Mikroskopie von Belebtschlamm, brauchen wir das noch?

Prof. Dr. Hilde LemmerMünchenlemmer@oec.net

Inhalt• Abwasserreinigung als biologischer Prozess• Selektion von Abwasserorganismen• Indikator-Organismen der Abwasserreinigung• Grundprinzip und Nutzen der mikroskopischen

Beurteilung von abwasserbürtigen Biozönosen• Möglichkeiten der mikroskopischen Bestimmung

von Indikator-Organismen- Lichtmikroskopie (Phasenkontrast, Hellfeld, Dunkelfeld)- Fluoreszenzmikroskopie (FISH, ELF)

• Nutzen mikroskopischer Untersuchungen -ein Paar Fallbeispiele

• Fazit

Abwasserreinigung als biologischer Prozess...

Abwasserreinigung im natürlichen Gewässer:Selbstreinigung des Fließgewässers

und Gewässergüte

www.wasserforscher.de

Das Saprobiensystem: Organismen als Verschmutzungsindikator

Abwasserreinigung in einer Kläranlage entspricht der Selbstreinigung eines Gewässers – konzentriert in Raum und Zeit

Mudrack & Kunst 1994

Festbett-Reaktor

Fluss

Fluss

durchmischter Reaktor

Biofilm -Organismen wachsen auf Grenzflächen

Organismen in Suspension, einzeln oder zu Flocken verklebt

Die Organismen, die sich bei der Abwasserreinigung entwickeln, entsprechen denen des Saprobiensystems, d.h. sie zeigen den aktuellen Verschmutzungsgrad an.

Selektionvon Abwasserorganismen...

Wachstumsrate / Schlamm-AufenthaltszeitDie große Vielfalt an Mikroorganismen in der Abwasserreinigung ermöglicht unterschiedlichste Wachstumsraten, je nach Aufenthaltszeit im System.

SuspensionFlockeBiofilm

Mudrack & Kunst 1988

Durchfluss-Reaktor

Fermenter mit Biomasse-Rückführung

Die Wachstumsrate wiederum beeinflusst den Abbauvon Abwasserinhaltsstoffen, z.B. Nitrifikation, Schadstoffabbau.

Organismenverteilung im Schlamm

niedriges Schlammalter / hohe Schlammbelastung

hohes Schlammalter / niedrige Schlammbelastung

Patterson & Hedley 1992

ccccc

Je höher entwickelt der Organismusist, desto längere Generationszeit, desto höheres Schlammalter ist nötig. Einfach strukturierte Organismen wie Bakterien wachsenschnell. Sie bestehen auch bei niedrigem Schlammalter.

Hoffman & Decho 1999

Hohe SchlammbelastungNahrung in der Wasserphasedirekte Aufnahme in freie Zellen

Niedrige SchlammbelastungNahrung adsorbiert an Schlamm oder PartikelHydrolyse durch Exoenzymeim Biofilm

* Schlammbelastung = kg BSB5/(kg TS * d)

Nahrungszugang für die Organismen

Spezifische Umweltbedingungenermöglichen das Wachstum spezifischer Organismen, die an diese Konditionen angepasst sind, d.h. es entwickeln sich spezifischeorganismische Lebensgemeinschaften = Biozönosen.

Das bedeutet, wenn die bevorzugten Wachstumsbedingungen für einen Organismus bekanntsind, und man diesen Organismus in der Biozönose entdeckt, dann können daraus die in diesem Biotop vorherrschenden Umweltbedingungen abgeleitetwerden. Der Organismus wird zum Zeigerorganismus oder Indikatororganismus.

Selektion von Abwasserorganismen

Indikator-Organismen der Abwasserreinigung ...

Selektion von Indikatororganismen

www.environmentalleverage.com; www.micrographia.com

www.asissludge.com

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SubstratScherkräfte

Nitrat

Sauerstoff pH-Wert

Temperatur

Ammonium

Phosphor

Grundprinzip und Nutzen der Mikroskopie von AbwasserorganismenSchon mit einfacherLichtmikroskopie können auffällige Organismen aus abwasserbürtigen Biozönosenganz spezifische Milieu- und Substratbedingungen aufzeigen.

Das hilft bei der Beurteilung� der Abwasserqualität� der Qualität der Betriebsabläufe� von Optionen für eine Anlagenoptimierung

Darüber hinaus unterstützt es die Beurteilung � von Nährstoff-, Sauerstoff-Versorgung� von (aufkommenden) Schlammabsetzproblemen� des Erfolgs der Bekämpfung von Blähschlamm,

Schwimmschlamm und Schaum� eines Einbruchs der Abbauleistung

Möglichkeiten der mikroskopischen Bestimmung von Indikator-Organismen

- Lichtmikroskopie- Fluoreszenzmikroskopie

Vorgehensweise bei der Licht-Mikroskopie

• Untersuchung von Form und Struktur der Schlammflocken• Untersuchung der hauptsächlich auftretenden Einzeller,

z.B. Amöben, Flagellaten, Ciliaten

• Untersuchung der hauptsächlich auftretenden Vielzeller, z.B. Rädertiere, Nematoden Bärtierchen, Bauchhärlinge

• Untersuchung von auffälligen Bakterien und Blaualgen

durch (1) Phasenkontrast-Mikroskopie von Nativpräparaten

durch (2) Dunkelfeld-Mikroskopie von Nativpräparaten

durch (3) Hellfeld-Mikroskopie von Färbepräparaten, gefärbten Organismen wie Algen

Phasenkontrast-Mikroskopie

Microthrix parvicella, ein Fadenbakterium in

BelebtschlammPhasenkontrast, 100-fach

Auffällige Organismen wie fadenförmig wachsende Bakterien sowie Einzeller können damit leicht aufgefunden und identifiziert werden.

www.lfu.bayern.de/analytik_stoffe/fachinformationen/biol_analytik_mikrobielle_oekologie/mikroskopie_techniken/

Achtung:Nicht-auffällige Bakterien wie Kokken oder Stäbchen werden mit dieser Technik nicht unterschieden!

Bild Margit Schade

www.stanford.edu/class/cee274s/photos/microscopy4.jpg

Dunkelfeld-MikroskopieLichtbrechende Strukturen wie eingelagerte Schwefelkügelchen in Schwefelbakteriensind im Dunkelfeld leicht zu erkennen

Thiothrix sp. in BelebtschlammDunkelfeld 100-fach

Hellfeld-Mikroskopiebei Färbetechniken wie Gram und Neisser

wikipedia.org/wiki/GramnegativDie Gram-Färbung differenziert zwischen dicker und dünner Zellwand von Bakterien dick: gram+ = blau; dünn: gram- = rot

Die Neisser-Färbung färbt Körnchen von Polyphosphat und ZellwändeN+ =grau-blau; N- = gelb

Microthrix parvicellain BelebtschlammBilder Margit Schade

Pseudomonas aeruginosa

Hellfeld-Mikroskopiebei gefärbten Organismen wikipedia.org/wiki/Gramnegativ

Phototrophe Organismengewinnen ihre Energie über Licht und nutzen dafür farbstoffhaltige

PurpurbakteriumChromatium okenii

GrünalgeChlamydomonas sp.

Cyanobakterium (Blaualge)Aphanizomenon flos-aquae

Chlorophyll A = grün, GrünalgenPhycobiline = blaugrün, CyanobakterienCarotenoide = orange, Purpurbakterienoder Mischungen hieraus

www.kit.edu/img/pi/2011_107_Angewandte_Lebenswissenschaften_im_Fokus72dpi.jpg

www4.fimr.fi/project/algaline/gallery/gallery.htm

www.plingfactory.de

BurgunderblutalgeOscillatoria rubescens

cdn.fotocommunity.com

Lichtfallen . Deren Farben können nur im Hellfeld unterschieden werden.

Und wie werden einfache Kokken und Stäbchen unterschieden?

www.uni-duisburg.de/.../05chem/0504/050401.jpg

Zur Untersuchungunauffälliger Organismen wie Bakterien sind ausgefeiltere Techniken nötig, z.B. die Fluoreszenz-Mikroskopie zurBestimmung der

���� Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)

���� Enzym-markierten Fluoreszenz (enzyme-labeled fluorescenceELF )

Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)

DNS-Stücke ("Gen-

Sonden")

Hybridisierung

Waschschritt

Martha

Erwin

Herr Unbekannt

Gen-Sonden-Technik

Cartoon Elisabeth Müller & Joachim Czichos

20 µm

B

C

A

Untersuchung nicht-fädigernocardioformer ActinomycetenMNP1-CY3A RaffinerieB Kommunale Anlage (WOR)C Kommunale Anlage (STA)

Fotos: Elisabeth Müller

www.lfu.bayern.de/analytik_stoffe/fachinformationen/biol_analytik_mikrobielle_oekologie/mikroskopie_techniken/

Untersuchung der Enzym-Aktivität in situ

Fädige Actinomyceten mit fluoreszenz-markierter

Enzym-Aktivität

Foto: Margit Schadewww.lfu.bayern.de/analytik_stoffe/fachinformationen/biol_analytik_mikrobielle_oekologie/mikroskopie_techniken/

Enzym-markierte Fluoreszenz (enzyme labeled fluorescenceELF) ermöglicht die mikroskopische Untersuchung von Enzym-Aktivitäten in situ . Die enzymatische Spaltung von fluoreszenz-markiertem Substrat ergibt einen leuchtenden Niederschlag an der Reaktionsstelle.

So wird die Aktivität von Lipasen, Esterasen, Phosphatasen oder Glucuronidasen in der unbeein-flussten Umweltprobe sichtbar gemacht.

Nutzen mikroskopischer Untersuchungen -ein Paar Fallbeispiele...

Problem einer Belebungsanlage mit Ringlace:Zusammenbruch Nitrifikation, Belebtschlamm orange

Chemisch-physikalische Messungen:Ammonium im Ablauf, Abfall BSB-Abbau

Phasenkontrast-Mikroskopie:Öltropfenwurm Aeolosoma sp. massenhaft

Ursachenfindung/ Problembeseitigung:Öltropfenwürmer weiden nitrifizierenden Belebtschlammab.Erniedrigung des Schlamm-alters, Animpfen mit Schlamm der Nachbarkläranlage.

www.mikroskopieren.de/bilder/fotos/aeolosoma_variegatum_hemprichi.jpg

Problem einer Belebungsanlage:Schwächelnde Abauleistung

Chemisch-physikalische Messungen:P-Gehalt im Ablauf > 0,5 mg/l

Phasenkontrast-/Hellfeld-Mikroskopie :

Ursachenfindung/ Problembeseitigung:Phosphor im Ablauf nicht voll bioverfügbar.Vorsichtige Erniedrigung des Fällmittel-Einsatzes zum Erhalt von ortho-P.

Gonin et al. 2000

Fadentyp 0041 untypisch blau in der Neisserfärbung� P-Mangel

Caulobacter sp.mit langen Stielen über 15µm �P-Mangel

www.environmentalleverage.com

Problem einer 2stufigen Belebungsanlage:Geruchsbildung in Stufe 1, O2-Eintrag schlecht

Chemisch-physika-lische Messungen:O2-Gehalt BB niedrig, P-Gehalt extrem niedrig

Phasenkontrast-Mikroskopie:Spirillen/Spirochäten� O2-Mangel

Ursachenfindung/ Problembeseitigung:Umpumpen stark fällmittel-haltigen Schlamms führt zu P-Fällung am falschen Ort. 021N-Biofilm verstopft Filterkerzen.Aussetzen des Pumpens, Reinigung der Belüfterkerzen.

www.pmbio.icbm.de/mikrobiologischer-garten/pics/mix09.jpg

schleimiger Aufwuchs von Fadentyp 021N auf den

Filterkerzen � P-Mangel

Eikelboom 2000

www.biologieolympiade-hessen.de/page6/page12/page13/files/page13-1036-thumb.jpg

Problem einer Belebungsanlage:Geruchsprobleme, Schlammindex steigt an

Chemisch-physikalische Messungen:O2-Gehalt Belebung 2 mg/l

Phasenkontrast-Mikroskopie:Fädige/nicht-fädige Schwefelbakterien mit Schwefel-Einlagerung � reduzierte Schwefel-Verbindungen, z.B. H2S

Ursachenfindung/ Problembeseitigung:

Reduzierte S-Verbindungen in faulenden Schlammablagerungen.

Kanalnetz spülen, Aufenthaltszeit VK verkürzen, Belüfter reinigen,

Räumerschild NK auf Schäden untersuchen.

www.asissludge.com

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Problem einer Tierkörper-Verwertungsanlage:Giftstoß erledigt Nitrifikation; Animpfen mit Schlamm der Nachbarkläranlage erfolglos

Chemisch-physikalische Messungen:hohe Ammonium-Werte, keine Nitrifikation

Fluoreszenz-Mikroskopie (FISH):Gensonden zeigen Nitrosomonas- und Nitrobacter-Arten in der TKV, in der Nachbar-KA hingegen Nitrosospira- und Nitrospira-Arten.

Ursachenfindung/ Problembeseitigung:Die Nitrifikanten der TKV sind völlig andere als die der kommunalen Anlage, die nicht an hohe NH4-Konzentrationen angepasst sind. Erst Animpfen mit Schlamm einer anderen TKV bringt Erfolg.

Nitrosomonas spp. blauNitrospira spp. rot

Nielsen et al. 2010

Problem einer Belebungsanlage:Schwimmschlamm durch Microthrix parvicella, Höhe der Al-Dosierung zur Bekämpfung unklar.

Chemisch-physikalische Messungen: Schlechte

Ablaufwerte wegen Schlammabtriebs

Phasenkontrast-/Hellfeld- + Fluoreszenz-Mikroskopie (ELF):Massenhaft Microthrix vorhanden, Lipase-Aktivität hoch, Al-Dosierung verringert Lipase-Aktivität deutlich.

Ursachenfindung/ Problembeseitigung:Saure Al-Salze behindern die Aufnahme von Fettsäuren durch Microthrix, geeignete Al-Dosierung drängt ihn also zurück. Monitoring der Lipaseaktivität ermöglicht eine Optimierung der Al-Dosierung. Die Faustregel-Konzentration von 3 mg Al/g TS * d kann oft deutlich unterschritten werden.

Bild Margit sSchade

Problem einer Belebungsanlage:Rückläufige AbbauleistungChemisch-physikalische Messungen:BTS 0,2 kg BSB5/kg TS * d

Phasenkontrast-Mikroskopie:Hoch organisierte Organismen wie

Räder-, Bärtiere, Nematoden � Schlammalter > 20d, ≠ t TS, aerob

Ursachenfindung/ Problem-beseitigung: Unterschätzung des wahren Schlammalters wegen nicht berücksichtigter Schlamm-mengen in NK und RS-Leitungen.Erniedrigung TSBB bis zur gewünschten BTS. www.environmentalleverage.com

Problem einer Belebungsanlage der Papierindustrie:ISV > 300 ml/g, Schlammabtrieb NK schleimig

Chemisch-physikalische Messungen:CSBAblauf filtriert ok, unfiltriert hoch wegen Schlammabtriebs, BSB:N:P-Verhältnis zeigt N-Mangel an.

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Ursachenfindung/Problembeseitigung:Hochlast-Fäden des Typs 021N führen zu schleimigem Blähschlamm. Zunächst Abhilfe durch N/P-Gabe, mittelfristig Einführung eines aeroben Selektors.

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Phasenkontrast-Mikroskopie:Starke Fädigkeit mit Fadentyp 021N, daneben auch Sphaerotilus natans �

Hochlast sowie Nährstoffmangel bzw. Kohlenstoff-Überschuss

Fazit

Mit einfacherLichtmikroskopie können auffällige Organismen aus abwasserbürtigen Biozönosenganz spezifische Milieu- und Substratbedingungen aufzeigen.

Das hilft bei der Beurteilung� der Qualität von Abwasser und Betrieb� der Nährstoff- und Sauerstoff-Versorgung� von (aufkommenden) Schlammabsetzproblemen� eines Einbruchs der Abbauleistung

Die Mikroskopie liefert schnell und kostengünstig redundante Hinweise zur Betriebsoptimierung und effizienten Problembekämpfung.

Korr. Abwasser 59 (5), 437-445, 2012.