Aus der Klinik für Rinder

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Testikuläre Gewebetextur und Durchblutung sowie

Ejakulatbeschaffenheit von Bullen unter Einbeziehung der Analyse

reaktiver Sauerstoffspezies und des Spermienchromatins nach

experimenteller skrotaler Hyperthermie

INAUGURAL - DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

vorgelegt von

Pia Nicola Albrecht

aus Bremen

Hannover 2006

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. H. Bollwein 1. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. H. Bollwein 2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. A.-R. Günzel-Apel Tag der mündlichen Prüfung: 16. 11. 2006

Meinen Eltern

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 1

2 Literatur 2

2.1 Anatomie von Hoden und Nebenhoden 2

2.1.1 Hoden und Nebenhoden des Bullen 2

2.1.2 Arterielle und venöse Gefäßversorgung des Bullenhodens 3

2.1.3 Wärmeregulation des Hodens 4

2.2 Grundlagen und Technik der Sonographie 6

2.2.1 Prinzip des Ultraschalls 6

2.2.2 Computergestützte Graustufenanalyse sonographischer B-Bilder 6

2.2.3 Grundlagen der Dopplersonographie 7

2.2.4 Auswertung der Dopplerkurven 9

2.3 Sonographische Untersuchungen am Hoden 10

2.3.1 Subjektive Beurteilung am Hoden erstellter B-Bilder 10

2.3.2 Darstellung hyperthermiebedingter Veränderungen mittels Echotexturanalyse 12

2.3.3 Andere Anwendungsgebiete der computergestützten Echotexturanalyse

bei der sonographischen Untersuchung von Hodengewebe 13

2.3.4 Untersuchungen des testikulären Blutflusses 13

2.3.5 Zusammenhang zwischen testikulärem Blutfluss und Ejakulatbeschaffenheit 14

2.4 Spermienmorphologie, Spermatogenese und epididymale Spermienreifung 16

2.4.1 Spermienmorphologie und Funktion 16

2.4.2 Spermatogenese und epididymale Spermienreifung 17

2.4.3 Hyperthermiebedingte Veränderungen der Spermien 18

2.5 Durchflusszytometrie 25

2.5.1 Prinzip des Durchflusszytometers 25

2.5.2 Bestimmung der DNA-Fragmentation mittels SCSA™-Färbung 28

2.5.3 Bestimmung reaktiver Sauerstoffspezies 30

3 Material und Methoden 32

3.1 Verwendete Tiere 32

3.2 Versuchsaufbau 32

3.3 Lokale Wärmeapplikation am Hoden 33

3.4 Computergestützte Echotexturanalyse 34

3.5 Blutflussanalyse in der A. testicularis 37

3.6 Samengewinnung 39

3.7 Konventionelle Spermaanalyse 39

3.8 Probenanalyse mit dem Durchflusszytometer 39

3.8.1 Vorbereitung der Proben für die Durchflusszytometrie 40

3.8.2 SCSA™-Färbung, Messung und Auswertung 41

3.8.3 Dihydrorhodamin (DHR)/PI-Färbung und Messung 42

3.9 Statistische Auswertung 43

4 Ergebnisse 44

4.1 Skrotale Oberflächentemperatur während der Wärmeapplikation 44

4.2 Einfluss der Hyperthermie auf die klinischen Befunde 45

4.3 Einfluss der Hyperthermie auf die Echotextur des Hodens 47

4.3.1 Einfluss der Hyperthermie auf den mittleren Grauwert 47

4.3.2 Einfluss der Hyperthermie auf den Kontrast 48

4.3.3 Einfluss der Hyperthermie auf den vertikalen Fraktionswert 49

4.4 Einfluss der Hyperthermie auf den Blutfluss der A. testicularis 51

4.4.1 Einfluss der Hyperthermie auf die mittlere Blutflussgeschwindigkeit (TAMV) 51

4.4.2 Einfluss der Hyperthermie auf den Resistance Index (RI) 53

4.5 Einfluss der Hyperthermie auf die konventionellen Spermaparameter 55

4.5.1 Einfluss der Hyperthermie auf die Spermienkonzentration 55

4.5.2 Einfluss der Hyperthermie auf die Gesamtspermienzahl im Ejakulat 56

4.5.3 Einfluss der Hyperthermie auf den prozentualen Anteil vorwärtsbeweglicher

Spermien 58

4.5.4 Einfluss der Hyperthermie auf den Fremdzellgehalt 59

4.5.5 Einfluss der Hyperthermie auf die Bildung primärer Spermienanomalien 60

4.5.6 Einfluss der Hyperthermie auf die Bildung sekundärer Spermienanomalien 61

4.6 Einfluss der Hyperthermie auf die durchflusszytometrisch ermittelten

Spermaparameter 62

4.6.1 Einfluss der Hyperthermie auf die Stabilität des Spermienchromatins 62

4.6.2 Einfluss der Hyperthermie auf die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies 63

4.6.2.1 Einfluss der Hyperthermie auf den prozentualen Anteil fluoreszierender

Spermien in stimulierten und unstimulierten Proben nach DHR/PI-Färbung 63

4.6.2.2 Einfluss der Hyperthermie auf die Fluoreszenzintensität unstimulierter

Spermien nach DHR/PI-Färbung 65

4.6.2.3 Einfluss der Hyperthermie auf die Fluoreszenzintensität stimulierter

Spermien nach DHR/PI-Färbung 66

5 Diskussion 68

5.1 Klinische Befunde und skrotale Oberflächentemperatur 70

5.2 Einfluss der Hyperthermie auf die Echotextur des Hodens 71

5.3 Einfluss der Hyperthermie auf den Blutfluss der A. testicularis 73

5.4 Einfluss der Hyperthermie auf die konventionellen Ejakulatparameter 75

5.5 Einfluss der Hyperthermie auf die durchflusszytometrisch

ermittelten Ejakulatparameter 78

5.6 Zusammenhänge zwischen der Echotextur des Hodens, dem Blutfluss

der A. testicularis sowie den untersuchten Ejakulatparametern 80

5.7 Schlussfolgerung und Ausblick 81

6 Zusammenfassung 82 7 Summary 84

8 Literaturverzeichnis 86 9 Anhang 98

9.1 Verwendete Medien, Chemikalien und Puffer 98

9.2 Fluorochrome 102

9.3 Verwendete Geräte, Produkte und Instrumente 104

9.3.1 Erwärmung 104

9.3.2 Spermagewinnung und Durchflusszytometrie 104

9.3.3 Echotextur- und Blutflussanalyse 105

Abkürzungsverzeichnis

A. = Arteria

Abb. = Abbildung

ad = auf

B-Bild = Brightness-Bild

B-Sonographie = Brightness-Sonographie

bzw. = beziehungsweise

°C = Grad Celsius

ca. = circa

cm = Zentimeter

D = enddiastolische Frequenzverschiebung

DCFH = Dichlorofluoreszin

DFI = DNA-FragmentationIndex

d.h. = das heißt

DHR = Dihydrorhodamin

DMSO = Dimethylsulfoxid

DNA = Desoxiribonuclein Acid

et al. = und andere

Fa. = Firma

FITC-PNA = Fluorescence-Isothiocyanat markiertes Peanut-Agglutinin

FL-1-3 = Fluoreszenzkanäle 1-3

FSC = Forward Scatter

FSH = Follikel stimulierendes Hormon

GSA = Graustufenanalyse

kg = Kilogramm

M = minimale Frequenzverschiebung

mM = Millimolar

Max = Maximum

MHz = Megahertz

Min = minimale diastolische Frequenzverschiebung

Mio = Millionen

ml = Milliliter

MMP = Mitochondrienmembranpotenzial

MOsm = Milliosmol

Mrd. = Milliarden

m/s = Meter/Sekunde

n = Anzahl

nm = Nanometer

NaCl-Lösung = Natrium-Chlorid-Lösung

NIH = National Institute of Health

NP = Number of Pixels

p = Irrtumswahrscheinlichkeit

PI = Pulsatility Index

PI (Farbstoff) = Propidiumjodid

PMT = Photomultiplikatordetektorröhren

PSV = Peak Systolic Velocity

R = Spermienpopulation

r = Korrelationskoeffizient

RI = Resistance Index

ROI = Regions of Interest

ROS = Reaktive Sauerstoffspezies

s = Sekunden

S = maximale Frequenzverschiebung

SAS = Statistical Analysis System

SSC = Side Scatter

SCSA = Sperm Chromatin Structure Assay

Tab. = Tabelle

TAMF = Time Averaged Maximum Frequency Shift

TAMV = Time Averaged Maximum Velocity

u. = und

z.B. = zum Beispiel

µg = Mycrogramm

µl = Mycroliter

- 1 - Einleitung

1 Einleitung In der modernen Rinderzucht ist die frühzeitige Erkennung einer reduzierten Fertilität bei

Bullen von entscheidender Bedeutung. Die Untersuchung der Hoden erfolgt meist mit Hilfe

subjektiver Methoden wie der Palpation und hat daher nur eine eingeschränkte Aussagekraft.

Aus diesem Grund setzten GÁBOR et al. (1998) erstmals die computergestützte

Echotexturanalyse ultrasonographisch erzeugter B-Bilder zur Beurteilung des Hodengewebes

ein, um eine Aussage über die Hodenfunktion und damit auch die Fertilität des Bullen machen

zu können. In der Regel wird dabei der mittlere Grauwert bestimmt, welcher einen

eindimensionalen Parameter darstellt und damit nur eine Aussage über die relative Häufigkeit

von Pixeln mit bestimmten Grauwerten in einem B-Bild ermöglicht (GRAUE 2002). Mit

neueren Softwareprogrammen ist es seit einigen Jahren auch möglich eine zweidimensionale

Graustufenanalyse durchzuführen (SZCZYPINSKÌ 1998), mit deren Hilfe man auch Aussagen

über die räumliche Verteilung der Grauwerte treffen kann. Dies hat beispielsweise die

Sensitivität bei der Erkennung zyklischer Veränderungen am Endometrium des Rindes erhöht

(SCHMAUDER 2003), wurde aber bisher nicht zur Untersuchung des Hodens eingesetzt. In

verschiedenen Studien konnten bereits mehrfach, sowohl in der Human- (BATTAGLIA et al.

2000, 2001) als auch in der Veterinärmedizin (SCHEIBENZUBER 2005), Zusammenhänge

zwischen der Hodenfunktion und dem Blutfluss der A. testicularis aufgestellt werden. So

zeigten farbdopplersonographische Untersuchungen, dass Zusammenhänge zwischen dem

testikulären Blutfluss und der Gesamtspermienzahl bestehen. Ein weiteres neues Verfahren zur

Objektivierung andrologischer Befunde stellt die durchflusszytometrische Untersuchung nach

Fluoreszenzfärbung der Spermien dar. Durch die Anwendung unterschiedlicher Farbstoffe

können verschiedenste Zellorganellen und deren Funktion analysiert und so eine mögliche

Schädigung der Spermienzellen nachgewiesen werden (KRIENKE 2003; WU 2005). Studien

haben gezeigt, dass eine experimentell induzierte skrotale Hyperthermie zu einer

Beeinträchtigung des Hodengewebes und der Spermien nach einem zeitlich festgelegten

Schema führt (SAACKE et al. 1994; SETCHELL 1998)

Ziel der vorliegenden Studie war es, anhand eines solchen Modells zu überprüfen, inwieweit

die dadurch provozierten Alterationen des Hodengewebes auf der Basis der zweidimensionalen

Graustufenanalyse sonographischer B-Bilder sowie farbdopplersonographischer

Blutflussmessungen der A. testicularis darzustellen sind. Eine durchflusszytometrische

Analyse der Spermien nach Dihydrorhodamin-Färbung sollte außerdem Aufschluss darüber

geben, inwieweit diese zur Messung der Synthese reaktiver Sauerstoffspezies geeignet ist.

- 2 - Literatur

2 Literatur

2.1 Anatomie von Hoden und Nebenhoden

2.1.1 Hoden und Nebenhoden des Bullen

Hoden und Nebenhoden gehören zur keimbereitenden und keimleitenden Funktionsgruppe

des männlichen Geschlechtsapparats. Beide Organe sind paarig angelegt und für

Samenzellproduktion, -reifung und -transport sowie für die Bildung von Testosteron

verantwortlich. Die Bullenhoden liegen längsoval im Hodensack (Skrotum). Der

Nebenhodenschwanz (Cauda epididymidis) bildet den tiefsten Punkt im Skrotum, dorsal

gefolgt vom Nebenhodenkörper (Corpus epididymidis), der dem Hoden medial anliegt. Der

Nebenhodenkopf (Caput epididymidis) liegt auf dem Hoden (Abb.2.1).

Der Hoden wird eng vom Bauchfell, der Tunica vaginalis, umschlossen. Mit der Tunica

vaginalis ist die bindegewebige Organkapsel des Hodens, die Tunica albuginea testis, fest

verbunden. Diese hält das Hodenparenchym zusammen. Bindegewebssepten strahlen von der

Tunica albuginea radiär ins Innere des Hodens und bilden die Septula testis. Im Zentrum des

Hodens vereinigen sie sich zum längs verlaufenden Mediastinum testis. Eingebettet im

Hodenparenchym befinden sich die Tubuli seminiferi contorti, recti und das mittig gelegene

Rete testis mit den abgehenden Ductuli efferentes (Abb. 2.1). Die erwähnten Strukturen

dienen der Spermatogenese (GASSE 1999).

Tubuli seminiferi contorti

Septula testis

Ductus epididymidis Cauda epididymidis

Abb. 2.1 : Schematische Darstellung eines Bullenhodens mit Nebenhoden (modifiziert nach CERVENY et al. 2005)

Rete testis

Tunica albuginea

Mediastinum testis

A. testicularis und Plexus pampiniformis

Caput epididymidis

Ductuli efferentes

Ductus deferens

Corpus epididymidis

- 3 - Literatur

Die Hodendimensionen von Holstein-Friesian Bullen variieren in Abhängigkeit vom Alter der

Tiere. Nach KRAUSE (190) weisen Tiere mit einem Alter von 1 bis 1,5 Jahren einen

Hodensackumfang von 30 cm, ein Hodensackvolumen von 1,2 Litern, eine Hodenlänge von

8,5 cm sowie eine Hodendicke von 4,5 cm auf.

2.1.2 Arterielle und venöse Gefäßversorgung des Bullenhodens

Der Hoden des Bullen wird durch die A. testicularis mit Blut versorgt (Abb. 2.2). Diese

entspringt direkt aus der A. abdominalis und verläuft entlang der Bauchwand in der Plica

vasculosa zum tiefen Leistenring. Bei Erreichen des Samenstrangs beginnt das Gefäß sich

stark zu winden, so dass 7 Meter des Gefäßes auf 10 cm Samenstranghöhe

zusammengedrängt werden (NICKEL et al. 1996; CERVENY et al. 1999). Bei Erreichen des

proximalen Hodenpols geht die Arterie in einen gestreckten Verlauf am Margo epididymidis

über (FEHLINGS 1976) und teilt sich bei Erreichen des distalen Hodenpols in einen Ramus

lateralis und medialis auf. Diese bilden nach HEES et al. (1990) eine netzartige Struktur, das

Stratum arteriosum, an der lateralen bzw. medialen Seite des Hodens. Vom Stratum

arteriosum ausgehend laufen die Gefäße als Zentripetalarterien, die Tunica albuginea

penetrierend, in Richtung Mediastinum testis. Dort kommt es zu einer Aufknäuelung mit

Abgabe mehrerer größerer Äste in die peripheren Regionen des Hodens sowie kleiner Äste an

das Rete testis (AMSELGRUBER und SINOWATZ 1987). Die Ausbildung eines feinen

Kapillarsystems in der Peripherie dient der Versorgung der Tubuli seminiferi contorti und

recti (AMSELGRUBER et al. 1986).

Der venöse Abfluss wird über Gefäße gewährleistet, die das arterielle System eng begleiten.

Im Bereich der Tubuli seminiferi contorti und recti befindet sich ein ausgespanntes venöses

Netz in direkter Nachbarschaft zu den arteriellen Gefäßen (HEES et al. 1990). Bei Erreichen

der Tunica albuginea bildet sich erneut ein verzweigtes, venöses System, das Stratum

venosum, von wo aus das Blut über einen medialen und lateralen Venenast in Richtung

Samenstrang abfließt (HEES et al. 1990). Auf Höhe des Samenstrangs wird die

schleifenförmig verlaufende A. testicularis rankenartig vom stark verästelten venösen System,

dem Plexus pampiniformis, umspannt (Abb. 2.2). Dieser dient sowohl dem venösen

Rücktransport des Blutes als auch der Thermoregulation des Hodens (NICKEL et al. 1996;

CERVENY et al. 1999).

- 4 - Literatur

Abb. 2.2: Ausschnitt eines Korrosionspräparats der A. testicularis und des Plexus pampiniformis im Bereich des Samenstrangs (modifiziert nach CERVENY et al. 2005)

2.1.3 Wärmeregulation des Hodens

Die Temperatur des Hodengewebes muss stetig 2 bis 6 °C unterhalb der physiologischen

Körperkerntemperatur liegen, um eine Produktion fertiler Spermien sicherzustellen (WAITES

1970; KASTELIC et al. 2000). Die verringerte Hodentemperatur im Vergleich zur

Körperkerntemperatur wird durch die extraabdominale Lage der Gonaden in Verbindung mit

einer Reihe weiterer Mechanismen erreicht:

Durch die Verknäuelung von A. testicularis und Plexus pampiniformis wird das arterielle, in

den Hoden fließende Blut auf Grundlage des Gegenstromprinzips vom venösen Blut

abgekühlt (COULTER u. KASTELIC 1994).

Plexus pampiniformis

A. testicularis

Plexus pampiniformis

A. testicularis

- 5 - Literatur

Des Weiteren entspannt sich bei einer Erwärmung der Hoden die unterhalb der Skrotalhaut

liegende Tunica dartos, welche aus feinen Muskelzellen besteht, sowie der Musculus

cremaster. Die auf diese Weise entstehende Oberflächenvergrößerung des Skrotums und die

sich vergrößernde Entfernung zwischen Hoden und Körper sorgen für einen erhöhten

Wärmetransfer über die Haut und eine geringere Beeinträchtigung der Hoden durch die

Körperkerntemperatur (HARTIG 1954; SETCHELL 1978).

BLAZQUEZ et al. (1988) stellten fest, dass die Skrotalhaut mit besonders vielen Schweiß-

und Talgdrüsen ausgestattet ist und dabei fast kein Unterhautfettgewebe besitzt.

KASTELIC et al. (2000) verwiesen auf das komplexe Blut- und Lymphgefäßsystem unter der

dünnen, fast haarlosen Haut. Diese Gegebenheiten machen eine geringere Hodentemperatur

im Vergleich zur Körperkerntemperatur durch Verdunstungskälte, erhöhten Wärmetransfer

über die Haut und fehlende Isolierung möglich.

- 6 - Literatur

2.2 Grundlagen und Technik der Sonographie

2.2.1 Prinzip des Ultraschalls

Die Sonographie beruht auf der Erzeugung von Ultraschallwellen durch piezoelektrische

Kristalle. Diese befinden sich im Schallkopf und erzeugen impulsartige Schallwellen, die von

den untersuchten Strukturen unterschiedlich stark reflektiert werden. Die eintreffenden

Signale werden vom Ultraschallgerät in Spannungssignale umgewandelt und diese wiederum

in Bildpunkte mit 256 verschiedenen Grautönen konvertiert (GIESE 1997). Je höher die

Konsistenz des untersuchten Gewebes ist, desto stärker werden die Schallwellen reflektiert

und umso heller die sich daraus ergebenden Bildpunkte dargestellt (GLADISCH 1993).

2.2.2 Computergestützte Graustufenanalyse sonographischer B-Bilder

Die computergestützte Graustufenanalyse (GSA) ermöglicht eine objektive Grauwertanalyse

von B-Bildern. Mit Hilfe der GSA können unterschiedliche Parameter bestimmt werden. Bei

der eindimensionalen Analyse kann die Häufigkeitsverteilung der Grauwerte, nicht aber die

Lage der einzelnen Töne zueinander bestimmt werden. Ein auf diese Weise ermittelter

Grauwert zweier Bilder kann somit trotz unterschiedlicher Textur identisch sein (HERMES

1998) (vergleiche Abb. 2.3).

Abb. 2.3: Eindimensionale Grauwerthistogramme zweier unterschiedlicher Schwarz-Weiß-Bilder (HERMES 1998)

Grauwerttextur

Histogramme

Grauwerte

- 7 - Literatur

Neben der eindimensionalen Analyse gibt es die Möglichkeit, die B-Bilder zweidimensional

auszuwerten, d.h. die räumliche Verteilung der Pixel zu beurteilen. Diese Analyseform

ermöglicht eine genauere Aussage über die Echotextur (SZCZYPINSKÌ 1998).

SCHMAUDER (2003) nutzte diese Analyseparameter für sonographische Untersuchungen

zyklusbedingter Veränderungen der Echotextur des Endometriums der Kuh. Es zeigte sich,

dass die „Homogenität“ als ein Echotexturparameter zweiter Ordnung in der Lage war, die

östrogenbedingten Änderungen in der Echotextur um den Zeitpunkt des Östrus darzustellen.

Mit Hilfe der computergestützten Analyse können nach HERMES (1998) wesentlich feinere

Unterschiede zwischen den aus 256 Graustufen bestehenden Ultraschallbildern festgestellt

werden als mit dem bloßen Auge. Dieses kann nur zwischen maximal 30 Graustufen

unterscheiden. Nach Ansicht der Autoren ist dies der Grund für häufig unbemerkte

Veränderungen innerhalb der Graustufen bei subjektiven, mit dem Auge erfolgten

Bewertungen sonographisch erstellter B-Bilder. Ein weiterer Vorteil der computergestützten

Analyse besteht in der Schnelligkeit der Auswertung sowie der Möglichkeit der Speicherung

aller Daten. GABOR et al. (1998) nutzten die Computeranalyse von B-Bildern zur

untersucherunabhängigen, objektiven Beurteilung von Struktur und Funktion des Hodens.

DELORME und ZUNA (1995) weisen allerdings darauf hin, dass mit der computergestützten

Echotexturanalyse keine Artefakte erkannt werden können. Laut HERMES (1998) sollten

sichtbare Artefaktbereiche bei der Bestimmung der Interessenregionen (ROI = regions of

interest) ausgegrenzt werden. Auf diese Weise ist es möglich, mittels computergestützter

Echotexturanalyse auch kleinste morphologische Veränderungen zu identifizieren.

2.2.3 Grundlagen der Dopplersonographie

Die Dopplersonographie basiert auf der Messung der Frequenzverschiebung, des so

genannten Doppler-Shifts, zwischen gesendeten und empfangenen Schallwellen. Dieser

entsteht, wenn Sender und Empfänger sich relativ zueinander bewegen (GIESE 1997).

Im Fall der Untersuchung des Blutflusses reflektieren die sich bewegenden Blutkörperchen

die von der Ultraschallsonde ausgesandten Schallwellen, wodurch sich deren Frequenz ändert

(GIESE 1997). Die Frequenzverschiebung wird vom Dopplergerät gemessen und kann farbig

kodiert auf dem sonographischen B-Bild dargestellt werden. In der Regel werden positive

Frequenzverschiebungen, welche bei einem sich auf den Schallkopf zubewegenden Blutfluss

- 8 - Literatur

entstehen, rot dargestellt. Bewegen sich die Blutkörperchen dagegen vom Schallkopf weg, so

kommt es zu einem negativen Doppler-Shift, welcher üblicherweise blau erscheint

(DUDWIESUS 1995).

Werden die Frequenzverschiebungen in einem Diagramm in Abhängigkeit von der Zeit

aufgetragen, entstehen bei arteriellen Blutflüssen Dopplerwellen mit hoher Amplitude

während der Systole und niedriger Amplitude während der Diastole (DUDWIESUS 1995)

(vergleiche Abb. 2.4).

S = maximale Frequenzverschiebung [Hz] D = enddiastolische Frequenzverschiebung [Hz] TAMF = mittlere, maximale Frequenzverschiebung über einen Herzzyklus [Hz] M = minimale Frequenzverschiebung [Hz] Abb. 2.4: Schematische Darstellung einer Dopplerwelle (modifiziert nach DIAZ PEINADO 2003)

- 9 - Literatur

2.2.4 Auswertung der Dopplerkurven

Die Beurteilung des Blutflusses kann qualitativ, quantitativ sowie semiquantitativ anhand der

Auswertung der Dopplerwellen erfolgen. In der vorliegenden Arbeit wurde der testikuläre

Blutfluss quantitativ und semiquantitativ beurteilt, so dass im Folgenden nur diese

Auswertungsmethoden näher erläutert werden.

Am häufigsten werden zur semiquantitativen Beurteilung des Blutflusses in der

Dopplersonographie der von POURCELOT (1974) beschriebene Resistance Index (RI) und

der von GOSLING und KING (1975) definierte Pulsatility Index (PI) herangezogen.

Die Berechnungsformeln der Dopplerindices lauten:

RI = (S-D) / TAMF

PI = (S-M) / TAMF

Bei kontinuierlichem diastolischen Blutfluss konnten von THOMPSON et al. (1988) keine

Unterschiede in Bezug auf die Wertigkeit der genannten Dopplerindices aufgeführt werden.

Treten Nullflüsse auf, darf nach FENDEL und SOHN (1989) der RI auf Grund falscher

Werterstellung nicht angewendet werden.

Weiterhin werden bei der quantitativen Auswertung die Blutflussgeschwindigkeiten zur

Beurteilung des Blutflusses herangezogen. Hierbei wird die mittlere Blutflussgeschwindigkeit

(TAMV = time averaged maximum velocity) angegeben, welche sich nach FENDEL und

GANS (1993) aus der Formel der mittleren Frequenzverschiebung (TAMF) und dem Winkel

α zwischen Dopplerstrahl und Blutflussrichtung ergibt:

TAMV = TAMF x cos α

- 10 - Literatur

2.3 Sonographische Untersuchungen am Hoden

2.3.1 Subjektive Beurteilung am Hoden erstellter B-Bilder

Die Untersuchung mittels Ultraschall stellt nach LOVE (1992) eine geeignete Methode zur

Beurteilung von Größe und Volumen der Hoden dar. CARTEE et al. (1986) beurteilten

sonographisch das Hodengewebe von Bullen und stellten dabei fest, dass dieses eine

homogene und hypoechogene Struktur aufweist. Das im Zentrum des Hodens gelegene

Mediastinum testis war dagegen hyperechogen.

Bei einer akuten Orchitis kommt es nach LÜERSSEN und JANTHUR (2001) zu einer

Größenzunahme und rundlicheren Form der Hoden des Hundes. Die sonographisch

darstellbare Struktur des Hodengewebes blieb zunächst homogen und hypoechogen, mit

fortschreitender Krankheitsdauer wurde diese aber zunehmend inhomogen mit vermehrt

echodichten Bereichen.

LOVE (1992) konnte mit Hilfe der B-Sonographie an Hengsthoden klinisch und palpatorisch

unauffällige tumoröse Entartungen des Hodengewebes nachweisen. Die veränderten Areale

stellten sich in der Regel heterogen mit lokaler Begrenzung dar. Neben tumorösen

Entartungen können nach SIDIBÉ et al. (1992) auch multifokale Veränderungen im Hoden

wie Fibrosierungen und Abszesse ultrasonographisch festgestellt werden.

Nach Aussage von GLATZEL et al. (1996) kann bei der Darstellung der Hoden im

sonographischen B-Bild eine deutlich genauere Aussage über die Zuchttauglichkeit des

Bullen gemacht werden als mit einer ausschließlich klinischen Untersuchung. Mittels

Ultraschallanalyse an Hodenpaaren geschlachteter Bullen konnten die Autoren injiziertes

Eisen und gesättigte NaCl-Lösung als umschriebene, lokale, hyperechogene Bereiche

nachweisen. Injiziertes Wasser stellte sich erwartungsgemäß in Form von anechogenen

Gewebslücken dar. Auf dieser Grundlage konnten in einem Folgeversuch bei 100 klinisch

und palpatorisch unauffälligen Tieren 24 pathologische Hodenveränderungen wie

Entzündungsreaktionen, Ödeme und Kalzifikationen sonographisch dargestellt werden.

GOULETSOU et al. (2004) inokulierten in die Hoden von 9 Schafböcken einen isolierten

bakteriellen Erreger (Arcanobakterium pyogenes) um experimentell eine Orchitis auszulösen.

In Anschluss untersuchten sie die Tiere klinisch und führten Ultraschalluntersuchungen an

den Hoden durch. Histologische Untersuchungen der Hoden wurden mit Hilfe zeitversetzter

- 11 - Literatur

Euthanasie jeweils eines Tieres ab Tag 3 nach vollzogener Inokulation durchgeführt. Die

Ultraschalluntersuchungen, sowie die Erhebung der klinischen Befunde, wurden in den ersten

30 Tagen zweimal wöchentlich, im Anschluss bis Tag 70 einmal wöchentlich und bis

Versuchende (Tag 204) dann alle zwei Wochen durchgeführt.

Bei der klinischen Untersuchung konnte am Tag nach der Inokulation Fieber sowie eine

Schwellung des Skrotums aller Tiere festgestellt werden. Des weiteren fraßen die Schafböcke

schlecht und zeigten nur geringes Interesse an der Umwelt. Die ultrasonographische

Untersuchung ergab eine Verkleinerung der Hoden trotz einer skrotalen Schwellung. Die

Echogenität im Bereich der Inokulationen war zwischen Tag 3 und Tag 50 erhöht, welches

die Autoren in der akuten Phase auf eine, in der histologischen Untersuchung erkannte,

Mineralisation der Tubuli zurückführten. Im späteren Versuchsabschnitt führten

Fibrosierungen zur Darstellung einer echodichteren Struktur. Eine anechogene Zone um die

Hoden zwischen den Tagen 5 und 99 wurde von den Autoren auf eine entzündungsbedingte

Flüssigkeitsansammlung zurückgeführt. Bei der histologischen Auswertung der Organe

konnte ein subkutanes Ödem, sowie eine Ödematisierung der testikulären Tuniken festgestellt

werden. Des Weiteren beschreiben die Autoren die Infiltration von neutrophilen Granulozyten

und Leukozyten in das Hodengewebe sowie eine Auflösung des epithelialen Zellverbandes.

Sie gehen aufgrund aller erhobenen Befunde von einer Infertilität der Schafböcke über eine

Zeitspanne von 2 Monaten nach dem Eingriff aus.

- 12 - Literatur

2.3.2 Darstellung hyperthermiebedingter Veränderungen mittels Echotexturanalyse

SIDIBÉ et al. (1992) führten einen Hyperthermieversuch an vier Bullen der Rasse

Schwedisch Rotbunt durch, wobei sie über einen Zeitraum von 96 Stunden die skrotale

Oberflächentemperatur von im Mittel 31,6°C auf durchschnittlich 35,4°C erhöhten. Die

subjektive Beurteilung der Echogenität des Hodengewebes erbrachte keine Veränderungen,

d.h. es waren keine Zusammenhänge zwischen der Echogenität des Hodenparenchyms und

der Spermaqualität festzustellen.

ARTEAGA et al. (2005) konnten, ebenso wie von SIDIBÉ und Mitarbeitern 1992

beschrieben, ohne computergestützte B-Bild-Analyse, d.h. mittels subjektiver Beurteilung,

keine Echogenitätsveränderungen ermitteln. In diesem Versuch wurde zusätzlich die

Beziehung zwischen der Pixel-Intensität, d.h. dem mittleren Grauwert der Pixel der am Hoden

erstellten B-Bilder, und der Samenqualität untersucht. Es wurden dazu zwei Versuchsgruppen

mit jeweils acht Fleischrindern gebildet. Bei Gruppe 1 fand eine Wärmeapplikation am Hoden

über 4 Tage, bei Gruppe 2 über 8 Tage statt. Im Anschluss an die Hyperthermie wurde das

Gewebe wöchentlich über einen Zeitraum von 8 Wochen mittels Ultraschall untersucht und

Nativsperma mikroskopisch analysiert. Es zeigte sich bei der dritten Untersuchung an Tag 14

nach Beendigung der Wärmeapplikation ein signifikanter Abfall (p<0,05) des mittels

Computeranalyse ermittelten mittleren Grauwerts im Hodenparenchym. Im Anschluss kam es

zu einem Wiederanstieg bis auf Ausgangsniveau an Tag 21 gefolgt von einem weiteren

signifikanten Abfall (p<0,05) an Tag 28. In den folgenden Messwochen stieg die Kurve

wieder an und lag ab Tag 42 auf Ausgangsniveau. Außer dem mittleren Grauwert wurde in

diesem Versuch noch der NP-Wert (Number of Pixels) erhoben. Dieser Wert stellt den

Grauton dar, welcher im analysierten Interessenbereich am häufigsten vorkommt. Der NP-

Wert fiel erst an Tag 21 signifikant (p<0,05) ab und stieg anschließend bis zum Ende des

Versuchs langsam wieder an, blieb aber deutlich unterhalb des Ausgangsniveaus. Die

Änderungen in der Vorwärtsmotilität sowie in der Anzahl normaler Spermazellen (siehe

2.4.3) traten zeitlich versetzt zu den Alterationen im B-Bild auf, d.h. zwischen den

Änderungen der sonographisch darstellbaren Hodenstruktur und einer drei Wochen später

gewonnenen Spermaprobe bestand eine hohe Korrelation.

BRITO et al. (2003) führten einen Hyperthermieversuch an Bos indicus sowie Bos indicus x

Bos taurus Bullen mit einer Gruppengröße von 6 bzw. 7 Tieren durch. In diesem Versuch

- 13 - Literatur

zeigten sich nach viertägiger lokaler Hodenerwärmung im Gegensatz zu den Ergebnissen von

ARTEAGA und Mitarbeitern (2005) keine Veränderungen des durch Computeranalyse

ermittelten mittleren Grauwerts.

2.3.3 Andere Anwendungsgebiete der computergestützten Echotexturanalyse bei der

sonographischen Untersuchung von Hodengewebe

Mit der eindimensionalen Graustufenanalyse gelang es HAMM und FOBBE (1995), am

Menschenhoden verschiedene Entwicklungsstadien anhand unterschiedlicher Grauwerte zu

differenzieren. Präpubertale Hoden stellten sich deutlich echoärmer als reife Hoden dar.

EVANS et al. (1996), CHANDOLIA et al. (1997) sowie GRAUE (2002) erhielten mit Hilfe

der Grauwertanalyse ähnliche Ergebnisse wie HAMM und FOBBE (1995) an Kälbern und

Jungbullen.

GABOR et al. (1998) konnten mittels eindimensionaler Graustufenanalyse eine hohe

Korrelation (r = -0,5) zwischen der Größe des Bereichs der Tubuli seminiferi des

Bullenhodens und dessen Echotextur aufzeigen. Der Bereich der Tubuli seminiferi wurde im

Anschluss an die Bestimmung des mittleren Grauwerts des Hodengewebes histologisch

bestimmt. Nach Aussage der Autoren lässt sich auf dieser Grundlage mittels Ultraschall eine

Aussage über die Hodenfunktion treffen.

Die eindimensionale Graustufenanalyse diente GLATZEL et al. (1996) der objektiven

Beurteilung pathologischer Prozesse im Bullenhoden. Mit ihrer Hilfe konnten bei klinisch

unauffälligen Tieren Entzündungen, Ödembildungen und Kalzifikationen nachgewiesen

werden. Nach Meinung der Autoren kann somit eine deutlich genauere Aussage über die

Zuchttauglichkeit gemacht werden als dies bei ausschließlich klinischer Untersuchung

möglich wäre.

2.3.4 Untersuchungen des testikulären Blutflusses

HORSTMANN et al. (1991) untersuchten den testikulären Blutfluss bei Männern mit

entzündlichen Erkrankungen der Hoden und Nebenhoden. Sie wiesen in ihren Versuchen eine

Hyperämie sowie einen reduzierten Widerstandsindex (RI) im Vergleich zu gesunden

Männern nach.

- 14 - Literatur

Der testikuläre Blutfluss von Tieren wurde bereits in mehreren Versuchen mit Hilfe der

Dopplersonographie bestimmt. POZOR und McDONNELL (2004) untersuchten mit dieser

Methode den testikulären Blutfluss beim Hengst. Dazu wurden die Dopplerindizes RI und PI

der A. testicularis ermittelt. Es zeigten sich trotz pathologischer Veränderungen der Hoden

einiger Tiere (Torsionen, Ödeme, Tumore) keine bzw. nur bei starker Ödematisierung

mittelgradige Erhöhungen der Widerstandswerte gegenüber Tieren mit physiologischen

Hodenbefunden.

Auch beim Hund wurde der testikuläre Blutfluss farbdopplersonographisch dargestellt. Dabei

stellten GUMBSCH et al. (2002) fest, dass der supratestikuläre Blutfluss der A. testicularis

nicht von Gewicht, Rasse bzw. testikulärem Volumen abhängig ist.

WITTE (1999) überprüfte bei Bullen an der A. testicularis die Blutflussgeschwindigkeit, den

RI sowie den PI im Hinblick auf Tageszeit und Alter der Tiere, krankhafte Veränderungen der

Hoden sowie die Wirkungsweise von Sedativa und sexueller Stimulation. Mit zunehmendem

Alter der Bullen und bei Sedation der Tiere sank die mittlere Blutflussgeschwindigkeit und

die Werte für RI bzw. PI stiegen. Tageszeit sowie sexuelle Stimulation hatten dagegen keine

Auswirkungen auf den testikulären Blutfluss. Die Auswirkungen pathologischer

Veränderungen waren verschieden. Eine einseitige Hodentorsion führte zu einer erhöhten

mittleren Blutflussgeschwindigkeit sowie zu verringerten Widerstandswerten. Bei einem Tier

mit Hodenverkalkung kam es zu einer erhöhten mittleren Blutflussgeschwindigkeit ohne

Beeinflussung der anderen Messparameter. Hodendegenerationen stellten sich durch einen

verringerten systolischen sowie erhöhten diastolischen Blutfluss und erniedrigte

Widerstandswerte dar.

2.3.5 Zusammenhang zwischen testikulärem Blutfluss und Ejakulatbeschaffenheit

In der Humanmedizin wurden schon verschiedene Untersuchungen im Zusammenhang mit

Blutflussmessungen durchgeführt. BATTAGLIA et al. (2000) untersuchten Männer mit einer

Azoospermie, Oligozoospermie und Normospermie. Der Pulsatility Index (PI) der

transmediastinalen Arterie von Patienten mit einer Azoospermie war signifikant höher als bei

Patienten mit einer Oligozoospermie. Diese zeigten wiederum einen signifikant erhöhten PI

im Vergleich zu Männern mit einer Normospermie.

- 15 - Literatur

BIAGIOTTI et al. (2002) untersuchten Männer mit Genitalerkrankungen und damit

einhergehender Azoospermie, Oligozoospermie oder Normospermie. Sie konnten die

Ergebnisse von BATTAGLIA et al. (2000) bestätigen und stellten einen positiven

Zusammenhang zwischen der Spermatogeneserate und dem Resistance Index (RI) fest. Die

Autoren vermuten eine Bedeutung des RI als Indikatorwert für die Spermatogeneserate.

TARHAN et al. (2003) protokollierten ein höheres testikuläres Blutflussvolumen bei

gesunden Männern im Vergleich zu Patienten mit Varikocele. Es konnte ein positiver

Zusammenhang zwischen dem Blutflussvolumen und der Spermienkonzentration der

Ejakulate sowie dem Hodenvolumen hergestellt werden. Die Autoren vermuten einen

gestörten Energiemetabolismus im mikrozirkulatorischen Gefäßsystem der Männer mit

Varikocele.

Im Rahmen von experimentellen Studien an Ratten, bei denen mittels einer Ligatur der A.

testicularis der Blutfluss über einen Zeitraum von fünf Stunden um 30 % reduziert wurde,

stellten BERGH et al. (2001) deutliche Einbußen in der Spermaqualität fest.

SCHULZE (2004) beobachtete bei Besamungshengsten eine positive Korrelation zwischen

dem mittleren testikulären Blutfluss der A. testicularis und der Gesamtspermienkonzentration,

nicht aber zu anderen Spermaqualitätsparametern. Des Weiteren bestand kein Zusammenhang

zwischen RI sowie PI und den gemessenen Spermaparametern.

SCHEIBENZUBER (2005) untersuchte den PI und den mittleren Blutfluss der A. testicularis

von Hengsten. Es konnte keine Korrelationen zwischen dem PI sowie dem mittleren

Blutflussvolumen und dem Hodenvolumen, der Tageszeit sowie der Untersuchungswoche

hergestellt werden. Des Weiteren bestand kein Zusammenhang zwischen dem PI und der

Quantität sowie Qualität des Spermas und dem Alter der Tiere. Ein saisonaler Einfluss ließ

sich anhand eines erhöhten PI im Juli und Oktober, verglichen mit den Werten des Monats

Januar, protokollieren. Das mittlere Blutflussvolumen reduzierte sich bei regelmäßigem

Deckeinsatz und stand in positiver Korrelation zur Gesamtspermienzahl pro Ejakulat.

Zwischen der Fertilität und den genannten Blutflussparametern bestand kein Zusammenhang.

- 16 - Literatur

2.4 Spermienmorphologie, Spermatogenese und epididymale Spermien-

reifung

2.4.1 Spermienmorphologie und Funktion

Im Folgenden soll nur auf die für diese Arbeit wichtigen morphologischen Strukturen

eingegangen werden:

Zellkern

Unterhalb des Akrosoms liegt im basalen Drittel des Spermienkopfes der Zellkern. Das

Kernchromatin ist hochkondensiert, und seine lamellenartige Struktur ist auf den Austausch

der Histone durch Protamine zurückzuführen. Die kompakte Struktur des Chromatins schützt

die Erbinformationen vor Mutagenen und anderen schädlichen Substanzen (TÖPFER-

PETERSEN u. AURICH 2000; ROVAN 2001).

Plasmamembran

Die gesamte Samenzelle ist überzogen von der Zell- oder Plasmamembran. Sie ist eine

biologische Membran mit einer Lipiddoppelschicht und Modulen wie Glykoproteinen,

Proteoglykanen und Cholesterin. Der Anteil an ungesättigten Fettsäuren in den

Phospholipiden ist extrem hoch. Als Besonderheit zeichnet sich der extrem hohe

Cholesteringehalt im Kopfbereich der Membran aus, welcher eine reduzierte Fluidität an

dieser Stelle zur Folge hat (TÖPFER-PETERSEN u. AURICH 2000; ROVAN 2001)

Mitochondrien

Die Mitochondrien werden auch als Kraftwerke der Zelle bezeichnet. Sie liegen im

Mittelstück des Spermiums, sind längsoval und vorrangig für die Motilität der Zelle

verantwortlich. Untersuchungen haben ergeben, dass die Anzahl der Mitochondrien und die

damit verbundene Höhe des Mitochondrienmembranpotenzials (MMP) die Überlebensdauer

der Samenzellen bedingen. Säugetierzellen können aufgrund ihres hohen

Mitochondriengehalts Tage befruchtungsfähig bleiben. Die Struktur der Mitochondrien weist

eine lamellenartig angeordnete Innenmembran mit Mikrotubuli sowie eine sie umschließende

glatte Schicht aus Mantelfasern auf (TÖPFER-PETERSEN u. AURICH 2000).

- 17 - Literatur

Bei der Energiegewinnung und -bereitstellung kommt es in den Mitochondrien zur

Entstehung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), welche bei normalem Stoffwechsel im

Gleichgewicht zum antioxidativen System stehen (ROVAN 2001). Wird die Zelle

physikalischen oder chemischen Noxen ausgesetzt, entsteht nach SIKKA (2001) ein

Ungleichgewicht mit der Folge von oxidativem Stress für die Zelle. Dies kann je nach Menge

der ROS einen Funktionsverlust der Zelle bedingen oder gar zum Zelltod führen.

2.4.2 Spermatogenese und epididymale Spermienreifung

Im Keimdrüsenepithel des Hodens, den so genannten Tubuli seminiferi contorti, liegen von

Geburt an teilungsfähige Spermatogonien vor. Mit Eintritt in die Geschlechtsreife bedingt

eine steigende Konzentration der Hormone FSH und Testosteron die Induktion der

Spermatogenese (Abb. 2.5). Die Spermatogonien treten in eine erste Meiose mit Verdopplung

des diploiden Chromosomensatzes (= primäre Spermatocyte) ein gefolgt von einer weiteren

Meiose mit dem Ergebnis zweier diploider sekundärer Spermatozyten (SINOWATZ 2001).

Eine dritte Meioseteilung des diploiden Chromosomensatzes lässt nach JOHNSON et al.

(2000) die haploiden Spermatiden entstehen. Mit diesem Teilungsvorgang, welcher beim

Bullen ca. 45 Tage dauert, ist die Spermatocytogenese beendet.

Bei der nun folgenden Spermiogenese findet die Differenzierung der Spermatiden zu

hochspezialisierten Spermatozoen über einen Zeitraum von ca. 17 Tagen statt. Sie lässt sich in

vier Phasen unterteilen, die Golgi-, Kappen-, Akrosom- und Reifephase. In dieser Zeit kommt

es zur Anbildung des Spermatozoenschwanzes, einer Vakuolenbildung über dem apikalen

Bereich des Kerns und einer Verdichtung des Kerns durch einen Austausch typischer

Kernproteine gegen die spermienspezifischen Protamine. Die Mitochondrien bilden ab diesem

Zeitpunkt das Mittelstück, und es kommt zu einer zunehmenden Verlagerung des Plasmas in

Richtung Geißel. In der Reifephase kommt es zur Ausformung der typischen Spermienform

und zur Abschnürung des letzten Plasmarestes, dem Residualkörperchen (SINOWATZ 2001).

Es folgt die Freisetzung des Spermatozoons in das Lumen, die so genannte Spermiation.

- 18 - Literatur

Trotz der kompletten Ausstattung der Spermatozoen nach Freisetzung in das Tubuluslumen

sind diese noch nicht befruchtungsfähig. Es bedarf einer 8- bis 14-tägigen Reifungspassage

(ORGEBIN-CHRIST 1962; ROSS u. ENTWISTLE 1978) durch den Nebenhoden, in der die

Spermien die Bewegungs- sowie Befruchtungsfähigkeit erwerben (Abb. 2.5). Epididymale

Proteine werden in die Plasmamembran der Spermien eingebaut, Enzyme modifizieren

membraneigene Proteine, und es kommt zu Proteinumlagerungen, bevor die Zelle

befruchtungsfähig den Nebenhoden verlassen kann (SINOWATZ 2001). Verschiedene Ein-

und Umbauprozesse während der Nebenhodenpassage dienen nach TREVOR (2000) dem

Schutz des Spermiums vor chemischen und physikalischen Noxen bei Verlassen der

Gonaden.

2.4.3 Hyperthermiebedingte Veränderungen der Spermien

Es wurde bereits eine Reihe von Versuchen durchgeführt, bei denen die Auswirkungen einer

experimentell induzierten lokalen Hyperthermie am Hoden auf die Ejakulatbeschaffenheit

untersucht wurden.

EL AZAB (1966) untersuchte die Auswirkung einer lokalen Wärmeapplikation auf die

Spermatogenese, Spermienbeschaffenheit und Reifung der Spermien bei Höhenfleckvieh-

Bullen. In seiner Studie wurden die Hoden von fünf Bullen über einen Zeitraum von 1, 3, 6,

12 bzw. 18 Stunden mittels eines zirkulierenden, 43°C warmen Wasserbads erwärmt.

Abb. 2.5: Der Verlauf der Spermatogenese und der Nebenhodenpassage des Rindes (modifiziert nach BARTH u. OKO 1989 und JOHNSON et al. 1994)

- 19 - Literatur

Im Anschluss an die Erwärmung wurden Spermaproben bis zum Erreichen der

Ausgangsqualität zweimal wöchentlich untersucht. Die zwei Stiere mit vollzogener ein- bzw.

dreistündiger Wärmeapplikation zeigten eine Zunahme primärer Spermienanomalien

inklusive abgelöster Köpfe im Anschluss an Woche 2 mit einem Höhepunkt von 15 bzw. 22

% in Woche 3. Schwanzveränderungen traten zwischen der 4. und 7. Woche nach dem

Eingriff auf und fielen im Anschluss langsam wieder ab. Ab der 11. Woche lagen die Werte

pathologischer Spermien wieder auf Ausgangsniveau. Die drei Tiere mit einer 6-, 12- bzw.

18-stündigen Wärmeapplikation wiesen ebenfalls ab Woche 3 eine deutliche Zunahme

primärer Spermienanomalien mit einem Höhepunkt von 60 % in Woche 6 auf. Die Anzahl

loser Köpfe stieg schon in der zweiten Woche an und normalisierte sich im Anschluss an

Woche 3 wieder. Schwanzveränderungen ließen sich in dieser Gruppe nicht protokollieren.

Die Spermienkonzentration der Proben aller Tiere sank ab Woche 3 stark ab, und die Proben

enthielten zwischen Woche 3 und 7 viele Spermatogenese- und Epithelzellen. Das Maximum

dieser Zellen lag in Woche 3 bei 57*103/mm3. Je nach Dauer der Wärmeapplikation wurden

Minimalwerte in der Spermienkonzentration zwischen 4*105 (einstündige

Temperaturerhöhung, Woche 7) und 0,4*105 Spermien/mm3 (12- und 18-stündige

Applikation, Woche 4) erreicht. Erst nach der siebten Versuchswoche waren kaum noch

Zellen zu finden und die Anzahl vorwärtsmotiler Spermien stieg wieder an, bis in Woche 16

die Ausgangslage wieder hergestellt war. Der Autor vermutet eine Auflösung des

Zellverbandes im Bereich des Keimdrüsenepithels mit Abstoßung der einzelnen Schichten

nacheinander, bevor es zu einer Beeinträchtigung der Mitose kommt.

ROSS und ENTWISTLE (1978) führten eine zehn- bzw. zwanzigstündige lokale

Hodenerwärmung an jeweils zwei Bullen der Rasse Shorthorn durch. Zur Bestimmung der

Dauer der Entwicklungs- und Reifevorgänge der Spermien sowie des Maßes der

Gewebeschädigung wurde den Tieren vor Anlegen des Wärmeapplikationssystems 3H-

Thymidin intraarteriell am Hoden auf Höhe des Nebenhodenkörpers verabreicht. Während der

Erwärmung konnte eine durchschnittliche skrotale Oberflächentemperatur von 35°C

protokolliert werden. Nach Beendigung der Hyperthermie wurde das Ejakulat jeweils eines

Tieres mit erfolgter zehn- bzw. zwanzigstündiger Wärmeapplikation über 18 Wochen

zweimal wöchentlich auf Spermienkonzentration, Motilität und anormale Spermien hin

untersucht. Bei den anderen zwei Tieren wurden diese Parameter nur über 2 Wochen

untersucht, da im Anschluss eine einseitige Kastration erfolgte. Die Hoden der kastrierten

Tiere mit zehn- bzw. zwanzigstündiger applizierter Temperaturerhöhung dienten einer

- 20 - Literatur

histologischen Untersuchung zur Bestimmung des Maßes der Gewebsschädigung durch

exogene Wärmezufuhr. Von den zwei langfristig untersuchten Tieren zeigte das Tier mit

vollzogener zehnstündiger Wärmeapplikation einen kontinuierlichen Motilitätsabfall ab der

vierten Woche mit einem Tiefpunkt unterhalb von 10 % in Woche 7. Im Anschluss stiegen

die Werte wieder gleichmäßig an und verblieben ab Woche 14 auf Ausgangsniveau. Das Tier

mit erhaltener zwanzigstündiger Wärmeapplikation zeigte eine reduzierte Motilität von 50 %

in der vierten Woche gefolgt von einem Wiederanstieg der Werte (Woche 5) mit

anschließendem erneuten Abfall der Motilität auf 60 % in Woche 6. Ab Woche 7 variierten

die Werte leicht zwischen 70 und 80 % und lagen ab Woche 14 wieder konstant auf

Ausgangsniveau (80 %).

Die Konzentration der Spermien im Ejakulat des Tieres mit einer zehnstündigen

Wärmeapplikation brach zwischen der sechsten und dreizehnten Woche deutlich ein. Der

Tiefpunkt lag unterhalb von 200 Mio/ml und hielt während der Wochen 8 bis 11 an. Das Tier

mit einer zwanzigstündigen Wärmeapplikation zeigte starke Konzentrationsschwankungen

während der gesamten Versuchsphase ohne ersichtlichen Zusammenhang mit der

Wärmeapplikation. Der prozentuale Anteil anormaler Spermien stieg bei dem Tier mit

vollzogener zehnstündiger Wärmeapplikation deutlich zwischen den Wochen 3 und 9

(Maximalwert von 70 %) und fiel im Anschluss kontinuierlich wieder bis kurz über

Ausgangsniveau. Nach der zwanzigstündigen Wärmeapplikation zeigten sich zwei kurze

Anstiege anormaler Zellen auf 40 %, der erste konnte zwischen Woche 3 und 6, der zweite

zwischen Woche 11 und 13 protokolliert werden. Im Anschluss an Woche 6 bzw. 13 sanken

die Werte wieder bis auf Ausgangsniveau. Das Erscheinen 3H-Thymidin markierter Zellen im

Ejakulat der langfristig untersuchten Bullen konnte in den Wochen 4 und 5 sowie extrem

stark ab Woche 7 mit Höhepunkt in Woche 9 protokolliert werden. Schätzungen der

epithelialen Entwicklungszeit lagen bei durchschnittlich 13,4 Tagen, die epididymale

Transitzeit wurde auf 13,5 Tage eingeschätzt. Bei den histologischen Untersuchungen der

Hoden der zwei kastrierten Tiere zeigte sich eine deutlich stärkere Beeinträchtigung der

histologischen Gewebestruktur nach der zehnstündigen als nach der zwanzigstündigen

Wärmeapplikation. Die Autoren vermuten hier, genau wie bei den Spermaparametern, eine

tierindividuelle Empfindlichkeit.

VOGLER et al. (1991) testeten Vorwärtsmotilität, Konzentration und Morphologie der

Spermien an Nativsperma sowie aufgetauten Proben von sechs Holstein-Friesian Bullen nach

einer 48-stündigen Hyperthermie am Hoden. Die Spermaproben wurden zweimal wöchentlich

- 21 - Literatur

über 39 Tage nach beendeter Wärmeapplikation untersucht. Während der Hyperthermie lag

eine durchschnittliche skrotale Oberflächentemperatur von 34,8°C vor. Bei der Analyse der

Ejakulatbeschaffenheit zeigten die unverdünnten Nativproben 2 bis 3 Wochen nach der

Erwärmung eine um 20 % verringerte Vorwärtsmotilität im Vergleich zum Ausgangswert (70

%) mit anschließender Normalisierung auf Ausgangsniveau. In der ersten Woche nach

Beendigung der Wärmeapplikation konnten bei den Nativproben keine, bei den aufgetauten

Proben des entsprechenden Tages allerdings geringe Einbußen in der Vorwärtsmotilität im

Vergleich zu Tiefgefrierspermaproben aus Spermagewinnungen vor Versuchsbeginn

verzeichnet werden. Die Autoren vermuten trotz der im Nativsperma nicht sichtbaren

Einbußen auch während des epididymalen Transits eine Schädigung der Zellen durch die

Hyperthermie. Dieses wird ihrer Meinung nach an der verringerten Vorwärtsmotilität nach

zusätzlicher Stresseinwirkung durch Tiefgefrieren deutlich. Die Konzentration der

gewonnenen Spermaproben zeigte während der gesamten Versuchsphase keine signifikanten

Veränderungen. Der Gehalt primärer und sekundärer Veränderungen stieg deutlich ab Tag 9

an. Die Kurve erreichte Werte oberhalb von 80 % anormaler Zellen zwischen dem 18. und 21.

Tag nach der Wärmeapplikation und sank in den folgenden Messtagen stetig wieder bis kurz

über das Ausgangsniveau ab (Ausgangswert: 20 %). Die Kurve der Veränderungen wurde

dominiert von Kopfveränderungen (abgelöste Köpfe inklusive).

Im Jahre 1993 wiederholten VOGLER et al. ihren Hyperthermieversuch, untersuchten aber

keine Gefrierspermaproben. Die gewonnenen Ergebnisse der Spermaqualitätsanalyse

stimmten mit den 1991 gewonnenen Werten überein.

ARTEAGA et al. (2005) führten an Hoden von 16 Fleischrinderbullen ebenfalls einen

Hyperthermieversuch durch. Es wurden zwei Gruppen mit jeweils acht Tieren gebildet.

Gruppe 1 wurde einer Wärmeapplikation von vier, Gruppe 2 von acht Tagen unterzogen. Im

Anschluss an die Wärmeapplikation wurden Ejakulate über einen Zeitraum von acht Wochen

einmal wöchentlich analysiert. Als Qualitätsparameter wurden von den Autoren die

Vorwärtsmotilität sowie die Anzahl normaler Spermien gemessen. Zwischen dem 7. und 38.

Tag kam es zu einer signifikant reduzierten Vorwärtsmotilität beider Gruppen. Der Tiefpunkt

an Tag 21 wies bei Gruppe 1 einen Wert von 50 %, bei Gruppe 2 von 20 % auf. Es folgte ein

kontinuierlicher Wiederanstieg der Werte von Gruppe 1 bis auf Ausgangsniveau, Gruppe 2

verblieb bis Versuchende leicht darunter (Ausgangswert beider Gruppen: 75 %). Der Gehalt

normaler Spermien war zwischen den Tagen 10 und 31

- 22 - Literatur

signifikant erniedrigt. Der Anteil sank von 75 % (Ausgangswert) auf einen Minimalwert von

30 (Gruppe 1) bzw. 10 % (Gruppe 2) an Tag 21. Es folgte eine Normalisierung der Werte von

Gruppe 1 bis auf Höhe des Ausgangsniveaus, Gruppe 2 verblieb bis Versuchende leicht

darunter. Die Versuchsergebnisse zeigten eine Abhängigkeit der Schädigungen von der

Wärmeapplikationszeit.

WILDEUS und ENTWISTLE (1986) kombinierten einen 48-stündigen lokalen

Hyperthermieversuch an sechs Bullen mit einem einseitigen Ligationsversuch der A.

testicularis. Es wurden drei Paare gebildet, deren gesamte Versuchsphase sich immer auf 34

Tage belief. Paar A wurde acht Tage nach Versuchsbeginn operiert und der Hoden direkt im

Anschluss isoliert. Bei Paar B erfolgte die Operation nach 14 und bei Paar C nach 20 Tagen.

Aufgrund des festgelegten Versuchszeitraums kam es nach 26 (Paar A), 20 (Paar B) bzw. 14

Tagen (Paar C) zur Schlachtung der Tiere mit anschließender histologischer Untersuchung

des Hodengewebes. Nach der Operation wurden bis zum Zeitpunkt der Schlachtung alle zwei

Tage Ejakulate gewonnen und der Gehalt anormaler Zellen untersucht. Der Gehalt abgelöster

Köpfe von Paar A stieg ab Tag 16 nach vollzogener Operation mit einem Höhepunkt an Tag

20 an und erreichte am letzten Messtag vor der Schlachtung (Tag 26) wieder das

Ausgangsniveau. Paar B wies diesen Anstieg ab Tag 12 mit einem Höhepunkt an Tag 14 auf

und fiel bis zum Zeitpunkt der Schlachtung nur geringgradig wieder ab. Bei Paar C konnten

bis zum Zeitpunkt der Schlachtung keine Veränderungen protokolliert werden. Der Gehalt an

Spermien mit Schwanzveränderungen stieg bei Paar A 8 Tage zeitverzögert zu den abgelösten

Köpfen an. Die Werte erhöhten sich stetig bis zum Zeitpunkt der Schlachtung. Paar B zeigte

nur an Tag 10, Paar C an Tag 4 eine punktuelle Erhöhung des Gehalts an Spermien mit

anormalen Schwänzen. Die Autoren vermuten eine Schädigung der Spermien durch den

Eingriff in die unterschiedlichen Stadien der frühen Spermienentwicklung. Des Weiteren

werden tierindividuelle Empfindlichkeiten vermutet.

WU (2005) führte einen 48-stündigen lokalen Hyperthermieversuch am Hoden von vier

Bullen der Rasse deutsches Fleckvieh durch. Die durchschnittliche skrotale

Oberflächentemperatur während der Erwärmung lag bei 35,5°C. Im Anschluss an die

Wärmeapplikation wurden über einen Zeitraum von 61 Tagen dreimal wöchentlich und in 22

weiteren Tagen einmal wöchentlich Motilität, Konzentration und Morphologie untersucht. Es

zeigte sich ein Rückgang der Vorwärtsmotilität zwischen den Tagen 12 und 28 mit

Tiefpunkten unterhalb von 40 % an den Tagen 12, 19, 23 und 26. An Tag 16 zeigte sich ein

- 23 - Literatur

punktueller Anstieg der Vorwärtsmotilität auf 70 %. Im Anschluss an Tag 26 stiegen die

Werte wieder an und erreichten an Tag 30 das Ausgangsniveau (80 %). Außer einem

punktuellen Einbruch an Tag 51 mit einem Wert von 65 % blieb die Vorwärtsmotilität ab Tag

30 auf Höhe des Ausgangswerts. Die Konzentration der Ejakulate wies einen Abfall ab Tag

12 mit Tiefpunkten tierindividuell zwischen Tag 28 und 30 auf. Im Anschluss kam es zu

einem Wiederanstieg der Werte gefolgt von einem weiteren Abfall der Konzentration

zwischen den Tagen 42 und 51. Die Tiefpunkte erreichten tierindividuell Werte zwischen 0,6

und 0,2 Mrd./ml. Ab Tag 51 lagen die Werte aller Proben wieder stabil auf Höhe des

Ausgangsniveaus (tierindividuell entsprechend zwischen 1*109 und 2,1*109

Spermazellen/ml). Als weitere Spermaqualitätsparameter untersuchte WU (2005) den Gehalt

primärer und sekundärer Spermienanomalien. Der prozentuale Anteil primärer

Spermienanomalien stieg ab Tag 16 an und zeigte an Tag 23 sein Maximum von 30 %.

Sekundäre Spermienanomalien traten schon ab Tag 9 auf und erreichten ihr Maximum von 60

% an Tag 14. Es folgte ein kontinuierlicher Abfall beider Anomalieformen mit Erreichen des

Ausgangsniveaus ab Tag 44.

In den vorliegenden Arbeiten konnten sehr häufig tierindividuelle Unterschiede in der

Reaktionsstärke und -zeit protokolliert werden (WILDEUS u. ENTWISTLE 1986;

WILLIAMSON 1974; ROSS u. ENTWISTLE 1978; VOGLER et al. 1991 und 1993; WU

2005). Laut den Autoren WILLIAMSON (1974) und ROSS und ENTWISTLE (1978) sind

die unterschiedlichen zeitlichen Reaktionen auf tierindividuell unterschiedliche epididymale

Transitzeiten zurückzuführen. Den Grund für die verschieden starken Reaktionen auf die

Hyperthermie sahen SKINNER und LOUW (1966) und ROSS und ENTWISTLE (1978) in

einer unterschiedlichen genetischen Resistenz sowie tierindividuellen Empfindlichkeit. Nach

SKINNER und LOUW (1966) zeigen an warme Klimazonen adaptierte Bullenrassen eine

geringere Sensitivität gegenüber erhöhten Hodentemperaturen als Tiere gemäßigter

Klimazonen. VOGLER et al. (1993) hegten den Verdacht, dass die unterschiedlichen

Empfindlichkeiten einzelner Tiere einer Rasse auf eine mangelnde Möglichkeit einer

ausreichenden Thermoregulation zurückzuführen ist.

- 24 - Literatur

Das zeitverzögerte Auftreten verschiedener Spermienanomalien basiert nach EL AZAB

(1966), WILDEUS und ENTWISTLE (1986) und VOGLER et al. (1993) auf einer

Schädigung unterschiedlicher Stadien der frühen Zellentwicklung. KHAN und BROWN

(2002) führten einen einstündigen Hyperthermieversuch bei 42°C an Ratten durch und

beschrieben eine höhere Sensibilität sich teilender Zellen. Der Zelltod im Keimdrüsenepithel

erhöhte sich 15 Stunden nach der Wärmeapplikation aufgrund der Auslösung einer Apoptose

deutlich und erreichte das Ausgangsniveau etwa 24 Stunden nach Ende der Wärmeexposition.

Spermatiden waren von der Apoptose nicht betroffen.

- 25 - Literatur

2.5 Durchflusszytometrie

2.5.1 Prinzip des Durchflusszytometers

Das Prinzip der Durchflusszytometrie wurde von KRIENKE (2003) sehr detailliert

beschrieben. Daher soll im Folgenden nur auf die wichtigsten Grundzüge eingegangen

werden.

Bei der Durchflusszytometrie können die Größe, die Granulation sowie nach Behandlung mit

Fluorochromen die Fluoreszenz von Zellen bestimmt werden. Mittels eines Argonionenlasers

mit einer Wellenlänge von 488 nm werden einzelne, durch eine Messzelle laufende Zellen

einem Lichtstrahl ausgesetzt (BECTON DICKINSON 1999; GÖTTLINGER et al. 1999). Die

auf die Zellen treffenden Wellen werden gebeugt, wodurch in gleich bleibender Achse mit

Hilfe des Forward Scatters (FSC) die Zellgröße gemessen wird (Abb. 2.6). Der Side Scatter

(SSC) misst im 90°-Winkel zum Laserstrahlengang die Reflexion der Laserwellen durch die

Zelle und stellt so Informationen über die Granulation des Zellinhalts dar.

Abb. 2.6: Entstehung von Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht während der durchflusszytometrischen Analyse (mod. nach BECTON DICKINSON 1999)

Vorwärtsstreulicht FSC -Zellgröße-

Seitwärtsreflexion SSC -Zellgranulation

Argonlaser 488 nm

- 26 - Literatur

Des Weiteren werden verschiedenfarbige Fluoreszenzen der durch den Laser angeregten

Zellen gemessen (GROGAN u. COLLINS 1990). Die Art der Fluoreszenz ist abhängig von

der Vorbehandlung der Zellsuspension mit entsprechenden Fluorochromen. Die Emission

wird mit Hilfe verschiedener Photomultiplikatordetektorröhren (PMT) im 90°-Winkel zum

Laserstrahl gemessen (Abb. 2.7). Für die unterschiedlichen Fluoreszenzen stehen bei den

routinemäßig eingesetzten Durchflusszytometern drei verschiedene Filter zur Verfügung. Der

FL-1 (grüne Fluoreszenz), der FL-2 (orange Fluoreszenz) sowie der FL-3 Filter (rote

Fluoreszenz).

Das nachfolgende Schema (Abb. 2.7) soll den Vorgang der Durchflusszytometrie

verdeutlichen.

- 27 - Literatur

MesszellePhotodiode

FSC

(

)

PMT

wahlweise FL 2

(orange Fluoreszenz)

oder FL 3

(rote Fluoreszenz)

PMT

SSC

Argon – Laser

488 nm

Halbspiegel

Messzelle

PMT wahlweise FL 2

(orange Fluoreszenz) oder FL 3

(rote Fluoreszenz)

PMT SSC

Halbspiegel

Argon-Laser

488 nm

Pro

be

Strahlengang d. emittierten

Lichts

FSC

48

8/1

0

530/30 4

88

/10

F

L 2

: 5

85

/42

Ba

nd

pass

filt

er

FL

3:

63

0 L

an

gp

ass

filt

er

PM

T

FL

1

(grü

ne

Flu

ore

szen

z)

Abkürzungen: PMT : Photomultiplikatordetektorröhren FSC : Forward Scatter SSC : Side Scatter FL1-3 : Fluoreszenzkanäle 1-3

Abb. 2.7: Schematische Darstellung des optischen Systems eines Durchflusszytometers (mod. nach BECTON DICKINSON 1999)

- 28 - Literatur

2.5.2 Bestimmung der DNA-Fragmentation mittels SCSA™-Färbung

Die SCSA™-Färbung dient der Untersuchung der Chromatinstabilität von Zellen (EVENSON

et al. 1991; LOVE u. KENNEY 1998). Eine bei der Probenvorbereitung zugesetzte Säure (pH

1,2) lässt die DNA je nach Stabilität denaturieren. Die Entstehung einzelsträngiger DNA kann

im Folgenden mit Hilfe des metachromatischen Farbstoffs Acridinorange, welcher bei

Bindung an doppelsträngige DNA grün und bei Bindung an einsträngige DNA rot

fluoresziert, nachgewiesen werden. Anhand von Punktwolken kann der Anteil rot

fluoreszierender Zellen, also geschädigter Zellen mit einzelsträngiger DNA, an der

Gesamtfluoreszenz (Grün- und Rotfluoreszenz) errechnet werden (BALLACHEY et al. 1987;

EVENSON et al. 1991). Der so erhaltene Wert wird nach EVENSON et al. (2002) als DNA-

Fragmentationsindex (DFI) bezeichnet. In einem Histogramm aufgetragen, betitelten

EVENSON et al. (2002) die Spermien mit einer hohen Rotfluoreszenz als DFI-Spermien

(Abb. 2.8).

Abb. 2.8: Häufigkeitsverteilung der DNA-Fragmentationsindex-Werte

DFI-Wert = Anteil der Rotfluoreszenz an der Gesamtfluoreszenz (modifiziert nach EVENSON et al. 2002)

- 29 - Literatur

BALLACHEY et al. (1987) und EVENSON et al. (1991) konnten eine negative Korrelation

(p<0.01) zwischen dem DFI-Wert und der Befruchtungsfähigkeit der Spermien herstellen. Je

mehr so genannte DFI-Spermien in der Probe enthalten waren, desto geringer war die

Fertilität.

Im Jahre 2002 wiesen EVENSON et al. auf einen erhöhten DFI-Wert aufgrund vermehrter

Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) hin. Die Bildung der ROS konnte auf das

Vorhandensein von Leukozyten oder aber chemischen sowie physikalischen Noxen

zurückgeführt werden.

Bei Hengsten (LOVE u. KENNEY 1999) und Bullen (KARABINUS et al. 1997; WU 2005)

führte eine lokale 48-stündige Isolierung des Hodens zu einem Anstieg der skrotalen

Oberflächentemperatur um durchschnittlich 3°C. LOVE und KENNEY (1999) untersuchten

die Proben täglich bis 60 Tage nach der Wärmeapplikation. Mittels SCSA™-Assay konnten

drei Plateaus mit erhöhten DFI-Werten protokolliert werden. Plateau 1 wurde von Tag 10 bis

Tag 24 nach Beendigung der Wärmeapplikation gemessen. Plateau 2 erstreckte sich von Tag

24 bis 33, und Plateau 3 erschien zwischen den Tagen 38 und 40. Die Autoren ordneten den

entsprechenden Zeiträumen eine Schädigung der Zellen bestimmter Stadien zu. Plateau 1

zeigte die Schädigung der Spermatiden, Plateau 2 der späten und Plateau 3 der frühen

primären Spermatozyten. Die Erhaltung initialer Werte in den ersten zehn Tagen nach der

Wärmeapplikation führen die Autoren auf einen Schutz der Samenzellen während des

epididymalen Transits zurück.

KARABINUS et al. (1997) untersuchten nach der Erwärmung Spermaproben dreimal

wöchentlich über einen Zeitraum von 21 Tagen. Es zeigte sich eine leichte Erhöhung des DFI

direkt nach der Erwärmung an den Tagen 3 und 6. An Tag 9 lag der Wert auf

Ausgangsniveau. In der folgenden Messperiode (Tag 12 bis 21) konnte eine deutliche

Zunahme des DFI protokolliert werden, was nach Aussage der Autoren auf eine Schädigung

der Spermatiden und Spermatozyten schließen lässt. Der Anstieg der DFI-Werte direkt im

Anschluss an die Temperaturerhöhung deutete nach KARABINUS et al. (1997) auf eine

Schädigung der Spermien während des epididymalen Transits hin.

WU (2005) fand bei Anwendung einer ähnlichen Versuchsanordnung über 61 Tage nach 48-

stündiger lokaler Hyperthermie am Hoden von Bullen der Rasse Deutsches Fleckvieh einen

starken Anstieg des DFI-Werts ab Tag 7 mit Höhepunkt an Tag 23 (Wert: 60 %) und

anschließendem kontinuierlichen Abfall bis kurz über den Ausgangswert. Zwischen den

Tagen 47 und 49 zeigte sich erneut eine geringgradige Erhöhung des DFI mit anschließender

- 30 - Literatur

Einstellung der Werte auf Ausgangsniveau. Die statistisch Auswertung ergab eine positive

Korrelation (r = 0.81) zwischen dem DFI und dem Prozentsatz an Spermien mit

Kopfanomalien an Tag 23.

2.5.3 Bestimmung reaktiver Sauerstoffspezies

Das übermäßige Vorliegen reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) ist häufig Ursache einer

mangelnden Fruchtbarkeit von Samenzellen (EVENSON et al. 1982; OCHSENDORF u.

PODDA 1999; HENKEL u. SCHILL 2000; SIKKA 2001). Als Hauptquelle von ROS sahen

OCHSENDORF und PODDA (1999) im Ejakulat vorhandene Leukozyten.

Genitaltraktentzündungen bei Menschen führten nach Versuchen von HENKEL und SCHILL

(2000) sowie SIKKA (2001) zu einem deutlichen Anstieg der ROS-Konzentration mit einer

daraus resultierenden starken Einschränkung der Spermienmotilität bis hin zur

Befruchtungsunfähigkeit. OCHSENDORF und PODDA (1999) beschrieben eine

hauptsächliche Produktion von ROS in den Mitochondrien im Rahmen des aeroben

Stoffwechsels. In physiologischen Mengen waren sie an der Akrosomreaktion sowie an der

Kapazitation beteiligt. Bei unphysiologisch hohen Metabolitkonzentrationen wurden diese

Vorgänge beeinträchtigt. Bei normaler Regulation des Zellmetabolismus sorgen nach SIKKA

(2001) antioxidative Systeme für eine Reduzierung der ROS auf eine physiologische Menge.

OSTROVIDOV et al. (2000) beschrieben einen Nachweis von ROS (Superoxidanionen und

Peroxiden) mit Hilfe der DHR- sowie DCFH-Färbung lebender Mäusezellen (Maus-Maus

Hybridom (Mark 3) Zelllinie). DHR zeigte eine höhere Sensivität gegenüber

Superoxidanionen, DCFH gegenüber Peroxiden.

Sowohl DHR als auch DCFH sind nach HALLIWELL und WHITEMAN (2004)

membranpermeabel und fluoreszieren erst bei Oxidierung durch die in der Zelle vorhandenen

ROS. Es kommt zu einer starken Grünfluoreszenz proportional zur Menge reaktiver

Sauerstoffspezies. Bei der Oxidation von DHR entsteht Rhodamin, welches in der Zelle

kumuliert, da es nicht membranpermeabel ist. DCFH wird zu DCF oxidiert. DCF ist

membranpermeabel und kann dadurch auch außerhalb der Zelle reagieren (OHASHI et al.

2002; SUBRAMANIAM et al. 2002). Aufgrund dieser Tatsache wird DCFH nach Aussage

der oben genannten Autoren eine geringere Spezifität zugewiesen als DHR.

EVENSON et al. (1982) beschrieben einen Zusammenhang zwischen Zellmetabolismus und

Fluoreszenzintensität bei einer DHR-Färbung. Es zeigte sich eine Korrelation zwischen der

Fluoreszenzintensität und der Anzahl der Mitochondrien sowie dem mitochondrialen

- 31 - Literatur

Membranpotential. Die Fluoreszenz war auf das Mittelstück der Spermien beschränkt und

korrelierte direkt mit einer Verringerung der Motilität.

HECZKO (2004) untersuchte den Einfluss von karotinoidem Astaxanthin auf die

Spermaqualität und Fertilität von Zuchthengsten. Mit Hilfe DHR gefärbter Proben war ein auf

diesen Zusatzstoff zurückzuführender Schutz der Spermien vor einer Lipidperoxidation nicht

nachweisbar.

- 32 - Material und Methoden

3 Material und Methoden 3.1 Verwendete Tiere

Zur Durchführung der Versuche wurden über einen Zeitraum von drei Monaten vier Holstein-

Friesian Bullen in die Rinderklinik der Tierärztlichen Hochschule Hannover eingestellt. Das

Alter der Tiere betrug 12 (Bulle B), 15 (Bulle A), 17 (Bulle C) und 19 Monate (Bulle D). Die

Tiere befanden sich in Boxenhaltung und wurden mit handelsüblichem Heu und Kraftfutter

versorgt. Voraussetzung für die Aufnahme der Tiere in den Versuch war eine klinische

Allgemeingesundheit, Routine im Untersuchungs- sowie Ejakulatgewinnungsprozess

(wöchentliche Voruntersuchungen über einen Zeitraum von drei Monaten) und eine

Spermaqualität mit mindestens 80 % morphologisch normalen sowie mehr als 70 %

vorwärtsbeweglichen Spermien.

3.2 Versuchsaufbau

Die Versuche fanden an allen Tieren gleichzeitig statt. Vor der 48-stündigen lokalen

Wärmeapplikation wurden die Echotextur des Hodengewebes sowie der Blutfluss der

A. testicularis einmalig drei Tage vor der Erwärmung (physiologischer Wert, Woche 0)

erfasst. Das Nativsperma der Tiere wurde zur Erhebung der Ausgangsbefunde (Woche 0)

zweimal im Abstand von zwei Tagen konventionell und durchflusszytometrisch untersucht

(Abb. 3.1). Die Auswirkungen der lokal ausgelösten Hyperthermie wurden einmal pro Woche

(mittwochs) mittels sonographischer Untersuchung des Hodengewebes und

dopplersonographischer Blutflussanalyse der A. testicularis untersucht. Die

durchflusszytometrische Analyse der Auswirkungen der Hyperthermie auf die Spermien-

DNA und die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies fand über einen Zeitraum von 10 Wochen

zweimal wöchentlich (dienstags und freitags) statt (Abb. 3.1). Bei der Darstellung dieser

Ergebnisse wurden die in den jeweils zwei Versuchstagen gewonnenen Werte zu einem Wert

pro Woche zusammengefasst.

- 33 - Material und Methoden

Abb. 3.1: Tage der Untersuchungen vor (-) und nach der 48-stündigen lokalen Wärmeapplikation Die Mittelzeile stellt die entsprechende Woche der Untersuchungen dar An Tag 66 wurde keine Blutflussanalyse mehr durchgeführt

3.3 Lokale Wärmeapplikation am Hoden

Nach Erhebung der Ausgangswerte wurden die vier Tiere mit Hilfe eines wattierten

Polyesterbeutels (Abb. 3.2 a) einer 48-stündigen transskrotalen Wärmeapplikation

unterzogen. Dieser wurde über den gesamten Hoden einschließlich des Hodenhalses gestülpt

und mittels einer Bandage befestigt. Zur äußeren Abschirmung gegen einen Wärmetransfer

wurde eine Plastikfolie um den Beutel gewickelt und zur Erhebung der Temperaturkurve ein

Temperaturfühler innerhalb des Beutels auf der Skrotalhaut angebracht. Zur Befestigung des

Polyesterbeutels am Tier diente ein Gurtsystem. Am Brustgurt konnte im dreistündigen

Rhythmus die Temperatur der Skrotalhaut digital abgelesen und protokolliert werden (Abb.

3.2 b). Direkt nach Beendigung der Wärmeapplikation fand eine Spermagewinnung und

-untersuchung sowie eine Kontrolle der Körpertemperatur statt. Am darauf folgenden Tag

wurden die Ultraschalluntersuchungen durchgeführt.

Spermaanalyse

Tag

Tag

-4 3 10 17 24 31 38 45 52 59 (66)

-5 -2 2 5 9 12 16 19 23 26 30 33 37 40 44 47 51 54 58 61 65 68

Wärmeapplikation Echotextur- und Blutflussanalyse

Wo 0 Wo 1 Wo 2 Wo 3 Wo 4 Wo 5 Wo 6 Wo 7 Wo 8 Wo 9 Wo 10

- 34 - Material und Methoden

Abb. 3.2: a: Lokale Wärmeapplikation mittels eines Polyesterbeutels

b: Darstellung der digitalen Temperaturanzeige (30,6°C = Skrotalhauttemperatur zu Beginn der Wärmeapplikation)

3.4 Computergestützte Echotexturanalyse

Die sonographischen Untersuchungen für die computergestützte Echotexturanalyse wurden in

einem ruhigen, abgedunkelten Raum durchgeführt. Zur Anwendung kam das

Farbdopplersonographiegerät SSA-370A Version K der Firma Toshiba (Tokyo/Japan). Die

Untersuchungen fanden mit immer gleichen Einstellungen statt.

Der Linearschallkopf wurde in kaudo-kranialer Richtung auf die Skrotalhaut aufgesetzt (Abb.

3.3 a). Ein handelsübliches Ultraschallgel diente als Kontaktmedium. Pro Hoden wurden je

ein Längsschnitt und ein Querschnitt im oberen, mittleren und unteren Drittel erstellt (Abb.

3.4). Um möglichst sichere Ergebnisse zu erhalten, wurden von jeder Lokalisation zwei Bilder

aufgenommen. Somit entstanden bei jeder Untersuchung pro Hoden 8 Bilder (Abb. 3.3 b).

a b

- 35 - Material und Methoden

Abb. 3.3: a: Anlegen eines Linearschallkopfes zur Echotexturanalyse

b: Sonographisches B-Bild eines Längsschnittes durch den Hoden

Abb. 3.4: Schnittlokalisationen am Bullenhoden bei der Echotexturanalyse Die Auswertung der Bilder wurde mit Hilfe der Software MaZda® (Technische Universität,

Lodz, Polen) vorgenommen. Hierbei wurden zwei rechteckige Kästchen, so genannte „ROI“

(regions of interest), nebeneinander auf dem Ultraschallbild positioniert. Die Lokalisation

befand sich ca. 1 cm oberhalb des Mediastinum testis in homogenen Texturbereichen. Ihre

Größe war auf 1 x 1,5 cm festgelegt. Die anschließend gemittelten Analysergebnisse aus

beiden ROI ergaben den mittleren Grauwert sowie die Werte für Kontrast und Vertical

Fraction.

Längsschnitt

Querschnitt im oberen Drittel

Querschnitt im mittleren Drittel

Querschnitt im unteren Drittel

a b

- 36 - Material und Methoden

Die Rechengrundlage des Programms bei der Analyse der ROI basiert auf einer Aufteilung

der Region in Buchstaben. Die Buchstaben finden in den einzelnen Formeln der jeweiligen

Parameter Anwendung. Das folgende Schema (Abb. 3.5) soll den Vorgang verdeutlichen.

Abb. 3.5: Ultraschallbild mit einer eingezeichneten Analyseregion (ROI) und Darstellung der Aufteilung dieses Rois durch das Programm zur Parameterberechnung auf Formelgrundlage

Im Folgenden werden die in dieser Arbeit verwendeten Parameter näher erklärt. Die

genannten Formeln zu den einzelnen Parametern wurden von SZCZYPINSKÌ (1998) bei der

Entwicklung des Programms festgelegt.

Mean

Der Parameter Mean stellt den mittleren Grauwert eines ROIs dar. Das Analyseprogramm

misst den Grauwert jedes einzelnen Pixels und dividiert die Summe im Anschluss durch die

Pixelzahl.

Die Errechnungsformel lautet wie folgt:

‡”

A B C D E F G H I J K L X N O P Q R S T U V W Y Z

ROI

Mean:

- 37 - Material und Methoden

Kontrast

Bei der Erstellung des Kontrastwerts werden vom Computerprogramm immer Pixelpaare der

jeweiligen ROI miteinander verglichen. Die Pixelpaare haben durch einen festgesetzten

Vektor einen definierten Abstand und eine definierte Ausrichtung im zu analysierenden Feld.

Formel zur Errechnung des Kontrastparameters:

Vertical Fraction

Das Programm führt bei der Fraktionsanalyse Grauwertvergleiche der Pixel in einer

bestimmten Richtung durch. Bei der Vertical Fraction werden in vertikalen Verläufen die

Grauwerte der Pixel gemessen. Das Ergebnis zeigt dann die relative Häufigkeit von

Durchläufen einer in der Programmierung festgelegten Länge mit einem bestimmten Grauton

an.

Die entsprechende Berechnungsformel lautet:

3.5 Blutflussanalyse in der A. testicularis

Die Darstellung des Blutflusses in der A. testicularis erfolgte im Anschluss an die B-Bild-

Aufnahmen ebenfalls mit Hilfe des Farbdopplersonographen SSA-370A Version K der Firma

Toshiba. Die mit dem Gerät erstellten Dopplerwellen wurden mit einem Videorekorder

(Version: VHS SV 661 X der Firma Samsung) aufgezeichnet.

Vor Beginn der Untersuchung wurden den Tieren einige Minuten zur Beruhigung gelassen.

Die Farbdoppleruntersuchung erfolgte transkutan unter Verwendung eines handelsüblichen

Kontakgels mit einem 10,0 MHz-Linearschallkopf bei immer gleich bleibenden

Einstellungen. Die Sonde wurde außen am Samenstrang mittig zwischen äußerem Leistenring

und Hoden in kaudo-kranialer Richtung angelegt. Somit konnten Querschnitte der A.

testicularis im B-Modus dargestellt und mit Hilfe des Farbdopplergerätes Dopplerwellen

abgeleitet werden (Abb. 3.6 b).

Kontrast

Fraction

- 38 - Material und Methoden

Abb. 3.6: a: Dopplerwellen mit Beschriftung der maximalen systolischen (S), minimalen diastolischen (Min) sowie enddiastolischen (D) Frequenzverschiebung

b: B-Bild mit Querschnitten der A. testicularis und dem gesetzten Messgate des Dopplerstrahls

Zur Auswertung der gewonnenen Dopplerwellen wurde ein Bildanalyseprogramm (NIH-

Image, Version 1.60, U.S. National Institute of Health, 1999) auf einem Apple-Computer

verwendet. Die Auswertung erfolgte nach dem von BÜHLMEYER (1999) beschriebenen

Verfahren. Voraussetzung für die Tauglichkeit zweier aufeinander folgender Wellen war eine

hohe Ähnlichkeit sowie der Gefäßquerschnitt im B-Bild mit nicht mehr als 60° Abweichung

vom Dopplerstrahl. Bestimmt wurden die maximale systolische (S), die minimale diastolische

(Min), die enddiastolische (D) sowie die mittlere Frequenzverschiebung über dem Herzzyklus

(TAMF = Time Averaged Maximum Frequency Shift) (Abb. 3.6 a). Für die Bestimmung der

TAMF wurde eine Hüllkurve über die Welle gelegt und das Integral unter der Kurve

berechnet. Anhand der gewonnenen Daten konnten der Resistance Index (RI), der Pulsatility

Index (PI) sowie die mittlere Blutflussgeschwindigkeit (TAMV) errechnet werden. Um

repräsentative Werte zu erhalten, wurden pro Tier und Woche von jeweils fünf

Dopplerwellenpaaren die Mittelwerte errechnet.

S

D

D = Min

a b

- 39 - Material und Methoden

3.6 Samengewinnung

Bei der Samengewinnung wurde eine künstliche Scheide (Fa. Minitüb, Landshut) eingesetzt.

Ein Bulle gleicher Größe diente als Sprungpartner. Vor jeder Spermagewinnung wurden zwei

Aufsprünge ohne Ejakulation durchgeführt.

3.7 Konventionelle Spermaanalyse

Unmittelbar nach der Spermagewinnung wurde der Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien

unter einem Lichtmikroskop, das mit einer Wärmeplatte (37 °C) ausgestattet war, subjektiv

geschätzt und die Samendichte lichtmikroskopisch mit einer „Thoma neu“-Zählkammer

ermittelt (WEITZE 2001). Des Weiteren wurde von jeder Probe ein ungefärbter

Objektträgerausstrich angefertigt. Diese Ausstriche wurden nach vollständiger Trocknung auf

Fremdzellgehalt sowie primäre und sekundäre Anomalien der Spermien untersucht. Hierfür

wurden pro Objektträger 300 Zellen unter einem Mikroskop mit 400-facher Vergrößerung

ausgezählt.

3.8 Probenanalyse mit dem Durchflusszytometer

Das gesamte Probenaufkommen während der Versuchszeit wurde mit dem

Durchflusszytometer Epics XL AF 02020 der Firma Beckman Coulter GmbH gemessen. An

das Gerät war ein IBM-compatibler Computer angeschlossen.

Vor Beginn der Messungen wurde das Durchflusszytometer zweimal mit einer Cleanse-

Flüssigkeit und im Anschluss zweimal mit bidestilliertem Wasser gespült. Zur Justierung kam

die Flow-Check™- Flüssigkeit (Fa. Beckman Coulter GmbH, Krefeld) zum Einsatz, welche

fluoreszierende Latexkügelchen enthält. Anhand dieser konnten immer identische

Messeinstellungen des Geräts zu Beginn der Probenanalysen garantiert werden. Nach der

Justierung wurde mit dem Messen der Samenproben begonnen.

Ausgestattet war das Durchflusszytometer mit einem luftgekühlten Argonionenlaser mit einer

Wellenlänge von 488 nm sowie mit drei verschiedenen Filtern (FL-1 (grüne Fluoreszenz), FL-

2 (orange Fluoreszenz) und FL-3 (rote Fluoreszenz)). Die Auswertung der gewonnenen Daten

fand mit den Softwareprogrammen Expo 32 ADC XL 4 Color™ und Expo 32 Analysis™ der

- 40 - Material und Methoden

Firma Beckman Coulter GmbH (Krefeld) statt. Das Programm DAS Version 4.40 wurde zur

Auswertung der SCSA™-Daten herangezogen.

3.8.1 Vorbereitung der Proben für die Durchflusszytometrie

Unmittelbar nach der Justierung wurde das Nativsperma in ein 37°C warmes Wasserbad

gestellt und die Dichte wie unter 3.7 beschrieben bestimmt. Anschließend wurde die

Spermienkonzentration mit Hilfe des Verdünners Andromed™ (Fa. Minitüb, Landshut) auf

50 Millionen Zellen pro Milliliter eingestellt und bei 37°C über 30 Minuten gelagert.

Mit Ausnahme der für die SCSA™-Färbung vorgesehenen Proben wurde das Sperma

anschließend für die DHR/PI-Färbung über einem Percoll®- Dichtegradienten zentrifugiert,

um Verdünner, Seminalplasma und Fremdstoffe zu entfernen. Hierzu wurden in einem 15-ml

-Kunststoffzentrifugenröhrchen (Fa. Sarstedt) 2 ml 70%iges Percoll® vorsichtig mit 2 ml

35%igem Percoll® und anschließend mit 1 ml der mit Andromed™ auf 50 Millionen/ml

verdünnten Probe überschichtet (HARRISON et al. 1982). Es folgte eine Zentrifugation bei

37°C und 1400 Umdrehungen für 15 Minuten. Im Anschluss daran wurde der Überstand

direkt mit einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt und das Pellet in 1 ml auf 37°C vorgewärmter

Tyrodelösung (Rezept im Anhang) resuspendiert. Die entstandene Suspension wurde in einem

15 ml Kunststoffzentrifugenröhrchen (Fa. Sarstedt) mit Tyrodelösung auf eine Konzentration

von 5x106 Spermien pro Milliliter eingestellt und stand in dieser Form für die DHR/PI-

Färbung zur Verfügung.

Für die SCSA™-Färbung wurde die mit Andromed hergestellte Verdünnung mit einer

Konzentration von 50x106 Spermien pro Milliliter direkt im Verhältnis 1:10 mit Tyrodelösung

auf 5x106 Spermien pro Milliliter verdünnt.

Die Herstellungsanweisungen sowie die Konzentrationen der verwendeten Fluorochrome

werden im Anhang (8.2) beschrieben.

- 41 - Material und Methoden

3.8.2 SCSA™-Färbung, Messung und Auswertung

Für die SCSA™-Färbung wurde die Tyrodeverdünnung mit einer Konzentration von 5x106

Spermien pro ml mit TNE-Puffer nochmals auf 2x106 Spermien pro Milliliter verdünnt. 200 µl

der gewonnenen Spermiensuspension wurden mit 0,4 ml Säuredetergenz versetzt und exakt

30 Sekunden auf dem Vortexer gemischt. Im Anschluss wurde 1,2 ml Akridinorange-

Gebrauchslösung hinzugefügt. Die Inkubationszeit vor der Messung betrug 3 Minuten.

Zur Messung wurden der FL-1- (grüne Fluoreszenz) und der FL-3-Filter (rote Fluoreszenz)

verwendet. Aufgrund der hohen Empfindlichkeit des Durchflusszytometers gegenüber dem

Farbstoff Acridinorange wurden vor Messbeginn und nach jeder fünften Probe

Referenzproben eines klinikeigenen Bullen mit bekannter Fluoreszenzintensität gemessen.

Auf diese Weise konnten gleich bleibende Einstellungen garantiert werden.

Bei der Auswertung wurde durch eine computergestützte Einzelfluoreszenzbestimmung jedes

Spermiums der Anteil an rot fluoreszierenden Spermien zur Gesamtfluoreszenz (rot und grün

fluoreszierende Spermien) errechnet und nach EVENSON und JOST (2000) als DFI (DNA-

Fragmentationsindex) bezeichnet. Die gewonnenen DFI-Werte wurden in einem Histogramm

dargestellt, aus dem der Mittelwert sowie die Standardabweichung als Maß für die Streuung

um den Mittelwert berechnet wurden. Für die weitere Auswertung mussten im

Punktwolkendiagramm (Abb. 3.7) die Spermien mit erhöhtem DFI-Wert manuell von den

Spermien mit niedrigem DFI-Wert getrennt werden. Das Computerprogramm errechnete auf

dieser Basis den prozentualen Anteil der Spermien mit erhöhtem DFI-Wert gemessen an der

Gesamtprobe.

- 42 - Material und Methoden

Abb. 3.7: Punktwolkendiagramm bei der durchflusszytometrisch durchgeführten

Spermienchromatinstrukturanalyse (SCSA™) (R = Spermienpopulation). Schematische Darstellung der Spermien mit grüner Fluoreszenz (a), d.h. doppelsträngiger DNA und Spermien mit erhöhter Rotfluoreszenz (b, c), d.h. mit vermehrt vorkommender einzelsträngiger DNA nach der SCSA™ (modifiziert nach KRIENKE 2003)

3.8.3 Dihydrorhodamin (DHR)/PI-Färbung und Messung

Für die Dihydrorhodamin (DHR)/PI–Färbung wurden von der in 3.8.1 beschriebenen

Tyrodeverdünnung (5x106 Spermien/ml) 500 µl vorgelegt und mit 2,5 µl frisch angesetztem

DHR-Farbstoff versetzt. Nach einer Inkubationszeit von 15 Minuten bei 37°C und 5%iger

CO2-Atmosphäre wurde die Probe in zweimal 240 µl aufgeteilt und mit jeweils 2,5 µl PI

versetzt. Einer der beiden Proben wurde zur Stimulation der Peroxidation noch 2,5 µl frisch

zubereitetes H2O2 zugesetzt. Nach einer weiteren Inkubation von 15 Minuten bei 37°C und

5%iger CO2-Atmosphäre wurden beide Proben gemessen.

Zur Messung der Ergebnisse wurden ein FL-1- (grüne Fluoreszenz) sowie ein FL-3-Filter

(rote Fluoreszenz) verwendet. Anhand der Fluoreszenz konnte nach subjektiver Trennung der

Punktwolken zwischen vitalen (keine Rotfluoreszenz), toten (starke Rotfluoreszenz) und

Spermienzellen mit starker Peroxidation (deutliche Grünfluoreszenz) unterschieden werden

(Abb. 3.8).

FL-3 (rote Fluoreszenz)

FL-1

(gr

üne

Fluo

resz

enz)

400

600

1000

800

0

200

1000800400 6000 200

Debris

R

(a)

(b)

(c)

FL-3 (rote Fluoreszenz)

FL

-1 (

grün

e F

luor

esze

nz)

- 43 - Material und Methoden

Abb. 3.8: Punktwolkendiagramm nach DHR/PI-Färbung und durchflusszytometrischer Auswertung (Ausdruck des Computerbildes; C = vitale Spermien mit vermehrter Peroxidation; B = nichtvitale Spermien) Schematische Darstellung der nichtvitalen Spermien mit Rotfluoreszenz (b) und der vitalen Spermien mit verstärkter Grünfluoreszenz, d. h. vermehrter Peroxidation (c) nach DHR/PI-Färbung

3.9 Statistische Auswertung

Die Verwaltung aller gewonnenen Daten wurde mit Excel durchgeführt.

Das Statistikprogramm Stat View Version 5.0 (SAS Institute Inc., Cary/North Carolina, 1998)

diente der Erstellung der verschiedenen Einzelgraphen. Aufgrund der geringen

Versuchstieranzahl von n = 4 wurde in dieser Arbeit nur deskriptive Statistik angewendet,

erstellt mit dem Statistikprogramm SAS 9.1 (SAS Institute Inc., Cary/North Carolina, USA,

1998).

B

C

b

c

FL

- 3

(rot

e F

luor

esze

nz)

FL-1 (grüne Fluoreszenz)

- 44 - Ergebnisse

4 Ergebnisse 4.1 Skrotale Oberflächentemperatur während der Wärmeapplikation

Die Messwerte des Temperaturfühlers auf der Skrotalhaut wurden im dreistündigen

Rhythmus digital am Brustgurt abgelesen. Bei tierindividuell unterschiedlichem

Ausgangswert (Tier D 30,6°C, Tier A 32,2°C, Tier C 32,3°C, Tier B 33,3°C) und

unterschiedlich starker Reaktion auf die Wärmeapplikation zeigten die Einzelkurven einen

sehr ähnlicher Verlauf (Abb. 4.1).

Die durchschnittliche Ausgangstemperatur der vier Tiere direkt nach Anlegen des

Wärmeapplikationssystems lag bei 32,0°C (Stunde 0). Innerhalb der ersten drei Stunden stieg

die Oberflächentemperatur um durchschnittlich 3,2°C auf eine Temperatur von 35,2°C an. Ein

maximaler Durchschnittswert von 37,1°C wurde ca. zwölf Stunden nach Beginn der

Wärmeapplikation erreicht, welcher allerdings im Anschluss wieder konstant auf

durchschnittlich 36,5°C (Stunde 24) abfiel. Nach 36 Stunden zeigte sich erneut ein höherer

Durchschnittswert von 37,0°C. Die Endtemperatur vor Abnahme des Gurtsystems lag bei

36,3°C (Stunde 48). Bulle C zeigte mit mehreren Werten oberhalb von 38,0°C die stärkste

skrotale Erwärmung mit kontinuierlichem Kurvenverlauf oberhalb des Durchschnitts.

- 45 - Ergebnisse

Abb. 4.1: Skrotale Oberflächentemperatur (°C) der vier Tiere (Bulle A, Bulle B, Bulle C, Bulle D)

vor und während der lokalen 48-stündigen Wärmeapplikation

4.2 Einfluss der Hyperthermie auf die klinischen Befunde

Verhalten und Futteraufnahme der vier Bullen änderten sich sowohl während, als auch nach

der Wärmeapplikation nicht. Die Körperkerntemperatur lag nach der Hyperthermie bei allen

Tieren im physiologischen Bereich.

Die Messungen der Hodendimensionen wurden zwei Tage vor der lokalen Wärmeapplikation,

24 Stunden nach Abnahme des Gurtsystems sowie nach Beendigung der gesamten

Versuchsphase (Woche 10) durchgeführt (Tab. 4.1). Im Befestigungsbereich des

Isoliermaterials wies Bulle B nach Abnahme des Gurtsystems am Hodenhals eine leichte

Rötung auf. Einen Tag nach Beendigung der Wärmeapplikation zeigte sich eine

durchschnittliche Zunahme des Hodensackumfangs um 9 %. Das Hodensackvolumen

vergrößerte sich um 22 %, und Länge sowie Breite des Hodens nahmen um jeweils 7 % zu.

Nach Beendigung des Versuchs lagen die durchschnittlichen Werte auf bzw. leicht unter

Ausgangsniveau ausgenommen das Hodensackvolumen. Dieses lag noch 5 % oberhalb des

Wärmeapplikationsbeginn

Skr

otal

e

Obe

rflä

chen

tem

pera

tur

[°C

]

Stunden vor (0) und während der Wärmeapplikation

28

30

32

34

36

38

40

0 3 6 12 18 24 30 36 42 48 0

- 46 - Ergebnisse

Ausgangswertes. Bulle B zeigte 24 Stunden nach Beendigung der Wärmeapplikation die

stärkste Zunahme von Hodensackumfang und Volumen.

Tab. 4.1: Hodendimensionen der vier Holstein-Friesian Bullen (Bulle A, Bulle B, Bulle C,

Bulle D, Mittelwert aller vier Tiere) vor der Wärmeapplikation, 24 Stunden nach Abnahme des Gurtsystems sowie nach Beendigung des Versuchs (Tag 68)

Zeitpunkt der Hodensackumfang Hodensackvolumen Hodenlänge Hodendicke

Messung [cm] [l] [cm] [cm]

Vor der lokalen Wärmeapplikation 24 Stunden nach Abnahme des Gurtsystems Nach Beendigung des Versuchs (Tag 68)

34 35 35 36 35 36 40 37 39 38 35 34 36 36 35,3

1,0 1,1 1,2 1,3 1,2 1,3 1,6 1,3 1,4 1,4 1,2 1,2 1,2 1,3 1,2

6,5 7,0 8,0 8,5 7,5 7,5 8,0 8,0 8,5 8,0 6,5 7,0 8,0 8,0 7,4

4,5 4,5 5,0 4,0 4,5 5,2 4,8 5,0 4,3 4,8 4,0 4,5 4,5 4,0 4,3

- 47 - Ergebnisse

4.3 Einfluss der Hyperthermie auf die Echotextur des Hodens 4.3.1 Einfluss der Hyperthermie auf den mittleren Grauwert

Die Veränderungen des mittleren Grauwertes waren bei allen Tieren über die gesamte

Versuchsphase sehr ähnlich (Abb. 4.2). Nur Bulle C zeigte abweichend von den anderen

Tieren eine punktuelle Verringerung in Woche 6.

Alle vier Tiere hatten ähnliche Ausgangswerte (Bulle A: 52; Bulle B: 51; Bulle C: 50; Bulle

D: 53). Bei der ersten sonographischen Untersuchung nach der Wärmeapplikation (Woche 1)

zeigten alle Bullen maximale mittlere Grauwerte. Der relative Anstieg lag zwischen 18 und

45 % (Tier A 18 %, Tier D 25 %, Tier C 39 %, Tier B 45 %). Zwischen Woche 2 und 3 fielen

die Grauwerte der Bullen A, C und D wieder bis auf Ausgangsniveau ab. Bei Bulle B

reduzierte sich der mittlere Grauwert langsamer und erreichte erst in Woche 6 das

Ausgangsniveau. Die Hodentextur des Bullen C zeigte in Woche 6 einen kurzzeitigen Abfall

des mittleren Grauwerts auf ein Minimum, welches 33 % unterhalb des Ausgangsniveaus lag.

Bulle B wies über die gesamte Versuchsphase die höchsten mittleren Grauwerte auf. Es

wurde ein durchschnittlicher Wert von 59 protokolliert. Die Bullen A, C und D zeigten

Durchschnittswerte von 56, 54 und 52.

- 48 - Ergebnisse

Abb. 4.2: Mittlerer Grauwert des Hodenparenchyms der vier Bullen (Bulle A, Bulle B, Bulle C,

Bulle D) vor und nach der lokalen 48-stündigen Wärmeapplikation 4.3.2 Einfluss der Hyperthermie auf den Kontrast

Die Kontraständerungen der Echotextur waren bei allen Bullen sehr ähnlich (Abb. 4.3). Wie

schon beim mittleren Grauwert konnte auch beim Kontrast nur bei Bulle C in Woche 6 ein

punktuell verringerter Wert verzeichnet werden.

Die Ausgangswerte lagen zwischen 42 und 46 (Bulle A: 46, Bulle B: 42, Bulle C: 43 und

Bulle D: 44). Direkt nach der Wärmeapplikation kam es in Relation zum Ausgangswert zu

einem maximalen Anstieg des Kontrasts um 15,9 bis 31,9 % Prozent (Tier A 27,8 %, Tier B

31,9 %, Tier C 21,9 %, Tier D 15,9 %). Bei den Bullen A, B und D stieg der Kontrast bis

Woche 2 an, wohingegen Tier C den Maximalwert schon in Woche 1 erreichte. Bei allen

Bullen war in Woche 3 ein Rückgang der Werte festzustellen, der jedoch individuell

verschieden stark ausgeprägt war. Während die Bullen A, C und D in dieser Woche bereits

wieder die Höhe des Ausgangsniveaus erreicht hatten, dauerte der Rückgang

Wärmeapplikation

Wochen vor (0) und nach der Wärmeapplikation

mit

tler

er G

rauw

ert

20

30

40

50

60

70

80

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0

- 49 - Ergebnisse

des Kontrasts bei Bulle B bis Woche 6 an. Bulle C fiel, wie bereits erwähnt, in Woche 6

durch einen punktuellen Einbruch auf einen Wert 25,8 % unterhalb des Ausgangsniveaus auf.

Die Mittelwerte der gesamten Versuchsphase lagen mit Werten von 45 (Tier C), 46 (Tier D)

und 48 (Tier A und B) sehr nah beieinander.

Abb. 4.3: Kontrast des Hodenparenchyms der vier Bullen (Bulle A, Bulle B, Bulle C, Bulle D)

vor und nach der lokalen 48-stündigen Wärmeapplikation

4.3.3 Einfluss der Hyperthermie auf den vertikalen Fraktionswert

Der vertikale Fraktionswert zeigte ähnliche Kurvenverläufe bei den Tieren B und D. Bulle C

wies wie bei den bereits beschriebenen Echotexturparametern als einziges Tier einen

punktuellen Werteabfall in Woche 6 auf (Abb. 4.4).

25

30

35

40

45

50

55

60

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Kon

tras

t

Wochen vor (0) und nach der Wärmeapplikation

Wärmeapplikation

0

- 50 - Ergebnisse

Die Werte aller Bullen zeigten einen Anstieg direkt nach der Wärmeapplikation mit

Höhepunkt in Woche 1 (Bulle B, C und D) bzw. 2 (Bulle A). Sie stiegen zwischen 0,4 und

1,4 % gegenüber den Ausgangswerten an (Tier A 1,4 %, Tier B 0,8 %, Tier C 1,0 % und Tier

D 0,4 %). Es folgte ein Abfall des vertikalen Fraktionswertes des Bullen A mit Erreichen des

Ausgangsniveaus in Woche 3. Auf etwa diesem Niveau blieb der vertikale Wert bis zum Ende

des Untersuchungszeitraums.

Die Werte des Bullen C blieben bis Woche 4 erhöht, fielen dann in Woche 5 bis auf

Ausgangsniveau und in Woche 6 auf ein Minimum ab, das 1,3 % unterhalb des

Ausgangswertes lag. In den Wochen 7 bis 10 entsprachen die Fraktionswerte wieder den

Werten, welche zwischen den Wochen 1 und 4 gemessen worden waren.

Die Bullen B und D zeigten nach Erreichen des Maximalwertes einen kontinuierlichen Abfall

bis Woche 5 auf durchschnittlich 1,4 % unterhalb des Ausgangsniveaus. Im Anschluss stiegen

die Werte wieder bis auf das Ausgangsniveau an.

Die Tiere B und D wiesen, über den gesamten Untersuchungszeitraum betrachtet, Mittelwerte

von 0,909 bzw. 0,908 auf. Die Durchschnittswerte der Tiere A und C lagen trotz

unterschiedlicher Verläufe im Mittel sehr nah beieinander. Sie zeigten Werte von 0,921 bzw.

0,920. Damit betrugen die Unterschiede zwischen den mittleren vertikalen Fraktionswerten

der Bullen maximal 1,3 %.

- 51 - Ergebnisse

Abb. 4.4: Vertikaler Fraktionswert des Hodenparenchyms der vier Bullen (Bulle A, Bulle B, Bulle C, Bulle D) vor und nach der lokalen 48-stündigen Wärmeapplikation

4.4 Einfluss der Hyperthermie auf den Blutfluss der A. testicularis

4.4.1 Einfluss der Hyperthermie auf die mittlere Blutflussgeschwindigkeit (TAMV)

Die vier Bullen wiesen ähnliche Änderungen in der mittleren Blutflussgeschwindigkeit

(TAMV) der A. testicularis bei unterschiedlich starker Reaktion auf die Wärmeapplikation

auf (Abb. 4.5).

Vor der Wärmeapplikation war TAMV bei Bulle A (Wert: 0,44) 76 % höher als bei Bulle B

(Wert: 0,75). Die TAMV-Werte der Tiere C und D (0,35 und 0,37) lagen 40 % und 48 % über

dem Ausgangswert des Bullen B. Nach der Wärmeapplikation war TAMV bei allen Tieren

abgefallen. Bei den Bullen B und C betrug der Rückgang vom Ausgangswert 36 % bzw. 23 %

(Woche 1). Beim Bullen B normalisierte sich die mittlere Blutflussgeschwindigkeit zwischen

Woche 2 und 4 mit leichten Schwankungen auf Ausgangsniveau und zeigte in Woche 5 einen

Wärmeapplikation

Wochen vor (0) und nach der Wärmeapplikation

vert

ikal

er F

rakt

ions

wer

t

0,89

0,90

0,91

0,92

0,93

0,94

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0

- 52 - Ergebnisse

punktuellen Werteanstieg auf ein Maximum von 52 % über dem Ausgangswert. In Woche 6

lag TAMV wieder auf Ausgangsniveau und zeigte ab Woche 7 bis Versuchsende Werte leicht

oberhalb der ursprünglichen mittleren Blutflussgeschwindigkeit.

Die Werte des Tieres C waren bis einschließlich Woche 4 auf sehr niedrigem Niveau, zeigten

im Anschluss einen Anstieg bis auf Ausgangsniveau (Woche 5), bevor sie ab Woche 6 erneut

auf einen Wert 45 % unterm Ausgangswert (Woche 7) abfielen. Nach Woche 7 hatte der

Blutfluss in der A. testicularis des Bullen C annähernd die ursprüngliche

Blutflussgeschwindigkeit erreicht.

Bei den Tieren A und D fiel TAMV der A. testicularis zwischen den Wochen 0 und 2

kontinuierlich um 31 % bzw. 26 % ab. Danach stiegen die Werte wieder an und erreichten in

Woche 4 (Tier D) bzw. 5 (Tier A) nahezu das Ausgangsniveau. Bei Bulle D sank die mittlere

Blutflussgeschwindigkeit in den Wochen 5 und 6 erneut ab, gefolgt von einem leichten

Wiederanstieg. In der 9. Woche nach der Temperaturerhöhung erreichte TAMV fast wieder

das Ausgangsniveau. Bei Bulle A dagegen verblieb TAMV zwischen den Wochen 6 und 9

kontinuierlich leicht unter den Ausgangswerten.

Die Durchschnittswerte der gesamten Versuchsphase lagen bei 0,29 (Tiere B und C), 0,32

(Tier D) und 0,36 (Tier A).

- 53 - Ergebnisse

Abb. 4.5: Mittlere Blutflussgeschwindigkeit in der A. testicularis der vier Bullen (Bulle A,

Bulle B, Bulle C, Bulle D) vor und nach der lokalen 48-stündigen Wärmeapplikation

4.4.2 Einfluss der Hyperthermie auf den Resistance Index (RI)

Nur bei Bulle B war direkt im Anschluss an die Wärmeapplikation (Woche 1) eine deutliche

Änderung des Resistance Index (RI) gegenüber dem Ausgangswert (0,86) festzustellen

(Abb. 4.6). Er stieg bei diesem Bullen um 40 % auf 1,20 an und fiel dann langsam wieder ab,

bis er in Woche 5 das Ausgangsniveau erreichte.

Auffallend waren die individuellen Unterschiede in der Höhe der RI-Werte während des

Untersuchungszeitraums (Abb. 4.6). Die vier RI-Mittelwerte der einzelnen Kurvenverläufe

differierten maximal um 50 % ausgehend vom niedrigsten Wert (durchschnittliche RI-Werte:

Bullen A und C: 0,6, Bulle D: 0,8 und Bulle B: 0,9).

Wärmeapplikation

mit

tler

e B

lutf

luss

gesc

hwin

digk

eit [

m/s

ec]

Wochen vor (0) und nach der Wärmeapplikation

0,05

0,13

0,21

0,29

0,37

0,45

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

0

- 54 - Ergebnisse

Abb. 4.6: Resistance Index (RI) der vier Bullen (Bulle A, Bulle B, Bulle C, Bulle D)

vor und nach der lokalen 48-stündigen Wärmeapplikation

Wärmeapplikation

Res

ista

nce

Inde

x

Wochen vor (0) und nach der Wärmeapplikation

0,3

0,5

0,7

0,9

1,1

1,3

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

0

- 55 - Ergebnisse

4.5 Einfluss der Hyperthermie auf die konventionellen Spermaparameter

4.5.1 Einfluss der Hyperthermie auf die Spermienkonzentration

Vor der Wärmeapplikation betrugen die Werte 1,4 Mrd./ml (Bulle A), 1,6 Mrd./ml (Bulle B),

2,3 Mrd./ml (Bulle D) und 2,6 Mrd./ml (Bulle C) (Abb. 4.7). Nach der Wärmeapplikation

zeigte die Spermienkonzentration in den Proben der Bullen A, B und D ähnliche

Veränderungen. Die Werte verblieben bis einschließlich Woche 1 (Tiere A und B) bzw. 2

(Tier D) auf Ausgangsniveau. Zwischen Woche 2 (Tiere A und B) bzw. 3 (Tier D) und

Woche 5 zeigte sich eine deutliche Konzentrationsabnahme bis auf < 0,2 Mrd./ml bei allen

drei Tieren in Woche 5. Im Anschluss stiegen die Werte ab Woche 6 (Tiere A und D) bzw.

Woche 9 (Tier B) leicht an, blieben aber bis Versuchsende unter Ausgangsniveau.

Die Spermienkonzentrationen der Proben von Tier C verblieben bis Woche 2 auf

Ausgangsniveau. Es folgte ein Abfall mit Tiefpunkt in Woche 5 (0,8 Mrd./ml) und

anschließendem Anstieg bis auf Ausgangsniveau (Woche 7). In den Wochen 8 und 10 sank

die Konzentration punktuell auf 1,7 bzw. 1,9 Mrd./ml ab.

Die durchschnittlichen Spermienkonzentrationen, errechnet aus allen während des

Untersuchungszeitraums gemessenen Werten, betrugen 0,4 Mrd./ml (Tier B), 0,8 Mrd./ml

(Tier A), 0,9 Mrd./ml (Tier D) und 2,1 Mrd./ml (Tier C).

- 56 - Ergebnisse

Abb. 4.7: Spermienkonzentration (Mrd./ml) in den Proben der vier Bullen (Bulle A, Bulle B, Bulle C, Bulle D vor und nach der lokalen 48-stündigen Wärmeapplikation

4.5.2 Einfluss der Hyperthermie auf die Gesamtspermienzahl im Ejakulat

Die Gesamtspermienzahl in den Ejakulaten der Einzeltiere veränderte sich bei allen Bullen

ähnlich (Abb. 4.8).Vor der Wärmeapplikation war der Spermiengehalt in den Proben der

einzelnen Tiere mit 3,6 Mrd. (Bulle B), 5,8 Mrd. (Bulle A), 8,3 Mrd. (Bulle D) und 10,5 Mrd.

(Bulle C) sehr unterschiedlich. Im Anschluss an Woche 1 (Bullen A und B) bzw. 2 (Bullen C

und D) kam es zu einer deutlichen Verringerung der Werte. Die Minima in Woche 4 (Bulle

D) bzw. 5 (Bullen A und C) wiesen Werte von 0,3, 0,2 und 3,7 Mrd. Spermien pro Ejakulat

auf. In den Proben des Bullen B wurden zwischen Woche 3 und 8 Werte weniger als 0,2 Mrd.

gemessen. Danach folgte ein kontinuierlicher Anstieg der Gesamtspermienzahl bis auf

Ausgangsniveau. Nur beim Bullen C kam es im Verlauf nochmals zu einem punktuellen

Abfall der Spermienzahl in Woche 8. Der durch die Hyperthermie bedingte prozentuale

Verlust an Spermien zwischen Ausgangswert und Tiefpunkt war bei Bulle C mit 65 %

Wärmeapplikation

Wochen vor (0) und nach der Wärmeapplikation

Spe

rmie

nkon

zent

rati

on [

Mrd

./ml]

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

- 57 - Ergebnisse

deutlich geringer als bei den anderen drei Bullen. In den Proben dieser Tiere zeigten sich

Verringerungen um 96 (Tiere B und D) bzw. 97 % (Tier A).

Die Durchschnittswerte der Einzeltiere, gemessen über die gesamte Versuchszeit, lagen bei

1,1 Mrd. (Bulle B), 2,4 Mrd. (Bulle A), 4,4 Mrd. (Bulle D) und 8,0 Mrd. (Bulle C).

Abb. 4.8: Gesamtspermienzahl im Ejakulat (Mrd.) der vier Bullen (Bulle A, Bulle B, Bulle C,

Bulle D) vor und nach der lokalen 48-stündigen Wärmeapplikation

-2

0

2

4

6

8

10

12

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ges

amts

perm

ienz

ahl i

m E

jaku

lat [

Mrd

.]

Wärmeapplikation

Wochen vor (0) und nach der Wärmeapplikation

- 58 - Ergebnisse

4.5.3 Einfluss der Hyperthermie auf den prozentualen Anteil vorwärtsbeweglicher

Spermien

Die Vorwärtsmotilität unterlag bei allen Bullen bis Woche 5 sehr ähnlichen Veränderungen

(Abb. 4.9). Der prozentuale Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien lag vor der

Wärmeapplikation bei 80 % (Tiere B, C und D) bzw. 85 % (Tier A). Direkt nach Beendigung

der Hyperthermie (Woche 1) verringerte sie sich auf durchschnittlich 55 % und lag in den

Wochen 3 bzw. 4 und 5 unter 10 % bzw. 5 %. Im Anschluss daran stiegen die Werte der Tiere

A, C und D stetig wieder bis kurz unter das Ausgangsniveau an. Nur bei Tier C sank erneut in

den Wochen 8 und 10 der Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien punktuell unter 50% ab. Bei

Bulle B wurde erst im Anschluss an Woche 7 das Ausgangsniveau annähernd erreicht. Die

Mittelwerte über die gesamte Versuchsphase von 29 % (Tier B), 39 % (Tier D), 42 % (Tier C)

und 43 % (Tier A) verdeutlichen die tierindividuell unterschiedlichen Veränderungen im

prozentualen Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien.

Abb. 4.9: Vorwärtsmotilität der Spermien (%) in den Proben der vier Bullen (Bulle A, Bulle B,

Bulle C, Bulle D) vor und nach der lokalen 48-stündigen Wärmeapplikation

Wärmeapplikation

Wochen vor (0) und nach der Wärmeapplikation

Vor

wär

tsm

otil

ität

[%

]

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

- 59 - Ergebnisse

4.5.4 Einfluss der Hyperthermie auf den Fremdzellgehalt

Bei der Analyse der Einzelgraphen fielen ähnliche Verläufe im Fremdzellgehalt der Ejakulate

bei individuell unterschiedlichen Gehalten an Entzündungs-, Spermatogenese- und

Epithelzellen auf (Abb. 4.10). Die stärkste Fremdzellzunahme zeigten die Bullen B und D mit

einem Anstieg des Durchschnittswertes von 8 % in Woche 2 auf ein Plateau oberhalb von

90 % in den Wochen 4 und 5. Die Tiere A und C zeigten geringere Reaktionen auf die

Wärmeapplikation. Der Fremdzellgehalt nahm ab Woche 2 stetig zu und erreichte Maxima

von 56 % bzw. 13 % in Woche 5 bzw. 4 und 5. Im Anschluss an die Maximalwerte sank der

Fremdzellgehalt in den Ejakulaten der Bullen A, C und D kontinuierlich ab und erreichte das

Ausgangsniveau in Woche 7. Die Werte des Bullen B verblieben noch bis einschließlich

Woche 7 oberhalb von 80 % und zeigten im Anschluss einen stetigen Abfall mit Erreichen

des Ausgangswerts in Woche 10.

Die mittleren Fremdzellgehalte der gesamten Versuchszeit differierten mit Werten von

4 % (Tier C), 16 % (Tier A), 25 % (Tier D) und 43 % (Tier B) sehr stark.

Abb. 4.10: Fremdzellgehalt (%) in den Ejakulaten der vier Bullen (Bulle A, Bulle B, Bulle C,

Bulle D) vor und nach der lokalen 48-stündigen Wärmeapplikation

Fre

mdz

ellg

ehal

t [%

]

Wärmeapplikation

Wochen vor (0) und nach der Wärmeapplikation

-20

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

- 60 - Ergebnisse

4.5.5 Einfluss der Hyperthermie auf die Bildung primärer Spermienanomalien

Die Änderungen im prozentualen Anteil primärer Spermienanomalien waren bei den vier

Tieren ähnlich (Abb. 4.11). Vor der Wärmeapplikation lag dieser Anteil bei durchschnittlich

1,1 % (Bulle A: 1,7 %, Bulle B: 1,4 %, Bulle C: 0,2 %, Bulle D: 1,0 %). Im Anschluss an

Woche 1 nahmen die Werte bei allen Bullen zu und zeigten Maximalwerte von

22,5 % (Bulle A), 41,1 % (Bulle B), 44,6 % (Bulle C) und 45,0 % (Bulle D) in Woche 4

(Tiere A, C und D) bzw. 5 (Bulle B). Es folge ein kontinuierlicher Abfall des Prozentsatzes

primärer Spermienanomalien bis kurz über das Ausgangsniveau inklusive eines zweiten

leichten Anstiegs der Werte bei den Bullen A, B, und D in Woche 8.

Die Mittelwerte der einzelnen Bullen über den gesamten Versuchszeitraum lagen bei

14,0 % (Tier C), 14,7 % (Tier A), 17,7 % (Tier D) und 19,1 % (Tier B).

Abb. 4.11: Prozentsatz primärer Spermienanomalien in den Proben der vier Bullen (Bulle A,

Bulle B, Bulle C, Bulle D) vor und nach der lokalen 48-stündigen Wärmeapplikation

Wärmeapplikation

prim

äre

Spe

rmie

nano

mal

ien

[%]

Wochen vor (0) und nach der Wärmeapplikation

-10

0

10

20

30

40

50

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

- 61 - Ergebnisse

4.5.6 Einfluss der Hyperthermie auf die Bildung sekundärer Spermienanomalien

Alle in Abbildung 4.12 eingetragenen Kurven zeigen sehr ähnliche Verläufe, jedoch mit

individuell unterschiedlich starker Reaktion auf die Wärmeapplikation. Die Ausgangswerte

sekundärer Spermienanomalien lagen durchschnittlich bei 1,8 % (Bulle A: 4,4 %,

Bulle B: 0,7 %, Bulle C: 1,2 % und Bulle D: 1,0 %). Im Anschluss an Woche 1 kam es zu

einem Anstieg der Werte auf ein durchschnittliches Maximum von 60,9 % (Bulle A und B,

Woche 2) bzw. 59,0 % (Bullen C und D, Woche 3), dem ein Abfall der Werte bis zum

Erreichen des Ausgangsniveaus in Woche 4 (Tiere B) bzw. 6 (Tiere A, C und D) folgte.

Der durchschnittliche Prozentsatz sekundärer Spermienanomalien, errechnet aus allen

während der Versuchslaufzeit erhobenen Daten, war bei Tier B mit 10,6 % etwas niedriger als

bei den Tieren A, C und D mit Werten von 16,4 %, 14,2 % und 16,0 %.

Abb. 4.12: Prozentsatz sekundärer Spermienanomalien in den Proben der vier Bullen (Bulle A,

Bulle B, Bulle C, Bulle D) vor und nach der lokalen 48-stündigen Wärmeapplikation

Wärmeapplikation

Wochen vor (0) und nach der Wärmeapplikation

seku

ndär

e Sp

erm

iena

nom

alie

n [%

]

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

- 62 - Ergebnisse

4.6 Einfluss der Hyperthermie auf die durchflusszytometrisch

ermittelten Spermaparameter

4.6.1 Einfluss der Hyperthermie auf die Stabilität des Spermienchromatins

Die Analyse mittels SCSA™ erbrachte sehr ähnliche Veränderungen im DFI bei allen Tieren

(Abb. 4.13). Der durchschnittliche Ausgangswert lag vor der Wärmeapplikation bei 8,9 %

(Bulle A: 10,4 %, Bulle B: 9,6 %, Bulle C: 10,3 % und Bulle D: 5,1 %). Danach folgte ein

Anstieg des prozentualen Anteils chromatininstabiler Spermien mit Höhepunkt in Woche 4

(Tiere A, C und D) bzw. 5 (Tier B). Die Proben der Tiere wiesen zu diesen Zeitpunkten eine

DFI von 64,3 % (Bulle A), 69,0 % (Bulle B), 86,1 % (Bulle C) und 89,5 % (Bulle D) auf. In

den Folgewochen fielen die Werte wieder und erreichten zu Versuchsende annähernd das

Ausgangsniveau.

Die durchschnittlichen Prozentsätze chromatininstabiler Spermien, errechnet aus allen

während der Versuchslaufzeit erhobenen Daten, lagen bei 23,1 % (Bulle C), 30,9 %

(Bulle B), 33,1 % (Bulle D) und 33,7 % (Bulle A).

- 63 - Ergebnisse

Abb. 4.13: Prozentualer Anteil chromatininstabiler Spermien in den Proben der vier Bullen (Bulle A, Bulle B, Bulle C, Bulle D) vor und nach der lokalen 48-stündigen Wärmeapplikation

4.6.2 Einfluss der Hyperthermie auf die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies

4.6.2.1 Einfluss der Hyperthermie auf den prozentualen Anteil fluoreszierender Spermien in stimulierten und unstimulierten Proben nach DHR/PI–Färbung

Bei der Erstellung der Kurven für die stimulierten und unstimulierten Proben konnte ein

identischer Kurvenverlauf festgestellt werden. Aus diesem Grunde werden in Abbildung 4.14

die Änderungen im prozentualen Anteil fluoreszierender Zellen anhand der unstimulierten

Proben der vier Bullen dargestellt. Zwischen den Wochen 3 und 6 bzw. 8 war es anhand des

hohen Fremdzellgehalts in den Proben der Tiere D und B nicht möglich, mit Hilfe der

Durchflusszytometrie verlässliche Daten zu erheben. Aus diesem Grund werden in diesem

Zeitraum keine Werte dargestellt.

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Wärmeapplikation

Wochen vor (0) und nach der Wärmeapplikation

proz

entu

aler

Ant

eil

chro

mat

inin

stab

iler

Spe

rmie

n [%

]

- 64 - Ergebnisse

Die Ausgangswerte lagen bei durchschnittlich 62,1 % (Bulle A: 69,7 %, Bulle B: 64,0 %,

Bulle C 62,5 % und Bulle D: 52,0 %). Es folgte ein stetiger Abfall der Prozentsätze

fluoreszierender Spermazellen bei allen Tieren auf minimal 14,2 % (Bulle C) bzw. 14,1 %

(Bulle A) in den Wochen 4 bzw. 5. Die Proben der Tiere B und D erreichten auswertbare

Tiefpunkte von 36,5 % bzw. 21,1 % in Woche 3. Im Anschluss stiegen die Prozentsätze aller

Tiere wieder bis auf Ausgangsniveau. Die Proben der Tiere D und B waren erst ab Woche 6

bzw. 8 wieder auswertbar.

Abb. 4.14: Prozentualer Anteil fluoreszierender Spermien in den unstimulierten Proben der vier

Bullen (Bulle A, Bulle B, Bulle C, Bulle D) nach DHR/PI-Färbung vor und nach der lokalen 48-stündigen Wärmeapplikation

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Wochen vor (0) und nach der Wärmeapplikation

Wärmeapplikation

A

ntei

l flu

ores

zier

ende

r S

perm

ien

[%]

- 65 - Ergebnisse

4.6.2.2 Einfluss der Hyperthermie auf die Fluoreszenzintensität unstimulierter Spermien nach DHR/PI-Färbung

Die DHR-Fluoreszenzintensität der unstimulierten Proben vor und nach der

Wärmeapplikation zeigte einen ähnlichen Kurvenverlauf für alle Tiere bei individuellem

Ausmaß der Reaktion (Abb. 4.15). Bulle A wies, abweichend von den anderen

Versuchstieren, in Woche 3 einen Anstieg der DHR-Fluoreszenzintensität auf.

Nach Beendigung der Wärmeapplikation trat, verglichen mit dem mittleren Ausgangswert

von 14,5 (Bulle A: 12,4, Bulle B: 14,8, Bulle C: 17,3, Bulle D: 13,5) im Anschluss an Woche

1 ein durchschnittlicher Fluoreszenzabfall der unstimulierten Proben aller Tiere auf. Die

Werte der Bullen B und D sanken auf die geringsten Minimalwerte von 1,5 (Woche 5) bzw.

2,6 (Woche 4) ab. Im Anschluss an Woche 4 stieg die Fluoreszenz der Spermien des Bullen D

wieder an und verblieb ab Woche 6 auf Ausgangsniveau. Die Fluoreszenzintensität der

unstimulierten Probe des Bullen B wies in Woche 6 einen punktuellen Anstieg auf, fiel aber

in Woche 7 erneut auf Minimalniveau ab, gefolgt von einem Anstieg mit Erreichen des

Ausgangsniveaus in Woche 10.

Die Spermienfluoreszenz der unstimulierten Proben des Bullen C fiel im Anschluss an Woche

1 auf einen durchschnittlichen Wert von 9,1 in den Wochen 2 bis 5 ab. Es folgte ein

Wiederanstieg mit Erreichen des Ausgangsniveaus ab Woche 7. In Woche 8 zeigte sich bei

diesem Bullen ein punktueller Abfall auf 12,3.

Die Proben des Bullen A wiesen im Anschluss an Woche 1 einen Tiefpunkt mit einer

Fluoreszenzintensität von 3,7 in Woche 2 auf. Danach fand ein Anstieg bis auf

Ausgangsniveau statt (Woche 3), gefolgt von einem erneuten Fluoreszenzabfall mit einem

Wert kurz über Minimalniveau in Woche 5. Ab Woche 6 lagen die Werte dieses Bullen erneut

auf Ausgangsniveau.

Die Durchschnittswerte pro Tier, gebildet aus allen Werten der Versuchsphase, zeigen die

unterschiedlichen Reaktionen der Einzeltiere. Die mittlere Fluoreszenzintensität lag bei 6,8

(Bulle B), 10,3 (Bulle D), 10,9 (Bulle A) und 13,7 (Bulle C).

- 66 - Ergebnisse

Abb. 4.15: Fluoreszenzintensität unstimulierter Spermien in den Proben der vier Bullen (Bulle A,

Bulle B, Bulle C, Bulle D) nach DHR/PI-Färbung vor und nach der lokalen 48-stündigen Wärmeapplikation

4.6.2.3 Einfluss der Hyperthermie auf die Fluoreszenzintensität stimulierter Spermien nach

DHR/PI-Färbung

Die DHR-Fluoreszenzintensität der mittels H2O2 stimulierten Spermien unterlag sehr

ähnlichen Veränderungen wie die der unstimulierten Samenzellen (Abb. 4.16). Die

Fluoreszenzintensität war jedoch insgesamt erhöht, und es konnte in Woche 1, verglichen mit

dem durchschnittlichen Ausgangswert von 32, bei allen Tieren ein gemittelter punktueller

Anstieg um 22 % verzeichnet werden, bevor es im Anschluss zu dem in 4.6.2.2 beschriebenen

deutlichen Fluoreszenzabfall kam.

Flu

ores

zenz

inte

nsit

ät

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

17,5

20,0

22,5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Wärmeapplikation

Wochen vor (0) und nach der Wärmeapplikation

- 67 - Ergebnisse

Abb. 4.16: Fluoreszenzintensität stimulierter Spermien in den Proben der vier Bullen (Bulle A,

Bulle B, Bulle C, Bulle D) nach DHR/PI-Färbung vor und nach der lokalen 48-stündigen Wärmeapplikation

Flu

ores

zenz

inte

nsit

ät

Wärmeapplikation

Wochen vor (0) und nach der Wärmeapplikation

-10

0

10

20

30

40

50

60

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

- 68 - Diskussion

5 Diskussion Seit etwa zwei Jahrzehnten werden sonographische Untersuchungen im B-Modus

durchgeführt, um die klinischen Befunde am Hoden zu objektivieren (SIDIBÉ et al. 1992;

GLATZEL et al. 1996; LÜERSSEN u. JANTHUR 2001; GOULETSOU et al. 2004). Diese

Untersuchungsmethode birgt den Nachteil, dass die Auswertung der erstellten Bilder in der

Regel subjektiv mit dem menschlichen Auge erfolgt (HERMES 1998). GABOR et al. (1998)

wandten erstmals ein computergestütztes Verfahren zur Beurteilung der Echogenität

sonographischer B-Bilder des Hodens an. Sowohl letztgenannte als auch andere Autoren

(GRAUE 2002; BRITO et al. 2003; ARTEAGA et al. 2005) konnten mit Hilfe dieser Technik

Zusammenhänge zwischen der sonographischen Echotextur und der Spermaqualität beim

Bullen aufzeigen. In allen bisherigen Untersuchungen wurden ausschließlich

Echotexturparameter der ersten Ordnung bestimmt. Diese geben Auskunft über die Häufigkeit

bestimmter Grauwerte, nicht aber über deren Anordnung. Seit einigen Jahren stehen

Software-Programme zur Verfügung, welche auch die Erfassung von Echotexturparametern

der zweiten Ordnung möglich machen und somit eine Aussage über die räumliche Verteilung

der Pixel mit bestimmten Grauwerten erlauben (SZCZYPINSKÌ 1998; SCHMAUDER 2003).

Bei der sonographischen Untersuchung des Hodens wird seit einigen Jahren neben dem

B-Bild auch der Doppler-Modus eingesetzt. Dabei ergaben sich Hinweise auf

Zusammenhänge zwischen der testikulären Blutversorgung und der Spermaproduktion bzw.

-qualität. So konnten in der Humanmedizin (BATTAGLIA et al. 2000; BIAGIOTTI et al.

2002; TARHAN et al. 2003) und Veterinärmedizin (BERGH et al. 2001; SCHEIBENZUBER

2005) Abhängigkeiten zwischen dem testikulären Blutfluss und der Spermaqualität

beobachtet werden.

Im Rahmen der spermatologischen Diagnostik wurden in den letzten Jahren bei verschiedenen

Spezies vermehrt Fluoreszenzfärbungen der Spermien eingesetzt und mittels

Durchflusszytometrie beurteilt (BALLACHEY et al. 1987; EVENSON et al. 1991;

KARABINUS et al. 1997; LOVE u. KENNEY 1999; KRIENKE 2003; WU 2005). Diese

Technik hat den Vorteil, dass in sehr kurzer Zeit eine große Spermienpopulation objektiv

erfasst werden kann.

- 69 - Diskussion

Auf diese Weise sind sehr gut reproduzierbare Daten über Zelleigenschaften erhältlich

(BALLACHEY et al. 1987; EVENSON et al. 1991). Da es eine Vielzahl von Farbstoffen gibt,

die als Marker für unterschiedlichste Zellcharakteristika eingesetzt werden können, ist die

Bestimmung verschiedener Spermaparameter möglich. Ein Farbstoff, welcher erst seit kurzem

in der Spermatologie angewendet wird, ist z.B. Dihydrorhodamin (HECZKO 2004). Dieser

Farbstoff wird bei anderen Zellen als Marker für oxidative Prozesse eingesetzt

(OSTROVIDOV et al. 2000). Es ist allerdings noch nicht genau bekannt, wie sensitiv dieser

auf Spermazellveränderungen reagiert.

Die experimentell induzierte Hyperthermie des Skrotums ist ein häufig gewähltes Modell, um

an Hodengewebe (SIDIBÉ et al. 1992; BRITO et al. 2003; ARTEAGA et al. 2005) und

Spermien (EL AZAB 1966; ROSS u. ENTWISTLE 1978; WILDEUS u. ENTWISTLE 1986;

ARTEAGA et al. 2005; WU 2005) artifiziell pathologische Veränderungen zu induzieren.

Durch eine Reihe von Untersuchungen ist mittlerweile relativ genau bekannt, welche

histologischen Alterationen die Hodenerwärmung bewirkt (ROSS u. ENTWISTLE 1978;

WILDEUS u. ENTWISTLE 1986; KHAN u. BROWN 2002).

Ziel dieser Arbeit war es zu überprüfen, ob im Rahmen der zweidimensionalen

Echotexturanalyse sonographischer B-Bilder sowie der farbdopplersonographischen

Untersuchung des Blutflusses der A. testicularis gegenüber den herkömmlichen Methoden

zusätzliche Informationen über pathologische Veränderungen des Hodengewebes gewonnen

werden können. Außerdem sollte überprüft werden, inwieweit sich neue

durchflusszytometrische Assays zur Beurteilung der Spermaqualität eignen. Für die

Untersuchungen wurde das Modell der experimentell induzierten Hyperthermie des

Hodengewebes eingesetzt, um kontrolliert Veränderungen am Hodengewebe und an den

Spermien zu induzieren.

- 70 - Diskussion

5.1 Klinische Befunde und skrotale Oberflächentemperatur

Das klinische Allgemeinbefinden der Tiere war während und nach der Wärmeapplikation

ungestört. Die Tiere zeigten kein Fieber und verhielten sich unauffällig. Die

maximalen Zunahmen der skrotalen Oberflächentemperatur während der Wärmeapplikation,

verglichen mit den Ausgangswerten, lagen bei 3,9°C (Bulle B), 5,5°C (Bulle A), 6,3°C

(Bulle C) und 6,6°C (Bulle D) (Mittelwert: 5,6°C). In der Studie von WU (2005)

wurden etwas höhere Temperaturzunahmen mit Werten zwischen 6,3 und 7,1°C

erzielt, während andere Autoren geringere Anstiege der Skrotaltemperatur von 3,8°C

beobachteten (SIDIBÉ et al. 1992; BRITO et al. 2003). Die unterschiedlich starken

Temperaturerhöhungen der Einzeltiere schwankten in diesem Versuch deutlich stärker

(2,7°C) als in der Studie von WU (2005) (1,1°C).

Einen Tag nach Abnahme des Gurtsystems lag eine deutliche Zunahme von

Hodensackumfang und -volumen sowie Hodenlänge und -dicke bei allen Tieren vor. Bulle B

zeigte die stärksten Veränderungen. Der Grund für die Zunahmen scheint, unter Beachtung

der zeitverzögert im Ejakulat protokollierten Entzündungszellen, eine durch die

Wärmeapplikation provozierte aseptische Entzündungsreaktion zu sein. LÜERSSEN und

JANTHUR (2001) stellten bei akuter entzündlicher Erkrankung des Hundehodens

ultrasonographisch eine Größenzunahme sowie eine rundlichere Form fest. GOULETSOU et

al. (2004) beobachteten nach intratestikulärer Injektion von Bakterien bei Schafböcken zur

experimentellen Induktion einer akuten Orchitis sowohl eine subkutane Ödematisierung als

auch Flüssigkeitsansammlung im Cavum vaginale.

Der im vorliegenden Versuch festgestellte Größenzuwachs des Skrotums lässt nicht unbedingt

Rückschlüsse auf eine Zunahme der Hodengröße zu. Ebenso ist als Ursache eine Verdickung

der Skrotalhaut und des peritestikulären Gewebes denkbar. Somit ist nicht auszuschließen,

dass es in der vorliegenden Studie, wie von GOULETSOU et al. (2004) beschrieben, zu einer

Hodenverkleinerung und Verdichtung des Hodengewebes gekommen ist.

Bulle B wies am Hodenhals zusätzlich eine Rötung der Haut auf. Es ist davon auszugehen,

dass aufgrund von massiverem Druck und starker Reibung durch das Gurtsystem eine

Reizung des Gewebes sowie des Blutgefäßsystems mit zusätzlicher Wärmeentwicklung und

Gewebeirritation stattgefunden hat, welche mit großer Wahrscheinlichkeit auch zu den

- 71 - Diskussion

deutlich stärker ausgeprägten Veränderungen vieler nachfolgend beschriebener Parameter

geführt hat.

5.2 Einfluss der Hyperthermie auf die Echotextur des Hodens

Der Einfluss der Hyperthermie auf die Hodentextur wurde in dieser Arbeit objektiv mit Hilfe

der Graustufenanalyse sonographischer, im B-Modus erstellter Bilder ermittelt. Es wurden der

mittlere Grauwert als Parameter erster Ordnung sowie der Kontrast und der vertikale

Fraktionswert als Parameter zweiter Ordnung untersucht.

Der mittlere Grauwert war in Woche 1, d.h. direkt nach der Wärmeapplikation deutlich

angestiegen und erreichte, ausgenommen bei Bulle B, in Woche 3 wieder das

Ausgangsniveau. In den Folgewochen traten tierindividuelle Unterschiede auf. Die Grauwerte

des Bullen C sanken, abweichend von den Werten der anderen Tiere, in Woche 6 punktuell

ab. Aufgrund des kontinuierlichen Abfalls ab Woche 4 ist hier nicht von einem Messfehler,

sondern von einer individuellen Einzelreaktion unbekannter Ursache auszugehen. Tier B

zeigte im Vergleich zu den anderen Bullen den höchsten mittleren Grauwert sowie eine um

drei Wochen zeitverzögerte Rückkehr bis auf Ausgangsniveau, welches, wie bereits erwähnt,

auf die zusätzliche Reizung durch das Gurtsystem zurückzuführen ist.

ARTEAGA et al. (2005) verzeichneten im Anschluss an Woche 2 nach der Hyperthermie

einen Abfall des mittleren Grauwerts. BRITO et al. (2003) konnten dagegen während der

gesamten Versuchsphase keine Veränderungen des mittleren Grauwerts nachweisen.

Ursache dafür könnten geringere Temperaturerhöhungen (durchschnittlich 3,8°C) während

der Wärmeapplikation gewesen sein. Es ist davon auszugehen, dass es im Versuch von

ARTEAGA et al. (2005) zu einer ausgeprägten Ödematisierung ohne Gewebeverdichtung und

- durch die damit einhergehende Einlagerung sich hypoechogen darstellenden Wassers

(GLATZEL et al. 1996) - zu einer Erniedrigung des mittleren Grauwerts gekommen ist.

Das Ausbleiben derartiger Reaktionen im Versuch von BRITO et al. (2003) ist

höchstwahrscheinlich auf eine geringere genetische Empfindlichkeit der verwendeten, an

heiße Klimazonen adaptierte Rassen (Bos indicus sowie Bos indicus x Bos taurus Bullen)

gegenüber hohen Temperaturen zurückzuführen. SKINNER und LOUW (1966)

machten ähnliche Beobachtungen hinsichtlich der Spermaqualität bei Bullen aus warmen

Klimazonen. Nach einer Hyperthermie wiesen diese nur geringe Veränderungen in der

Spermaqualität auf.

- 72 - Diskussion

Die Auswirkungen der lokalen Wärmeapplikation auf die Echotexturparameter zweiter

Ordnung waren von Tier zu Tier unterschiedlich. Der Kontrast, bestimmt durch

die Grauwertunterschiede von Pixelpaaren, welche im Analysefeld durch einen

bestimmten Vektor miteinander verbunden sind, wies ähnliche Veränderungen wie der

mittlere Grauwert auf. Allerdings stiegen die Werte, anders als beim mittleren Grauwert, bei

den meisten Bullen in Woche 2 weiter an und sanken erst danach, ähnlich wie die mittleren

Grauwerte, wieder ab.

Der vertikale Fraktionswert, welcher die relative Häufigkeit identischer, vertikaler

Grauwertanalysen festgesetzter Länge in der Analyseregion beschreibt, wies unerwartete

Veränderungen auf. Bei den Bullen A und C trat in den Wochen 1 und 2 ein leichter Anstieg

auf, mit unmittelbar darauf folgendem Absinken auf Ausgangsniveau. Der Bulle C fiel in

Woche 6, wie auch schon beim mittleren Grauwert und Kontrast beschrieben, durch einen

punktuellen Abfall des vertikalen Fraktionswertes auf. Die Tiere B und D wiesen nach einem

ebenfalls kurzen Anstieg direkt nach der Wärmeapplikation ab Woche 3 deutlich erniedrigte

Werte mit einem Anstieg bis auf Ausgangsniveau ab Woche 5 auf.

Die Ergebnisse zeigen, dass die Echotexturparameter zweiter Ordnung zusätzliche

Informationen über das zu untersuchende Gewebe liefern. Bisher fehlen vergleichbare

Analysen von Echotexturparametern zweiter Ordnung am Hoden. Es existieren allerdings

Studien, in denen Echotexturparameter zweiter Ordnung nach der Erstellung von B-Bildern

anderer Organsysteme bestimmt wurden. SCHMAUDER (2003) beobachtete im Rahmen

sonographischer Untersuchungen zyklusbedingter Veränderungen der Echotextur des

Endometriums der Kuh, dass die „Homogenität“, ein Echotexturparameter zweiter Ordnung,

in der Lage war, die östrogenbedingten Änderungen im Zeitraum des Östrus darzustellen,

während der mittlere Grauwert relativ konstant blieb.

Die unterschiedlichen Reaktionen bei den vier Bullen lassen individuelle Einflüsse vermuten

(ROSS u. ENTWISTLE 1978). Bei den Bullen B und D kam es im Vergleich zu den Tieren A

und C zu einer zusätzlichen Reizung von Gewebe und Blutgefäßsystem durch das Gurtsystem

bzw. durch eine stärkere Temperaturerhöhung um 6,6°C während der Wärmeapplikation.

Dieses kann, gepaart mit einer möglicherweise geringeren Fähigkeit des Bullen D mittels

Thermoregulation das Hodengewebe zu schützen, den Grund für die sichtbaren individuellen

Veränderungen des vertikalen Fraktionswerts dieser Tiere darstellen. VOGLER et al. (1993)

verwiesen bei tierindividuellen Reaktionen innerhalb einer Rasse auf die gerade beschriebene

- 73 - Diskussion

mangelnde Fähigkeit der Thermoregulation. Diese könnte auf eine verringerte Anzahl

von Schweiß- und Talgdrüsen, welche nach Aussagen von BLAZQUEZ et al. (1988) an

der Thermoregulation beteiligt sind, oder auf eine mangelnde Fähigkeit der Relaxation

des Musculus cremaster und der Tunica dartos zurückzuführen sein. Der letztgenannte

Punkt wurde von HARTIG (1954) und SETCHELL (1978) als zentraler Mechanismus für

die Erhaltung der 2 bis 6°C kühleren Hodentemperatur im Vergleich zur

Körperkerntemperatur beschrieben.

Eine eindeutige Zuordnung der Veränderungen der Echotexturparameter zweiter Ordnung ist

aufgrund bisheriger fehlender Daten zum Hoden nicht möglich. Der Anstieg beider Parameter

zweiter Ordnung sowie des mittleren Grauwerts direkt nach der Wärmeapplikation ist

wahrscheinlich auf eine Entzündungsreaktion mit Gewebeverdichtung zurückzuführen.

GRAUE (2002) wies im Vergleich zu Kälbern eine Gewebeverdichtung bei pubertären

Bullen nach. GOULETSOU et al. (2004) erklärten die verstärkte Echogenität mit einer

Kalzifikation der Tubuli in der akuten Entzündungsphase. Der in der vorliegenden Studie

beschriebene Abfall des vertikalen Fraktionswertes der Tiere B und D weist auf eine

entzündungsbedingte Flüssigkeitszunahme im Gewebe hin, welche im Zusammenhang mit

dem mittleren Grauwert in Bezug auf die Ergebnisse von ARTEAGA et al. (2005) bereits

diskutiert wurde. Es ist anzunehmen, dass die Parameter zweiter Ordnung eine detailliertere

Aussage über Echotexturveränderungen am Hoden ermöglichen und folglich die in der

vertikalen Fraktionsanalyse beobachtete Abnahme der Grauintensität der Hodentextur der

Bullen B und D bei der Erhebung des mittleren Grauwerts verborgen blieb.

5.3 Einfluss der Hyperthermie auf den Blutfluss der A. testicularis

In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals der Einfluss einer Hyperthermie auf den

testikulären Blutfluss beim Bullen untersucht. Der neben der mittleren

Blutflussgeschwindigkeit ermittelte Resistance Index (RI) stellt ein Maß für den

Blutflusswiderstand des vom untersuchten Gefäß versorgten Organs dar.

Die mittlere Blutflussgeschwindigkeit der A. testicularis nahm direkt nach der

Wärmeapplikation bei allen Tieren ab. Tierindividuell sanken die Werte bis zur ersten (Bullen

B und C) bzw. zweiten Woche (Bullen A und D). Danach lagen sie mit Schwankungen auf

(Bulle A, C und D) oder geringfügig über (Bulle B) Ausgangsniveau. Der Anstieg der

mittleren Blutflussgeschwindigkeit diese Bullen ist vermutlich auf ausgeprägte

Regenerationsprozesse im Hoden zurückzuführen. Tier C zeigte abweichende Werte

- 74 - Diskussion

unbekannter Ursache im späten Versuchsverlauf. Die Blutflussgeschwindigkeit der A.

testicularis dieses Bullen sank zwischen Woche 5 und 7 erneut deutlich ab. Das die mittlere

Blutflussgeschwindigkeit nach der Hyperthermie abnahm, war insofern überraschend, als eine

Gewebeerwärmung gewöhnlich mit vermehrter Durchblutung einhergeht. Vergleichsdaten

aus anderen Studien stehen derzeit nicht zur Verfügung, es ist aber davon auszugehen, dass

während und unmittelbar nach der Hyperthermie eine entzündungsbedingte Hyperämie

vorgelegen hat. HORSTMANN und Mitarbeiter (1991) beschrieben dieses Phänomen bei

akuten, entzündungsbedingten Erkrankungen der Hoden des Mannes. Da in der vorliegenden

Studie die Blutflussmessung erst 30 Stunden nach Abschluss der Wärmeapplikation

durchgeführt wurde, ist es durchaus möglich, dass die hyperämische Phase zu diesem

Zeitpunkt bereits beendet war.

Die festgestellte Abnahme der mittleren Blutflussgeschwindigkeit beruht

höchstwahrscheinlich auf der bereits beschriebenen entzündungsbedingten

Gewebeverdichtung der Hoden (GOULETSOU et al. 2004) und einer darauf beruhenden

Einengung der Gefäße mit Stauung des Blutflusses. Für diese Vermutung spricht auch der

parallel zum Abfall der mittleren Blutflussgeschwindigkeit beobachtete Anstieg des

Resistance Index bei dem Bullen B.

Der Resistance Index zeigte jedoch nur bei diesem Bullen Veränderungen. So stieg der

Widerstandswert in Woche 1 deutlich an, sank im Anschluss kontinuierlich wieder ab und lag

ab Woche 5 auf Ausgangsniveau. Bei den drei anderen Tieren veränderten sich die Werte

während der Versuchslaufzeit nur unbedeutend. POZOR und McDONNELL (2004) stellten

nur bei starken pathologischen Veränderungen der Hoden eine Erhöhung des RI fest.

HORSTMANN et al. (1991) beschreiben eine Verringerung des RI in den Arterien

entzündeter Hoden, die höchstwahrscheinlich auf eine inflammatorisch bedingte Dilatation

der Gefäße mit Verringerung des peripheren Widerstands bei fehlender Verdichtung des

Hodengewebes zurückzuführen ist.

- 75 - Diskussion

5.4 Einfluss der Hyperthermie auf die konventionellen Ejakulatparameter

Spermienkonzentration und Spermiengehalt

Die Spermienkonzentration sank nach der Hyperthermie bei allen Bullen deutlich ab. Bei den

Bulle A und B zeigte sich zwischen der 2. und 10. Woche, beim Bulle D zwischen der 3. und

10. Woche eine verringerte Konzentration an Spermien pro Milliliter.

Die Anzahl an Spermien im Gesamtejakulat fiel ebenfalls ab Woche 2 bzw. 3, stieg dann

jedoch in Woche 9 deutlich an und erreichte in Woche 10 das Ausgangsniveau. Folglich ist

die geringe Spermienkonzentration in Woche 10 auf eine Zunahme des Ejakulatvolumens

zurückzuführen. Der Spermiengehalt des Bullen C pro Milliliter und im Gesamtejakulat wies,

verglichen mit den anderen Tieren, eine geringere Reduktion in den Wochen 3 bis 6 auf. Nach

Erreichen des Ausgangsniveaus in Woche 7 erfolgte bei diesem Bullen ein erneuter

punktueller Abfall beider Parameter in Woche 8, welcher vermutlich nicht direkt auf die

Hyperthermie, sondern auf eine unbekannte Ursache zurückzuführen ist.

EL AZAB (1966) und GOULETSOU et al. (2004) führten die Verringerung der

Spermienkonzentration auf eine hyperthermiebedingte Auflösung des epithelialen

Zellverbands mit anschließender Verringerung der Mitoseaktivität zurück.

Aufgrund des relativ frühen Absinkens der Werte in dieser Studie wird eine beschleunigte

Nebenhodenpassage vermutet.

VOGLER et al. (1991, 1993) konnten keine Konzentrationsverringerung in den Ejakulaten

nachweisen. Die Ergebnisse bezüglich der Konzentrationsänderungen waren in der Studie von

WU (2005) mit denen des vorliegenden Versuchs annähernd identisch.

ROSS und ENTWISTLE (1978) ermittelten, vergleichbar mit dem vorliegenden Versuch,

sehr starke Unterschiede im Konzentrationsabfall von Tier zu Tier. Die Autoren führten dies

auf unterschiedliche tierindividuelle Empfindlichkeiten zurück. Diese scheinen auch der

Grund für die abweichenden Ergebnisse von VOGLER et al. (1991, 1993) im Vergleich zur

vorliegenden Studie zu sein, denn sowohl Versuchsaufbau als auch Rasse und

durchschnittliche Temperaturerhöhung während der Wärmeapplikation waren identisch. Die

gerade beschriebenen tierindividuellen Unterschiede innerhalb einer Rasse basieren entweder

auf einer unterschiedlichen Empfindlichkeit der Spermien im Nebenhoden sowie der

Spermatiden und Spermatozyten der Einzeltiere (ROSS u. ENTWISTLE 1978) oder aber auf

einer besonders guten bzw. schlechten Fähigkeit der Thermoregulation (VOGLER et al.

1993). Die Fähigkeit einer guten Wärmeregulation und / oder eine geringere

Thermoempfindlichkeit der Spermien scheint bei Tier C gegeben zu sein, denn dieses weist

- 76 - Diskussion

die geringsten Veränderungen trotz eines maximalen Temperaturanstiegs von 6,3°C während

der Wärmeapplikation auf.

Fremdzellgehalt

Als Fremdzellen wurden Spermatogenese-, Epithel- sowie Entzündungszellen protokolliert.

Besonders gehäuft zeigten sie sich in den Ausstrichen der Bullen B und D. Der

Fremdzellgehalt stieg synchron mit dem Abfall der Spermienkonzentration an. Ab der 3.

Woche waren im Ejakulat aller Tiere vermehrt Fremdzellen nachweisbar. Im Anschluss an

Woche 6 (Tiere A, C und D) bzw. 9 (Tier B) war der Ausgangsstatus wieder erreicht. Der

Anstieg war bei Bulle C geringer als bei den anderen Tieren. In den Proben der Bullen B und

D wurden die stärksten Zunahmen an Fremdzellen beobachtet. Die Zeitspanne hoher

Fremdzellgehalte war bei Tier B am längsten. Hierfür kann die starke Skrotalentzündung

aufgrund der Reibung des Gurtsystems am Hodenhals (Tier B) bzw. die deutliche

Temperaturerhöhung um 6,6°C, kombiniert mit einer schlechteren Fähigkeit der

Wärmeregulation (Tier D) verantwortlich sein (VOGLER et al. 1991). Auch eine individuell

höhere Gewebeempfindlichkeit des letztgenannten Tieres muss in Betracht gezogen werden

(ROSS u. ENTWISTLE 1978).

EL AZAB (1966) führte, wie bereits erwähnt, das Erscheinen von Spermatogenese- und

Epithelzellen auf die Auflösung des epithelialen Zellverbands zurück. KHAN und BROWN

(2002) beobachteten eine durch Wärmeapplikation induzierte Apoptose insbesondere von sich

in der Meiose befindendlichen Spermatogenesezellen. GOULETSOU et al. (2004)

beschreiben eine Auflösung des epithelialen Zellverbands kombiniert mit einer Infiltration

von Entzündungszellen bei einer akuten Orchitis.

- 77 - Diskussion

Vorwärtsmotilität

In den Proben aller Tiere zeigte sich ein deutlicher Rückgang des Anteils vorwärtsmotiler

Spermien direkt nach der Wärmeapplikation. Er fiel kontinuierlich ab Woche 1 bis Woche 3

und stieg im Anschluss an Woche 5 (Tiere A, C und D) bzw. 7 (Tier B) langsam wieder bis

leicht unter das Ausgangsniveau. Als Ursache des Motilitätsverlusts der Spermien wird eine

hyperthermiebedingte Störung der Spermienentwicklung und –reifung zugrunde gelegt

(WILDEUS u. ENTWISTLE 1986; VOGLER et al. 1991, 1993). Das frühe Absinken des

Anteils vorwärtsmotiler Spermien in der ersten Woche deutet auf eine Schädigung der im

Nebenhoden befindlichen Spermien hin.

Uneinheitliche Reaktionen der Einzeltiere auf die Wärmeapplikation können auf eine

individuell unterschiedliche Sensibilität der Spermien zurückgeführt werden (ROSS u.

ENTWISTLE 1978). Die langsamere Erholung der Spermienmotilität beim Bullen B deutet

auf eine verstärkte Entzündungsreaktion bedingt durch das Gurtsystem hin. GOULETSOU et

al. (2004) beschreiben eine zusätzliche Schädigung der Spermien bei hohem

Entzündungszellgehalt in Folge einer leukozytären Produktion von reaktiven

Sauerstoffspezies. Dieser Sachverhalt wurde von OCHSENDORF und PODDA (1999)

ebenfalls beschrieben.

Primäre und sekundäre Spermienanomalien

Um den Einfluss der Hyperthermie auf die Spermienmorphologie zu charakterisieren, wurden

in dieser Studie die Anteile an primären und sekundären Spermienanomalien bestimmt. Ein

erhöhter Anteil an primären Anomalien war bei allen Tieren ab Woche 2 zu verzeichnen. Es

zeigten sich Kopf- sowie Schwanz- und Mittelstückdeformationen, wobei die Kopfanomalien

deutlich dominierten.

Ein erhöhter Anteil an sekundären Spermienanomalien war ab Woche 1 bis Woche 4 (Tier B)

bzw. bis Woche 6 (Tiere A, C und D) zu beobachten und trat daher deutlich eher im Ejakulat

auf als die Zunahme der primären Veränderungen. Dieser Sachverhalt entspricht den

Befunden von EL AZAB (1966), GOULETSOU et al. (2004) sowie WU (2005). Die

Entstehung sekundärer Anomalien wird der epididymalen Transitphase zugeordnet. Die

Bildung primärer Anomalien ist auf eine Schädigung der Spermatiden und Spermatozyten

während der Spermatogenese zurückzuführen (EL AZAB 1966; WILDEUS u. ENTWISTLE

1986; VOGLER et al. 1991 u. 1993; WU 2005).

- 78 - Diskussion

5.5 Einfluss der Hyperthermie auf die durchflusszytometrisch ermittelten

Ejakulatparameter

Spermienchromatinstabilität

Zur Charakterisierung der Spermienchromatinstabilität wurde ein bereits etabliertes

Verfahren, der SCSA™ (Sperm Chromatin Structure Assay) angewandt.

Beim SCSA™ zeigte sich eine Zunahme chromatingeschädigter Spermien ab Woche 1 mit

Höhepunkten in Woche 4 (Bullen A, C, und D) bzw. 5 (Bulle B). Zu Versuchsende lagen die

Werte wieder leicht über Ausgangsniveau. KARABINUS et al. (1997) und WU (2005)

erzielten vergleichbare Ergebnisse. Die Entstehung der Chromatinveränderungen ist auf eine

Schädigung der Spermatiden und Spermatozyten während der Spermatogenese

zurückzuführen (KARABINUS et al. 1997).

KHAN und BROWN (2000) verweisen auf eine besondere Empfindlichkeit sich in der

Meiose befindender Spermatozyten gegenüber Hitzeeinwirkung. Dies wird auch in der

vorliegenden Färbung anhand der Maximalwerte in den Wochen 4 und 5 deutlich. Die

geringgradigen Veränderungen bereits in Woche 1 könnten, wie von KARABINUS et al.

(1997) versucht wurde zu erklären, auf eine Schädigung der Spermazellen im Nebenhoden

zurückgeführt werden. Es wäre aber auch denkbar, dass, wie bereits erwähnt, bei den Bullen

in der vorliegenden Studie eine verkürzte Nebenhodenpassage vorlag und es daher,

vergleichbar mit den Studien von LOVE und KENNEY (1999) und WU (2005), zu keiner

hyperthermiebedingten Schädigung der im Nebenhoden liegenden Spermien kam.

Reaktive Sauerstoffspezies

Die Färbung der Spermien mit DHR dient dem Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies (ROS),

welche in erhöhten Konzentrationen zu Funktionseinschränkungen der Spermien führen

(OCHSENDORF u. PODDA 1999). Die Oxidation von DHR zu Rhodamin ist proportional

zur vorliegenden Menge reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) (HALLIWELL u. WHITEMAN

2004), welche vorrangig in den Mitochondrien im Rahmen des aeroben Stoffwechsels

gebildet werden (OCHSENDORF u. PODDA 1999). Im vorliegenden Versuch fiel die

Fluoreszenzintensität der Spermien nach DHR-Färbung im Anschluss an Woche 1 deutlich ab

und erreichte in Woche 6 (Tiere A, C und D) bzw. 10 (Tier B) wieder das Ausgangsniveau.

Bei den stimulierten Spermien konnte in Woche 1 ein punktueller Fluoreszenzanstieg

verzeichnet werden, bevor es zu einem starken Fluoreszenzabfall kam. Bei einer Schädigung

der Spermie, beispielsweise durch Kryokonservierung, kann es zu einer

- 79 - Diskussion

Funktionseinschränkung des antioxidativen Systems mit der Folge vermehrt vorliegender

ROS kommen (BILODEAU et al. 2000). Diese wiederum sind für eine erhöhte Fluoreszenz

verantwortlich. Bei der vorliegenden Studie ist allerdings von einer gravierenden Schädigung

der Mitochondrien durch die Hyperthermie auszugehen, weshalb im Anschluss an Woche 1

weniger ROS gebildet wurden und somit die Fluoreszenz abnahm (EVENSON et al. 1982).

Die Vermutung über eine Schädigung der Mitochondrien wird durch zeitliche

Übereinstimmung der Reduktion vorwärtsmotiler Spermien und der gesteigerten

Fluoreszenzintensität gestützt. Der punktuelle Fluoreszenzanstieg bei den stimulierten

Spermien in Woche 1 könnte als eine Reaktion bei abgeschwächter Schädigung im

Nebenhoden geschützter Spermazellen gedeutet werden. Die Stimulation mittels

Wasserstoffperoxid stellt einen zusätzlichen Stress für die Zelle dar, welcher von intakten,

nicht aber von hitzebeeinträchtigten Spermien kompensiert werden kann. Nach dieser

Hypothese könnte es, wie oben bereits erwähnt, zu einem Ungleichgewicht zu Gunsten der

ROS in der Zelle gekommen sein, was eine stärkere Fluoreszenz in Woche 1 zur Folge gehabt

hätte.

Der prozentuale Anteil fluoreszierender Samenzellen lässt aufgrund des in der Färbung

ebenfalls enthaltenen Todfarbstoffs Propidiumjodid (PI) eine Aussage über den Anteil

membranintakter Samenzellen zu. GARNER et al. (1994) beschreiben eine hohe

Bindungsaffinität des Farbstoffs PI zur Zell-DNA ausschließlich bei defekter

Plasmamembran. Solange die Membran intakt ist, kann der Farbstoff diese nicht

durchdringen. Im vorliegenden Versuch konnte ein Einbruch des prozentualen Gehalts an

membranintakten Spermien ab Woche 1 verzeichnet werden. Im Anschluss an Woche 6

stiegen die Werte wieder bis auf Ausgangsniveau an. Diese Abnahme des Prozentsatzes

membranintakter Spermien ist auf eine Membranschädigung während der Hyperthermie

zurückzuführen. Sehr ähnliche Beobachtungen hatte auch WU (2005) gemacht.

- 80 - Diskussion

5.6 Zusammenhänge zwischen der Echotextur des Hodens, dem Blutfluss

der A. testicularis sowie den untersuchten Ejakulatparametern

Die Verringerung der mittleren Blutflussgeschwindigkeit zeigte sich zeitgleich mit der

Erhöhung des mittleren Grauwerts und des Kontrasts der Echotextur. Alle drei Parameter

normalisierten sich im Anschluss an Woche 2. Ab diesem Zeitpunkt kam es zu

Veränderungen bei den konventionellen Spermaparametern. Frühe Indikatoren für eine

vorangegangene Schädigung von Hodengewebe und Spermien waren das Auftreten

sekundärer Spermienanomalien sowie eine deutliche Abnahme des Anteils

vorwärtsbeweglicher Spermien auf Werte unterhalb von 30 % in Woche 2. Die

Spermienkonzentration und der Gehalt primärer Spermienanomalien veränderten sich erst ab

Woche 3 deutlich. Zum gleichen Zeitpunkt wiesen die Ejakulate eine deutliche Zunahme von

Entzündungs-, Epithel- und Spermatogenesezellen mit Höhepunkt in Woche 5 auf.

Übereinstimmend mit den Ergebnissen von ARTEAGA et al. (2005) konnte auch in diesem

Versuch eine zeitliche Verzögerung von 2 bis 3 Wochen zwischen Alterationen im B-Bild

und Veränderungen der konventionellen Spermaparameter beobachtet werden.

Der Anstieg der Fluoreszenz und des prozentualen Gehalts fluoreszierender Zellen nach

DHR/PI-Färbung geben einen frühzeitigen Hinweis auf eine vorangegangene Schädigung.

Die genannten Parameter veränderten sich schon in Woche 1. Der Anstieg der Fluoreszenz

konnte im vorliegenden Versuch allerdings nur bei den stimulierten Proben beobachtet

werden. Die Veränderungen in der Chromatinstruktur der Spermien waren erst ab der zweiten

Woche deutlich sichtbar.

Parameterübergreifend fiel auf, dass der Bulle B mit der stärksten Zunahme der

Hodendimensionen als einziges Tier eine Erhöhung des RI zeigte und bei den Parametern

mittlerer Grauwert, Spermienkonzentration, Vorwärtsmotilität und Fremdzellgehalt die

stärksten Veränderungen aufwies. Des Weiteren zeigte er bei den Parametern mittlerer

Grauwert, Kontrast, Vorwärtsmotilität, Fremdzellgehalt, primäre Spermienanomalien und

Fluoreszenzintensität nach DHR/PI-Färbung eine zeitverzögerte Normalisierung im Vergleich

zu den anderen drei Tieren. Diese Abweichungen lassen sich auf die nur bei diesem Tier

eingetretene lokale Reizung durch das Gurtsystem und die in der Folge verstärkte Entzündung

mit längerer Regenerationsphase zurückführen.

Des Weiteren konnte die individuelle Reaktion des Tieres C im letzten Drittel der

Versuchsphase sowohl in den ultrasonographisch ermittelten Echotexturparametern

- 81 - Diskussion

(Woche 6), im mittleren Blutfluss (Woche 7), in der Spermienkonzentration und

Vorwärtsmotilität (Woche 8) als auch in der Spermienfluoreszenz nach DHR/PI-Färbung

(Woche 8) dargestellt werden. Auch hier wurde eine Zeitverzögerung zwischen dem

Auftreten veränderter Ultraschallbefunde und Spermaparameter deutlich. Die Schädigungen

der Mitochondrien der Spermien werden anhand der gleichzeitigen Verringerung von

Vorwärtsmotilität und Fluoreszenzintensität nach DHR-Färbung deutlich. Beide Parameter

stellen Indikatoren für den Mitochondrienmetabolismus dar.

Die Veränderungen der Spermienchromatinstruktur und der primären Spermienanomalien

waren in ihrem Verlauf sehr ähnlich. Der deutlich höhere Anteil an chromatininstabilen

Spermien weist allerdings auf eine Schädigung der Erbsubstanz auch morphologisch

unauffälliger Spermien durch die Hyperthermie hin, was den Beobachtungen von WU (2005)

entspricht.

5.7 Schlussfolgerung und Ausblick

Da die im Rahmen der computergestützten Graustufenanalyse erhobenen

Echotexturparameter zweiter Ordnung teilweise andere hyperthermiebedingte Veränderungen

zeigten als der mittlere Grauwert als Parameter erster Ordnung, ist davon auszugehen, dass

erstere zusätzliche Informationen über die im Hodengewebe ablaufenden Prozesse liefern. Ob

diese Informationen hinsichtlich der Diagnose pathologischer Prozesse am Hoden von

Bedeutung sind, ist in künftigen klinisch ausgerichteten Studien durch Gegenüberstellung von

Befunden der Echotexturanalyse und histologischen Befunden abzuklären.

Aus dem Vergleich der Änderungen der beiden Blutflussparameter wird deutlich, dass die

mittlere Blutflussgeschwindigkeit ein sensitiverer Parameter zur Darstellung

entzündungsbedingter Veränderungen der Hodendurchblutung ist als der häufiger verwendete

Resistance Index.

Die durchflusszytometrische Untersuchung mittels Dihydrorhodamin gefärbter Spermien

stellt eine geeignete Methode vor allem zur Beurteilung der Mitochondrienfunktion dar. Nach

Stimulation mit Wasserstoffperoxid scheinen sich auch bei geringgradig geschädigten

Spermien Hinweise auf deren antioxidative Kapazität zu ergeben. Dies ist in künftigen

Studien durch Vergleich der Funktion antioxidativer Enzyme und der Fluoreszenzintensität

der Spermien nach DHR-Färbung zu prüfen.

- 82 - Zusammenfassung

6 Zusammenfassung

Albrecht, Pia Nicola:

„Testikuläre Gewebetextur und Durchblutung sowie

Ejakulatbeschaffenheit von Bullen unter Einbeziehung der Analyse

reaktiver Sauerstoffspezies und des Spermienchromatins nach

experimenteller skrotaler Hyperthermie“

Ziel dieser Arbeit war es, am Modell einer experimentell induzierten Hyperthermie die

Aussagekraft der zweidimensionalen Graustufenanalyse ultrasonographisch erstellter B-

Bilder im Hinblick auf entzündungsbedingte Echotexturveränderungen des Bullenhodens zu

untersuchen. Des Weiteren sollte überprüft werden, inwieweit Blutflussveränderungen der A.

testicularis auf der Grundlage entzündlicher Prozesse mit Hilfe der Dopplersonographie

erfasst werden können. Bei der durchflusszytometrischen Analyse stellte sich die Frage, ob

der Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies mit Hilfe der Dihydrorhodaminfärbung eine

geeignete Methode zur Beurteilung der Spermaqualität darstellt.

Die Hyperthermie wurde mittels einer lokalen Wärmeisolierung des Skrotums von vier Bullen

(bezeichnet als Bullen A-D) über 48 Stunden herbeigeführt. Während der Erwärmung

konnten individuell unterschiedliche Erhöhungen der skrotalen Oberflächentemperatur

zwischen 3,9 und 6,6°C verzeichnet werden. Vor Anlegen des Gurtsystems fand eine

Erhebung der physiologischen Daten sowie in den 10 folgenden Wochen die Aufzeichnung

der hyperthermiebedingten Veränderungen statt. Die Echotextur- sowie Blutflussanalyse fand

einmal wöchentlich, die Erhebung der konventionellen und durchflusszytometrisch

ermittelten Parameter zweimal pro Woche in immer gleich bleibendem Abstand statt. Bei der

Echotexturanalyse von B-Bildern wurden die Parameter mittlerer Grauwert, Kontrast und

Vertical Fraction bestimmt. Eine farbdopplersonographische Untersuchung wurde zur

Ermittlung der mittleren Blutflussgeschwindigkeit und des Resistance Index angewendet. Die

Graustufenanalysesoftware MaZda® diente der Erhebung des mittleren Grauwerts als ein

Parameter erster Ordnung, sowie des vertikalen Fraktionswerts und des Kontrasts als

Analyseparameter zweiter Ordnung. Durchflusszytometrisch wurde der SCSA™ zur

Bestimmung der Chromatinstruktur und die Messung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies

nach Dihydrorhodaminfärbung durchgeführt.

Bei der klinischen Untersuchung der Tiere wies nur der Bulle B nach der Hyperthermie eine

Reizung der Skrotalhaut am Hodenhals mit deutlicher Schwellung des Skrotums bei

- 83 - Zusammenfassung

ungestörtem Allgemeinbefinden auf. Die anderen drei Tiere zeigten nur geringe skrotale

Umfangsvermehrungen.

Die Echotexturanalyse der sonographischen B-Bilder des Hodengewebes ergab bei den vier

Bullen für alle Parameter direkt im Anschluss an die Hyperthermie in den Wochen 1 bzw. 2

die höchsten Werte. Eine Rückkehr der Parameter mittlerer Grauwert und Kontrast auf das

Ausgangsniveau konnte bei drei Tieren in Woche 3, bei Tier B allerdings erst in Woche 6

verzeichnet werden. Der vertikale Fraktionswert nahm bei 2 Tieren in Woche 2 wieder die

ursprünglichen Werte an, während er bei den Bullen B und D über das Ausgangsniveau

hinaus abfiel und erst ab Woche 5 kontinuierlich wieder bis auf die Ursprungswerte anstieg.

Die mittlere Blutflussgeschwindigkeit war nur in Woche 1 abgefallen und lag ab Woche 2 bei

drei Tieren wieder auf Normalniveau. TAMV des Bullen B stieg über den Ursprungswert

hinaus an und blieb bis Versuchende auf einem leicht erhöhten Niveau. Der Resistance Index

wies nur beim letztgenannten Tier eine Erhöhung in Woche 1 mit anschließender Rückkehr

bis auf Ausgangsniveau (Woche 5) auf. Bei der konventionellen Spermaanalyse zeigte sich

eine Verringerung der Vorwärtsmotilität direkt nach Abnahme des Gurtsystems mit Tiefpunkt

in Woche 5 und anschließender Rückkehr bis kurz unter das Ausgangsniveau. Sekundäre

Spermienanomalien konnten zwischen den Wochen 1 und 4 (Tier B) bzw. 1 und 6 (Tiere A, C

und D) gemessen werden. Ab Woche drei wiesen die Ejakulate eine Verringerung von

Konzentration und Gesamtspermienzahl mit deutlichem Wiederanstieg ab Woche 9 auf, und

es konnten primäre Spermienanomalien bis einschließlich Woche 10 verzeichnet werden.

Zwischen Woche 3 und Woche 6 (Bullen A, C und D) bzw. 8 (Bulle B) wiesen die Ejakulate

deutliche Zunahmen von Entzündungs-, Epithel- und Spermatogenesezellen mit Höhepunkt in

Woche 5 auf. Durchflusszytometrisch wurde eine mit dem Anstieg der primären

Spermienanomalien vergleichbare Zunahme chromatingeschädigter Spermien nach

SCSA™-Färbung protokolliert. Die Fluoreszenzintensität nach Dihydrorhodaminfärbung

stieg in Woche 1 kurzzeitig an, fiel dann auf Tiefstwerte in Woche 4 bzw. 5 ab und

normalisierte sich anschließend auf Ausgangsniveau.

Die durchgeführten Untersuchungen zeigen, dass bei der Auswertung sonographischer B-

Bilder die Bestimmung von Echotexturparametern zweiter Ordnung sowie die

farbdopplersonographische Erfassung der mittleren Blutflussgeschwindigkeit gegenüber

herkömmlichen Verfahren zusätzliche Informationen über Hodenveränderungen liefern.

Außerdem können mit Hilfe der durchflusszytometrischen Analyse der Bildung reaktiver

Sauerstoffspezies frühzeitig Einschränkungen in der Funktion der Spermien nachgewiesen

werden.

- 84 - Summary

7 Summary

Albrecht, Pia Nicola:

“Tissue structure and blood flow of bull testes as well as

semen quality including the analysis of reactive oxygen species and

sperm chromatin structure following experimentally

induced scrotal hyperthermia”

The aim of this study was to investigate the suitability of two dimensional parameters

produced on B-mode ultrasound images during examining alterations of the echotextur in

testes of bulls generated by inflammatory processes using the model of experimentally

induced hyperthermia. In addition, it was investigated to which extent the alterations of blood

flow of the testicular artery induced by inflammation in the testicles could be detected by

doppler ultrasonography. It was also to clarify whether the detection of reactive oxygen

species by staining the sperms with dihydrorhodamin provide an objective possibility for the

assessment of sperm quality.

The hyperthermia was generated by local heating of testes of four bulls (designated as bulls

A-D) 48 hours long. The surface temperature of the scrotum rose between 3.9 and 6.6°C

depending on the animals during the phase of heating. The investigation of the bulls started

one week before the heating and was continued in the ten following weeks. The examination

of echotexture and blood flow was carried out once per week, the conventional and flow

cytometric data were measured twice per week always keeping the same interval between

each investigations. Mean grey scale value, contrast and vertical fraction were defined by

computer assisted grey scale analysis on B-mode ultrasound images whereas the mean blood

flow and resistance index were measured by colordoppler sonography. The mean grey scale

value as a parameter of the first order as well as contrast and vertical fraction representing

parameters of the second order were generated by the grey scale analysis software MaZda®

during the echotexture analysis. As flow cytometric assays the SCSA™ as well as the

Dihydrorhodamin staining were carried out to investigate the chromatin structure and the

production of reactive oxygen species of the sperms.

- 85 - Summary

During the clinical investigation irritation of the scrotal skin with clear swelling of the testes

was observed at bull B after hyperthermia without influencing the general condition of the

animal. Only minor alterations were noticed at the scrotum of the other three bulls.

All of the parameters measured on the B-mode ultrasound images of the testicle tissues from

every bull showed the highest values in first or second week subsequent to the hyperthermia.

The data of mean grey scale value and contrast of three bulls reached again the base level in

the third week and at bull B in the sixth week. The values of vertical fraction dropped to the

base level in the second week at two bulls, however at the bulls B and D it decreased further

and started to rise in the fifth week till reaching the base level again.

The mean blood flow of three bulls was decreased only in the first week and returned to the

initial level at the second week. The mean blood flow of bull B increased over the base level

and stayed slightly elevated till the end of the experiment. Only the resistance index of the last

mentioned bull showed a rise in the first week that was followed by a fall reaching the base

level in week five.

The forward motility fell after finishing the heating showing the lowest levels in the fifth

week and reached nearly the initial level later on. Secondary sperm aberrations were observed

between the first and forth week at bull B furthermore between the first and sixth week at

bulls A, C and D. Both the sperm concentration and the total sperm number were reduced

from the third week showing a clear rise from the ninth week. Primary sperm aberrations were

noticed till the end of the examinations including week ten. An obvious increase of

inflammatory, epithelial and spermatogenetic cells was observed between the third and sixth

week at bulls A, C, and D in addition between the third and the eight week at bull B. All of

the bulls showed the highest values in the fifth week.

Increased proportion of sperms with damaged chromatin was observed after SCSA™ staining

during the flow cytometric examination that was comparable to the rise of the primary sperm

aberrations. The fluorescence intensity after Dihydrorhodamin staining rose in the first week

that was followed by a decline reaching the lowest values in week four and five and returning

to the base level subsequently.

The accomplished examinations show that analysis of the parameters of the second order on

B-mode ultrasound images as well as the mean blood flow detected by doppler sonography

provide additional information about the alterations of the testes compared to the conventional

methods. In addition, the analysis of the amount of reactive oxygen species was found to be a

good indicator of restricted sperm functions at an early stage.

- 86 - Literaturverzeichnis

8 Literaturverzeichnis

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- 98 - Anhang

9 Anhang 9.1 Verwendete Medien, Chemikalien und Puffer

Inhaltsstoffe

Besonderheiten

Tyrodemedium

- NaCl 5,844 g pro 1000 ml

- KCL 0,231 g pro 1000 ml

- CaCl2 0,294 g pro 1000 ml

- MgCl2 0,081 g pro 1000 ml

- Na2HPO4 0,061 g pro 1000 ml

- Na-Pyruvat 0,110 g pro 1000 ml

- Na-Laktat Syrup 4,04 ml

- Hepes 2,383 g pro 1000 ml

- Penicillin K 0,050 g pro 1000 ml

- PVP 0,500 g pro 1000 ml

- PVA 0,500 g pro 1000 ml

- NaHCO3 2,100 g pro 1000 ml

PH-Wert : 7,4 Osmolarität : 320 mOsm

10-fach konzentrierte

Saline-Hepes-

Stammlösung

(Grundlage der

Percoll®-Lösungen)

(35 % und 70 %)

10-fach konzentrierte

Saline-Hepes-Stammlösung

- NaCl 1,4 M -> 8,00 g

- Hepes 200 mM -> 4,77 g

- Glucose x H2O 90 mM -> 1,80 g

- Kaliumhydroxid (KOH, 1M) 25 mM

-> 2,50 ml

Abgewogene Teile in 70 ml aqua dest. lösen. Mit NaOH auf pH 7,4 einstellen. Nachfolgend mit aqua dest. auf 100 ml auffüllen und auf pH 7,6 einstellen. Lösung kann eingefroren werden.

- 99 - Anhang

Lösung „M“

10,8 g 10-fach konzentrierte

Saline-Hepes-Stammlösung

50 µl Gentamycinsulfat

(Konzentration (20 mg/ml)

-> mit steril filtriertem Aqua dest. auf 100 ml auffüllen -> Gentamycinsulfat hinzufügen End-pH = 7,4 Osmolarität: 295 mOsmol/kg

Lösung 1 + 9P

5,4 g der Saline-Hepes-Stammlösung

50,9 g Percoll® (unverdünnt)

sterilfiltriert zusammenfügen Osmolarität : 350 mOsmol/kg

- Oa = 0,1 x (10m + 9p)

- R = [Oa – (0,1 x dp)] / (0,9 x dp) - 0,85

- Vp = (10m – 295) / [ R x (295 – p)] - 11

- Zugabe in g = (Vp – 9) x 1,13 x 5 (g)

Berechnung Zugabemasse Percoll® (unverdünnt) zu 1 + 9P

100 % Percoll®-

Saline-Lösung

- berechnete Masse Percoll®

- 1 + 9P- Lösung

Zusammenfügen Isoosmolarität (295 mOsmol/kg) prüfen

70%ige Percoll®-

Gebrauchslösung

- 37,5 ml 100 % Percoll®- Saline-

Lösung

- 15,5 ml Lösung M

Zusammenfügen Isoosmolarität prüfen Bei 5°C 2 Wochen lagerfähig

- 100 - Anhang

35%ige Percoll®-

Gebrauchslösung

- 17,5 ml 100 % Percoll®- Saline-

Lösung

- 32,5 ml Lösung M

Zusammenfügen Isoosmolarität prüfen Bei 5°C 2 Wochen lagerfähig

Wasserstoffperoxid

30%ige

Gebrauchslösung

- 29,4 µl H202

- 970,6 µl Tyrode-Medium

Zusammenfügen Direkt verwenden Bezug Wasserstoffperoxid: Sigma-Aldrich Chemie Ch.-B. 044K1333

Dimethylsulfoxid

(DMSO)

Bezug: Sigma-Aldrich Chemie Ch.-B. 083K0136

Säuredetergenz-

Lösung (pH 1,2)

- 300 ml Aqua bidest

- 4,39 g 0,15 M NaCl 0,5 ml 0,1%

- 20 ml 2,0 N HCl

- Aqua bidest. ad 500 ml

Reagenzien zusammenfügen mit 5N HCl auf pH 1,2 einstellen Bezug: Sigma-Aldrich Chemie GmbH Lagerung : 4°C

- 101 - Anhang

TNE-Puffer 10x, pH

7,4

- 9,48 g 0,01 M Tris-HCl

(Trizma Base)

- 52,6 g 0,15 M NaCl

- 2,23 g 1 mM EDTA - 600 ml Aqua

bidest

Reagenzien zusammenfügen Mit NaOH auf pH 7,4 einstellen Bezug: Sigma-Aldrich Chemie GmbH

TNE-Puffer 1x, pH

7,4

- 90 ml Aqua bidest

- 10 ml TNE-Puffer 10x

Zusammenfügen Bezug: s.o. Verwendet zur Konzentrationsverdünnung von 5x106 auf 2x106

Spermien/ml beim SCSA

AndroMed®

Vor Gebrauch Konzentrat auf 1:5 (Andromed® :Aqua bidest) verdünnen Bezug: Firma Minitüb Art. Nr.: 13503/1200

- 102 - Anhang

9.2 Fluorochrome

Inhaltsstoffe

Besonderheiten

Propidiumiodid

(PI) 95 – 98 %

2,99 mM Bezug: Sigma-Aldrich Chemie Katalog-Nr. P 4170

Acridine Orange

(AO)-Stammlösung

(1 mg/ml)

- 10 mg AO

- 10 ml Aqua bidest

Zusammenfügen

Lagerung bei 4°C (Polysciences, 04539)

Färbepuffer pH 6,0

- 370 ml 0,1 M Citric acid-Puffer

- 630 ml 0,2 M Na2HPO4-Puffer

Mit NaOH konz. auf pH6 einstellen Lagerung bei 4°C

Acridin Orange-

Gebrauchslösung

- 372 mg 1 mM EDTA

- 8,77 g 0,15 M NaCl

- 100 ml Färbepuffer pH 6

- 600 µl AO-Stammlösung

Lagerung : 4°C Während der Messung Lagerung auf Eis

- 103 - Anhang

Puffer für

Acridinfärbung

1. Citric acid Puffer

2. 0,2 M Na2HPO4-

Puffer

- 21,01 g Citric acid monohydrate

- Aqua bidest. ad 1000 ml

- 28,4 g Sodium phosphate dibasic

- Aqua bidest. ad 1000 ml

Zusammenfügen Bezug: Sigma - Aldrich Chemie, C-1909 Lagerung : 4°C Zusammenfügen Bezug: Sigma - Aldrich Chemie, S-7907 Lagerung : 4°C

Dihydrorhodamin123

(DHR)

- 2,5 µl Aliquot

- 22,5 µl DMSO

40 mM Reagenzien direkt vor Gebrauch zusammenfügen

Bezug: Sigma - Aldrich Chemie Katalog-Nr. D 1054

- 104 - Anhang

9.3 Verwendete Geräte, Produkte und Instrumente

9.3.1 Erwärmung

- handelsübliche Kunstwatte

- dünne Plastikfolie (handelsübliche Mülltüten)

- nicht elastische Bandagen (Reiterbedarf)

- Tesa® Krepp- und Klebeband unterschiedlicher Breiten

- Digitales Thermometer mit externem Temperaturfühler

- Gurtsystem (Reiterbedarf)

9.3.2 Spermagewinnung und Durchflusszytometrie

- künstliche Scheide für Bullen (Fa. Minitüb GmbH, Art. Nr.: 11020/0035)

- beheizbares Wasserbad (Fa. Memmert GmbH & Co. KG)

- Eppendorf-Gefäße (Fa. Sarstedt AG & Co,1,5 ml)

- Eppendorfpipetten (1000 µl, 100 µl, 10 µl, 5 µl)

- Pipettenspitzen weiß (10 µl) (Fa. MBT Brand)

- Pipettenspitzen gelb (100 µl) und blau (1000 µl) (Fa. Sarstedt AG & Co)

- Kunststoffzentrifugenröhrchen 15 ml (Fa. Sarstedt AG & Co)

- Zentrifuge (Megafuge 2.0 R (Fa. Heraeus Instruments GmbH)

- Wasserstrahlpumpe, Haake (Fa. Landgraf Laborgeräte GmbH)

- Photometer SpermaCue (Fa. Minitüb GmbH)

- Wärmeschrank mit CO2-Begasung HeraCell (Fa. Heraeus Instruments GmbH)

- Durchflusszytometer Epics XL AF 02020 (Fa. Beckman Coulter GmbH)

- Flow-Röhrchen (Fa. Beckman Coulter GmbH)

- Styroporgefäß

- Eismaschine

- Vortexer (Fa. Lab4you GmbH)

- Thermometer

- Stoppuhr

- Heizblock für Eppendorf-Gefäße (Fa. Landgraf Laborgeräte GmbH)

- Objektträger und Deckgläschen (Fa. Sarstedt AG & Co)

- 105 - Anhang

9.3.3 Echotextur- und Blutflussanalyse

- handelsübliches Ultraschallgel

- Videokassetten (Fa. Kodak GmbH)

- MO-Disketten (Fa. Kodak GmbH)

Danksagung

Herrn Prof. Dr. Heinrich Bollwein danke ich ganz besonders für die Überlassung dieses

interessanten Themas, seine fachlich kompetente Betreuung sowie die sorgfältige Korrektur

meiner Arbeit.

Des Weiteren bedanke ich mich ganz herzlich bei Herrn Prof. Dr. Harald Sieme für seine

fachliche Beratung und Unterstützung. Frau Dr. Isabelle Beatrice von Richthofen möchte ich

meinen Dank aussprechen für ihre immer gewährte Unterstützung und die niemals

versiegende gute Laune, mit der sie den praktischen Teil meiner Arbeit ganz besonders

bereichert hat. Mein Dank gilt auch Frau Dr. Cordula Köß für die wissenschaftliche

Unterstützung im Labor sowie ihre kompetente Hilfe bei der schriftlichen Anfertigung dieser

Arbeit.

Ganz besonders erwähnen möchte ich auch die Tierpfleger der Klinik für Rinder der

Tierärztlichen Hochschule Hannover. Ich danke ihnen für die gute Pflege „meiner“ vier

Bullen und ihre unermüdliche Hilfe im praktischen Umgang mit den Tieren.

Für die fachliche und organisatorische Unterstützung im Labor gebührt mein herzlicher Dank

Frau Karin Löppen sowie Frau Almuth Peters.

Trotz eines sehr interessanten Themas, besten Voraussetzungen und einer guten Betreuung

hätte ich diese Arbeit ohne die unermüdliche Unterstützung meines Freundes Balázs sowie

meiner Freunde Fabienne, Martin, Carla, Dagmar, Juliane und Charlotte nicht in dieser Weise

vollenden können.

Last but not least möchte ich meinen Eltern Jutta und Reinhard Albrecht, meinem Bruder

Jannis sowie meinen Großeltern Grete und Walter Woldt besonders herzlich danken.

Der 24-stündige EDV-Notdienst, liebe Worte und Ratschläge sowie die großzügige

finanzielle Unterstützung waren die Basis, auf der ich meinen Wunsch zu promovieren

verwirklichen konnte.