Grassilage als Rohstoff für die chemische Industrie

Grassilage als Rohstoff für diechemische IndustrieTim Sieker, Andreas Neuner, Darina Dimitrova, Nils Tippkötter,Hans-Jörg Bart, Elmar Heinzle und Roland Ulber*

Grassilage stellt einen nachwachsenden Rohstoff mit großem Potenzial dar. Neben Cellu-

lose und Hemicellulose enthält sie auch organische Säuren, insbesondere Milchsäure. In

einem Bioraffinerie-Projekt wird die Milchsäure aus der Silage isoliert und mit gentech-

nisch optimierten Stämmen zu L-Lysin weiterverarbeitet. Die Lignocellulose wird hydroly-

siert und zu Ethanol fermentiert. Ein besonderes Augenmerk liegt auf der Integration der

unterschiedlichen Prozesse sowie der einzelnen Prozessschritte zu einem Gesamtprozess,

der sämtliche Inhaltsstoffe der Silage verwertet.1)

Schlagwörter: Bioraffinerie, Milchsäure, Nachwachsende Rohstoffe, Prozessintegration,Silage

Eingegangen: 19. April 2010; revidiert: 07. Juni 2010; akzeptiert: 08. Juni 2010

1 Problemstellung

Gräser gehören zu den wichtigsten Feldfrüch-ten weltweit. Sie wurden traditionell als Futter-mittel genutzt und haben so über den größtenTeil der Menschheitsgeschichte die Energie fürMobilität und viele Industrien geliefert [1].Heutzutage werden Gräser für dieselbe Funk-tion wieder interessant, da die enthaltenenZucker und Polysaccharide als Rohstoff derzweiten Generation entweder durch die Fer-mentation zu Ethanol für den Mobilitätssektoroder zur Herstellung von Building blocks füreine stoffliche Nutzung dienen können.

Neben der vielen Vorteile von Gräsern wieder Möglichkeit zur extensiven Nutzung auchschlechterer Böden sowie Energieeinsparun-gen beim Anbau und höhere Erträge im Ver-gleich zum Anbau einjähriger Energiepflan-zen [2, 3], ist die Lagerung von Grasschnitt eingroßes Problem. Im Gegensatz zu Holz istGras nur sehr kurz lagerfähig und verdirbtbereits innerhalb weniger Tage, was die Ver-fügbarkeit auf die Wachstumsperiode von Maibis Oktober einschränkt [4]. Dieses Problemwird dadurch verschärft, dass Energiegräserzur Optimierung von Ertrag und Nachhaltig-keit nur einmal im Jahr geerntet werden sollen[3], wodurch innerhalb kurzer Zeit großeBiomassemengen anfallen. Eine Möglichkeit,auch große Mengen von Gras kostengünstigzu lagern, ist die Silierung [4]. Dabei wird dasGras in Silos oder Ballen verdichtet und luft-

dicht abgeschlossen. Dies begünstigt dasWachstum von Lactobacilli, die einen Teil derverfügbaren Zucker zu Milchsäure fermentie-ren. Die Kombination aus Ansäuerung undLuftausschluss bewirkt dann die Konservie-rung [5]. Silage stellt somit einen über das gan-ze Jahr verfügbaren Rohstoff dar, der zur Her-stellung von Grund und Feinchemikalienbeziehungsweise Energie und Wärme genutztwerden kann.

2 Überblick über den Gesamt-prozess

Im ersten Prozessschritt wird aus der Silageein Presssaft hergestellt. Dieser enthält die or-ganischen Säuren, insbesondere Milchsäure,freie Zucker, Mineralien und weitere Nährstof-fe. Die Aufarbeitung von Milchsäure aus Sila-gepresssaft ist bereits beschrieben [4, 6]. Als Al-ternative wird die Möglichkeit zur Nutzungunterschiedlicher ionischer Flüssigkeiten fürdie Extraktion untersucht. Die reine Milchsäu-re kann entweder als Rohstoff für die Herstel-lung z. B. von Polymilchsäure genutzt werden,oder es kann, bei geringerem Aufreinigungs-grad, ein Gemisch aus Milchsäure, Essigsäureund anderen Inhaltstoffen hergestellt werden.Dieses Gemisch soll mit gentechnisch für dieNutzung von Milchsäure als Substrat optimier-ten Corynebacterium glutamicum-Stämmen zuL-Lysin fermentiert werden.

Der bei der Herstellung des Presssaftes an-fallende Presskuchen enthält Polysaccharide,die ebenfalls einen wertvollen Fermentations-rohstoff darstellen. Obwohl Graslignocellulo-

Die in Gräsern ent-haltenen Zuckerund Polysaccharidekönnen als Rohstoffder zweiten Gene-ration dienen.

Gras ist nur sehrkurz lagerfähig, wasdie Verfügbarkeitauf die Wachs-tumsperiode vonMai bis Oktobereinschränkt.

Der Presssaft ent-hält die organischenSäuren, insbeson-dere Milchsäure,freie Zucker, Mine-ralien und weitereNährstoffe.1)Vorgetragen auf der DECHEMA-Tagung Industrielle

Nutzung nachwachsender Rohstoffe – Chemie, Biotech-nologie, Verfahrenstechnik, 20.01. – 21.01.2010, Frank-furt am Main.

Silage 1153ChemieIngenieurTechnik

Chemie Ingenieur Technik 2010, 82, No. 8 © 2010 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.cit-journal.de

DOI: 10.1002/cite.201000088

sen relativ wenig Lignin enthalten [7], erfordertauch die Nutzung der in Grassilage enthal-tenen Polysaccharide einen Vorbehandlungs-schritt. Die Hauptbarriere gegen eine enzyma-tische Hydrolyse bilden Phenolcarbonsäuren,die durch eine enzymatische Vorbehandlungentfernt werden können [8]. Darauf basierendwird versucht, mehrere Prozessschritte zueiner simultanen Vorbehandlung, Verzucke-rung und Fermentation (Simultaneous Pretreat-ment, Saccharification and Fermentation, SPSF)zu integrieren. Da das Raffinat aus der Milch-säureextraktion noch Zucker sowie Nährsalzeund Spurenelemente enthält, soll es in der Fer-mentation als Medienzusatz eingesetzt wer-den. In der beschriebenen Arbeit wurde dazuder nicht aufbereitete Presssaft verwendet, dadie Verfahrensentwicklung für die Milchsäu-reextraktion noch nicht abgeschlossen ist.

Die Reststoffe sowohl aus der Fermentationzu Lysin als auch aus der Ethanolfermentationsollen zur Biogasherstellung genutzt werden.Abb. 1 gibt einen Überblick über den Gesamt-prozess zur Nutzung von Grassilage. Eine öko-nomische Bewertung dieses Gesamtkonzeptesliegt noch nicht vor. Diese soll erst zum Endedes Projektes erfolgen, da zum bisherigenZeitpunkt noch nicht alle Verfahrensentwick-lungen abgeschlossen sind.

3 Material und Methoden

Die Silage wurde von einem örtlichen Land-wirtschaftlichen Betrieb (Münchweiler, HofgutNeumühle, Dienstleistungszentrum landwirt-schaftlicher Raum (DLR) Westpfalz) zur Ver-fügung gestellt. Für die Herstellung des Silage-presssaftes wurde eine manuell betriebeneHochdrucktinkturenpresse, Typ HP2, der Fir-ma Fischer genutzt. Pro Ansatz wurden 500 gSilagefeuchtmasse 40 min bei 100 bar gepresst.

3.1 Ethanolherstellung

Für die Produktion von Ethanol wurden Sac-charomyces cerevisiae (DSM 70449) und Pachy-solen tannophilus (DSM 70352) verwendet. Letz-terer ist in der Lage, Xylose zu Ethanolumzusetzen [9 – 11]. Die verwendeten Mikro-organismen wurden über die DSMZ bezogen.

Die verwendeten Enzyme wurden zumEinen von der Firma Novozymes zur Ver-fügung gestellt. Aus dem „Biomass Kit“ wur-den drei verschiedene Enzyme verwendet: alsCellulase wurde Celluclast 1,5 L (NS 50013),als ß-Glucosidase Novozyme 188 (NS 50010)und als Hemicellulase Shearzyme 500 L (NS50030) eingesetzt. Zum Anderen wurden von

Abbildung 1. Übersichtsschema für die geplante Nutzung der Grassilage.

Es wird ein Verfah-ren zur simultanenVorbehandlung,Verzuckerung undFermentation ent-wickelt.

1154 T. Sieker et al.Forschungsarbeiten

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der Firma Biocatalysts ein Ferulasäureesterase-präparat (Depol 740 L), welches für die enzy-matische Vorbehandlung eingesetzt wurde,sowie ein Enzymmix (Depol 670 L), der beider simultanen Vorbehandlung, Verzuckerungund Fermentation eingesetzt wurde, zur Ver-fügung gestellt. Bei allen eingesetzten Enzy-men handelt es sich um kommerziell erhält-liche technische Flüssigpräparate.

Sofern nicht anders beschrieben, wurde derSilagepresskuchen vor der Vorbehandlungbeziehungsweise der Fermentation bei 50 °Cgetrocknet und anschließend mechanisch miteinem Schneidwerk auf eine Größe von1 – 2 mm zerkleinert. Für die Vorbehandlungmit alkalischem Wasserstoffperoxid wurden3 g Silagepresskuchen (120 g/L) mit einer0,6 % Wasserstoffperoxidlösung versetzt undmit 10 M NaOH auf pH 11 eingestellt. Der An-satz wurde in einem Überkopfschüttler (Intel-li-Mixer, NeoLab) bei 25 Upm und 50 °C 24 hlang inkubiert. Die Versuche zur enzymati-schen Vorbehandlung sowie zur Hydrolyse desSilagepresskuchens wurden in einem Volu-men von 25 mL (50 mL Reaktionsgefäße)durchgeführt. Im einfachen Ansatz wurden1 – 3 g Silagepresskuchen (40 – 120 g/L) hydro-lysiert. Hierfür wurden pro Gramm Substrat160 lL Cellulase, 16 lL b-Glucosidase und53,3 lL Hemicellulase sowie, bei der enzyma-tischen Vorbehandlung, 750 lL Ferulasäure-esterase verwendet. Die Versuche wurden ineinem Citronensäure-Phosphat (CP)-Puffer beieinem pH-Wert von 5 durchgeführt. ZurDurchmischung der Reaktionsansätze wurdeein Überkopfschüttler (Intelli-Mixer, NeoLab)verwendet, welcher bei 25 Upm in einem auf50 °C temperierten Inkubator betrieben wurde.

Die Screeningversuche zur Ethanolherstel-lung wurden in Gaschromatographie-Head-space-Vials (25 mL, Arbeitsvolumen: 10 mL)durchgeführt, die mit Butyl/PTFE-Septen ver-schlossen wurden. Um anaerobe Fermentati-onsbedingungen zu schaffen, wurden die Kul-turen nach dem Animpfen sowie nach jederProbenahme mit Stickstoff begast. Die Fer-mentationen wurden bei 30 °C und pH 5,0 ineinem Schüttelinkubator durchgeführt. AlsSubstrat wurden 120 g/L Silagepresskuchen inCP-Puffer und die entsprechende Menge anEnzymen eingesetzt. Zur Versorgung der Kul-tur mit Nährsalzen, Spurenelementen undVitaminen wurden 3,3 Vol.-% Silagepresssaftzugegeben. Auf eine weitere Supplementie-rung wurde verzichtet. Die Vorkulturen derbeiden Mikroorganismen wurden über Nachtbei 30 °C auf Komplexmedium (DSMZ 186)angezogen, wobei entweder Glucose oder Xylo-se als Kohlenstoff-Quelle enthalten war.

Die Messung der Zuckerkonzentrationenerfolgte mittels HPLC (300 x 8 mm Repro-GelCa++ Dr. Maisch GmbH; 80 °C; Eluent Wasser,Detektion: RI). Die Messung des bei den Fer-mentationen entstandenen Ethanols erfolgtemittels Head-Space-Gaschromatographie (Cla-rus 500; PerkinElmer; 30 m x 0,250 mm Elite-Wax-Kapillare, Headspace-Sampler-Tempera-tur 80 °C, Ofen-Temperatur 60 °C, TrägergasHelium, 120 kPa).

3.2 Stammoptimierung für dieL-Lysin-Herstellung

Bei den verwendeten Bakterienstämmen han-delt es sich um Mutanten von Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032. Die als LysC bezeich-nete Mutante (LU 11716) hat eine Punktmuta-tion im Gen der Aspartokinase (NCgl0247).Aufgrund dieses Basenaustausches wird dieEndprodukthemmung durch Lysin und Threo-nin ausgeschaltet [12]. Alle genetischen Modi-fikationen wurden über homologe Rekombina-tion im Genom integriert.

Die Kultivierung von C. glutamicum erfolgteauf einem Rotationsschüttler bei 30 °C und230 Upm in Schikanenkolben in 10 % des Füll-volumens. Die erste Vorkultur (Kulturvolumen5 mL) wurde über Nacht in CM-Medium [12]durchgeführt. Die zweite Vorkultur (Kulturvo-lumen 10 mL, CG 121/2-Medium [13] mit Lak-tat als Kohlenstoffquelle) wurde mit OD 0,5 bis1 mit den abzentrifugierten und zweimal mitsteriler 0,9 % NaCl-Lösung gewaschenen Zel-len der ersten Stufe angeimpft und 10 h inku-biert. Die Hauptkultur wurde analog zur zwei-ten Vorkultur durchgeführt (Kulturvolumen:25 mL). Zur statistischen Absicherung wurdenzwei Parallelkultivierungen durchgeführt.

Das Wachstum der Kulturen wurde durchMessung der optischen Dichte der Zellsuspen-sion bei einer Wellenlänge von 660 nm gegenWasser bestimmt (Spektralphotometer Nova-spec®II, Pharmacia Biotech, Little Chalfont,UK, Schichtdicke 1 cm). Zwischen der OD660

und der Biomasse besteht beim Wildtyp vonC. glutamicum der folgende Zusammenhang[13]

BTM g L�1� � � 0� 353OD600 (1)

Die Analyse der Aminosäurekonzentrationim Kulturüberstand erfolgt mit der HPLC-An-lage Agilent 1100 Series (Agilent Technologies,Waldbronn, Deutschland) mit einer C18 RP-Säule (Phenomenex, Gemini 5u C18 110A,150 × 4,6 mm, Flussrate 1 mL/min, Säulen-



temperatur 40 °C, Injektionsvolumen 70 lL)mit Vorsäule (MAX-RP, 4 mm × 3 mm). Dereingesetzte Kulturüberstand wurde 1:10 mitABU (a-Amino-Buttersäure [222,18 lM]) alsinternem Standard verdünnt. Es wurde eineautomatische Vorsäulenderivatisierung mito-Phtaldialdehyd (OPA) durchgeführt. DieDetektion der Aminosäuren erfolgte mittelsFluoreszenzdetektion (Anregung: 330 nm,Emission: 460 nm). Es wurde ein Gradient aus40 mM Na2HPO4 (pH 7,8) und einem Methan-ol/Acetonitril/Wasser-Gemisch (45/45/10 (v/v))gefahren. Zur Kalibration wurden mit ABUverdünnte Aminosäurestandards eingesetzt.

Die Bestimmung der in den 1:10 mit ABUverdünnten Kulturüberständen enthaltenenZucker und organischen Säuren erfolgte iso-kratisch mit 7 mM H2SO4 mit einer HPLC-An-lage von Kroma Systems (Kontron Instru-ments, Neufahrn, Deutschland) über eineAminex-Säule (HPX-87H; 300 x 7,8 mm; Bio-Rad, Hercules, USA, Flussrate 1 mL/min,Ofentemperatur 55 °C, Injektionsvolumen20 lL). Die Detektion der Zucker erfolgte mit-tels eines RI Detektors, organische Säurenwurden über einen UV Detektor bei 210 nmdetektiert.

Die Elementarmodenanalyse wurde mittelsMETATOOL [12, 14] durchgeführt. Die mathe-matischen Details des Algorithmus sind in derLiteratur detailliert beschrieben [14]. Das Mo-dell wurde anhand der Datenbank Kyoto Enzy-clopedia of Genes and Genomes [15] erstellt.

4 Ergebnisse

4.1 Nutzung von Silagepresssaft undHydrolysat als Fermentations-medium

Der Einsatz von Silagepresssaft wurde in derLiteratur bisher nur selten beschrieben[16, 17], darunter ist keine Beschreibung derNutzung von Silagepresssaft für die Herstel-lung von Ethanol. Gegenüber der Nutzung derGesamtsilage hätte die Verwendung des Sila-gepresssaftes als Fermentationsmedium denVorteil, die Logistik zu vereinfachen. So könntedas Abpressen der Silage dezentral erfolgenund die Weiterverarbeitung in einer zentralenStelle [4]. Die durchgeführten Versuche zeig-ten, dass Silagepresssaft ohne vorherige Aufar-beitung als Fermentationsmedium für dieEthanolherstellung ungeeignet ist, da die hoheMilchsäurekonzentration von bis zu 80 g/L imPresssaft die verwendeten Hefen inhibiert.Daher wurde eine Kombination von Silage-presssaft und hydrolysiertem Presskuchen un-tersucht. Während andere silagebasierte Bio-raffinerien den getrockneten Presskuchen alsFasermaterial, z. B. als Dämmstoff für die Bau-industrie [4] verwenden, kann auf diese Weisedie gesamte Silage zur Ethanolherstellung ge-nutzt werden. Zur Fermentation wurde dasHydrolysat mit Silagepresssaft versetzt. DurchZugabe des Presssaftes kann bereits beimEinsatz von 2 % Silagepresssaft zum Hydroly-sat auf eine weitere Supplementierung desMediums mit Nährsalzen und Vitaminen ver-zichtet werden (s. Abb. 2). In der weiterenEntwicklung soll an dieser Stelle das Raffinatder Milchsäureextraktion verwendet werden(s. Abb. 1). Dies bewirkt eine Kostensenkungdes Prozesses, da kostenintensive Vitamine,Spurenelemente und Nährsalze durch einenAbfallstrom ersetzt werden.

Bezüglich der Hydrolyse des Presskuchenswurde zunächst angenommen, dass eine Vor-behandlung der Silage nicht notwendig sei, daGras nur wenig Lignin enthält [6, 7] undbereits während des Silierens Zucker aus derHemicellulose freigesetzt werden [18, 19]. Dieserwies sich aber als nicht haltbar. Gras enthältzwar nur wenig Lignin, jedoch behindern invielen ligninfreien Geweben Phenolcarbonsäu-ren, hauptsächlich Ferula- und p-Cumarsäure,die Hydrolyse [7, 20]. Eine geeignete chemi-sche Vorbehandlung ist die Nutzung von alka-lischem Wasserstoffperoxid. Dabei werden dieEsterbindungen zwischen der Hemicelluloseund den Phenolsäuren gespalten und die Phe-nolcarbonsäuren freigesetzt. Um eine ausrei-chende Effizienz der Vorbehandlung zu ge-währleisten, wurde der Presskuchen vor der

Abbildung 2. Verlauf der Ethanolkonzentration bei Kultivierung-sansätzen mit unterschiedlichen Presssaftkonzentrationen im Ver-gleich zum Einsatz von Nährsalzen und Spurenelementen (Saccha-romyces cerevisiae und Pachysolen tannophilus, Kulturvolumen10 mL, 30 °C, pH 5, 200 rpm, anaerob, in 45° geneigten 25 mLGC-Headspace-vials).

Das Abpressen derSilage könntedezentral erfolgenund die Weiterver-arbeitung in einerzentralen Stelle.

Bereits beim Zugabevon 2 % Silagepress-saft zum Hydrolysatkann auf eine wei-tere Supplementie-rung des Mediumsmit Nährsalzen undVitaminen verzich-tet werden.



Vorbehandlung einer mechanischen Zerklei-nerung unterzogen.

Um den Gesamtprozess weiter zu verein-fachen, wurde eine enzymatische Vorbehand-lung mittels eines kommerziellen Ferula-säurepräparates getestet. Dieses spaltet dieEsterbindungen zwischen der Hemicelluloseund der Ferulasäure sowie in geringeremMaße die zur p-Cumarsäure [7, 21], wodurchdie Freisetzung von Glucose aus Gräserndurch Hydrolyse mittels Cellulase verbessertwerden kann. Darüber hinaus stellen die frei-gesetzten Phenolsäuren ein wertvolles Neben-produkt dar [22]. Da die Ferulasäureesterasenatürlicherweise synergistisch mit cellulyti-schen Enzymen zusammenwirkt, hat sie die-selben Optima wie handelsübliche Cellulasenund Xylanasen. Einige Xylanasen, wie das hiereingesetzte Präparat Shearzyme 500 L, verfü-gen bereits über eine Ferulasäureesterase-Ne-benaktivität. Daher wurde versucht, die Vorbe-handlung und Verzuckerung in einemeinzigen Schritt durchzuführen. Abb. 3 ver-gleicht drei unterschiedlich integrierte An-sätze. Die erreichten Konzentrationen undAusbeuten werden durch die Integration nichtbeeinflusst, allerdings kann die Gesamtpro-zesszeit halbiert werden.

Es ist bekannt, dass durch Integration vonHydrolyse und Fermentation (Simultaneoussaccharification and fermentation, SSF) einBioethanolprozess erheblich vereinfacht wer-den kann [23 – 25]. Nachdem gezeigt werdenkonnte, dass die Integration von Vorbehand-lung und Hydrolyse ohne Verluste möglich ist,wurde versucht, alle drei Schritte in einem An-satz durchzuführen (SPSF). Das Ergebnis istin Abb. 4 dargestellt und mit einem SSF-Ver-fahren nach alkalischer Peroxid-Vorbehand-lung verglichen. Gegenüber der alkalischenPeroxidvorbehandlung kann die Ethanolkon-zentration durch die Verwendung von Ferula-säureesterasen deutlich gesteigert werden. DieAusbeuten betragen, bezogen auf die Trocken-masse der Silage, bei dem SSF Ansatz nachalkalischer Peroxid-Vorbehandlung 53,2 g/kg,bei dem Ansatz mit Shearzyme 500L 65,1 g/kg,bei den Ansätzen mit Depol 670L mit undohne mechanische Vorbehandlung 91,3 g/kg.Bezogen auf den Gesamtzuckergehalt der Sila-ge liegt die Ausbeute im SPSF-Verfahren beica.139 g/kg. Durch die synergistische Wir-kungsweise von enzymatischer Vorbehand-lung und Hydrolyse im SPSF-Ansatz kannauch auf eine mechanische Vorbehandlung,wie sie bei der Vorbehandlung mit alkalischemPeroxid notwendig ist, verzichtet werden, dadie Fasern während der Hydrolyse zersetztwerden. Eine wirtschaftliche Betrachtung derVerfahrenskombination liegt noch nicht vor.

Allerdings kann durch die Kombination beigleichem Chemikalieneinsatz die Prozesszeitverringert sowie die für die mechanische Vor-behandlung notwendige Investition gespartwerden, was das Verfahren wirtschaftlich vor-teilhaft macht.

Abbildung 3. Vergleich der Zuckerkonzentrationen im Hydrolysatnach der Vorbehandlung mit Ferulasäureesterase und der Verzucke-rung. Ansatz 1 ist zweistufig. Nach der 24-stündigen Vorbehand-lung wurde der Überstand abgenommen und neuer Puffer sowiedie Enzyme zugegeben (Hydrolyse für weitere 24 h). Die dargestell-ten Konzentrationen sind die Summe der Konzentrationen nachden beiden Schritten. Ansatz 2 wurde nach 24 h Vorbehandlung umdie Hydrolyse-Enzyme ergänzt und weitere 24 h inkubiert. Ansatz3 ist ein vollständig integrierter Ansatz, Vorbehandlung und Hydro-lyse erfolgen innerhalb von 24 h.

Abbildung 4. Verlauf der Ethanolkonzentration bei unterschiedlichen Kulti-vierungsansätzen (Saccharomyces cerevisiae und Pachysolen tannophilus,Kulturvolumen 10 mL, 30 °C, pH 5, 200 rpm, anaerob, in 45° geneigten 25 mLGC-Headspace-vials). Von den SPSF-Ansätzen erfolgte einer mit zuvormechanisch vorbehandelter Silage, beim zweiten Ansatz wurde auf einemechanische Vorbehandlung verzichtet. Die Silagepresskuchenkonzentra-tion betrug bei allen Kultivierungen 120 g/L.



4.2 L-Lysin-Herstellung

Die aus dem Silagepresssaft gewonneneMilchsäure beziehungsweise ein weniger auf-gearbeitetes Gemisch aus Milch- und Essigsäu-re soll zu L-Lysin umgesetzt werden. Um dieszu erreichen, wird ein Corynebacterium gluta-micum-Stamm entsprechend gentechnischmodifiziert. C. glutamicum ist natürlicherweisein der Lage, sowohl D- als auch L-Laktat zu ver-stoffwechseln [26]. Erste Experimente zeigten,dass auf einer Mischung aus D- und L-Laktatdas L-Laktat zuerst und mit einer wesentlichhöheren Verbrauchsrate von 16,8 mM/(g h)verstoffwechselt wird als das D-Laktat(1,5 mM/(g h)). Dies ist darauf zurückzufüh-ren, dass die D-Laktat-Dehydrogenase nur ingeringen Mengen konstitutiv exprimiert wird[27]. Daher war der erste Schritt die Über-expression der D-Laktat-Dehydrogenase (Dld).Durch den Austausch des natürlichen Promo-

tors der Dld mit dem stärkeren, konstitutivenPromotor der Superoxid Dismutase (Psod) ausC. glutamicum konnte die Expression derD-Laktat-Dehydrogenase verstärkt werden,was zu einem verbesserten Wachstum aufeinem Gemisch aus D- und L-Laktat führt.Die Wachstumsrate konnte von 0,21 h–1 auf0,36 h–1 verbessert werden.

Trotz des verbesserten Wachstums auf D,L-Laktat findet mit dem verbesserten Stammkeine Überproduktion von L-Lysin statt. DaLaktat über die Oxidation zu Pyruvat in denZentralstoffwechsel gelangt war die Pyruvat-carboxylase (pyc) das nächste Target für ein Ge-netic Engineering. Durch eine Überexpressionder Pyruvatcarboxylase sollte die Gluconeoge-nese verstärkt und eine bessere Kohlenstoffver-teilung ermöglicht werden [28]. Der neueStamm LysC dld pyc Psod zeigt eine im Ver-gleich zum Ausgangsstamm fast doppelteWachstumsrate (s. Abb. 5) und eine um 25 %höhere Biomasseausbeute. Eine signifikanteLysinüberproduktion konnte jedoch nicht be-merkt werden. Um mögliche Ursachen hierfürzu finden, wurde ein metabolisches Flussmo-dell erstellt und eine Elementarmodenanalysedurchgeführt (Abb. 6). Ein Hauptproblem beider Überproduktion von Lysin ist, dass proMol Lysin 4 Mol NADPH benötigt werden. DaC. glutamicum nicht über eine Transhydroge-nase oder andere Enzyme zur Umwandlungvon NADH in NADPH verfügt, muss ein an-derer Weg zur Versorgung mit NADPH beimWachstum auf Laktat als einziger C-Quelleverfügbar sein. Die Elementarmoden sollenbei theoretisch maximaler Lysinausbeute mitgleichzeitiger Biomasseproduktion eine theo-retische Flussverteilung liefern, die weitereTargets für die Stammoptimierung liefern.

5 Zusammenfassung

Die präsentierten Ergebnisse zeigen einenWeg zur Entwicklung einer Bioraffinerie fürdie vollständige Nutzung von Grassilage zurHerstellung von Milchsäure, Lysin und Ethan-ol auf. Das Konzept sieht eine Trennung derSilage in einen Silagepresssaft für die Milch-säuregewinnung und einen Presskuchen zurEthanolherstellung vor. Obwohl der Silage-presssaft nicht direkt fermentiert werdenkann, ist seine Nutzung beziehungsweise dieNutzung des Raffinats aus der Milchsäureauf-arbeitung zur Supplementierung von Hydro-lysaten des Presskuchens möglich, wodurchKosten eingespart werden können. Bei derNutzung des Silagepresskuchens zur Ethanol-herstellung konnte durch die Integration vonVorbehandlung, Hydrolyse und Fermentation

Abbildung 5. Vergleich der spezifischen Wachstumsraten der optimier-ten Corynebacterium glutamicum-Stämme auf einem D,L-Laktat-Ge-misch.

Abbildung 6. Theoretische Lysin- und Biomasseausbeute einesLysinproduzenten (C. glutamicum lysCfbr ) mit Laktat als Kohlen-stoff und Energiequelle.

Obwohl der Silage-presssaft nichtdirekt fermentiertwerden kann, istseine Nutzung be-ziehungsweise dieNutzung des Raffi-nats aus der Milch-säureaufarbeitungzur Supplementie-rung von Hydroly-saten des Press-kuchens möglich.



eine erhebliche Steigerung der Ausbeute,einhergehend mit einer deutlichen Prozessver-einfachung gegenüber einer chemischen Vor-behandlung erzielt werden. Da die Ethanolaus-beute mit 0,09 gEthanol/gSilage noch rechtniedrig liegt, bietet dieses Verfahren einen An-satzpunkt für weitere Optimierungen. Für dieweitergehende Nutzung der aus dem Presssaftisolierten Milchsäure wurden Corynebacteriumglutamicum-Stämme durch die verstärkte Ex-pression der D-Laktat-Dehydrogenase hinsicht-lich einer besseren Verstoffwechslung derMilchsäure optimiert. In der weiteren Arbeitsoll auch die Anwendbarkeit der bisherigenEntwicklungen für die Herstellung weitererwertgesteigerter Produkte wie Itakon- undBernsteinsäure aus Silagehydrolysaten oder1,2–Propandiol aus Milchsäure getestet wer-den. Darüber hinaus müssen Untersuchungenzur Nutzbarkeit der Fermentationsrückständezur Biogasherstellung sowie eine Wirtschaft-lichkeitsbetrachtung des Gesamtkonzeptes er-folgen.

Die vorgestellten Arbeiten werden imRahmen des vom BMELV über die FNRgeförderten Verbundprojektes „Nutzungvon Silage und Silagepresssaft als Roh-stoff zur Gewinnung von Grund- undFeinchemikalien“ (FKZ 22025407) finan-ziell unterstützt. Unser Dank geht anDr. Huck von der DLR für die Bereit-stellung der Silage.

Prof. Dr. rer. nat. R. Ulber([email protected]),Dipl.-Biotech. T. Sieker,Dipl.-Chem. N. Tippkötter,Technische Universität Kaiserslautern – Biover-fahrenstechnik, Gottlieb-Daimler-Straße 44,D-67663 Kaiserslautern, Germany;Prof. Dipl.-Ing. Dr. tech. E. Heinzle,Dipl. Biol. A. Neuner,Universität des Saarlandes – Technische Bio-chemie, Campus A1 5, D-66123 Saarbrücken,Germany;Prof. Dipl.-Ing. Dr. techn. H.-J. Bart,M.Sc.Eng. D. Dimitrova,Technische Universität Kaiserslautern – Ther-mische Verfahrenstechnik, Gottlieb DaimlerStraße 44, D-67663 Kaiserslautern, Germany.

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