SCHNELLE EFFEKTE DER SCHILDDRÜSENHORMONE UND … · Die Tagesproduktion der Hormone der Schilddrüse beträgt 83-93 µg T 4 ( 11, 67, 84 ), 9 µg T 3 und 0,9 µg rT 3 ( 11, 64 )

Aus der Abteilung für Biochemische EndokrinologieInstitut für Physiologische Chemie desUniversitätskrankenhauses Eppendorf in HamburgAbteilungsdirektor Professor Dr. med. Hans Joachim Seitz

SCHNELLE EFFEKTE DER SCHILDDRÜSENHORMONEUND SPEZIELL VON 3,5-L-DIJODTHYRONIN ( 3,5-L-T2 )

AUF DEN INTERMEDIÄRSTOFFWECHSELDER LEBER UND DER NIERE

ODER

DAS EINMALEINS DER LEBER- UND NIERENPERFUSION

D I S S E R T A T I O N

ZUR ERLANGUNG DES GRADES EINES DOKTORS DER MEDIZIN

dem Fachbereich Medizin der Universität Hamburg vorgelegt von

NIELS KÖSTER AUS HAMBURG

HAMBURG 1998

Yvette und Thiess-Richard,meiner Familie,meinen Großeltern,Jan Peter, Annemarie und Günther

ERKLÄRUNG

Ich versichere ausdrücklich, daß ich die Arbeit selbständig und ohne fremde Hilfe verfaßt,

andere als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel nicht benutzt und die aus den

benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen einzeln nach Ausgabe

( Auflage und Jahr des Erscheinens ), Band und Seite des benutzten Werkes kenntlich ge-

macht habe, und daß ich die Dissertation bisher nicht einem Fachvertreter an einer anderen

Hochschule zur Überprüfung vorgelegt oder mich anderweitig um Zulassung zur Promotion

beworben habe.

______________________

Niels Köster

Angenommen von dem Fachbereich Medizin

der Universität Hamburg am : 15. Oktober 1998

Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs

Medizin der Universität Hamburg

Sprecher : Prof. Dr. med. H.-P. Leichtweiß

Referent : Prof. Dr. med. H.-J. Seitz

Korreferent : Prof. Dr. med. G. Mayr

Inhaltsverzeichnis4

I Einleitung 8

Physiologie und Pathologie der Schilddrüsenhormone 8

Hormonproduktion 10

Hormontransport, Metabolismus und Elimination 11

Hormonaktion 12

Fragestellungen 16

II Material und Methoden 17

1. Tierhaltung und Provokation der Hypothyreose 17

2. Rezyklierende Leberperfusion und ihre Standardisierung 18

3. Offene Leberperfusion und ihre Standardisierung 21

4. Isolierte Mitochondrien aus Rattenhepatozyten und ihre

Standardisierung 22

5. Isolierte Nierenperfusion und ihre Standardisierung 25

6. Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs 27

7. Spektrophotometrische Bestimmungen 28

Protein-Bestimmung 28

Substratbestimmungen 28

Bestimmung von Enzymaktivitäten 30

8. Substanzen 31

9. Statistische Auswertung 32

III Ergebnisse 33

1. Rezyklierende Leberperfusion 33

1.1 Sauerstoffverbrauch der isoliert rezyklierend perfundierten Leber

hypothyreoter, männlicher und gehungerter Ratten 33

1.2 Stimulation des Sauerstoffverbrauchs durch 3,5-L-T2 35

Inhaltsverzeichnis5

1.3 Stimulation des Sauerstoffverbrauchs durch 3,5-L-T2 bei

perfundierten Lebern weiblicher Ratten 37

1.4 Vergleich der Stimulation des Sauerstoffverbrauchs bei männ-

lichen und weiblichen Versuchstieren 38

1.5 Steigerung der eingesetzten Hormonkonzentration 40

1.6 Stimulation des Sauerstoffverbrauchs durch 3,5-L-T2 bei isoliert

rezyklierend perfundierten Lebern männlicher, hypothyreoter

Ratten nach kohlenhydratreicher Diät 42

1.7 Stimulation des Sauerstoffverbrauchs durch 3,5-L-T2 bei isoliert

rezyklierend perfundierten Lebern weiblicher, hypothyreoter,

kohlenhydratreich ernährter Ratten 46

Zusammenfassung der Ergebnisse III.1 52

2 Kombiniert offene und rezyklierende Leberperfusion 54

2.1 Stimulation des Sauerstoffverbrauchs durch 3,5-L-T2 bei offen

und rezyklierend perfundierten Lebern männlicher, hypothyre-

oter und gehungerter Ratten 55

2.2 Steigerung der Glucoseproduktion bei offener und rezyklierender

Leberperfusion durch 3,5-L-T2 58

2.3 Steigerung der Harnstoffproduktion bei offener und rezyklieren-

der Leberperfusion durch 3,5-L-T2 59

2.4 Perfusionsdruck und Kaliumkonzentration im Perfusat 61


3 Einfluß von Ionenkanalblockern auf die Stimulation des Sauerstoff-

verbrauchs isoliert rezyklierend perfundierter Lebern hypothyre-

oter, gehungerter, männlicher Ratten durch 10-10 M 3,5-L-T2 63

3.1 Einfluß von Ouabain auf die Stimulation des Sauerstoffverbrauchs

durch 3,5-L-T2 63

3.2 Einfluß von Nifedipin auf die Stimulation des Sauerstoffverbrauchs

durch 3,5-L-T2 65

Inhaltsverzeichnis6

3.3 Einfluß von SITS auf die Stimulation des Sauerstoffverbrauchs

durch 3,5-L-T2 67

3.4 Einfluß von Amilorid auf die Stimulation des Sauerstoffverbrauchs

durch 3,5-L-T2 69


4 Einfluß von 3,5-L-T2 auf die oxydative Phosphorylierung bei

isolierten Mitochondrien der Rattenleber 72


5 Isolierte Nierenperfusion 76

5.1 Einfluß von 3,5-L-T2 bei isolierter Nierenperfusion

hypothyreoter Ratten 76

5.2 Einfluß von 3,5-L-T2 bei isolierter Nierenperfusion

euthyreoter Ratten 77

5.3 Einfluß von 3,5-L-T2 auf kultivierte Mesangiumzellen 78


IV Diskussion 81

1 Induzierte Hypothyreose durch Na131J i.p. 81

2 Die isolierte Leberperfusion als Modell der Wahl zur Untersu-

chung der schnellen Wirkungsweise von Schilddrüsenhormonen 82

3 Der Effekt von 3,5-L-T2 auf Gluconeogenese und O2-Verbrauch 83

4 Einfluß der Ernährung auf den Effekt von 3,5-L-T2 86

5 Einfluß des Geschlechts auf den Effekt von 3,5-L-T2 87

6 Untersuchungen zum Mechanismus der Wirkung von 3,5-L-T2

bei rezyklierender und offener Leberperfusion 89

7 Einfluß von Ionenkanalblockern auf den Effekt von 3,5-L-T2 92

8 Wirkung von 3,5-L-T2 auf isolierte Mitochondrien aus Hepatozyten

in vivo 97

Inhaltsverzeichnis7

9 Organspezifität der Wirkung von 3,5-L-T2 100

V Zusammenfassung 103

VI Literaturverzeichnis 104

Anhang

Abkürzungsverzeichnis 110

Danksagungen 112

Lebenslauf 113

Einleitung8

I EINLEITUNG

Physiologie und Pathophysiologie der Schilddrüsenhormone

Zu den physiologischen Funktionen der Schilddrüse gehört die Sekretion der Schilddrüsen-

hormone Thyroxin ( Tetrajodthyronin, T4 ) und Trijodthyronin ( T3 ). Sie beeinflussen eine

ganze Reihe von metabolischen Prozessen, wie den Stoffwechselgrundumsatz, kardiale und

neurologische Funktionen sowie das Wachstum u.a. mehr.

Die Einordnung der Schilddrüsenhormone in den hormonellen Regelkreis von Synthese und

Sekretion zeigt Abb. 1.

Hypothalamus

Hypophysenvorderlappen

Schilddrüse

T3 Albumin/Präalbumin/TBG T4

Ziel-Gewebe

Abb. 1Hypothalamus-Hypophysen-Schilddrüsen-Achse : Schematische Darstellung der hormonellen

Steuerung von Produktion, Ausschüttung und Transport der Schilddrüsenhormone.

Schilddrüsenerkrankungen äußern sich in quantitativen oder qualitativen Veränderungen

der Hormonsekretion bzw. in einer Größenzunahme der Schilddrüse oder in beidem.

TRH

TSH

Einleitung9

Die Hypothyreose teilt man in angeborene und erworbene Formen ein. Eine Schilddrüsen-

insuffizienz prä- oder perinatal kann als irreversible Folge das Krankheitsbild des Kretinis-mus

verursachen, das sich im Kindesalter durch Entwicklungsstörungen besonders der

Sinnesorgane, der Haut und des Skeletts sowie einer geistigen Retardierung auszeichnet.

Im Erwachsenenalter verursacht eine Unterfunktion der Schilddrüse das klinische Erschei-

nungsbild der Hypothyreose oder Myxödem mit reduziertem kalorischen Verbrauch

( Hypometabolismus ) als prinzipiellem Erscheinungsbild. Meistens handelt es sich bei

der Hypothyreose um eine ungenügende Produktion einer primär gestörten Schilddrüsen-

funktion ( primäre Hypothyreose ). Bei unzureichender Stimulation oder Ausfall der

Stimulation der Schilddrüse durch niedriges oder fehlendes TSH handelt es sich um eine

sekundäre Hypothyreose, und bei mangeldem TRH liegt eine tertiäre Hypothyreose vor.

Symptome einer Schilddrüsenunterfunktion leiten sich von einer Minderung des Stoff-

wechselgrundumsatzes ab und hierdurch bedingt eine erniedrigte Wärmeproduktion. Mit einer

die ( primäre ) Hypothyreose begleitenden Fettstoffwechselstörung gehen typischer-weise

erhöhte Cholesterinspiegel einher. Klinisch kann bei ausgeprägter Unterfunktion der

Schilddrüse im Erwachsenenalter eine Herzinsuffizienz, wie auch eine eingeschränkte phy-

sische sowie geistige Leistung imponieren.

Nicht zuletzt kommt es aufgrund einer unzureichenden Sekretion von Thyroxin ( T4 ), deren

Folge eine permanente Stimulation der Schilddrüse zur Hormonproduktion ist, zur Hyper-

plasie der Drüse und zur Ausbildung eines Kropfes.

Eine Überfunktion der Schilddrüse mit erhöhten Hormonspiegeln von T3 und/oder T4 hat das

Krankheitsbild der Hyperthyreose, bzw. bei exzessiver Hormonsekretion die Thyreo-toxikose

zur Folge. Als Symptome des Hypermetabolismus resultieren Gewichtsabnahme,

Wärmeintoleranz, Tachykardie, arterieller Hypertonus und Nervosität. Klinisch imponieren

Patienten in ausgeprägten Fällen durch eine physische und psychische Unruhe.

Auch bei der Hyperthyreose kann es zu einer Vergrößerung der Schilddrüse ( Struma )

kommen, bis hin zur Ausbildung eines Kropfes. Besonders ausgeprägt ist dies bei der von

Einleitung10

Basedow´schen Erkrankung der Fall mit dem zusätzlichen typischen Symptom des Exoph-

thalmus.

Die Hyperthyreose führt graduell zu einer Steigerung des Stoffwechselgrundumsatzes und in

ausgeprägten Fällen zur Einstellung einer katabolen Stoffwechsellage. Hierbei kommt es zu

vermehrtem Proteinabbau und zur Mobilisierung von Fettreserven. Die damit einher-gehende

Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs und die gesteigerte Wärmeproduktion läßt sich durch

Messung des Sauerstoffverbrauchs im Stoffwechselgrundumsatz ( BMR ) nachweisen ( 8 ).

Hormonproduktion

Die Tagesproduktion der Hormone der Schilddrüse beträgt 83-93 µg T4 ( 11, 67, 84 ), 9 µg T3

und 0,9 µg rT3 ( 11, 64 ). Das im Blut zirkulierende T4 wird vollständig in der Schild-drüse

gebildet. Die tägliche Gesamtproduktion für T3 beträgt jedoch 30 µg ( 22,6 - 44,8 µg) ( 7, 11,

57, 84 ) und für rT3 beträgt sie 28 µg ( 97,5 % extrathyroidale Dejodierung von L-T4 ) ( 11 ).

Zustande kommt diese Menge durch Monodejodierung des von der Schilddrüse produzierten

T4, davon ca. 41 % zu T3 und ca. 38 % zu rT3, in peripheren Geweben. Beim T3 sind nur etwa

20 %( 46 ) direkt thyroidaler Herkunft . 80% des T3 sind Produkt aus den peripheren Geweben

durch das verantwortliche Enzym Monodejodinase Typ I, welches

L-T4 zunächst in 5´-Position am Außenring unter Beteiligung eines R-SH vorwiegend in Leber

und Niere dejodiert ( 17 ). Von der Tagesgesamtproduktion des T3 werden zwischen 29 und

56 %, vom rT3 ca. 28 % weiter dejodiert. Weitere Untersuchungen zu den einzel-nen

Dejodierungsschritten ergaben, daß praktisch das gesamte 3,5-L-T2 durch Dejodierung am

Phenolring des 3,5,3´-L-T3 entsteht, katalysiert durch die Enzyme Monodejodinase Typ I und

II und täglich 0,6 - 2,9 µg beträgt ( 17, 18, 21, 50 ). Durch weitere Dejodierungs-schritte

entsteht zuletzt das L-Thyronin ( s. Abb. 2 ).

Die bekannten therapeutisch verwendeten antithyroidalen Agenzien, wie Derivate des

Thioharnstoffs und Mercaptoimidazole entfalten komplexe Wirkung auf die Hormonbio-

synthese. Sie inhibieren die initiale Oxidation, dh. organische Bindung von Jod an das

Tyrosingrundgerüst, sodaß die Konzentration von Dijodtyrosin ( DIT ) in Relation zu

3,3´,5,5´-Tetraiodo-L-Thyronin ( T4 )

Einleitung11

Monodejodinase Typ I und II Monodejodinase Typ I und III

3,5,3´-Tiiodo-L-thyronin ( T3 ) 3,3´,5´-Triiodo-L-thyronin ( rT3 )

3,5-Diiodo-L-thyronin ( T2 ) 3,3´-Diiodo-L-thyronin 3´,5´-Diiodo-L-thyronin

3-Iodo-thyronin 3´-Iodo-thyronin

Thyronin

Abb. 2Dejodierungsschema der Schilddrüsenhormone, modifiziert nach J. Köhrle ( 38 ). Neben der

Monodejodinase Typ I werden zwei weitere Typen II und III beschrieben, wobei Typ II in

verschiedenen Geweben, wie Hypophyse, Gehirn und braunem Fettgewebe vorkommt und

Typ III als Isoenzym bei neonatalen Ratten, sowie in der Placenta von Mensch und Ratte vor-

kommt ( 17, 48 ). Wie Auf´mkolk et al., sowie Leonard et al. und andere Arbeitsgruppen

zeigen konnten, ist die Monodejodinase Typ I durch Propylthiouracil ( PTU ) hemmbar

( 3, 17, 48 ).

Monojodtyrosin ( MIT ) sinkt. Dadurch wird die Verbindung der Iodotyrosine zu den

hormonell aktiven Iodothyroninen blockiert.

Hormontransport, Metabolismus und Elimination

Im Blut sind T3 und T4 an Plasmaproteine gebunden ( Thyroxin bindendes Globulin TBG,

T4-bindendes Präalbumin TBPA, Albumin) . Zwischen T4 und den Proteinen stellt sich ein

Bindungsgleichgewicht ein, wobei nur ca. 0,03 % des Hormones frei vorliegen. Beim T3 liegen

ca. 0,3 % in der freien Form vor. Nur die freien, ungebundenen Hormonanteile ge-langen in die

Gewebe und können dann ihre Wirkungen entfalten.

Primäre Schwankungen der Schilddrüsenhormone bewirken persistierende Verschiebungen

der Konzentration von freiem Hormon im Verhältnis zum Gesamthormon, da die homöosta-

Einleitung12

tischen Mechanismen die Konzentration des freien Hormones nicht durch eine Veränderung

der TBG Konzentration normalisieren können. Die Konsequenz ist eine Veränderung des

metabolischen Status.

Schilddrüsenhormone unterliegen metabolisch hauptsächlich einer schrittweisen Dejodie-rung

einzelner Jodatome ( Monodejodierung ) bis hin zum Thyroningerüst ( s. Abb. 2 ). Im Falle der

Monodejodierung von T4 wird T3 erzeugt ( T3-Neogenese ) . Und da ca. 30 % des T4 zu T3

konvertiert wird und zusätzlich T3 eine höhere metabolische Potenz verglichen mit T4

entwickelt, könnte man T4 als Prohormon und T3 als das eigentlich aktive Hormon be-

zeichnen, das durch die Monodejodierung erzeugt wird. 80 % des im Blut zirkulierenden T3

wird durch Monodejodierung in verschiedenen Organen, insbesondere der Leber und der Niere

aus T4 erzeugt, der Rest direkt durch die Schilddrüse.

40 % des gesamten T4 wird ebenfalls durch Monodejodinase Typ I in 5-Position dejodiert

( Innenring ); es entsteht 3,3´,5´-Trijod-L-thyronin ( rT3 ), welches, wenn überhaupt nur

geringe metabolische Aktivität entfaltet. Ein weiterer Stoffwechselweg von T4 und T3 ist die

Konjugation in der Leber, prinzipiell mit aktivierter Glucuronsäure und Schwefelsäure, wo-ran

sich Dejodierung und biliäre Elimination anschließen ( 17 ).

20 % der gesamten T4 und T3 Menge werden an der Alaninseitenkette oxidativ desaminiert und

decarboxyliert, wodurch Tetrajod- und Trijodthyroacetat ( Tetrac bzw. Triac ) entste-hen, die

nur eine geringe biologische Aktivität aufweisen.

Hormonaktion

Schilddrüsenhormone beeinflussen das Wachstum und die Entwicklung von Geweben, ins-

besondere bei Gehirn, Knochen und Muskulatur. Ebenso wird der Gesamtenergieverbrauch

und der Umsatz von Substraten, wie Glucose, Fettsäuren und Aminosäuren von den Hor-

monen der Schilddrüse gesteuert, inklusive ihrer selbst. Die genauen Mechanismen und

zellulären Ebenen, auf denen die Schilddrüsenhormone eingreifen, sind Ziel vieler wissen-

schaftlicher Untersuchungen.

Einleitung13

Auf der Ebene des Zellkerns wird die Genexpression durch Schilddrüsenhormone beein-flußt,

auf mitochondrialer Ebene die oxydative Phosphorylierung und an der Plasmamem-bran wird

auf den Flux von Substraten und Kationen, wie Kalium und Calcium Einfluß genommen. Von

besonderem Interesse ist der zeitliche Ablauf verschiedener Effekte nach Hormonexposition,

da er Aufschluß über die physiologische Bedeutung und Wirkungsweise des eingesetzten

Hormones geben kann.

Das Tetrajodthyronin, T4 und seine einzelnen Dejodierungsprodukte, inklusive der Trijod-

thyronine T3, rT3 und Dijodthyronine T2 sind auf eigene hormonelle Aktivität in verschie-denen

Versuchsmodellen untersucht worden. T4 selbst weist eine geringe biologische Wirk-samkeit

auf, sodaß es auch als Prohormon des wirksamen T3 beschrieben werden kann. Tri-

jodthyronin, T3 bewirkt an seinem Zellkernrezeptor eine Stimulation oder Repression der

Transkription spezifischer Genabschnitte und damit die Bildung oder Unterdrückung der

Synthese spezifischer mRNAs und dadurch eine spezifische Induktion bzw. Repression be-

stimmter Proteine; vergleiche die Übersichten, dargestellt von Dillmann et al. sowie Marish und

Oppenheimer ( 16, 51 ).

Auch mitochondriale Proteine werden durch die Schilddrüsenhormone induziert, wie die

Enzyme Glycerin-3-phosphat-dehydrogenase ( 47 ), die Pyruvat-Carboxylase ( 5 ) und das

Cytochrom C ( 70, in einer Übersicht siehe 65 ). Der Wirkungseintritt beginnt jeweils nach

Stunden bzw. Tagen, und ob eine direkte oder bei Wirkungseintritt erst nach Tagen indi-rekte

Wirkung vorliegt, ist unklar.

Beispielhaft für einen schnellen Wirkungseintritt nach Schilddrüsenhormongabe ist die

kernvermittelte Bildung der mRNA „spot-14“, die 30-60 min nach T3-Gabe im Zytosol

nachgewiesen werden konnte, für deren biologische Funktion aber bisher noch keine Er-

kenntnisse vorliegen. Für weitere Enzyme, wie die hepatische Glucokinase oder die hepa-tische

Phosphoenol-pyruvat-Carboxykinase ( PEPck ) konnte ein ähnlich schneller Wir-

kungsmechanismus aufgezeigt werden.

Neben den kernvermittelten Wirkungen des T3 sind seit Jahren auch schnellere und sehr

schnelle Effekte des Hormones in der Diskussion. Von besonderem Interesse ist, ob den

Einleitung14

Effekten von L-T3 binnen Minuten eine Wirkung auf die Zellmembran zugrunde liegt oder auf

die Mitochondrien und so die mitochondriale Aktivität stimuliert wird.

Es gab Hinweise auf zeitlich sehr rasche Reaktionen nach dem Einsatz von Schilddrüsen-

hormonen. Bei diesen Wirkungen wurden aufgrund ihrer kurzen zeitlichen Abfolge mito-

chondriale Mechanismen angenommen. So schlossen Seitz et al. auf schnelle mitochondriale

Effekte in der Leber bei einer durch L-T3 bewirkten Senkung des mitochondrialen ATP/ ADP-

Quotienten ( 75 ). Müller et al. berichteten von einer Steigerung der hepatischen

Gluconeogenese und Glucoseproduktion aus Alanin bei gleichzeitig erhöhtem Sauerstoff-

verbrauch ( 56 ); in beiden Fällen am Modell der isoliert-perfundierten Rattenleber. Hier wurde

aufgrund des zeitlich raschen Ablaufs eine primär nukleäre Mitbeteiligung ausge-schlossen.

Horst et al., aus derselben Arbeitsgruppe, beschrieben ein neues wirksames Jodothyronin 3,5-

L-T2, welches Dejodierungsprodukt von L-T3 ist und zu einer raschen Steigerung des

Sauerstoffverbrauchs im beschriebenen Versuchsaufbau der isoliert-perfun-dierten Leber

hypothyreoter Ratten führte, während T3 und T4 durch Hemmung der Mono-dejodinase Typ I

durch PTU ihre ursprünglich steigernde Wirkung auf den Sauerstoffver-brauch verloren.

Hieraus abgeleitet wird ein getrennter Wirkungsmechanismus der Schilddrüsenhormone dis-

kutiert. Hiernach entfalten T3 und T4 eine primär nukleäre und T2 eine direkte mitochondri-ale

Wirkung ( 32 ).

Die Arbeitsgruppe von Hummerich et al. stieß bei der Untersuchung des Effektes von T3 an

der isoliert-perfundierten Rattenleber auf eine gesteigerte Calcium-Aufnahme und einer da-mit

verbundenen schnellen mitochondrialen Aktivierung. Im Vergleich zu anderen Hormo-nen wie

Glukagon, Vasopressin, sowie T2 und T4, bewirkte T3 im zeitlichen Verlauf eine vermehrte

Calcium-Aufnahme in die Zellen parallel zu gesteigerter Atmung und gesteiger-ter

Gluconeogenese. Die gleichsinnige Veränderung des Calcium-Einstroms nach Exposi-tion mit

den verglichenen Hormonen läßt die Autoren eine direkte calciumvermittelte Wir-kung auf den

mitochondrialen Stoffwechsel vermuten ( 34 ).

Versuche weiterer Arbeitsgruppen an Mitochondrien, die 15 min nach intraperitonealer

Injektion von L-T3 aus Lebern hypothyreoter Ratten isoliert worden waren, wiesen anhand

Einleitung15

mehrerer Parameter mitochondrialer Aktivität euthyreote Werte auf : Bei der Transportrate

von Adeninnucleotiden über die innere Membran ( 54 ), dem Protonengradienten ∆pH

( 14 ), dem ADP/O- Quotienten ( 14, 62 ), dem H+/O- Quotienten ( 14 ), wie auch bei der

Zykluszeit der Mitochondrien, um vom ADP-limitierten State 4 über den ADP-stimulierten

State 3 wieder zum State 4 zurückzugelangen ( 13 ). Unverändert blieben das Membran-

potential ∆Ψ, die proton-motive-force ∆p, wie auch der Sauerstoffverbrauch ( 14 ).

Darüber hinaus beschrieben Sterling et al. ( 81 ), daß bei 30 min nach ip. Injektion von T3

isolierten Mitochondrien eine signifikante Steigerung der ATP-Produktion und des Sauer-

stoffverbrauchs, wie auch bei direkter Gabe von L-T3 zu submitochondrialen Partikeln einen

gesteigerten Einbau von 32P in generiertes ATP. Hieraus wurde der Schluß gezogen, daß eine

gesteigerte oxydative Phosphorylierung zugrundeliegt ( 83 ). Einigen anderen Arbeitsgruppen

gelang es allerdings nicht, diesen Befund zu reproduzieren. Ferner haben eine Reihe von

Autoren eine Bindung von L-T3 an mitochondriale Proteine beschrieben; die physiologische

Bedeutung blieb kontrovers ( 26, 28, 80 ).

Die neuen Befunde über schnelle Wirkungen der Schilddrüsenhormone, insbesondere von 3,5-

L-T2 auf den Stoffwechsel der Leber geben Anlaß zur Diskussion über ein neues Prin-zip der

Wirkung dieser Hormone und sind in der Literatur unterschiedlich bewertet worden. Auch

wird die physiologische Bedeutung der Wirkung von 3,5-L-T2 kontrovers diskutiert, da einige

Laboratorien die Effekte nicht reproduzieren konnten ( mündliche Mitteilung ) und in anderen

Laboratorien die Effekte nur klein ( < 10 % ) waren.

So wurde in den vorliegenden Experimenten nicht nur die bewährte rezyklierende Perfu-sion,

wie in der Vergangenheit angewandt, sondern in Kooperation mit einem anderen La-bor das

aufwendige Modell einer nicht rezyklierenden, offenen Perfusion zusätzlich einge-setzt, um

jeden Zweifel zum Befund selbst auszuräumen.

Aufgrund der vorliegenden Befunde über eine schnelle Wirkung von 3,5-L-T2, soll auch der

Mechanismus und seine physiologische Bedeutung näher untersucht werden.

Fragestellungen :

Einleitung16

1. Welchen Einfluß hat L-T2 auf die Zellatmung und die Gluconeogenese der Leber und

wie schnell tritt die Wirkung ein ?

2. Gibt es geschlechtsspezifische Unterschiede bei der Wirkung von L-T2 auf die Leber

und welche Rolle spielt der Ernährungsstatus der Versuchstiere ?

3. Wie ist der Ablauf der Wirkung von L-T2 bei der isoliert perfundierten Leber ?

4. Welches sind die zugrundeliegenden subzellulären Mechanismen ? Läßt sich eine

Wirkung auf mitochondrialer Ebene nachweisen ?

5. Gibt es auch andere Organe, bei denen sich eine vergleichbare Wirkung von L-T2

nachweisen läßt ?

Für die einzelnen Fragestellungen wurden die Modelle der isoliert perfundierten Ratten-leber,

in den Variationen der offenen und geschlossenen Perfusion, sowie die Mitochon-

drienpräparation und die isolierte Nierenperfusion ausgewählt.

Die Ergebnisse zeigen, daß es sich bei 3,5-L-T2 in der Tat ( neben L-T3 ) um ein neues, seine

Wirkung schnell entfaltendes Schilddrüsenhormon handelt.

_______________

Material und Methoden17

II MATERIAL UND METHODEN

1. Tierhaltung und Provokation der Hypothyreose

Als Versuchstiere wurden Wistar-Ratten verwandt, spez. pathogen-frei, bezogen von der

Firma Wiga ( Charles River ), männlich und weiblich, denen, wenn nicht anders angege-ben,

am Vormittag des dem Versuch vorausgegangenen Tages das Futter entzogen wurde.

Als Futter wurde Altromin Standarddiät verwandt. Die Tiere hatten freien Zugang zum

Wasser. Die Raumtemperatur betrug konstant 22 ± 2°C, bei einem 12-stündigen Hell- Dunkel-

Wechsel.

Die Hypothyreose wurde erzeugt durch intraperitoneale Injektion von 0,25 mCi Na131J bei ca.

140 g schweren Tieren. Es war nach etwa 10 Tagen eine weitestgehende Wachstums-

stagnation zu verzeichnen ( zu diesem Zeitpunkt zwischen 200-240 g KG ). Das Leberge-

wicht ( LG ) der in den Versuch genommenen Tiere lag unter dem von euthyreoten Tieren

( <7 g ). Darüber hinaus machte sich der hypothyreote Status bemerkbar durch Hypother-

Tab. 1 Zusammenfassung der Befunde hypothyreoter im Vergleich zu euthyreoten und hyperthyreoten

Versuchstieren

Parameter Einheit Hypothyreose Euthyreose Hyperthyreose

Serum

L-T3 ng/ml 0,43 ± 0,04 0,65 ± 0,04 2,40 ± 0,20

L-T4 ng/ml 9,7 ± 1,0 23 ± 1 116 ± 14

Leber

Gewicht g/100 g KG 2,9 ± 0,2 4,1 ± 0,3 3,8 ± 0,1

Malic-Enzym U/g 0,12 ± 0,05 3,3 ± 0,1 9,6 ± 0,1

O2-Verbrauchin Perfusion, t = 0 min

µmol/g/min 1,71 ± 0,08 3,80 ± 0,21


mie ( kalte Extremitäten ) und eine auffallende Hypomobilität der Tiere im Vergleich zu

euthyreoten. Die hypothyreoten Tiere wurden nach etwa vier Wochen in den Versuch ge-

nommen.

2. Rezyklierende Leberperfusion und ihre Standardisierung

Die anästhesierten Tiere ( Nembutal , Ceva, 60mg/ml, in einer Dosierung von 6mg/100g KG

) wurden laparotomiert, und nach Präparation und Darstellung der Vena cava caudalis wurde

diese zwischen linker und rechter Vena renalis mit einer Ligatur umschlungen, noch nicht

ligiert. Nach Ligieren der V. renalis dex. wurde rechts nephrektomiert. Nach Dar-stellung der

Vena portae wurde auch hier eine Ligatur gelegt und 2mm distal der Ligatur inzidiert und eine

Knopfkanüle eingebracht und mittels der liegenden Ligatur fixiert. Zu diesem Zeitpunkt wurde

die Leber mit vorher bereitetem und begastem Puffer perfundiert

( Fluß 20 ml/min, Krebs-Henseleit-Puffer ( 21 ), Carbogen-begast O2/CO2 95%/5%, 37°C,

pH=7,4, Heparin-Zusatz 1000 IE/1,5 l ) bei gleichzeitiger Eröffnung der V. cava caud. zur

Ausblutung und Freispülung der Leber, da die Lebern stets zellfrei perfundiert wurden. Jetzt

wurde das Diaphragma eröffnet und die V. cava proximal der Leber ligiert, was die

Flußrichtung von Knopfkanüle in V. portae via Leberbett in Richtung V. cava caud. be-

stimmte. Nach Kanülierung der eröffneten V. cava caud. mittels eines dünnen, kurzen Plas-

tikschlauches proximal der V. testicularis dex. und Fixierung durch die bereits liegende

Ligatur, konnte die Leber gänzlich freipräpariert und als intaktes Organ entnommen wer-den.

Abschließend wurde die so präparierte Leber in die vorbereitete und temperierte Per-

fusionskammer unter Konnektierung des hier bereits zirkulierenden Perfusionssystems ein-

gebracht.

Die isolierte Perfusion war stets zellfrei. Als Perfusionspuffer diente Krebs-Henseleit-Puffer (

21 ), der konstant temperiert war auf 37°C, dem als Substrat Alanin 10mM zugesetzt

wurde und nach einstündiger Perfusion, um eine Substratverarmung auszuschließen weitere

5mM Alanin. So war es möglich die Organfunktion, gemessen am Sauerstoffverbrauch und der

Gluconeogenese, sowie der Harnstoffsynthese für mindestens 3 Stunden stabil zu hal-ten.

37°C


Abb. 3 Schematische Darstellung der isoliert rezyklierend perfundierten Rattenleber in der Perfu-

sionsapparatur nach Schimassek. Aufbau der Perfusionskammer 100x100x50 cm3 ( W.

Krannich KG, Göttingen ) s. Schema ; Temperatur 37°C, Verwendung von Glasröhren und

einem Magnetrührer im Reservoirgefäß.

Nach der Leberpassage wurde der Perfusionspuffer direkt an einer Clark-Elektrode vorbei-

geführt ( angeschlossen an einen Säure-Basen-Analysator, Typ PHM 71 b, Radiometer

Copenhagen; Nullpunkteinstellung durch 30 min N2-begastes H2O ), durch die kontinuier-lich

der Sauerstoffgehalt des Puffers gemessen und aufgezeichnet wurde. Die Elektrode wurde vor

jeder Perfusion neu auf Krebs-Henseleit Puffer, Carbogen-begast ( s.o. ), für 37°C geeicht (

830 µmol O2/Liter bei 95% O2/ 5% CO2 äquilibrierten Puffer ). Durch weitestgehende

Perfusionspufferführung durch Glasrohre wurde der Gasverlust minimiert und im

Perfusionssystem kontrolliert eingestellt auf 800 µmol O2/l. Die O2-Sättigung des Puffers

wurde zum Perfusionsbeginn und nach Perfusionsende kontrolliert.

Nach Konnektierung der Leber in der Perfusionskammer wurde nach 30 Minuten Vorper-

fusionszeit als Äquilibrierungsphase im Anschluß der Versuchsbeginn als Zeitpunkt


t = 0 min festgelegt und dann, wenn nicht anders beschrieben, 90 Minuten perfundiert.

Während der Perfusion wurde zu im einzelnen angegebenen Zeitpunkten Perfusat zur Be-

stimmung verschiedener Parameter entnommen. Zum Zeitpunkt t = 0 min wurde, wenn nicht

anders beschrieben, das zu untersuchende Schilddrüsenhormon in der angegebenen

Konzentration zugesetzt.

Aus dem Perfusat wurden verschiedene Substrate und Enzyme bestimmt : Alaninverbrauch,

Glucose- und Harnstoffproduktion, GOT oder LDH u.a. zu den im einzelnen angegebenen

Tab. 2 Zusammenfassung der gemessenen Substrate als Stoffwechselparameter bei geschlossener

und offener Leberperfusion am Ende der Perfusionszeit; vergleiche hierzu auch die Kapitel

III.1.2 und III.2.2 und II.2.3

Parametergeschlossen-rezyklierende

Leberperfusionoffene

Leberperfusion

Glucose 28,6 ± 3,3 µmol/g 9,0 ± 0,7 µmol/ml/g

Harnstoff 74,6 ± 6,8 µmol/g 52,3 ± 13,4 µmol/ml/g

Alaninverbrauch 210 ± 30 µmol/g nicht gem.

Zeitpunkten. Mittels der gewählten Parameter ließ sich die Lebersyntheseleistung und die

Intaktheit der Zellen des Organs nachweisen. Die im Zytosol vorkommende GOT signali-

sierte bei erhöhtem Austritt ins Perfusat eine höhergradige Schädigung der Zytoplasma-

membran. Ein Anstieg der Produktion von Glucose und Harnstoff setzt eine abgelaufene

Gluconeogenese und Harnstoffsynthese, resp. intaktes Zytosol und intakte Mitochondrien

voraus.

Es fand sich bei intakten Lebern in den einzelnen Versuchsgruppen unter den dort angege-

benen Versuchsbedingungen nach 30minütiger Vorperfusion, zum Zeitpunkt t = 0 min, ein

einheitlicher Sauerstoffverbrauch ( s. auch Tab.1 und Kapitel Ergebnisse ).


Abschließend wurde die Leber aus der Perfusionsapparatur entnommen, von Bindegewebs-

resten freipräpariert, abgetrocknet und das Feuchtgewicht ermittelt, um es in Bezug zu den

einzelnen Parametern zu setzen. Gleichzeitig erfolgte die Konnektierung der Perfusionsap-

paratur ohne die Leber, um abschließend die Linearität der Sauerstoffmessung zu überprü-fen,

als letzte Kontrolle im System.

3. Offene Leberperfusion und ihre Standardisierung

Die Präparation der Leber gestaltete sich w. o. beschrieben bis zur Entnahme des Organes. Die

Perfusionsapparatur ist in Abb. 4 schematisch dargestellt. Der Unterschied zur vorbe-

schriebenen Perfusion ist der offene Abfluß, sodaß das Perfusat nicht ein zweites mal zur

Abb. 4 Schema der offen isoliert perfundierten Rattenleber; gestrichelte Linie kennzeichnet Um-

wandlung zur geschlossenen Perfusion

Leber gelangt. Notwendigerweise wird das Pufferreservoir entsprechend groß gewählt

O2 Clark-Elektrode

pH-Elektrode

K+-Elektrode

∆p

Reservoir,Krebs-Henseleit-Puffer

Leber

Pumpe

37°C

Fritte,Carbogen-begast

Auffangbehälter

Perfusions-block


( 5 Liter ), und in diesem Versuchsaufbau wird die Temperatur des Perfusionspuffers so

gewählt, daß sie bei Erreichen der Leber 37° C beträgt. Auch ist der Perfusionsblock ( s. Abb.

4 ) auf 37° C temperiert.

Vor der Passage des Perfusionspuffers durch die Leber wurde mittels eines Druckaufneh-mers

der Perfusionsdruck ∆p kontinuierlich aufgezeichnet. Direkt nach der Leberpassage wurde

mittels der oben beschriebenen Clark-Elektrode kontinuierlich der Sauerstoffgehalt des

Perfusates gemessen, sowie auch parallel dazu mithilfe einer pH-Elektrode ∆ pH und durch

eine weitere Elektrode der Kaliumausstrom bestimmt. Wie oben schon beschrieben wurden

auch hier als Stoffwechselparameter Glucose, Harnstoff und LDH aus dem Perfu-sionspuffer

bestimmt. Vergleiche dazu die Daten der Tabellen 1 und 2.

4. Isolierte Mitochondrien aus Rattenhepatozyten und ihre Standardisierung

Gehungerten, männlichen hypothyreoten Ratten wurde zu angegebenen Zeitpunkten vor

Dekapitierung intraperitoneal NaCl ( 0,9% bei Kontrollen ), bzw. als Schilddrüsenhormon

3,5-L-T2 ( in angegebener Konzentration ) injiziert.

Nach Dekapitierung der Tiere und anschließendem Ausbluten der Lebern wurden diese mit

Saccharose-Lösung ( 0,25 M Saccharose, pH 7,4 ) abgespült, von Bindegewebs- und Ge-

fäßresten befreit, gewogen und wie folgt beschrieben auf Eis oder bei 4°C weiterverarbei-tet.

Die Präparation der Mitochondrien wurde nach den für Zellfraktionierungen üblichen Ver-

fahren durchgeführt. Dazu wurde das Gewebe zunächst schonend homogenisiert mittels

Potter-Homogenisator und anschließend die Mitochondrien durch Differentialzentrifugation

isoliert ( s. schematische Darstellung in Abb. 5 ).

Homogenat

5min, 600 g ( 3000 rpm )


Pellet Überstand ( Zelltrümmer, Zellkerne ) ( Mitochondrien, Lysosomen, Mikrosomen, Zytosol )

5min, 5100 g ( 9000 rpm )

Überstand Pellet ( Zytosol, Lysosomen, Mikrosomen ) ( Mitochondrien )

1,5 min, 12300 g ( 14000 rpm )

Überstand Pellet ( Mitochondrienbruchstücke ) ( Mitochondrien )

Aufnahme in 4 ml Saccharose-Lösung

Abb. 5 Schematische Darstellung der Mitochondrienpräparation

Messung mitochondrialer Atmung

Die Sauerstoffkonzentration im Inkubationsmedium wurde wiederum w. o. beschrieben mit

einer Clark-Elektrode bestimmt. Um einen definierten Sauerstoffgehalt im Meßmedium zu

erreichen wurde es zuvor 30 min im Thermostaten mit einer Pumpe belüftet. Die sich dabei

einstellende Sauerstoffkonzentration im Medium beträgt bei 30°C 195,5 µmol/l.

In den Versuchsansätzen wurde zunächst die Intaktheit der Präparation überprüft. Anschlie-

ßend nach Spülen des Reaktionsgefäßes mit destilliertem Wasser wurden dann 1,9 ml des

belüfteten, vortemperierten Inkubationsmediums ( 110mM Mannitol, 10mM KH2PO4, 60 mM

KCl, 60 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, pH = 7,4 ) in das Reaktions-

gefäß pipettiert und die Rührung der Meßzelle eingeschaltet. Zuerst wurde der Meßwert für

100%ige Luftsättigung des Mediums über 60 Sekunden registriert.


Nach Zusatz von 50 µl Mitochondriensuspension wurde das Reaktionsgefäß verschlossen.

Jetzt wurde die endogene Atmung für 60 sek. registriert und dann die Substrate ( 30 µl

Abb. 6 Schematische Darstellung der polarographischen Meßzelle

Succinat 1M bzw. 30 µl Glutamat 1M ) zugesetzt. Der ADP-Zusatz ( 15 µl ADP 0,05 M )

erfolgte dann erst nachdem die Atmungsgeschwindigkeit für mindestens 60 sek. konstant war.

Nach der Zugabe von ADP wurde abgewartet, bis die Mitochondrien vom aktiven

phosphorylierenden Zustand ( hohe Atmungsgeschwindigkeit ) in den kontrollierten Zustand

zurückgekehrt waren und eine konstante ( geringere ) Atmungsgeschwindigkeit erreicht hatten.

Bei der Durchführung der Atmungsversuche wurde jede Atmungskurve bis zum Erreichen des

anaeroben Zustandes registriert und vor jeder neuen Messung das Reaktionsgefäß gründlich

gereinigt.

Zur Berechnung des Verhältnisses der Atmungsgeschwindigkeit im aktiven phosphorylier-ten

Zustand ( nach ADP-Zusatz ) und dem im kontrollierten Zustand ( nach Phosphorylie-rung des

zugesetzten ADP ) wurde die Atmungsgeschwindigkeit aus dem Anstieg der Tan-genten

bezogen auf mg Protein / ml Mitochondriensuspension der Substrate wie folgt be-stimmt :

391 nmol O / ml ⋅ 30 mm / min ⋅ 2 ml Succinat V resp. = ⋅ tan α

Kanüle für Zusätze

Verschlußstempel

Temperiermantel

Inkubationsraum

Rührer Sauerstoffelektrode


217 mm ⋅ mg Protein

= 108,1 nmol O / min ⋅ tan α / mg Protein

391 nmol O / ml ⋅ 10 mm / min ⋅ 2 ml Glutamat V resp. = ⋅ tan α 217 mm ⋅ mg Protein

= 36,0 nmol O / min ⋅ tan α / mg Protein

5. Isolierte Nierenperfusion und ihre Standardisierung

Zur isoliert rezyklierend perfundierten Nierenperfusion kamen Nieren von hypothyreoten, für

24 Stunden gehungerten, männlichen Ratten zum Einsatz, analog zu den für isolierte

Leberperfusion verwendeten Tiere.

Die Perfusion der isolierten Nieren erfolgte in einem Rezirkulationssystem mit Dialyse. Es

wurde mit dem gleichen Perfusionsmedium perfundiert, das auch schon bei der isolierten

Leberperfusion zum Einsatz kam ( Krebs-Henseleit-Puffer ( 21 ), Carbogen-begast O2/CO2

95%/5%, 37°C, pH 7,4, Heparin-Zusatz 1000 IE/5l ).

Apparativer Aufbau

Vom Vorratsgefäß wurde das Perfusionsmedium mit einer Rollenpumpe durch einen kom-

merziellen Kapillarplattendialysator gepumpt ( SECON, Göttingen, Typ 101 ) und in das

Vorratsgefäß zurückgeleitet. Das Perfusionsmedium wurde durch 5000 ml eines begasten

Dialysats kontinuierlich regeneriert ( Dialysatreservoir ). Eine Akkumulation von schädi-

genden Peroxiden konnte so durch die Dialyse vermieden werden. Damit war es möglich, die

Organfunktion für ca. 2 Stunden stabil zu halten.


Der Dialysator diente auch als Oxygenator - „ dialung“ ; über Glasfritten wurde vorge-

wärmtes, wasserdampfgesättigtes Carbogen in das Dialysat geleitet. Die Rezirkulation des

Dialysats erfolgte mit 360 ml/min durch eine Zentrifugalpumpe.

Aus dem Perfusatkreislauf entnahm eine zweite Rollenpumpe unmittelbar hinter dem Dialy-

sator das für die Nierenperfusion benötigte dialysierte und aufoxygenierte Perfusat. Es ge-

langte nach Passieren eines 12 µm Zellulosenitrat-Filters und einer Wärmeschlange mit

Windkessel zu der am Präparationstisch fixierten doppelläufigen Perfusionskanüle. Wäh-rend

die Außenkanüle der Zuleitung des Perfusionsmediums diente, war der innere Teil der Kanüle

zur Registrierung des Perfusionsdruckes an einen Druckaufnehmer angeschlossen

( GOULD STATHAM INSTRUMENTS, USA, Typ P 50 ). So war es möglich, die Niere

fluß- und druckkonstant zu perfundieren.

Die isolierte Niere selbst lag in einer temperierten Metallschale, die ebenfalls am Präpara-

tionstisch fixiert war. Zum Auffangen des venösen Effluates wurde ein Doppeltrichter unter die

Nierenschale geschwenkt.

Die Zurückleitung des venösen Effluates in das Vorratsgefäß erfolgte luftblasenfrei über ein

geregeltes Quetschventil. Mit Hilfe einer weiteren Rollenpumpe wurde ein Aliquot des ve-

nösen Effluates ( 0,5 ml / min ) einer Tripel-Durchflußmeßeinheit zugeführt ( ESCHWEI-LER,

Kiel, Elektrodentyp MTD ) und anschließend in das Vorratsgefäß zurückgeleitet; pO2, pCO2

und pH wurden damit kontinuierlich gemessen.

Operationstechnik

Die Versuchstiere entsprachen den selben Anforderungen, wie sie bei der isolierten Leber-

perfusion zum Einsatz kamen. Zur Perfusion wurde jeweils die rechte Niere verwendet; das

Gewicht der dekapsulierten linken Niere diente als Referenzgewicht.

Nach intraperitonealer Anästhesie mit Nembutal wurde das Tier in Rückenlage auf einen

temperierten Präparationstisch aufgelegt. Nach medianer Laparotomie wurde die rechte Niere

zusammen mit dem Ureter von dem umgebenden Gewebe sowie der Nebenniere befreit. Für

den Gefäßanschluß der Niere an den Perfusionskreislauf wurden folgende Ge-fäße


freipräpariert und legiert : Aorta abd., A. renalis sin. et dex., A. mesenterica sup., V. cava.

Nach dem Abbinden des Ureters wurde dieser ca. 1 cm distal des Nierenbeckens mit einem 1

cm langen Polypropylenschlauch, sehr sorgfältig unter Vermeidung von Blutungen

katheterisiert. Nach Einbettung der rechten Niere in eine temperierte Metallschale in situ folgte

das Abbinden der A. renalis sin., der A. mesenterica und der Aorta abd. ca. 1,5 cm kaudal der

A. renalis sin. und dann die Abklemmung der Aorta abd. kaudal der rechten Nierenarterie. Die

doppelläufige Perfusionskanüle wurde distal der Klemme in die Aorta abd. eingeführt. Die

Perfusion wurde in situ begonnen, sobald die Aorta abd. kranial der A. mesenterica

abgebunden und die Gefäßklemme entfernt war. Danach wurde die Perfu-sionskanüle fest

eingebunden, die Gefäßverbindungen zum Tier getrennt, das Tier entfernt und die Blutreste mit

warmen Perfusat abgespült. Ein temperierter Doppeltrichter wurde zum Auffangen des

venösen Effluates unter die Nierenschale geschwenkt. Die V. cava inf. wurde mit einem am

Trichterblock schwenkbar angeordneten V2A-Rohr kanüliert; das kau-dale Ende der V. cava

wurde abgebunden.

6. Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs

Die Sauerstoffmessung während geschlossener, sowie während offener Leberperfusion wur-de

mit Hilfe eines Säure-Basen-Analysators Typ PHM 71 b Radiometer Copenhagen und einer

angeschlossenen Clark-Elektrode bestimmt und durch einen Schreiber aufgezeichnet. Vor den

Messungen wurde der Nullpunkt mittels N2-begasten Wassers vorgenommen. An-schließend

erfolgte die Einstellung auf 37°C temperierten, Carbogen-begasten ( 95% O2 / 5% CO2 )

Krebs-Henseleit-Puffer ( 21 ) : In einem Liter Puffer werden 830 µmol/ l Sauer-stoff gelöst (

35 ). Trotz weitestgehender Führung in Glasrohren waren geringfügige Gas-verluste zu

verzeichnen, sodaß sich ein kontrollierter Ausgangswert von 800 µmol/l O2 für den

Sauerstoffgehalt vor Leberperfusion ergab.

Am Anfang und am Ende jeden Experimentes wurde der Sauerstoffgehalt des Puffers bzw.

Inkubationsmediums überprüft, um erhöhten Gasverlust, Elektrodendriften o.a. auszu-

schließen.


Bei den Versuchen mit isolierten Mitochondrien ( siehe dazu Kapitel III.4 ) wurde die Sau-

erstoffkonzentration im Inkubationsmedium wiederum mit einer Clark-Elektrode bestimmt.

Nach 30 minütiger Belüftung durch eine Pumpe betrug der Sauerstoffgehalt des Mediums bei

30 °C im Thermostaten 195,5 µmol/l als Referenzwert.

7. Spektrophotometrische Bestimmungen

Protein-Bestimmung

Zu 50 µl BSA-Standard bzw. Probe wurden 2 ml 1/5 verdünntes Bio-Rad-Reagenz pipettiert

und nach Ablauf von mindestens 15 min bei 595 nm die Proteinkonzentration ermittelt.

Substratbestimmungen

Alanin-Bestimmung ( 2 )

Nach dem Testprinzip :

ALANIN - DH

L - Alanin + NAD+ + H2O Pyruvat + NH4+ + NADH + H+

Testansatz : 980 µl Tris-Hydrazin-Puffer, pH 1020 µl 0,1 M NAD200 µl H2O300 µl Probeneinsatz

Die Bestimmung von E1 erfolgte nach 45 min bei 334 nm, die enzymatische Umsetzung mit 10

µl L-Alanin-Dehydrogenase ( Alanin-DH, 5 mg / ml ) gestartet und E2 nach weiteren

120 min bestimmt.

Glucose-Bestimmung ( 2 )



HEXOKINASE

Glucose + ATP Glucose - 6 - P + ADP

GLUCOSE - 6 - P - DH

Glucose - 6 - P + NADP Gluconat-6-Phosphat + NADPH + H+

Testansatz : 1340 µl 0,4 M TRA - Puffer, pH 7,210 µl 0,5 M MgSO4

10 µl 0,1 M ATP40 µl 0,02 M NADP100 µl Probe

Die Bestimmung von E1 erfolgte bei 334 nm. Anschließend wurde die enzymatische Umset-

zung mit 10 µl Hexokinase / Glucose - 6 - Phosphat - Dehydrogenase ( 3 mg / ml ) gestartet

und E2 nach 20 min bestimmt.

Harnstoff-Bestimmung ( 2 )


UREASE

Harnstoff + H2O 2 NH4+ + CO2

GLU - DH

α - Ketoglutarat + NADH + NH4+ Glutamat + NAD+ + H2O

Testansatz : 500 µl 0,4 M TRA - Puffer, pH 8,010 µl 0,55 M α - Ketoglutarat70 µl 0,01 M NADH20 µl Glutamat - DH ( 10 mg / ml in Glycerin )1400 µl H2O100 µl Probe

Die Bestimmung von E1 erfolgte bei 334 nm. Anschließend wurde die enzymatische Umset-

zung mit 50 µl Urease ( 2mg / ml ) gestartet und E2 nach 60 min bestimmt.

Bestimmung von Enzymaktivitäten


Bestimmungen von Enzymaktivitäten wurden bei 25 °C vorgenommen und kontinuierlich

aufgezeichnet. Die photometrische Auswertung erfolgte bei 334 nm.

Glutamat-Oxalacetat-Transaminase ( GOT ) - Bestimmung ( 2 )


GOT

L - Aspartat + α - Ketoglutarat Oxalacetat + L - Glutamat

MDH

Oxalacetat + NADH + H+ Malat + NAD+

Testansatz : 750 µl 0,2 M KH2PO4, pH 7,450 µl 0,01M NADH10 µl Malat - Dehydrogenase ( 1 mg / ml )580 µl H2O200 µl Perfusat

Zunächst wurde die Reaktion mit 50 µl 0,55 M α - Ketoglutarat gestartet; nach 5 min er-folgte

der zweite Start mit 500 µl 0,25 M Aspartat.

Lactat-Dehydrogenase ( LDH ) - Bestimmung


LDH

NADH + H+ + Pyruvat NAD + + Lactat

Testansatz : 1000 µl 0,4 M TRA - Puffer, pH 8,070 µl 0,01 M NADH20 µl 0,5 M Pyruvat500 µl H2O100 µl Probe

Die Reaktion wurde mit 70 µl 0,01 M NADH gestartet und die Messung der Extinktion bei

366 nm bei Raumtemperatur per Schreiber über mindestens 5 min registriert.

Malat-Enzym - Bestimmung ( 17, 27 )



MALAT - ENZYM

L - Malat + NADP Pyruvat + CO2 + NADPH + H+

Vorbereitet zur Messung wird 1 g Leber im siebenfachen Volumen eiskalter 0,154 M KCl

gepottert und bei 100 000 g für 30 min zentrifugiert.

Testansatz : 350 µl 0,4 M TRA - Puffer, pH 7,210 µl 0,5 M L - Malat670 µl 0,01 M MnCl2

870 µl H2O100 µl Überstand bei Lebern hypothyreoter Ratten

Gestartet wurde die Reaktion mit 20 µl 0,02 M NADP.

8. Substanzen

Es wurden nur die L - Formen der angegebenen Schilddrüsenhormone eingesetzt. Die

verwendeten Schilddrüsenhormone waren ein Geschenk der Firma Henning Berlin und wiesen

einen Reinheitsgrad von über 99,5 % auf.

Die Schilddrüsenhormone wurden nach dem Auswiegen in einem Tropfen 1 N NaOH

aufgenommen und anschließend mit H2O weiter auf angegebene Konzentrationen verdünnt.

Die verwendeten Enzyme wurden von der Firma Boehringer Mannheim bezogen.

Alle anderen verwendeten Substanzen wurden, wenn nicht anders angegeben, von den Firmen

Merck, Sigma Chemie oder Boehringer Mannheim bezogen.

9. Statistische Auswertung


Die statistische Auswertung erfolgte nach dem Student´s t - Test für unabhängige bzw.

gepaarte Werte ( 33 ). Angegeben sind Mittelwerte ± Standardabweichung des Mittelwertes (

SEM ).

Ergebnisse33

III ERGEBNISSE

1. Rezyklierende Leberperfusion

Standardisierung des Modells

Die in die Versuche genommenen Tiere waren stets hypothyreot, männlich und hungerten 24

Stunden vor Versuchsbeginn, sodaß der Glykogengehalt der Lebern vernachlässigbar gering

war und bei Kontrollversuchen, wie auch den Versuchen mit Einsatz von Schild-

drüsenhormonen die Gluconeogenese anhand der Glucoseproduktion gemessen werden

konnte.

1.1 Sauerstoffverbrauch der isoliert rezyklierend perfundierten Leber hypothyreoter,

männlicher und gehungerter Ratten

Nach Installation der präparierten Lebern hypothyreoter, männlicher, gehungerter Ratten in die

Perfusionskammer wurde standardisiert für 30 Minuten vorperfundiert und dieser Zeit-punkt t

= 0 min gesetzt. Zu diesem Zeitpunkt erfolgte bei den Kontrollen kein weiterer Zu-satz, bei

weiteren Versuchen wurden Schilddrüsenhormone in angegebenen Konzentrationen

hinzugefügt und im weiteren der Sauerstoffverbrauch kontinuierlich gemessen, wie auch

mittels Perfusatentnahmen zu angegebenen Zeitpunkten die hierin enthaltenen Substrate bzw.

Enzyme bestimmt. Die Perfusionszeit betrug, wenn nicht anders angegeben, 90 Mi-nuten. Nach

Beendigung der Perfusion wurde das Feuchtgewicht der Lebern bestimmt, um den

Sauerstoffverbrauch über die Zeit ins Verhältnis zu setzen.

Das Perfusat enthielt bei allen Leberperfusionen, soweit nicht anders angegeben, Alanin in

einer Ausgangskonzentration von 10 mM, gelöst in Krebs-Henseleit-Puffer ( 21 ), tempe-riert

auf 37 °C, Carbogen - begast ( 95 % O2 / 5% CO2 ) bei konstantem pH 7,4. Nach 30-

minütiger Äquilibrierung, zum Zeitpunkt t = 0 min, wurde den Kontrollperfusionen kein

Ergebnisse34

weiteres Agens zugesetzt. Lediglich nach 60 minütiger Gesamtperfusionszeit ( zum Zeit-punkt

t = 30 min ) wurden weitere 5 mM Alanin, um einer Substratverarmung vorzubeu-gen, bei

allen Perfusionen in das Pufferreservoir nachgegeben. Die Ergebnisse der Perfusat-

bestimmungen zu den Zeitpunkten 0, 30, 60 und 90 Minuten ( Glucose, Harnstoff, GOT ) faßt

Tab. 2 auf Seite 20 zusammen.

Die Kontrollperfusionen von Lebern hypothyreoter, männlicher, gehungerter Ratten

( n = 11 ) sind in Abb. 7 graphisch zusammengefaßt. Der Ausgangs-Sauerstoffverbrauch

betrug zum Zeitpunkt t = 0 min 1,71 ± 0,08 µmol/min/g und stieg über 90 min Perfusions-

zeit um 0,53 ± 0,05 auf 2,24 ± 0,07 µmol/min/g signifikant, p < 0,01 an. Prozentual stieg

t in min0 20 40 60 80 100

∆ O 2-Verbrauch in µmol/min/g

0,0

0,5

1,0

1,5

t in min0 20 40 60 80 100

O2-

Ve

rb

ra

uc

h i

n µ

mo

l/m

in/

g

1,5

2,0

2,5

3,0

Abb. 7Sauerstoffverbrauch isoliert rezyklierend perfundierter Lebern männlicher, hypothyreoter,

gehungerter Ratten

o Kontrollen ( MW ± SEM, n = 11 )

Dargestellt sind der relative Sauerstoffverbrauch ( gr. Graphik ), sowie der absolute

Sauerstoffverbrauch ( kl. Graphik ) in µmol/min/g.

Ergebnisse35

der Sauerstoffverbrauch hierbei im Vergleich zum Ausgangswert um 31 % nach 90 min.

Der Alaninverbrauch aus dem Perfusat, wie auch die abgelaufene Gluconeogenese mit Glu-

coseproduktion sowie die Harnstoffsynthese signalisieren funktionstüchtige Zellkomparti-

mente und eine GOT Aktivität von stets unter 1,5 U/l beweisen die Intaktheit der Zellen.

1.2 Stimulation des Sauerstoffverbrauchs durch 3,5-L-T2

Der Effekt des Zusatzes von 3,5-L-Dijodthyronin ( 3,5-L-T2 ) in einer Konzentration von

10-12 M, entsprechend der von Pinna et al. ( 66 ) bei Probanden gefundenen physiologi-

t in min0 20 40 60 80 100


0,0

0,5

1,0

1,5

t in min0 20 40 60 80 100

O2-

Ve

rb

ra

uc

h i

n µ

mo

l/m

in/

g

1,5

2,0

2,5

3,0

*

Abb. 8Sauerstoffverbrauch isoliert rezyklierend perfundierter Lebern männlicher, hypothyreoter,

gehungerter Ratten, ∗ = p < 0,01 .


n 10 -12 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt t = 0 min ( MW ± SEM, n = 9 )



Ergebnisse36

schen Konzentration, zum Perfusionspuffer zum Zeitpunkt t = 0 min im Modell der isoliert

rezyklierend perfundierten Leber hypothyreoter, männlicher, gehungerter Ratten steigerte den

Sauerstoffverbrauch innerhalb von 90 min Perfusion vom Ausgangswert 1,62 ± 0,12

µmol/min/g um 1,28 ± 0,12 µmol/min/g signifikant, p<0,01 auf 2,90 ± 0,18 µmol/min/g. Am

Ende der Perfusionszeit war der Sauerstoffverbrauch, verglichen mit den Kontrollen um 0,66

µmol/min/g oder 29,5 % über diese angestiegen, vergleiche dazu Abb. 8.

Wie in Abb. 8 ( kl. Graphik ) dargestellt entspricht dies im absoluten Vergleich gegenüber dem

Anstieg der Kontrollen von 31 %, nach beschriebener Schilddrüsenhormongabe einer

Stimulation des Sauerstoffverbrauchs um 79 % und damit mehr als dem zweieinhalbfachen.

Der Ausgangs-Sauerstoffverbrauch lag nach der Vorperfusionszeit zum Zeitpunkt t = 0 min

geringfügig unter dem der Kontrollen. Bis zur 30. Minute verliefen beide Kurven weitge-

hend parallel. Danach stieg der Sauerstoffverbrauch in der Versuchsgruppe im Vergleich zum

Kontrollkollektiv jedoch deutlich höher und steiler an. Die Kurvenverläufe im direkten

Vergleich unterscheiden sich bereits nach 45 min statistisch signifikant voneinander.

Tab. 3 Steigerung der Glucose- und Harnstoffproduktion rezyklierend perfundierter Rattenlebern durch

3,5-L-T2 10-12 M zum Zeitpunkt t = 0 min im Vergleich zu Kontrollen.

Angaben in µmol/g Leber Feuchtgewicht.

* p < 0,05, ** p < 0,01

Kontrollen 0 30 60 90 ( min ) n

Glucose 4,8 ± 1,1 8,9 ± 1,8 17 ± 3 29 ± 3 5

Harnstoff 8,1 ± 2,9 31 ± 9 58 ± 9 75 ± 7 5

3,5-L-T2 0 30 60 90 ( min ) n

Glucose 4,8 ± 1,1 10 ± 2 * 27 ± 2 ** 42 ± 7 ** 4

Harnstoff 8,1 ± 2,9 43 ± 6 * 84 ± 3 ** 136 ± 9 ** 4

Ergebnisse37

Wie der Sauerstoffverbrauch unterschieden sich auch die Stoffwechselparameter von denen des

Kontrollkollektivs. Die Harnstoffproduktion steigerte sich nach Hormonzusatz von 30,6 ± 8,8

auf 43,0 ± 5,9 µmol/g, wie auch die Glucoseproduktion nach Gabe von 10 -12 M 3,5-

L-T2 von 8,9 ± 1,8 auf 11,6 ± 1,6 µmol/g bereits nach 30 min an ( p < 0,05 ), um nach 60 min

ein Signifikanzniveau von p < 0,01 zu erreichen. Vergleiche dazu Tab. 3.

1.3 Stimulation des Sauerstoffverbrauchs durch 3,5-L-T2 bei perfundierten Lebern

weiblicher Ratten

Im folgenden wurde untersucht, ob es geschlechtsspezifische Unterschiede in der Wirkung von

3,5-L-T2 auf den Stoffwechsel der perfundierten Lebern gibt. Die Perfusion der Lebern

weiblicher Ratten vollzog sich analog denen der männlichen Tiere. Die Versuchsbedingun-gen

waren mit gehungertem Status, induzierter Hypothyreose sowie rezyklierender Perfu-sion

identisch.

Abb. 9 faßt die Versuchsergebnisse der weiblichen Kontrollperfusionen ohne Schilddrüsen-

hormonzusatz und die Versuchsgruppe mit Einsatz von 10-12 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt

t = 0 min zusammen. Bei den Kontrollperfusionen betrug der Ausgangs-Sauerstoffver-brauch

2,08 ± 0,19 µmol/min/g und stieg im Verlauf der 90 minütigen Perfusion um 0,47 ± 0,03

µmol/min/g , entsprechend 22,6 % auf 2,55 ± 0,19 µmol/min/g an.

Nach Zusatz von 10-12 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt t = 0 min stieg der Sauerstoffverbrauch,

nach 15 Minuten gleichmäßigen Verlaufs mit den Kontrollen, dann steiler an als diese, um ein

signifikant höheres Niveau nach bereits 25 Minuten Perfusion zu erreichen mit p<0,01. Nach

einem zu Perfusionsbeginn niedrigeren Ausgangsverbrauch als die Kontrollgruppe von 1,97 ±

0,13 µmol/min/g und einer Steigerung um 1,03 µmol/min/g erreichte der Sauer-stoffverbrauch

nach 90minütiger Perfusion 3,00 ± 0,10 µmol/min/g, entsprechend 52,3 % über dem

Vergleichszeitpunkt der Kontrollen.

Ergebnisse38

t in min0 20 40 60 80 100

∆ O2-Verbrauch in µmol/min/g

0,0

0,5

1,0

1,5

t in min0 20 40 60 80 100

O2-V

er

br

au

ch

in

µm

ol/

min

/g

2,0

2,5

3,0

*

Abb. 9Sauerstoffverbrauch isoliert rezyklierend perfundierter Lebern weiblicher, hypothyreoter,

gehungerter Ratten, ∗ = p < 0,01.

¡ Kontrollen ( MW ± SEM, n = 4 )

l 10-12 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt t = 0 min ( MW ± SEM, n = 5 )



1.4 Vergleich der Stimulation des Sauerstoffverbrauchs bei männlichen und

weiblichen Versuchstieren

Die Kontrollgruppen der männlichen und weiblichen Versuchstiere verlaufen in der Dar-

stellung des relativen Sauerstoffverbrauchs fast identisch; vergleiche dazu Abb. 10 a. Wie in

der männlichen Kontrollgruppe steigt der Sauerstoffverbrauch bei den weiblichen Tieren

geringfügig aber kontinuierlich an. Im Vergleich der absoluten Werte fällt jedoch trotz ins-

gesamt parallelen Verlaufs eine deutliche Betragsdifferenz auf; vergleiche dazu Abb. 10 b.

Ergebnisse39

Die Lebern weiblicher, hypothyreoter, gehungerter Ratten wiesen einen signifikant höheren

Sauerstoffverbrauch auf, als die männlichen Versuchstiere. Sowohl Ausgangs-Sauerstoffver-

brauch, wie auch der Wert nach 90 Minuten Perfusionszeit liegen bei den weiblichen Tieren

fast parallel verschoben um ca. 0,34 µmol/min/g höher als die männliche Kontrollgruppe mit

einem Signifikanzgrad von p<0,01.

Die prozentuale Stimulation des Sauerstoffverbrauchs durch 3,5-L-T2 beträgt in der Gruppe

der weiblichen Versuchstiere 17,7 % und fällt damit geringer aus als die Stimulation bei den

männlichen Versuchstieren ( 29,5 % ), wie anhand des Vergleichs der absoluten Werte (

dargestellt in Abb. 10 b ) sichtbar wird. Auch das Ausgangsniveau des Sauerstoffver-brauchs

der beiden Versuchsgruppen ist unterschiedlich und liegt bei den weiblichen Ratten signifikant

höher als bei den männlichen Versuchstieren, p<0,01 ( siehe Abb. 10 b ).

t in min0 20 40 60 80 100


0,0

0,5

1,0

1,5

t in min0 20 40 60 80 100

O2-V

er

br

au

ch

in

µm

ol/

min

/g

1,5

2,0

2,5

3,0

Abb. 10 a Abb. 10 b

relativer Sauerstoffverbrauch in µmol/min/g absoluter Sauerstoffverbrauch in µmol/min/g

Stimulation des Sauerstoffverbrauchs isoliert rezyklierend perfundierter Lebern hypothyreoter, gehungerter

Ratten

o Kontrollen, männlich ( MW ± SEM, n = 11 )

n 10-12 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt t = 0 min, männlich ( MW ± SEM, n = 9 )

¡ Kontrollen, weiblich ( MW ± SEM, n = 4 )

l 10-12 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt t = 0 min, weiblich ( MW ± SEM, n = 5 )

Ergebnisse40

Zum Perfusionsende befinden sich dann aber beide Versuchsgruppen nach Stimulation des

Sauerstoffverbrauchs durch 10-12 M 3,5-L-T2 im Vergleich beim absoluten Verbrauch fast auf

demselben Endniveau nach 90 min; vergleiche hierzu Abb. 10 b.

Ein weiterer Unterschied liegt in der Dynamik der hormonstimulierten Verlaufskurven. Der

Zeitpunkt, zu dem nach Stimulation des Sauerstoffverbrauchs durch 3,5-L-T2 das Niveau der

Kontrollgruppe verlassen wird liegt im Falle der Versuchsgruppe der weiblichen Tiere deutlich

früher als bei den männlichen Tieren. So erreicht der Sauerstoffverbrauch der hor-

monstimulierten Versuchsgruppe bei den weiblichen Tieren früher ein signifikant erhöhtes

Niveau im Vergleich zu ihren Kontrollen, als es bei der Vergleichsgruppe der männlichen Tiere

erreicht wird. Auch erreicht der Sauerstoffverbrauch bei den perfundierten Lebern weiblicher

Ratten nach Stimulation durch 10-12 M 3,5-L T2 früher eine Einstellung auf ein Endniveau als

es bei den männlichen Versuchstieren erlangt wird.

1.5 Steigerung der eingesetzten Hormonkonzentration

Um eine Aussage darüber machen zu können, ob das geringere Ausmaß der Stimulation des

Sauerstoffverbrauchs der Ursache nach an der Erschöpfung der Atmungskapazität der Leb-ern

weiblicher, hypothyreoter, gehungerter Ratten lag, oder eine weitere Steigerbarkeit, auf ein ∆

O2, wie bei den männlichen Versuchstieren erreicht werden konnte, wurde die Kon-zentration

von 3,5-L-T2 auf 10-10 M erhöht und die Ergebnisse in Abb. 11 dargestellt.

Eine Steigerung der Konzentration von 3,5-L-T2 auf 10-10 M bewirkte im Endbetrag keine

weitere Zunahme des Sauerstoffverbrauchs im Vergleich zur Stimulation durch die niedri-gere

Konzentration von 10-12 M. Im Vergleich des relativen Sauerstoffverbrauchs der per-fundierten

Lebern lag nach 90 minütiger Perfusion der Verbrauch sogar geringfügig unter dem nach

Einsatz der geringeren Konzentration des Schilddrüsenhormones. Lediglich im Kurvenverlauf

liegt bei erhöhter Hormonkonzentration eine geringfügig früher signifikante Stimulation vor,

mit p<0,01 nach 20 Minuten; im Vergleich zum selben Signifikanzniveau nach Einsatz von 10-

12 M 3,5-L-T2 wurde dies nach 25 Minuten erreicht.

Ergebnisse41

t in min0 20 40 60 80 100


0,0

0,5

1,0

1,5

t in min0 20 40 60 80 100

O2-V

er

br

au

ch

in

µm

ol/

min

/g

2,0

2,5

3,0

*

Abb. 11 Sauerstoffverbrauch isoliert rezyklierend perfundierter Lebern weiblicher, hypothyreoter,

gehungerter Ratten, ∗ p < 0,01

¡ Kontrollen ( MW ± SEM, n = 4 )

l 10-12 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt t = 0 min ( MW ± SEM, n = 5 )

t 10-10 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt t = 0 min ( MW ± SEM, n = 4 )

Dargestellt sind der relative Sauerstoffverbrauch ( gr. Graphik ). sowie der absolute


Der Ausgangssauerstoffverbrauch lag in der Versuchsgruppe mit 2,24 ± 0,16 µmol/min/g

geringfügig über dem Ausgangswert der Kontrollgruppe, wie auch über der durch 10-12 M T2

stimulierten Gruppe. Im weiteren Verlauf unterschieden sich die beiden hormonstimu-lierten

Versuchsgruppen jedoch kaum voneinander. Der Sauerstoffverbrauch der isoliert

rezyklierend perfundierten Lebern weiblicher, hypothyreoter, gehungerter Ratten scheint durch

Erhöhung der Hormonkonzentration von 3,5-L-T2 nicht weiter steigerbar ist.

Frühere Befunde unserer Arbeitsgruppe waren bei rezyklierender Perfusion männlicher

Ergebnisse42

Lebern identisch; auch hier konnte durch Steigerung der Hormonkonzentration keine wei-

tere Steigerung des Sauerstoffverbrauchs erzielt werden.

1.6 Stimulation des Sauerstoffverbrauchs durch 3,5-L-T2 bei isoliert rezyklierend

perfundierten Lebern männlicher, hypothyreoter Ratten nach kohlenhydratrei-

cher Diät

Es ist bekannt, daß der Serum-T3-Spiegel in Phasen des Hungers abfällt, um anschließend nach

Wiederfütterung mit kohlenhydratreicher Nahrung kurzfristig wieder anzusteigen. Daher stellt

sich die Frage, ob der Effekt von 3,5-L-T2 auch durch den Ernährungsstatus der Versuchstiere

modulierbar ist. Für 3,5-L-T2 sind keine Serum-Spiegel im Hunger bekannt.

Um den Einfluß des gehungerten Status der Versuchstiere auf die Steigerung des Stoffwech-

sels durch 3,5-L-T2 der perfundierten Lebern zu untersuchen, wurden die gehungerten Tie-re

mit einer Versuchsgruppe kohlenhydratreich ernährter Tiere verglichen.

Die Leberperfusion unterschied sich lediglich durch den nicht gehungerten Status der Tiere von

den unter III.1.1 und III.1.2 beschriebenen Versuchsanordnungen. Statt dessen wurden die

hypothyreoten, männlichen Tiere nach einem Tag Hungern die darauffolgenden zwei Tage mit

einem kohlenhydratreichen Futter versorgt. Der nicht gehungerte Status machte sich in Bezug

auf das Gewicht der Lebern kaum bemerkbar. Gehungerte Tiere wiesen ein Lebergewicht von

5,8 ± 0,01 g auf; die Lebern der Tiere dieser Versuchsanordnung wogen 5,8 ± 0,21 g.

Der Sauerstoffverbrauch der perfundierten Lebern hypothyreoter, männlicher, kohlenhy-

dratreich ernährter Ratten lag zum Zeitpunkt t = 0 min mit 1,38 ± 0,12 µmol/min/g O2 und

einem Anstieg über 90 Minuten um 0,47 ± 0,03 µmol/min/g auf 1,85 ± 0,10 µmol/min/g

signifikant und annähernd parallel verschoben unter den zu vergleichenden Kontrollen der

gehungerten Tiere aus dem Versuch III.1.1, p<0,01.

Die Stimulation des Sauerstoffverbrauchs wiederum durch 10-12 M 3,5-L-T2 bewirkte, bei

gleichem Ausgangsniveau der Versuchsgruppe mit 1,31 ± 0,07 µmol/min/g, eine schon nach 20

Ergebnisse43

Minuten signifikante Steigerung der Atmung, die nach 90 minütiger Perfusion, um 1,02 ± 0,14

µmol/min/g erhöht, auf 2,32 ± 0,15 µmol/min/g anstieg. Nach Hormonzugabe unterscheidet

sich diese Versuchsgruppe bei Aufzeichnung der Verlaufskurve des ∆ O2-Ver-brauchs durch

einen früheren Anstieg von den gehungerten Lebern. Der Anstieg des Sauer-stoffverbrauchs

beträgt bei der Kontrollguppe 34 %, verglichen mit 77 % nach Stimulation der Atmung durch

das eingesetzte Schilddrüsenhormon. Während die Kontrollgruppe ab der 60. Minute

Perfusionszeit ein Plateau zu erreichen scheint, deutet sich dieses bei hormonell stimulierter

Perfusion erst ab der 80. oder 90. Minute an; siehe dazu auch Abb. 12.

t in min0 20 40 60 80 100


0,0

0,5

1,0

1,5

t in min0 20 40 60 80 100

O2-V

er

br

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*

Abb. 12 Sauerstoffverbrauch isoliert rezyklierend perfundierter Lebern männlicher, hypothyreoter,

kohlenhydratreich ernährter Ratten, ∗ p < 0,01.

² Kontrollen ( MW ± SEM, n = 4 )

u 10-12 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt t = 0 min ( MW ± SEM, n = 6 )



Im Vergleich zu den Perfusionen gehungerter Ratten unterscheiden sich die Kontrollen beider

Versuchsgruppen im Verlauf kaum. Lediglich ein dezent späterer Anstieg der Kon-trollen der

Ergebnisse44

kohlenhydratreich ernährten Tiere, sowie der stets niedrigere relative Sauer-stoffverbrauch

machen die geringfügigen Unterschiede aus, wie in Abb. 13 a zum Ausdruck kommt.

Die Darstellung des absoluten Sauerstoffverbrauchs in der Abb. 13 b zeigt jedoch einen

Betragsunterschied von im Verlauf fast konstant 18 % niedrigerem, entsprechend 0,36

µmol/min/g O2-Verbrauch, gegenüber dem gehungerten Status; jeweils bezogen, wie an-

gegeben auf das Lebergewicht in Gramm.

Berücksichtigt man bei kohlenhydratreich ernährten Tieren die durch Glykogenspeicherung

bedingte geringere Konzentration atmungsaktiver Kompartimente, muß der Sauerstoffver-

brauch auf Milligramm Protein pro Gramm Leber bezogen werden. Die gehungerten Le-

t in min0 20 40 60 80 100


0,0

0,5

1,0

1,5

t in min0 20 40 60 80 100

O2-V

er

br

au

ch

in

µm

ol/

min

/g

1,5

2,0

2,5

3,0

Abb. 13 a Abb. 13 b


Stimulation des Sauerstoffverbrauchs isoliert rezyklierend perfundierter Lebern männlicher, hypothyreoter

Ratten

o Kontrollen, gehungert ( MW ± SEM, n = 11 )

n 10-12 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt t = 0 min, gehungert ( MW ± SEM, n = 9 )

² Kontrollen, kohlenhydratreiche Diät ( MW ± SEM, n = 4 )

u 10-12 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt t = 0 min, kohlenhydratreiche Diät ( MW ± SEM, n = 6 )

bern wiesen im Mittel 332 ± 10 mg Protein / g Leber ( n = 5 ) auf und die kohlenhydrat-reich

ernährten Tiere 269 ± 5 mg Protein / g Leber ( n = 10 ) auf; p<0,01. Bezogen auf das Protein

glichen sich die Sauerstoffverbrauchswerte fast an.

Ergebnisse45

Die Lebern gehungerter hypothyreoter Ratten wiesen zu Beginn der Perfusion einen Sauer-

stoffverbrauch von 5,15 ± 0,24 nmol/min/mg Protein und im Vergleich dazu, nach kohlen-

t in min0 20 40 60 80 100


0,0

0,5

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1,5

t in min0 20 40 60 80 100

O2-V

er

br

au

ch

in

µm

ol/

min

/g

1,5

2,0

Abb. 14 Sauerstoffverbrauch isoliert rezyklierend perfundierter Lebern männlicher, hypothyreoter,

kohlenhydratreich ernährter Ratten

² Kontrollen ( MW ± SEM, n = 4 )

u 10-12 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt t = 0 min ( MW ± SEM, n = 6 )

t 10-10 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt t = 0 min ( MW ± SEM, n = 2 )



hydratreicher Diät einen Sauerstoffverbrauch von 5,12 ± 0,45 nmol/min/mg Protein auf. Nach

der abgelaufenen Stimulation erreichten die vorher gehungerten Lebern nach 90 Mi-nuten

Perfusionszeit einen O2-Verbrauch von 8,74 ± 0,54 nmol/min/mg Protein, vergleich-bar den

Lebern der zuvor kohlenhydratreich ernährten Tiere die am Ende der Perfusion bei 8,62 ± 0,56

nmol/min/mg Protein lagen.

Ergebnisse46

Die graphische Darstellung des absoluten Sauerstoffverbrauchs in Abb. 13 b veranschau-licht

noch einmal die Betragsdifferenzen der verglichenen Ernährungsstatus bei isoliert

rezyklierender Perfusion. Nach kohlenhydratreicher Kost kann das Atmungsniveau gehun-

gerter Lebern nach Stimulation nicht ganz erreicht werden. Die prozentuale Berechnung des

Sauerstoffverbrauchs nach Stimulation durch das Schilddrüsenhormon in den beiden Ver-

suchsgruppen beträgt bei gehungerten Versuchstieren 29,5 % und nach kohlenhydratreicher

Diät 25,4 % und fällt damit nahezu identisch aus.

In einem ausgewählten Experiment wurde die eingesetzte Konzentration von 3,5-L-T2 auf 10-10

M gesteigert, um auszuschließen, daß eine fehlende Steigerbarkeit des Sauerstoff-verbrauchs

auf einen Hormonmangel zurückzuführen ist. Wie in der Abb. 14 dargestellt, liegt der

Sauerstoffverbrauch nach erhöhter Hormonkonzentration bei hypothyreoten Ratten nach

kohlenhydratreicher Diät jedoch nicht über dem der Versuchsgruppe mit geringerem

Hormoneinsatz, sondern gerinfügig darunter. Auch ist die Stimulation des O2-Verbrauchs

gegenüber der Kontrollgruppe nicht früher signifikant gesteigert.

1.7 Stimulation des Sauerstoffverbrauchs durch 3,5-L-T2 bei isoliert rezyklierend

perfundierten Lebern weiblicher, hypothyreoter, kohlenhydratreich ernährter

Ratten

Um den Einfluß kohlenhydratreicher Diät auf den Sauerstoffverbrauch weiblicher, hypothy-

reoter Ratten zu untersuchen, wurde den Tieren nach Futterentzug für einen Tag, an den

darauffolgenden zwei Tagen kohlenhydratreiche Kost ad libitum angeboten. Am vierten Tag

wurden die Lebern in den Versuch genommen und perfundiert. Das Lebergewicht der ge-

hungerten Tiere von 4,17 ± 0,12 g unterschied sich nur gering von dem der nicht gehun-gerten

glykogenspeichernden Lebern, die im Mittel 4,56 ± 0,21 g Feuchtgewicht aufwiesen und damit

nur 9,4 % schwerer waren.

Der kontinuierlich aufgezeichnete Sauerstoffverbrauch der perfundierten weiblichen Lebern

hypothyreoter, kohlenhydratreich ernährten Ratten ohne Hormonzusatz betrug 1,50 ± 0,08

µmol/min/g zum Zeitpunkt t = 0 min. Verglichen mit den gehungerten Tieren aus Versuch

Ergebnisse47

t in min0 20 40 60 80 100


0,0

0,5

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t in min0 20 40 60 80 100

O2-V

er

br

au

ch

in

µm

ol/

min

/g

1,5

2,0

2,5

*


kohlenhydratreich ernährter Ratten, ∗ = p < 0,01.

↵ Kontrollen ( MW ± SEM, n = 3 )¬ 10-12 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt t = 0 min ( MW ± SEM, n = 3 )Dargestellt sind der relative Sauerstoffverbrauch ( gr. Graphik ), sowie der absolute


III.1.3, bei deren Kontrollgruppe der Sauerstoffverbrauch 2,08 ± 0,19 µmol/min/g betrug,

entspricht dies einer Senkung um 27,9 %, die nicht allein durch das erhöhte Lebergewicht

erklärt ist, wie Abb. 16 b zeigt. Wie bei den Lebern der gehungerten weiblichen Ratten, stieg

bei den Kontrollen der gefütterten Tiere der Sauerstoffverbrauch im Verlauf der 90 minütigen

Perfusion signifikant um 0,55 ± 0,06 µmol/min/g O2 an, auf den Endbetrag von 2,05 ± 0,11

µmol/min/g, prozentual ausgedrückt um 36,7 %, p<0,01, vergleiche dazu Abb. 15.

Nach Zusatz von 10-12 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt t = 0 min stieg der Sauerstoffverbrauch von

1,52 ± 0,12 µmol/min/g binnen 90 minütiger Perfusion um 0,94 ± 0,09 µmol/min/g, bzw. 61,2

Ergebnisse48

% auf 2,45 ± 0,05 µmol/min/g signifikant und deutlich höher an, als das bei der Kontrollgruppe

zu verzeichnen war; siehe dazu Abb. 15.

Wie bei den gehungerten Tieren war der basale O2-Verbrauch durch 3,5-L-T2 zu steigern.

Bei Darstellung des relativen Sauerstoffverbrauchs als ∆-O2 scheint sich die Versuchsgrup-pe

bereits nach 20 min von der Kontrollgruppe zu unterscheiden. Die Auftragung des abso-luten

Sauerstoffverbrauchs jedoch macht deutlich, daß ein wirklicher Unterschied als signi-

t in min0 20 40 60 80 100


0,0

0,5

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1,5

t in min0 20 40 60 80 100

O2-V

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au

ch

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µm

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min

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1,5

2,0

2,5

3,0

Abb. 16 a Abb. 16 b


Stimulation des Sauerstoffverbrauchs isoliert rezyklierend perfundierter Lebern weiblicher hypothyreoter

Ratten

¡ Kontrollen, gehungert ( MW ± SEM, n = 4 )

l 10-12 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt t = 0 min, gehungert ( MW ± SEM, n = 5 )

↵ Kontrollen, kohlenhydratreiche Diät ( MW ± SEM, n = 3 )¬ 10 -12 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt t = 0 min, kohlenhydratreiche Diät ( MW ± SEM, n = 3 )

fikante Stimulation jedoch auch erst nach 40 min erreicht ist mit p<0,01, der sich bis zur 90.

Minute kontinuierlich weiter steigert.

Im direkten Vergleich zu den gehungerten weiblichen, hypothyreoten Versuchstieren aus dem

Kapitel III.1.3, dargestellt in Abb. 9 fallen mehrere Unterschiede auf. Zunächst scheint bereits

die hormonell nicht stimulierte Kontrollgruppe der kohlenhydratreich ernährten Tie-re im O2-

Verbrauch später anzusteigen, als die gehungerten Tiere. Nach 20 und 30 Minuten Perfusion

Ergebnisse49

liegen die kohlenhydratreich gefütterten Tiere im Sauerstoffverbrauch noch unter-

t in min0 20 40 60 80 100


0,0

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t in min0 20 40 60 80 100

O2-V

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2,5


kohlenhydratreich ernährter Ratten

↵ Kontrollen ( MW ± SEM, n = 3 )¬ 10-12 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt t = 0 min ( MW ± SEM, n = 3 )t 10-10 M 3,5-L- T2 zum Zeitpunkt t = 0 min ( MW ± SEM, n = 2 )



halb der gehungerten Ratten, erreichen aber nach 90 minütiger Perfusion dasselbe Niveau des

O2-Verbrauchs. In der Darstellung des absoluten Sauerstoffverbrauchs unterscheiden sich die

beiden Versuchsgruppen, jedoch aufgrund des schon unterschiedlichen Ausgangs-niveaus, wie

oben beschrieben, gravierend voneinander.

Nach hormoneller Stimulation stiegen die gehungerten Lebern jedoch signifikant früher im

Sauerstoffverbrauch an als die Vergleichsgruppe der stimulierten Lebern nach kohlenhy-

dratreicher Diät. Nachdem die gehungerten Lebern bereits nach 25 Minuten signifikant mehr

Sauerstoff verbrauchten, ist dies bei den gefütterten Tieren erst nach 40 Minuten der Fall.

Auch betrug das ∆ des O2-Verbrauchs bei den gehungerten Tieren im Mittel 0,56 µmol mehr

Ergebnisse50

Sauerstoff nach Gabe von 10-12 M 3,5-L-T2, im Vergleich zu einer Steigerung um 0,39 µmol

O2 als Mittelwert der nicht gehungerten Versuchstiere. Prozentual fällt der Vergleich jedoch

nicht so gravierend aus. Aufgrund des geringeren basalen Sauerstoffver-brauchs beträgt die

Stimulation nach kohlenhydratreicher Wiederfütterung 61,2 %. Vergli-chen mit der bei

gehungerten Tieren fällt diese hier mit 52,3% geringfügig niedriger aus.

In einem weiteren Experiment wurde die Konzentration des eingesetzten Schilddrüsen-

hormones 3,5-L-T2 auf 10-10 M erhöht, um zu prüfen, ob die Stimulation des Sauerstoff-

verbrauchs in diesem Versuchsaufbau zu steigern, bzw. zu beschleunigen war. Abb. 17 stellt

das Versuchsergebnis vom Einfluß einer Erhöhung des Hormonzusatzes bei isoliert

rezyklierend perfundierter Lebern weiblicher, kohlenhydratreich ernährter Ratten dar. Aus der

Darstellung des ∆ O2-Verbrauchs wird ersichtlich, daß praktisch im gesamten Verlauf der

Perfusion keine weitere Steigerung des Sauerstoffverbrauchs möglich war. Erst nach 80- bis

90-minütigem nahezu identischem Anstieg, als bei dem geringeren Hormonzusatz die

Verlaufskurve in ein Plateau zu münden scheint, ist dies bei Einsatz von 10-10 M 3,5-L-T2 noch

nicht zu registrieren. Bei Auftragung der absoluten Werte des Sauerstoffverbrauchs ( siehe

Abb. 17, kl. Graphik ) wird es noch deutlicher, daß zu diesem Zeitpunkt noch kein Plateau

erreicht zu sein scheint. Im Vergleich zu dem vorherigen Experiment betrug der Ausgangs-

Sauerstoffverbrauch zum Zeitpunkt t = 0 min 1,58 ± 0,03 µmol/min/g und wurde binnen 90

Minuten Perfusion um 1,15 ± 0,13 und damit um 81,0 % signifikant auf 2,86 ± 0,09

µmol/min/g O2 gesteigert, p<0,01.

Der abschließende Vergleich männlicher und weiblicher hypothyreoter Ratten nach kohlen-

hydratreicher Diät ist in den Abb. 18 a und b zusammengefaßt. Hier ist der basale Sauer-

stoffverbrauch, wie auch die Stimulation des Sauerstoffverbrauchs durch 10-12 M 3,5-L-T2

nebeneinander dargestellt. Wie schon im Kapitel III.1.4 beschrieben und in den Abb. 10 a und

b dargestellt, liegt der basale Sauerstoffverbrauch bei weiblichen, gehungerten, hypo-thyreoten

Ratten höher als bei männlichen. Genauso fällt diese Differenz zugunsten eines höheren

Atmungsniveaus bei weiblichen, kohlenhydratreich ernährten Versuchstieren im Vergleich zu

den männlichen aus.

Ergebnisse51

t in min0 20 40 60 80 100


0,0

0,5

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t in min0 20 40 60 80 100

O2-V

er

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µm

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min

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1,5

2,0

2,5

Abb. 18 a Abb. 18 b


Stimulation des Sauerstoffverbrauchs isoliert rezyklierend perfundierter Lebern kohlenhydratreich ernährter

Ratten

² Kontrollen, männlich ( MW ± SEM, n = 4 )u 10-12 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt t = 0 min, männlich ( MW ± SEM, n = 6 )↵ Kontrollen, weiblich ( MW ± SEM, n = 3 )¬ 10-12 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt t = 0 min, weiblich ( MW ± SEM, n = 3 )

Bei den weiblichen Tieren liegt der Sauerstoffverbrauch mit 1,52 ± 0,12 µmol/min/g auch in

dieser Versuchsanordnung wiederum höher als bei den männlichen Ratten mit 1,31 ± 0,07

µmol/min/g; vergleiche dazu die Abb. 18 a und b. Durch die Darstellung des ∆ O2-Verbrauchs

wird anschaulich gemacht, daß sich sowohl männliche als auch weibliche Kon-trollen im

Verlauf gleichen. Auch die Steigerung des Sauerstoffverbrauchs während 90 mi-nütiger

Perfusion auf 0,55 ± 0,06 µmol/min/g ohne Zusatz von 3,5-L-T2 bei den weiblich-en, sowie auf

0,47 ± 0,03 µmol/min/g bei den männlichen Versuchstieren unterscheidet sich kaum

voneinander.

Nach Einsatz von 10-12 M 3,5-L-T2 ist der Sauerstoffverbrauch männlicher Lebern nach 25-30

Minuten etwas früher signifikant erhöht, als der der weiblichen Versuchstiere, die sich erst

nach 40 Minuten von ihrer Kontrollgruppe unterscheiden. Im weiteren Verlauf der 90

minütigen Perfusion sind die Unterschiede der verglichenen Versuchsgruppen gering.

Ergebnisse52

_______________

Zusammenfassung der Ergebnisse III.1

3,5-L-T2 stimuliert signifikant den Sauerstoffverbrauch isoliert rezyklierend perfundierter

Lebern hypothyreoter männlicher Ratten. Korrespondierend zu diesem Befund ist die

Gluconeogeneserate, wie auch die Harnstoffproduktion der Lebern im Vergleich zu den

Kontrollperfusionen gesteigert.

Im Vergleich zu weiblichen Versuchstieren fällt die Stimulation des Sauerstoffverbrauchs der

männlichen Tiere höher aus, wobei jedoch das Ausgangsniveau des O2-Verbrauchs der

männlichen Tiere bei Perfusionsbeginn niedriger liegt als bei den weiblichen. So ist der Betrag

der Atmungsstimulation ∆ O2 nach Zusatz von 3,5-L-T2 bei männlichen gehungerten Ratten

höher als bei weiblichen.

Der gefütterte Status der männlichen und weiblichen Tiere hat keinen Einfluß auf die Höhe des

Sauerstoffverbrauchs im Ausgangsniveau, wie auch nicht nach Stimulation der Atmung durch

3,5-L-T2, wenn die Werte auf das hepatische Protein bezogen werden, daß bei Le-bern nach

kohlenhydratreicher Diät geringer ausfällt. Die Steigerung des Sauerstoffver-brauchs ist aber

früher signifikant erhöht, als das bei den gehungerten Tieren zu verzeich-nen war.

Eine Steigerung der zugesetzten Hormonkonzentration hat, unabhängig von den sonstigen

Versuchsbedingungen, nie eine weitere Steigerung oder einen wesentlich früheren Anstieg des

Sauerstoffverbrauchs der perfundierten Lebern zur Folge gehabt.

Ergebnisse53

2. Kombiniert offene und rezyklierende Leberperfusion

Für ausgewählte Experimente wurde der apparative Perfusionsaufbau verändert, um den

Mechanismus des Effektes von 3,5-L-T2 näher zu untersuchen. Im Gegensatz zur geschlos-sen

rezyklierenden Perfusion, die in einem Kreissystem den Perfusionspuffer immer wieder zur

Leber geleitet, wird er bei der offenen Perfusion lediglich einmal zur Leber geleitet und direkt

dahinter an verschiedenen Elektroden vorbeigeführt, mittels derer der Sauerstoffver-brauch,

wie auch die Ionenströme gemessen werden können. Anschließend wird der Perfu-sionspuffer

Ergebnisse54

abgeleitet, sodaß Perfusatproben entnommen werden können, und der Über-schuß in einem

Sammelbehälter aufgefangen.

Diese Perfusionsapparatur eignet sich besonders zur Untersuchung des Stoffwechsels der

perfundierten Organe, da die Stoffwechselprodukte zu jedem Zeitpunkt bestimmt werden

können, ohne daß sie in einem rezyklierenden System akkumulieren. Eine weitere Beson-

derheit dieses Systems liegt in der Möglichkeit, nach entsprechender Vorperfusion zur

Äquilibrierung zunächst, wie oben beschrieben, eine Zeit offen zu perfundieren und dann das

System umzustellen, um anschließend für den gleichen Zeitraum geschlossen rezyklie-rend

weiterperfundieren zu können. Technisch bedarf es hierzu lediglich eines Kurzschlie-ßens des

Systems, indem der Puffer nach Oxygenierung wieder dem Perfusionsorgan zuge-führt wird;

siehe dazu die schematische Darstellung der Abb. 4 in Kapitel II. 3. Freigesetz-te Mediatoren,

die den Stoffwechsel beeinflussen gelangen bei offener Perfusion nach Durchströmen des

Perfusionsorganes nicht wieder zu diesem zurück, sodaß bei einem nach-zuweisenden Einfluß,

dieser durch das Umschalten auf rezyklierende Perfusion aufgedeckt werden kann.

Die Vorperfusionszeit betrug 20 Minuten und analog zur vorher beschriebenen rezyklieren-den

Perfusion wurde nach deren Ablauf dieser Zeitpunkt t = 0 min gesetzt und bei Kon-

trollperfusionen kein Zusatz, bzw. bei den Versuchen mit Hormoneinsatz zu diesem Zeit-punkt

3,5-L-T2 zum Perfusionspuffer zugegeben wurde. Aus den Daten der vorangegan-genen

Experimente geht hervor, daß eine Konzentration von 10-9 M 3,5-L-T2 sicher im maximal

stimulierenden Bereich liegt, sodaß sie hier für diese ausgewählten Experimente eingesetzt

wurde.

Das Versuchsprotokoll sah die ersten 60 Minuten offene Perfusion vor und im direkten

Anschluß mit der selben Leber, durch Umschalten des Systems für weitere 60 Minuten

geschlossen rezyklierende Perfusion. Während der gesamten Perfusionszeit wurde der

Sauerstoffverbrauch kontinuierlich durch eine Clark-Elektrode aufgezeichnet. Durch eine

Kalium-Elektrode wurde der Kaliumausstrom der Leberzellen gemessen und durch einen

Druckaufnehmer der Perfusionsdruck ∆p kontrolliert. In 10 minütigem Abstand gewonnene

Perfusatproben dienten zur Bestimmung von Glucose, Harnstoff und der LDH, als Parame-ter

des Zellschadens des perfundierten Organs. Das Umschalten der Perfusionapparatur ge-

Ergebnisse55

währleistete, daß weder Sauerstoffmessung, noch die Bestimmung der Substrate bzw. der

LDH unterbrochen werden mußten.

Um die Intaktheit der perfundierten Lebern zu kontrollieren, wurde abschließend nach 140

Minuten Perfusion Adrenalin in einer Konzentration von 10-6 M dem Perfusionmedium zu-

gesetzt. In allen Versuchen fiel binnen Sekunden der Sauerstoffverbrauch der perfundierten

Lebern dramatisch ab, um anschließend ebenso schnell und steil deutlich über das vorherbe-

stehende Atmungsniveau hinaus wieder anzusteigen. Der initiale Abfall erklärt sich durch die

α1-Rezeptor vermittelte Vasokonstriktion, während nach erneuter Öffnung der Gefäße der

rapide Anstieg des Sauerstoffverbrauchs die Intaktheit der perfundierten Organe, auch nach

140 minütiger Perfusion bewies.

2.1 Stimulation des Sauerstoffverbrauchs durch 3,5-L-T2 bei offen und rezyklierend

perfundierten Lebern männlicher, hypothyreoter und gehungerter Ratten

Der Sauerstoffverbrauch der Kontrollperfusionen betrug zum Zeitpunkt t = 0 min 2,69 ± 0,14

µmol/min/g und war damit fast identisch mit dem Ausgangswert der Versuchsgruppe zum

selben Zeitpunkt, der 2,72 ± 0,12 µmol/min/g betrug als 3,5-L-T2 dem Perfusions-puffer

zugesetzt wurde.

Bei offener Perfusion verliefen die Kontrollen fast linear auf dem Ausgangsniveau und be-

trugen am Ende der 60 minütigen Perfusion 2,71 ± 0,20 µmol/min/g ( Abb. 19 ). Zu die-sem

Zeitpunkt begann die rezyklierende Perfusion und der Sauerstoffverbrauch stieg bei

den Kontrollen, identisch zu den vorherigen Versuchen zur rezyklierenden Perfusion, auch hier

um 0,55 µmol/min/g nach dann insgesamt 120 Min Perfusion auf 3,26 ± 0,22 µmol/ min/g an,

entsprechend 20,3 % ( vergleiche dazu die Befunde aus III.1.1 ).

Ergebnisse56

t in min0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

O2-Verbrauch in µmol/min/g

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

*

** *

of fen of fenrezykl ierend

Abb. 19 Sauerstoffverbrauch isoliert offen perfundierter ( t = 0 bis 60 min ) und isoliert rezyklierend

perfundierter ( t = 60 bis 120 min ) Lebern männlicher, hypothyreoter, gehungerter Ratten.


n 10-9 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt t = 0 min ( MW ± SEM, n = 4 )

Zur Kontrolle nach 15 min offener Perfusion zum Zeitpunkt t = 135 min Zusatz von Adrenalin

in einer Konzentration von 10-6 M; ∗ p < 0,01 ∗∗ p < 0,05.

Die weitere offene Perfusion ließ den Sauerstoffverbrauch auf 2,79 ± 0,14 µmol/min/g im

Verlauf von weiteren 15 min abfallen. Damit pendelte sich der Sauerstoffverbrauch nach

60 Minuten rezyklierender Perfusion und daran anschließender offener Perfusion nach kur-zer

Zeit wieder auf dem Niveau der offenen Perfusionsperiode ein.

Abschließend wurde die Kontrolle der Intaktheit der perfundierten Lebern, wie oben be-

schrieben durch den Zusatz von 10-6 M Adrenalin überprüft. Der Sauerstoffverbrauch fiel bei

den Kontrollen binnen Sekunden um 0,69 µmol/min/g auf 2,10 ± 0,19 µmol/min/g ab, um im

weiteren Verlauf genauso schnell wieder anzusteigen. Nach 10 Minuten, zum Zeit-punkt t =

Ergebnisse57

145 min, betrug der O2-Verbrauch dann 3,11 ± 0,31 µmol/min/g und fiel in der

darauffolgenden Zeit allmählich auf das Niveau bei offener Perfusion zurück.

Während der 60 minütigen offenen Perfusion bewirkte 3,5-L-T2 einen langsameren allmäh-

lichen Anstieg des Sauerstoffverbrauchs von 2,72 ± 0,12 µmol/min/g um 0,22 µmol/min/g auf

2,94 ± 0,02 µmol/min/g, entsprechend 8,1 % nach 60 min; p<0,05.

Anschließend folgte die rezyklierende Perfusion, die im Unterschied zu den vorherigen

Versuchen, dargestellt in III.1.2, einen sofortigen Anstieg des Sauerstoffverbrauchs zeigte.

Dieser war bereits nach 10 Minuten signifikant erhöht mit 3,34 ± 0,06 µmol/min/g, gegen-über

2,89 ± 0,24 µmol/ min/g O2-Verbrauch der Kontrollen; p<0,01; vergleiche dazu Abb. 19.

Im weiteren Verlauf der 60 min geschlossen rezyklierender Perfusion ist der Sauerstoffver-

brauch nach Stimulation durch das Schilddrüsenhormon 3,5-L-T2 stets signifikant höher als

derjenige des Kontrollkollektivs mit p<0,01 und scheint, ab der 40. Minute ( entspricht der

100. Minute im Versuchsprotokoll ) ein Plateau zu erreichen. Nach 120 min Perfusion ( 60 min

offen und 60 min rezyklierend ) beträgt der Sauerstoffverbrauch der 3,5-L-T2-stimu-lierten

Versuchsgruppe 3,86 ± 0,02 µmol/min/g, gegenüber einem Sauerstoffverbrauch von 3,26 ±

0,22 µmol/min/g der Kontrollen. Die Stimulation durch 3,5-L-T2 bewirkte damit nach weiteren

60 Minuten Perfusion einen um 18,4 % höheren O2-Verbrauch. Vergleiche hierzu auch die

vorherigen Befunde in III.1.2 und Abb. 8, bei denen die Steigerung des O2-Verbrauchs erst

nach 45 Minuten statistisch signifikant war, die Zunahme des Sauerstoff-verbrauchs jedoch

29,5 % über den Kontollen lag.

Nach Ablauf von 120 min Perfusion folgten erneut 15 min offene Perfusion, in der der Sau-

erstoffverbrauch nach dann 135 min Gesamtperfusionszeit um 0,64 µmol/min/g auf 3,22 ± 0,09

µmol/min/g abfiel. Im Gegensatz zu den Kontrollen, die fast auf das Ausgangsniveau abfielen,

lag er damit immer noch 15,4 % höher als der Endwert der offenen Perfusions-periode.

Der Zusatz von 10-6 M Adrenalin, wie bei den Kontrollen hatte wiederum einen sofortigen

Abfall des Sauerstoffverbrauchs zur Folge. Nach bereits 2 Minuten sank der O2-Verbrauch auf

2,31 ± 0,04 µmol/min/g, um daran anschließend ebenso schnell wieder anzusteigen und mit

dem Kontrollkollektiv verglichen, zum Zeitpunkt t = 145 min ein wesentlich höheres Niveau

von 3,42 ± 0,19 µmol/min/g O2 zu erreichen. Zum Zeitpunkt des Abfalls des Sauer-

Ergebnisse58

stoffverbrauchs war auch der durch den Druckaufnehmer gemessene Perfusionsdruck er-höht,

was auf den durch α1-Rezeptoren vermittelten vasokonstringierenden Effekt des Adre-nalins

zurückzuführen ist; siehe auch hierzu Abb. 19.

2.2 Steigerung der Glucoseproduktion bei offener und rezyklierender Leberperfusion

durch 3,5-L-T2

Als weiteren Stoffwechselparameter der perfundierten Leber nach Stimulation durch das

Schilddrüsenhormon 3,5-L-T2 wurde aus beschriebenen Perfusatproben die Glucoseproduk-

t in min0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

0

5

10

15

20

Glucose-Produktion in µmol/g

* *

a b

Abb. 20 a offene Perfusion Abb. 20 b geschlossene Perfusion

o Kontrollen ( MW ± SEM, n = 4 )n 10-9 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt t = 0 min ( MW ± SEM, n = 4 )

Glucoseproduktion isoliert perfundierter Lebern männlicher, hypothyreoter und gehungerter Ratten. OffenePerfusion ( t = 0 bis 60 min ) und geschlossen rezyklierende Perfusion ( t = 60 bis 120 min ); ∗ p < 0,01tion bestimmt. Den Glucosespiegel des Perfusates nach Leberpassage während offener Per-

fusion stellt die Abb. 20 a dar. Wie hier zu sehen, war die Steigerung der Gluconeogenese in

den ersten 60 min offener Perfusion aus dem angebotenen Alanin durch 3,5-L-T2 nach 40 min

signifikant höher als der Glucosespiegel der Kontrollgruppe; p<0,01. In der graphi-schen

Darstellung lag die Glucoseproduktion zwar stets über derjenigen der Kontrollgruppe, der

Ergebnisse59

Befund ist aber weniger ausgeprägt, als in der anschließenden rezyklierenden Leberper-fusion

von der 60. bis zur 120. Minute; vergleiche dazu Abb. 20 b.

Nach Beginn der rezyklierenden Perfusion vom Zeitpunkt t = 60 min bis 120 min war die

Steigerung der Glucoseproduktion bereits nach 10 min ( in der 70. Minute im Versuchspro-

tokoll ) in der durch 3,5-L-T2 stimulierten Versuchsgruppe signifikant gegenüber den Kon-

trollen erhöht; p < 0,01. Die Glucoseproduktion stieg steil an, bis sie nach 40 Minuten ( in der

100. Minute im Versuchsprotokoll ) ein Plateau zu erreichen schien; vergleiche dazu Abb. 20

b. Dieser Befund korrespondierte genau mit der Kinetik des Sauerstoffverbrauchs, der sich

zum selben Zeitpunkt einem Plateau näherte. Der Vergleich der Glucoseproduktion bei

rezyklierender und offener Leberperfusion ist in Tab. 2 auf Seite 20 zusammengestellt. Für den

direkten Vergleich geht in die Berechnung bei rezyklierender Perfusion die Zeit mit ein, bei

offener Perfusion zusätzlich die Flußgeschwindigkeit.

Wie Abb. 20 a veranschaulicht, lag die 3,5-L-T2 stimulierte Glucoseproduktion stets über der

Kontrollgruppe, parallel zum Sauerstoffverbrauch. Wiederum wurde nach rezyklieren-der

Perfusion ab dem Zeitpunkt t = 120 min weiter offen perfundiert und nach 15 min zum

Zeitpunkt t = 135 min Adrenalin in einer Konzentration von 10-6 M zugesetzt, um die

Intaktheit der perfundierten Lebern zu kontrollieren ( siehe oben ).

2.3 Steigerung der Harnstoffproduktion bei offener und rezyklierender

Leberperfusion durch 3,5-L-T2

Die Harnstoffsynthese ist, genauso wie die Glucoseproduktion, ein wichtiger Stoffwechsel-

parameter für die perfundierte Leber. Wie oben beschrieben wurde aus den gewonnenen

Perfusatproben auch der Harnstoff bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Abb. 21 a für den

Zeitraum der offenen ( t = 0 bis 60 min ) und 21 b für den Zeitraum der rezyklierenden

( t = 60 bis 120 min ) Perfusion dargestellt. Wie hier zu sehen verlief die Harnstoffproduk-tion

der Kontrollen sowohl bei offener, wie auch bei rezyklierender Perfusion nahezu auf

Ergebnisse60

t in min

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Ha

rn

st

of

f-P

ro

du

kt

ion

in

µm

ol/

g

25

50

75

100

125

150 ba

*

*Abb. 21 a offene Perfusion Abb. 21 b geschlossene Perfusion

o Kontrollen ( MW ± SEM, n = 4 )n 10-9 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt t = 0 min ( MW ± SEM, n = 4 )

Harnstoffproduktion isoliert perfundierter Lebern männlicher, hypothyreoter und gehungerter Ratten. Offene

Perfusion ( t = 0 bis 60 min ) und geschlossen rezyklierende Perfusion ( t = 60 bis 120 min ); ∗ p < 0,01

einem gleichbleibenden Niveau. Nach Zugabe des Schilddrüsenhormones 3,5-L-T2 stieg die

Harnstoffsynthese schon bei offener Leberperfusion an und unterschied sich signifikant nach 40

Minuten von den Kontrollen; p < 0,01. Auch im weiteren Verlauf lag sie zu je-dem Zeitpunkt

über dem Niveau der Kontrollen.

Nach Beginn der rezyklierenden Perfusion vom Zeitpunkt t = 60 bis 120 min war die Stei-

gerung der Harnstoffproduktion bereits nach 20 Minuten ( in der 80. Minute im Versuchs-

protokoll ), in der durch 3,5-L-T2 stimulierten Versuchsgruppe signifikant gegenüber den

Kontrollen erhöht; p < 0,01. Wie bei der Glucoseproduktion und dem Sauerstoffverbrauch

stieg auch die Harnstoffproduktion steil an und schien nach 30 Minuten ( 90. Minute im

Versuchsprotokoll ) ein Plateau zu erreichen; vergleiche dazu Abb. 19 und 20 b, sowie

Ergebnisse61

21 b. Der Vergleich der Harnstoffproduktion bei rezyklierender und offener Leberperfusion ist

in Tab. 2 auf Seite 20 zusammengestellt. Für den direkten Vergleich geht in die Berech-nung

bei rezyklierender Perfusion die Zeit mit ein, bei offener Perfusion zusätzlich die

Flußgeschwindigkeit.

Wiederum wurde nach rezyklierender Perfusion ab dem Zeitpunkt t = 120 min weiter offen

perfundiert und nach 15 min zum Zeitpunkt t = 135 min Adrenalin in einer Konzentration von

10-6 M zugesetzt, um die Intaktheit der perfundierten Lebern zu kontrollieren ( siehe oben ).

2.4 Perfusionsdruck und Kaliumausstrom in das Perfusat

Die kontinuierliche Registrierung des Perfusionsdruckes ∆p wies zu keinem Zeitpunkt der

Perfusionen weder des Kontrollkollektivs, noch der durch 3,5-L-T2 stimulierten Versuchs-

gruppe je einen Unterschied auf. Lediglich nach beschriebenem Zusatz von 10-6 M Adre-nalin

stieg der Perfusionsdruck kurzfristig an, aufgrund der durch α1-Rezeptoren vermittel-ten

Vasokonstriktion ( Werte nicht dargestelt ).

Auch bei der Messung des Kalium-Ausstromes der Leberzellen in das Perfusionsmedium war

keine Änderung festzustellen. Zu diesem Parameter ergab sich bei den Kontrollen, wie auch bei

der Versuchsgruppe nach Zusatz von 10-9 M 3,5-L-T2 kein Hinweis auf einen Ef-fekt ( Werte

nicht dargestellt ).

_______________


Bei der offenen Leberperfusion stieg der Sauerstoffverbrauch nach Stimulation durch 3,5-L-T2

langsamer an, als dies bei von Beginn an rezyklierender Perfusion der Fall war. Korres-

Ergebnisse62

pondierend zu diesem Befund verhielt es sich mit der Glucose- und Harnstoffproduktion, die

beide erst nach 40 minütiger Perfusion signifikant über den Kontrollen lagen.

Als jedoch nach 60 minütiger offener Perfusion das System umgestellt wurde auf rezyklie-

rende Perfusion, stieg der Sauerstoffverbrauch ohne erneute Hormonzugabe im Vergleich zu

den Kontrollen sofort steil an. Nach weiterer Perfusion unterschieden sich die hormon-

stimulierten Lebern bereits nach 10 min signifikant von den Kontrollen und erreichten nach 40

bis 60 minütiger rezyklierender Leberperfusion ein Plateau, welches sofort nach Rück-stellung

auf offene Perfusion wieder abfiel.

Auch Glucose- und Harnstoffproduktion beschrieben den selben Verlauf. Sie stiegen signi-

fikant bereits nach 10 bzw. 20-minütiger rezyklierender Perfusion an und erreichten, wie der

Sauerstoffverbrauch nach 40 bzw. 30 Minuten ein Plateau.

Bei den anderen gemessenen Parameter, wie dem Perfusionsdruck und insbesondere dem

Kaliumausstrom lies sich ein Einfluß von 3,5-L-T2 nicht nachweisen.

3. Einfluß von Ionenkanalblockern auf die Stimulation des Sauerstoffverbrauchs

isoliert rezyklierend perfundierter Lebern hypothyreoter, gehungerter,

männlicher Ratten durch 10-10 M 3,5-L-T2

Ergebnisse63

Die vorangegangenen Experimente zeigten einen deutlichen stimulierenden Effekt von 3,5-L-

T2 auf den Sauerstoffverbrauch, Glucose- und Harnstoffproduktion. Über den Mechanis-mus

dieser Wirkung ist noch wenig bekannt. Um zu prüfen, ob der Effekt durch Elektrolyt-ströme (

z.B. Kalium- oder Calciumeinstrom, Natriumausstrom ) zu erklären ist, wurden in den

folgenden Experimenten spezifische Hemmer der Ionenkanäle in das Perfusat gegeben und der

T2-Effekt auf den Sauerstoffverbrauch gemessen.

Die folgenden Versuche beschreiben den Einfluß unterschiedlicher Ionenkanäle auf die Sti-

mulation des Sauerstoffverbrauchs der isoliert rezyklierend perfundierten Lebern hypothy-

reoter, gehungerter, männlicher Ratten durch 3,5-L-T2 . Die eingesetzte Konzentration des

Hormons wurde im Vergleich zu den vorher beschriebenen Experimenten im Kapitel III.1 auf

10-10 M erhöht und liegt im sicher maximal stimulierenden Bereich. Die Versuchsanord-nungen

sind die selben, wie in den vorbeschriebenen Experimenten des Kapitels III.1 zur

rezyklierenden Leberperfusion.

3.1 Einfluß von Ouabain auf die Stimulation des Sauerstoffverbrauchs durch

3,5-L-T2

Die Na+-K+-Pumpe reguliert die Konzentration der Na+- und K+-Ionen in der Zelle. Das

Transportsystem ist in der Plasmamembran so ausgerichtet, daß sie Na+ aus der Zelle hin-aus-

und K+ in die Zelle hineinpumpt. Um die Pumpe zu betreiben muß im Inneren der Zelle ATP

vorhanden sein. Ouabain ist ein spezifischer Inhibitor der Pumpe, der nur dann wirksam ist,

wenn es sich außerhalb der Zelle befindet.

Vor Installation der freipräparierten Lebern in die Perfusionsapparatur wurde dem Perfu-

sionspuffer Ouabain in einer Konzentration von 10-6 M zugesetzt. Nach anschließender

Äquilibrierungszeit von 30 min wurde den Kontrollen kein weiteres Agenz zugesetzt; der

Versuchsgruppe wurde 3,5-L-T2 in der Konzentration von 10-10 M zugesetzt.

Die Abb. 22 b faßt die Ergebnisse des Versuches unter Blockade des Na+/K+-Kanals durch

Ouabain ohne und mit Stimulation durch 3,5-L-T2 zusammen und im Vergleich dazu ist in

Ergebnisse64

Abb. 22 a dieselbe Versuchsanordnung ohne Ionenkanalblockade aus III.1.2 noch einmal

dargestellt.

Der basale Sauerstoffverbrauch der perfundierten Lebern zum Zeitpunkt t = 0 min wurde durch

den Zusatz von 10-6 M Ouabain zum Perfusat geringfügig gesenkt. Dies traf auf die Kontroll-,

wie auch auf die Versuchsgruppe zu. Im Verlauf der Perfusion stieg dann weder,

t in min0 20 40 60 80 100


0,0

0,5

1,0

1,5

t in min0 30 60 90

O2 µ

mo

l/m

in/

g

1,5

2,0

2,5

3,0

t in min0 20 40 60 80 100


0,0

0,5

1,0

1,5

t in min0 30 60 90

O2 µ

mo

l/m

in/

g

1,5

2,0

2,5

3,0*

Abb. 22 a, ohne Zusatz zum Perfusat Abb. 22 b, Zusatz von 10-6 M Ouabain

o Kontrollen ( MW ± SEM, n = 11 ) o Kontrollen ( MW ± SEM, n = 2 )n 10-12 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt t = 0 min n 10-10 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt t = 0 min ( MW ± SEM, n = 9 ), ∗ p < 0,01 ( MW ± SEM, n = 5 )

Wirkung von Ouabain auf die Stimulation des Sauerstoffverbrauchs durch 3,5-L-T2 bei isoliert perfundierten

Lebern männlicher, hypothyreoter, gehungerter Ratten.

Dargestellt sind der relative Sauerstoffverbrauch ( gr. Graphik ), sowie der absolute Sauerstoffverbrauch

( kl. Graphik ) in µmol/min/g.

wie in den Vorexperimenten, der Sauerstoffverbrauch der Kontrollen, noch derjenige der durch

3,5-L-T2 stimulierten Versuchsgruppe an. Sowohl bei der Darstellung des absoluten

( kl. Graphik ), wie auch des relativen Sauerstoffverbrauchs ( gr. Graphik ) in der Abb.

22 b wurde die inhibierende Wirkung auf eine Steigerung des Sauerstoffverbrauchs durch 3,5-

L-T2 deutlich. Die Kontrollen zum Zeitpunkt t = 0 min verbrauchten 1,59 ± 0,16 µmol/min/g

und nach 90 Minuten Perfusion dann 1,75 ± 0,09 µmol/ min/g O2, und damit lediglich 0,16

µmol/min/g mehr; vergleiche dazu auch Abb. 22 a ohne Ouabain. Nach Zu-

Ergebnisse65

satz von 3,5-L-T2 zum Ouabain-haltigen Perfusionspuffer unterschied sich die Steigerung des

Sauerstoffverbrauchs von 1,37 ± 0,09 µmol/min/g um 0,21 µmol/min/g auf 1,57 ± 0,11

µmol/min/g nicht von den Kontrollen.

Nach Blockade der Na+/K+-Pumpe durch Ouabain in einer Konzentration von 10-6 M war also

durch 3,5-L-T2 bei isoliert rezyklierender Leberperfusion der Sauerstoffverbrauch hy-

pothyreoter, gehungerter, männlicher Ratten nicht zu steigern.

Um zu prüfen, ob die Lebern bezüglich des Sauerstoffverbrauchs überhaupt noch stimulier-bar

waren, wurde am Ende der Perfusionen jeweils Adrenalin in einer Konzentration von 10-6 M

dem Perfusat zugesetzt, was stets den vorbeschriebenen rapiden Anstieg des Sauer-

stoffverbrauchs zur Folge hatte und die Intaktheit der perfundierten Lebern auch zum Ver-

suchsende bewies; siehe dazu auch Abb. 19 im Kapitel III.2.1.

3.2 Einfluß von Nifedipin auf die Stimulation des Sauerstoffverbrauchs durch

3,5-L-T2

Bei Nifedipin handelt es sich um einen selektiven Blocker des Calciumkanals, der dem Per-

fusionsmedium, analog dem oben beschriebenen Versuch aus III.3.1, vor Installation der

Lebern zugegeben wurde. Nifedipin, in der Konzentration von 10-6 M, blockiert den Calci-

umeinstrom in die Zelle.

Nach der Äquilibrierungszeit verbrauchten die Kontrollen zum Zeitpunkt t = 0 min 2,17

± 0,08 µmol/min/g O2, dargestellt in Abb. 23 b. Der Ausgangs-Sauerstoffverbrauch lag mit

Nifedipin-Zusatz im Medium signifikant höher als bei den Kontrollen ohne Nifedipin-Zu-satz;

vergleiche dazu die Kontrollgruppe in Abb. 23 a. Die Zunahme des O2-Verbrauchs war mit

0,65 µmol/min/g den Kontrollen ohne Calciumkanalblocker vergleichbar und stieg nach 90 min

Perfusion auf 2,82 ± 0,04 µmol/min/g an.

Ergebnisse66

t in min0 20 40 60 80 100


0,0

0,5

1,0

1,5

t in min0 20 40 60 80 100


0,0

0,5

1,0

1,5

t in min0 30 60 90

O2 µ

mo

l/m

in/

g

1,52,02,53,03,5

t in min0 30 60 90

O2

µmo

l/m

in/

g

1,52,02,53,03,5

* *

Abb. 23 a, ohne Zusatz zum Perfusat Abb. 23 b, Zusatz von 10-6 M Nifedipin

o Kontrollen ( MW ± SEM, n = 11 ) o Kontrollen ( MW ± SEM, n = 3 )n 10-12 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt t = 0 min n 10-10 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt t = 0 min ( MW ± SEM, n = 9 ) ( MW ± SEM, n = 2 )

Wirkung von Nifedipin auf die Stimulation des Sauerstoffverbrauchs durch 3,5-L-T2 bei isoliert perfundierten



( kl. Graphik ) in µmol/min/g; ∗ p < 0,01.

Die Versuchsgruppe mit 3,5-L-T2-Zusatz zum Zeitpunkt t = 0 min wies unter Einfluß von

Nifedipin einen niedrigeren Ausgangs-Sauerstoffverbrauch auf, stieg aber in noch größerem

Ausmaß um 1,62 ± 0,17 µmol/min/g von 1,92 ± 0,04 µmol/min/g auf 3,54 ± 0,13 µmol/ min/g

an. Die Steigerung des Sauerstoffverbrauchs lag somit noch über der vergleichbaren durch 3,5-

L-T2 stimulierten Gruppe ohne Nifedipin-Zusatz; vergleiche dazu die Abb. 23 a und b.

Der Zusatz des Calciumkanalblockers Nifedipin zum Perfusionsmedium konnte die Stimula-

tion des Sauerstoffverbrauchs durch 3,5-L-T2 nicht inhibieren. Eher schien ein zusätzlich

potenzierender Effekt vorzuliegen, da bereits nach 40 min Perfusion, verglichen mit den

Kontrollen, ein signifikant höherer O2-Verbrauch vorlag. Die Steigerung des Sauerstoffver-

brauchs gegenüber den Kontrollen betrug am Perfusionsende 25,5 %.



Ergebnisse67

zum Perfusat gegeben, was stets den vorbeschriebenen rapiden Anstieg des Sauer-


suchsende bewies; siehe dazu auch Kapitel III.2.1.

3.3 Einfluß von SITS auf die Stimulation des Sauerstoffverbrauchs durch 3,5-L-T2

Bei SITS handelt es sich um einen selektiven K+/H+-Kanalblocker, der dem Perfusions-

medium in einer Konzentration von 10-6 M zugesetzt wurde. Die Versuchsergebnisse sind

in Abb. 24 b zusammengefaßt.

Nach Zusatz von SITS zum Perfusionspuffer betrug der Ausgangs-Sauerstoffverbrauch 1,93 ±

0,03 µmol/min/g in der Kontrollgruppe und liegt damit nur geringfügig oberhalb der

Kontrollgruppe ohne diesen K+/H+-Blocker; vergleiche dazu Abb. 24 a und b. Und auch im

weiteren Verlauf der 90 minütigen Perfusion wiesen die Kontrollen einen nahezu iden-

tischen Verlauf auf. Die Zunahme des Sauerstoffverbrauchs betrug 0,56 µmol/min/g und

erreichte 2,48 ± 0,03 µmol/min/g.

Nach Zusatz von 10-10 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt t = 0 min stieg der Sauerstoffverbrauch erst

spät an und unterschied sich erst in der 60. Minute signifikant von den Kontrollen. Der

Ausgangs-Sauerstoffverbrauch lag mit 1,79 ± 0,05 µmol /min/g zwar unterhalb dem der

Kontrollgruppe, wie aber die Darstellung des relativen Sauerstoffverbrauchs in Abb. 24 b

verdeutlicht unterschieden sich Versuchs- und Kontrollgruppe bezogen auf den Ausgangs-

verbrauch zum Zeitpunkt t = 0 min innerhalb der ersten 60 min jedoch kaum voneinander.

Dennoch erreichte der stimulierte O2-Verbrauch 2,82 ± 0,07 µmol/min/g und und lag damit

1,03 ± 0,11 µmol/min/g, bzw. 13,7 %, signifikant über den Kontrollen; p<0,01. Im Ver-

gleich zur Perfusion ohne Ionenkanalblocker fiel die Stimulation des Sauerstoffverbrauchs

durch 3,5-L-T2 jedoch geringer aus; vergleiche dazu die Abb. 24 a und b.

Ergebnisse68

t in min0 20 40 60 80 100


0,0

0,5

1,0

1,5

t in min0 30 60 90

O2

µmo

l/m

in/

g

1,5

2,0

2,5

3,0

t in min0 20 40 60 80 100


0,0

0,5

1,0

1,5

t in min0 30 60 90

O2 µ

mo

l/m

in/

g

1,5

2,0

2,5

3,0

*

*

Abb. 24 a, ohne Zusatz zum Perfusat Abb. 24 b, Zusatz von 10-6 M SITS


Wirkung von SITS auf die Stimulation des Sauerstoffverbrauchs durch 3,5-L-T2 bei isoliert perfundierten



( kl. Graphik ) in µmol/min/g; ∗ = p < 0,01.



zum Perfusat gegeben, was stets den vorbeschriebenen rapiden Anstieg des Sauer-


suchsende bewies; siehe dazu auch III.2.1.

3.4 Einfluß von Amilorid auf die Stimulation des Sauerstoffverbrauchs durch

3,5-L-T2

Amilorid blockiert selektiv den Kanal, über den Na+- und H+-Ionen ausgetauscht werden.

Ergebnisse69

Es wurde dem Perfusionsmedium in einer Konzentration von 10-3 M zugesetzt. Hiernach

betrug bei der Kontrollgruppe ohne Zugabe von 3,5-L-T2 der Sauerstoffverbrauch zum

Zeitpunkt t = 0 min 1,48 ± 0,03 µmol/min/g. Er fiel damit niedriger aus als bei der Kon-

trollgruppe ohne Amiloridzusatz, wie auch schon im Ouabain-Experiment beschrieben. Im

weiteren Verlauf unterschied sich die Amilorid-Gruppe von allen anderen bisherigen Versu-

chen durch einen allmählichen Abfall des Sauerstoffverbrauchs auf 1,28 ± 0,04 µmol/min/g

t in min0 20 40 60 80 100


0,0

0,5

1,0

1,5

t in min0 30 60 90

O2

µmo

l/m

in/

g

1,5

2,0

2,5

3,0

t in min0 20 40 60 80 100


0,0

0,5

1,0

1,5

t in min0 30 60 90

O2 µ

mo

l/m

in/

g

1,5

2,0

2,5

3,0

*

*

Abb. 25 a, ohne Zusatz zum Perfusat Abb. 25 b, Zusatz von 10-3 M Amilorid


Wirkung von Amilorid auf die Stimulation des Sauerstoffverbrauchs durch 3,5-L-T2 bei isoliert perfundierten



( kl. Graphik ) in µmol/min/g, ∗ = p < 0,01.

nach 90 Minuten Perfusion, p<0,01; vergleiche dazu Abb. 25 a und b.

Nach Zusatz von 10-10 M 3,5-L-T2 zum Zeitpunkt t = 0 min, bei einem O2-Verbrauch von 1,38

± 0,07 µmol/min/g war dieser nach 10 min sehr schnell signifikant erhöht, p<0,01; siehe Abb.

25 b. Die Steigerung des Sauerstoffverbrauchs in der Versuchsgruppe erreichte schon nach 20

min ihr Maximum mit 1,85 ± 0,10 µmol/min/g, und fiel anschließend nach der 20. Minute

langsam bis zum Perfusionsende, parallel zum Verlauf der Kontrollen, kon-

Ergebnisse70

tinuierlich ab.

Der O2-Verbrauch nach 90 Minuten rezyklierender Perfusion betrug noch 1,53 ± 0,14 µmol

/min/g und war bei Auftragung der absoluten Werte, verglichen mit dem Ausgangswert nicht

mehr signifikant erhöht. Wie bei den Leberperfusionen mit Zusatz von Ouabain ( sie-he III. 3.1

und Abb. 22 a und b ), wurde auch hier durch Blockade eines Ionenkanals der am Na+-

Transport beteiligt ist, nicht nur der basale Sauerstoffverbrauch gesenkt, sondern auch seine

Steigerung durch 3,5-L-T2 verhindert.

_______________


Um zu prüfen, ob der Wirkungsmechanismus der Sauerstoffstimulation durch 3,5-L-T2 von

Ionenströmen über die Zellmembran abhängig ist wurden dem Perfusionspuffer verschie-

dene selektive Blocker der Ionenkanäle zugesetzt.

Während die Zusätze von Nifedipin und SITS kaum einen Einfluß auf die Hormonwirkung

hatten, war eine Stimulation des Sauerstoffverbrauchs isoliert rezyklierend perfundierter

Lebern nach Ouabain-Zusatz zum Perfusat nicht mehr nachweisbar. Ouabain ist ein selek-tiver

Hemmer der Na+-K+-Pumpe, sodaß der stimulierende Effekt durch 3,5-L-T2 auf den O2-

Verbrauch von diesem Ionenkanal abhängig war.

Amilorid, als ein Hemmer des Na+/H+-Kanals, hat auch einen, im Vergleich zu Ouabain

geringeren, inhibierenden Einfluß auf die Stimulation des Sauerstoffverbrauchs durch 3,5-L-T2.

Da weder Nifedipin noch SITS einen Einfluß auf die Stimulation des O2-Verbrauchs hatten ist

ein Calcium- bzw. Kalium-vermittelter Effekt ausgeschlossen, wie das auch für das Ka-lium in

Ergebnisse71

den Experimenten der offenen Leberperfusion gezeigt werden konnte; vergleiche dazu Kapitel

III.2.

4. Einfluß von 3,5-L-T2 auf die oxidative Phosphorylierung bei isolierten

Mitochondrien der Rattenleber

Die vorangegangenen Experimente zeigten überzeugende Befunde zur schnellen Wirkung von

3,5-L-T2 an der isoliert perfundierten Rattenleber im Sinne einer Steigerung des Sauer-

stoffverbrauchs und damit korrespondierend einer Stimulation der Gluconeogenese aus dem

Ergebnisse72

angebotenen Alanin sowie der Harnstoffsynthese. Diese Effekte waren bei offener Leber-

perfusion weniger ausgeprägt, als nach der anschließenden rezyklierenden Perfusion, was

darauf hindeutete, daß die Wirkung von 3,5-L-T2 auf die Lebern keine direkte ist. Um auf-

zudecken, welche Mechanismen in diese Wirkung involviert sind wurden, unter der Vor-

stellung, daß Ionenströme über die Zellmembran den Effekt vermitteln könnten, die Expe-

rimente mit dem Einsatz selektiver Ionenkanalblocker durchgeführt. Die Untersuchungen

ergaben, daß die Wirkung von 3,5-L-T2 auf den Sauerstoffverbrauch mit dem transmembra-

nen Flux der Na+-Ionen und der Na+/K+-ATPase korrespondieren.

Zur weiteren Abklärung des Mechanismus einer stimulierenden Wirkung von 3,5-L-T2 auf die

Atmung der perfundierten Lebern wurden Experimente an isolierten Mitochondrien

durchgeführt. Vorversuche unserer Arbeitsgruppe zeigten nach direkter Zugabe von 3,5-L-T2

in vitro zu isolierten Mitochondrien aus Lebern männlicher, hypothyreoter, gehungerter Ratten

keinen Einfluß auf deren Atmungsaktivität ( Werte nicht dargestellt ). Deshalb wurde, unter

der Vorstellung, daß die Wirkung auf die Mitochondrien analog der oben beschriebenen

Befunde eine indirekte sein könnte, das Hormon intraperitoneal gespritzt,

in vivo, und die Mitochondrien anschließend isoliert, um ihre Atmungsaktivität zu messen.

Untersucht wurde hierzu der stimulierende Einfluß von 3,5-L-T2 auf die oxidative Phospho-

rylierung unter Einsatz der Substrate Succinat und Glutamat bei isolierten Mitochondrien aus

Rattenlebern. Männlichen, hypothyreoten, gehungerten Wistar-Ratten wurde intraperi-toneal

250 µg 3,5-L-T2/100 g KG und den Kontrollen NaCl 0,9% gleichen Volumens inji-ziert, um

nach 30, 60 und 90 Minuten die Mitochondrien zu isolieren und im Anschluß de-ren

Atmungsaktivität zu messen. Nach Inkubation der Mitochondrien bei 30° C in 110mM

Mannitol mit den Substraten Succinat ( 10 mM ) bzw. Glutamat ( 5 mM ) wurde nach Zu-satz

von 0,05 M ADP die mitochondriale Atmung gemessen. Das Ergebnis zeigen die Abb. 26 und

27.

Die Kontrollen, denen intraperitoneal NaCl 0,9% injiziert wurde wiesen nach Succinat-Zusatz

einen Sauerstoffverbrauch von 154 ± 8 nmol/min/mg Protein auf; vergleiche dazu Abb. 26,

zum Zeitpunkt t = 30 min. Nach Zusatz von Glutamat betrug der Sauerstoffver-brauch der

Kontrollen 104 ± 4 nmol/min/mg Protein; vergleiche dazu Abb. 27, zum Zeit-punkt t = 30 min.

Ergebnisse73

30 Minuten nach intraperitonealer Injektion von 250 µg 3,5-L-T2/100 g KG und Zusatz von

Succinat stieg der Sauerstoffverbrauch auf 173 ± 4 nmol/min/mg Protein signifikant an;

p<0,01, vergleiche hierzu Abb. 26.

nm

ol

O2/

min

/m

g P

ro

te

in

Kontrollen

nach 30 min

0

120

140

160

180Oxidative Phosphorylierung, Succinat

*

3,5-L-T2

nach 30 min

Abb. 26 Sauerstoffverbrauch isolierter Mitochondrien aus Lebern männlicher, hypothyreoter, gehun-

gerter Ratten. Den Kontrollen wurde 30 min vor der Mitochondrienpräparation NaCl 0,9%

und der Versuchsgruppe 250 µg 3,5-L-T2 / 100g KG in vivo i. p. injiziert.

Substrat zur oxidative Phosphorylierung war jeweils Succinat 10 mM.

Beide Versuchsgruppen n = 3; ∗ p<0,01

Ebenso stieg der Sauerstoffverbrauch 30 Minuten nach intraperitonealer Injektion von 250 µg

3,5-L-T2/100 g KG und Zusatz von Glutamat auf 118 ± 6 nmol/min/mg Protein auch

signifikant an; p<0,0125, vergleiche dazu Abb. 27.

60 Minuten nach intraperitonealer Injektion der gleichen Menge von 3,5-L-T2 lag der Sau-

erstoffverbrauch nach Zusatz von Succinat mit 162 ± 3 nmol/min/mg Protein im Bereich

der Kontrollen. Bei Zusatz von Glutamat als Substrat der oxidativen Phosphorylierung be-

Ergebnisse74

0

90

100

110

120

Kontrollen

nach 30 min

nm

ol

O2/

min

/m

g P

ro

te

in

Oxidative Phosphorylierung, Glutamat *

3,5-L-T2

nach 30 min

Abb. 27 Sauerstoffverbrauch isolierter Mitochondrien aus Lebern männlicher, hypothyreoter, gehun-

gerter Ratten. Den Kontrollen wurde 30 min vor der Mitochondrienpräparation NaCl 0,9%

und der Versuchsgruppe 250 µg 3,5-L-T2 / 100g KG in vivo i. p. injiziert.

Substrat zur oxidative Phosphorylierung war jeweils Glutamat 5 mM.

Beide Versuchsgruppen n = 3; ∗ p<0,0125

trug der O2-Verbrauch nach 3,5-L-T2-Applikation 113 ± 1 nmol/min/mg Protein und lag

damit wiederum signifikant höher als die Kontrollen; p<0,01, Werte nicht dargestellt.

Und auch 90 Minuten nach intraperitonealer Injektion von 250 µg 3,5-L-T2 je 100 g KG lag

der Sauerstoffverbrauch bei Zusatz beider verwendeten Substrate signifikant über den Kon-

trollen. Nach Succinat-Zusatz betrug der O2-Verbrauch 181 ± 14 nmol/min/mg Protein;

p<0,0125. Nach Glutamat-Zusatz stieg der Sauerstoffverbrauch auf 127 ± 3 nmol/min/mg

Protein und lag erneut signifikant über dem der Kontrollen; p<0,01, Werte nicht darge-stellt.

Der vereinheitlichte Versuchsansatz lies mittels beschriebener Methodik der Messung der

Atmung isolierter Mitochondrien aus Lebern männlicher, hypothyreoter gehungerter Ratten

sehr gleichmäßige Einzelergebnisse erzielen. Bereits 30 min nach intraperitonealer Injektion

von 250 µg 3,5-L-T2 je 100g KG stieg der Sauerstoffverbrauch der Mitochondrien sowohl bei

Succinat als auch bei Glutamat als Substrat der oxidativen Phosphorylierung signifikant im

Vergleich zu den Kontrollen an. Nach 60 min war der Sauerstoffverbrauch bei Succinat als

Ergebnisse75

Substrat in seinem Anstieg weniger ausgeprägt, als bei dem Substrat Glutamat ( keine Abb.,

vergleiche die Werte oben ). Nach 90 min lag der O2-Verbrauch wieder signifikant bei beiden

verwendeten Substraten hoch über den Kontrollen.

_______________


In vivo durch 3,5-L-T2 stimulierte isolierte Mitochondrien aus Lebern männlicher, hypothy-

reoter, gehungerter Ratten wiesen nach 30 Minuten eine signifikante Steigerung des Sauer-

stoffverbrauchs und damit eine gesteigerte oxydative Phosphorylierung bei Einsatz der Sub-

strate Succinat, wie auch Glutamat auf.

Die Wirkung von 3,5-L-T2 auf den Anstieg der mitochondrialen Atmung hatte nach 30 Mi-

nuten ein Niveau erreicht, daß zu späteren Zeitpunkten der Messung ( nach 60 und 90 min )

nicht mehr wesentlich steigerbar war.

5. Isolierte Nierenperfusion

Ergebnisse76

Nach den bisherigen Experimenten lies sich ein schneller Effekt von 3,5-L-T2 auf die Sti-

mulation des Sauerstoffverbrauchs, sowie auf die Glucose- und Harnstoffproduktion am

Versuchsmodell der isoliert perfundierten Leber nachweisen. In weiteren Versuchen wurde

dann der Mechanismus dieses Effektes an verschiedenen Versuchsmodellen näher unter-sucht.

Neben der Leber stellt die Niere ein im Stoffwechsel der Schilddrüsenhormone wichtiges

Organ dar; siehe dazu auch S. 10 in der Einleitung. Die folgenden Experimente sollen die

Frage beantworten, ob die Effekte von 3,5-L-T2 auf den Stoffwechsel der Leber begrenzt sind

oder sich auch eine Wirkung im Sinne einer Stimulation des Sauerstoffverbrauchs an der Niere

nachweisen läßt. Als Versuchsmodell wurde die isoliert perfundierte Niere von hypothyreoten

Ratten gewählt.

Die in den Versuch genommenen Tiere waren stets männlich, hypothyreot und hungerten 24

Stunden vor dem Versuchsbeginn. Dem Perfusionspuffer wurde 3,5-L-T2 in einer Kon-

zentration von 10-9 M zugesetzt, die sicher im maximal stimulierenden Bereich liegt, wie aus

vorangegangenen Experimenten hervorging.

5.1 Einfluß von 3,5-L-T2 bei isolierter Nierenperfusion hypothyreoter Ratten

Im beschriebenen Versuchsmodell der isolierten Nierenperfusion ( siehe Material und Me-

thoden S. 25 ff. ) wurde zum Referenzgewicht der Nieren der Sauerstoffverbrauch ( O2 in

µmol/min/g ) gemessen, sowie glomeruläre Filtrationsrate ( GFR in µl/min/g ), Natrium-

Filtrationsrate ( Na FR in µmol/min/g ), Natrium-Reabsorptionsrate ( Na RR in µmol/min /g ),

Kalium-Filtrationsrate ( K FR in µmol/min/g ), Kalium-Reabsorptionsrate ( K RR in

µmol/min/g ), Glucose-Reabsorptionsrate ( Gl RR in µmol/min/g ) und der Quotient aus

Natriumreabsorption / O2-Verbrauch. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefaßt.

Sie zeigten, daß durch den Zusatz von 3,5-L-T2 nach 20 minütiger Äquilibrierungszeit in

einer Konzentration von 10-9 M zum Perfusionspuffer keine Steigerung des Sauerstoffver-

Tab. 4 Zusammenfassung der Befunde zum Einfluß von 3,5-L-T2 auf die isolierte Nierenperfusion;

angegebene Werte als MW ± SEM; Kontrollen n = 19; 10-9 M 3,5-L-T2; n = 10

Ergebnisse77

Parameter Einheit Kontrollen 10-9 M 3,5-L-T2

O2-Verbrauch µmol/min/g 8,3 ± 0,5 7,8 ± 0,8

GFR µl/min/g 761 ± 50 693 ± 58

Na FR µmol/min/g 108 ± 7 100 ± 9

Na RR µmol/min/g 96 ± 6 88 ± 8

K FR µmol/min/g 3,7 ± 0,2 3,4 ± 0,3

K RR µmol/min/g -0,2 ± 0,3 0,7 ± 0,3

GI RR µmol/min/g 5,1 ± 0,4 4,7 ± 0,4

Na RR/O2-Verbrauch --- 11,8 ± 0,7 11,6 ± 0,6

brauchs der isoliert perfundierten Nieren zu verzeichnen war. Auch die übrigen gemesse-nen

Funktionsparameter der Nieren waren im Verlauf nicht signifikant verändert; verglei-che hierzu

Tab 4.

5.2 Einfluß von 3,5-L-T2 bei isolierter Nierenperfusion euthyreoter Ratten

Bei Voruntersuchungen an isoliert perfundierten Nieren von euthyreoter Ratten war nach

Zusatz von 10-9 M 3,5-L-T2 eine Reduktion der Natrium-Rückresorption ( Na RR ), sowie des

Quotienten aus Natrium-Rückresortion/O2-Verbrauch zu verzeichnen. Im einzelnen betrug die

Na RR bei Kontrollen 87,2 ± 10,3 µmol/min/g ( n = 3 ) und nach Zusatz von

10-9 M 3,5-L-T2 nur noch 77,6 ± 2,1 µmol/min/g ( n = 8 ); p<0,05. Der Quotient aus

Na RR/O2-Verbrauch betrug bei Kontrollen 11,2 ± 1,0 ( n = 3 ) und nach Hormonzusatz

wie oben nur noch 9,9 ± 0,3 ( n = 8 ); p<0,01 ( Werte nicht dargestellt ). Die übrigen

gemessenen Parameter unterschieden sich auch in diesem Versuchsansatz nicht signifikant

voneinander. Eine Steigerung des Sauerstoffverbrauchs durch 3,5-L-T2, war auch in dieser

Versuchsanordnung nicht nachzuweisen.

Ergebnisse78

5.3 Einfluß von 3,5-L-T2 auf kultivierte Mesangiumzellen

Nachdem es nicht gelungen war an der Niere als ganzem Organ in der isolierten Perfusion

einen Einfluß von 3,5-L-T2 nachzuweisen stellte sich die Frage, ob dies auch auf zellulärer

Ebene zutrifft. Mesangiumzellen sind spezialisierte glatte Muskelzellen der Niere und regu-

lieren funktionell durch ihren Kontraktionszustand den Ultrafiltrationskoeffizienten und da-mit

die glomeruläre Filtrationsrate ( GFR ). Mesangiumzellen von Ratten können kultiviert werden

und kontrahieren sich nach Zusatz vasoaktiver Hormone.

Der Kontraktionszustand der Zellen in Kultur wurde mikroskopisch beobachtet und jeweils vor

Zusatz von 3,5-L-T2 in angegebener Konzentration und 5 min bzw. 8 min nach Zusatz von 3,5-

L-T2 photographiert. Die Ergebnisse sind in der Tab. 5 zusammengefaßt. Es wur-den pro

Versuch 20 Zellen ausgewählt und in ihrem Kontraktionszustand beurteilt und aus-gemessen.

Die Ergebnisse sind angegeben als Prozentsatz der kontrahierten Mesangium-zellen.

Tab. 5 Ausmaß der Kontraktion kultivierter Mesangiumzellen nach Zusatz von Schilddrüsenhormonen

in angegebenen Konzentrationen; Angaben jeweils in %

SD-HormoneKonz.

L-T4 L-T3 L-T2

10-13 M <15 <15 44

10-9 M <15 <15 64

Die Kontraktion der Zellen trat bereits 4 Minuten nach Zusatz von 3,5-L-T2 ein und ist bereits

nach 8 Minuten abgeschlossen. L-T4 und L-T3 in angegebenen Konzentrationen bewirkten nur

einen geringen Anteil kontrahierter Zellen.

Nach Zusatz von 3,5-L-T2 zu kultivierten Mesangiumzellen kontrahierten sich die Zellen in

starkem Ausmaß. Dieser Effekt war durch Zusatz verschiedener Analoga zu L-T2 nicht wei-ter

steigerbar ( Werte nicht dargestellt ). Besonders eine Dosisreduktion bis auf 10-13 M 3,5-L-T2

Ergebnisse79

mit einer 44%igen Kontraktionsrate ist in diesem Ausmaß nur vergleichbar der be-kannten

kontrahierenden Wirkung von Angiotensin II in einer Konzentration von 10-8 M auf

Mesangiumzellen.

Diese Befunde würden einen Einfluß von 3,5-L-T2 auf die glomeruläre Filtrationsrate

( GFR ) erwarten lassen. Im Versuchsmodell der isoliert perfundierten Niere war dies bei

hyothyreoten Ratten nicht nachweisbar und bei euthyreoten Ratten gerade nicht mehr signi-

fikant ( Werte nicht dargestellt ).

_______________


Bei isolierter Nierenperfusion männlicher, hypothyreoter, gehungerter Ratten waren nach

Zusatz von 3,5-L-T2 in einer Konzentration von 10 -9 M zum Perfusionsmedium die gemes-

senen Parameter im Vergleich zu den Kontrollen nahezu unverändert, sodaß eine Wirkung auf

den Stoffwechsel, vergleichbar derjenigen bei der isolierten Leberperfusion, nicht nach-

zuweisen ist.

Lediglich einen Nebenbefund stellte die Induktion einer ausgeprägten Kontraktion von kulti-

vierten Mesangiumzellen dar, der sogar noch bei einer Konzentration von 10-13 M des ein-

gesetzten Schilddrüsenhormones 3,5-L-T2 nachzuweisen war. Der analoge Befund eines

Einflusses auf die glomeruläre Filtrationsrate bei der isolierten Perfusion des ganzen Or-gans

fehlte, so daß sich hier keine physiologische Bedeutung ableiten lies.

Diskussion81

IV DISKUSSION

1. Induzierte Hypothyreose durch Na131J i.p.

In den beschriebenen Versuchen wurden vornehmlich hypothyreote Ratten verwendet, um die

Versuchsansätze weitest möglich zu standardisieren und damit vergleichbar zu machen.

Die durch intraperitoneale Injektion von Na131J induzierte Hypothyreose ist ein gängiges

Verfahren, wobei die Dosierung des Isotops mit 0,25 mCi im Vergleich zu anderen Arbeits-

gruppen z.T. niedriger ausfällt. Müller et. al. ( 55 und 56 ) verwendeten dieselbe Dosie-rung;

Menahan et al. ( 53 ) setzten zur Induktion der Hypothyreose 0,5 mCi ein und Sestoft et al. (

77 ) dosierten zur Induktion der Hypothyreose bei Ratten 2 mCi und nahmen die Tiere nach 3

Wochen in den Versuch. Die nach Ablauf von 4 Wochen zum Versuchsbeginn gemessenen

Schilddrüsenhormonspiegel, betrugen 0,43 ± 0,04 ng/ml für L-T3 bzw. 9,7 ± 1,0 ng/ml für L-

T4 und bestätigten die hypothyreote Stoffwechsellage. Im Vergleich bestimmten Müller et al. (

56 ) ebenfalls nach i.p. verabreichten Na131J für L-T4 < 8 ng/ml und Cooper et al. ( 12 ) bei

MMI-hypothyreoten Ratten für L-T3 0,2 ng/ml und L-T4 4,8 ng/ml. Bei euthyreoten Tieren

betrugen die Hormonspiegel bei L-T3 0,65 ± 0,04 und bei L-T4 23 ± 1 ng/ml.

Weitere gemessene Parameter signalisierten eine Schilddrüsenunterfunktion der Versuchs-tiere,

wie das im Verhältnis zum Körpergewicht reduzierte Lebergewicht im Vergleich zu

euthyreoten Tieren. Es betrug bei hypothyreoten Ratten 2,9 ± 0,2%, identisch bei Menahan et

al.( 53 ) und bei Sestoft et al. 3,2 % ( 76 ). Bei euthyreoten Ratten ergab sich ein Ver-hältnis

von 4,1 ± 0,3 % ( siehe Tab. 1 ).

Es gab noch weitere Hinweise auf den hypothyreoten Status im Vergleich zu euthyreoten

Tieren : Na131J-gespritzte Ratten boten neben stets kalten Extremitäten auch eine ausgepräg-te

Hypomobilität, ein reduziertes Abwehrverhalten, ein struppigeres Fell, sowie insgesamt auch

eine Stagnation des Wachstums 10 bis 14 Tage nach der Na131J-Behandlung. Die Malat-

Enzym-Aktivität in der Leber, als ein Parameter des thyreoten Status ( 51 ), war bei

hypothyreoten Tieren deutlich niedriger als bei euthyreoten. Und vor allem der niedrige

Sauerstoffverbrauch der perfundierten Lebern sprach für eine deutliche Reduzierung der

Schilddrüsenhormon-Spiegel ( vergleiche auch Tab. 1 auf Seite 17 ).

Diskussion82

2. Die isolierte Leberperfusion als Modell der Wahl zur Untersuchung der schnellen

Wirkungsweise von Schilddrüsenhormonen

Das Modell der isolierten Leberperfusion mit Lebern hypothyreoter Ratten ist besonders gut

geeignet zur Untersuchung des Einflusses von Schilddrüsenhormonen auf den Lebermetabo-

lismus. Nach Präparation der Lebern ( vergleiche dazu Kapitel II.2, Seite 18 ff. ) und In-

stallation in die Perfusionsapparatur wurde sowohl beim Versuchsaufbau der rezyklieren-den,

wie auch der offenen Perfusion eine konstante Perfusionstemperatur durch die beheizte

Perfusionskammer nach Schimassek ( siehe Abb. 3, Seite 19 ), bzw. durch den beheizten

Perfusionsblock bei der offenen Perfusion ( siehe Abb. 4, Seite 21 ) und in beiden Ansätzen

durch den auf 37°C temperierten Krebs-Henseleit-Puffer gewährleistet.

Die kontinuierliche Begasung des Krebs-Henseleit-Puffers mit Carbogen ( 95% O2/ 5%

CO2 ) stellte den pH konstant auf 7,4 ein und gewährleistete einen Sauerstoffgehalt von

über 0,8 µmol/ml. Die weitestgehende Führung des Perfusionspuffers durch Glasrohre ver-

hinderte einen nennenswerten Gasverlust. Bei Probeläufen, ohne dazwischengeschaltete Le-

bern, konnte ein konstant hoher Sauerstoffgehalt des Puffers aufgezeichnet werden. Bei einem

Perfusionsfluß von ca. 5 ml/min/g bedeutete das ein Sauerstoffangebot von über 4 µmol/min/g,

sodaß ein Sauerstoffmangel der perfundierten Lebern ausgeschlossen werden konnte. Eine

weitere Steigerung des Perfusionsflusses hätte einen höheren Perfusionsdruck zur Folge, was

dann einerseits zu einer Schädigung der Leberzellen und einem Anstieg der gemessenen GOT-

bzw. LDH-Aktivität geführt hätte und andererseits zu einer Shunt-Perfu-sion im Sinne einer

Mehrperfusion der Hauptgefäße unter Umgehung der Leberkapillaren.

Direkt nach der Leberpassage wurde der Sauerstoffgehalt des Perfusionspuffers durch eine

Clark-Elektrode mit Säure-Basen-Analysator aufgezeichnet und daraus der Sauerstoffver-

brauch der perfundierten Lebern berechnet. Die Gruppe der Kontrollperfusionen wies bei

männlichen, hypothyreoten, gehungerten Ratten bei rezyklierender Perfusion einen Sauer-

stoffverbrauch von 1,71 µmol/min/g auf ( siehe dazu Abb. 7, Seite 34 ) und entsprach den

Werten von Horst et al. ( 32 ) mit 1,9 µmol/min/g im gleichen Versuchsmodell, wie auch den

Diskussion83

gemessenen Werten von Müller et al. ( 56 ) mit 1,62 µmol/min/g, ebenfalls bei isoliert

perfundierten Lebern hypothyreoter, gehungerter männlicher Ratten unter Verwendung ei-nes

Fluorocarbonmediums zur Perfusion. Für Lebern euthyreoter Ratten geben Sestoft et al. ( 77 )

3,8 µmol/min/g O2-Verbrauch an, wobei es sich hier um kleine Ratten mit einem

Körpergewicht von 170 g handelte.

Auch die gemessenen Substrate gaben Aufschluß über den intakten Stoffwechsel der perfun-

dierten Lebern ( vergleiche dazu Tab. 2, Seite 20 ). Das mit dem Perfusionspuffer angebo-tene

Alanin lag mit 10 mM über der von Exton et al. ( 19 ) beschriebenen, für die Gluco-neogenese

limitierenden Konzentration. Die Glucoseproduktion der Kontrollen lag mit 29 µmol/g bei

rezyklierender und 22 µmol/g bei offener Leberperfusion etwas über den gemes-senen Werten

von Müller et al. ( 55 ); wie auch die Harnstoffsynthese mit 75 µmol/g bzw. 98 µmol/g im

Vergleich zur selben Arbeitsgruppe etwas höher ausfiel. Der Unterschied könnte an einer

niedrigeren Gluconeogeneserate und Harnstoffproduktion aufgrund des ver-wendeten

Perfusionsmediums ( Fluorocarbon bei Müller et al. ) liegen.

3. Der Effekt von 3,5-L-T2 auf Gluconeogenese und O2-Verbrauch

Im Laufe der isoliert rezyklierenden Leberperfusion bei männlichen, hypothyreoten, gehun-

gerten Kontrollen stieg der Sauerstoffverbrauch ohne Hormonzusatz über den Zeitraum von 90

Minuten langsam von 1,71 auf 2,24 µmol/min/g an ( Abb. 7, Seite 34 ). Durch die ab-gelaufene

Gluconeogenese, aus dem im Perfusionspuffer in einer Konzentration von 10 mM gelösten

Alanin, stieg die Glucoseproduktion der nach 24 Stunden Hunger glykogenleeren Lebern, wie

auch die Harnstoffproduktion parallel an ( Tab. 3, Seite 36 ). Nach Ablauf der

Äquilibrierungszeit, zum Zeitpunkt t = 0 min betrug die Glucoseproduktion der Kontrollen 4,8

µmol/g und stieg über die 90-minütige Perfusion kontinuierlich auf 29 µmol/g. Gleich-zeitig

stieg die Harnstoffproduktion von 8,1 auf 75 µmol/g in der selben Perfusionszeit.

Nach Zusatz von 3,5-L-T2 in einer Konzentration von 10-12 M, die der von Pinna et al.

( 66 ) im Serum von gesunden Probanden gefundenen entspricht, stieg der Sauerstoffver-

brauch auf 2,90 µmol/min/g an und lag im Verlauf nach 50 Minuten bereits signifikant über den

Diskussion84

Kontrollen. Parallel dazu war auch die Gluconeogeneserate und die Harnstoffproduk-tion nach

Hormonzusatz erhöht, jedoch bereits nach 30 Minuten signifikant über den Kon-trollen und

stieg im weiteren Verlauf der 90 Minuten Perfusion auf 42 µmol/g bzw. 136 µmol/g an.

Somit konnte der Sauerstoffverbrauch der isoliert rezyklierend perfundierten Lebern männ-

licher, hypothyreoter, gehungerter Ratten um 30 % gesteigt werden. Die Steigerung der

Gluconeogenese betrug 47 % und bei der gemessenen Harnstoffsynthese sogar 82 %. In der

Bilanz wird also mehr Harnstoff produziert als Glucose, da ein Teil der Glucose in Pyruvat

umgewandelt und zu CO2 und H2O abgebaut wird.

Für 3,5-L-T2, welches durch Monodejodierung aus L-T3 entsteht, beschrieben Horst et al.

( 32 ) einen schnellen Effekt auf den Sauerstoffverbrauch von perfundierten Lebern männli-

cher, hypothyreoter, gehungerter Ratten 30 Minuten nach Hormonzusatz; einen Effekt der

durch L-T3 und L-T4 bei gleichzeitiger Inhibierung ihrer Dejodierung durch Propylthioura-cil (

PTU ) in diesem Ausmaß nicht hervorzurufen war. Hieraus schlossen die Autoren auf einen für

L-T2 spezifischen schnellen Effekt, der über eine direkte mitochondriale Wirkung vermittelt

wird. Kvetny ( 41 ) beschreibt eine Stimulation des Sauerstoffverbrauchs bei hu-manen

Monozyten ebenfalls durch 3,5-L-T2, ebenfalls schnell innerhalb von 30 Minuten. Eine

Steigerung der Glucoseaufnahmen in die Zellen konnte er jedoch nicht nachweisen.

Im zeitlichen Ablauf unterscheidet sich die 3,5-L-T2-Wirkung von anderen bekannten Hor-

monen, wie Glukagon oder Adrenalin erheblich. Diese bewirken an der Plasmamembran durch

die Stimulierung der Adenylatcyclase die Bildung von cAMP als zweiten Boten im Cytosol,

der verschiedene Reaktionskaskaden und zelluläre Prozesse in Gang setzt, u. a. steigt auch der

Sauerstoffverbrauch ( vergleiche hierzu auch Abb. 19, Seite 56 ). Im Ver-gleich laufen diese

Prozesse sofort, binnen Sekunden bis wenigen Minuten ab. Da die Stei-gerung des

Stoffwechsels durch 3,5-L-T2 langsamer abläuft ( ab 30 min ), scheint sie nicht einem

unmittelbar vergleichbaren Reaktionsprinzip zu unterliegen, welches wie ein Schalter entweder

an- oder ausgeschaltet werden kann.

Es ist bekannt, daß unter Einfluß des Schilddrüsenhormones L-T3 eine Steigerung des Inter-

mediärstoffwechsels über eine vermehrte Synthese spezifischer Proteine über den nukleären

Stoffwechsel gesteuert wird. Den Einfluß der Proteinbiosynthese auf die schnellen Effekte von

Diskussion85

Schilddrüsenhormonen untersuchten Horst et al. ( 32 ) am Modell der isolierten Leber-

perfusion durch Zusatz von Cycloheximid in einer Konzentration von 20 µg/ml zum Perfu-

sionsmedium. Die schnelle Steigerung des Sauerstoffverbrauchs durch L-T3 konnte durch den

Cycloheximidzusatz nicht verringert werden, woraus die Autoren den Schluß zogen, daß ein

durch Proteinsynthese vermittelten Effekt in diesem Versuchsansatz nicht vorlag.

In der selben Arbeit wurde untersucht, ob durch eine Steigerung der Hormonkonzentration der

Effekt auf den Sauerstoffverbrauch noch früher zu erzielen bzw. weiter steigerbar ist. Das

Ergebnis zeigte, daß oberhalb einer Konzentration von 10-12 M 3,5-L-T2 keine wesent-liche

Steigerung des Sauerstoffverbrauchs gemessen werden konnte. Dieser Befund ent-spricht auch

den Ergebnissen dieser Arbeit, als bei weiblichen Ratten und kohlenhydrat-reich gefütterten

männlichen Tieren eine weitere Steigerung des Sauerstoffverbrauchs der perfundierten Lebern

durch eine Erhöhung der eingesetzten Hormonkonzentration nicht zu erzielen war.

Die Untersuchungen einzelner Dejodierungsschritte durch Engler et al. ( 17 ) und Faber et al. (

20 ) ergaben, daß etwa 5 % des geamten 3,5,3´-L-T3 durch 3´-Monodejodierung zu 3,5-L-T2

reduziert werden und entsprechend eine Serumkonzentration von 0,4 - 5,3 ng/dl anzunehmen

ist. Für die tatsächliche physiologische Konzentration von 3,5-L-T2 im menschlichen Serum

gesunder Probanden bestimmten Pinna et al. ( 66 ) 16,2 ± 6,4 ∗ 10-12 M/l ( einen

Normalbereich von 3,4 - 29 ∗ 10-12 M/l, entsprechend dem MW ± 2 Standard-abweichungen ).

Bei hypothyreoten Patienten betrug der Wert für 3,5-L-T2 0,75 ± 1,6 ∗

10-12 M/l. Somit entsprach das in den Versuchen eingesetzte Hormon der physiologischen

Konzentration im unteren Normalbereich. Inwieweit sich möglicherweise das Bild durch die

dabei noch nicht berücksichtigte Proteinbindung an Albumin ändert müssen weitere Unter-

suchungen zeigen.

4. Einfluß der Ernährung auf den Effekt von 3,5-L-T2

Diskussion86

In den vorangegangenen Experimenten hatten die hypothyreoten Ratten vor Versuchsbeginn

stets 24 Stunden gehungert, da die Glucoseproduktion der perfundierten Lebern einen sensi-

tiven Parameter für ihren Stoffwechsel darstellte.

Es ist aber bekannt, daß es eine Interaktion zwischen der Wirkung von Schilddrüsenhormo-nen

und kohlenhydratreicher Ernährung gibt, da die Enzymausstattung der Zellen durch den

Ernährungszustand bestimmt wird. Mariash et al. ( 52 ) zeigten eine unterschiedliche Induk-

tion von hepatischen Enzymen der Lipogenese ( ME, FAS, G6PD, 6PGD ) nach kohlenhy-

dratreicher Diät bei hypo- und euthyreoten Ratten. Die Aktivität dieser Enzyme war bei hy-

pothyreoten Ratten nach kohlenhydratreicher Diät gegenüber normaler Diät bereits erhöht. Für

eine weitere Stimulation durch L-T3 waren nach kohlenhydratreicher Diät nur geringe und

weitaus niedrigere Konzentrationen des Hormones notwendig als nach normaler Diät. Die

Autoren interpretierten die Ergebnisse als eine synergistische Wirkung bei der Induk-tion

hepatischer Enzyme der Lipogenese durch Schilddrüsenhormone und nach kohlenhy-

dratreicher Diät. Als mögliche Ursachen wurden sowohl eine erhöhte metabolische Clea-rance

von L-T3, als auch eine durch die kohlenhydratreiche Diät bedingte gesteigerte relati-ve

Affinität zum nukleären Rezeptor ausgeschlossen.

Bei isoliert rezyklierender Leberperfusion hypothyreoter Ratten nach kohlenhydratreicher Diät

fiel bei der Auftragung der auf das Lebergewicht bezogenen Werte für den Sauerstoff-

verbrauch auf, daß die gehungerten Tieren sowohl beim Vergleich der Kontrollgruppen, als

auch nach Stimulation durch 3,5-L-T2 einen höheren O2-Verbrauch aufwiesen ( vergleiche

Abb. 13, Seite 44 ). Berücksichtigt man bei kohlenhydratreich ernährten Tieren die durch

Glykogenspeicherung bedingte geringere Dichte atmungsaktiver Kompartimenten, so muß man

den Sauerstoffverbrauch auf Milligramm Protein pro Gramm Leber beziehen. So um-gerechnet

ergaben sich für den Sauerstoffverbrauch der Lebern gehungerter Tiere mit 5,15

nmol/min/mgProtein und nach kohlenhydratreicher Diät 5,12 nmol/min/mgProtein gleiche Aus-

gangswerte.

Nach Zugabe von 3,5-L-T2 war der Sauerstoffverbrauch der Lebern nach kohlenhydratrei-cher

Diät bereits nach 30 Minuten signifikant im Vergleich zur Kontrollgruppe gesteigert. Durch

den gefütterten Zustand der Tiere lief die Stimulation des Sauerstoffverbrauchs of-fensichtlich

rascher ab als bei gehungerten Tieren. Auch hier könnte die Erklärung dafür eine bereits nach

Diskussion87

kohlenhydratreicher Diät vorbestehende Enzyminduktion sein, die nach Hormonexposition den

Sauerstoffverbrauch früher ansteigen läßt.

Vergleicht man nun das Ausmaß der Steigerung des Sauerstoffverbrauchs durch 3,5-L-T2,

ergaben sich bei gehungerten und kohlenhydratreich ernährten hypothyreoten Versuchstie-ren

keine Unterschiede. Bezogen auf den Ausgangswert betrug die Zunahme der Atmung 30%,

bzw. 25 %.

Bei Untersuchungen zur Monodejodierung von T3 und rT3 fanden Burger et al. ( 10 ) nach

hochkalorischer Diät bei sonst gesunden Probanden eine 4- bis 5-%ige Dejodierung von L-T3

an 3´-Position ( und dadurch Bildung von 3,5-L-T2; vergleiche Abb. 2, Seite 11 ) bei ei-nem

insgesamt erhöhten L-T3-Plasmaspiegel. Darüber hinaus stellten die Autoren bei dieser

Ernährung eine deutlich gesteigerte Plasma-Clearance-Rate von 3,5-L-T2 fest. Dies inter-

pretierten sie als eine Alteration des peripheren Stoffwechsels der Schilddrüsenhormone durch

die hochkalorische Ernährung im Sinne einer Zunahme der Dejodierung am Innen-ring. Sollte

diese Hypothese zutreffen, wäre sie eine Erklärung für die fehlende Zunahme der Stimulation

des Sauerstoffverbrauchs nach kohlenhydratreicher Ernährung. Nach Zusatz einer höheren

Konzentration von 3,5-L-T2 müßte dann jedoch der vollständige vorbeschrie-bene Effekt zu

beobachten sein.

Aber auch durch eine Erhöhung der eingesetzten Hormonkonzentration auf 10-10 M konnte

keine weitere Steigerung des Sauerstoffverbrauchs, sowie auch keine schneller ablaufende

Stimulation des Sauerstoffverbrauchs durch 3,5-L-T2 erzielt werden ( vergleiche dazu Abb. 14,

Seite 45 ).

5. Einfluß des Geschlechts auf den Effekt von 3,5-L-T2

In den vorangegangenen Experimenten kamen ausschließlich männliche hypothyreote Ver-

suchstiere zum Einsatz. Der Stoffwechsel der Schilddrüsenhormone ist bei den Geschlech-tern

jedoch nicht einheitlich. Faber et al. ( 21 ) fanden heraus, daß die physiologisch vor-

kommenden Serumspiegel von 3,5-L-T2 bei männlichen Ratten höher sind als bei weibli-chen.

Diskussion88

Bei höherer Syntheserate der weiblichen Tiere findet sich bei diesen aber gleichzeitig auch eine

höhere Hormon-Clearance, woraus ein insgesamt niedrigerer Spiegel resultiert.

Die Leberperfusion hypothyreoter, gehungerter weiblicher Ratten wies nur wenige Unter-

schiede im Vergleich zu der Perfusionen von Lebern männlicher Versuchstiere auf. Der

Ausgangs-Sauerstoffverbrauch weiblicher Rattenlebern lag aber mit 1,97 µmol/min/g

signifikant höher als bei den männlichen Tieren ( vergleiche dazu Abb. 10, Seite 39 ). Und auch

die Steigerung des Sauerstoffverbrauchs unterschied sich nach Zusatz von 3,5-L-T2 bereits

nach 40 Minuten signifikant von den Kontrollen. Sie fiel jedoch mit 18 % geringer aus als bei

der männlichen Vergleichsgruppe, bei der die Steigerung 30 % betrug.

Ursache für den zu Perfusionsbeginn höheren Sauerstoffverbrauch der weiblichen hypothy-

reoten Ratten kann eine im Vergleich zu den männlichen Tieren veränderte Rezeptorausstat-

tung für Schilddrüsenhormone der einzelnen Zellkompartimente der Lebern und/oder auch eine

unterschiedliche Enzymausstattung der Zellen sein, die durch die Steroidhormone der

Geschlechter ( Androgene und Östrogene ) gesteuert wird. Ebenso wäre dies eine Erklärung

für die geringfügig früher signifikante Stimulation des Sauerstoffverbrauchs bei den weib-lichen

Ratten. Die von Faber et al. ( 21 ) beschriebene höhere Hormon-Clearance für 3,5-L-T2 ist

möglicherweise der Grund dafür, daß der Sauerstoffverbrauch der weiblichen hy-pothyreoten

Tiere nicht um den selben Prozentsatz steigerbar war, wie bei den männlichen Tieren. Denn

auch eine Steigerung der Hormonkonzentration auf 10-10 M hatte weder einen höheren Anstieg

des Sauerstoffverbrauchs zur Folge, noch fiel dieser früher signifikant aus, als bei den

Kontrollen ( vergleiche dazu Abb. 11, Seite 41 ). Insgesamt scheint bei der Betrachtung der

Stimulation des Sauerstoffverbrauchs durch 3,5-L-T2 der Geschlechter in der absoluten

Darstellung die höhere Steigerbarkeit bei den männlichen Tiere das höhere Ausgangsniveau der

weiblichen Tiere auszugleichen.

Parallel zu den Experimenten kohlenhydratreich ernährter männlicher Versuchstiere, wur-den

analog zur Beantwortung der Frage, ob die Zeit bis zu einer signifikanten Steigerung des

Sauerstoffverbrauchs bei weiblichen Tieren durch ihren Ernährungszustand noch weiter

verkürzt werden kann, Experimente mit weiblichen hypothyreoten kohlenhydratreich er-

nährten Ratten durchgeführt ( vergleiche dazu Abb. 18, Seite 51 ).

Diskussion89

Die Ergebnisse zeigten, daß der Sauerstoffverbrauch auch in dieser Versuchsgruppe nach 40

Minuten signifikant anstieg, was im Vergleich zu den gehungerten weiblichen Tieren keine

zusätzliche Beschleunigung der Wirkung von 3,5-L-T2 darstellte.

Auch bei diesem Experiment fiel der berechnete Sauerstoffverbrauch bezogen auf das Le-

bergewicht im Vergleich zum gehungerten Status geringer aus, was durch die Glykogenver-

dünnung der atmungsaktiven Zellkompartimente zu erklären ist. Im Vergleich lag sogar das

Lebergewicht der gefütterten Tiere mit 4,56 g um 9,4 % meßbar höher, als das der gehun-

gerten mit 4,17 g.

6. Untersuchungen zum Mechanismus der Wirkung von 3,5-L-T2 bei rezyklierender

und offener Leberperfusion

Für ausgewählte Experimente an männlichen, hypothyreoten, gehungerten Ratten wurde der

Versuchsaufbau der Leberperfusion verändert, um den Mechanismus des Effektes durch 3,5-L-

T2 näher untersuchen zu können.

Das Modell der kombiniert offenen und rezyklierenden Leberperfusion ermöglichte die pa-

rallele Messung von Sauerstoffverbrauch, Kaliumausstrom aus den Leberzellen, Perfusions-

druck sowie zur Kontrolle der Intaktheit des Stoffwechsels der perfundierten Lebern die Pa-

rameter Harnstoffsynthese und Glucoseproduktion. In dieser Versuchsanordnung folgte der

zunächst offenen, anschließend eine Phase rezyklierender Perfusion.

Im Vergleich zu den in Kapitel IV.3 diskutierten Experimenten lag der Ausgangswert des

Sauerstoffverbrauchs mit 2,69 µmol/min/g ( vergleiche Abb. 19, Seite 56 ) über den gemes-

senen Werten des Ausgangsniveaus bei rezyklierender Perfusion. Verglichen mit den Wer-ten

bei euthyreoten Versuchstieren ( vergleiche Tab. 1, Seite 17 ) spricht auch dieser Wert für eine

deutliche Hypothyreose, wie auch die zur Kontrolle gemessenen Serumkonzentra-tionen der

Schilddrüsenhormone der in den Versuch genommenen Tiere. Auch bei diesem

Ausgangsniveau war, wie in den Versuchen zu sehen und im Folgenden diskutiert, durch 3,5-

L-T2 noch eine deutliche Stimulation des Sauerstoffverbrauchs zu erzielen.

Diskussion90

Bei der zunächst 60-minütigen offenen Perfusion lief die Kurve des O2-Verbrauchs bei den

Kontrollen annähernd auf dem Ausgangsniveau geradeaus. Nach Stimulation durch 10-9 M 3,5-

L-T2, einer sicher im maximal stimulierenden Bereich liegenden Konzentration, stieg der

Sauerstoffverbrauch im Verlauf weitaus weniger steil an, als bei den vorangegangenen

Experimenten ( vergleiche Abb. 8, Seite 35 und Abb. 19, Seite 56 ) und erreichte nach 60

Minuten Perfusion ein gerade signifikant höheren Wert als die Kontrollen.

Nach Umschalten auf rezyklierende Perfusion stieg der Sauerstoffverbrauch jedoch bereits

nach abgelaufenen 10 Minuten steil an, und erreichte im weiteren Verlauf ab der 40. Minu-te (

entsprechend der 100. Minute Gesamtperfusionzeit ) ein Plateau ( vergleiche Abb. 19, Seite 56

). Im Vergleich zu den Kontrollen war der O2-Verbrauch bei rezyklierender Perfu-sion schon

nach 10 Minuten und anschließend bis zum Perfusionsende signifikant erhöht.

Nach abschließend erneut offener Perfusion fiel der Sauerstoffverbrauch der hormonstimu-

lierten Versuchsgruppe ab, verblieb aber immer noch auf einem deutlich höheren Niveau als die

Kontrollen, die sich wieder in der Nähe des Ausgangsverbrauchs einpendelten

( Abb. 19 ).

Der Verlauf der Stimulation des Sauerstoffverbrauchs durch 3,5-L-T2 bei im Wechsel offe-ner,

rezyklierender und wieder offener Perfusion legte den Schluß nahe, daß nicht das Hor-mon

selbst die Wirkung vermittelt, da sonst schon bei zuerst offener Perfusion eine deutli-chere

Stimulation zu erwarten gewesen wäre ( vergleiche auch die Adrenalin-Wirkung nach

abschließend offener Perfusion, Abb. 19 ). Anscheinend führte 3,5-L-T2 an den Zellen eine

Veränderung herbei oder setzte eine Substanz X frei, die erst bei Rezirkulation des Medi-ums

wirksam wird. Ferner ist diese entfaltete Wirkung nach Unterbrechung der Rezirkula-tion (

durch abschließende offene Perfusion ), möglicherweise durch Auswaschen der Sub-stanz X,

weitgehend reversibel. Die vorangegangenen Experimente, mit ausschließlich re-zyklierender

Perfusion ( vergleiche dazu Kapitel IV.3, Seite 83 ff. ), machten des weiteren deutlich, daß das

Prinzip dieses Effektes nicht dem eines Schalters unterliegt, der entweder an- oder

ausgeschaltet wird, sondern offenbar einer kontollierten Modulation.

Diskussion91

Die gemessene Glucoseproduktion verlief gleichsinnig wie der Sauerstoffverbrauch: wäh-rend

der zunächst offenen Leberperfusion stieg nach Stimulation durch 3,5-L-T2 die Gluco-

seproduktion nach 40 Minuten auf ein signifikant höheres Niveau als die Kontrollen. Nach

Umschalten auf rezyklierende Perfusion war der Anstieg wiederum sofort nach 10 Minuten

signifikant höher als bei Kontrollperfusionen und erreichte, korrespondierend zum Sauer-

stoffverbrauch, ab der 40. Minute ( 100. Minute Gesamtperfusionszeit ) ein Plateau ( ver-

gleiche dazu Abb. 20 a und b, Seite 58 ).

Ebenfalls verlief die Harnstoffproduktion der perfundierten Lebern gleichsinnig zum O2-

Verbrauch. Bei zunächst offener Perfusion war der Anstieg 30 Minuten nach Zusatz von 3,5-

L-T2 verglichen mit den Kontrollen zwar schon signifikant; aber weitaus deutlicher fiel auch

hier die Steigerung der Harnstoffsynthese nach Umschalten auf rezyklierende Perfu-sion nach

Ablauf von 60 Minuten aus. Erneut stieg die Harnstoffproduktion bereits nach 10 Minuten steil

an, unterschied sich im Verlauf immer deutlicher von den Kontrollen und erreichte bereits nach

30 Minuten ( 90. Minute Gesamtperfusionszeit ) ein Plateau ( verglei-che dazu Abb. 21 a und

b, Seite 60 ), wie zuvor schon beim Sauerstoffverbrauch und der Glucoseproduktion

beschrieben.

Die kontinuierliche Registrierung des Perfusionsdruckes ∆p wies zu keinem Zeitpunkt der

Perfusionen, weder des Kontrollkollektivs, noch der hormonstimulierten Versuchsgruppe einen

Unterschied auf. Ein vasoaktiver Effekt des eingesetzten Hormones war daher auszu-schließen.

Gleiches gilt für die Messung des Kaliumausstromes der Leberzellen in das Perfusionsmedi-um.

Auch bei diesem Parameter ergaben sich bei den Kontrollen, wie auch der Versuchs-gruppe

nach Zusatz von 10-9 M 3,5-L-T2 keine Hinweise auf eine Änderung. Somit scheint ein Kalium-

Signal als Vermittler des stimulierenden Effektes von 3,5-L-T2 auf den Sauer-stoffverbrauch,

die Steigerung der Harnstoffproduktion sowie der Gluconeogenese auszu-scheiden.

Bei der Untersuchung des Wirkungsmechanismus von 3,5-L-T2 auf die isoliert perfundierte

Leber ist zu berücksichtigen, daß die Leber kein einheitliches Organ darstellt. Sie ist die größte

„Drüse“ des menschlichen Organismus und ihr Funktionsspektrum außerordentlich groß. So

konnten Hummerich et al. ( 34 ) bei isolierten Hepatozyten nach Zusatz von 3,5-L-T2 keinen

Effekt feststellen. Der strukturelle Aufbau umfaßt aber neben den Hepatozyten und den

Diskussion92

interlobulären Gallengängen auch Epithelzellen und die Kupffer-Zellen ( organspe-zifische

Makrophagen ), die ebenfalls als mögliche Wirkorte des Hormones zu diskutieren sind und die

gemessenen Effekte vermittelt haben könnten.

7. Einfluß von Ionenkanalblockern auf den Effekt von 3,5-L-T2

Zur Abgrenzung der Vermittlung des auslösenden Effektes von 3,5-L-T2 durch Ionenströme

über die Zellmembran bei rezyklierend perfundierter Lebern hypothyreoter Ratten, wurden dem

Perfusionsmedium verschiedene, im Folgenden diskutierte selektive ionenkanalblockie-rende

Agenzien zugesetzt.

Für die Experimente mit Einsatz selektiver Ionenkanalblocker kamen wiederum männliche,

hypothyreote, gehungerte Ratten zum Einsatz, und für 3,5-L-T2 wurde eine maximal stimu-

lierende Konzentration von 10-10 M gewählt.

Na+-K+-ATPase-Aktivität (Na+/K+-Kanal ) und Ouabain

Die durch Schilddrüsenhormone induzierte Thermogenese wird vermittelt durch die Stimu-

lation des aktiven Na+-Transportes der plasmamembranständigen Na+-K+-ATPase. Wie Asano

und Edelman ( 2 ) beschrieben, sind Na+-K+-ATPase-Aktivität und Sauerstoffver-brauch nach

Stimulation durch L-T3 bei Skelettmuskelpräparaten direkt proportional. Ferner beschrieben

Kalderon et al. ( 37 ) eine erhöhte Dichte der Na+-K+-ATPase auf der hepati-schen

Plasmamembran hyperthyreoter Ratten.

Ismail-Beigi und Edelman ( 36 ) führten die Stimulation der Na+-Pumpe durch die

Schilddrüsenhormone auf entweder eine Aktivierung der mitochondrialen ATP-Synthese und

einem daraus resultierenden lokalen Anstieg der ATP-Konzentration zurück oder auf eine

direkte Aktivierung des Enzymes. Die Autoren leiten daraus auch einen möglichen

Regulationsmechanismus für den Stoffwechsel durch Schilddrüsenhormone in verschiedenen

physiologischen Status ( Kälte, Hunger, Fieber, Katecholaminausschüttung wie bei Sepsis etc.

Diskussion93

) ab. Wenn es einen Zusammenhang dieses Regulationsprinzips auch mit 3,5-L-T2 gibt, müßte

die Stimulation der Atmung durch die Blockade des Na+/K+-Kanals unterdrückt werden

können.

Krenning et al. ( 40 ) beschrieben bei isolierten Hepatozyten für den aktiven Transport von

Schilddrüsenhormonen eine Abhängigkeit vom Na+-Gradienten an der Plasmamembran und

einen reduzierten Transport bei Inhibierung der Aktivität der Na+-K+-ATPase durch Oua-bain.

Die Autoren leiteten daraus, neben der Dejodierung der Schilddrüsenhormone, ein mögliches

weiteres Regulationsprinzip von Wirkung und Metabolismus der Hormone ab.

Bei Ouabain handelt es sich um einen selektiven Blocker des Na+/K+-Kanals, der in einer

Konzentration von 10-6 M vor Einsatz des Hormons dem Perfusionsmedium zugesetzt wur-de

( vergleiche dazu Abb. 22 b, Seite 64 ). Der Ausgangs-Sauerstoffverbrauch wurde so-wohl bei

der Kontrollgruppe, als auch bei der Versuchsgruppe durch Ouabain geringfügig gesenkt.

Im weiteren Verlauf konnte dann jedoch durch 3,5-L-T2, auch in der eingesetzten sicher

maximal stimulierenden Konzentration von 10-10 M über die gesamte Perfusionszeit keine

Steigerung des Sauerstoffverbrauchs verzeichnet werden. Nach abschließender Überprüfung

der Intaktheit der perfundierten Lebern durch Zusatz von Adrenalin und einer darunter

sofortigen Steigerung des Sauerstoffverbrauchs war eine toxische Ursache als Erklärung für

den vorher fehlenden Anstieg des Sauerstoffverbrauchs ausgeschlossen.

Somit scheint die Na+-K+-ATPase in die Vermittlung der Steigerung des Sauerstoffver-brauchs

durch 3,5-L-T2, wie auch schon für die anderen Schilddrüsenhormone gezeigt wur-de ( 9, 37 ),

bei der isoliert rezyklierend perfundierten Leber hypothyreoter Ratten invol-viert zu sein.

Hierbei müßte dann 3,5-L-T2 selbst, oder eine durch 3,5-L-T2 freigesetzte Substanz X an die

Zellmembran binden, um die beobachteten Effekte hervorzurufen wo-durch die Steigerung der

Gluconeogeneserate und des Alaninverbrauchs durch 3,5-L-T2 noch nicht erklärt ist.

In weiteren Experimenten kamen Nifedipin als selektiver Blocker des Ca++-Kanals, SITS als

selektiver Blocker des K+/H+-Kanals und Amilorid als selektiver Blocker des Na+/H+-Kanals

zum Einsatz, bei ansonsten identischen Versuchsanordnungen zu dem oben beschrie-benen

Einsatz von Ouabain.

Diskussion94

Ca++-Kanal und Nifedipin

Als einen schnellen Effekt von Schilddrüsenhormonen an der Plasmamembran von Ratten-

thymozyten, beschrieben Segal et al. ( 72, 73, 74 ), die Aufnahme von Glucose und Ca++ in die

Zelle und charakterisierten das Ca++ als „ersten Boten“ für die prompte Wirkung von

Schilddrüsenhormonen. Müller et al. ( 55 ) und Hummerich et al. ( 34 ) stellten nach

Schilddrüsenhormongabe eine Stimulation der Aufnahme von Aminosäuren und Ca++ in

Leberzellen fest. Die Autoren korrelierten diesen Effekt bei gehungerten Ratten mit einer

Steigerung des Sauerstoffverbrauchs und der Gluconeogenese und bei gefütterten Ratten mit

der Stimulation von Atmung und Glykolyse ( 34 ).

In der selben Arbeit wird auch von einer gleichgerichteten Wirkung von 3,5-L-T2 bei ge-

hungerten Versuchstieren auf den Ca++-Einstrom, sowie O2-Verbrauch und Gluconeoge-nese

berichtet und die Stimulation durch die Hormone auf eine Änderung der mitochondri-alen,

sowie der cytosolischen Ca++-Konzentrationen zurückgeführt. An isolierten Erythro-

cytenmembranen stellten Davis et al. ( 15 ) eine durch Schilddrüsenhormone und einige

-analoga stimulierte Ca++-ATPase-Aktivität fest.

Um eine mögliche Beteiligung der Vermittlung des Effektes von 3,5-L-T2 durch einen Ca++-

Einstrom in die Leberzellen zu überprüfen, wurde dem Perfusionspuffer Nifedipin zugesetzt

und der Sauerstoffverbrauch der Lebern hypothyreoter, gehungerter Ratten ge-messen (

vergleiche dazu Abb. 23 a und b, Seite 66 ). Der Einsatz von Nifedipin, einem wirksamen

selektiven Blocker des Ca++-Kanals, in einer Konzentration von 10-6 M hatte einen steigernden

Effekt auf das Ausgangsniveau des Sauerstoffverbrauchs der beiden Ver-suchsgruppen.

Nach Hormonzusatz stieg der Sauerstoffverbrauch früher auf signifikant höhere Werte als bei

der Kontrollgruppe, und sogar früher als bei den Perfusionen ohne Nifedipin-Zusatz. Auch das

Ausmaß der Stimulation erreichte einen signifikant höheren Sauerstoffverbrauch als ohne

Nifedipinzusatz, trotz eines höheren Ausgangsniveaus. Hieraus folgt, daß der Zu-satz von

Nifedipin zum Perfusionsmedium dem stimulierenden Effekt von 3,5-L-T2 bei re-zyklierender

Leberperfusion eher Vorschub leistet, auf keinen Fall jedoch inhibiert.

Diskussion95

Somit scheint Ca++ für den Hormoneffekt keine wesentliche Rolle zu spielen. Auch die zeitliche

Lücke zwischen dem Beginn des beschriebenen Ca++-Einstromes [ nach 2 Minu-ten ( 34 )] und

dem Anstieg des Sauerstoffverbrauchs [ nach 20 Minuten ] ist nicht plausi-bel.

K+/H+-Kanal und SITS

Zur Überprüfung eines Einflusses des K+/H+-Kanals auf die Stimulation des Sauerstoffver-

brauchs durch 3,5-L-T2 wurde dem Perfusionsmedium der selektive Blocker SITS zugesetzt (

vergleiche dazu Abb. 24 a und b, Seite 68 ). Der Einsatz von SITS in einer Konzentration von

10-6 M zum Perfusionsmedium hatte nur eine geringe Erhöhung des Ausgangsniveaus des

Sauerstoffverbrauchs zur Folge. Nach Zusatz von 3,5-L-T2 stieg der Sauerstoffver-brauch,

vergleichbar den vorherigen Experimenten ohne SITS-Zusatz zum Perfusionsmedi-um, an. Für

einen inhibierenden Effekt von SITS und damit ein Einfluß des K+/H+-Kanals auf den 3,5-L-T2

Effekt gibt es somit keinen Hinweis.

Auch die vorangegangenen Experimente der kombiniert offenen und rezyklierenden isolier-ten

Leberperfusion, bei denen eine Kaliumelektrode zur Messung des K+-Ausstromes aus den

Leberzellen zum Einsatz kam ( vergleiche Kapitel IV.6, Seite 89 ), hatten bereits erge-ben, daß

ein Kaliumsignal als Vermittler des 3,5-L-T2 Effektes nicht wahrscheinlich ist.

Na+/H+-Kanal und Amilorid

Zur Überprüfung eines Einflusses des Na+/H+-Kanals auf die Stimulation des Sauerstoff-

verbrauchs durch 3,5-L-T2 wurde dem Perfusionsmedium der selektive Blocker Amilorid

zugesetzt ( vergleiche dazu Abb. 25 a und b, Seite 69 ). Der Einsatz von Amilorid in einer

Konzentration von 10-3 M zum Perfusionsmedium hatte eine Reduktion des Sauerstoffaus-

gangsniveaus zur Folge. Der O2-Verbrauch der Kontrollgruppe fiel im weiteren Verlauf der

Perfusion stetig leicht ab im Unterschied zu den Kontrollen ohne Amiloridzusatz, bei denen der

Sauerstoffverbrauch leicht anstieg.

Diskussion96

Nach Zugabe von 3,5-L-T2 stieg der Sauerstoffverbrauch bereits nach 10 Minuten auf ein

gegenüber Kontrollen signifikantes Niveau und noch für die darauf folgenden 10 Minuten

weiter an. Nach insgesamt 20 Minuten Perfusionszeit fiel die Kurve stetig, den Kontrollen von

Perfusionsbeginn an vergleichbar, bis zum Perfusionsende ab. Nach Amiloridzusatz zum

Perfusionsmedium schien aufgrund einer den Na+-Strom über die Zellmembran blok-kierenden

Wirkung erneut eine hormoninduzierte Steigerung des Sauerstoffverbrauchs wirk-sam

verhindert worden zu sein. Die anfängliche Steigerung des O2-Verbrauchs könnte durch den

nicht-blockierten Na+/K+-Kanal ermöglicht worden sein, wenn durch diesen Kanal initial ein (

reflektorisch ) erhöhter Na+-Einstrom stattgefunden hat, der im weiteren Ver-lauf der

Perfusion langsam abklang.

So zeigten die Experimente der isolierten rezyklierenden Leberperfusion mit Einsatz ver-

schiedener selektiver ionenkanalblockierender Substanzen, daß die Natrium-Kanäle wahr-

scheinlich einen Einfluß auf den durch 3,5-L-T2 vermittelten Effekt haben.

Jedoch weder die Calcium- noch die Kalium-Kanäle, korrespondierend zu den vorherigen

Experimenten bei kombiniert offener und rezyklierender Leberperfusion ( vergleiche Kapi-tel

IV.6, Seite 89 ), scheinen die hormonelle Wirkung zu vermitteln.

8. Wirkung von 3,5-L-T2 auf isolierte Mitochondrien aus Hepatozyten in vivo

Die Regulierung der Atmung durch Schilddrüsenhormone betrifft die Zellkompartimente Kern

und Mitochondrien. Schilddrüsenhormone bewirken eine Steigerung der Expression

bestimmter Genabschnitte, die für Proteine der Atmungskette kodieren; möglicherweise

werden auch Membranlipide verändert. Sterling et al. ( 79, 82 ) fanden eine Proteolipid-

fraktion der inneren Mitochondrienmembran isoliert aus Rattenhepatozyten, die eine spe-

zifische feste Bindung mit T3 eingeht. Biologische Effekte konnten mit der Bindung nicht

korreliert werden.

Diskussion97

Vom selben Autor sind auch schnelle Effekte der Schilddrüsenhormone auf die oxidative

Phosphorylierung, wie bei submitochondrialen Vesikeln durch direkten nanomolaren Zusatz

von T4 beschrieben worden ( 83 ); wie auch eine alternative Interpretation der von ihm

gefundenen schnellen Effekte durch eine Bindung von L-T3 an die Adeninnukleotidtrans-lokase

( ANT ) der inneren Mitochondrienmembran.

Oppenheimer und Silva ( 60 ) stellten fest, daß Schilddrüsenhormone Schlüsselenzyme kon-

trollieren, die letztlich die Bereitstellung von Reduktionsäquivalenten für die mitochondriale

Matrix erhöhen. In der Folge kommt es zu einer Steigerung der Atmungskapazität und ATP-

Synthese.

Soboll beschrieb in einer Übersichtsarbeit ( 78 ), daß Schilddrüsenhormone die für die Zell-

atmung zuständigen Gene beeinflussen. Hierbei findet die Modulation hauptsächlich auf der

Ebene der Transkription statt.

Darüber hinaus bewirken Schilddrüsenhormone aber auch schnelle Effekte auf die mito-

chondriale Aktivität, die binnen Minuten auftreten und von der Genexpression, der für die

Zellatmung verantwortlichen Abschnitte unabhängig sind. Die schnellen Effekte durch

Schilddrüsenhormone auf die Atmung resultieren aus der direkten Interaktion mit Kompo-

nenten des mitochondrialen Atmungsapparates ( 45 ), bzw. seinen inneren Membranen

( 37 ). Permeabilitätsänderungen der inneren Mitochondrienmembran können die Atmungs-

aktivität und damit die ATP-Produktion der Mitochondrien dem Energiebedarf der Zelle

entsprechend beeinflussen und stellen somit einen möglichen Regulationsmechanismus des

Stoffwechsels durch die Schilddrüsenhormone dar ( 25 ).

Bei der Adeninnukleotidtranslokase ( ANT ) handelt es sich um ein in die innere Mitochon-

drienmembran integriertes Protein, daß den Austausch von Adeninnukleotiden zwischen dem

Cytosol und der mitochondrialen Matrix kontrolliert. Durch mitochondriale oxydative

Phosphorylierung generiertes ATP ( 6 ) wird durch die ANT ins Cytosol transferiert, um so für

energieverbrauchende Reaktionen ( Muskelkontraktion, Proteinbiosynthese, Gluconeo-genese

u.a. ) zur Verfügung zu stehen. Damit ist die ANT ein wichtiges Verbindungsglied zwischen

ATP-Synthese und Energieverbrauch und stellt mit ihrer postulierten Beeinfluß-barkeit durch

die Schilddrüsenhormone ein weiteres mögliches Regulationsprinzip dar.

Diskussion98

Die Stimulation mitochondrialer Aktivität und die Steigerung der Aktivität der ANT durch

Schilddrüsenhormone, speziell L-T3, haben Höppner et al. in einer Arbeit ( 29 ) zusammen-

gefaßt. Hiernach ist offen, ob eine direkte Bindung von L-T3 an mitochondriale Proteine oder

eine Bindung an spezifische Proteine der Zellmembran mit konsekutiver Alteration des

Ionentransportes zugrundeliegt. Ausgeschlossen wurde von ihnen jedoch ursächlich die ANT

Genexpression und eine direkte Bindung der Schilddrüsenhormone an das ANT-Mole-kül.

Auch Mowbray et al. ( 54 ) konnten zeigen, daß die bei thyroidektomierten Ratten reduzier-te

ANT-Aktivität 15 Minuten nach einer einzelnen intravenösen Gabe von L-T3 in physiolo-

gischer Konzentration auf normale Werte angehoben werden konnte. Hieraus schlossen die

Autoren, daß die Kontrolle über die Adeninnucleotidtranslokase eine Komponente des Me-

chanismus sei, über den die schnelle und direkte Wirkung der Schilddrüsenhormone auf die

oxydative Phosphorylierung vermittelt wird.

Nach den Untersuchungen von Horst et al. ( 32 ) an isoliert perfundierten Lebern hypothy-

reoter Ratten war die Stimulation der Atmung durch L-T3 und L-T4 nach Hemmung ihrer

Dejodierung durch PTU nicht mehr nachweisbar. Die Stimulation der Atmung durch 3,5- L-T2

war dagegen unbeeinträchtigt. Hieraus leiteten die Autoren ab, daß die Wirkung der

Schilddrüsenhormone auf eine Steigerung der Atmung durch 3,5-L-T2 vermittelt wird.

Um einen Einfluß von 3,5-L-T2 auf die oxydative Phosphorylierung und mitochondriale At-

mung zu untersuchen, wurden die Experimente an isolierten hepatischen Mitochondrien hy-

pothyreoter, gehungerter Ratten durchgeführt. Nachdem Halangk et al. aus unserer Arbeits-

gruppe zunächst nach Gabe von 3,5-L-T2 in vitro zu isolierten Mitochondrien keinen Effekt

nachweisen konnten ( Werte nicht dargestellt ), wurden die beschriebenen Versuche in vivo

durchgeführt.

In vivo war 30 Minuten nach intraperitonealer Injektion von 250 µg 3,5-L-T2 /100 g KG bei im

Anschluß isolierten Mitochondrien von gehungerten, hypothyreoten, männlichen Ratten eine

signifikante Steigerung des Sauerstoffverbrauchs und damit der oxydativen Phosphory-lierung

bei Zusatz der Substrate Succinat, wie auch Glutamat zu beobachten ( vergleiche dazu die

Abb. 26 und 27 auf den Seiten 73 und 74 ). Zu späteren Zeitpunkten ( 60 und 90 Minuten ) ist

Diskussion99

keine wesentliche Zunahme des Sauerstoffverbrauchs aufgetreten, sodaß der vollständige

Effekt von 3,5-L-T2 nach 30 Minuten erreicht ist.

Nachdem in vitro der Zusatz von 3,5-L-T2 zu isolierten Mitochondrien keinen Einfluß auf den

Sauerstoffverbrauch hatte, in vivo jedoch binnen 30 Minuten eine signifikante Steige-rung des

Sauerstoffverbrauchs und damit der oxydativen Phosphorylierung nachzuweisen war, kann der

Effekt kein direkter sondern muß ein vermittelter sein. Wie oben schon dis-kutiert kommt

dafür eine durch 3,5-L-T2 bewirkte Veränderung an den Zellen oder die Freisetzung einer

Substanz X in Frage, die zu einer Steigerung der mitochondrialen Atmung und damit des

Sauerstoffverbrauchs führt ( vergleiche dazu Kapitel IV.6, Seite 89 ff. ).

Der zeitliche Ablauf der Stimulation des Sauerstoffverbrauchs isolierter Mitochondrien kor-

respondiert wiederum mit den Befunden des stimulierten Sauerstoffverbrauchs und der ge-

steigerten Gluconeogenese bei isolierter Leberperfusion ( vergleiche dazu Kapitel IV.3, Sei-te

83 ff. ).

O´Reilly und Murphy ( 61 ) beschrieben im selben Modell, bei in vivo isolierten Mitochon-

drien aus Lebern männlicher, hypothyreoter Ratten ebenfalls eine Stimulation der mitochon-

drialen Atmung durch 3,5-L-T2 nach 60 Minuten. Nach Inhibierung der Dejodinase mit PTU

konnte durch L-T3 kein vergleichbarer Effekt erzielt werden, woraus die Autoren den Schluß

zogen, daß die stimulierende Wirkung von L-T3 auf die mitochondriale Atmung erst nach

seiner Dejodierung zu 3,5-L-T2 vermittelt wird.

Ebenfalls in einem Versuchsaufbau mit isolierten Mitochondrien von Hepatozyten euthyre-oter

Ratten beschrieben Lombardi et al. ( 49 ) 60 Minuten nach Einmalinjektion von 3,5-L-T2 eine

30%-ige Steigerung der mitochondrialen Atmung. Hierbei waren weder der Proto-nenfluß über

die innere Mitochondrienmembran, noch das phosphorylierende System von 3,5-L-T2

beeinflußt. Die Autoren diskutierten, daß die Steigerung der mitochondrialen At-mung durch

eine Steigerung der Substratoxydation hervorgerufen wird. Sie postulierten ei-nen prinzipiell

unterschiedlichen Wirkmechanismus von 3,5-L-T2 und L-T3 auf die Stimula-tion der

mitochondrialen Atmung. In der Interpretation der Befunde stellten sie die Ge-schwindigkeit

der Atmungssteigerung nach 3,5-L-T2 heraus, die physiologische Bedeutung haben könnte,

wenn schnelle Energiebereitstellung für die Zelle notwendig ist.

Diskussion100

Befunde von Lanni et al. ( 42 ) zeigten, daß es einen unterschiedlichen Mechanismus der

Wirkung von L-T3 und L-T2 auf die Mitochondrien von Rattenhepatozyten gibt. Während L-T3

auf die mitochondriale Masse und Aktivität Einfluß hat, entfaltet L-T2 seine Wirkung direkt auf

den Cytochrom-Oxydase-Komplex. Der selbe Autor beschrieb aber in weiteren

Untersuchungen ( 43, 44 ), im Gegensatz zu den Befunden oben, eine spezifische Bindungs-

stelle für 3,3´-L-T2 an isolierten Mitochondrien, an die auch weniger spezifisch 3,5-L-T2

bindet. Eine physiologische Bedeutung für 3,5-L-T2 wurde nicht diskutiert.

Ob für die beschriebene Wirkung von 3,5-L-T2 eine spezifische Bindung an Proteine der

Zellmembran verantwortlich ist oder analog den Befunden zu L-T3 auch ein Einfluß von 3,5-L-

T2 auf ANT vorliegt, muß in weiteren Untersuchungen gezeigt werden. Nach fehlen-der

direkter Wirkung von 3,5-L-T2 in vitro ist das Vorhandensein eines spezifischen intra-

mitochondrialen Rezeptors, den Wrutniak et al. ( 85 ) für L-T3 an der mitochondrialen Ma-trix

beschrieben, nicht wahrscheinlich.

9. Organspezifität der Wirkung von 3,5-L-T2

Nachdem die bisher beschriebenen Versuche zur Wirkung von 3,5-L-T2 ausschließlich auf

das Organ, bzw. subzelluläre Organellen der Leber beschränkt waren, sollte im weiteren

untersucht werden, ob auch an anderen, für den Stoffwechsel der Schilddrüsenhormone

wichtigen Organen, wie der Niere eine Wirkung des Hormones nachweisbar ist.

Isolierte Nierenperfusion

Die Niere, als ein wichtiges Organ im Stoffwechsel der Schilddrüsenhormone, stellt neben

der Leber den hauptsächlichen Ort ihrer peripheren Dejodierung dar, was auch in den zahl-

reichen Untersuchungen zu diesem Thema zum Ausdruck kommt.

Ferguson et al. ( 22 ) zeigten, daß die isoliert perfundierte Niere eine hohe Kapazität zur

Dejodierung von L-T4 zu L-T3 hat, wobei die L-T3-Produktion proportional zur L-T4-Dejo-

Diskussion101

dinase-Aktivität und L-T4-Aufnahme ist. Daher konnte die Seite der 5´-Dejodinase auf kon-

traluminaler Oberfläche des renalen Tubulus lokalisiert werden. Bei diesen Untersuchungen

fand er keine Abhängigkeit der glomerulären Filtrationsrate ( GFR ) oder Na+-Rückresorp-tion

( Na RR ) von der Konzentration der eingesetzten Schilddrüsenhormone.

Adlkofer und Schurek ( 1 ) stellten fest, daß nach tubulärer Filtration die Reabsorptionska-

pazität für L-T3 und L-T4, auch bei einer Konzentration der eingesetzten Hormone, die die

physiologische um das 100-fache übersteigt, nicht sättigbar war. Der Sauerstoffverbrauch der

perfundierten Nieren lag trotz euthyreoter Versuchstiere im gleichen Bereich, wie bei den

durchgeführten Versuchen mit hypothyreoten, gehungerten Tieren ( vergleiche dazu Tab. 4,

Seite 77 ).

Bei hypothyreoten Versuchstieren fanden Holmes et al. ( 30 ) einen erhöhten Na+-Verlust der

perfundierten Nieren. Diesen führten sie auf eine geringere Atmung und Glykolyse zu-rück und

eine dadurch verringerte Energiebereitstellung für die Na+-Rückresorption der Nieren. Die

Autoren leiteten daraus eine wichtige Bedeutung der Schilddrüsenhormone für den

Nierenstoffwechsel ab, im Sinne einer Regulierung der Energiebereitstellung für die

Nierenrinde, wie auch für das Nierenmark durch anaerobe Glykolyse.

Die Versuche an der isoliert perfundierten Niere hypothyreoter, männlicher Ratten zeigten, daß

nach dem Zusatz von 3,5-L-T2 zum Perfusionsmedium in beschriebener Versuchsan-ordnung

keine signifikante Stimulation des Sauerstoffverbrauchs zur Folge hatte ( verglei-che dazu Tab.

4, Seite 77 ).

Auch eine ganze Reihe funktioneller Parameter der isolierten Nierenperfusion, wie der

glomerulären Filtrationsrate ( GFR ), der Natriumfiltration ( Na FR ) und -reabsorption

( Na RR ), wie auch der Kaliumfiltration ( K FR ) und -reabsorption ( K RR ) blieben un-

beeinflußt, oder der Betrag der entfalteten Wirkung ist so gering, daß er durch den be-

schriebenen Versuchsansatz nicht erfaßt wird.

Lediglich der singuläre Befund an kultivierten Mesangiumzellen, bei denen sogar nach Zu-satz

von 3,5-L-T2 in einer Konzentration von nur 10-13 M Kontraktionen nachgewiesen wer-den

Diskussion102

konnten, die in diesem Ausmaß sonst nur nach Zusatz von Angiotensin II vorzufinden sind,

bleibt zu diskutieren.

Funktionell regulieren Mesangiumzellen als Abkömmlinge der glatten Muskulatur durch ih-ren

Kontraktionszustand die glomeruläre Filtrationsrate durch Beeinflussung des Ultrafiltra-

tionskoeffizienten. Wenn bei isolierter Nierenperfusion keine Änderung der glomerulären

Filtrationsrate nach Zusatz von 3,5-L-T2 nachweisbar war, so ist dies möglicherweise durch

den Versuchsaufbau erklärbar, der bei dieser sensiblen Funktionsgröße durch den Perfu-

sionsdruck nicht differenziert genug beurteilt werden kann. Weitere Versuche in vivo und in

vitro müssen zeigen, wie schnell der Effekt von 3,5-L-T2 zu beobachten und worauf er

zurückzuführen ist.

Zusammengefaßt unterscheiden sich die Befunde zum Sauerstoffverbrauch der isoliert per-

fundierten Niere nach Zusatz von 3,5-L-T2 nicht von denen der anderen Schilddrüsenhor-mone

L-T3 und L-T4.

Somit ist eine Wirkung von 3,5-L-T2 auf den Sauerstoffverbrauch, oxydative Phosphorylie-

rung und Gluconeogenese, vergleichbar derjenigen auf die Leber, an der Niere nicht nach-

weisbar und weitere Versuche an spezifischeren Modellen müssen zeigen, ob die Wirkun-gen

von 3,5-L-T2 einzig auf die Leber beschränkt sind.

Zusammenfassung103

V Zusammenfassung

Die vorliegenden Experimente an der offen und rezyklierend perfundierten Leber zeigeneindeutig, daß es neben den schon lange bekannten Hormonen T3 und T4 ein weiteresSchilddrüsenhormon gibt, nämlich 3,5-L-T2, welches auf eine bisher nicht vollständig geklärteWeise binnen 30 Minuten mitochondriale Atmung, Glucose- und Harnstoff-Produktion in derLeber stimuliert. Mögliche Wirkungsmechanismen werden diskutiert.

Beteiligt sind die Zellkompartimente Zellmembran und Mitochondrien. An der Zellmem-bransteht der Wirkungsmechanismus in einem direkten Zusammenhang mit der plasma-membranständigen Na+/K+-ATPase, denn deren Hemmung verhinderte eine Stimulation desSauerstoffverbrauchs durch 3,5-L-T2. Aufgrund der Geschwindigkeit der eintretendenWirkung von 3,5-L-T2 kann diese nicht kernvermittelt und muß unabhängig von der Pro-teinbiosynthese sein.

Der durch das Hormon vermittelte Effekt trat bei rezyklierender Perfusion weitaus schnellerein und erreichte höhere Werte als bei offener Perfusion. Anscheinend wird das Hormon nachdem erstem Kontakt mit der Leber modifiziert oder es vermittelt seine Wirkung durchFreisetzung einer Substanz X, die dann ihrerseits die beschriebene Steigerung des Stoff-wechsels auslöst. Diese Wirkung ist reversibel, wie die Versuche bei offener Leberperfu-sionzeigten, als am Versuchsende wieder hormonfrei perfundiert wurde.

Darüberhinaus entfaltet das Hormon seine atmungssteigernde Wirkung über die Mitochon-drien. Auch hier wurde der Effekt bei isolierten Mitochondrien nicht direkt durch 3,5-L-T2

erzielt, wie die Experimente in vitro zeigten, sondern nach in vivo Applikation des Hormo-neswar die Atmung wiederum bereits nach 30 Minuten signifikant gesteigert.

Dem Prinzip dieses Effektes von 3,5-L-T2 liegt offenbar kein Schalter zugrunde, der entwe-deran- oder ausgeschaltet wird, sondern eher eine kontrollierte Regulation, an der auch einspezifischer Rezeptor beteiligt sein könnte. Eine Reihe von schnellen Effekten, die früherL-T3 zugeschrieben worden sind, müssen, wie die Experimente mit Einsatz von PTU zei-gen,als Wirkung von 3,5-L-T2 aufgefaßt werden.

Durch die veränderte Enzymausstattung der Zellen, wie nach kohlenhydratreicher Ernäh-rungoder unter Einfluß der unterschiedlichen Steroidhormone der Geschlechter, ist die Ge-schwindigkeit des Effektes nur geringfügig steigerbar unabhängig von der eingesetzten Hor-monkonzentration.

Bei Mesangiumzellen, spezialisierten glatten Muskelzellen, die für die Regulation der GFR derNiere verantwortlich sind, wurde durch 3,5-L-T2 in einer Konzentration von lediglich 10-13 Meine starke Kontraktion ausgelöst, vergleichbar mit Angiotensin II. Wurden die Experimenteauf das Gesamtmodell der isoliert perfundierten Niere ausgedehnt konnte nur eine geringeWirkung festgestellt werden.

3,5-L-T2 ist das Produkt aus der 3´-Dejodierung von 3,5,3´-L-T3 durch das Enzym Mono-dejodinase Typ I. Die tägliche Produktion beträgt beim Menschen 0,6 - 2,9 µg und die phy-siologische Serumkonzentration 16,2 ± 6,4 ∗ 10-12 Mol/l bzw. 0,4 - 5,3 ng/dl. Die Serum-spiegel von 3,5-L-T2 unterliegen einer hohen Hormon-Clearance.

Literaturverzeichnis104

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Anhang110

ABKÜRZUNGEN

ADP Adenosindiphosphat

ANT Adeninnukleotidtranslokase

ATP Adenosintriphosphat

BMR Basal Metabolic Rate, Stoffwechselgrundumsatz

cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat

Chol Cholesterin

DIT Dijodtyrosin

FAS Fettsäuresynthetase

FR Filtrationsrate

g Gramm

GFR Glomeruläre Filtrationsrate

GOT Glutamat-Oxalacetat-Transaminase

G6PD Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase

i.p. intra peritoneal

KG Körpergewicht

l Liter

LDH Lactat-Dehydrogenase

LG Lebergewicht

M Mol

ME Malic Enzyme

min Minute

Anhang111

MIT Monojodtyrosin

MMI 2-Mercapto-1-Methylimidazol

MW Mittelwert

p Druck

PEPck Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase

6PGD 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase

PTU 6-n-Propyl-2-Thiouracil

eingetragener Warenname

RNA Ribonukleinsäure

RR Rückresorptionsrate

R-SH Sulfidseitengruppen-tragender Cofaktor

SEM Standard Error of the Mean

SITS 4-Acetamido-4´-isothiocyanatostilbene-2,2´-disulfon-säure

T1 3-Monojodthyronin, L-T1

T2 3,5-Dijod-L-thyronin, L-T2

T3 3,5,3´-Trijod-L-thyronin, L-T3

rT3 reverses L-T3

T4 3,5,3´,5´-Tetra-L-thyronin, L-Thyroxin

TBG Thyroxin bindendes Globulin

TBPH T4 bindendes Präalbumin

Tetrac Tetrajodthyroacetat

TRH TSH Releasing Hormone

TSH Thyroidea stimulierendes Hormon

Anhang112

DANKSAGUNGEN

Ich danke Herrn Professor Dr. med. Hans Joachim Seitz, Institut für Physiologische Chemie,

Abteilung für Biochemische Endokrinologie, für die Überlassung des Themas und die

Betreuung der Arbeit.

Meine weiterer Dank gilt

Herrn Prof. Dr. med. Christoph Weiss (em.), Institut für Physiologie der Universität Lübeck,

und Herrn Dr. Horst Pagel für die Gastfreundschaft und Unterstützung bei der Durchführung

der Experimente an der isoliert perfundierten Niere;

Herrn Prof. Dr. med. Dieter Häussinger, Klinik für Innere Medizin der Universität Düsseldorf,

vormals Universität Freiburg, für Gastfreundschaft und Unterstützung bei der Durchführung

der Experimente an der offenen Leberperfusion;

Herrn Priv.-Doz. Dr. rer. nat. Peter Schönfeld, Institut für Physiologische Chemie der

Universität Magdeburg für die Unterstützung bei der Durchführung der Experimente an den

isolierten Mitochondrien;

der Firma Henning Berlin, die die verwendeten Schilddrüsenhormone dem Institut für

Physiologische Chemie der Universität Hamburg als Geschenk überließen.

Anhang113

LEBENSLAUF

Niels Köster

geb. am 24. März 1965 in Hamburg

1971 bis 1975 Grundschule Hasselbrook, Hamburg

1975 bis 1984 Gymnasium Borgfelde, Hamburg, Abitur

1985 bis 1992 Studium der Medizin an der Universität Hamburg,

Staatsexamen

1988 bis 1994 Experimentelle Arbeit zur Erstellung der Promotion, zunächst in der

Abt. Biochemische Endokrinologie, am Institut für Physiologische

Chemie an der Universität Hamburg; später Zusammenarbeit mit

Arbeitsgruppen aus Laboratorien der Universitäten Lübeck,

Magdeburg und Freiburg

1992 bis 1993 wissenschaftlicher Mitarbeiter am Institut für Physiologische Chemie,

Abt. Biochemische Endokrinologie bei

Herrn Prof. Dr. H.-J. Seitz, an der Universität Hamburg, Fachbereich

Medizin

1993 bis 1994 Arzt im Praktikum in der Abt. für Anästhesiologie und operative

Intensivmedizin bei Herrn Dr. med. P. Hoffmann,

Allgemeines Krankenhaus Barmbek in Hamburg

seit 1994 Assistenzarzt in der Abt. Anästhesiologie, operative Intensivmedi-

zin bei Herrn Dr. med. P. Hoffmann, Allgemeines Krankenhaus

Barmbek in Hamburg;

seit 1998 Leitender Arzt Herr Dr. med. Hp. Moecke

Hamburg, den 27. Februar 1998

Documents

SCHNELLE EFFEKTE DER SCHILDDRÜSENHORMONE UND … · Die Tagesproduktion der Hormone der Schilddrüse beträgt 83-93 µg T 4 ( 11, 67, 84 ), 9 µg T 3 und 0,9 µg rT 3 ( 11, 64 )