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E L E K T R O P H O R E S E Makromoleküle (Proteine, DNA, RNA) besitzen Ladungen und können daher in einem elektrischen Feld wandern.

Die Wanderungsgeschwindigkeit ist abhängig von: (a) Größe der LADUNG (b) GRÖSSE des Moleküls (c) FORM des Moleküls (d) KRAFT des elektrischen Feldes

Damit Strom fließen kann, müssen Trägermedium (Gel) und Probenmaterial in Puffer (Elektrolyt) gelöst bzw. damit gesättigt sein.

Der Stromfluß wird durch Elektrolyse aufrecht erhalten, die an den Elektroden (in getrennten Pufferreservoirs) stattfindet.

Kathode: 2 e- + 2 H2O 2 OH- + H2

Anode: H2O 2 H+ + 1/2 O2 + 2 e-

Trägermedien:

☯ Polyacrylamid-Gele für Proteine, DNA ☯ Agarose-Gele für DNA, RNA ☯ Papier für andere geladene Moleküle

Zur Herstellung von PAA-Gelen benötigt man:

Acrylamid

N,N'-Methylenbisacrylamid (Vernetzer), BIS

Katalysatorsystem, das freie Radikale (SO4-).

erzeugt:

(a) (NH4)2S2O8 (Ammoniumperoxodisulfat, Ammoniumpersulfat, APS)

(b) TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin)

S2O82- 2 (SO4-). TEMED

© O.Meixner – Elektrophorese - Handout 1

Polymerisation: APS setzt in Lösung Sulfat-Radikale frei. APS-Lösungen sind daher nicht beständig

(nur rund 1/2 Stunde verwendbar!).

TEMED bewirkt als Katalysator eine explosionsartige Freisetzung der Radikale.

Die Radikale greifen die Doppelbindungen des Acrylamid und des Bisacrylamid an und führen zur Radikalkettenpolymerisation.

Die Eigenschaften des PAA-Gels hängen von Polymerisationsgrad und Vernetzungsgrad ab, sie werden definiert durch den T-Wert und C-Wert.

V100).ba(T +

=ba

100.bC+

= T ... Total-Acrylamid-Konzentration (%)

C ... Vernetzungsgrad (%) wobei: a ... Masse Acrylamid in g

b ... Masse Bisacrylamid in g V ... Volumen in ml

Disk-PAGE (Diskontinuierliche Polyacrylamid-Gelelektrophorese Zwei verschieden hoch vernetzte Acrylamidgele mit unterschiedlichen pH-Werten werden übereinander geschichtet. (1) Sammelgel: Oben; weitmaschig; dient zur Konzentrierung der Proteine (scharfe Banden, gute Trennung)

Sammelgelpuffer: meist TRIS/HCl, pH 6,8

(2) Trenngel: unten; engmaschig; dient zur Probenauftrennung.

Trenngelpuffer meist TRIS/HCl, pH 8,8

Elektrodenpuffer: hat entweder den gleichen pH-Wert wie der

Trenngelpuffer oder einen etwas niedrigeren; er enthält darüberhinaus GLYCIN.


Konzentrierung der Proben im Sammelgel: ☯ Glycin ist im Sammelgel ein ungeladenes Zwitterion.

☯ Chlorid, Proteine und Glycin wandern in Richtung Anode.

☯ Zwischen "Leitionen" (Chlorid) und "Folgeionen" (Glycinat) wird aufgrund ihrer

unterschiedlichenBeweglichkeiten (Chlorid-hoch; Glycinat-niedrig) ein

Potenzialgradient (Feldstärkegradient zwischen Chlorid und Glycinat) aufgebaut, in

welchem sich die Proteine nach ihren Beweglichkeiten gestapelt orientieren.

☯ "Stacking effect" Glycinat


Proteine Chlorid

☯ Der so geordnete Stapel wandert mit konstanterGeschwindigkeit (Isotachophorese)

bis zum Trenngel.

☯ Im Trenngel wird Glycinat geladen (pH-Wert höher), überholt die Proteine, weil klein

und schnell; der Feldstärkegradient bricht dadurch zusammen; die Proteine werden

durch die engen Maschen des Trenngels stark gebremst und langsam voneinander

getrennt.

SDS-Elektrophorese Durch Beladung der Proteine mit SDS (Sodium Dodecyl Sulphate; anionisches Detergenz) werden die Eigenladungen effektiv überdeckt; es entstehen anionische Micellen mit konstanter Nettoladung: 1,4g SDS pro g Protein.

O-Na+

O S-O-(CH2)11-CH3

O Natriumdodecylsulfat

Dabei wird SDS vorwiegend an die hydrophoben Regionen der Proteine angelagert.

Folge: die Auftrennung erfolgt nur mehr nach Molekülgrösse und nicht mehr nach Ladung. Meistens wird SDS-Elektrophorese mit reduzierenden Agentien kombiniert, um auch noch die Molekülformen auszugleichen: Spaltung von H- und Disulfidbrücken, Auflösung der Tertiärstruktur. (a) Nichtreduzierende SDS-Behandlung z.B. für Serumproteine, um die Proteinkonformation zu erhalten

Nach Behandlung mit SDS, aber ohne reduzierendes Agens:


(b) Reduzierende SDS-Behandlung Ist die häufigste Anwendung; es kommt zur Streckung der Polypeptide, zur Bildung

von Micellen und zum Ausgleich der Molekülformen. CH2-SH


CH-OH CH2-SH

CH-OH CH2-OH

CH2-SH Mercaptoethanol

DTT, Dithiothreitol

(c) Reduzierende SDS-Behandlung mit Alkylierung Besserer und dauerhafter Schutz der SH-Gruppen durch Alkylierung mit

Jodacetamid; die Banden werden schärfer

AUSWERTUNG einer SDS-PAGE PAGE = Polyacrylamid-Gelelektrophorese

die SDS-PAGE (meist als SDS-disk-PAGE) dient zur Trennung von Proteinen zur Reinheitsprüfung von Proteingemischen zur Molmassebestimmung von Proteinen

Bestimmung der Molmasse von Proteinen Neben den Probeproteinen wird auf das Gel eine Molmasse-Standardlösung (Gemisch verschiedener Proteine mit bekannten Molmassen) aufgetragen.

Kathode

L a u f r i c h t u n g

- - - - P r o b e n - - -

Stan

dard

1

Stan

dard

2

+ Anode

Nach Entwicklung des Gels und Färbung der Banden werden die Laufstrecken der Standardproteine abgemessen und gegen die Molmassen (besser: log MW) in eine Eichgerade eingezeichnet. Daraus können die Molmassen der Probenproteine berechnet werden. Die Angabe der Protein-Molmassen erfolgt in D (Dalton) oder kD (Kilo-Dalton) = [g/mol]

Kalibrationsgerade - Molmasse

3,500

4,000

4,500

5,000

5,500

6,000

0 10 20 30 40 50 60

Laufstrecke (mm)

log

MM

John Dalton, 1766-1844, englischer Naturforscher; machte grundlegende Untersuchungen zur Atomtheorie; Ihm zu Ehren wird die Einheit der Atommasse im englischsprachigen Raum mit Dalton benannt. In der Proteinchemie hat sich das D bzw. kD als Einheit der Molmasse durchgesetzt.


Isoelektrische Fokussierung IEF Elektrophoretische Trennung von Proteinen aufgrund unterschiedlicher isoelektrischer Punkte. Im Elektrophoresegel ist dabei ein pH-Gradient aufgebaut.

Kathode

- Anode

+ pH 10 pH 3

Der pH-Gradient wird durch Einbettung von Polyampholyten (aliphatische Polyamino-polycarbonsäuren) in die Gelmatrix (meist Polyacrylamid) erzielt.

pH 14 Je mehr Polyampholyte, desto linearer

viele Polyampholyte ist der Gradient.

1 Polyampholyt

pH 0

TRENNSTRECKE

Kathode-

Anode +

Allgemeinformel der Ampholyte:

Beim Anlegen eines elektrischen Feldes wandern die Ampholyte bis zum Erreichen ihres IEP und bauen dadurch einen stabilen pH-Gradienten auf. Erst danach wird die Probe aufgetragen und „fokussiert“ (= wandert zu ihrem IEP).

Auswertung

☯ Analog zur Auswertung der SDS-PAGE.

☯ Standard: "pI-Standard" (Mischung von Standard-Proteinen mit bekannten IEP's).

☯ Eichgerade (Standard-pI-Werte gegen Laufstrecken) dient zur Ermittlung der IEP's der Probenproteine

☯ pI = IEP = pH-Wert, bei dem Ladungsneutralität herrscht.


Nachweis von Makromolekülen in Elektrophorese-Gelen

(1) Färbung mit Coomassie-Brillantblau

oder anderen Proteinfärbemitteln (z.B. Fluoreszenzfarbstoffe wie Fluorescamin). Quantitative Auswertung mittels Densitometer (Durchlichtscanner) möglich.

(2) Silberfärbung von Proteinen hochempfindliche Methode für niedrigste

Konzentrationen. (Prinzip wie S/W-Fotografie)

(3) Autoradiographie

Zum Nachweis radioaktiver Substanzen bzw. radioaktiv

markierter Makromoleküle (meist DNA-Nachweis); Einsatz bei

Verbrechensaufklärung, in der Gerichtsmedizin etc.

(4) Protein-Blotting mit anschließendem Immunstaining ("W-Blot")

Transfer von Makromolekül-Banden eines Elektrophoresegels auf die Oberfläche

einer immobilisierenden Membran. Anschließend Detektierung spezifischer Banden

mit Antikörpern (Immunstaining).



BB LL OO TT TT II NN GG PRINZIP:Übertragung von Makromolekülen aus Elektrophoresegelen auf eine Membran ohne Verlust des Originalmusters. Die Moleküle werden auf der Membran adsorbiert (immobilisiert, da nicht mehr beweglich) und können dort entweder

☯ nachgewiesen oder ☯ von dort weiterverarbeitet werden:

Zwischenschritt für Proteinsequenzierung bzw. Elutionsmethode für weitergehende Analysen)

VORGANGSWEISE:

1 TRANSFER vom Gel auf die Membran.

2 BLOCKIERUNG der unbesetzten Bindungsstellen auf der Membran.

3 SPEZIFISCHE LIGANDENBINDUNG ("SONDEN") oder spezielle FÄRBETECHNIKEN als Nachweisreaktion.

Anwendungen :

PROTEIN-BLOTTING: WESTERN-Blot NUCLEINSÄURE-BLOTTING: SOUTHERN-Blot: für DNA

NORTHERN-Blot: für RNA

Vorteile:

(1) Moleküle sitzen an der Oberfläche (und nicht diffus in einem Gel); geringste Mengen sind daher leicht nachweisbar.

Elektrophoresegel

Konzentrierungseffekt; hohe Empfindlichkeit: pg bis ng-Bereich

Blotting-Membran

(2) Für die vorausgehende Elektrophorese sind nur kleine Mengen von (häufig sehr teuren) Untersuchungslösungen notwendig.

(3) Moleküle können leicht mit großmolekularen und leicht detektierbaren Liganden (z.B. Antigene,Antikörper, Lectine, Nucleinsäuren) verbunden werden.

(4) Schnelle Analyse

(5) Leichte Handhabung und Lagerung der Transfers

TRANSFERMETHODENKapillarblotting Diffusionsblotting Vakuumblotting Elektrophoretisches Blotting (Elektroblotting)

1. DIFFUSIONSBLOTTING Blotfolie wird auf das Gel gelegt; Transfer erfolgt nur durch Diffusion; Beschleunigung der Diffusion durch Temperaturerhöhung ("Thermoblotting"); keine quantitativen Transfers möglich. 2. KAPILLARBLOTTINGStandardmethode (DNA, RNA und Proteine); Puffer wird durch Kapillarwirkung aus einer Vorratswanne durch das Gel und die Blotfolie in einen Stapel trockener Filterpapierschichten gesaugt; Dauer: ca. 12-20 Stunden.

Filterpapier-Stapel

Blotting-Membran

Elektrophorese-Gel

3. VAKUUMBLOTTINGAnstelle des saugenden Papiermaterials wird ein schwaches Vakuum angelegt;

Nachteil: Elektrophoresegele können kollabieren Vorteile: Dauer nur 3-4 Stunden quantitativ (kein Rücktransfer) höhere Bandenschärfe kostensparend (weniger Lösungen und Filterpapier)

4. ÜBERDRUCKBLOTTING Wie Vakuumblotting, nur statt Vakuum wird Überdruck angelegt.

4. ELEKTROBLOTTING (Elektrophoretisches Blotting) Fast ausschließlich für Proteine; werden durch Isotachophorese transportiert.

Man unterscheidet die Methoden: Tankblotting Semidry-Blotting


TANKBLOTTING:

Gel und Blotfolie werden zwischen Filterpapiere und Schwammtücher geklemmt.

Dieses "Gelsandwich" wird in einen horizontalen Puffertank

(mit Platinelektroden) eingehängt und an ein Power-Supply angeschlossen.

Vorteil: Quantitativer Transfer möglich. Nachteil: Puffer muß gekühlt werden. Dauer: Zwischen 1 und 10 Stunden

(über Nacht)

SEMIDRY-BLOTTING:

Gel und Membran befinden sich zwischen horizontal angeordneten Graphitplatten (Elektroden); zwischen Gel/Membran und den Graphitplatten sind Filterpapierblätter und/oder Schwämme (mit Puffer getränkt) angeordnet.

Vorteile: Einfacher, billiger, schneller (20 min bis 1 h); Kühlung nicht notwendig


BLOTTING-MEMBRANEN (-Folien):

Nitrocellulose ist die meist verwendete Membran. Vorteile:

☯ Proteine können reversibel gefärbt werden (danach Entfärbung und spezifischer Nachweis).

☯ Präparative Techniken möglich (Proteine später wieder eluierbar).

Nachteile: Limitierte Bindekapazität und schlechte mechanische Stabilität.

Weitere gebräuchliche Membanen sind:

Polyvinylidendifluorid-Membranen, (PVDF), "TEFLON" Diazobenzyloxymethyl- (DBM-) und Diazophenylthioether- (DPT-) Papiere Nylonmembranen Ionenaustauschermembranen

BLOCKIEREN - Abdecken der unbesetzten Bindungsstellen auf der Blot-Folie.

Protein Blockier-Reagenz Protein

Verwendung makromolekularer Substanzen, die an der nachfolgenden Nachweisreaktion nicht beteiligt sein dürfen. für Nukleinsäuren:

"Denhardts Puffer" (BSA, Ficoll, Polyvinylpyrrolidon, EDTA, NaCl, TRIS/HCl pH 7,0; 10-50 mg/l heterologe DNA)

für Proteine: z.B. BSA (2%) oder Magermilchpulver oder Fischgelatine oder Casein oder Hämoglobin

DETEKTION - Identifizierung der Banden:

(a) Färbemethoden: Zur Begutachtung des gesamten Elektrophorese-Profils VOR dem Blockieren und den spezifischen Nachweisen.

Nukleinsäuren: Ethidiumbromid (wird meist schon dem Elektrophorese-Gel vor der Trennung zugegeben; Banden sind dann im UV-Licht sichtbar.

Proteine: Reversible Färbung mit Ponceau S


(b) Spezial-Detektion: (Beispiele)

Hybridisierung: ☯ Komplementäre DNA oder RNA ("Sonden") wird an die DNA oder RNA auf der Folie

gebunden.

☯ Nachweis durch radioaktiv oder nichtradioaktiv markierte Sonden (z.B. Digoxigenin oder Biotin-Streptavidin).

Immunblotting: (im Laborjargon der "W-Blot")

Sondierung nach einzelnen Proteinzonen mit spezifischen Antikörpern.

Sichtbarmachung: Bindung eines weiteren Antikörpers: enzymgekoppelter Sekundär- Antikörper.

Das Immunblotting erfolgt nach dem "ELISA"-Prinzip:

Enzyme Linked Immunosorbent Assay = Enzym gebundener Immunnachweis

Der "richtige" ELISA-Test wird in

Mikrotiterplatten durchgeführt.

ELISA-Platte


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