J. SCItORMiILLER und R. FRESENIUS: Fr~ktionierung enzymatischer Hydrolysate 279

2. Um eine i~hnliehe Vitaminanreieherung im Weizen und Roggen zu erzielen, sind zun~iehst kleine Mengen im Laboratorium unter wechselnden Versuehsbedingun- gen hydrothermiseh behandelt worden. Dureh ein besonderes Bohrverfahren hat sich ein sehalenfreies Endospermmehl gewinnen lasse. Der Thiamin-, Nieotins/~ure- und Mineralstoffgehalt der Endospermmehle ist ermittelt worden.

3. Feuehtigkeitsgehalt, Temperatur und Behandlungszeit, unter denen eine Vit- amin- und Mineralstoffanreieherung im Endosperm eintritt, sind festgelegt worden.

4. Mahlversuche mit behandelten Weizen- und goggenpartien sowie Unter- suehungen des Vitamin- und Mineralstoffgehaltes der Passagenmehle haben die often- bar anf Diffusion beruhende Ver~nderung der Vitamin- und Minera]stoffverteilung im hydrothermisch behandelten Getreide best~tigt.

Fraktionierung enzymatischer Hydrolysate von ~- und fl-Casein

Voll

J. SCttORM()LLER und R. IPRESENIUS *

Mitteilung aus dem Institut /'gr Lebensmittelchemie und Lebensmitteltechnologie der Teehnischen Universit~it Berlin**

Mit 2 Textabbildungen

(Eingegangen am 1. Dezember 1960)

Fiir die Versorgung des mensehliehen Organismus spielt, vor allem im Sguglings- alter, das Casein der Milch eine wesentliehe Rolle. In ihm ist der Phosphor fast aus- sehlieBlieh an die Hydroxyaminos/~ure Serin, daneben in geringem AusmaB wahr- seheinlieh aueh an Threonin gebunden. Casein selbst ist dureh die Untersuehungen yon MELnANDE~ 1 als ein zusammengesetztes Proteid erkannt worden, aus dem der ge- nannte Autor drei elektrophoretiseh unterseheidbare Komponenten abtrennen konnte, die er als z<-, ~- und y-Casein bezeiehnete. Sp/~ter zeigte sieh, dag s-Casein in weitere, als K- nnd c%-Casein untersehiedene Fraktionen getrennt werden kann ~, die ftir die Coagulation des Caseins yon Bedeutung sind 3. Eine weitere Komponente, das X-Casein, wurde als Begleiter des K-Caseins aufgefunden und isoliert 4. Die mengen- mggig wiehtigsten Komponenten sind im Kuhmileheasein s-Casein mit 75%, fi- Casein mit 22% und y-Casein mit rund 5~o des Gesamtproteids 5. Untersuehungen

* Dissertation R. F~ESE~US: ,,Fraktionierung enzymatischer Hydrolysate yon ~- und G- Casein und das Caleiumbindungsverm6gen der Fraktionen". Inaug.-Diss. Teehn. Univ. Berlin 1960 (D 83).

** Die Untersuehungen wurden durch eine Saehbeihil~e yon Freunden der Teehnischen Universit~t Berlin in dankenswerter Weise gefhrdert.

1 MELLANDER, O. Upsala L~karaforen Fhrhandl. 52, 107 (1947). - - ~V[ELLANDER, 0., U. C. H. DE VERDIEX: Aeta Soc. Med. Upsaliensis 57, 218 (1952)

MCMEEKIN, T. L., M. L. GXOVES and N. J. Hire: Abstr. Pap. Amer. chem. Soc. April 1957, S. 65. C. - - WAUG~, D. t~., and P. H. yon HlrrEC: J. Amer. chem. Soc. 78, 4576 (1956). - - SULLIVAN, R. A., M. E. I[~ITZI)ATRIK n. E. K . STANTON: Nature (Lond.) 186, 616 (1959). - - MCMEEKIN, T. L., N. J. Hlrr u. M. L. G~ovEs: Biochim. biophys. Acts 83, 35 (1959).

8 CARLSTR6M, G. A.: Agrie. Seand. 4, 357 (1955). - - GARNIER, J.: Intern. Milehwirtseh. Kongr. 3, 1448 (1959).

¢ LONG, J . , Q. YAN WINKLE U. J . A. GOULD : J . Dairy Sei. 41, 317 (1958). 5 HIPP, N. J . , M. L. GROVES, J . H. CUSTER U. T. L. MC]V[EEKIN: J . Da i ry Sei. ~o, 272 (1952).

280 J. SCHO~ffLL~R und R. I~RESE~IUS *

fiber die AminosKurenzusammensetzung, fiber endsti~ndige Gruppen, Kohlenhydrat- komponenten und Aminosiiuresequenzen sowie fiber Molekulargewichte und mole- kularen Zustand der einzelnen Caseinkomponenten 1 braehten weitere Einblieke in die Struktur dieser Proteide.

Die enzymatisehe Spaltung des Caseins besitzt erhebliehes Interesse im Rahmen ern~hrungsphysiologischer Fragestellungen, daneben aueh ffir die bei der Labung auftretenden Ver~nderungen und nicht zuletzt ffir das Sehieksal des Caseins bei enzymatischen Reifungsprozessen. Es nimmt deshalb nicht wunder, dab gerade in jfingster Zeit yon versehiedenen Autoren versueht wurde, dureh Untersuchung enzymatischer Spaltprodukte weitere Informationen fiber die Zusammensetzung des Caseins und dessen Sehieksal beim fermentkatalysierten Abbau zu gewinnen. Dureh Hydrolyse mit proteolytischen Fermenten erh~lt man Peptidgemisehe, aus denen Phosphopeptide durch FKllung als schwerl5sliche Pb- oder Ba-salze oder mittels chromatographiseher und elektrophoretischer Methoden angereichert werden, l~ber die Darstellung yon Phosphopeptidfraktionen oder Phosphopeptonen geben ver- sehiedene Ubersiehten Auskunft 2. Bei den meisten der untersuchten ,,Phospho- .p.eptone ''8 handelt es sich offenbar urn Gernisehe rnehrerer Phosphopeptide, worauf OSTE•BERG 4 ausdrficklich hinweist. PETERSON U. Mitarb. 5 gelang es zum ersten Mal, aus fi-Casein dureh kurzzeitige Hydrolyse rnit Trypsin und anschlieBende Fraktio- nierung an Ionenaustauschern oder fraktionierte Ba-Salz-FKllung ein Phosphopeptid zu isolieren, dessen weitgehende, wenn aueh nicht vSllige Einheitliehkeit mit Hilfe der Zonenelektorphorese nachgewiesen wurde. P~T~RSO~ zeigte weiterhin, dab lang- ausgedehnte tryptische tIydrolyse die ZerstSrung der endst£ndigen Arginylgruppen zur Folge hat. So ist verst~ndlich, dal3 PA~TLITSC~EO und GRONDIG 6 bei einer Hydro- lysedauer yon 5 Tagen Bin Phosphopeptid erhielten, das kein Arginin (und Lysin) enthielt. In einer kfirzlich erschienenen Arbeit berichten die genannten Autoren fiber ein aus elektrophoretiseh einheitlichern ~-Casein dureh Pepsinabbau erhaltenes Phosphopeptid vom Mol.-Gew. 34797. In letzter Zeit hat S]RID 8 fiber die Trennung derartiger Peptide an Ionenaustauschern berichtet. Wit haben in Untersuchungen unseres Arbeitskreises 9 zur Feinfraktionierung von Phosphopeptidgemischen aus reifendem Sauermilchk~se die Ablenkungs-Papierelektrophorese herangezogen. BEN- NICH U. Mitarb. 1° isolierten nach kurzzeitiger Trypsinbehandlung yon ~-Casein rnittels Elektrophorese ein einheitliehes Phosphopeptid, dem sie auf Grund der Analyse folgende Zusammensetzung zuschrieben: Asp3, Glug, Glyl, Alae, Vale, Ileua, Mete, Sers, Thrl, Pr%, Lysl_~, (PQ)~. Dabei sind Asparagins£ure und Lysin endsti~ndig. Die Sequenz wurde allerdings nicht errnittelt. Wie oben erw~thnt, sind die Phosphat-

Literatur in der eingangs zitierten Dissertation. 2 McM]~EK%~, T. L., u. B. D. POLIS: Advanc. Protein Chem. 5, 208 (1949).- ~ELLA~DER, O. :

Zit. S. 279, Anm. 1. - - PERL~A~, G. E. : Advanc. Protein Chem. 10, 1 (1955). 3 AOREN, G., U. J. GLOMSET: Acta Chem. Seand. 7, 1071 (1953). - - DAMODARA~, M., u.

B. V. R.CMACHA~DRAN: Biochem. J. 35, 122 (1941).- RIMI~GTO~, C. : Biochem. J. 35,321 (1941). 0ST~RBERO, 1~. : Arkiv for Kemi 13, 409 (1959).

5 PETERSON, R. F., L. W. NAUMAk~-:N U. T. L. MCMEEKIN: J. Amer. chem. Soc. 80, 95 (1958). PANTLITSCHKO, M., u. E. GR?)NDIG: Mh. Chem. 89, 274; 489 (1958).

7 GRi)NDIO, E., u. M. PANTLITSCHKO: Mh. Chem. 90, 891 (1959). s ST~D, L.: Acta Chem. Scand. 13, 1787 (1959); dort auch weitere Litcratur.

SC~OR~iiLLER, J., G. BRESSAU U. H.-D. BELITZ: Diese Z. 108, 346 (1958). - - SCHORMULLER, J., u. K. LEH~n~: Diese Z. 110, 363 (1959). - - SC~OR~i2LLE~, J., K. LEHMANN U. H.-D. B~LITZ: Diese Z. 111, 180 (1960).

10 BEkN~ICH, H., B. JOI~AI#SSON U. R. (~STERBERG." Act& Chem. Scand. 13, 1171 (1959).

Fraktionierung enzymatischer Hydrolysate yon ~- undfl-Casein 281

gruppen im Casein zum grSBten Teil esterartig mit Serin 1, in geringem MaBe auch mit Threonin 2 verbunden. Seit den Arbeiten y o n PERLMAN~ 3, die fiir eine Phosphat- bindung neben Monoestern auch Diester des Typus N-P-O und 0-P-O verantwort- lieh macht, hat die Frage nach der Art soleher Bindungen zu einer intensiven Be- sch~ftigung mit diesem Problem geffihrt, ohne dab allerdings von anderen Autoren die genannten Befunde best~tigt werden konnten 4. KELLEY 5 maB den Einbau yon ~s0 aus H2~sO nach Hydrolyse der Phosphatesterbindnngen und schloB aus seinen Versuehen, da~ der Hauptteil des Phosphates als Diester vorliegen mfisse.

Da die im Casein gebundenen Phosphatgruppen nicht gleichmgl~ig auf das Molekfil verteilt sind s, sondern an einzelnen Stellen geh~tuft auftreten, entstehen bei der enzyma- tisehen Hydrolyse auch phosphatreiche Bruehstfieke, die nieht welter yon Proteinasen und Peptidasen angegriffen werden. Erst nach Dephosphorylierung durch Phospha- tasen kann eine weitere Hydrolyse der Peptidmolekfile stattfinden. Es ist bemerkens- wert, da~ Phosphopeptide mit mehreren Phosphatgruppen oft anch von Phosphatasen nicht angegriffen werden 7, so dab es im Darm zu einer Anh~nfung solcher Peptide kommen kann. 1V[ELLA:NDER s billigt den enzymresistenten Phosphopeptiden eine physiologisehe Bedeutung aueh im Hinblick auf die Calciumversorgung zu, da sie Calciumionen komplex zu binden vermSgen und als leicht 15sliche Calcinmkomplexe vom Darm resorbiert werden.

Die kurze, hier gebrachte Literaturfibersieht zeigt, daI~ viele Versuche unter- nommen wurden, sowohl das Gesamteasein wie aueh seine wichtigsten Komponenten unter physiologisehen Bedingungen fermentativ abzubauen und aus den Hydroly- saten ,,Phosphopeptone", besser Gemisehe yon Phosphopeptiden, zu isolieren und zu analysieren. Die wichtige Rolle des Calciums im Casein, insbesondere bei Mecha- nismen der Milchgerinnung sowie bei der obenerw~hnten Calciumresorption im Darm, legt auBerdem nahe, sieh mit dem CaleiumbindungsvermSgen von Phospho- peptiden niiher zu besch~ftigen. LTber die letztgenannte Frage wird in einer folgenden Arbeit berichtet. Die vorliegenden Untersuchungen besch/iftigen sich mit der bilanz- mi~Bigen Erfassung aller Fraktionen, wie sie nach peptischer und tryptischer, unter physiologischen Bedingungen durchgeffihrter Hydrolyse anfallen. Solche Unter- suchungen sind bisher nicht bekannt geworden, obgleich man erwarten kann, dab sie n£here Aufschlfisse fiber den Bau und das Verhalten yon Caseinkomponenten zu liefern verm5gen.

Zur Kliirung dieser Verhiiltnisse wurden zun~chst ~-Casein und fl-Casein nach An- gaben der Literatur dargestellt, beide Caseinkomponenten dann mit reinem Pepsin und Trypsin hydrolysiert, die Hydrolysate fraktioniert und schlieBlich wie im folgenden beschrieben analysiert.

1 LIP)~IA~T, F.: Bioehem. Z. 262, 3 (1933). - - AGREI¢, G., C. H. DE VEI~DIEI~ n. J. GLOMSET: Acta Chem. Scand. ~, 324 (1951).

VERDIE~, C. H. DE: Acta Chem. Scand. 7, 196 (1953). 3 PERL~ANN, G. E.: Nature (Lond.) 174, 273 (1954).

HOFMA~¢, T.: Biochem. J. 69, 139 (1958). - - KAr~AN, E. B., u. M. TELKA: Biochim. biophys. Acta 79, 275 (1959). - - (~STERBERG, R.: Zi~5. S. 280, Anm. 4. - - PA~TLITSCI~KO, ~., U. E. GRUi'~IDIG-" Zit. S. 280, Anm. 6.

5 KELLEY, J. J. : Studies on the dephosphorylation of Casein. Univ. Madison, Wisconsin. Diss. Abstr. 19 (12), 3113 (~[959).

Vgl. z. B. J. SCHOI~Mt~LLER 11. Mitarb. : Zit. S. 280, Anm. 9. 7 SCrZORMffLLE~, J., K. LEnMANN U. H.-D. BELITZ** Zi~. S. 280, Anm. 9. s MELLA~DER, O.: Nutr. Rev. 13, 161 (1955).

282 J. SC~OR~t~5~R und R. FRESENIUS:

Experimenteller Teil

1. Darstellung von g-Casein und h-Casein Zur Darstellung beider Caseinkomponenten wurde nach der von H~P~' u. Mitarb. ~ angegebenen

Methode gearbeitet. Als Ausgangsmaterial dien~e Casein, das nach Hn'~ ~ aus frischer nicht er- hitzter Magermilch durch S~uref~llung gewonnea und, wie in dcr zitierten Literatur angegeben, durch fraktionierte F~llung aus w~l~rigen HarnstofflSsungen aufgearbeitet wurde.

Bezogen auf die Trockensubstanz, enthiel t von beiden so dargestel l ten Pr~tparaten g-Casein 1,04 % P,/~-Casein 0,64 ~o P. Diese Befunde stehen in guter Ubere ins t immung mi t Angaben yon H ~ ~, der in g-Casein 0,98% P, in h-Casein 0,64% P land. Die a tomaren N/P-Verh~ltnisse be t rugen bei g-Casein 35, bei/~-Casein 53. Zur Kon~rolle wurden aul~erdem die Extinktionskoe~fizienten beider K o m p o n e n t e n bei 278 rote ge- messen (Schichtdicke 1 cm, Konzen t r a t i on 1 g Trockensubstanz in 1000 ml Wasser). Gefunden wurden folgende Werte :

g-Casein: 1,066 (HIPP: 1,023) h-Casein: 0,515 (H~r~: 0,50).

2. Hydrolyse yon g-Casein und h-Casein mit Pepsin

Zur Ermittlung des Hydrolysegrades wurde die Zunahme des Aminostickstoffes nach der Methode yon POeE und STEVENS 3 gcmcssen. Das Veffahren wurde zur Bestimmung absoluter Wer~e mit Recht kritisiert~; fiir die hier durchgeffihr~en Relativmessungen ist es jedoch, ins- besondere wegen des geringen Zeitbedarfes, recht gut geeignet. In Anlehnung an die Arbeiten yon MELLANDER ~ und GROVES ~ wurden 1,00 g trockenes ~- bzw. h-Casein innerhalb yon 4--5 Std dureh vorsichtige trop~enweise Zugabe yon 0,2 n-N~Ott unter Riihren in L5sung gebracht, wobei durch st~ndige Kontrolle mit der Glaselektrode Sorge getragen war, dal~ der p~-Wer~ nicht fiber 8,0 anstieg. Sodann wurde die L5sung in einem Gul~ unter Schfit~eln zu 5,0 ml 0,3 n-HC1 gegeben, der pH-Wert auf 2,0 eingeste]lt und das Volumen au~ 45 ml gebracht. Die trfibe, opaleseierende L5sung wurde im Thermostatenbad bei 37 ° C gehalten und nach 10 min mit einer 37 o C warmen LSsung yon 10,0 mg kristallisiertem Pepsin (Fa. Mann Res. Labor., New York) in 5 ml Wasser versetzt. Bei st~ndiger pH-Kontrolle und unter Rfihren wurde dutch Zugabe einigcr Tropfen

n-ItC1 der pi~-Wert konstant gehalten.

3 ~ o o

° ~ ~ . o

$0 120 780 2¢0 rain

Abb. 1. Ve~'lau] de~' Hydrol.yse yon ~- und fi-Casein mit Pepsin. © - - © ~-Casein; ©-- -© ~-Casein

Der Zeitpunkt der Zugabe wurde als Start (Zeit 0) angesehen. In bestimmten Zeitintervallen wurden jeweils 5,0 ml zur Aminostickstoffbestimmung cntnommen. Ein Auftreten yon freiem anorganischen Phosphat, geprfift nach der sparer er- wahnten Methode (S. 284), konnte nieht festgestellt werden.

Abb. 1 zeigt den Verlauf der Pep- sinhydrolyse flit g- u n d h-Casein.

Aus dem Diagramm geht hervor, dab nach etwa 3 Std die Zunahme des Amino-N nur noch gering, die

t tydrolyse also zum grSl~ten Tell beendet ist. g-Casein wird in s tarkerem Ma~ gespalten als h-Casein. Die Hydrolyse grSl]erer g- und fl-Caseinmengen inpr i ipara t ivem

1 HIrr, N. J., M. L. GRovEs, J. H. CUSTER U. T. L. ~¢[cMEEKI~: Zit. S. 279, Anm. 5. 2 I~IPP, ~. J., M. L. GROVES, J. H. CUSTER U. T. L. ~/[CMEEKIN: J. Amer. chem. Soc. 72,

4928 (1950). 3 PORE, C. G., u. H. F. STEVENS: Biochem. J. 83, 1070 (1939).

Vgl. K. LEgMAn,: Trennung und Charakterisierung yon Phosphopeptiden aus Casein- Abbauprodukten. Inaug. Diss. Teehn. Univ. Berlin 1959 (D 83).

5 ~¢~ELLA~DER, O . : Z i t . S. 279, Anm. 1. 6 GROVES, M. L., N. J. HIPP u. T. L. MOMEEKZN: J. Amer. chem. Soc. 80, 716 (1958).

Fraktionierung enzymatiseher Hydrolysate yon ~- und B-Casein 283

Ausmal3 (20 bzw. 10 g) erfolgte unter den gleiehen Versuehsbedingungen, sie wurde jedoeh naeh 3 Std abgebroehen. Die Hydrolysate wurden alsbald, wit im Absehnitt 4 besehrieben, fraktioniert .

3. Hydrolyse von oc- und B-Casein mit Trypsin In Anlehnung an die Arbeiten yon !~¢[ELLANDER 1 und PETERSON ~ wurde 1,00 g trockenes

a- bzw. B-Casein durch tropfenweise Zugabe yon 0,2 n-NaOH unter stgndigem SchtitioeN bei l~ufender lo~-Kontrolle innerhalb yon 5 Std gelSst, ohne den pH-Wert fiber 8,0 ansteigen zu Iassen. Zuletzt wurde auf Io~ 7,2 eingestellt und nach 2) weiter verfahren. Als Ferment diente krist~llisier- tes Trypsin (Fa. Mann Res. Labor., New York).

Abb. 2 zeigt den Verlauf der tryptischen Hydrolysekurven. Sie steigen innerhalb der ersten 30 min stark an und n~hern sich dann asymptotisch einem Grenzwert. Auch hier wird ~-Casein st/trker gespalten als B-Casein. Die tIydrolyse grSgerer ~- und

.o___o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

• IZO 180 f¢0mig

Abb. 2. Verlau/ der Hydrolyse yon o:- und B-Casein mit Trypsin• © - - © e-Casein; ©---O B-Casein

fl-Caseinmengen ffir praparat ive Zweeke erfolgte nnter den gleiehen Versuehs- bedingungen wie bei Pepsin gesehildert, wurde jedoch naeh 1 Std abgebroehen. Die Hydrolysate wurden alsbald wie ansehlieBend besehrieben fraktioniert.

4. Pralctionierung der Hydrolysate Ziel und Zweck der Fraktionierung war, Peptide verschiedenen Phosphatgehaltes

weitgehend voneinander zu trennen und gleichzeitig dig Mengenverhgltnisse der verschiedenen Fraktionen zu ermitteln. Schlieglich wurden, soweit dies pr/iparativ auf Grund der anfallenden Mengen mSglieh war, die Endfraktionen isoliert und in einer folgenden Arbeit auf ihr relatives CalciumbindungsvermSgen untersucht.

MELLA~DE~ 8 hatte schon 1947 die F£11ung mittels Bleiacetat bei Zimmertempera- tur und p~ 4,7 mit Erfolg zur Trennung phosphathaltiger Peptide benutzt. Die fiber- schfissigen Blei-Ionen entfernte er mit tt2S. Eine weitere sehnelle und einfaehe Fraktionierungsmethode, die zugleich Anhaltspunkte fiber die MolekfilgrSBe liefert, ist die Dialyse durch Cellophan oder andere Diaphragmen. Wit hat ten sie in unserem Arbeitskreis a zur Charakterisierung der MolektilgrSgen yon Phosphopeptidh'aktionen benutzt, wie sie aus reifendem Sauermilchkgse isoliert werden k6nnen. Es darf jedoch nicht verschwiegen werden, dag bei der Dialyse eines Peptidgemisches - - und um ein solches handelt es sich in der Regel - - , dessen einzelne Komponenten nur unerhebliche Unterschiede in der MolekfilgrSBe aufweisen, keine scharfe Trennung erzielt werden kann. Die Trennung ist um so besser, je unterschiedlieher die Molekiil- gr6Ben oder exakter die Wirkungsquerschnitte der Molekfile sind. Bezeichnen wir im folgenden den jeweils unter gleiehen Dialysebedingungen erhaltenen Anteil innerhalb des Dialysiersehlauehes (Dialyser/iekstand) als ,,h6hermolekular" und den naeh augen gewanderten Antefl (Dialysat) als ,,niedermolekular", so hat diese will- kfirliehe Differenzierung nnr bedingten Weft. Sie l~13t jedoch immerhin relative Vergleiehe der einzelnen Fraktionen eines komplexen Ansatzes zu.

Wir haben in nnseren Untersuehungen sowohl Trennverfahren der Fgllung wie der Dialyse in den Verfahrensgang eingearbeitet und weiterhin zur Kennzeiehnung

i ~¢~ELLANDER, O.-" Zit. S. 279, Anm. 1. 2 PETEt~SON, R. F., L. W. ~-AUMANN U. T. L. MCI-~EEKI~-. 3 1V~ELLANDER, O. : EXt. S. 280, Anm. 5.

LEmux~r, K. : Zit. S. 282, Anm. 4.

284 J. SCHOR2CIULLER und R. FRESENIUS:

der Molekfilgr6ge das Verh/tltnis yon Gesamt-Stiekstoff zu Amino-Stickstoff er- mit te l t . Diese Rela t ion er laubt allerdings aueh nur d a n n eindeutige Aussagen, wenn endst/~ndige Aminogruppen oder basischer Stiekstoff des Arginins u n d Hist idins fehlen; sind diese zugegen, so wird der Quot ient zu hoeh ausfallen und l£gt d a n n eine Berechnung der MolekfilgrSl3e nieht zu. Nach unseren Er fahrungen 1 sind Phos- phopeptide der bier un te rsuch ten Art arm an den genann ten basischen Aminosguren und k6nnen daher hinsichtl ich ihrer MolekiilgrSBe auf diese Weise reeht gut ein- gesch/itzt werden. Aus diesen Be t raeh tungen Iolgt, dab Aussagen fiber MolekfilgrSge und Basizit/~t erst d a n n zul/tssig sind, wenn drei Eigenschaften einer Pept idf rakt ion: F~l lbarkei t mi t Pb- Ionen , Dialysierbarkei t und der genannte N /Amino-N- - Quot ient in Betracht gezogen werden. Zur weiteren Charakterisierung haben wir schlieglich noch die a tomaren N/P-Verhgltnisse der einzelnen F rak t ionen ermit tel t .

Ver/ahrensgang In Anlehnung an Arbeiten von ~¢[ELLANDER 2 und an solche unseres Institutes 1 wurde folgen-

dermagen veffahren: die enzymatischen Caseinhydrolysate wurden zun~chst auf pH 4,7 gebracht und ein ausf~llender, als ,,Gelfraktion" (,,2") bezeichneter Niederschlag abzentrifugiert. Das Zentrifugat (,3") wurde mit ges~ttigter Bleiacetatl5sung versetzt und der gebildete Niederschlag durch seharfes Zentrifugieren abgetrennt. Niederschlag (,4") und Zentrifugat (,5") wurden in je 1 1 Wasser gegeben und mit je l0 ml konz. HC1 versetzt, wobei der Niederschlag in L6sung ging. Nach dem Erw~rmen auf 70 ° C wurde fiber Nacht H2S unter Druck eingeleitet. Das aus- gesehiedene PbS wurde auf der Nutsche fiber Kieselgur (Hyflo-Super-Cel, John Mansville Co., New York, USA) abgetrenn~. Die v611ig klaren und farblosen LSsungen wurden im Vakuum (Badtemperatur 40 ° C) auf je 150 ml eingeengt und unter Toluolschutz dreimal bei Zimmer- temperatur gegen Wasser 20 Std dialysiert. Die vereinigten Dialyserfickstiinde und die Dialysate wurden im Vakuum auf etwa 50 ml konzentriert und lieferten die Fraktionen ,,6", ,,7", ,8" und ,9". Diese wurden mit der zehnfachen Volumenmenge Aceton versetzt, die Niedersehl~ige ~b- getrennt und getroclmet.

I m Verlauf der Frak t ion ie rung wurden, wie bereits erw/thnt, alle F rak t ionen auf ihren Gehalt an Stiekstoff u n d Phosphor un te r sueh t und die a tomaren N/P-Verhglt- nisse der F rak t i onen ermittel t . Von den isolierten Pr/~paraten wurden auBerdem Proben zur Bes t immung des Amino-N gezogen u nd der Quot ient Gesamt-N/Amino-N bes t immt . Folgendes Schema veransehaul icht den Gang der Frakt ionierung.

Zur Bestimmung yon Phosphor und Stickstoff in einer Analysenprobe wurden je nach dem PhosphorgehMt ein oder mehrere ml als aliquoter Tefl der Probel6sung enmommen und mit 0,35 ml konz. H2SO~ unter wiederholter Zugabe weniger Tropfen Perhydrol wie iiblich auf- gesehlossen. Von der auf 25 ml gebraehten mineralisierten LSsung wurden 20 ml zur Phosphor- bestimmung naeh FISKE und Sv~AROW 3 in der yon UM~REIT U. Mitarb. ~ beschriebenen Modi- fikation entnommen. Entgegen den Angaben der genanngen Autoren wurde jedoch keine weitere Schwefels~ure zugesetzt, da die L6sung vor der Zugabe der fibrigen Reagentien die erforderliche Menge yon 10 mval H2S04 (± 30%) bereits enthielt. Zur Bestimmung des GesamtstickstoJJs wurde 1 ml der AufsehhB16sung mit n-NaOH gegen p-Nitrophenol neutralisiert und auf 25 ml aufgeffillt. 1 ml dieser LSsung diente zur Stiekstoffbestimmung naeh MOORE und STEIN 5. Die Bestimmung bzw. der Nachweis yon anorganischem Phosphat erfolgte ebenfalls naeh U?CIBREIT U. MitaI'b. (vgl. oben). St5rende Peptide, die mit Molybdat Trfibungen geben, wurden zuvor mit 2 ml 20 vol.-%iger Trichloressigs~ure und 2 ml 10 vol.-%iger Silicowolframs~ure (in n-I-I~SO~) pro 25 ml ausgef~llt und abfiltriert. Die Bestimmung des ~-Amino-Sticksto//s der isolierten Endpro- dukte wurde nach MOORE und STEIN 5 durchgeffihrt.

1 SC~OaMtiLLER, J., u. Mitarb.: Vgl. Zit. S. 280, Anm. 9; Zit. S. 282, Anm. 4. ~V[ELANDER, 0.: Zit. S. 279, ARm. 1.

3 FISKE, C. H., u. Y. SUB~AROW: J. biol. Chem. 66, 375 (1925). 4 UMBREIT, W. W., R. G. BURRIS U. I. F. STAUFER: Manometric Techniques and Tissue

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FrakCionierung enzymatischer Hydrolysate yon ~- und fl-Casein 285

[ ~- oder fl-Casein ,,1" [

I enzymatische Hydrolyse

I $

[ ~Niederschlag ,,2" [

Gel

[ Niederschlag ,,4" [

I Dialyse

Filtrat ,, 3"

I Bleif~llung

]

Ffl tmt . 5 "

] Dialyse

4

5. Analysenergebnisse In den Tabellen 1--4 sind die Analysenergebnisse der Fraktionierung zusammen-

gestellt. Die Angaben ~o N und ~o P sind bezogen auf den eingesetzten Casein- Stickstoff bzw. -Phosphor. (N/P)1 ist das atomare Stickstoff-Phosphor-Verhaltnis der Fraktionen, (N/P)~ bedeutet das Stickstoff-Phosphor-Verh£1tnis der nachAceton- f~llung erhaltenen Pr£parate. Mit I~/A wird der Quotient Gesamt-I~/Amino-N der Pr£parate bezeichnet. Die Bczifferung der Fraktionen nimmt Bczug auf das oben gebrachte Schema.

Tabelle 1. t'ra]~tionierung yon pepsin- behandeltem :¢.Casein

N Nr. %

i 100 2 4,7 3 96 4 12 5 78 6 2,7 7 8,4 8 5,0 9 7

(N/P), (~/Ph

100 34 8,9 18,5

84 3~ - - 50 35 77 - - 15,2 6 6 31 9 7

~ ,2 19 17 2 88 101

Tabelle 2..Fra~ionierung yon pepsin- behanddtem fl-Casein

N/A Nr.

- - 1

10 2 - - 3 - - 4

- - 5

9 6 6 7

10 8 6 9

Tabelle 3. _Fraktionierung von trypsin- behandeltem a-Casein

(:XlPh

100 37 2,1 417

97 29 76 9 18 107 52 8 22 11

~ ,4 48 1 135

1 100 2 24 3 76 4 19 5 52 6 11

87 4!:o 9

(N/P)2 , N/A

334 ]21

5 11

3 12 135 5

Z. L e b e n s m i t t . - U n t e r s u c h . , B a n d 114

N P % %

[ 1oo :1oo 45 9 4 55 i 6

2,1 '41 4,5 5 I 0,02i 0,4 0,35 I 1,7

513,7 1,5 3,0

(NIP), I (N/Ph

56 19

495 10

665

139 908

Tabelle 4. Fraktionierung behandeltem fi-Casein

N ~ P 5~r. % % (I~IP)I (N/P).

1 100 2 30 3 69 4 16 5 50 6 4,6 7 6,4 8 ~,0 9 4

1 ~ 12 547 12

yon trypsin-

100 50 - - 22 68 48 77 44 - - 59 11 18 141 21 11 8 35

2 ,9 8 7 1 167 151

~fA

m

14

1 0

11 19 7

2O

286 J. SCHO~Ii)LLEI¢ und I~. FEESENIUS :

])iskussion der Ergebnisse

a) Uber die Fraktionierung von Phosphopeptonen dureh Pb- oder Ba-salzf/~llung liegen, was N/P-Bilanzen betriffg, nnr wenige Angaben vor. G~ovEs u. Mitarb. 1 erhielten naeh 11/2 -bis 21/2-stfindiger Hydrolyse mig Pepsin bei 30 ° C einige Fraktio- nen, die einen Vergleich mit der yon uns ermittelten Bilanz zulassen, obwohl dort yon den Autoren Ba ++ anstelle yon Pb ++ zur F/tllung des Niedersehlages ,,4" ver- wendet wurde. Die Numerierung entspricht unserem Schema (s. S. 285), die Prozent- angaben beziehen sieh auf eingesetztes Casein (Tab. 5).

PETERSO~ u. Mitarb. 2 isolierten aus fi-Casein, das bei 25°C und PH 7,2 mit 0,33~o Trypsin behandelt war, ein Gel, das 25~o des Gesamt-N vom Casein, jedoch keinen

Phosphor enthielt. Naeh Ansiiuern Tabelle 5 ..... auf pH 4,7 fiel ein weiterer Nieder-

-~ P ~/p seh!ag mit 22% N und 18°/o P, be- yr. % % zogen auf das eingesetzte /?-Casein.

c~-C~sein: 42 11 28 15 b) Die Anreicherung der Phos- 731678 244826 13 phopeptide dutch Bleisalzfgllung

- - war beim peptisehen Abban weniger /?-Casein: 25 21 92 14 gut als bei tryptiseher Hydrolyse;

4 12 5 78--76 5--3 __ aus dem Phosphorgehalt der Frak- tionen ,3" und ,4" erreehnen sich

Werte yon 60~o bzw. 35~o f/it die Pepsinspaltung und solehe yon 78% bzw. 77~o ffir die Trypsinspaltung.

Aus einem Vergleich der fiir die einzelnen Fraktionen ermittelten N/P-Verhi~lt- nisse geht hervor, dab eine Phosphopeptidanreichernng nicht allein durch die Blei- salzfgllung, sondern auch im Gange der Dialyse eintrat, und zwar derart, dab der Dialyserfickstand phosphorreicher war als das Dialysag. Eine weitere wenn aueh nicht erhebliche Anreicherung phosphorhaltiger Peptide fand bei der Acetonfi~llung start, dadurch bedingt, dab ein geringer Teil phosphorarmer Peptide nicht in die Fgllung ging.

c) Die Spaltung des Proteinmolekiils durch Pepsin oder Trypsin verl£uft in grunds/~tzlich verschiedener i~ichtung. Pepsin hydrolysiert nur Peptidbindungen der NtI-Gruppen aromatischer Aminosauren, in unserem Falle also vorzugsweise solche des Phenylalanins und Tyrosins. Trypsin hingegen spaltet nur Peptidbindungen, deren Carboxylgruppe yon Arginin oder Lysin stammt. Demnach kann man summa- risch die Anzahl der Spaltstellen ffir die entsprechende Proteolysenart berechnen, wenn der Gehalt an den genannten Aminos/~uren bekann~0 ist.

Gol~I)o~ u. Mi~arb. a geben liir die genannten Aminos/iuren in :~- und fi-Casein folgende Werte an (Tab. 6).

Somit kSnnten maximal 105 g ~-Casein an 73 Stellen und 105 g fi-Casein an 53 Stellen durch Pepsin gespalten werden, wenn man davon absieht, dab verschiedene in Frage kommende Peptidbindungen infolge Bloekierung durch die N/ihe yon Phosphat- gruppen pepsinresistent sind. Aus der Lage der Hydrolysekurven (Abb. 1) ergibt sich ffir das Verh~ltnis der Zunahme an Amino-N bei der Itydrolyse yon ~- und fl-Casein etwa ein Weft yon 1,3. Als Maximalverh~ltnis ffir c~- und fi-Casein errechnet sich ein Wert yon 73/53 = 1,4. In gleicher Weise ergibt sich ffir den tryptischen Abbau ein

GRoves, M. L., N. J. HI1,~ u. T. L. MCMEEKIN: Zi~. S. 282, Anm. 6. 2 PETE~SO~, 1%. F., L. W. NAU~ANN U. T. L. MeMEEKI~: Zig. S. 280, Anm. 5.

Go~DO~, W. G., W. F. SEMMET, I~. S. CABr.E U. N. J. MORRIS: J. Amer. chem. Soc. 71, 3293 (1949); 75, 1678 (1953).

Fraktionierung enzymatischer Hydrolysate yon ~- und fl-Casehl 287

Verh&ltnis 1,1, wahrend aus der maximalen SpaltmSglichkeit der hier wesentlichen Aminos£uren sich ein Verh&ltnis yon 86/64 = 1,3 errechnet.

d) Uber die Analysenbilanz der Fraktionierung 1/~gt sieh folgendes sagen: Bei der Hydrolyse mit Pepsin ]iefert :c-Casein nnr eine geringe Menge ,,Gel" (,,2"), die etwa 5~o des Gesamt-N nnd fund 9% des Gesamt-P enth&lt; bei/~-Casein enthielt der An~eil derselben tPraktion jedoeh 45% des Gesamt-N und 93% des ge- samten Phosphors. Dureh die Bleifallung des Filtrates ( ,3") wurde yore :c-Casein- Hydrolysat die Halfte des vorhandenen Phosphors abgetrennt, yon dem sich bei der ansehlieBenden l~raktionierung ein Drittel in hShermolekularen und zwei Drittel in niedermolekularen Fraktionen wiederfanden. Die phosphorarmen Spaltprodukte erwiesen sieh als niedermolekular, da sie zu etwa 73 % in das Aul]endia- Tabelle 6. Vorkommen einiger Aminosiiuren in c~- und lysat (.9") gingen. :c-Casein w u r - fi-Casein de demnach durch peptische Hydro- ~-Casein fl-Caseia lyse zum grSBten Teil in phosphor- Aminos~ure

(Xquivalente pro 105 g Protein) arme, zum geringeren Teil in phos- p h o r r e i e h e P e p t i d e z e r l e g t . A u s Arg in in . . . 25 20 dem Verhalten bei der Dialyse folgt, Lysin . . . . 61 44 dab der phosphorarme Anteil nieder- Phenyl~lanin 28 35 molekulare Spaltstficke enthielt, Tyrosin . . . 45 18 wghrend die phosphorreiche Kompo- nente zu etwa einem Drittel hShermolekularen, zu etwa zwei Dri~tel niedermoleku- laren Anfbau zeigte, fi-Casein hingegen lieferte zu etwa gleiehen Teilen eine hSher- molekulare (phosphorreiche) Gelfraktion und eine niedermolekulare (phosphorarme) Fraktion; letztere li~13t wegen ihres relativ hohen N/A-Wertes auf eine Anh~tufung basischer Gruppen schliegen.

Bei der Hydrolyse mit Trypsin wnrde sowohl yon :c-Casein wie yon/LCasein etwa ein Viertel des Gesamtstickstoffs in der Gelfraktion abgeschieden. Die Gel-Fraktion des :c-Caseins enthielt nur sehr wenig Phosphat, die des fl-Caseins war wesen~lieh phosphatreicher. Als t tauptfraktion trat in beiden Fallen die im AuBendialysat~ (,,9") zu 48 bzw. 35% (bezogen auf Stiekstoff) isolierte Komponente auf. Sie war nieder- molekular und sehr arm an Phosphor. Dureh Bleifi~llung warde bei e- und fl-Casein eine geringe, sehr phosphorreiehe Fraktion erhalten. Die N/A-Werte der Fraktionen ,,6" und ,,7" unterscheiden sieh nut wenig und liegen bei 10--11. Dies l~t6t auf weit- gehend gleiehe Peptidgr6Be beider Fraktionen sehliegen. Zusammenfassend la13t sieh sagen, dab :c-Casein dureh kurzzeitigo tryptische tIydrolyse zu einem Viertel in hShermolekulare, phosphorarme Peptide, zu einem Viertel in phosphorreiche Brueh- stiieke mittlerer GrSl3e und zur tI&lfte in niedermolekulare, sehr phosphorarme Brueh- stiieke gespalten wurde, fi-Casein lieferte in etwa gleiehen Anteilen h6hermolekulare, phosphorarme Peptide, phosphorreiehe Peptide mittlerer GrSBe und niedermolekulare phosphorarme Peptide.

Damit best/ttigen diese Untersuehungen an :c- und fi-Casein frtihere Untersuchun- gen unseres Arbeitskreises i, wonach im Gesamteasein stark saure Bereiehe vor- kommen, die neben Phosphoserin vor ahem Glutamins~ure und Asparaginsgure ent- halten. Die ausgesprochen saute Natur soleher Zen~ren ist dutch eine Anh/~ufung yon Phosphoseringruppen bedingt. Abseits yon diesen Zentren liegen nut vereinzelt Gruppen yon phosphoryliertem Serin. Aus der mengenm/il3igen Verteilung der nach Pepsinhydrolyse abgetrennten Fraktionen kann weiterhin gefolgert werden, dab im

1 SC~ORMi3LLEt¢, J . , K . LEtI~ANlg U. H.-I) . BELITZ: Zit. S. 280, A n m . 9.

20*

288 :E. RENNER und F. ~IERMEIER:

:c-Casein die Aminosguren Tyrosin und Phenylalanin gleiehm/~l]iger auf das Molek/il vertefl~ sind als im fi-Casein. Wir nehmen an, dab bei fi-Casein die genannten Amino- s/~uren sieh vornehmlich in phosphorarmen Bezirken finden, wghrend sic bei e-Casein aueh in der Nahe phosphorreieher Molekiilgruppierungen auftreten. Auch ffir die Aminosi~uren Lysin und Arginin sind naeh den Ergebnissen der tryptisehen Hydro- lyse Bezirke h/tufigeren Vorkommens sowohl beim :c-Casein wie beim fl-Casein zu vermugen. Sic liegen offenbar beim :c-Casein in den phosphorarmen, bei /~-Casein vornehmlich in den phosphorreiehen Molekfilbezirken.

Zusammen]assung

~- und fl-Casein wurden der enzymatischen Kurzzeit-t tydrolyse mit Pepsin und Trypsin unterworfen. Die erhaltenen Hydrolysate wurden, nach Abtrennung einer hShermolekularen ,,Gelfraktion", durch Bleisalzf~llung in phosphorreiehe und phos- phorarme Fr~ktionen aufgetrennt. Dureh Dialyse dieser Fraktionen und durch Ermittlung des Verh~ltnisses Gesamt-S~iekstoff/Amino-Stiekstoff wurden Riick- schlfisse auf die durchsehnittliche Molekiilgr6Be der Fraktionen gezogen. Der Gang der Fraktionierung wurde dureh Aufstellung einer Stickstoff- und Phosphorbilanz veffolgt. Die im AnsehluB an die Dialyse erhaltenen Fraktionen wurden isoliert. Mengenverh~ltnisse, durchschnittliche Molekfilgr6Ben und Phosphatgehalt der bei Hydrolyse yon ~- und fi-Casein mit Pepsin und Trypsin erhaltenen Peptidbruchstfieke wurden diskutiert und Riiekschliisse auf den Bau yon ~- nnd fi-Casein gezogen.

Uber das Verhiiltnis von pH-Wert, Sguregrad und Alizarol-Farbstufe in Milch

Von

EDMUND RENNER und FRIEDRICH KIERMEIER

Mitteilung aus dem Milchwirtscha]tlichen Institut der Techn. Hochschule Miinchen in Weihen- stephan (Obb.)

M_it 3 Textabbfldungen

(Eingegangen am 1. Dezember 1960)

Zur Bestimmung des Frisehezustandes der Milch werden mehrere Methoden ver- wendet, die voneinander wesentlich verschieden sind. W~hrend der S~uregrad naeh SOXHLET-HENKEL ill einer Messung der potentiellen Aeidit~t der Milch besteht und somi~ sowohl den dissoziierten als anch den nieht-dissoziierten Antefl der insgesamt vorhandenen S~ure erfaB~, wird mi~ dem pg-Wert die aktuelle Acidifi£t mit dem dissoziierten Antefl der vorhandenen S~ture bestimmtL Die Alizarolprobe nach M o ~ s 2, die vor allem ira sfiddeutschen Raum yon den Molkereien zur Kontrolle des Frisehezustandes der angelieferten Milch eingesetzt wird, stellt naeh TILLMANS and OB~RMEI~R 3 eine colorimetrisehe Bestimmung des p~-Wertes dar, wobei durch

1 RO~,])ER, G. : Grundziige der Milchwirtschalt und des ~Iolkereiwesens. S. 263. Itamburg- Berlin: Paul Parey 1954.

2 MO~R~S, W.: Diese Z. 22, 459 (1911). TILL~A~S, J., U. W. OBERMEIER: Diese Z. 40, 23 (1920).