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6. Woche

Glastechnik

Glastechnische Arbeiten dürfen nur unter ständiger Überwachung des

Praktikumsleiters durchgeführt werden.

Schneiden des Glasrohres

Das Schneiden des Glasrohres geschieht mit Glasschneidemesser (od. mit

Ampullenfeile). Ein Strich mit dem Glasschneidemesser wird um das Umfang des

Glasrohres gemacht (ca. ein achtel des Umfanges soll eingeschnitten werden) so,

dass das Werkzeug an das Rohr gedrückt wird und das Rohr von uns gedreht wird.

Halten wir das Rohr jetzt mit unseren beiden Händen so, dass beide Daumen an der

Gegenseite des Schnittes anlehnen, und gleichzeitig ziehen wir das Rohr stark

„auseinander“. Das Rohr bricht wo eingeschnitten wurde, splitterfrei. Die scharfen

Kanten können wir abschmelzen.

Anfertigung von Kapillaren

Zur Anfertigung von Kapillaren schneidet man einige 6-8 cm lange Rohrstücke

(Durchmesser 6-8 mm) aus Weichglas (=Glassorte mit niedrigem

Erweichungspunkt). Das Rohr lässt sich auf der „Stichflamme“ eines Bunsenbrenners

erweichen. Das Rohrstück wird mit beiden Händen nahe zu den Rohrenden

gehalten. Die Mitte des Rohres wird beim ständigen Rühren solange erhitzt bis es

weich wird und die Flamme gelb gefärbt wird. Das Rohr wird jetzt aus der Flamme

genommen und kräftig auseinander gezogen (ca. 50-70 cm) und in dieser Position

gehalten, bis das Glas sich erhärtet (dauert einige Sekunden). Die Kapillare wird nun

in 5-7 cm langen Stücken geschnitten und in einem Reagenzglas aufbewahrt.

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CHROMATOGRAPHISCHE ANALYSENVERFAHREN

Die Chromatographie ist ein Verfahren zur Trennung von Stoffgemischen oder

zur Gewinnung hochreiner Stoffe. Die zu trennenden Substanzen werden über 2

Phasen verteilt. Eine dieser Phasen ist unbeweglich und hat eine große Oberfläche,

die andere Phase ist beweglich und bewegt sich durch die andere hindurch. Die

unbewegliche Phase kann ein Feststoff (auch Adsorbent genannt), oder eine

Flüssigkeit sein. In diesem Fall wird die Flüssigkeit als dünner Film auf einem

porösen, kleinkörnigen Feststoff ausgebreitet. Die bewegliche Phase kann eine mit

der unbeweglichen Phase nicht mischbare Flüssigkeit, oder ein nichtlösliches Gas

sein. Die Komponente des zu trennenden Gemisches binden sich gemäß einem

physikalisch-chemischen Mechanismus in unterschiedlichem Maße an die stationäre

Phase, und die Probenbestandteile wandern entlang der stationären Phase. Diese

Bewegung wird von der „mobilen” Phase gesichert. Die Chromatographie wurde

1903 von dem russischen Biologen Tswett entdeckt, als er eine Lösung grüner

Pflanzenfarbstoffe durch eine mit Kalk gefüllte Säule laufen ließ. Die Farbstoffe

passierten die Säule unterschiedlich schnell und trennten sich auseinander. Die

Trennung beruht hier auf der unterschiedlich starken Adsorptionsbindung zwischen

den einzelnen Farbstoffen (Adsorptiv) und dem Kalk (Adsorbent). Die Methode hat

sich allerdings erst in den zwanziger-dreißiger Jahren verbreitet als Ergebnis der

Arbeiten von Kuhn, Lederer und Zechmeister. (Zechmeister war der Institutsleiter

unseres Institutes von 1924 bis 1940.) Heute ist die Chromatographie eine weit

verbreitete Analysenmethode geworden, die in allen Gebieten der chemischen,

biochemischen und biologischen Analytik angewendet wird.

Einteilung der chromatographischen Verfahren:

• Nach Aggregatzustand der stationären und mobilen Phase

• Nach der Technik der Ausführung

• Nach dem Mechanismus der Trennung

Als stationäre Phase kann ein Festkörper mit großer aktiver Oberfläche

verwendet werden, dann spricht man bei Verwendung von Gasen als mobile Phase

von Gas-Adsorptionschromatographie (gas-solid chromatography GSC) oder, mit

flüssiger mobiler Phase, von Flüssig-Adsorptionschromatographie (liquid-solid

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chromatography LSC) Verwendet man eine Flüssigkeit als stationäre Phase, die von

einem inerten Träger mit großem Porenvolumen aufgesaugt ist, dann unterteilt man

in Gas-Verteilungschromatographie (gas-liquid chromatography GLC) und Flüssig-

Verteilungschromatographie (liquid-liquid chromatography LLC).

Nach der Methode der Ausführung unterscheidet man zwischen „dreidimensionalen“

oder Säulenchromatographie und „zweidimensionalen“ Schicht- und Papier-

Chromatographie.

Für die Entwicklung der Chromatogramme verwendet man bei der Trennung fast

ausschließlich die sog. Elutionsverfahren. (Hier wird die Probe in den kontinuierlich

strömenden Eluenten gegeben.) Die sich stark an die stationäre Phase bindende

Substanz bewegt sich kaum oder langsam, während die sich schwach bindende

Substanz sich schneller bewegt (Abb. 1).

Abbildung 1. Prinzip der Elution

Chromatographische Trennmechanismen:

Adsorptionsvorgänge

Verteilungsvorgänge

Austauschvorgänge

Ausschlußeffekte

Biospezifische Effekte

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Adsorptionschromatographie

In der Adsorptionschromatographie spielen die heterogene Gleichgewichte (gas-fest,

flüssig-fest) eine Rolle, die infolge der verschiedenen Absorptionskräften, die

zwischen der stationären Phase und den Komponenten des zu trennenden

Gemisches auftreten, entstanden sind. (Die mobile Phase darf nur schwach

adsorbiert werden, da sonst die adsorbierenden aktiven Stellen blockieren würden.)

Die Stärke der Absorption hängt von der Molekülstruktur, von der Zahl und

Charakter der Funktionsgruppen der zu trennenden Moleküle, von dem

Polaritätsverhältnis zwischen Adsorbent und mobiler Phase ab. Das

Adsorptionsgleichgewicht kann in weitem Umfang durch die Wahl der stationären

oder mobilen Phase beeinflusst werden. Adsorptionschromatographie kann man

sowohl in Säulen als auch in Schichten ausführen.

Verteilungschromatographie

Verteilungschromatographie basiert auf der abweichenden Löslichkeit der

einzelnen zu trennenden Stoffe in den sich miteinander nicht mischenden

Flüssigkeiten. Man bindet die als stationäre Phase dienende Flüssigkeit als einen

Flüssigkeitsfilm an die Oberfläche eines festen Stoffes (Träger). Der Träger kann z.B.

Kieselgel (Silicagel), Aluminiumoxid, Zellulose, künstliches Polymer, (z.B. Polystyrol)

sein. Der mit der stationären Phase beladener Träger hält diese auch dann fest,

wenn eine damit nicht mischbare Lösung (oder Gas) daran vorbeigeführt wird (mobile

Phase). Gewöhnlich ist die stationäre Phase polar, und die mobile Phase weniger

polar, aber immer öfter kommt die gegengesetzte Phasenfolge vor: die stationäre

Phase ist hydrophob, (kann sogar ein Kohlenwasserstoff sein) und die mobile Phase

ist eine polare, hydrophile Flüssigkeit. Diese Phasenordnung nennen wir

Chromatographie mit umgekehrter Phase (Reversed Phase Chromatography RPC).

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Ionenaustauschchromatographie

Bei der Ionenaustausch-Chromatographie stellt sich ein

Austauschgleichgewicht zwischen den Ionen in der Lösung und den sog.

Gegenionen ein, die an eine feste stationäre Phase nur elektrostatisch gebunden

und deshalb austauschbar sind. Die stationäre Phase ist meistens ein Kunstharz mit

entsprechenden funktionellen Gruppen (Kunstharzaustauscher). Prinzipiell

unterscheidet man zwischen Kationen-Austauschern und Anionen-Austauschern. Die

Wanderungsgeschwindigkeit der Ionen wird meist durch den pH-Wert des Eluenten

bestimmt.

Die Kationaustauscher enthalten säurige Oberflächen-Gruppen (Sulfonsäure: -

SO3H, Carboxyl: -COOH, Phenol-OH usw.), die Anionaustauscher basische

Oberflächen-Gruppen (Aliphatische oder Aromatische Amine, Hidroxylamine,

quaterne Ammoniumgruppen) (Abb. 2).

Abbildung 2 Prinzip des Anionenaustausches

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Ausschlusschromatographie

Diese, vor allem in der Biochemie und Naturstoffchemie angewandte,

chromatographische Methode nutzt die Größenunterschiede der zu trennenden

Moleküle zur Trennung aus. Bei der Elution erscheinen die einzelnen Komponenten

nacheinander in der Reihenfolge abnehmender Molekülgröße, d.h. die größten

Moleküle (mit der höchsten Molmasse) werden zuerst eluiert. Erklärt wird dieser

Vorgang durch das sog. Ausschlusskonzept. Danach enthält das Gel Poren

definierter Größe. Die größeren Moleküle können nicht in das Innere der stationären

Phase eindringen und werden daher vom Lösungsmittel (mobile Phase) rascher

fortgeführt als kleine, diffusionsfähige Moleküle. Somit erscheinen alle Moleküle,

deren Molekülgröße (und damit ihre Molmasse auch) außerhalb der

Ausschlussgrenze liegt, praktisch gleichzeitig im Eluat. Mittelgroße Moleküle dringen

demgegenüber unterschiedlich (je nach Molekülgröße) in das Gel ein. Sie können

dadurch voneinander getrennt werden. Ihnen steht für diese Diffusion ein Teil des

Volumens der Gelporen zur Verfügung. Kleine Moleküle durchdringen die gesamte

Gelmatrix und werden ungetrennt am spätesten eluiert. Muss man nur sehr große

Moleküle von sehr kleinen trennen, spricht man oft von Gelfiltration. Überschreitet

das zu trennende Gemisch einen großen Fraktionsbereich (Molmassenbereich),

nennt man es diesen Prozess Ausschluss-chromatographie (Gelchromatographie)

(Abb. 3).

Als stationäre Phasen werden „soft-Gele“ und „hard-Gele“ verwendet. Softgele

müssen vor Gebrauch erst in Wasser gequellt werden, um die entsprechende

Porenstruktur zu erreichen. Hardgele haben eine von der mobilen Phase

unbeeinflussbare Porenstruktur. Die verwendeten so genannten „Molekülfilter“ sind

perlförmige, im Wasser unlösliche Polymere (Dextran, Agarose, Polyakrylamid,

Polystyrol, usw.).

Der Fraktionierungsbereich bedeutet die untere und obere Grenze der

Molekülgröße, die mit dem Gel getrennt werden kann. Die ausschließende

Molekülgröße (Ausschlussgrenze) bedeutet die Molekülgröße, die nicht mehr ins Gel

eindringen kann.

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Abbildung 3. Prinzip der Ausschlusschromatographie

Spezielle Mechanismen

Über Affinitätschromatographie sprechen wir, wenn die stationäre Phase

aktive Stellen enthält, die spezifisch für eine gewisse Verbindungsgruppe besonders

hohe Affinität zeigen. Ein Beispiel ist die Komplexbildung zwischen einem Enzym

und seinem Substrat.

Chromatographische Trennsysteme werden als chiral bezeichnet, wenn sie

Moleküle mit asymmetrischen Kohlenstoffatomen besitzen. Mit Hilfe von chiralen

Trennsystemen können Enantiomere von biologisch aktiven Substanzen getrennt

werden.

Die Chromatographie als analytische Methode

Wenn Chromatographie als analytische Methode angewendet wird, taucht die

Frage auf, ob die Methode für qualitative oder für quantitative Analyse geeignet ist?

Die Antwort ist: für beide. Die qualitative Auswertung der Chromatogramme erfolgt

so, dass die getrennten Substanzen durch bestimmte Kenngrößen charakterisiert

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werden. Diese sind für eine große Anzahl von Verbindungen bekannt und können

daher in vielen Fällen zur Identifizierung verwendet werden. Im Allgemeinen

beziehen sich die Kenndaten darauf, wie lange eine Substanz braucht, bis sie vom

Eingangspunkt (Einlaß, Start) zum Endpunkt (Ausgang) gelangt, d.h. wie stark sie

zurückgehalten wird (Retention) (Abb.4). Als Retentionszeit bezeichnet man in der

Gas- und Säulenchromatographie die Zeit, die vom Start bis zum Auftreten des

Substanzmaximums am Ausgang vergangen ist.

Die quantitative Bestimmung basiert darauf, dass die Größe des am

Chromatogramm ersichtlichen Signals im (möglichst linearen) Verhältnis zu der

Menge des betroffenen Stoffes steht. Für die quantitative Auswertung der

Chromatogramme werden meist die Flächen der Banden (auch Signalen, Peaks

genannt) integriert und miteinander verglichen. Auch ein Schichtchromatogramm

kann quantitativ ausgewertet werden, wenn mit Hilfe von optischem Densitometer die

Schicht abgetastet, und ein Chromatogramm aufgezeichnet wird. Da bekommen wir

ein Chromatogramm, ähnlich wie bei der Säulenchromatographie.

Abbildung 4 Das Chromatogramm

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Papierchromatographie

Träger der stationären Phase ist reine Cellulose, ein spezielles Filterpapier

(sog. Chromatographie-Papier). Die eigentliche stationäre Phase ist Wasser. Die

Cellulosenfaser ist entweder schon mit Wasser benetzt oder man lässt das

wasserhaltige, organische Laufmittel durchsickern, so dass ein Teil des Wassers

vom Papier adsorbiert werden kann und mit ihm zusammen die stationäre Phase

bildet. Als mobile Phase (Fließmittel) verwendet man z.B. wasserhaltiges n-Butanol,

Ethylacetat usw.

Arbeitsphasen der Papierchromatographie:

Auftragen der Probe: Die zu trennende Probe wird mit Hilfe von Kapillar-

Mikropipette, Mikrospritze oder einfach mit einer Glaskapillare als möglichst kleiner

Substanzfleck auf den Papierstreifen aufgetragen und trocknen gelassen

(Startpunkt). Die Größe des Fleckes soll nicht über 0.5 cm sein. Die untere Grenze

der Probenmenge wird durch die Empfindlichkeit der Entwicklungsmethode

angegeben.

Trennung: Das Papier wird in eine – mit der benötigten Menge Laufmittel gefüllte –

Trennkammer gehängt oder gestellt.

a.) Aufsteigende Chromatographie (Abb. 5):

Die Lösungsmittelfront läuft nach oben. Da die Schwerkraft den Kapillarkräften

entgegenwirkt, nimmt die Sauggeschwindigkeit allmählich ab, die Laufstrecke ist

begrenzt (20-30 cm). Der Startpunkt liegt 2.5 – 3 cm von dem unteren Ende des

Streifens.

Abbildung 5.

Aufsteigende Papierchromatographie

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b.) Absteigende Chromatographie

Hier wird das Papier über den Rand einer Wanne herangehängt und nur mit

seinem oberen Ende in die mobile Phase eingetaucht. Die Trennung erfolgt

schneller, da Kapillarkräfte und Schwerkraft gemeinsam wirken.

c.) Zirkular-Chromatographie

Da läuft die mobile Phase von der Mitte eines Rundfilters aus kontinuierlich nach

außen. Das Laufmittel wird mit Hilfe eines Papierdochtes von unten angesaugt

(Abb. 6.).

Abbildung 6.

Zirkular-Chromatographie

Bei keinen Verfahren darf das Lösungsmittel während der Durchführung der

Trennung verdunsten. Man verwendet deshalb geschlossene Apparaturen (meist

Glaskammer), deren Atmosphäre mit den Dämpfen des verwendeten

Lösungsmittelgemisches gesättigt ist.

Nachweis der einzelnen Substanzen („Entwicklung“)

Zum Nachweis der einzelnen Substanzflecken werden diese, sofern sie keine

Eigenfarbe haben, mit einem Sprühreagenz besprüht, die zusammen mit den

Substanzflecken Farbeffekte gibt („Entwicklung“).

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Aminosäuren und Proteine sind z.B. mit Ninhydrin, reduzierende Zucker mit

Ammoniak-Silber-Nitrat, Phenols mit Eisen(III)Chlorid, Karbonsäuren mit Säure-Base

Indikatoren, usw. hervorzurufen. Das Reagenz bringt man mit einem Zerstäuber auf

Abb. 7).

Abbildung 7. Zerstäuber

Oft hilft es auch, das Chromatogramm im UV-Licht zu betrachten, falls die

Substanzen entsprechend absorbieren (z.B.Steriode) (Abb. 8).

Abbildung 8. Nachweis mit UV-Lampe

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Die Komponente eines Substanzgemisches werden durch ihre

Wanderungsgeschwindigkeit charakterisiert. In der Papierchromatographie und

Dünnschichtchromatographie gibt man meist die sog. RF-Werte an (retention factor).

Entfernung des Substanzflecks (Mitte) vom Start RF =———————————————————— Entfernung der Lösungsmittelfront vom Start

RF ist eine Zahl zwischen 0 und 1. RF ist für ein Stoff charakteristisch, aber nur

bei konstanten Verhältnissen: gleiches Papier, gleiches Lösungsmittel-System,

konstante Temperatur, gleiche Laufzeit, usw.). Zur Sicherheit lässt man meist bei

einem Chromatogramm eine bekannte Vergleichsubstanz (Referenzsubstanz)

mitlaufen, um Veränderungen der RF-Werte kontrollieren zu können.

Versuch 1

Untersuchung von Faserschreiber-Farben mittels Zirkular-Chromatographie

Durchführung:

Vom Fließmittel (Gemisch Toluol-Methanol 10:1, oder 50:1) gieße man ca. 10 cm3 in

den Unterteil einer Petri-Schale, und decke man sie mit dem Oberteil ab. Markiere

und durchlöche man den Mittelpunkt des Chromatographie-Papiers (Marke:

Whatman No 1). Zeichne man mit Bleistift (Grafit!) mit Hilfe eines 2 Forint

Geldstückes einen Kreis um die Mitte des Papiers. Mit Faserschreibern

verschiedener Farben ziehe man 8-10 mm lange Bögen entlang des Kreises (3-4

Bögen). Die Bögen sollen einander nicht berühren! Stecke man einen ungefähr 1,5

cm langen Filterpapierdocht in das Loch, wodurch das Lösungsmittel aufgesaugt

werden kann. Dann lege man das Filterpapier in die Petrischale so, dass das Docht

2-4 mm ins Lösungsmittel hineinhängt, und decke man sie mit dem Oberteil ab. Das

Chromatogramm entwickelt sich in 10-30 Minuten. Die Front darf den Rand der

Petrischale nicht erreichen. Die Trennleistung des Systems kann gut veranschaulicht

werden, wenn auf einem Feld alle Farben, die auch separat aufgebracht wurden,

aufeinander gezeichnet werden.

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Versuch 2

Trennung von Metallionen mit Papierchromatographie

Die Papierchromatographie eignet sich nicht nur für die Trennung von organischen

Verbindungen, sondern man kann sie auch in der anorganischen Analytik anwenden.

Zum Beispiel für die Trennung von Cu2+, Co2+, Ni2+, Fe3+ Ionen.

Durchführung:

Gießen man den Laufmittel (9:1 Gemisch von Aceton und 20% Salzsäure) in den

Unterteil einer Petri-Schale, und decke man den mit dem Oberteil sorgfältig ab. Die

Proben der einzelnen Ionen liegen in Lösungen vor. Die Proben werden mittels einer

Kapillare in den Mittelpunkt des Chromatographie-Papiers aufeinander aufgetragen.

Dazu muss die Kapillare mit der Lösung ruhig und senkrecht auf das

Chromatographie-Papier aufgesetzt werden, die Lösung darf nicht auf das Papier

aufgetropft werden. Nach dem Trocknen des Flecks stecke man den Docht durch

den Mittelpunkt des Papiers. Entwickelt wird das Chromatogramm auf ähnlicher

Weise, wie im Versuch 1. Nach Trocknen wird das Chromatogramm mit 0.5%

Rubeanwasserstoffsäure-Lösung besprüht. Die Methode ist empfindlicher, wenn das

Papier nach Besprühen kurz mit Ammoniak-Dampf behandelt wird. Reihenfolge der

Ionen vom Mittelpunkt Richtung Rand des Papiers ist: Ni2+, Co2+, Cu2+, Fe3+.

Bemerkung: Rubeanwasserstoffsäure ergibt mit vielen Metallionen farbige Komplexe.

Die Beurteilung wird erleichtert, wenn vor der Entwicklung in die 4 Ecken des Papiers

1-1 Tropfen Probe-Lösung aufgebracht wird. Die Farben der Referenzflecken können

leicht mit den Farben der Bänder des Chromatogramms verglichen werden.