Grundlagen der lasergestützten Charakterisierungvon Metabolismus und Morphologie von Zellverbänden

MEMOMEMOTeil 1Teil 1

Institut für Bioprozess- und Analysenmesstechnik (iba) e.V.Fachbereich BiowerkstoffeRosenhofD-37308 Heilbad HeiligenstadtDr.-Ing. K. LiefeithTel.: +49 (0)3606 671170klaus.liefeith@iba-heiligenstadt.de

LaVision BioTec GmbHMeisenstr. 65D-33607 BielefeldDr. H. SpieckerTel.: +49 (0)521 2997710spiecker@lavisionbiotec.com

Universität BielefeldBiophysik & Angewandte NanowisenschaftenUniversitätsstrasse 25D-33615 BielefeldProf. Dr. D. AnselmettiTel.: +49 (0)521 1065391dario.anselmetti@physik.uni-bielefeld.de

Erforschung eines optischen Messverfahrens zur dreidimensionalen berührungs- und zerstörungsfreien in vitro-Untersuchung und qualitativen Evaluierung von komplexen biologischen Systemen (LaVision BioTec GmbH, FKZ: 13N8434)

Erprobung von nicht-linearen Laser-Raster-Mikroskopieverfahren (Universität Bielefeld, FKZ: 13N8432)

Neue Kultivierungsmethode für das Tissue Engineering durch 3D-ECM-Analyse mittels zeit- und ortsaufgelösterLaserraster-Mikroskopie am Bioreaktor (iba Heiligenstadt, FKZ: 13N8435)

Teilverbundprojekte

Einleitung

Konservative Therapieformen der Arthrose (Abrasion, Pridiebohrung, Mosaikplastik) resultieren häufig in einem minderwertigen fibrösen Ersatzknorpel. Eine innovative Weiterentwicklung der seit 1993 praktizierten Therapie mit körpereigenen Chondro-zyten stellt die Matrix-gekoppelte Autologe Chondrozyten Implantation (MACI®) dar. Diese 3D-Kultivierungsmethode maximiert die Syntheseraten knorpel-spezifischer ECM-Moleküle bei gleichzeitiger Minimierung des chirurgischen Aufwandes. Als Ergebnis der präimplantativen Kultivierung werden auf Kollagen I/III-Membranen vorkultivierte Chondrozyten in das Defektareal implantiert.

Abb. 1: Chondrozyten auf einer Kollagen I/III-Membran (1-Photonen-Anregung bei 488 nm, CLSM, grün: autofluores-zierende Kollagen I/III-Faser und Keratansulfat(Anti-KS-FITC-Konjugat, monoklonal), rot: Zellge-genfärbung mit SYTO 83.

KeratansulfatChondrozyt

Kollagen I/III-Faser

Fließkammer (Bypass)

Medien-Inflow

Bioreaktor (Medienkonditionierung)

online-Kontrolle

durch2-Photonen-Mikroskopie

Ziel des Projektes

Knorpelbiopsie

Expansion autologer Chondrozyten

präimplantative in vitro-Kultivierungauf Kollagen I/III-Scaffolds

Erhalt der Zelldifferenzierung

geeignete Scaffoldmaterialien undScaffoldstrukturen

biochemische Stimulierung

mechanische/hydrodynamischeStimulierung

Knorpel

Therapie von Knorpelschäden

Knorpel besteht überwiegend aus extrazellulärer Matrix (ECM), deren Komposition eine entscheidende Rolle für die Funktionalität des Gewebes spielt. Das knorpel-typische Kollagen Typ II garantiert die strukturelle Integrität, während keratansulfat-tragende Proteglykane die mechanische Pufferleistung realisieren. Schädigungen des Knorpels manifestieren sich kurz- oder langfristig in Arthrosen.

Die während der Zellexpansion stattfindende zunehmende Zell-dedifferenzierung soll durch die Wahl geeigneter Scaffoldmaterialien sowie durch externe Zellstimulierungen während der präimplantativen Kultivierung minimiert bzw. aufgehalten werden. Die Bewertung differenzierungsfördernder Effekte kann über die Zellzahl, Zellverteilung, Zellmorphologie und ECM-Synthese (z.B. Keratan-sulfat, Kollagen Typ II; siehe Abb. 1) während der präimplantativen Kultivierung erfolgen.Die Herausforderung für eine online-2-Photonen-Mikroskopie besteht dabei in der komponentenspezifischen Visualisierung und quanti-tativen Analyse von Autofluoreszenzsignalen/SHG der drei wesent-lichen Komponenten: Scaffold, Chondrozyten sowie ECM.

verschiebbare Platte

biokompatible Membran

Zellzahl

Zellmorphologie

Synthese von ECM

Medienflow

Deckglas

Z

X-Y

Zellen auf Scaffold

obere Kammer

untere Kammer

rotierende Welle

hydrodynamischer Scherstress

mechanische Stimulation

Technik der Laserscannenden 2-Photonen-MikroskopieExperimenteller Aufbau

nichtlineare optische Absorp-tion limittiert die Anregung vonFluorochromen auf die Fokus-ebene

echte räumliche Selektivität

quadratische Abhängigkeitder Fluoreszenzintensität von der Anregungsenergie

Analyse von Geweben und Zellen unter nichtinvasivenBedingungen

schonende Gewebeanalyse

Reduzierung von Fotobleaching und Fotoschädigungen

keine Vorbehandlung der zu analysierenden Proben notwendig (Autofluoreszenz)

Analyse bis in eine Tiefe von 1 mm in biologischen Geweben und3D-Zellkulturen aufgrund der verwendeten hohen Wellenlänge mitgeringer Streuung von Photonen

Abb. 2: Grundlage der Multiphotonenmikros-kopie – die simultane Absorption von zwei oder mehr niedrig-energetischer Photonen zur Anregung von Fluoreszenz.

Vorteile der 2-Photonen-Anregung

1 Ti:Sa-Laser 5 Mikroskop 9 Dichroitischer Spiegel2 Pre-Chirp 6 Probe 10 Objektiv3 Strahl-Multiplexer 7 Filterrad / Spektrometer 11 PMT4 Scanner-Spiegel 8 Kamera

SchwammVlies (ACI-MaixTM)

Variation der Scaffoldstrukturzur Optimierung der

Zellperformance