H5N1, H1N1, H7N7 –

Die Verozell-Technologie als wirksame Maßnahme

gegen mögliche Influenza-Pandemien

Otfried Kistner

Schladminger Gesundheitsgespräche:“Pandemien – Wie sicher ist Österreich”

Schladming, 5 - 6 Juni 2009

Strategien zur Prävention / Behandlung von Infektionen mit pandemischen Influenzaviren

Antivirale Medikamente- M2 Ionenkanal-Inhibitoren (Amantadin, Rimantadin) oder

Neuraminidase-Inhibitoren (Oseltamivir, Zanamivir)- können für die Prophylaxe oder eine frühe Behandlung

von Influenza (aber innerhalb der ersten 48 Stunden) verwendet werden

- Nebenwirkungen (Zentralnervensystem und Gastrointestinal-Trakt) und das Risiko einer schnellen Resistenzentwicklung der Viren (Amantadin, Rimantadine)

ImpfstoffeInfluenza-Impfstoffe können mit einer Wirksamkeit von 70% -90% gegen eine Infektion mit interpandemischen (epidemischen) Influenzaviren schützen. Laut Influenza-Experten, u.a. der WHO und des CDC sind Impfstoffe die beste Strategie, eine Pandemie zu bekämpfen bzw. zu verhindern

Tscheljabinsk(Russland)Aug. 2005

Donaudelta(Rumänien)Sept. 2005

ManyasseeDogubayazit(Türkei)Okt. 2005

Nowosibirsk(Russland)Juli 2005

Pawlodar(Kasachstan)Juli 2005

Qinghai See (China)Mai 2005 – Erregerbei Zugvögelnnachgewiesen

SüdkoreaDez. 2003

ChinaJan. 2004

JapanJan. 2004

Hongkong1997

VietnamJan. 2004

ThailandNov. 2003

IndonesienJan. 2004

MalaysiaAug. 2004

KambodschaJan. 2004

Betroffene Länder,Datum des ersten Auftretens

Bestätigte Todesfälle bei Menschen (WHO)(seit 2003: 262 von 433 Infizierten = 61%)Flugroute Zugvögel aus Südostasien

17

115

6

56

7

25

4

Modified Graphik @APA, Quelle: APA/Science/UNO World Food Programme

Ausbreitung von H5N1 in Asien und Europa durch Zugvögel

AserbaidschanÄgyptenIrakNigeriaLaos PDRPakistan

5

227

Stand 2. Juni 2009

121

Influenza-Impfstoff Produktion in bebrüteten Hühnereiern

27 February 2004 VOL 303 SCIENCE www.sciencemag.org

Keine Hühner – keine Eier – kein Impstoff (?)

WHO Memorandum 1995

Influenza has been a significant public health problem worldwide, with three pandemics during the past century. Immunization is the most effective measure to control an influenza pandemic. Since rapid production of large amounts of influenza vaccine depends on the availability of fertile hens‘eggs to grow the viruses, there is an urgent need for the development of alternative cell culture systems, which would allow rapid scale-up of production in the event of a pandemic. This WHO meeting discussed the results of studies from several laboratories on the cultivation of influenza viruses in stable cell lines, and made recommendations for further work.

Biomedizinisches Forschungszentrum in Orth / Donau

Keine regulatorischen Einschränkungen zur Verwendung von Verozellen für die Produktion von Impfstoffen für Menschen: Verozellen sind heute von Regulatorischen Behörden in mehr als 60 Ländern weltweit akzeptiert und werden seit mehr als 20 Jahren für die Produktion zugelassener Impfstoffe (hauptsächlich Polio und Tollwut) verwendetBaxter hat eine voll charakterisierte und ausgetestete Vero-Zell-Linie:

- US FDA lizensierter Pocken-Impfstoff (ACAM2000)- US FDA „Drug Masterfile“ für SARS Coronavirus und Influenza-

Impfstoffe (saisonal und „pandemic (-like)“)- Nationale Lizenz in den Niederlanden für saisonale Influenza-

Impfstoffe- EU Mock Up Lizenz für den H5N1 Influenza-Impfstoff Celvapan

Verwendung eines serumprotein-freien MediumsSehr großes Potential zur Herstellung einer Reihe von viralen ImpfstoffenFür alle Arten von Impfstoffen anwendbar:inaktivierte „whole virus-“ (Ganzkeim-), „split-“ (Spalt-) und „subunit-“ (Untereinheiten-) Impfstoffe sowie lebend-attenuierte Impfstoffe

Vorteile der Serumprotein-freien Verozell-Technologie

Serum-Protein-freie Verozell-Technologie zur Herstellung von (Kandidat-) Impfstoffen

• Influenzavirus – pandemisch und interpandemisch (Orthomyxovirus)• Vacciniavirus / Smallpox Vaccine ACAM 2000 & Recombinants• SARS Coronavirus (Coronavirus)• West Nile Virus (WNV) (Flavivirus)• Japanese Encephalitis Virus (JEV) (Flavivirus)• St. Louis Encephalitis Virus (SLEV) (Flavivirus)• Yellow Fever Virus (YFV) (Flavivirus)• Ross River Virus (RRV) (Alphavirus)• Chikungunya Virus (Alphavirus)• Western Equine Encephalitis Virus (Alphavirus)• Eastern Equine Encephalitis Virus (Alphavirus)• Venezuelian Equine Encephalitis Virus (Alphavirus)• Parainfluenza Virus (Paramyxoviren)• Rotavirus (Reoviren)• Hepatitis A Virus (HAV) (Picornavirus)Produktion von (Kandidat)-ImpfstoffenWachstumskinetiken

Baxter‘s Influenza-Impfstoff Produktionsanlagein Bohumil, Tschechien

Kapazität:20 Millionen Dosen des trivalenten saisonalen Influenza-Impfstoffs oder 100 - 120 Millionen Dosen an pandemischen Impfstoff pro JahrBohumil ist die erste und derzeit einzige GMP und BSL-3lizensierte Produktionsanlage für Zellkultur-Influenza-Impfstoffe

Baxter‘s Influenza Impfstoff Produktionsanlagein Bohumil, Tschechien: Fermentation

Verozell „Microcarrier“-Kulturen

vor der Infektion 2 - 3 Tage nach der Infektion

Baxter‘s Influenza Impfstoff Produktionsanlage in Bohumil, Tschechien: Reinigung und Fertigung des Bulkproduktes

Vorteile des Vero-Impfstoffes gegenüber denEi-Impfstoffen im Falle einer Pandemie (I)

Logistik

Die Produktion von Influenzaviren mit der konventionellen Ei-Technologie erfordert eine sorgfältige und vorausschauende Planung, um eine ausreichende Verfügbarkeit an bebrüteten Hühner-Eiern zu gewährleisten

Die Hühner in diesen Geflügelfarmen sind aber empfänglich für Infektionen mit Krankheitserregern. Der Fall des Hongkong H5N1 Vogelvirus von 1997 hat außerdem gezeigt, daß pandemische Viren auch das Potential haben können, embryonierte Hühnereier zu töten und damit eine Impfstoffproduktion verhindern zu können. Darüber hinaus kann es zu einem eklatanten Mangel an embryoniertenHühnereiern kommen, da auch die Hennen in den Geflügelfarmen an der Infektion mit pandemischen Influenzaviren sterben können.

Die Verozell-Produktion ist unabhängig von Eiern und kann daher zu jeder Zeit sofort gestartet werden.

Vorteile des Vero-Impfstoffes gegenüber denEi-Impfstoffen im Falle einer Pandemie (II)

Sicherheit / Schnelligkeit der Produktion

Influenzaviren mit pandemischen Potential erfordernBiosicherheitsstufen und -labors des Safety Level 3 (BSL-3)Baxter‘s Produktionsanlagen haben BSL-3 Status;der Vorteil: Wildtyp-Viren können direkt verwendet werdenHerstellanlagen für eine Produktion im bebrüteten Hühner-Eikönnen ausschließlich unter BSL-2 arbeiten und sind somitabhängig von der Verfügbarkeit von attenuiertenReassortanten;der Nachteil: Generierung und Safety-Testung der attenuiertenRG Reassortanten dauern mehrere Wochen, bevor dieImpfstoff-Herstellung starten kann

In dieser Zeit können durch die Verwendung des Wildtypsbereits mehrere Millionen Dosen pandemischer Impfstoffhergestellt werden

Baxter’s pandemisches Influenzavirus-Impfstoffprogramm

Spezifische Besonderheiten

Zellkultur (Verozellen), keine embryonierten Hühnereier

Wildtyp-Viren, keine attenuierten Reverse Genetics (RG) Reassortanten

“Whole virus”-Impfstoffe, keine “Split” oder “subunit”-Impfstoffe

Nicht-adjuvantiert

GMP lizensierte BSL-3 (“Biosafety level” 3) Herstellungs-Anlage

Sehr hohe Ausbeuten von mehr als 2 Millionen H5N1 A/Vietnam/1203/2004 Impfstoff-Dosen pro Fermenterlauf; resultierend in etwa 100 – 120 Millionen Impfstoff-Dosen pro Jahr

Electronenmikroskopische Analyse einesH5N1 (Vietnam 1203) Kandidat-Impfstoffes (Vergrößerung: 400.000x)

Evolution of the H5N1 Hemagglutinin Gene

Clade 2.3

Clade 2.2

Clade 2.1

Clade 1

Clade 0

Kreuz-neutralisierende Aktivität von Meerschweinchen-Seren, immunisiert mit einem H5N1 Vietnam 1203 Kandidat-Impfstoff

Subtyp Clade Virus Stamm Jahr Neutralisation-Titer

H5N1

1

Vietnam 1203 2004 1,810

Vietnam 1194 2004 1,660

Thailand 83 2004 1,810

2.1 Indonesia 05 2005 1,076

2.2 turkey/Turkey 2005 905

2.2 chicken/Egypt 2006 830

2.3 A/Anhui 2005 538

0 Hong Kong 156 1997 3,948

H5N3 - Duck/Singapore 1997 1,280

H7N1 - FPV/Rostock 1934 < 28

Der Vietnam 1203 Whole Virus Kandidat-Impfstoff induziert hohe Titer von neutralisierenden Antikörper

gegen alle getesteten H5 Stämme der wichtigsten Clades

Kreuz-protektiver Effekt des H5N1 Kandidat-Impfstoffs in Mäusen: Protective Dose 50 (PD50)

PD50: Antigen Dosis, die 50% der immunisierten Mäusegegen die Infektion mit lebenden H5N1 Viren schützt

Impf-StammH5N1 Challenge Virus Stamm

Indonesia 05(Clade 2)

Vietnam 1203(Clade 1)

Indonesia 05 3 ng 11 ngVietnam 1203 11 ng 6 ng

Zusammenfassung Verozell-Technologie und Präklinische Studien

• Die Verozell-Technologie ermöglicht den Start der Impfstoff-Produktion zu jeder Zeit, sobald ein pandemisches Influenzavirus identifiziert, isoliert und von der WHO zur Verfügung gestellt wird; das erste Impfstoff-Lot kann dann bereits nach 12 Wochen zur Verfügung stehen

• Erfolgreiche Entwicklung und Herstellung von monovalenten Whole VirusH5N1 Kandidat-Impfstoffen gegen Vietnam 1203 und Indonesia 05 mitBaxter’s serumprotein-freier Verozell-Technologie. Eine Reihe von Studienweisen darauf hin, daß Whole Virus Influenza-Impfstoffe potentielleffektiver als Split oder Subunit-Impfstoffe in “unprimed” Populationen zusein scheinen

• Schutzversuche (sog. Challenge-Studien) zeigten, daß dieseH5N1 Kandidat-Impfstoffe Mäuse erfolgreich gegen die Infektion mitVertretern verschiedener H5N1 Virus-Gruppen (“Clades”) schützten, d.h. gegen Vietnam 1203 von 2004 als Vertreter des “Clade 1”, gegen den “Clade 2” Stamm Indonesia 05 von 2005, sowie gegen einen der erstenhumanen H5N1 Isolate (Hongkong 156) von 1997; und somit das Potential einer sehr hohen Kreuz-Protektivität zeigen

Klinisches H5N1 Entwicklungs-Programm

Baxter Studien für EU “Mock-up” Lizenz (A/Vietnam/1203/2004)Phase I/II Dosis-Eskalierungs-Studie (N=270)

12-17 Monate Booster mit A/Indonesia/05/2005Phase III Studie in jungen und älteren Erwachsenen (N=550)

NIH / NIAID gesponsorte Studie (A/Vietnam/1203/2004)Phase I/II Dosis-Eskalierungs-Studie (N=300)

Baxter’s Clade 2 H5N1 Studie (A/Indonesia/05/2005)Phase I/II Studie (N=110)

US DHHS gesponsorte Studie (A/Indonesia/05/2005)Phase I Studie (N=420), gestartet

EU “Pre-Pandemic” Lizenz-StudiePhase III Studie in jungen und älteren Erwachsenen sowie Risiko-Patienten (n= ca. 3,560), gestartet

Phase I/II Klinische Studie mit Baxter’s H5N1 Impfstoff“A Dose-Escalation Study of a Mock Up Pandemic Influenza Vaccine”

Studien-Design

“Primary Objective”:Identifizierung der Wirksamkeit und Verträglichkeit verschiedener Dosen von adjuvantierten und nicht-adjuvantierten Impfstoff-Präparationen eines pandemischen “Mock-Up”-Impfstoffs

Anzahl der Probanden:N= 270, 18 - 45 Jahre

Impfschema:2 Impfungen: Tag 0 und Tag 21

Dosen:3.75 µg, 7.5 µg, 15 µg, 30 µg adjuvantiert mit Al(OH)37.5 µg und 15 µg nicht-adjuvantiert

Phase I/II StudieVerträglichkeit über 7 Tage: Systemische Reaktionen

nach 1. Impfung

nach 2. Impfung

Phase I/II Studie – SeroprotektionMikroneutralisations-Test gegen Wildtyp Vietnam 1203

Percentage of subjects with neutralising antibody response (MN titer ≥20)

0%7%

0% 2% 0% 0%

21%26%

41%

16%

40%

11%

69% 64%

76%

61%

71%66%

21%24%

55%

37%

71%

42%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

3.75µg adjuv. 7.5µg adjuv. 7.5µg 15µg adjuv. 15µg 30µg adjuv.

Phase I/II Studie – SeroprotektionMikroneutralisations-Test gegen Clade 0, 1, und 2 Stämme

Percentage of subjects with neutralising antibody response (MN titer ≥20) 7.5 µg non-adj. dose

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0%

41%

76%

55%

Vietnam 1203clade 1

5%

48%

76%71%

0%

24%

45%

33%

Hongkong 156clade 0

Indonesia 05clade 2

heterologous strains

Ehrlich et al. N Engl J Med 2008; 358:24. A clinical Trial of a whole-virus H5N1 vaccine derived from cell culture

ObjectivesVerträglichkeit und Wirksamkeit eines Vietnam 1203 H5N1 Impfstoffes in jungen und älteren Erwachsenen Effekt von Booster-Impfungen Untersuchungen zur Induktion einer zellulären Immun-Antwort (B- und T-Zell Memory)

Probanden: 550, eingeteilt in 18 – 59 Jahre sowie über 60 Jahre

Impfungen: 2 Impfungen, Tag 0 und Tag 21

Booster-Impfung: nach 6, 12 oder 24 Monaten

Dosis: 7.5 µg nicht-adjuvantierter H5N1 Vietnam 1203 Impfstoff

Studien-Sites: Österreich und Deutschland

Phase III Studie für EU “Mock-Up” LizenzStudien-Design

Phase III Studie – SeroprotektionMikroneutralisations-Test gegen Wildtyp Vietnam 1203

Percentage of subjects with neutralising antibody response (MN titer ≥20)

4%

17%

51%54%

73% 74%

40% 40%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

18-59 years > 60 years

Baxter's Verozell “Whole virus” H5N1 Impfstoffe (A/Vietnam/1203/2004 and A/Indonesia/05/2005) sind sehr sicher und verträglich; vergleichbar mit saisonalen und H5N1 Influenza “Split”-Impfstoffen, die mit der konventionellen Ei-Technologie hergestellt wurdenImpfstoff-Dosen mit einem niedrigen Antigen-Gehalt von 3.75 µg oder 7.5 µg sind hoch-immunogen, wie die serologische Austestung mit 2 etablierten Testen, dem MN (Microneutralization-) und dem SRH (Single Radial Hemolysis-) Test, zeigtNicht-adjuvantierte Formulierungen sind immunogener als adjuvantierteDie Impfstoffe zeigen eine sehr gute Kreuz-Neutralisation gegen H5N1 Viren verschiedener CladesDer Impfstoff ist in den beiden getesteten Altersgruppen, den jüngeren (18 – 59 Jahre) und den älteren (60+) Erwachsenen gleich immunogen und verträglich

Zusammenfassung und Conclusio (I)

Ein heterologer einmaliger Booster mit dem Clade 2.1 Impfstoff Indonesia 12 – 17 Monate nach der primären Immunisierung mit dem Clade 1 Impfstoff Vietnam 1203 induzierte eine sehr schnelle und sehr gute Immunantwort gegen den initialen und den Booster Stamm und zeigt somit eine ausgezeichnete Induktion einer kreuz-protektiven “Memory” (Gedächtnis-) Immunantwort

Schutzraten zwischen 90% und 100% wurden bereits 7 Tage nach der Booster-Impfung erreicht

Die schnelle Induktion einer effektiven Schutzantwort wurde nicht nur gegen den Clade 1 Stamm Vietnam 1203 und den Clade 2 Stamm Indonesia erzielt, sondern auch gegen Vertreter der Clades 2.2 (turkey/Turkey) und 2.3 (Anhui), die nicht im Impf-Schema enthalten waren

Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß der beste Schutz gegen eine Pandemie durch eine Kombination von derzeitig vorrätigen Impfstoffen (“Stock-Piles”) und der einmaligen Verwendung eines aktuellen Pandemie-Impfstoffes (“Advanced Purchase Agreements”) erzielt werden können

Zusammenfassung und Conclusio (II)

European Medicines Agency – PRESS RELEASE

London, 18 December 2008 Doc. Ref. EMEA/CHMP/670724/2008-corr.

PRESS RELEASE Meeting highlights from the Committee for Medicinal Products for Human Use,

15-18 December 2008

Pandemic influenza vaccineThe CHMP adopted a positive opinion recommending the granting of a marketing authorisation under exceptional circumstances and subject to specific obligations that will be reviewed annually for the pandemic influenza vaccine Celvapan (pandemic influenza vaccine (H5N1 whole virion, vero cell derived, inactivated)), from Baxter AG. Pandemic vaccines are vaccines prepared from influenza viruses with a pandemic potential that are intended for use during an officially declared influenza pandemic. EMEA review began on 27 February 2008 with an active review time of 205 days.

Szenario zur Entstehung eines neuartigen pandemischen Influenzavirus

HUMAN VIRUS AVIAN VIRUS PANDEMIC HYBRIDVIRUS

HUMAN VIRUSThe classicalhuman virus infects

many humans

The deadly avian viruscan only infect

few humans

Millions of people are infectedwith the deadly hybridvirus

AVIAN VIRUS

Titer verschiedener Influenza A Virus-Stämmeaus Menschen und Tieren in Baxter‘s Verozell-Kulturen

Subtype Host Strain HAUHuman A/PR/8/34 256

H1N1 Human A/USSR/90/77 256Swine A/Swine/1976/31 256Duck A/Duck/Bavaria/2/77 256

H2N2 Human A/Singapore/1/57 128

Human A/Hong Kong/1/68 128H3N2 Swine A/Swine/Hong Kong/3/76 128

Swine A/Swine/Hong Kong/127/82 256Duck A/Duck/Hong Kong/24/75 256

H5N3 Duck A/Duck/Singapore/3/97 256

H7N1 Fowl A/FPV/Rostock/34 256

H9N2 Fowl A/Quail/Hongkong/G1/97 128Human A/Hongkong/1073/99 256

Human A/Viet Nam/1194/2004 1024H5N1 Human A/Viet Nam/1203/2004 1024

Human A/SP83/2004 (Thailand) 512Human A/Indonesia/05/2005 1024Fowl A/turkey/Turkey/1/2005 1024Fowl A/chicken/Egypt/03/2006 1024

Besondere Aspekte assoziiert mit der Verwendung vonWildtyp-Viren und der serumprotein-freien Verozell-Technologie

Erfolgreiche Vermehrung einer Reihe von Influenza A-Viren aus Menschen und Tieren der Subtypen H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H5N3, H7N1, und H9N2; einschließlich des neuen Influenza A(H1N1) Virus

Robuster Produktions-Prozeß im industriellen GMP Maßstab (6000 Liter Fermentation)

Hohe Ausbeuten von H5N1 Impfstoff-Antigens durch die Verwendung von Wildtyp-Viren

Kurze und sehr flexible Productions-zeiten - unabhängig von bebrüteten Hühnereiern- unabhängig von attenuierten (abgeschwächten) Reverse Genetics (RG) Reassortanten

H5N1 whole virus (Kandidat-) Impfstoffe mit allen originalen H5N1 Proteinen sind hoch-immunogen und induzieren eine sehr gute neutralisierende Aktivität gegen H5N1 Viren der Clades 0, 1, und 2

H5N1:„Influenza – GAU“ = Worst Case Scenario

HUMAN VIRUS AVIAN VIRUS

PANDEMIC HYBRIDVIRUS

Allgemeines – WHO “Swine Influenza H1N1 Virus“ (I)

April 24, 2009 “Influenza-like illness in the United States and Mexico”

April 27, 2009 WHO declared Influenza Pandemic Alert Level 4

April 29, 2009 WHO declared Influenza Pandemic Alert Level 5

Allgemeines – „Swine Influenza H1N1 Virus“ (II)

Swine influenza virus with gene segments derived from4 different influenza virus families

PBE 2 North American avianPA North American avianPB 1 HumanHA North American swine (but from the rare H1N2 family) NP North American swineNS North American swineNA Eurasian swineM Eurasian swine

The HA is low path i.e. it does not contain the polybasic cleavage sitein contrast to H5N1. It carries a monobasic cleavage site like seasonalhuman H1N1 viruses

Das von der WHO empfohlene Influenza A(H1N1) Virus (California) vom CDC (Centers of Disease Control) erhalten und GMP-Saatviren erfolgreich in Baxter's serumprotein-freien Verozellen hergestelltErfolgreiche Vermehrung zu guten Titern im industriellen 6000 Liter Maßstab gezeigt und Herstellungs-Prozeß etabliert; somit einen Zeitraum von 12 Wochen für die Bereitstellung der ersten abgefüllten Impfstoff-Lots im industriellen Maßstab bestätigtAlle relevanten Testsysteme etabliert und qualifiziert; u.a. Titrations-Teste, serologische Teste, Safety-Teste, Identitäts-BestimmungenInfektions-Studien in kleinen Labortieren (Mäuse, Meerschweinchen, Hamster) durchgeführt. Die Infektion ist nicht lethal, aber das Maus-Modell kann als Challenge-Modell etabliert werden, da infektiöses Virus in den Lungen der infizierten Tiere nachgewiesen werden kann Erste Immunisierungs-Experimente in Mäusen und Meerschweinchen gestartet

Zusammenfassung Influenza A(H1N1)