RIPAC-LABOR GmbH, Potsdam...1 Hygienische Probleme von Biogasanlagen unter besonderer Berücksichtigung von Clostridium botulinum und anderer pathogener Clostridien Dr. B. Köhler,

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Hygienische Probleme von Biogasanlagen unter besonderer Berücksichtigung von Clostridium botulinum und

anderer pathogener ClostridienDr. B. Köhler,

RIPAC-LABOR GmbH, Potsdam

Hygienische Probleme von Biogasanlagen unter besonderer

Berücksichtigung von Clostridium botulinum und

anderer pathogener Clostridien

11.04.2012 TLL Jena

Dr. med. vet. habil. Bernd Köhler

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Abbildung 1: Übersicht der Clostridien-Erkrankungen

1. Gasödeminfektionen (Rauschbrand, Pararauschbrand, Gasbrand,

Bradsot, Nekrotisierende Hepatitis u.a.)

2. Enterotoxämien (Breiniere, Nekrotisierende Enteritis,

Cl. perfringens Typ A- Enterotoxämie, Cl. sordellii- Enterotoxämie u.a.)

3. Intoxikationen durch Neurotoxine (Tetanus, Botulismus)

4. Lokale Infektionen [Ulzerative Enteritis (Cl. colinum),

Antibiotikainduzierte Colitis durch Cl. difficile) u.a.]

2




2

Abbildung 2: Bildung von Clostridium botulinum- Toxin

Clostridium barati und Clostridium butyricum- wahrscheinlichdurch die Aufnahme von Toxinplasmiden von

Clostridium botulinum

Clostridium botulinum - 7 Toxintypen A-G

Clostridium barati - Typ F

Clostridium butyricum - Typ E

Clostridium limosum - Typ C (eigene Untersuchungen)

3




3

Abbildung 3: Empfindlichkeit von Tieren und dem Menschen gegen die Toxine der Clostridium botulinum- Typen A-G

4




4

Abbildung 4: Vorkommen von C2-Toxin bei Clostridium botulinum Typ C und Typ D

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Abbildung 5: Clostridium botulinum C2- Toxin (Enterotoxin)

• Binäres Toxin aus Hafttoxin und Enterotoxin, kein Neurotoxin !

• Bildung während der Sporulation

• Cytopathogen für viele Zellarten besonders für Enterozyten

• Erhöhung der Permeabilität der Darmschleimhaut

• Hochgradige Flüssigkeitsakkumulation im Darm und in der Lunge (Lungenödem)

• Nekrotisch-haemorrhagische Schäden der Darmschleimhaut beifortgeschrittenen Erkrankungen

•Ursache verlustreicher Darmerkrankungen bei Wasservögeln

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Abbildung 6: Kodierung der Toxinbildung von pathogenen Clostridienstämmen

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Abbildung 7: Nachweis Botulinum-Neurotoxin bildender Keime im Boden eines Areals mit akutem Auftreten von Botulismus bei Wasservögeln

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Aus “Clostridia Molecular Biology in the Post-genomic Era”by Holger Brüggemann and

Gerhard GottschalkCaister Academic Press 2009, Norfolk KKSeite 108

• “Compared with culture methods, molecular detection

techniques are sensitive, specific, and rapid to perform.”

• “A disadvantage of molecular detection assays is that they do

not detect biologically active neurotoxin or even activity of

genes.”

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Abbildung 8: Untersuchungen zum Vorkommen von Cl. botulinum- Neurotoxin bildenden Stämmen im Biokompost, in Gärrückständen, in Gülle aus landwirtschaftlichen Betrieben und in Klärschlämmen von Kläranlagen 1980 -2007

1) Nachweis mittels Mausbioassay nach 7 tägiger Anreicherung in cooked meat-Medium bzw. Maltose Kalbfleischbouillon nachNishida und Nakagawara (Grenzwert ≥10 Dlm/ml)

2) zweifelhafter Befund, Toxin nicht typisierbar

0,722)30288Summe

003112Biogasanlagen

002211Proben aus Biotonne

009431Gülle aus Rinder- Schwein- und

Geflügelbetrieben (ca. 6-wöchige Vergärung)

005614Klärschlamm

2 Proben schwach toxisch/Ohne Zuordnung zu speziellem Toxintyp

2

22)10220Kompostproben

%Anzahl

BemerkungenNachweis Toxin-bildenderCl. botulinum –Stämme 1)

Anzahlder

Proben

Anzahl dergeprüften BetriebeUntersuchungsmaterial

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Abbildung 9: Übersicht der Ergebnisse der Untersuchung von Gärrückständen von Biogasanlagen auf Neurotoxin bildende Clostridium botulinum- Stämme nach ihrer Herkunft 1990 - 2012

2 x Typ A , 2 x Typ C/D, 1 x Typ B6,8593,26974Summe

010022Baden-Württemberg

2 x Typ A5025024Bayern

010022Sachsen

010066Sachsen-Anhalt

010055Nordrhein-Westfalen

01002020Brandenburg

2 x Typ C/D, 1 x Typ B123882225Niedersachsen

010066Mecklenburg-Vorpommern

10044Schleswig-Holstein

Toxintyp%Anzahl%Anzahl

PositivNegativGetestete Anlagen

Bundesland

11




11

Abbildung 10: Geografische Verteilung der untersuchten Biogasanlagen

• Anlagen mit Nachweis Neurotoxin bildenderClostridium botulinum- Stämme in Gärrück-ständen von Biogasanlagen

o Negative Anlagen

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BlesshuhnFulica atra

LachmöweLarus ridibundus

StockenteAnas platyrhynchos

HöckerschwanCygnus olor

Abbildung 11: Vergleich der Befunde in Rohstoffen und Gärrückständen von Biogasanlagen und Nachweis Neurotoxin bildender Clostridium botulinum-Stämme in Gärresten

1) Verarbeitung von verdorbener Silage, nach deren Verfütterung ein Botulismusausbruch bei Rindern erfolgte

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Abbildung 11A: Persistenz von Neurotoxin Typ A bildenden Clostridium botulinum- Stämmen in einer positiven Gärrückstandsprobe

1) Nach 7 tägiger Anreicherung im cooked meat medium2) ca. 25g schwere Mäuse

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Abbildung 12: Ursachen des Nachweises von Neurotoxin bildenden Clostridium botulinum in Gärrückständen von Biogasanlagen

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15

Abbildung 13: Biogasanlagen mit Nachweis Neurotoxin bildender Clostridium botulinum- Stämme in Rohstoffen mit negativen Befunden von Gärrückständen

1) Mit typenspezifischen Antitoxinen

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Abbildung 14: Beispiel Diagnostik B2 S1 Verdünnung 105 anaerob

Abbildung 2: Beispiel Diagnostik B2 S1 Verdünnung 105 anaerob

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Abbildung 15: Beispiel Diagnostik B1 S4 Verdünnung 106 mikroaerophil

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Abbildung 16: Gesamtübersicht Anlagentyp und Substratverteilung

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Abbildung 17: Vergleich der Clostridienkonzentrationen in Rohstoffen und Gärresten der Anlage A, B und C

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Abbildung 18: Vergleich der anaeroben Gesamtkeimzahlen insgesamt in Rohstoffen und Gärresten der Biogasanlagen A, B und C

0,00E+002,00E+064,00E+066,00E+068,00E+061,00E+071,20E+071,40E+071,60E+071,80E+072,00E+07

durc

hsch

nittl

iche

G

esam

tkei

mza

hl

Alle Anlagen Anlage A Anlage B Anlage C

Alle Anlagen 1,00E+07 2,74E+06Anlage A 1,89E+07 3,3E+06Anlage B 5,50E+06 2,8E+06Anlage C 5,60E+06 2,1E+06

Rohstoffe Gärresteanaerob anaerob

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Abbildung 19: Vergleich der aeroben und anaeroben Gesamtkeimzahlen

0,00E+00

5,00E+06

1,00E+07

1,50E+07

2,00E+07

2,50E+07

3,00E+07

3,50E+07

durc

hsch

nittl

iche

Ges

amtk

eim

zahl

Rohstoffe Gärreste Rohstoffe Gärreste Rohstoffe Gärreste

aerob aerob anaerob anaerob gesamt gesamt

Vergleich der Gesamtkeimzahlen


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22

Abbildung 20: Vergleich des Spektrums und der Nachweisraten der Clostridia spp. in Rohstoff- und Gärrückstandsproben in Prozent

-2Sonstige Clostridia spp. 1)

-1Clostridium septicum

-1Clostridium limosum

11Clostridium glycolicum

11Clostridium sordellii

73Clostridium tyrobutyricum

14Clostridium tertium

74Neue Clostridia spp.

94Clostridium sporogenes

108Clostridium butyricum

38Clostridium barati

1916Clostridium bifermentans

4247Clostridium perfringens

Gärrückstände in %Rohstoffe in %Spezies

1) Nicht Differenzierbar mittels MALDI-System

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Abbildung 21: Vergleich der Gesamtkeimzahlen für Clostridia spp. alle Anlagen

Vergleich der Gesamtkeimzahlen für Clostridia spezies

1

10

100

1000

10000

100000

Rohstof fe Gärreste Rohstof fe Gärreste Rohstoffe Gärreste Rohstoffe Gärreste Rohstoffe Gärreste Rohstoffe Gärreste

Cl.p. Cl.p. Cl. sporo. Cl. sporo. Cl. bif. Cl. bif . Cl. baratii Cl. baratii Cl. buty. Cl. buty. Cl. sordelii Cl. sordelii

KB

E/g

Unt

ersu

chun

gsm

ater

ial

Alle Anlagen

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Abbildung 22: Vergleich der Gesamtkeimzahlen der verschiedenenClostridia spp. in den Biogasanlagen A, B und C

V e rg le ic h d e r G e sa m tke im z ah le n fü r C lo s tr id ia s p e z ie s

1

10

100

1000

10000

100000

Rohs tof f e Gärres te Rohs tof f e Gärres te Rohs tof f e Gärres te Rohs tof f e Gärres te Rohs tof f e Gärres te

Cl.p. Cl.p . Cl. s poro. Cl. s poro. Cl. b if . Cl. b if . Cl. baratii Cl. baratii Cl. buty . Cl. buty .

KB

E/g

Unt

ersu

chun

gsm

ater

ial


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Abbildung 22 A: Hemmung der Vermehrung von Cl. botulinum in Gärrückständen von Biogasanlagen

• Vergleichsweise lange Generationszeit von Cl. botulinum von 20-30 Minuten im Verhältnis zu Cl. perfringens (Generationszeit 8-10 Minuten) u.a. schnell wachsenden Bakterienarten

• Verschiebung des Nährsubstrates in Richtung Zellulose u.a. pflanzlichen Rohstoffen

• Dominanz Zellulose abbauender Mikroflora

• Mangel von ausreichenden Nährstoffen für Cl. botulinum, die zudem von schnell wachsenden Keimen vor allem pathogenen Clostridien aufgebraucht werden

Konkurrenzmikroflora, die Cl. botulinum durch Bacteriozide hemmt

• pH-Wert (alkalischer pH-Wert für pathogene Clostridien)

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Abbildung 22: Vorkommen u. Toxizität von Cl. perfringens in Rohstoffen und in Gärresten der Biogasanlagentypen A, B und C

1) Ergebnisse mittels PCR

k. A. = keine Angaben

Multiplex PCR

Majorletale Toxine Minorletale Toxine

α-Toxin Nagler-Einheiten (NE)

Anlagen- Typ

Proben/ Material

Anzahl der

Proben

Cl. perfringens

positiv in %

Anzahl der

Isolate1)

α- Toxin

β1-Toxin

β2-Toxin

NetB-Toxin

Epsilon-Toxin

Jota- Toxin

μ-Toxin Hyaluro- nidase

Theta- Toxin

< 8 NE

16-32 NE

> 64 NE

Rohstoffe 20 20 4 4 0 1 0 0 0 k. A. 4 4 - - A1-A5

Gärreste 15 26,4 4 4 0 1 0 0 0 k. A. 4 4 - -

Rohstoffe 20 90 18 17 0 0 0 0 0 k. A. 18 11 7 - B1-B5

Gärreste 15 66,6 10 10 0 0 0 0 0 k. A. 10 3 6 1

Rohstoffe 20 95 19 19 0 6 0 0 0 k. A. 19 15 1 3 C1-C5

Gärreste 15 86,6 14 14 0 5 0 0 0 k. A. 14 12 1 1

Rohstoffe 60 68,3 41 41 0 7 0 0 0 k. A. 41 30 8 3 Σ

Gärreste 45 62,2 28 28 0 6 0 0 0 k. A. 28 19 7 2

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Abbildung 23: Veterinärhygienische Richtlinien/Anforderungen für denBetrieb von Biogasanlagen

• Regelmäßige Rohstoffkontrolle insbesondere von tierischen Rohstoffen

• Kein Einsatz von tierischen und pflanzlichen Rohstoffen aus Beständen mit Botulismusausbrüchen

• Mikrobiologische Untersuchung von Starterkulturen auf Neurotoxin bildende Clostridium botulinum- Stämme

• Ausstattung aller Biogasanlagen mit 2 Rohstoffsilos, die wechselseitig (etwa 4 wöchiger Rhythmus) bzw. nach Reinigung und Desinfektion betrieben werden sollten

• Ausstattung aller Biogasanlagen mit 2 Gärrückstandssilos, die abwechselnd inca. 3 monatigem Abstand zu befüllen sind

• Sicherung der Gärrückstände vor nachträglichen Kontaminationen (Schwarz-Weiß-Prinzip)

• Aus veterinärhygienischer Sicht kann die Verbreitung Neurotoxin bildender Cl. botulinumStämme nicht toleriert werden

• Jährliche Kontrolluntersuchung der Gärrückstände aller Biogasanlagen hinsichtlichdes Vorkommens Neurotoxin bildender Clostridium botulinum- Stämme

• Freiheit von Cl. chauvoei, Cl. perfringens Typ C und EHEC (Untersuchung bei speziellem Anlaß/ Verdacht)

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+1) Positiv (Nachweis Toxin bildender Stämme)- Negativ

- Stufenkontrolle- Hygienische Maßnahmen- Strukturelle Veränderungen

+1)+1)

Stufenkontrolle → Bewertung, Hygienische Maßnahmen+1)-

Keine Beanstandungen-+1)

Keine Beanstandungen--

Bewertung/ SchlussfolgerungenGärrückständeRohstoffe

Abbildung 24: Verfahrensweisen bei positivem Befund von Neurotoxin bildenden Cl. botulinum- Stämmen in Gärrückständen von Biogasanlagen

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