicklung gebildeten IAMs einer nitrilasekatalysierten Reaktion

entstammt. Voreifrige Rückschlüsse auf die in-vivo-Situation können aber irreführend sein,

da bisher unbekannte Regulationsmechanismen die enzymatische Aktivität der Nitrilasen

in-planta modifizieren könnten. Weitergehende Experimente an nitrilasedefizienten

Mutanten bzw. Fütterungsversuche mit isotopenmarkierten Biosynthesevorstufen sind

notwendig, um Klarheit über die Quelle des IAMs in Keimlingen und die Rolle der

Nitrilasen in diesem Prozeß zu erbringen.

Eine weitere Untersuchung der IAM-Gehalte in einzelnen Individuen demonstrierte eine

Metabolisierung des Amids in Abhängigkeit vom Entwicklungszustand der Keimlinge. Der

absolute Gehalt an IAM betrug 11.8 pg pro gequollenem Samen, und fiel innerhalb der

ersten 1 – 3 Tage der Keimung auf 2.8 pg pro Keimling ab. Zwischen Tag 5 und 14 ließ

sich ein erneuter Anstieg des IAM-Gehaltes auf 27.9 pg pro Keimling errechnen (Abb.

3.22 B). Auf Grundlage dieser Beobachtung wurden im folgenden Versuche zur

Identifikation von Proteinen unternommen, welche an der Umsetzung von IAM beteiligt

sein könnten. Die spezifische IAM-Umsetzung könnte beispielsweise von sogenannten

Amidohydrolase (Amidasen) katalysiert werden. Da zu Beginn dieser Arbeit keine pflanz-

lichen Amidohydrolasen bekannt waren, wurden die abgeleiteten Aminosäuresequenzen

bakterieller IaaH Gene miteinander verglichen. Mit Hilfe dieser Aminosäuresequenz-

analyse ließ sich ein etwa 118 Aminosäuren umfassender, konservierter, Sequenzbereich

ermitteln (Abb. 3.24), welcher eine Homologie von 73 % aufwies und zur Sichtung einer

A. thaliana Protein Datenbank verwendet wurde. Anhand dieser in-silico-Untersuchungen

wurden vier putative Amidohydrolasen (AMI1 – AMI4) im Proteom von A. thaliana

ausgemacht (3.7.1). Die Homologie dieser Proteine mit dem 118 Aminosäuren langen

Sequenzbereich der bakteriellen Amidohydrolasen lag zwischen 39.1 % und

60.4 %.

Diskussion

114

Die katalytischen Eigenschaften bakterieller Amidohydrolasen sind in der Vergangenheit

bereits umfassend untersucht worden. Im Vordergrund standen hierbei die Identifikation

des katalytischen Zentrums sowie die Analyse enzymatischer Reaktionsmechanismen

industriell genutzter Enzyme, wie der Amidohydrolase (EC 3.5.1.4) aus Rhodococcus sp.

(Accession M74531) bzw. Rhodococcus rhodochrous J1 (Accession D16204). KOBAYASHI

et al. (1997) gelang es mit Hilfe gerichteter Mutagenese zwei essentielle Aminosäuren

(L-Asp, L-Ser) im katalytischen Zentrum dieser Enzyme zu identifizieren. Entgegen der

Erwartung der Autoren zeigten die untersuchten Amidohydrolasen keine, für Sulfhydryl-

Enzyme typische, Beteiligung eines Cysteinrestes im aktiven Zentrum des Enzyms, welche

z.B. von Nitril-Hydrolasen bekannt ist (BORK & KOONIN, 1994). Der Vergleich der

putativen Amidasen aus A. thaliana mit den Rhodococcus Amidohydrolasen erlaubte eine

weitere Eingrenzung der Gruppe. Lediglich die, im folgenden als AMI1 bezeichnete,

Amidohydrolase aus A. thaliana (Accession AAG35612), verfügt über beide essentiellen

Aminosäuren des aktiven Zentrums (Abb. 3.25). In der zweiten putativen Amidase (AMI2,

Accession CAA71371) ist das katalytisch relevante L-Aspartat (Asp-133, AMI1)

konservativ gegen L-Glutamat (Glu-166, AMI2) ausgetauscht. Die beiden anderen Enzyme

(AMI3 und AMI4) enthielten anstelle des L-Serins (Ser-137, AMI1) funktionell nicht

vergleichbare L-Glycine (Gly-180, AMI3; Gly-167, AMI4), weshalb auf eine weitere

Untersuchung der beiden letztgenannten Proteine verzichtet wurde.

Bioinformatische Recherchen, unter Verwendung gängiger Datenbanken (AGI,

Arabidopsis Genomic Initiative), ermöglichten die chromosomale Lokalisation der beiden

Amidasen sowie die Sichtung der umliegenden Genregionen (Abb. 3.26). Die Nuklein-

säuresequenzen von AMI1 bzw. AMI2 zeigten keine Gemeinsamkeiten mit umliegenden

Genen. Eine Organisation der putativen Amidasen in Genfamilien kann demzufolge

ausgeschlossen werden.

Die vollständigen cDNA-Fragmente für AMI1 und AMI2 ließen sich mittels RT-PCR

amplifizieren, und anschließend in geeignete Expressionssysteme inserieren. Hierbei zeigte

sich, daß beide Amidasen in Blättern konstitutiv (Abb. 3.27), in Wurzeln hingegen nicht

nachweisbar exprimiert werden (3.7.3). Die Fusionskonstrukte ließen sich in Escherichia

coli exprimieren, wobei sich lediglich AMI1 unter nativen Bedingungen reinigen ließ. Die

heterologe Expression von AMI2 führte in zwei unabhängig voneinander erstellten

Expressionssystemen jeweils zur Einlagerung der Fusionsproteine in Einschlußkörpern.

Ähnliche Beobachtungen wurden bereits für die Amidase aus Rhodococcus rhodochrous

Diskussion

115

J1 gemacht. Hier konnte das Protein aber mittels Denaturierung und sequentieller

Renaturierung, unter Erhalt der enzymatischen Aktivität, aus den Einschlußkörpern

gereinigt werden (KOBAYASHI et al., 1997). In Anlehnung an diese Vorgehensweise konnte

schließlich auch ein Teil der AMI2-Fusionsproteine gewonnen und affinitätschromato-

graphisch gereinigt werden (Abb. 3.29 B).

Ein schlüssiger Funktionsnachweis der putativen Amidasen aus A. thaliana stand noch aus.

Folglich erschien es erstrebenswert, die Substratspezifität der heterolog exprimierten und

gereinigten Proteine zu überprüfen (3.8.1). Hierbei stellte sich heraus, daß AMI2 keines

der angebotenen Substrate umsetzte. Unter Berücksichtigung der Aufarbeitungsprozedur

darf, in Bezug auf die Amid-Umsetzung, jedoch nicht ohne weiteres auf eine fehlende

enzymatische Aktivität dieses Proteins geschlossen werden, da eine Denaturierung/

Renaturierung von Proteinen oftmals mit dem Verlust der enzymatischen Aktivität

einhergeht. Das nativ gereinigte AMI1-Fusionsprotein zeigte hingegen signifikante IAM-

Hydrolase-Aktivität. Von den angebotenen Substraten wurde IAM mit Abstand am besten

umgesetzt (Abb. 3.30). Hinzu kamen, verglichen mit dem IAM-Umsatz, geringere

Umsätze für L-Asparagin (41.5 %), 1-Naphthylacetamid (25.2 %), und Nikotinsäureamid

(10 %), wobei 1-Naphthylacetamid kein natives Substrat darstellt, da es in Pflanzen nicht

vorkommt. Im Gegensatz zu bakteriellen Amidasen (KOBAYASHI et al., 1998b), setzte

AMI1 nahezu kein IAN um.

Weil AMI1 neben IAM auch die Aminosäure L-Asparagin als Substrat akzeptierte, wurde

eine Beteiligung dieses Enzyms bei der Hydrolyse von Auxin-Konjugaten in Betracht

gezogen. Experimentell fand diese Hypothese jedoch keine Bestätigung, da eine

enzymatische Freisetzung von IES aus Indol-3-acetyl-L-aspartat nicht detektiert werden

konnte. In Verbindung mit dem Fehlen struktureller Ähnlichkeiten zu bisher bekannten

Auxin-Konjugat-Hydrolasen aus Enterobacter agglomerans (CHOU et al., 1998) und

A. thaliana (DAVIES et al., 1999; LECLERE et al., 2002) erlauben diese Daten den

Ausschluß einer solchen Funktion für AMI1.

Weiterführende Versuche zielten darauf ab, eine grundlegende Charakterisierung des

rekombinanten AMI1-Polypeptids durchzuführen (3.8.2). Das Reaktionsverhalten des

Enzyms war unter Standardbedingungen (T = 30 °C, pH = 7.5, 5 µg gereinigtes Protein,

10 mM IAM) mehr als 4 h stabil. Das pH-Optimum lag bei pH 7.0, wobei die

enzymatische Aktivität bei pH-Werten > 8 bzw. < 6 drastisch abnahm. Bei pH 7.0 wies

AMI1 ein Temperatur-Optimum von 35 – 37 °C aus. Temperaturen oberhalb von 37 °C

Diskussion

116

führten zu einer signifikanten Reduktion der Aktivität. Für das Strep-AMI1-Fusionsprotein

ließ sich ein apparenter Km-Wert von 972 µM (0 – 1 mM IAM) bestimmen, ein exakter

Wert für die Michaelis-Menten-Konstante konnte jedoch unter den gegebenen

Bedingungen nicht ermittelt werden, da sich die Reaktion nicht sättigen ließ. Mit

steigender Substratkonzentration nahm die spezifische Aktivität des rekombinanten

Proteins stetig zu, so ließ sich bei einer Substratkonzentration von 10 mM IAM eine

spezifische Aktivität von 4.1 nkat mg-1 Protein ermitteln, welche bei 25 mM IAM auf

7.5 nkat mg-1 Protein anstieg. Höhere Substratkonzentrationen ließen sich nicht berück-

sichtigen, da sich die Löslichkeit von IAM in Methanol limitierend auswirkte, und der

Einsatz größerer Methanolvolumina quenchende Effekte auf das photometrische

Analyseverfahren zeigte. Eine solche Substratkinetik (Abb. 3.31 A) wird häufig bei

Proteinen beobachten, welche allosterisch durch ihr Substrat oder einen Effektor aktiviert

werden, was oftmals mit einer Konformationsänderung des Proteins einhergeht (MONOD et

al., 1965). Als vielleicht prominentestes Beispiel für einen solchen Mechanismus sei in

diesem Zusammenhang nur die Ribulose-1,5-bisphosphat Carboxylase/Oxygenase

erwähnt, deren Aktivität in-vivo durch ein komplexes Zusammenspiel von Carbamy-

lierung, Mg2+-Konzentration, und einer RubisCO-Aktivase reguliert wird (JENSEN & BAHR,

1977; HARTMAN & HARPEL, 1994; SPREITZER & SALVUCCI, 2002). In Bezug auf die

generelle Charakterisierung des rekombinanten AMI1-Polypeptids konnte festgestellt

werden, daß die Amidase 1 aus A. thaliana in-vitro als Monomer fungiert (3.8.3), was vor

dem Hintergrund, daß viele bakterielle Amidasen obligat als Homodimere (KOBAYASHI et

al., 1993) bzw. Homotetramere (SOUBRIER et al., 1992) agieren, bemerkenswert erscheint.

Im weiteren Verlauf konnten polyklonale Antikörper gegen die beiden vollständigen

Proteine hergestellt werden, welche den Nachweis beider Proteine in cytosolischen

Proteinfraktionen aus A. thaliana erlaubten (Abb. 3.34). Auffällig war in diesem

Zusammenhang eine verhältnismäßig geringe Expression der Proteine. Die Messung der

IAM-Hydrolase-Aktivität in pflanzlichen Rohextrakten spiegelte die niedrige Expression

wider, da Enzymaktivitäten von lediglich 0.14 ± 0.01 pkat mg-1 Protein gemessen werden

konnten (3.8.5). Mit Fortführung der Experimente konnte eine spezifische Anreicherung

der Amidasen nach Chromatographie an Hydroxyapatit erzielt werden, welche durch die

Verwendung der α-Amidase-Seren (643 & 644) verfolgt werden konnte. Die chromato-

graphische Anreicherung führte zur Steigerung der enzymatischen Aktivität im

pflanzlichen Proteinextrakt auf 2.22 ± 0.71 pkat mg-1 Protein.

Diskussion

117

Abschließend stellte sich die Frage, ob die isolierten Amidasen aus A. thaliana mögliche

Komponenten des IES-Synthase-Komplexes darstellen. Unter Einsatz der gewonnenen

Antikörper gegen AMI1 und AMI2 wurde diese Fragestellung bearbeitet. Vorversuche zur

Immunpräzipitation der IES-Synthase aus angereicherten Proteinfraktionen ließen für das

α-AMI1-Serum eine Präzipitation der IES-Synthase erkennen, wohingegen die Gabe des

α-AMI2-Serums keinen Einfluß auf IES-Synthase zeigte (3.9.1). Zur weiterführenden

Untersuchung dieses Effektes wurden spezifische α-AMI1-Immunglobuline gereinigt, und

erneut zur Präzipitation der IES-Synthase verwendet. Entgegen den Erwartungen konnte in

diesen Versuchen keine Präzipitation der Synthase-Aktivität beobachtet werden, vielmehr

zeigte sich mit steigender IgG-Konzentration eine drastische Zunahme der IES-Synthase-

Aktivität um bis zu 700 % (Abb. 3.36). Daraus ließ sich schließen, daß das verwendete

Antikörper/Antigenverhältnis außerhalb des Äquivalenzbereiches (Heidelberger-Kurve)

lag und die Antikörper/Antigen-Komplexe somit nicht ausreichend miteinander vernetzen,

die Antikörper jedoch in erheblichem Maße mit der IES-Synthase interagieren. Hierbei

könnte die Steigerung der Aktivität durch eine Erhöhung der Löslichkeit des Synthase-

Komplexes bedingt sein, was zudem durch die Abnahme der tryptophanmetabolisierenden

Aktivität in den Sedimenten nahe gelegt wird. Darüber hinaus ist eine Stabilisierung des

Enzymkomplexes durch die Antikörper denkbar, welche hier als proteolytische

Schutzgruppen fungieren könnten. Eine immunaffinitätschromatographische Separation

einer angereicherten IES-Synthase Fraktion (2.10.2.3) mit anschließender Mikrosequenz-

ierung isolierter Polypeptide erlaubte jedoch keine näheren Aussagen zur Beteiligung von

AMI1 im IES-Synthase-Komplex. Augenscheinlich beinhaltete die untersuchte Protein-

fraktion zu hohe Mengen an Enzymen, welche unspezifisch mit der Sepharosematrix

interagierten, und so die spezifisch gebundenen Proteine überlagerten (3.9.2).

Interessanterweise ließen sich in einer sehr schwachen Proteinbande auf Höhe von 66 kDa

Hinweise auf eine Myrosinase (Accession NP_197972) finden. Diese Proteine sind, unter

anderem, an der enzymatischen Freisetzung von IES aus Glucobrassicin beteiligt und

stehen somit direkt mit der IES-Biosynthese in Verbindung. Eine kritische Betrachtung

dieser Ergebnisse ist indes unabdingbar, da es sich hier ebensogut um eine unspezifische

Bindung handeln könnte. In weiterführenden Experimenten könnte, nach weiterer im-

munologischer Reifung der α-AMI1-Immunglobuline, die Präzipitation spezifischer Anti-

körper/Antigen-Komplexe nach Bindung an einer Protein G-Matrix erzielt werden.

Diskussion

118

Möglicherweise können auf diesem Weg proteinmassenspektrometrische Informationen

bezüglich AMI1-assoziierter Proteine gesammelt werden.

In einer abschließenden Reihe von Experimenten zur Identifikation von Proteinen des IES-

Synthase-Komplexes wurde versucht, tryptophan- bzw. indol-3-acetamidbindende Proteine

mittels Photoaffinitätsmarkierung zu identifizieren (3.10). Zu diesem Zweck wurden ent-

sprechende photoaktivierbare Substanzen ([3H]3-6-Azido-L-tryptophan, [3H]2-6-Azido-

indol-3-acetamid) hergestellt. Obgleich die Funktionalität beider Verbindungen zweifels-

frei demonstriert werden konnte, ermöglichte die Verwendung dieser Azidoderivate keine

spezifische Markierung von pflanzlichen Enzymen. Insbesondere die Markierungs-

experimente mit [3H]2-6-Azidoindol-3-acetamid belegten, daß für eine eindeutige

Markierung von Proteinen mit ihrem Substrat unerwartet hohe Proteinmengen (> 0.75 µg)

notwendig waren (3.10.2). Die Photoaffinitätsmarkierung konnte sich bei der Identifikation

von Rezeptoren häufig bewähren, da Ligand/Rezeptor-Interaktionen in aller Regel einen

hochaffinen Charakter aufweisen, sowie mit einer kovalenten Bindung des Liganden an

den Rezeptor einhergehen. Von einer solchen Interaktion kann bei dem untersuchten

Substrat/Enzym-System indes nicht ausgegangen werden. Darüber hinaus sind die

gesuchten Zielproteine mit großer Wahrscheinlichkeit zu den sogenannten „unterrepräsen-

tierten“ Proteinen („low abundant proteins“) zu zählen, so daß diese Methode hier als nicht

praktikabel erachtet werden muß.

In Summe deuten die im Verlauf dieser Arbeit zusammengetragenen Daten konsistent auf

einen IES-Biosyntheseweg hin, der, analog zu dem bakteriellen Indol-3-acetamid-

Biosyntheseweg, ausgehend vom Trp via IAM zur IES führt. Untermauert wird diese

Aussage durch Arbeiten an dem Agrobacterium tumefaciens IaaM Gen, welches für eine

Tryptophan-2-Monooxygenase codiert. KLEE et al. (1987) beobachteten nach Über-

expression dieses Gens in Tabak und Petunien drastische Symptome einer Auxin-

überproduktion. Neben einem erwartet hohen IAM-Gehalt konnten auch enorm erhöhte

IES-Gehalte gemessen werden, was die Autoren zu der Schlußfolgerung führte, daß in

beiden Spezies ein enzymatischer Umsatz von IAM zur IES möglich sei, obgleich ein

autokatalytischer Zerfall des IAMs nicht ausgeschlossen werden konnte. Vor diesem

Hintergrund durchgeführte Aminosäuresequenzanalysen erbrachten keine präzisen Hin-

weise auf Tryptophan-2-Monooxygenase-ähnliche Enzyme im Proteom von A. thaliana.

Darüber hinaus läßt der beachtliche Einfluß der α-AMI1-Antikörper auf die IES-Synthase-

Aktivität mit großer Wahrscheinlichkeit auf eine Integration von AMI1 bzw. eines

Diskussion

119

amidaseähnlichen Proteins im Synthase-Komplex schließen. Dieser Befund scheint in

eklatanter Diskrepanz zu der Arbeit von MÜLLER & WEILER (2000a) zu stehen, die anhand

von Isotopenmarkierungsexperimenten den Einbau von zwei Molekülen Sauerstoff aus

Wasser in die IES postulierten, da die hier vorgeschlagene Indol-3-acetamid-

Reaktionssequenz lediglich zum Einbau eines Sauerstoffmoleküls in die IES führt.

Abb. 4.1: Massenspektrometrische Analyse des Sauerstoffeinbaus im Zuge von Indol-3-essigsäure-Synthase katalysierter Indol-3-essigsäure-Biogenese

Das Massenspektrum belegt den Einbau von zwei Molekülen Sauerstoff aus Wasser in die IES. Zur Kontrolle wurde die Reaktion (16 h, 30 °C) unter Zusatz von unmarkierter IES (0.5 mM) durchgeführt, um den nicht-enzymatischen Sauerstoffaustausch zwischen der Carboxygruppe und dem 18O-markierten Wasser zu untersuchen (verändert nach MÜLLER & WEILER, 2000a).

Bei genauerer Betrachtung der Primärdaten (Abb. 4.1) läßt sich hingegen erkennen, daß

der IES-Synthase-vermittelte Sauerstoffeinbau nicht vornehmlich zur Bildung von [18O]2-

IES (m/z = 199) führt, sondern die Produkte IES (m/z = 195), [18O]-IES (m/z = 197) und

[18O]2-IES (m/z = 199) in einem Verhältnis von 0.8 : 3.2 : 6 liefert, was von den Autoren

auf die nur 94 %-ige Isotopenanreichung des eingesetzten H218O zurückgeführt wurde.

Eine nitrilasekatalysierte Reaktion sollte jedoch einen deutlich höheren Anteil an zweifach 18O-markierter IES (m/z = 199) liefern, da bei einer solchen Hydratisierung, in einer

einstufigen Reaktion, simultan zwei Moleküle Wasser angelagert werden. Unter der

Prämisse einer Amidasebeteiligung erlaubt der, von KOBAYASHI et al. (1998b)

vorgeschlagene, katalytische Mechanismus (Abb. 4.2) bakterieller Amidasen eine anders

geartete Erklärung für die detektierte Isotopenverteilung von 32 % einfach 18O-markierter

zu 60 % doppelt 18O-markierter IES.

Diskussion

120

Abb. 4.2: Vorgeschlagener katalytischer Mechanismus bakterieller Amidasen Das tetraedrische Intermediat ist mit [I], die Imino-Übergangsform mit [II] bezeichnet (verändert nach KOBAYASHI et al., 1998b).

Hierbei würde das Substrat (IAM) unter Ausbildung eines tetraedrischen Intermediates (I)

an das Enzym binden. Diese Konformation erlaubt ein Oszillieren zwischen der tetrae-

drischen Hydroxyamino-Form (I) und einer Imino-Übergangsform (II), wobei in einer

Gleichgewichtsreaktion H2O angelagert bzw. abgespalten wird, ohne dabei entsprechende

Nitrilverbindungen freizusetzen. Auf diese Weise könnte, der aus dem Amid stammende,

nicht markierte Sauerstoff abgespalten und dafür ein 18O-markiertes Sauerstoffmolekül

eingeführt werden. Im Zuge der amidasekatalysierten Reaktion könnte schließlich ein

weiteres 18O-markiertes Sauerstoffmolekül (III) in die IES inseriert werden.

Letztendlich können nur Untersuchungen an Amidase-defizienten bzw. Amidase-über-

exprimierenden Mutanten Klarheit über den Stellenwert dieses Enzymes innerhalb der

IES-Biogenese erbringen. Zudem ist die Analyse AMI1-homologer Proteine anderer

Pflanzenspezies erstrebenswert, da sich so die Herkunft dieser enzymatischen Aktivität

aufklären ließe, welche einerseits ihren Weg von Höheren Pflanzen in pflanzenassoziierte

Bakterien gefunden haben könnte, oder aber andererseits prokaryotischer Natur sein

könnte und im Verlauf der Koevolution in das Genom Höhere Pflanzen integriert wurde.

Zusammenfassung

121

5 Zusammenfassung

Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, zum Verständnis der tryptophan-

abhängigen Auxinbiosynthese in Arabidopsis thaliana beizutragen. Die Beschreibung

eines tryptophanumsetzenden Indol-3-essigsäure-Synthase-Komplexes (MÜLLER &

WEILER, 2000a) diente dabei als Ausgangspunkt.

Es wurden Versuche unternommen, diesen IES-Synthase-Komplex proteinbiochemisch zu

reinigen. Unter Verwendung flüssigkeitschromatographischer Methoden ließ sich der

Komplex um einen Fakor von 180 anreichern, doch führten nachfolgende Photoaffinitäts-

markierungsversuche und proteinmassenspektrometrische Analysen nicht zu einer

Identifikation putativer Bestandteile des Enzymkomplexes.

Darüber hinaus wurde die Integration eines Flavin-Monooxygenase-ähnlichen Proteins

(YUCCA) in der IES-Synthase untersucht, wobei eine Beteiligung dieses Enzyms an der

IES-Synthase-vermittelten Auxin-Synthese nicht demonstriert werden konnte. Welche

Funktion diesem Protein in-vivo zuzuordnen ist wird diskutiert.

Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der biochemischen Charakterisierung der

Indol-3-essigsäure (IES) Biogenese. In diesem Zusammenhang wurde der Einfluß

unterschiedlicher Inhibitoren und Indol-Derivate auf den in-vitro-Umsatz von Tryptophan

(Trp) zur IES untersucht. Im Rahmen dieser Experimente konnte erstmalig ein

Verdünnungseffekt auf die in-vitro-IES-Synthese für eine indolische Verbindung (Indol-3-

acetamid) beobachtet werden, der zu der Hypothese einer intermediären Beteiligung dieser

Substanz im Verlauf der IES-Biosynthese führte. Dieser Annahme folgend, ließ sich in

weiterführenden Versuchen zweifelsfrei nachweisen, daß Indol-3-acetamid (IAM)

enzymatisch aus Trp entstehen kann und weiter zur IES umgesetzt wird. Nach Etablierung

eines hochsensitiven, gekoppelten, HPLC/GC-MS/MS-Analyseverfahrens konnte die

Quantifizierung von IAM in steril angezogenen Arabidopsis thaliana-Keimlingen

erfolgreich durchgeführt werden. Hierbei ließ sich eine entwicklungsbedingte Fluktuation

der IAM-Gehalte beobachten, was auf eine Metabolisierung von IAM in-planta verwies.

Daneben konnte ein putativer Syntheseweg für IAM in-vitro aufgezeigt werden, welcher

auf den enzymatischen Eigenschaften von Nitrilasen beruht. Der Stellenwert dieser

enzymatischen Quelle wird in Bezug auf die Keimlingsentwicklung diskutiert.

Zusammenfassung

122

Abschließend wurde die Identifikation IAM-umsetzender Enzyme im Proteom von

A. thaliana angestrebt. Es konnten vier putative Proteine identifiziert werden, von denen

zwei kloniert und untersucht wurden. Hierbei erwies sich, nach eingehender Charak-

terisierung, eines der Proteine (AMI1) als spezifische IAM-Hydrolase. Der Einsatz

spezifischer Antikörper, welche gegen das rekombinante AMI1-Protein gerichtet waren,

verdeutlichten in Immunpräzipitationsversuchen einen signifikanten Einfluß der

Antikörper auf die IES-Synthese-Aktivität. Dieses Ergebnis führte zu der Hypothese, daß

AMI1 oder ein amidaseähnliches Protein in dem IES-Synthase-Komplex integriert ist und

dort die Umsetzung von IAM zur IES, also die abschließende Teilreaktion, katalysiert. Ein

möglicher Mechanismus, welcher in Hinblick auf eine amidasekatalysierte Reaktion den

Einbau von zwei Molekülen Sauerstoff aus Wasser vermitteln würde, wird vorgestellt.

Zusammenfassung

123

Teile dieser Arbeit wurden bereits präsentiert bzw. veröffentlicht:

MÜLLER, A., POLLMANN, S., WEILER, E.W. and PIOTROWSKI, M. (2000). Properties of an IAA-synthase complex from Arabidopsis thaliana (Posterpräsentation). DFG Schwerpunktprogramm “Molecular Analysis of Phytohormone Action”. 1st International Conference.

POLLMANN, S., MÜLLER, A., PIOTROWSKI, M., WEILER, E.W. (2002). Auxin biosynthesis in Arabidopsis thaliana (mündliche Präsentation). DFG Schwerpunktprogramm “Molecular Analysis of Phytohormone Action”. 2nd International Conference.

POLLMANN, S., WEILER, E.W. (2002). Occurrence and formation of indole-3-acetamide in Arabidopsis thaliana (Posterpräsentation). Botanikertagung der Deutschen botanischen Gesellschaft 2002.

POLLMANN, S., MÜLLER, A., PIOTROWSKI, M., WEILER, E.W. (2002). Occurrence and formation of indole-3-acetamide in Arabidopsis thaliana. Planta 216 (1), 155-161

POLLMANN, S., NEU, D., WEILER, E.W. (2003). Molecular cloning and characterization of a novel amidase from Arabidopsis thaliana capable of converting indole-3-acetamide into the plant growth hormone, indole-3-acetic acid. Phytochemistry (in Druck).

Literatur

124

6 Literaturverzeichnis

AKABA, S., SEO, M., DOHMAE, N., TAKIO, K., SEKIMOTO, H., KAMIYA, Y., FURUYA, N., KOMANO, T., KOSHIBA, T. (1999) Production of homo- and hetero-dimeric isozymes from two aldehyde oxidase genes of Arabidopsis thaliana. J Biochem 126 (2), 395-401

ANDERSSON, B., SANDBERG, G. (1982) Identification of endogenous N-(3-indoleacetyl)aspartic acid in scots pine (Pinus sylvestris L.) by combined gas chromatography-mass spectrometry, using high-performance liquid chromatography for quantification. J Chromatogr 238, 151-156

AUSUBEL, F.M., BRENT, R., KINGSTON, R.E., MOORE, D.D., SEIDMANN, J.G., SMITH, J.A., STRUHL, K., EDS. (1995) Current protocols in molecular biology. John Wiley and Sons, New York

BAK, S., TAX, F.E., FELDMANN, K.A., GALBRAITH, D.W., and FEYEREISEN, R. (2001) CYP83B1, a cytochrome P450 at the metabolic branch point in auxin and indole glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis. Plant Cell 13, 101-111

BALDI, B.G., MAHER, B.R., SLOVIN, J.P., COHEN, J.D. (1991) Stable isotop labelling, in vivo, of D- and L-tryptophan pools in Lemna gibba and the low incorporation of label into indole-3-acetic acid. Plant Physiol 95, 1203-1208

BANDURSKI, R.S., COHEN, J.D., SLOVIN, J.P. and REINEKE, D.M. (1995) Auxin biosynthesis and metabolism. In: Plant hormones: Physiology, biochemistry and molecular biology. (P.J. Davies, ed.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 39-65

BAR, T., OKON, Y. (1993) Tryptophan conversion to indole-3-acetic acid via indole-3-acetamide in Azospirillium brasilense Sp 7. Can J Microbiol 39, 81-86

BARKAN, A. (1989) Tissue-dependent plastid RNA splicing in maize: Transcripts from four plastid genes are predominantly unspliced in leaf meristems and roots Plant Cell 1, 437-445

BARLIER, I., KOWALCZYK, M., MARCHANT, A., LJUNG, K., BHALERAO, R., BENNETT, M., SANDBERG, G., and BELLINI, C. (2000) The SUR2 gene of Arabidopsis thaliana encodes the cytochrome P450 CYP83B1, a modulator of auxin homeostasis. Proc Natl Acad Sci USA 97 (26), 14819-14824

Literatur

125

BARTEL, B. (1997) Auxin biosynthesis. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48, 51-66

BARTEL, B. and FINK, G.R. (1994) Differential regulation of an auxin-producing nitrilase gene family in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci USA 91, 6649-6653

BARTEL, B., LECLERE, S., MAGIDIN, M., and ZOLMAN, B.K. (2001) Inputs to the active indole-3-acetic acid pool: de novo Synthesis, conjugate hydrolysis, and indole-3-butyric acid β-oxidation. J Plant Growth Regul 20, 198-216

BARTLING, D., SEEDORF, M., MITHÖFER, A., WEILER, E.W. (1992) Cloning and expression of an Arabidopsis nitrilase which can convert indole-3-acetonitrile to the plant hormone, indole-3-acetic acid. Eur J Biochem 205, 417-424

BARTLING, D., SEEDORF, M., SCHMIDT, R.C., WEILER, E.W. (1994) Molecular characterization of two cloned nitrilases from Arabidopsis thaliana: key enzymes in biosynthesis of the plant hormone indole-3-acetic acid. Proc Natl Acad Sci USA 91, 6021-6025

BIALEK, K., MICHALCZUK, L., COHEN, J.D. (1992) Auxin biosynthesis during seed germination in Phaseolus vulgaris. Plant Physiol 100, 509-517

BIRNBOIM, H.C. and DOLY, J. (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucl Acids Res 7, 1513-1523

BISSELING, T. (1999) The role of plant peptides in intercellular signaling. Curr Opin Plant Biol 2, 365-368

BLUM, H., BEIER, H., GROSS, H.J. (1987) Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamid gels. Electrophoresis 8, 93-99

BODNARYK, R.P., PALANISWAMY, P. (1990) Glucosinolate levels in cotyledons of mustard, Brassica juncea L. and rape, B. napus L. do not determine feeding rates of flea beetle, Phyllotreta crucifera (GOEZE). J Chem Ecol 16, 2735-2746

BOERJAN, W., CERVERA, M., DELARUE, M., BEECKMAN, I., DEWITTE, W., BELLINI, C., CABOCHE, M., VAN ONCKELEN, H., VAN MONTAGU, M., INZÉ, D. (1995) Superroot, a recessive mutation in Arabidopsis, confers auxin overproduction. Plant Cell 7, 1405-1419

Literatur

126

BOLLETER, W.T., BUSHMAN, C.J., TIDWELL, P.W. (1961) Spectrophotometric determination of ammonia as indophenol. Anal Chem 33, 592-594

BORK, P. and KOONIN, E. (1994) A new family of carbon-nitrogen hydrolases. Protein Science 8, 1344-1346

BRADFORD, M.H. (1976) A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72, 248-254

BULLOCK, W.O., FERNANDEZ, M., SHORT, J.M. (1987) XL-1 Blue: a high efficiency plasmid transforming recA Escherichia coli strain with β-galactosidase selection. BioTechniques 5, 376-379

CELENZA, J.L. (2001) Metabolism of tyrosine and tryptophan – new genes for old pathways. Curr Opin Plant Biol 4, 234-240

CELENZA, J.L., GRISAFI, P.L., FINK, G.R. (1995) A pathway for lateral root formation in Arabidopsis thaliana. Genes Dev 9, 2131-2142

CHAPPLE, C. (1998) Molecular-genetic analysis of plant cytochrome P450-dependent monooxygenases. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 49, 311-343

CHAVADEJ, S., BRISSON, N., MCNEIL, J.N., DE LUCA, V. (1994) Redirection of tryptophan leads to production of low indole glucosinolate canola. Proc Natl Acad Sci USA 91 (4), 2166-2170

CHEN, K.H., MILLER, A.N., PATTERSON, G.W. and COHEN, J.D. (1988) A rapid and simple procedure for purification of indole-3-acetic acid prior to GC-SIM-MS analysis. Plant Physiol 86, 822-825

CHOU, J.-C., MULBRY, W. W., COHEN, J. D. (1998) The gene for indole-3-acetyl-L-aspartic acid hydrolase from Enterobacter agglomerans: molecular cloning, nucleotide sequence, and expression in Escherichia coli. Mol Gen Genet 259, 172-178

COONEY, T.P., NONHEBEL, H.M. (1991) Biosynthesis of indole-3-acetic acid in tomato shoots: measurement, mass spectral identification and incorporation of 2H from 2H2O into indole-acetic acid, D- and L-tryptophan, indole-3-pyruvate and tryptamine. Planta 184, 368-376

Literatur

127

COSTACURTA, A. and VANDERLEYDEN, J. (1995) Synthesis of phytohormones by plant-associated bacteria. Crit Rev Microbiol 21 (1), 1-18

COSTACURTA, A., KEIJERS, V. and VANDERLEYDEN, J. (1994) Molecular cloning and sequence analysis of an Azospirillium brasilense indole-3-pyruvate decarboxylase gene. Mol Gen Genet 243, 463-472

CRAVATT, B.F., GIANG, D.K., MAYFIELD, S.P., BOGER, D.L., KONER, R.A., GILULA, N.B. (1996) Molecular characterization of an enzyme that degrades neuromodulatory fatty-acid amides. Nature 384, 83-87

DARWIN, C. (1880) The power of movement in plants (assisted by F. Darwin). John Murray, London

DAVIES, R. T., GOETZ, D. H., LASSWELL, J., ANDERSON, M. N., BARTEL, B. (1999) IAR3 encodes an auxin conjugate hydrolase from Arabidopsis. Plant Cell 11, 365-376

DE LUCA, V., MARINEAU, C., BRISSON, N. (1989) Molecular cloning and analysis of an Azospirillium brasilense indole-3-pyruvate decarboxylase gene. Mol Gen Genet 243, 463-472

DELARUE, M., PRINSEN, E., VAN ONCKELEN, H., CABOCHE, M., BELLINI, C. (1998) Sur2 mutations of Arabidopsis thaliana define a new locus involved in the control of auxin homeostasis. Plant J 14, 603-611

DOHMOTO, M., SANO, J., ISAJI, G. and YAMAGUCHI, K. (2000) Indole-acetonitrile-sensitivity of transgenic tobacco containing Arabidopsis thaliana nitrilase genes. Plant Cell Report 19, 1027-1032

DOUCE, R., BOURGUIGNON, J., NEUBURGER, M., REBEILLE, F. (2001) The glycine decarboxylase system: a fascinating complex. Trends Plant Sci 4 (3), 167-176

DUNLAP, J.R. & BINZEL, M.L. (1996) NaCl reduces indole-3-acetic acid levels in roots of tomato plants independent of stress-induced abscisic acid. Plant Physiol 112, 379-384

DUNWELL, J.M., KHURI, S., and GANE, P.J. (2000) Microbial relatives of the seed storage proteins of higher plants: conservation of structure and diversification of function during evolution of the cupin superfamily. Microbiol Mol Biol Rev 64 (1), 153-179

Literatur

128

ECKHARDT, N.A. (2001) New insights into auxin biosynthesis. Plant Cell 13, 1-3

EKLÖF, S., ASTOT, C., BLACKWELL, J., MORITZ, T., OLSSON, O. AND SANDBERG, G. (1997) Auxin-Cytokinin interactions in wild-type and transgenic tobacco. Plant Cell Physiol 38, 225-235

ELLIOT, M.C., STOWE, B.B. (1971) Distribution and variation of indole glucosinolates in woad (Isatis tinctoria L.). Plant Physiol 48, 498-503

EMANUELE, J.J., HEASLEY, C.J., and FITZPATRICK, P.F. (1995) Purification and characterization of the flavoprotein tryptophan 2-monooxygenase expressed at high levels in Escherichia coli. Arch Biochem Biophys 316, 241-248

ERDMANN, N. and SCHIEWER, U. (1971) Tryptophan-dependent indole-acetic acid biosynthesis from indole, demonstrated by double-labeling experiments. Planta 97, 135-141

FARMER, E.E. and RYAN, C.A. (1992) Octadecanoid precursors of jasmonic acid activate the synthesis of wound-inducible proteinase inhibitors. Plant Cell 4, 129-134

FEYERABEND, M. and WEILER, E.W. (1989) Photoaffinity labeling and partial purification of the putative plant receptor for the fungal wilt-inducing toxin, fusicoccin. Planta 178, 282-290

FITZPATRICK, P.F. (2001) Substrate dehydrogenation by Flavoproteins. Acc Chem Res 34, 299-307

GALLATI, H. und PRACHT, I. (1985) Peroxidasen aus Meerrettich: Kinetische Studien und Optimierung der Peroxidase-Aktivitätsbestimmung mit den Substraten H2O2 und 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidin. J Clin Chem Clin Biochem 23, 453-460

GLAWISCHNIG, E., TOMAS, A., EISENREICH, W., SPITELLER, P., BACHER, A., GIERL, A. (2000) Auxin biosynthesis in maize kernels. Plant Physiol 123, 1109-1119

GODDIJN, O.J.M., DE KAM, R.J., ZANETTI, A., SCHILPEROORT, R.A., HOGE, J.H.C. (1992) Auxin rapidly down-regulates transcription of the tryptophan decarboxylase gene from Catharantus roseus. Plant Mol Biol 18, 1113-1120

Literatur

129

GOODWIN, P.B. (1978) Phytohormones and fruit growth. In: Letham, D.S., Goodwin, P.B., Higgins, T.J.V. (eds), Phytohormones and related compounds: a comprehensive treatise, vol II, Elsevier/North-Holland, Amsterdam, 175-214

GOPALRAJ, M., TSENG, T.-S., OLSZEWSKI, N. (1996) The Rooty gene of Arabidopsis thaliana encodes a protein with highest similarity to aminotransferases. Plant Physiol 111 (suppl.), 114

GUILLET, G., POURPART, J., BASURCO, J., DE LUCA, V. (2000) Expression of tryptophan decarboxylase and tyrosine decarboxylase genes in tobacco results in altered biochemical and physiological phenotypes. Plant Physiol 122, 933-943

HARTMAN, F.C. and HARPEL, M.R. (1994) Structure, function, regulation, and assembly of D-ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase. Annu Rev Biochem 63, 197-234

HILLEBRAND, H., BARTLING, D., WEILER, E.W. (1998) Structural analysis of the nit2/nit1/nit3 gene cluster encoding nitrilases, enzymes catalyzing the terminal activation step in indole-acetic acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. Plant Mol Biol 36, 89-99

HILLER, A., VAN SLYKE, D. (1933) Determination of ammonia in blood. J Biol Chem 102, 499

HULL, A.K., VIJ, R. and CELENZA, J.L. (2000) Arabidopsis cytochrome P450s that catalyze the first step of tryptophan-dependent indole-3-acetic acid biosynthesis. Proc Natl Acad Sci USA 97 (5), 2379-2384

HUTCHESON, S.W., KOSUGE, T. (1985) Regulation of indole-3-acetic acid production in Pseudomonas syringae pv. savastanoi. Purification and properties of tryptophan-2-monooxygenase. J Biol Chem 260 (10), 6281-6287

IGOSHI, M., YAMAGUCHI, I., TAKAHASHI, N., HIROSE, K. (1971) Plant growth substances in the young fruit of Citrus unshiu. Agr Biol Chem 35, 629-631

INOHARA, N., SHIMOMURA, S., FUKUI, T. and FUTAI, M. (1989) Auxin-binding protein located in the endoplasmic reticulum of maize shoots: molecular cloning and complete primary structure. Proc Natl Acad Sci USA 86, 3564-3568

Literatur

130

JENSEN, O.N., WILM, M., SHEVCHENKO, A., and MANN, M. (1998) Sample preparation methods for mass spectrometric peptide mapping directly from 2-DE gels. In: Methods in Molecular Biology 112, Proteome Analysis Protocols, Link, A.J., Ed., Humana Press, Inc., Totowa, N.J.

JENSEN, R.G. and BAHR, T.J. (1977) Ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase. Annu Rev Plant Physiol 28, 379-408

JONES, A.M. (1994) Auxin-binding proteins. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 45, 393-420

KAWAGUCHI, M., FUJIOKA, S., SAKURAI, A., YAMAKI, Y.T., SYÕNO, K. (1993) Presence of a pathway for the biosynthesis of auxin via indole-3-acetamide in Trifoliata orange. Plant Cell Physiol 34 (1), 121-128

KAWAGUCHI, M., KOBAYASHI, M., SAKURAI, A., SYÕNO, K. (1991) The presence of an enzyme that converts indole-3-acetamide into IAA in wild and cultivated rice. Plant Cell Physiol 32 (2), 143-149

KENDE, H. and ZEEVAART, J.A.D. (1997) The five ‘classic’ plant hormones. Plant Cell 9, 1197-1210

KING, J.J., STIMART, D.P., FISHER, R.H., BLEECKER, A.B. (1995) A mutation altering auxin homeostasis and plant morphology in Arabidopsis. Plant Cell 7, 2023-2037

KLEE, H. J., HORSCH, R. B., HINCHEE, M. A., HEIN, M. B., HOFFMANN, N. L. (1987) The effects of overproduction of two Agrobacterium tumefaciens T-DNA auxin biosynthetic gene products in transgenic petunia plants. Genes & Development 1, 86-96

KOBAYASHI, M., FUJIWARA, Y., GODA, M., KOMEDA, H. and SHIMIZU, S. (1997) Identification of active sites in amidases: Evolutionary relationship between amide bond- and peptide bond-cleaving enzymes. Proc Natl Acad Sci USA 94, 11986-11991

KOBAYASHI, M., GODA, M., and SHIMIZU, S. (1998a) Nitrilase catalyzes amide hydrolysis as well as Nitrile hydrolysis. Biochem Biophys Res Commun 253 (3), 662-666

KOBAYASHI, M., GODA, M., SHIMIZU, S. (1998b) The catalytic mechanism of amidase also involves nitrile hydrolysis. FEBS Lett 439, 325-328

Literatur

131

KOBAYASHI, M., KOMEDA, H., NAGASAWA, T., NISHIYAMA, M., HORINOUCHI, S., BEPPU, T., YAMADA, H., SHIMIZU, S. (1993) Amidase coupled with low-molecular-mass nitrile hydratase from Rhodococcus rhodochrous J1 - Sequencing and expression of the gene and purification and characterization of the gene product. Eur J Biochem 217, 327-336

KOBAYASHI, M., SHIMIZU, S. (1994) Versatile nitrilases: Nitrile-hydrolysing enzymes. FEMS Microbiol Lett 120, 217-224

KOGA, J., SYÕNO, K., ICHIKAWA, T. and ADACHI, T. (1994) Involvement of L-tryptophan aminotransferase in indole-3-acetic acid biosynthesis in Enterobacter cloacae. Biochem Biophys Acta 1209, 241-247

KUTZ, A., MÜLLER, A., HENNIG, P., KAISER, W.M., PIOTROWSKI, M. and WEILER, E.W. (2002) A role for nitrilase 3 in the regulation of root morphology in sulphur-starving Arabidopsis thaliana. Plant J 30 (1), 95-106

LAEMMLI, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685

LECLERE, S., TELLEZ, R., RAMPEY, R. A., MATSUDA, S. P. T., BARTEL, B. (2002) Characterization of a family of IAA-amino acid conjugate hydrolases from Arabidopsis. J Biol Chem 277, 20446-20452

LEHMAN, A., BLACK, R., ECKER, J.R. (1996) HOOKLESS1, an ethylene response gene, is required for differential cell elongation in the Arabidopsis hypocotyls. Cell 85, 183-194

LETHAM, D.S., GOODWIN, P.B. and HIGGINS, T.J.V. (eds) (1978) Phytohormones and related compounds: a comprehensive treatise. Elsevier/North-Holland Biomedical Press, Amsterdam, Netherlands

LIBBERT, E., FISCHER, E., DRAWERT, A. and SCHRÖDER, R. (1970) Pathways of IAA production by plants and their epiphytic bacteria: a comparison. Plant Physiol 23, 278-289

LJUNG, K., HULL, A.K., KOWALCZYK, M., MARCHANT, A., CELENZA, J., COHEN, J.D. and SANDBERG, G. (2002) Biosynthesis, conjugation, catabolism and homeostasis of indole-3-acetic acid in Arabidopsis thaliana. Plant Mol Biol 50, 309-332

Literatur

132

MACDONALD, H. (1997) Auxin perception and transduction. Plant Physiol 100, 423-430

MAGIE, A.R., WILSON, E.E., KOSUGE, T. (1963) Indoleacetamide as an intermediate in the synthesis of indole acetic acid in Pseudomonas savastanoi. Science 141, 1281-1282

MANULIS, S., SHAFIR, H., EPSTEIN, E, LICHTER, A., BARASH, I. (1994) Biosynthesis of indole-3-acetic acid via the indole-3-acetamide pathway in Streptomyces spp. Microbiology 140, 1045-1050

MARTIN, J., HARTL, F.U. (1997) Chaperone-assisted protein folding. Curr Opin Struc Biol 7 (1), 41-52

MASUCCI, J.D. and SCHIEFELBEIN, J.W. (1994) The rhd6 mutation of Arabidopsis thaliana alters root-hair initiation through an auxin- and ethylene-associated process. Plant Physiol 106 (4), 1335-1346

MCKINNEY, M.M., PARKINSON, A. (1987). A simple, non-chromatographic procedure to purify immunoglobulins from serum and ascitesfluid. Journal of Immunological Methods 96, 271 – 278

MELHADO, L.L., PEARCE, C.J., D’ALARCAO, M. and LEONARD, N.J. (1982) Specifically deuterated and tritiated auxins. Phytochemistry 21 (12), 2879-2885

MICHALCZUK, L., RIBNICKY, D.M., COOKE, T.J., COHEN, J.D. (1992) Regulation of indole-3-acetic acid biosynthetic pathways in carrot cell cultures. Plant Physiol 100, 1346-1353

MIKKELSON, D.M., HANSEN, C.H., WITTSTOCK, U., and HALKIER, B.A. (2000) Cytochrome P450 CYP79B2 from Arabidopsis catalyses the conversion of tryptophan to indole-3-acetaldoxime, a precursor of indole glucosinolates and indole-3-acetic acid. J Biol Chem 275, 33712-33717

MILES, E.W., KAWASAKI, H., AHMED, S.A., MORITA, H., MORITA, H., NAGATA, S. (1989) The beta subunit of tryptophan synthase. Clarification of the roles of histidine 86, lysine 87, arginine 148, cysteine 170, and cysteine 230. J Biol Chem 264, 6280-6287

MILLER, C.O., SKOOG, F., OKUMURA, F.S., VON SALTZA, M.H., and STRONG, F.M. (1956) Isolation, structure and synthesis of kinetin, a substance promoting cell division. J Am Chem Soc 78, 1375-1380

Literatur

133

MONOD, J., WYMAN, J. AND CHANGEUX, J. (1965) On the nature of allosteric transitions: a plausible model. J Mol Biol 12, 88-118

MOORE, T., C. (1989) In: Biochemistry and physiology of plant hormones. 2nd Edition; Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin, London, Paris, Tokyo, Hong Kong.

MÜLLER, A. (1999) Untersuchungen zur Auxin-Biosynthese in Arabidopsis thaliana [L.] Heynh. Dissertation, Ruhr-Universität Bochum

MÜLLER, A. and WEILER, E.W. (2000a) IAA-Synthase, an enzyme complex from Arabidopsis thaliana catalysing the formation of indole-3-acetic acid from (S)-tryptophan. Biol Chem 381, 679-686

MÜLLER, A., HILLEBRAND, H., WEILER, E.W. (1998) Indole-3-acetic acid is synthesized from L-tryptophan in roots of Arabidopsis thaliana. Planta 206, 362-369

MÜLLER, A., WEILER, E.W. (2000b) Indolic constituents and indole-3-acetic acid biosynthesis in the wild-type and a tryptophan auxotroph mutant of Arabidopsis thaliana. Planta 211, 855-863

MURASHIGE, T. and SKOOG, F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tabacco tissue cultures. Physiol Plant 15, 473-497

NONHEBEL, H.M., COONEY, T.P., SIMPSON, R. (1993) The route, control and compartmentation of auxin synthesis. Aust J Plant Physiol 20, 527-539

NORMANLY, J. (1997) Auxin metabolism. Physiol Plant 100, 431-442

NORMANLY, J., BARTEL, B. (1999) Redundancy as a way of life – IAA metabolism. Curr Opin Plant Biol 2, 207-213

NORMANLY, J., COHEN, J.D., FINK, G.R. (1993) Arabidopsis thaliana auxotrophs reveal a tryptophan-independent biosynthetic pathway for indole-3-acetic acid. Proc Natl Acad Sci USA 90, 10355-10359

Literatur

134

NORMANLY, J., GRISAFI, P., FINK, G.R., BARTEL, B. (1997) Arabidopsis mutants resistant to the auxin effects of indole-3-acetonitrile are defective in the nitrilase encoded by the NIT1 gene. Plant Cell 9, 1781-1790

NORMANLY, J., SLOVIN, J.P. and COHEN, J.D. (1995) Rethinking auxin biosynthesis and metabolism. Plant Physiol 107, 323-329

O’FARRELL, P.H. (1975) High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem 250, 4007-4021

OHMIYA, A., TANAKA, Y., KADOWAKI, K. and HAYASHI, T. (1998) Cloning of genes encoding auxin-binding proteins (ABP19/20) from peach: Significant peptide sequence similarity with germin-like proteins. Plant Cell Physiol 39 (5), 492-499

OSSWALD, S., WAJANT, H. and EFFENBERGER, F. (2002) Characterization and synthetic applications of recombinant AtNIT1 from Arabidopsis thaliana. Eur J Biochem 269 (2), 680-687

ÖSTIN, A., KOWALYCZK, M., BHALERAO, R. P., SANDBERG, G. (1998) Metabolism of indole-3-acetic acid in Arabidopsis. Plant Physiol 118, 285-296

PALME, K., HESSE, T., CAMPOS, N., GARBERS, C., YANOFSKY, M.F. and SCHELL, J. (1992) Molecular analysis of an auxin binding protein gene located on chromosome 4 of Arabidopsis. Plant Cell 4, 193-201

PAN, P., DUNN, M.F. (1996) beta-Site covalent reactions trigger transitions between open and closed conformations of the tryptophan synthase bienzyme complex. Biochem 35 (15), 5002-5013

PASQUALI, G., GODDIJN, O.J.M., DE WAAL, A., VERPOORTE, R., SCHILPEROORT, R.A., HOGE, J.H.C., MEMELINK, J. (1992) Coordinated regulation of two indole alkaloid biosynthetic genes from Catharantus roseus by auxin and elicitors. Plant Mol Biol 18, 1121-1131

PAWELEK, P.D., CHEAH, J., COULOMBE, R., MACHEROUX, P., GHISLA, S. and VRIELINK, A. (2000) The structure of L-amino acid oxidase reveals the substrate trajectory into an enantiomerically conserved active site. EMBO J 19 (16), 4204-4215

Literatur

135

PETERSEN, B.L., CHEN, S., HANSEN, C.H., OLSEN, C.E., HALKIER, B.A. (2002) Composition and content of glucosinolates in developing Arabidopsis thaliana. Planta 214 (4), 279-295

PHELPS, R.H. and SEQUEIRA, L. (1967) Synthesis of indoleacetic acid via tryptamine by a cell-free system from tobacco terminal buds. Plant Physiol 42, 1161-1163

PIOTROWSKI, M., SCHÖNFELDER, S. and WEILER, E.W. (2000) The Arabidopsis thaliana isogene NIT4 and its orthologs in tobacco encode β-cyano-L-alanine hydratase/nitrilase. J Biol Chem 276, 2616-2621

POLLMANN, S. (1999) Reinigung und Charakterisierung einer Indol-3-essigsäure Synthase aus Arabidopsis thaliana (L.) HEYNH. Diplomarbeit, Ruhr-Universität Bochum

PRESCOTT, A.G., JOHN, P. (1996) Dioxygenases: Molecular structure and role in plant metabolism. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 47, 245-271

RADWANSKI, E.R., BARCZAK, A.J., LAST, R.L. (1996) Characterization of tryptophan synthase alpha subunit mutants of Arabidopsis thaliana. Mol Gen Genet 253, 353-361

REINTANZ, B., LEHNEN, M., REICHELT, M., GRESHENZON, J., KOWALCZYK, M., SANDBERG, G., GODDE, M., UHL, R., and PALME, K. (2001) bus, a bushy Arabidopsis CYP79F1 knockout mutant with abolished synthesis of short-chain aliphatic glucosinolates. Plant Cell 13, 351-367

RIDDLE, V.M. and MAZELIS, M. (1964) A role for peroxidase in biosynthesis of auxin. Nature 202, 391-392

RIDDLE, V.M. and MAZELIS, M. (1965) Conversion of tryptophan to indoleacetamide and further conversion to indoleacetic acid by plant preparations. Plant Physiol 40, 481-484

ROJO, E., SHARMA, V.K., KOVALEVA, V., RAIKHEL, N.V., FLETCHER, J.C. (2002) CLV3 is localized to the extracellular space, where it activates the Arabidopsis CLAVATA stem cell signaling pathway. Plant Cell 14 (5), 969-977

Literatur

136

ROMANO, C.P. COOPER, M.L. and KLEE, H.J. (1993) Uncoupling auxine and ethylene effects in transgenic tobacco and Arabidopsis thaliana plants. Plant Cell 5, 181-189

ROSS, J.J., O’NEILL, D.P., SMITH, J.J., KERCKHOFFS, L.H.J. and ELLIOTT, R.C. (2000) Evidence that auxin promotes gibberellin A1 biosynthesis in pea. Plant J 21, 547-552

SACHS, J. (1887) Lectures in plant physiology. Clarendon Press, Oxford

SAMBROOK, J, FRITSCH, E.F. & MANIATIS, T. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual (2nd ed.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press

SAOTOME, M., SHIRAHATA, K., NISHIMURA, R., YAHABA, M., KAWAGUCHI, M., SYONO, K., KITSUWA, T., ISHII, Y., NAKAMURA, T. (1993) The identification of indole-3-acetic acid and indole-3-acetamide in the hypocotyls of Japanese cherry. Plant Cell Physiol 34, 157-159

SCHÄGGER, H., CRAMER, W.A., VON JAGOW, G. (1994) Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Analytical Biochemistry 217 (2), 220-230

SCHALLER, F., WEILER, E.W. (1997) Molecular cloning and characterization on 12-oxo-phytodienoate reductase from Arabidopsis thaliana, an enzyme of the octadecanoid signaling pathway. J Biol Chem 272, 28066-28072

SCHARF, K.-D. & NOVER, L. (1982) Heat-shock-induced alterations of ribosomal protein phosphorylation in plant cell cultures. Cell 30 (2), 427-437

SCHMIDT, R.C., MÜLLER, A., HAIN, R., BARTLING, D., WEILER, E.W. (1996) Transgenic tobacco plants expressing the Arabidopsis nitrilase II enzyme. Plant J 9, 683-691

SCHRÖDER, G., WAFFENSCHMIDT, S., WEILER, E.W. and SCHRÖDER, J. (1984) The T-region of Ti plasmids codes for an enzyme synthesizing indole-3-acetic acid. Eur J Biochem 138, 387-391

SEKIMOTO, H., SEO, M., DOHMAE, N., TAKIO, K., KAMIYA, Y., and KOSHIBA, T. (1997) Cloning and molecular characterization of plant aldehyde oxidase. J Biol Chem 272 (24), 15280-15285

Literatur

137

SEKIMOTO, H., SEO, M., KAWAKAMI, N., KOMANO, T., DESLOIRE, S., LIOTENBERG, S., MARION-POLL, A., CABOCHE, M., KAMIYA, Y., KOSHIBA, T. (1998) Molecular cloning and characterization of aldehyde oxidases in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol 39, 433-442

SEO, M., AKABA, S., ORITANI, T., DELARUE, M., BELLINI, C., CABOCHE, M., KOSHIBA, T. (1998) Higher activity of an aldehyde oxidase in the auxin-overproducing superroot1 mutant of Arabidopsis thaliana. Plant Physiol 116, 687-693

SKERRA, A. (1994) Use of the tetracycline promoter for the tightly regulated production of a murine antibody fragment in Escherichia coli. Gene 151, 131-135

SKOOG, F. and TSUI, C. (1948) Formation of adventitious shoots and roots in tobacco. Am J Bot 35, 782-787

SONGSTAD, D.D., DE LUCA, V., BRISSON, N., KURZ, W.G.W., NESSLER, C.L. (1990) High levels of tryptamine accumulation in transgenic tobacco expressing tryptophan decarboxylase. Plant Physiol 94, 1410-1413

SOUBRIER, F., LEVY-SCHIL, S., MAYAUX, J.F., PETRE, D., ARNAUD, A., CROUZET, J. (1992) Cloning and primary structure of the wide-spectrum Amidase from Brevibacterium sp. R312: high homology to the amiE product from Pseudomonas aeruginosa. Gene 116 (1), 99-104

SPREITZER, R.J., SALVUCCI, M.E. (2002) RUBISCO: Structure, Regulatory Interactions, and Possibilities for a Better Enzyme. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 53, 449-475

STUDIER, E.W. (1973) Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels. J Mol Biol 79, 237-248

SWARUP, R., PARRY, G., GRAHAM, N., ALLEN, T. and BENNETT, M. (2002) Auxin cross-talk: integration of signaling pathways to control plant development. Plant Mol Biol 49, 411-426

TAKAHASHI, N., YAMAGUCHI, I., KONO, T., IGOSHI, M., HIROSE, K., SUZUKI, K. (1975) Characterization of plant growth substances in Citrus unshiu and their change in fruit development. Plant Cell Physiol 16, 1101-1111

Literatur

138

THIMANN, K.V. (1977) Hormone action in the whole life of plants. Univ. of Massachusetts Press, Amherst.

THIMANN, K.V. and MAHEDEVAN, S. (1958) Enzymatic hydrolysis of indoleacetonitrile. Nature 181, 1466-1467

THIMANN, K.V., MAHADEVAN, S. (1964a) Nitrilase. I. Occurrence, preparation and general properties of the enzyme. Arch Biochem Biophys 105, 133-141

THIMANN, K.V., MAHADEVAN, S. (1964b) Nitrilase. II. Substrate specificity and possible mode of action. Arch Biochem Biophys 107, 62-68

TOBEÑA-SANTAMARIA, R., BLIEK, M., LJUNG, K., SANDBERG, G., MOL, J.N.M., SOUER, E., and KOES, R. (2002) FLOOZY of petunia is a flavin mono-oxygenase-like protein required for the specification of leaf and flower architecture. Genes Dev 16 (6), 753-763

TOBWIN, H., STRAEHELIN, T., GORDON, J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamid gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci 76, 4350-4354

TRUELSEN, T.A. (1973) Indole-3-pyruvic acid as an intermediate in the conversion of tryptophan to indole-3-acetic acid. II. distribution of tryptophan transaminase activity in plants. Physiol Plant 28, 67-70

UMHAU, S., POLLEGIONI, L., MOLLA, G., DIEDERICHS, K., WELTE, W., PILONE, M.S., and GHISLA, S. (2000) The x-ray structure of D-amino acid oxidase at very high resolution identifies the chemical mechanism of flavin-dependent substrate dehydrogenation. Proc Natl Acad Sci USA 97 (23), 12463-12468

VAUCLARE, P., DIALLO, N., BOURGUIGNON, J., MACHEREL, D., DOUCE, R. (1996) Regulation of the expression of the glycine decarboxylase complex during pea leaf development. Plant Physiol 112, 1523-1530

VENIS, M.A., NAPIER, R.M., BARBIER-BRYGOO, H., MAUREL, C., PERROT-RECHENMANN, C. and GUERN, J. (1992) Antibodies to a peptide from maize auxin-binding protein have auxin agonist activity. Proc Natl Acad Sci USA 89, 7208-7212

Literatur

139

VORWERK, S., BIERNACKI, S., HILLEBRAND, H., JANZIK, I., MÜLLER, A., WEILER, E.W., PIOTROWSKI, M. (2001) Enzymatic characterization of the recombinant Arabidopsis thaliana nitrilase subfamily encoded by the NIT2/NIT1/NIT3-gene cluster. Planta 212, 508-516

VOSS, S. and SKERRA, A. (1997) Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification. Protein Eng 10, 975-982

WEILER, E.W. (1980) Radioimmunoassays for the differential and direct analysis of free and conjugated abscisic acid in plant extracts. Planta 148, 262-272

WEILER, E.W. (1981) Radioimmunoassay for pmol-quantities of indole-3-acetic acid for use with highly stable [125I]- and [3H]-IAA derivatives as radiotracers. Planta 153, 319-325

WEILER, E.W. (1986) Plant hormone immunoassays based on monoclonal and polyclonal antibodies. In: Immunology in Plant Science, H.F. Linskens, E.F. Jackson, eds. Springer Verlag, Berlin, 1-17

WEILER, E.W., SCHRÖDER, J. (1987) Hormone genes and the crown gall disease. Trends Biochem Sci 12, 271-275

WENT, F.W. and THIMANN, K.V. (1937) Phytohormones. Macmillan, New York

WIGHTMAN, F. (1962) Metabolism and biosynthesis of indole-3-acetic acid and related indole compounds in plants. Can J Bot 40, 689-718

WINKLER, R.G., FRANK, M.R., GALLBRAITH, D.W., FEYEREISEN, R., FELDMANN, K.A. (1998) Systematic reverse genetics of transfer-DNA-tagged lines of Arabidopsis: isolation of mutants in the cytochrome P450 gene superfamily. Plant Physiol 118, 743-750

WINTER, A. (1966) A hypothetical route for the biogenesis of IAA. Planta 71, 229-239

Literatur

140

WRIGHT, A.D., SAMPSON, M.B., NEUFFER, G.M., MICHALCZUK, L., SLOVIN, J.P., COHEN, J.D. (1991) Indole-3-acetic acid biosynthesis in the mutant maize orange pericarp, a tryptophan auxotroph. Science 254, 998-1000

YOKOTA, T. (1997) The structure, biosynthesis and function of Brassinosteroids. Trends in Plant Science 2(4), 137-143

ZENK, M.H. (1961) 1-(Indole-3-acetyl)β-D-glucose, a new compound in the metabolism of indole-3-acetic acid in plants. Nature 191, 493-494

ZHAO, Y., CHRISTENSEN, S.K., FANKHAUSER, C., CASHMAN, J.R., COHEN, J.D., WEIGEL, D., CHORY, J. (2001) A role for flavin monooxygenase-like enzymes in auxin biosynthesis. Science 291, 306-309

Anhang

141

Anhang A

Nukleinsäure- und abgeleitete Aminosäuresequenz der, im Rahmen dieser Arbeit,

klonierten cDNA-Fragmente

i. YUCCA

Anhang

142

ii. AMI1

Anhang

143

iii AMI2

Anhang

144

Anhang B

Homologievergleich bekannter Amidasen bzw. amidaseähnlicher Proteine. Pflanzliche

Proteine sind fett unterlegt. Der Verwandtschaftsgrad ist entsprechend angegeben.

145

Danksagung

Nun ist es vollbracht und mir bleibt nur noch diese eine Seite, um meinem Dank Ausdruck

zu verleihen.

Ganz besonders danken möchte ich meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. E.W. Weiler für

sein Vertrauen, das er mir mit der Überlassung des Themas entgegengebracht hat. Zudem

möchte ich mich für die Gewährleistung optimaler Arbeitsbedingungen, seine

fortwährende Diskussionsbereitschaft sowie sein großes Interesse am Fortgang dieser

Arbeit bedanken.

Herrn PD Dr. J.-D. Schwenn danke ich für die Übernahme des Korreferates.

Meinen wissenschaftlichen Dank richte ich an Axel Müller, der mir stets zur Seite stand

und insbesondere bei analytischen Problemen eine große Hilfe war und Markus

Piotrowski, ohne dessen Kooperationsbereitschaft die massenspektrometrischen

Proteinanalysen nicht möglich gewesen wären.

Persönlich möchte ich mich bei meinem studentischen Helfer und S-Blöckler Daniel Neu

bedanken, der mir durch sein freundliches Wesen, sein Interesse und seine Zuverlässigkeit

viel Freude bereitete. Sabine Schönfelder, Julia Förster und Tim Janowitz danke ich für die

nette Arbeitsatmosphäre im Labor 3/29. Steffen Reinbothe danke ich für die wahrhaft

„meisterliche“ Unterweisung in Bezug auf die zweidimensionale Gelelektrophorese und

die vielen fruchtbaren Diskussionen. Des weiteren danke ich allen anderen Mitarbeitern

des Lehrstuhls für Pflanzenphysiologie für ihre Unterstützung.

Ganz besonders bedanke ich mich bei Florian Schaller und Alexandra Kutz für die vielen

inspirierenden Gespräche und die kritische Durchsicht dieses Manuskripts.

Zuallerletzt möchte ich es nicht versäumen, meiner ganzen Familie für ihre Unterstützung

und anspornenden Worte zu danken. Ohne ihre Hilfe wäre es mir sicherlich bedeutend

schwerer gefallen, mich nach experimentellen Rückschlägen neu zu motivieren.

146

Lebenslauf

Name: Stephan Pollmann

Geburtsdatum: 18. Februar 1970

Geburtsort: Gelsenkirchen

Eltern: Karl-Heinz und Hannelore Pollmann, geb. Kosczinski

Familienstand: verheiratet

Erlangung der Hochschulreife: Mai 1989

Studium der Biologie:

Oktober 1993 – Dezember 1999 an der Ruhr-Universität Bochum. Abschluß des

Biologie-Hauptstudiums mit der Diplomarbeit:

„Reinigung und Charakterisierung einer Indol-3-

essigsäure Synthase aus Arabidopsis thaliana (L.)

HEYNH.“ am Lehrstuhl für Pflanzenphysiologie

unter der Betreuung von Prof. Dr. E.W. Weiler.

Seit Januar 2000 Doktorand und wissenschaftlicher Mitarbeiter am

Lehrstuhl für Pflanzenphysiologie an der Ruhr-

Universität Bochum (Prof. Dr. E.W. Weiler).