Arch. exper. Path. u. Pharmakol., Bd. 221, S. 323--327 (1954).

II. Medizinische Universit~tsklinik Frankfurt a.M. (Direktor: Prof. Dr. M. G.~.NSSLEN).

Eine chromatographische Methode zur Bestimmung des Isonicotins~iurehydrazid.

Von FRED LEUSCHNER.

(Eingegan!len am 28. November 1953.)

Seit der Einff ihrung des Isonicotinsiiurehydrazids (INH) in die Thera- pie der Tuberkulose wurde ffir die quant i tat ive Best immung in bio- logischen Fli issigkeiten eine Reihe yon Verfahren vorgeschlagen, deren Ergebnisse aber zum grol~en Teil aus methodischen Grfinden nicht ver- gleiehbar sind.

S. It. RUBI u. Mitarb., V. MORVILLO U. S. GARATTINI und M. SCHOOG zeigten chemische BestimmungsmSglichkeiten, mit denen der Pyridinring am INH nach- gewiesen wird. J. M. KELLY U. R. B. POET, G. RUBINO U. N. BRACCO, O. WOLLEN- BERG und H. WOJAHN U. E, WEMP~ entwickelten Bestimmungsverfahren der Hydrazingruppe des INH. Den chemischen Methoden stehen die mikrobiologischen von F. J. GEKS, K. LIEBERMEISTER und R. BSNICKE gegenfiber. Wahrend die methodischen Fehler der chemischen Verfahren im wesentlichen in der unzureichen- den Extraktion und unspezifischen F~rbung zu suchen sind, ruben sie bei den mikrobiologischen Arbeitsgangen in Mel]fehlern, Schwankungen des N~hrboden- substrates, in ver~nderten Eigensehaften des Teststammes und in der Unspezifitgt durch tuberkulostatiseh wirksame Stoffwechselprodukte des INH.

Der yon nns eingeschlagene Weg benutzt die vertei lungschromato- graphische Trennung zur Best immung des INH. Zum qual itat iven Nach- weis der INH-Flecke auf einem Vergleichschromatogramm kann die grtin- blaue Fluorescenz im UV-Licht nach BrCN-Behandiung herangezogen werden. Dieser qualitative Nachweis gestattet bei Beriicksichtigung der Rf-Werte eine Abtrennung von verwandten Substanzen. Zur quant i~- t iven Best immung wurde das E luat mit p-Dimethylaminobenzaldehyd angef~rbt und im Stufenphotometer gemessen.

Experimentelles Vorgehen.

Fiir die Verteilungschromatographie wurde die aufsteigende, zweidimensionale Methode ausgewahlt. Schleicher & Schtill-Papier Nr. 2043b wird in Quadrate yon 29 29 cm GrS~e geschnitten, an 2 aufeinanderstol]enden Seiten 4 cm yore Rand mit den Startlinien markiert, zu einem Zylinder gerollt und Rand zu Rand gen~ht. Um das Papier zu reinigen, lieBen wir das erste LSsungsmittelgemisch vorerst allein im Papier aufsteigen und dann an der Luft wieder abtrocknen. Die zu unter- suehende Substanz wird mit Mikropipetten am Kreuzungspunkt der Startlinien i

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aufgetragen. Es empfiehlt sich, bei Benutzung der sogenannten Leukocytenpipet- ten (mit einem Volumen yon 20 mm a) eine Eichung mit Quecksilber vorzunehmen. Die aufzutragende Substanz soll so bemessen sein, dab sie naeh grSSenordnungs- mal3iger Schatzung 1--25/2g INH enth~lt. Man soll wegen der GrSBe des Start- fleekes niemals mehr als 20 mm a AnalysenlSsung auf einmal auftragen, aueh wenn eine grSBere Menge benStigt wird. Man tr~gt dann in mehreren Portionen auf, in- dem dazwischen immer wieder bei 80 C getrocknet wird. Die P~piere werden bei 20--22 C im LSsungsmittelgemisch der ersten Dimension entwickelt, bei 60 C ge- trocknet, umgen~ht und in das Gemisch fiir die zweite Dimension gebracht. Als Entwicklungskammern werden Glaszylinder mit ebenem Boden und luftdichtem Versehlu$ benutzt. Die Glaszylinder sind mit einer 0,5 cm hohen Schicht LSsungs- mittel aufgefiillt. Die notwendige Sattigung der Kammeratmosph~re wird erreieht, indem das LSsungsmittelgemisch 24 Std vor Beginn der Entwicklung in den Zy- linder gefiillt wird. Zur Entwickhng der Chromatogramme fanden wir eine Reihe von polaren LSsungsmittelgemisehen geeignet. Als Mal~stab der Verwendbarkeit wurde

1. die Trennung des INH mit scharfen Substanzfleeken yon der Isonieotia- s~ure, vom Isonieotins~tureamid und den entsprechenden Nicotinsaurederivaten,

2. die Trennung yon Substanzen aus Ham und Ham- oder Serumextrakten naeh J. M. KELLY U. R. B. POET, die mit p-Dimethylaminobenzaldehyd farbstoff- bildend sind, und

3. die fehlende Beeinflussung der F~rbemethoden dureh mSglieherweise naeh dem Trocknen der Chromatogramme zuriiekgebliebene Spuren yon LSsungsmittel angesehen.

Fiir die Trennung erwiesen sich zun/~chst Kombinationen yon heterocyclischen Verbindungen (a-Picolin, Pyridin, Tetrahydrofuran, Dioxan) mit Wasser gut ge- eignet, jedoch st6rten zurtiekgebhebene Spuren die Naehweismethoden, bei denen BrCN und p-Dymethylaminobenzaldehyd verwendet wird. Aliphatische Alkohole erfiillten dagegen alle Bedingungen.

Am gtinstigsten erwiesen sich folgende Kombinationen: Erste Dimension: Wasserges~ttigter sekund/~rer Butylalkohol: sekund/~rer Butylalkohol wird im Sehtittelzy!inder mit mindestens 12,5~/o Wasser gemischt, gut durchgeschfitelt und bis zur Trennung der beiden Phasen stehen gelassen. Zur Chromatographie wird die obere Phase verwendet. - - Zweite Dimension: Ein Gemisch aus 56 Teilen Isoamyl- alkohol, 24 Teilen Aceton, 6 Teilen Eisessig und 14 Teilen Wasser: Isoamylalkohol reinst der Firma Merck, Darmstadt, wird 2mal mit den gleichen Volumen 10~/oiger Salzs~ure, 2real mit 10/oiger Natronlauge und 3mal mit destilliertem Wasser aus- gesehfittelt; Aceton der Firma Merck, Darmstadt, fiir chromatographische Zwecke ; Eisessig pro analysi.

Die Entwicldung wird solange fortgefiihrt, bis die LSsungsmittel ungefi~hr 1 cm unter den oberen Rand des Papieres gestiegen sind. Die Front wird markiert und das Papier bei 80 C getrocknet. Die qualitative Charakterisierung auf den Chromato- grammen kann mit folgenden Farbreaktionen vorgenommen werden (LEvsCE~ER) :

1. Fluoreseenz mit BrCN und Natronlauge, 2. Gelbf/~rbung mit p-Dimethylaminobenzaldehyd und 3. Rotf/~rbung mit Selendioxyd.

Zur Abtrennung der Isonieotins/~ure, der INicotinsaure und der dazugehOrigen Amide eignet sich die BrCN-o-Phenylendiamin-Methode (LEusc~N~R). Die quali- tative Bestimmung muf~ auf einem Vergleichschromatogramm vorgenommen werden,

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denn keine der F~rbemethoden gestattet eine sp~tere fehleffreie quantitative Messung.

In den beschriebenen LSsungsmittelgemischen ergaben sich folgende Rr-Werte (Tab. 1). Im Ham erniedrigte sich der Rf-~Vert des INH um etwa 10/o .

Tabelle 1.

Isonieotinsaurehydrazid . . . Isonieotins~ure . . . . . . . Isonieotinsiiureamid . . . . . Nicotins~ure '. . . . . . . . Nicotins~ureamid . . . . . .

wasserges~ittigter Isoamylalkoholgemisch sekund~irer Butylalkohol

1. Dimension 2. Dimension

0,69-~0,74 0,26--0,32 0,77--0,79 0,33--0,37 0,79

0,64--0,67 0,50--0,54 0,54--0,56 0,62-4),65 0,58~0,59

Quantitative Auswertung.

Aus den Chromatogrammen wird jeweils das Papierstfickchen her- ausgeschnitten, auf dem im Vergleichschromatogramm INH mit den oben beschriebenen Me~hoden oder bei Konzentrationen fiber 20 ~g auf dem zu eluierenden Chromatogramm im UV-Licht als dunkler Fleck qualitativ nachgewiesen werden kann. ])as Papierstiickchen kann groB genug gehalen werden, denn INH-freies Untersuchungsmaterial zeigt in den fraglichen Chromatogrammabschnitten keine die Farbereaktionen stSrenden Substanzen. Bei unserer Versuchsanordnung wurde in der Regel ein Feld ausgeschnitten, das in beiden Richtungen den doppelten Durchmesser des qualitativ nachgewiesenen Fleckes besaB. Die Papier- s~iicke werden zerschnitten und durch 10 min Schfitteln in n/10 Salzs~ure eluiert. 1 ml davon wird in ein Zentrifugenglas fiberffihrt, mit 0,2 ml 6 n Salzs~ure und 0,3 ml p-Dimethylaminobenzaldehyd-Reagens versetzt (0,6 g p-Dimethylaminobenzaldehyd in 10 ml ~thylalkohol und 1 ml 12 n Salzs~ure gelSst; das Reagens mul~ t~glich frisch bereitet werden), ffir 45 rain in ein siedendes Wasserbad gebracht und dann mit n/10 Salz- s~ure bis zur 2 ml-Marke aufgeffillt. Gelegentlich vorhandene Papier- fasern werden abzentrifugiert. Die Bestimmung erfolgt im AnschluB an die Abkiihlung im PVLYRIcH-Stufenphotometer mit Filter S 41 unter Verwendung yon 5 cm-lY[il~rokfivetten gegen die LeerlSsung eines gleich grol~en, substanzfreien Papierstfickes aus den Chromatogrammabschnit- ten unterhalb der Startlinien. Der sich mit p-Dimethylaminobenzaldehyd bildende Farbstoff (PEsEz u. PETIt) folgt dem L~BERTschen Absorp- tionsgesetz. Der Extinktionsmodul ffir eine LSsung, die in 1 ml n/10 Salz- s~ure 2 ~g INH enthielt, betrug bei unserer Versuchsanordnung 0,18. Im Eluat aus den Papierchromatogrammen lassen sich sicher 0,5 ~g

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INH/ml n/10 Salzs~ure nachweisen. Bei Bestimmungen von Staadard- 15sungen ergaben sich die in Tab. 2 angeffihrten Resultate.

Tabelle 2.

Zahl der Aufgetragene Wledergefundene Bestimmungen /~Ienge INH Menge in % Verlust in% aVerlust in %

22 5--20/~g M ~ 90,3 M ~ 9,7 4,7

Bestimmung im Harn.

Der ttarn wir4 im Kfihlschrank gesammelt und gegebenenfalls mit 2 n Salzs~ure oder 2 n Natronlauge auf pH 6--7 eingestellt. Der Harn kann unmi~telbar auf die Chromatogramme aufgetragen werden, wenn- gleich sich die Verwendung des neutralisierten salzsauren Extraktes nach J. 1VI. K~Lzy u. R. B. PO~T als fehlerfreier erwiesen hat. Die Menge ist von der grSBenordnungsmgBigen INH-Konzentraion abh~ngig zu machen. Werden Konzentrationen fiber 25 ~g INH/ml Ham oder Ex- trakt erwartet, so sind 5--100 mm a auf jeweils 2 Chromatogramme auf- zutragen. Bei Konzentrationen unter 25 ~g INH/ml werden 30 ml im Wasserstrahlvakuum sehr vorsichtig zur Trockne eingedampft, 2mal mit 1 ml Wasser aufgenommen, auf 3 ml mit Wasser aufgefiillt und zentrifu- giert. Das klare Oberstehende wird ffir die Chromatographie gebraucht. Beim raschen Eindampfen im Vakuum kSnnen Verluste bis 20% ein- treten. Einengung des Harnes fiber das 10fache hinaus erwies sich fiir die Ausbildung eluierbarer Flecke als ungeeignet.

Die chromatographische Bestimmung yon INH im unmittelbar auf- getragenen Itarn zeigte die in Tab. 3 zusammengefai~ten Ergebnisse.

Tabelle 3.

Zahl der Peroral Versuchs- verabreichte personen Dosis

8 10 mg/kg

Harnausscheidung in % der verabreichten Dosis

9--24

I gesamt

in 24 Std Stundcn

0 - -313- -6 6--9 I

M=7,4 M=0,8 M=0,11 h

2,6 a = 0 ,3 a = 0,1 /

Besprechung.

0 M ~ 8,3 0 a ~ 2,7

Der papierchromatographische Trennungsgang ist geeigaet, aus den Stoffwechselprodukten des INtt eine Hauptfraktion abzutrennen, die mit dem freien INH identisch zu sein scheint, wenngleich geringffigige Verkiirzung des R~-Wertes und Verschiebung des Farbtones der BrCN- Fluorescenz des INH die MSglichkeit fiir das Vorliegen einer Verbindung des INtt erw~gen lassen (beide kSnnten auch als Effekt der Begleitsub- stanzen gedeutet werden). Dem Harn nachtr~glich in ~quivalenten Men- gen hinzugeffigtes INH verh~lt sich wie die ausgeschiedene Form. In

Chromatographisehe Methode zur Bestimmung des Isonicotins~turehydrazid. 327

einer Reihe polarer LSsungsmittelgemische mit Dioxan, Benzol, Tetra- hydrofuran, g-Picol in und Pyr id in erwies sich die F rakt ion unter Zu- grundelegung der oben angefi ihrten qual i tat iven Nachweismethoden als einheitl ich.

Freie Isonicotins~ure, Isonicot ins~ureamid und die entsprechenden Nicot insi iureverbindungen lassen sich gut abtrennen.

Die Ungenauigkeit tier l~Iethode wird bei Beri icksichtigung der Feh- lerbreite yon StandardlSsungen mit maximal ~25~o einzusch~tzen sein. Die Fehlerquel len sind bei Konzentrat ionen unter 25 #g INH/ml Ana- lysenlSsung haupts~chl ich in der E inengung der LSsung, bei hSheren Konzentrat ionen in Adsorpt ionsver lusten auf dem Papier und seltener in stSrenden Harnbeimengungen zu suchen.

Zusammenfassung,

Es wird eine papierehromatographische Methode zur Best immung des INH vorgeschlagen. Terti~re Nicotins~ure- und Isonicot ins~urederivate werden durch BrCN-Fluorescenz bzw. BrCN-o-Phenylendiamin-F~rbung differenziert. Nach Eluierung des INH wird mi% p-Dimethylaminobenz- a ldehyd quant i tat iv best immt.

Literatur, B6NICKE, R. : Arch. exper. Path. u. Pharmakol. 216, 490 {1952). - - GEKS, F. J. :

Klin. Wsehr. 1952, 1041. - - KELLY, J. M., u. R. B. POET: Am. Rev. Tbc. 65, 484 {1952). - - LEUSCHNER, F. : Naturwissenschaften 40, 554 (1953). - - LIEBERMEISTER, K. : Tuberkulosearzt 6, 492 (1952). - - MORWLLO, V., u. S. GARATTINI: Seduta della Soc. Lomb. di Sci. Med. e Biol. sulla idrazide dell' acido isonicotinico 1952. - - PESEZ, M., ll. A. PETIT: Bull. Soc. Chim. 14, 122 (1947). - - Ref. Chem. Zbl. 1948, I, 1438. - - RUBIN, S. H., L. DREKTER, J. SCHEINER U. E. DE R.ITTER: Diseases of the Chest 21, 439 (1952). - - RUEINO, G., u. N. BRACCO: Minerva med. (Torino) 1952, 2. - - ScEoo~, M.: Mfinch. med. Wsehr. 1952, 2136. --WOJAHN, H., u. E. WEMPE: Arzneimittel-Forsch. 8, 191 (1953). - - WOLLENBERG, O.: Klin. Wsehr. 1952, 906.

Dr. FRED LEUSCttNER, Erlangen, Membacher Weg 15.