Pharmazeutische Technologie und Medizinprodukte; Nanopharmazie_2

Nanopartikel zur Therapie und Diagnose

nawroth @uni-mainz.delangguth @uni-mainz.de

1. Prinzip, Typen von Nanopartikeln, Liposomen Teil 1

2. Herstellung, Charakterisierung, Liposomen & Lipoid-Partikel Teil 23. Magnetische Nanopartikel, Ferrofluide; Anwendungen

Liposomen : hohl Lipoid-Partikel : solid

• Der in Liposomen verkapselte Wirkstoff (Target) kann jeder Wasser-lösliche Stoff sein, z.B. Metallverbindungen für die Strahlentherapie, Wirkstoffe für Chemotherapie: MDT.

• Der in Lipoid-Partikel oder Aerosol-Partikel gelöste Wirkstoff kann jede lipophile Verbindung sein, z.B. Wirkstoffe für die Chemotherapie, Diagnose: MDT , Bildgebung.

• Polymere, Membranproteine und Oberflächengebundene Peptide • Magnetische Liposomen können Metall in drei Strukturen enthalten: a) Metallo-Lipid

Liposomen b) Liposomen mit verkapselten Maghemite Nanopartikeln, c) Metaloxide-LipidDoppelschalen-Liposomen. Der gebundene Wirkstoff (Target (T)) ,z.B. GdDTPA, drugs kann selektiv und zeitlich definiert freigesetzt werden (Lokalisation und Zeitsteuerung).

• Binäre Schalen- und Poly-Ferrofluide (d) enhalten z.B. ~ 10 - 100 magnetische Core-Partikelvon 10-20 nm Größe. Durch gezielte Struktur-Synthese können 5% Wirkstoff gebunden werden.

4 Typen von Pharma- Nanopartikeln :

Liposomen, Lipoid-partikel, Polymere, Ferrofluide

Liposome (30 – 500 nm) Lipoid-Particle Polymer Ferrofluid / magn-NP magnetic liposomeMicrosphere -------Aerosol particle--------- Poly-Ferrofluid multicomponent NP

kombinierte Partikel:

Herstellung von Liposomen und LipoidpartikelnPräparations-Schritte : Übersicht

1. Homogene Lipid-Filme : Lipide und lipophile Wirkstoffe (1)

2. Lipid-µ-Suspension und hydrophile Wirkstoffe (2)

3. Zugabe hydrophile Wirkstoffe (3), undLumen-Formulierung (innen)

Nanosuspension zum Rohprodukt

4. Reinigung: Entfernung des nicht-gebundenen Wirkstoffs (2,3) undMedium-Formulierung (außen)

5. Qualitätskontrolle QM: Analyse, Charakterisierung, Wirkstoff-Freisetzung

Hydrophile Wirkstoffe (2,3)

AmphiphileWirkstoffe

Lipophile Wirkstoffe

Vertiefende Vorlesung „Methoden der Membranbiochemie“ (PD. Dr. T. Nawroth): Montags 9h30-11h, Inst. f. Biochemie, Bibliothek

Liposomen : Aufbau und Typen SUV, LUV, MLV

• Einschalige Liposomen (..UV) : 1 Bilayer (5 nm):• SUV: kleine einschalige Liposomen: kleines Lumen • LUV: große einschalige Liposomen: großes Lumen,

aber geringer Lipidanteil• (GUV Riesenliposomen) … nicht für Pharma-Produkte

• Vielschalige Liposomen: mehrere Bilayer mit wässrigem Zwischenraum (3-4 nm)

• MLV: Multilamellare Lipid-Vesikel… verzögerte Wirkstofffreisetzung… hoher Lipidanteil (für hydrophobe, amphiphile W.)

• Liposomen, mit Ausnahme der GUV und großer MLV, sind zu klein, um im Mikroskop sichtbar gemacht zu werden. Bei Fluoreszenz erfolgt falsch zu große Abbildung (s = λ)

20 - 30nm

SUV

100 -

nm500

LUV

MLV

Vertiefende Vorlesung „Methoden der Membranbiochemie“ (PD. Dr. T. Nawroth): Montags 9h30-11h, Inst. f. Biochemie, Bibliothek

Herstellung von Liposomen und LipoidpartikelnPräparations-Schritt 1 : Lipid-Wirkstoff-Film

1.1. Herstellung organischer Lösungen : Lipide und lipophile Wirkstoffe (1)

1.2. Homogene Mischung1.3. Befilmung des Präparations-

gefäßes 1 (Kolben, Tank) (steriler Rotationsverdampfer)

1.4. Vakuumtrocknung :< 1mBar, > 5h zur Entfernung von Lösungsmittelresten

1.5. Cryo-Lagerung

Herstellung und Manipulation im Reinraum (GMP) !!

2.1. Herstellung wässriger Lösungen : Lumen-Formulierung und hydrophile Wirkstoffe (2)

2.2. Mischung2.3. Suspension im Präparations-gefäß1

(Kolben, Tank) durchRotationsmischung (Vortexing),Intensivmischung (Ultra-Turax), evtl. Gefrier-Tau-Zyklen

2.4. Aliquotierung / Lagerung : zur weiteren Suspension zum Produkt, ggfls. nach Zugabe weiteren Wirkstoffs (hydrophil).

Herstellung von Liposomen und LipoidpartikelnPräparations-Schritt 2 : Lipid-Wirkstoff-Suspension (H2O)

Herstellung und Manipulation im Reinraum (GMP) !!

µm-MLV

(DOPC)

Herstellung von Liposomen und LipoidpartikelnPräparations-Schritt 3 : finale Nano-Suspension

3.1. Herstellung: wässrige Lösungen : Hilfsstoffe, Lumen-Formulierung, hydrophile Wirkstoffe (3)

3.2. Mischung mit der Lipid-Suspension3.3. Nano-Suspension im Präparations-gefäß2

unter Schutzgas (steriler N2) durch:

- Ultraschall hoher Energiedichte : SUV. (30W/ml, 30 min.) - Ultraschall mittlere Energie, Zeit: LUV,. Lipoid-Partikel (Nano-Emulsionen) - Nanoporen-Filtration (Extruder): LUV - Ultraschall niedriger Energie: MLV- Rotationsmischung / Gefrieren : MLV - Hochdruck-Dispersion: Lipoid-Partikel . (Nano-Emulsionen)- Intensivmischung (Turax): Mikro- und . Nano-Emulsionen

… im Reinraum (GMP)

Herstellung von Liposomen und LipoidpartikelnPräparations-Schritt 4 : Entfernung von freiem Wirkstoff

4.1 Zentrifugation zur Entfernung vonBeimaterial (Ti-Späne, µm-Partikel)z.B. 13 000 g für 1 min.

4.2 Gelpermeation GPC oder Dialyse zur - Entfernung von nicht-gebundenem Wirkstoff aus dem Medium (außen)- Suspension in der. Medium-Formulierung. (im Außen-Medium)- Zufügen von Cryo-Protektien. (Trehalose) oder. Konservierungsmittel. (nicht bei Parenteralia)

4.3 Evtl. Gefriertrocknung zurKonserierung

… im Reinraum (GMP)

GelPermeations-Chromatographie GPC:- Material in Außen-Formulierung suspendieren !

- Sephadex G25m : 2 h steril quellen, 4x waschen

- Poly-Acrylamid-Gel (in situ autoklavierbar)

- Hydrophilisiertes Kieselgel (Toyo, Phenomex)

Herstellung von Liposomen : BeispielTarget-Liposomen für die Strahlentherapie

• F&E-Programm Nanotherapie(Nawroth, Langguth, Decker, Schmidberger, Bickes-Kelleher)

• Liposomen mit eingeschlossenem Metall-Chelat, z.B. Gd-DTPA, Er-DTPA, Lu-DTPAanalog für MRI/MRT: Magnevist, Gadovist (Schering);

• Fünf verschiedene Präparate aus einer Suspension -> Vergleichbarkeit

Festes Lipid (DOPC)

Liposomen1

Aliquotierung

Lipid-Suspension (MLV)

Medium

Lipidfilm

Nano-Suspension (Ultraschall, hohe ED.)

Aqua inj.

Wirkstoff 4 -LösungWirkstoff 2 Wirkstoff 3 Wirkstoff 1

Lumen-Formulierung

www.esrf.euESRF-Experimente

MD163, 249, 272

roheLiposomen1

Liposomen2 Liposomen3 Liposomen4 Liposomen5

roheLiposomen2

roheLiposomen3

roheLiposomen4

roheLiposomen5

Medium-FormulierungZentrifugations-GPC

Zellkulturen als Tumor-Modelle und Tierversuche (parallel) z.B. 32 * 96 = 3072 Tests (Multiwell)

Aliquotierung

Kontrolle

www.ill.euBAG-8-4; LTP

Formulierungen bei Liposomen : ZielsteuerungLumen- und Medium-Formulierung, Analysemethoden

• Medium-Formulierung :- brechen der Blut-Hirn-Schranke (BBB = blood brain barrier): hyperosmotischer Schock- Extrazelluläre Wechselwirkung, Aufnahme (Endocytose)

• Lumen-Formulierung :Intrazelluläre Wechselwirkung, Freisetzung aus dem Endosom, Wirkstoff-Freisetzung

• Zeitaufgelöste Analyse : Fluoreszenz (off-line), pulse-chase Methode (Pulsmarkierung mit Stop), Zellbiologische Testverfahren zur Proliferationshemmung (kinetische Zell-Test, „online“)

Nanopartikel Charakterisierung - 1 Ananlytik des Produkts: Wirkstoffgehalt und Partikelgröße

• Das Nanopartikel-Produkt ist mindestens in vierfacher Hinsicht zu analysieren:

- Wirkstoffgehalt (Photometrie, HPLC-Analytik, GC-MS)

- Partikelgröße (dynamische Lichtstreuung DLS; eventuell auch mit Streulichtmessung/ Photometrie)

- Wirkstoff-Freisetzung(Dissolution, kinetischer Test)

- Sterilität (Qualitätskontrolle)

Partikelgrößenverteilung, nach DLS (5 min. Messzeit)

Prinzip der Wirkstoffbestimmung an intakten Liposomen durch Photometrie

Drug release from liposomes: Shazly, Nawroth, Langguth (2008) Dissolution technologies 15, 7-10

Nanopartikel Charakterisierung - 2Sterilitätstest - Mikroskopische Inspektion

Sterilitätstests:

• Mikroskopische Inspektion:- niedrige Vergrößerung (100-fach): Pilze- hohe Vegrößerung (500-1300-fach):

Bakterien- Bakterien zeigen oft aktive Bewegung

• Mikrobiologische Untersuchung:- Probennahme unter Reinraumbedingungen(mikrobiologische Clean Bench)- Proben mit Agar-Platten kultivieren:

Standard-I medium (25 g/l, 2% Agar)Kulturzeit : 2 Wochen (30°)

- auf Staphylococcus aureus achten(stäbchenförmige Organismen, Bewegung)

Micrococcus Bakterien (1000-fach, Phasenkontrast)

Mikrobiologische Untersuchung von Nano-Pharmaka, Liposomen:

- Arbeitsplatz: mikrobiologische Werkbank (clean bench)- Petrischalen-Kulturen (Standard-I), Brenner, Impfösen (Platin)

Nanopartikel Charakterisierung - 3 Lipid-Ananlytik von Liposomen und Lipoid-Partikeln : DC, HPLC

• Lösen der Lipide aus den NP‘s durch org. Lösungsmittel (CHCl3-Methanol 3:1)

• Dünnschicht-Chromatographie Analyse (DC) nach Kopfgruppe und lipophilem Wirkstoff(CHCl3-Methanol-NH3 = 14:6:1)

• HPLC-Analyse nach Lipid-Kopfgruppe / Wirkstoff: SI60 / Lsgm.-Gradient >Polarität

• Fettsäure-Analytik (FS): - Lipide verseifen -> FS- FS in Methylester überführen(Diazomethan oder MeOH-H2SO4)- Gas-Chromatographie

Vertiefende Vorlesung „Methoden der Membranbiochemie“ (PD. Dr. T. Nawroth): Montags 9h30-11h, Inst. f. Biochemie, Bibliothek

Nanopartikel Charakterisierung 4 Partikelstruktur, -Größe : Streumethoden, Bildgebung

• Mikroskop : nur für große NP‘s (>0,5 µm)• Photometer: Lichtstreuung ergibt scheinbare

Absorption : A ~ 1/λ (Chong & Colbow), geeignet als Identitätstest

• Spektral-Photometer, Fluorimetrie: Bestimmung des Wirkstoffgehalts ohne HPLC / Trennschritt (fallabhängig)

• Genaue Struktur: Kleinwinkelstreung von Neutronen- oder Röntgenstrahlung (SANS, SAXS); Nachteil: aufwändig

• Laser-Diffraktion: Größenverteilung nur bei großen Partikeln (d = 300 nm – 0,1 mm); Nachteile: teuer, Probe wird stark verdünnt

• Elektronenmikroskopie EM : Einzelpartikel-Analyse, statistisch schwierig; nur für den F&E-Bereich

• Ungefähre Struktur ( ~10%) und Größenverteilung mit einfacher Methode: dynamische Lichtsteuung DLS- bei konzentrierten Orginalproben wegen Mehrfach-streuung unbedingt als Rückstreuung (α = 170°)- bei Nano-Pharmaka ist die Analyse an geschlossenen Vials möglich (steril, individuelle Einzelproben)

Analytik im Apothekenbereich und Klinik-Qualitätssicherung (QS) : Sterilitätstest / Mikrobiol. Untersuchung, Photometrie, Mikroskopie und DLS (20 – 50 000 €)

Prinzip der Streumethoden

Nanopartikel Charakterisierung - 5Partikelstruktur, -Größe : Mikroskopie

• Auflösung bei inkohärenter Lichtquelle (standard) auf die Wellenlänge beschränkt (0,6 µm; 1300-fache Vergrößerung) –zu gering für echte Nanopartikel!

• Liposomen und Lipoidpartikel sind farblos -> Phasenkontrast-Mikroskopie (Optik nach Zernicke)

• Zelluläre Lokalisation von Rezeptoren und aufgenommenen Nano-Pharmaka durch Fluoreszenz-Mikroskopiemöglich; Problem: Bleaching der Farbstoffe

Liposomen (MLV)

Zellen (Glioblastom)

Phasenkontrast-Mikroskop :

Strahlengang mit 2 Blenden (Ring-, Schlitzblende

Neutronenstreuung SANS und Elektronenmikroskopie Liposomen mit eingeschlossener RT-Target-Lösung (Charakterisierung - 6)

Unilamellare Liposomen (SUV): SANS gibt Größe (Rg) und Membrandicke (d) in 1s (ILL-D22, TR-SANS: zeitaufgelöst = Film).

Target-Lösung (Wirkstoff) eingeschlossen: Gd-DTPA (EM, links)

SANS of SUV from SBL (12g/l) in D2O (Tris-MES, pH7)

yields size and d-membrane

Size & d-membrane by SANS: Nawroth, Conrad, Dose (1989) Physica B156, 477

Nanopartikel Charakterisierung - 7Elektronen- Mikroskopie : Einzelpartikel-Visualisierung

• Direkte Visualisierung (a) kommt für metallhaltige NP‘s in Betracht.

• Negativ-Kontrastierung / Negative stain (b) ist die wichtigste Standard-Methode bei EM

• Lipid-Nanopartikel sind strukturell nicht fixiert. Daher eignet sich vor allem Cryo-EM (c) und Gefrierbruch-EM (d, und Präparat-Schema rechts)

• Metalle können durch EDX (e) im Raster-scanning-EM lokalisertwerden (Punktfokus, Röntgenfluoreszenz)

Übersicht über die wichtigstenPräparations-methoden zur Elektronenmikroskopie biologischer Proben. Probenpräparation Gefrierbruch-EM.

Vertiefende Vorlesung „Methoden der Membranbiochemie“ (PD. Dr. T. Nawroth): Montags 9h30-11h, Inst. f. Biochemie, Bibliothek

Struktur von therapeutischen Nanopartikeln :die medizinische Sicherheit hängt von den Eigenschaften ab

• Chemical and spectroscopy analysis of targetentrapping and release, and of components

• Average particle size estimation bydynamic light scattering DLS (PCS)

• Structure of individual particles byelectron microscopy (TEM)

• Structure and dynamics investigation byneutron small angle scattering SANS and TR-SANS (time-resolved)at ILL-D22

• Structure and target localization byanomalous X-ray scattering ASAXS and EXAFS at L-edges: at ESRF-ID1

• Target absorption at therapeutically used K-edges : at ESRF-ID17

TEM of a liposome (SUV) bearing Gd-DTP-DMPE

DLS of a disk-shaped Poly-Ferrofluid (160x10nm)for medical applications

SANS of a liposomes yields size & volume @ ILL-D22.

Lanthanide Nano-targetbiocompatible Gd-citrate formulation @ ESRF-ID1

Nanoparticles for therapy can carry drugs of radiation therapy targets (lanthanides).A size of 100 nm is optimal in load and avoids embolic, which appears, if >500 nm

The nanoparticles are characterized by:

embolic risk limit

(Charakterisierung - 8)

Nanopartikel Charakterisierung 9 Partikelgrößenverteilung : Dynamische Lichtstreuung DLS

• Partikel im Laser-Lichtstrahl erzeugen Interferenzmuster (Specles, 2D)

• Lichtstreu-Messung bei der nicht die Winkelabhängigkeit, sondern die zeitliche Schwankung ermittelt wird

• Das Streulicht schwankt im Maße der Brown‘schen Molekularbewegung, d.h. der Diffusion (Temperatur-abhängig).

• Bei Nanopartikeln erfolgt die Variation im µs-Bereich –> schneller Detektor.

• Analyse durch Autokorrelationsfunktion(Häufigkeits-Analyse).

• Die Interpretation mit allgemeinen Streugesetzen (I ~r6, M ~r3 etc.) liefert die Massenzusammensetzung der Probe aus Partikelpopulationen verschiedener Größe

• Bei konzentrierten Proben (Pharma-NP‘s) muß in Rückstreuung gemessen werden (170°)

Specles

Laser-Lichtstrahl

NP‘sBewegung

µs