DIE NATLIRWISSENSCHAFTEN 43. Jahrgallg Heft t t (Erstes Juniheft) t 956

giber den chemischen Mechanismus der Kohlens/ iureassimilat ion *) Woll OTTO WARBURG, GONTER I{RIPPAHL u n d WALTER SCHRODER, B e r l i l l - D a h l e m

Nach Arbeiten yon OCHOA, CALVINI), HORECKER llnd RACKER neigt man heute vielfach zu der Ansicht, dab in den beliehtetei1 griinen Pflanzenzellen zun~iehst Wasser ill Sauerstoff nnd Wasserstoff gespalten wird in eiller Reaktion, die als ,,HILL-Reaktion" bezeichnet wird. Der Sauerstoff des Wassers soll dabei frei wer- den, der Wasserstoff aber soll das Nikotins~ureamid hydrieren, die Wirkungsgruppe der wasserstoff- fibertragenden Atmullgsfermente. Alles weitere soll danll dureh eillen Mechanismus erfolgen, der nicht viel anders ist als der in entgegengesetzter Richtullg ver- laufende Atmungsmechanismus.

Diese Theorie hat mehrere sehwache Pullkte. Erstens macht sie nicht den Versuch, zu erkl~iren, was die HILL-Reaktion ~) ist, die doch in dem Ge- b~ude die Hanptsache ist. Zweitens gibt es keille Versuehe, die beweisell, dab die Sekund~irreaktionell wirldich die Umkehr yon Atmungsreaktionen sin& Zwar ist es wahr, dab man mit markierter Kohlen- s~ture zeigen kann, dab bald nach der Belichtullg Zwischenprodukte der Atmung auftreten, z.B. phos- phorylierte Pentose und phosphorylierte Glycerill- s~ure. Aber da man heute weil3, dab der im Licht aus Kohlens~ture entstehende Kohlellstoff in der induzier- ten Atmnllg sofort zu 2/3 wieder zurtickreagiert, so k6nnen die gefundenen Zwischenprodukte der Atmullg ebensogut voll der indnzierten Atmung wie yon einer Rednktion der Kohlens~ure herriihren.

Wir beschreiben im folgenden Versuehe, die in eine ganz andere Richtung weisen. Wit hubert ge- funden, dab die Kohlens~ure zun~tchst roll dem Chlorophyll chemisch gebundell wird, ulld dab dann die gebundene Kohlens~nre innerhalb der Chlorophyll- molekel im Licht unter Sauerstoffentwieklullg zur Stufe des Kohlenhydrats reduziert wird. Die Haupt- reaktion der Kohlens~tureassimilation verl~iuft hier- naeh innerhalb der Chlorophyllmolekel, also illnerhalb derjenigen Substallz, die das Licht absorbiert, wo- dutch viele Schwierigkeiten fortfallell, die man bisher durch Allllahme yon Sensib.ilisierungen, Radikalen nnd Lebensdauern ohlle grogen Erfolg zu fiberwinden versuchte. Nunmehr dagegen, welln das Licht illller- halb der Substanz wirkt, v o n d e r es absorbiert wird, wird die Kohlensiiureassimilation gew6hllliche Photo- chemic.

1. Ziichtu~g der ZelIen �9 Alle unsere Versuche sind mit lebender Chlorella

ausgeftthrt wordell, der Grtinalge, die seit dell Dah- lemer Arbeiten roll t9 t9 das Hauptversuchsobjekt der Kohlenstureassimilation gewordell ist. Die Alge wird ill rein anorganischem Medium, ullter Zusatz

*) Nach einem am 25.4.1956 im Chemisctlen Institut der Hum- boldt-Universit~t in Berlin gehaltenen Vortrag.

1) CAI.v~, M.: Z. angew. Chem. 68, 253 (1956). ~) Vgl. dazu O. WAt~BURG und G. KRIPPAHL [Z. Naturforsch.

10b, 30t (t955)], wo gezeigt wird, dab die HiLL-Reaktion in lebender Chlorella dutch eine CO~-Katalyse zustande kommt.

Naturwiss. t956

der AR~o~schen Mikroelemente 1), zu denen auch das Vanadium geh6rt, im Lieht yon Metallfadelllampen geziiehtet, wozu friiher noch weehselnde Mengen Tageslicht kamen.

Bezfiglich der Zfiehtullg der Chlorella haben wir ill der Ietzten Zeit einen wesentlichen Fortschritt er- zielt. Schon lunge wuBten wir, dal3 Zellen, die das Licht gut ansnutzen, immer dalln elltstehell, wenn die Zellen bei der Zucht aul3er dem Metallfadenlicht aueh Tageslicht erhalten. Die besten Zellen erhielten wir im Sommer bei seh611em Wetter an einem Siidfenster.

Wit haben nunmehr gefunden, dab es nieht, wie wir anfangs glaubten, die spektrale Zusammensetzung des Tageslichts ist, die hier giillstig wirkt, sondern dab es die periodische Allderung der Intensit~it des Lichts ist. Ziiehten wir in eillem gegen Tageslicht Verdun- kelten Raum mit einer 300 W-Metallfadenlampe, die kollstant mit ihrer Normalspannung yon 220 V brenIlt, .E 80

20 / / - "~l

, ~ .-'r I I O 2 g 6 6' I0

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/g 16" ~ 2O 22 Std 2g I I

72

Zelt

Fig. 1. Anderung der Quantenintensit~t ill 24 Std, bei der Zfichtung der Chlorella gemessen mit dem Chlorophyll-Quantenaktinometer

so erhaltell wir Zellen, die das Licht schlecht aus- llutzen. Lassen wir aber die Betriebsspannullg der gleichen Lampe ill 24 Std yon 50 bis 220 V ansteigen und wieder auf 50 V abfallen, so erhalten wir Zellen, die das Licht so gut ausnutzen wie die Tageslichtzellen an sch6nen Sommertagen.

Bei diesen Zfiehtullgsversuchen mit fluktuierender Lampenspannung haben wit die Quantenintensit~ten zu versehiedenell Zeiten der 24Std-Periode mit unserem Quantenaktinometer gemessen - - das nut Licht, das yon Chlorophyll absorbiert wird, migt - - und habell eine Intensit~itskurve erhalten, die in Fig. t abgebildet ist.

Der Untersehied zwischen dell Zetlen, die mit koi1- stanter ulld mit fluktuierender Lichtintensit~t ge- ziichtet worden sind, ist sehr erheblich. Bei der Zueht mit/luhtuierender Illtensit~t erhalten wit Zellen, deren Quantellbedarf pro Molekel entwickelten Sauerstoffs, ohne Berticksichtigung der Atmung, 3,5 bis 4,5 ist ulld mit Berticksichtigullg der Atmung 3,0 bis 4,0. Ein Quantenbedarf 3 bedeutet, dab die Liehtenergie im Rot bis zu 89 % ansgenutzt wird.

Bei der Zucht mit ko,nstanter Liehtintensit~tt er- haltell wir Zellell, deren Quantenbedarf pro MolekeI entwiekelten Sauerstoffs 8 bis t2 ist. Da 8 bis t2 diejelligen Qualltenzahlen sind, die JAMES FRANCK

1) AR~ON, D.: Nature [London] i72, t039 (1953); und all- gemein Amer. J. Bot. 25, 322 (1938).

21

2 3 8 O . W A R B U R G , G. I~RIPPAHL u n d W. SCHR6DNR: C h e m i s c h e r M e c h a n i s m u s d e r K o h l e n s ~ i u r e a s s i m i l a t i o n Die Natur- wissenschaften

und seine Kollegen seit 30 Jahren linden und als die besten Ausbeuten betrachten, ulld da in Amerika mit konstanter Liehtintensitiit geziichtet wird, so ist nun- mehr die Ursache dieser grogen Diskrepanzen auf- gekl~irt. Denn reproduzierbar, fiir aliquote Teile der- selben Stammkultur, k611nen wir die FRANcI~schen Ausbeuten oder 2- bis 3mal bessere Ausbeuten erzeugen, je nachdem wir mit konstanter oder fluktuierender Lichtintensit~it ztichten. Zur Erkl~irung m6chten wir glauben, dab sieh die Zellen gegen die ununterbrochene Belichtung, die unnattirlich ist, dadurch zur Wehr setzen, dab sie den gr6Beren Teil ihres Chlorophylls inaktivieren, das dann Licht absorbiert, aber keine Kohlens~inre red~ziert.

2. Die st6chiometrische Sauersto//entwicklung 1) Wir beschreiben nunmehr denjenigen Versuch, der

den gr6Bten Fortschritt auf nnserem Gebiet bedeutet, die st6chiometrische Sauerstoffey~twicklung aus Chlo- rella. Mit ,,st6chiometrisch" meineI1 wir, dab mit einer gegebenen Menge Chlorella nicht beliebig viel Sauer- stoff im Licht entwickelt werden kann, wie bei den Versuchen, bei denen die Chlorella Katalysator ist,

2511 lr~ll2~ t_02

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t I I I I 0 . I 2 3 g rain

Zelf (honlinv/erh'cher Bel/chfz'nq) Fig. 2. S t6chiometr i sche Sauers to f fen twick lung aus Chlorella im

Licht , bei E i n s t r a h l u n g kons t an t e r Licht intensi t~i t

sondern dab nur eine begrenzte Menge Sauerstoff ent- wickelt werden kann, die abh~ingt yon der Menge der Chlorella.

Um yon der katalytischen zur stSchiometrischen Anordllung zu gelangen, muB man die Chlorella aus ihrem normalell Kulturmedium in ein modifiziertes S~lzmedium iibertragen, das abet den Zellen nicht sehadet, da sie bei Riickfiihrung in ihr normales Medium unverlindert weiterw~ichst.

Ill Fig. 2 ist ein Versuch graphiseh dargestellt, bei dem t00mm 8 Chlorella, suspendiert ill dem modifizier- ten Medium, mit konstanter Liehtintensit~it belichtet wurden und bei dem der entwickelte Sauerstoff ge- messen wurde. Die Zeit t o ist dabei der Begilln der Belichtung naeh Dunkelheit. Wie man sieht, wird die zuerst schnelle Sauerstoffentwicklung bald langsamer und schlieBlich fast Null. Dann ist der Elldwert an entwickeltem Sauerstoff erreieht, der in unserem Versueh 23,4mm 3 Sauerstoff betr~igt. Alls t 0 0 m m a Zellen kann also Lieht 23,4 mm a = 1,05 Mikromole Sauerstoff entwickelll, das ist e twa soviel Sauerstoff, als rote Blutzellen gebunden an H~imoglobin enthalten. Die st6ehiometrische Sauerstoffentwieklung ist also sehr erheblich.

War bei dem Versueh die Sauerstoffentwicklung beendet und abgelesell, so wurden die Ze!len aus dem

!.) W A R B U R G , O . , U. icY. S C H R O D E R : g . N a t u r f o r s c h . 1 0 b ~ 6 3 9 0955).

Versuchsgef~iB herausgenommen, und es wurde ihr Chlorophyllgehalt bestimmt, t ie r gleich 1,02 Mikro- molen gefunden w-urde. Der Endwert an entwickeltem Sauerstoff war also, in Molen ausgedrtiekt, gleich dem Chlorophyllgehalt.

Diese Beziehung hat sich als allgemein giittig er- wiesen bis zu Chlorophyllgehalten yon 5 % des Zell- trockengewichts. Wurde der Chlorophyllgehalt der Zellen yon I auf 1/2 oder auf 1/2 vermindert - - was man durch Erh6hung der Lichtst~irke bei der Ziich- tung der Zellen in 24 Std erreichen kann - - , so wurden Endwerte an entwickeltem Sauerstoff gefunden, die im Verh~iltnis t:1/~: 1/7 standen. Man mul3 daraus sehHegen, dab der Sauerstoff aus einer Substanz ent- wiekelt wird, yon der t MolekeI mit 1 Molekel Chloro- phyll verbunden ist. Ich will, zun~ichst ohne Beweis, vorwegnehmen, dab diese Substanz Kohlens~iure ist, so dab wir also die stSehiometrische Sauerstoffent- wickhmg schreiben k6nnen:

Hell: (ChlCQ) + H20 = Chl + CH20 + 02.

wo Chl Chlorophyll bedeutet und CH20 allgemein die Stufe, bis zu der die Kohlens~ure reduziert worden ist.

3. Quantenbedar] Mil3t man bei der st6chiometrischen Sauerstoff-

entwickhlng auBer dem Sauerstoff und dem Chloro- phyll noch eine dritte Gr6Be, nS_mlich das absorbierte Licht, so erMlt man den Quantenbedarf der st6chio- metrischell Sauerstoffentwicklung. Es hat sich er- geben, dab zu Beginn der Belichtung I Lichtquantum t Molekel Sauerstoff entwickelt; dal3 die Quanten- ausbeute auf die H~tlfte gesunken ist, wenn die H/ilfte des Sauerstoffs entwickelt worden ist, auf !/,, wenn 3/4 des Sauerstoffs entwickelt worden ist, oder allgemein, dab ftir den ganzen Verlauf der st6chiometrischen Sauerstoffelltwicklung die Gleichung gilt

. E - - ~ } x 0 9 = 0 , O~ t . _ _ = 1 qo-- hv E x - ~ E q ) =

wo E den Endwert an ausgetriebenem Sauerstoff be- deutet und x dell bereits ausgetriebenen Sauerstoff.

Diese einfache Gleichung bedeutet, dab nur das- jenige Licht wirksam ist, das voll dem mit CO S ver- bundenen Chlorophyll absorbiert wird, w~ihrend das von dem freien Chlorophyll absorbierte Licht ftir die Wirkung verlorengeht. Setzt man nur dasjenige Licht in die Rechnung ein, das yon dem verbundenen Chloro, phyll absorbiert wird, so ist die Quantenausbeute ftir den ganzen Verlauf der Sauerstoffentwicklung gleich t.:

(ChlCO~) + H20 + t hv = Chl + CH20 + O~., (t)

wo h �9 v also nur die von dem verbundenen Chlorophyll absorbierten Qllanten bedeuten.

Ganz entsprechende Gleichungen haben wir frtiher fiir andere photochemische Pigmentreaktionen ge- funden, z. B. :[fir die Photodissoziation der Kohlenoxyd- eisenverbindungen

FeCO + t hv = Fe + CO.

Es sind die Gleichungen der Photodissoziation von Pigmenten ftir den Fall, dab das freie und das ver- bundene Pigment gleich stark absorbieren. Die Gfiltig- keit der G1. (1) ist also ein weiterer Beweis daftir, dab bei der st6chiometrischen Sauerstoffentwicklung der Sauerstoff aus dem ChlorophyI1 entwickelt wird.

Heft 1t O.WARBURG, G. KRIPPAHL und W. SCttRODER: Chemischer Mechanismus der Kohlens/iureassimilation 239 t956 (Jg. 43)

In der allgemeinen Photochemie gilt ein Problem dann als gel6st, wenn man die Reaktion gefunden hat, deren Quantenausbeute I ist, w/ihrend ein Mehr- quantenbedarf, den man findet, immer bedeutet, dab Sekund~r- oder Rfickreaktionen die Primgrreaktion verdecken. So ist nunmehr gefunden, dab die f -Quan- tenreaktion der Kohlens/iureassimilation die Sauer- stoffentwicklung aus einer CO=-Chlorophyllverbindung ist, und wenn wir bei nicht st6chiometrischen Versu- chen einen Quantenbedarf von drei oder mehr pro Molekel Sauerstoff finden, so kann es nicht anders sein, als dab Sekund~rreaktionen hinzukommen, die das einfache Verh~iltnis t Q : I Quantum verdeeken,

4. Riickreaktion

Eine solche Sekund/irreaktion sieht man, wenn man bei der st6chiometrischen Sauerstoffentwieklung, nachdem der Endwert erreicht ist, verdunkelt. Dann sieht man, wie ~/~ des im Lieht entwickelten Sauerstoffs zurfickreagiert und dabei 2/3 des im Licht erhaltenen Reduktionsprodukts der Kohlens/iure verbrennt. Wenn nun t Mol Quanten t Mol Sauerstoff entwickeln, aber ~/3 Mole Sauerstoff immer wieder zurfickreagieren, so entwickelt in der Bilanz t Mot Quanten nur 1/a Mol Sauerstoff oder 3 Mole Quanten entwickeln ein games Mol Sauerstoff. So kommt bei der nicht st6ehiometri- schen, bei der katalytischen Versuchsanordnung, durch (3berlagerung von Lichtreaktion und Rfick- reaktion der Mehrquantenbedarf pro Molekel Sauer- stoff zustande, den man bei der katalytischen Ver- suchsanordnung immer gefunden hat und den man aus energetischen Grtinden auch linden muBte. Doch wollen wir bier, wo wit auf den chemischen Mechanis- mus der C02-Assimilation hinaus wollen, die Energie beiseite lassen.

Historisch ist zu dem Bisherigen zu bemerken, dal3 die Quantenausbeute t bei der Entwicklung des Sauerstoffs bereits 1950 in Dahlem von DEAN ~BURK und dem Verfasser (O. W.) gefunden worden ist~), dab aber diese Entdeekung damals nicht die ihr zukom- mende Beachtung fand, da JAMES FRANCK und eine Schar yon Koltegen die Versuche, s tat t sie zu wieder- holen oder in Dahlem anzusehen, aus theoretischen Grfinden fiir unm6glich erkl/irten. Inzwischen sind die Methoden zur Messung der Quantenausbeute t wesent- lich verbessert worden; die fiberlagernde Rfiek- reaktion ist zeitlieh weiter hinausgeschoben worden, undes ist eine zweite unabh/ingige ehemische Methode zur Messung ausgearbeitet worden. Die Quanten- ausbeute I bei der Entwicklung des O2 ist heute so sicher nnd so genau zu bestimmen wie etwa die Sauer- stoffkapazit/it des Blutes, und wenn jemand sic noch heute nicht finden sollte, so ist mit Bestimmtheit zu sagen, dab er noch immer die alten Zellen in H/inden hat, deren Quantenbedarf bei der katalytischen An- ordnung t 2 ist und also bei der st6chiometrischen An- ordnung nicht t , sondern bestenfalls 1~/~ = 4 sein kann.

5. Kohlensdure 2)

Betrachten wir unsere Gleichung der st6chiometri- schen Sauerstoffentwicklung, so wird naeh ihr der Sauerstoff aus Kohlens~ure entwickelt, uI~d zwar aus

1) BvRx, D~AN, u. O. WARBVRG: Z. Naturforsch. 6b, 12 (1951). WAR-BURG, O.: Z. Elektrochem. 5s, 447 (1951).

~) WARBURG, O., 11. G~3NTER KRIPPAI-IL: Z. Naturforsch. l lb , 52 (1956).

Naturwiss. 1956

Kohlens/iure, die mit dem Chlorophyll verbunden ist. Wit wollen nunmehr Experimente beschreiben, aus denen hervorgeht, dab die im Chlorophyll gebundene Kohlens/iure tats/ichlieh die Qnelle des entwickelten Sauerstoffs ist.

Ha t man bei der st6chiometrischen Sauerstoff- entwicklung im Licht den Sauerstoffendwert erreicht, so muB man eine Dunkelpause einlegen, wenn man weitere Mengen Sauerstoff entwickeln will. In dieser Erholungszeit, die bei unserer Versuchsanordnung 20 mill betr/igt, muB Sauerstoff zugegen sein, da sonst die induzierte Atmung nicht ablaufen kann, die ia energetisch erst erm6glicht, dal3 der Sauerstoff im Licht entwickelt wird.

Wir haben nunmehr gefunden, dab in der Erho- lungszeit nieht nut Sauerstoff zur Verffigung stehen muB, sondern auch Kohlens/iure. Tats/ichlich erhfilt

Fig. 3. Manometriegef~iB zur Messung der stSchiometrischen Kohlens/iureentwicklung

man, wenn in der Erholungszeit Sauerstoff und Koh- lens/iure zur Verffigung stehen, beim Einsetzen der Belichtung wieder den vollen Sauerstoffwert, d.h. I Molekel Sauerstoff pro Molekel Chlorophyll. Steht aber nur Sauerstoff und keine Kohlens/iure zur Ver- fiigung, so erh/ilt man bei Belichtung keinen Sauerstoff.

~lber dieses Ergebnis haben wir uns sehr gewundert. Zwar ist die Notwendigkeit der Kohlens~ture bei der kat~ty~ischen Sauerstoffentwieklung selbstverst~ndlich, da es ja in der Bilanz die Kohlens/iure ist, die reduziert wird. Aber dab bei der stSchiometrischen Sauerstoff- entwicklung eine vorherige Bindung der Kohlensfiure Vorbedingung ist, schien nns unvereinbar zu sein mit der herrschenden Auffassung, dab die Prim/irreaktion der Kohlens/~ureassimilation die Wasserzersetzung ist. Die folgenden Versuche fiber die st6ehiometrische Kohlens/iureentwicklung haben hier die unwiderleg- liehe Entscheidung erbracht.

6. Die stbchiometrische Kohlensiiureentwicklung ~) Ein Manometriegef/ig (Fig. 3) enth~lt im Haup t -

raum 20 cm 3 Chlorellasuspension, in der Ansatzbirne t cm 3 n/lO Natriumfluorid, im Gasraum reines,

~) WARBIJRG, O., U. G. IZ•IPPAHL: Z. Naturforsch. 11b, 179 (1956).

2fa

~40 0. WARBURG, G. KRIPPAHL und W. SCHaSDE~: Chemischer 1V[echanismus der Kohlens~ureassimilation Die Natttr- wissensehaften

CQ-freies Argon. PH im t t aup t r aum und in der Birne ist 3,8. Gibt man dann - - im Dunkelli - - das Fluorid in den Haupt raum, so wird - - im Dunkeln - - Kohlens~iure aus der Chlorella bis zu eiliem Endwert ausgetrieben, der in etwa 20 min erreicht ist (Fig. 4). Zum Beispiel wurdeli aus ~ 500 m m s Chlorella in 20 min 592 m m ~ CO~. ausgetrieben, das silid 26,4 Mikromole. Wurde dalin der Chlorophyllgehalt bestimmt, so wurden in den t 500 m m ~ Zellen 27,2 Mikromole Chlorophyll gefunden. Wiederum also, wie bet der Eiitwicklung des Sauer- stoffs im Licht, aber diesmal bet eilier Dulikelreaktion, stoBen wir auf eilie st6chiometrische Beziehung zum

60o m~C~O~ / " -

500 / qO0 /

2oo

1oo

I o q

] I . / I ~? 12 ;'6 min gO

Zet7 (dunkel) be/ t o Zugzbe voa Fluor/d

Fig. 4.

cxl-~ I

StSchiometrisehe Kohlens~iureentwicklung aus Chlorella im Dunkeln

Chlorophyll: Die Menge der durch Fluorid austreib- baren Kohlens~iure ist gleich dem Chlorophyllgehalt der Zellen. Wiedermn haben w i r - - durch Ziichtung bet verschiedenen Lichtstiirkeli - - den Chlorophyllgehalt der Zellen im Verhfiltliis t : 1/~: 1/7 variiert; im gleichen Verhgltnis fandeli wir dann die Endwerte der ausge- triebelien Kohlens~inre. Wir mtissen daraus schlieBen, dab die durch Fluorid austreibbare Kohlens~iure an das Chlorophyll der Chlorella gebuliden ist.

Erhi tzt man die Zelleli vorher 5 rnin auf 65 ~ so kann nachher durch Fluorid keine Kohlens~iure ausgetrieben werden. Gefriert man die Zellen vorher und trocknet sie dann im gefrorelien Zustand, so kann IIachher mit Fluorid keine Kohlelisgure ausgetrieben werden. Sehr kleilie Konzentrationen an Blaus~ture, z,B. 10-4normal, verhindern die Austreibung der Kohlens~tnre durch Fluorid. Ans alledem folgt, dab die Anstreibnng der Kohlensiinre durch Fluorid eine Fermentreaktion ist.

Treibt man die Kohlens~iure durch Fluorid aus, w~scht dann das Fluorid aus den Zellen heraus und s~ittigt die Zellen mit einem Gasgemisch, das Kohlen- s~iure enth~lt, so wird die vorher durch Fluorid ausge- triebene Kohlens~ture wieder gebuliden, aber IIur dann, wenn das Gasgemisch auBer Kohlens~ure auch Sauer- stoff enth~tlt. Mit anderen Worten, es ist Atmung zur Bindung der Kohlens~iure notwendig, oder mit noch anderen Worten, es ist Energie zur Bindung der Kohlens~iure n6tig. Die Bindung der Kohlens~ure an das Chlorophyll ist also ein hochbiologischer Vorgang, und man wird hiernach vermuten, dab es dieienige Kohlens~iure ist, aus der im Licht der Sauerstoff ent- wickelt wird. Dutch die folgenden Versuche ist diese wahrscheinliche Vermutung bewiesen worden.

7. Funkt ion der Kohlens~ure

Man teilt eine Zellsuspension in 3 Teile und treibt aus dem ersten Teil mi t Fluorid alle Kohlens~ure aus, also t Mol pro Mol Chlorophyll; aus dem zweiten Tell treibt man nur ein halbes Mol Kohlens~ure aus, und aus dem dritteli Teil treibt man gar keine Kohlelis~ure aus. S~ttigt man die Zelleli dalin mit l0 Vo1.-% Kohlens~ure in Luft und belichtet, so findet man, dab im ersten Fall gar kein Sauerstoff entwickelt wird, im zweiten Fall 1/~ Mol ulid im dritteli Fall ein ganzes Mol Sauerstoff pro Mol Chlorophyll. W~scht man aber aus dem ersten Teii das Fluorid wieder fort und bindet die Kohlens~iure wieder an das Chlorophyll, so wird jetzt im Licht wieder I Mol Sauerstoff aus t Mol Chlorophyll elitwickelt. Das Ergebnis ist also, dab nur die mit Fluorid austreibbare Kohlelis~ure bet Belich- tung Sauerstoff entwickeln kann, wiihrelid alle alideren Formen yon Kohlens~ture, die bet S~ittigung mit t0 Vol.-% Kohlelis~ure in den Zelleli vorhandeli sind, die physikalisch gel6ste Kohlens~ure oder die Bi- karbonatkohlens~ture, ftir das Licht unallgreifbar sind.

Und die umgekehrte Versuchsanordnung: Wit ent- wickeln zun~ichst im Licht aus dem Chlorophyll t Mol Sauerstoff and gebeli dann IIaeh Verdunkelung Flno- rid zu den belichteten Zellen ulid zu den nicht be- lichteteli Kontrollzellen. Dann entwickelt Fluorid aus den belichteten Zellen weliiger Kohlens~ure als aus den IIicht beliehteten Kolitrollzellen, wie es sein muB, welin der elitwickelte Sauerstoff aus der ehemisch ge- bundenen Kohlens~ure s tammt.

8. Chlorophyll

Schreiben wir die st6chiometrische Sauerstoff- entwicklung und die stSchiometrische Kohlens~ure- entwicklung untereinander, so erhalten wir:

Hell: ChlCO 2 = Chl + C + O 3 Dunkel: Chl + CO S = ChlCO 2

Bilanz: CO 2 = C + 0 2.

Aus der Bilanz hebt sich das Chlorophyll heraus, das also hier ein durch chemische Zwischenreaktionen wir-

2,0

I '5

0 VO0 q30 ~qo 1/60 q80 500~I~,f20

We/leald'nge Fig. 5. Wirkungsspektrum des blaugriinen Lichts

kender Katalysator ist. Ein Traum der Chemiker 1) ist so in Erffillung gegangen: dab das Chlorophyll nicht nut physikalisqh durch Absorption des Lichts, sondern

1) WILLSTXTTER, R . , u . A . STOLL: U n t e r s u c h u n g e n f i b e r d i e Assimilation der Kohlens~iure. Berlin: Springer 1918.

Hett 11 O.WARBURG, G. KRIPPAHL und W. SCHR6DBR : Chemischer Mechan i smus der Kohlens~iureass imi la t ion ~ ~ l t956 (Jg. 43)

auch chemisch an der Assimilation der Kohlens~ture beteiligt ist.

Die weitere Verfolgung dieser Entdeeknng wird er- geben, wo in der Chlorophyllmolekel die funktionelle Kohlens~ture gebunden ist. Sehon jetzt ist es wahr- scheinlich, dab die funktionelle KohlensAure bei der Extraktion des Chlorophylls verlorengeht und des- halb in der Chlorophyllformel von HA~S FISCHER nicht vorkommt. In Zusammenhang mit diesen Ergebnissen werden unseres Eraehtens die Chlorophyllarbeiten yon JAMES CONANT ~) aus dem Jahre t93t wichtig werden, seine Entdeckung der Autoxydation des Chlorophylls und der labilen Kohlens~ure des Chloro- phylls.

Auch die katalytische Wirkung des blaugrfinen Lichts ~) mag dabei eine Rolle spielen. Im Maximum des blaugrfinen Wirkungsspektrums, das in Fig. 5 ab- gebildet ist, absorbieren nicht nur die Carotinoide, sondern hier hat auch das reine Chlorophyll beine Bande.

9. Energetik Wahrend in unseren friiheren Energiegleichungen s),

in Konzession an die herrschenden Ideen, die Kohlen- s~ure nur Wasserstoffakzeptor war, die in einer Dunkelreaktion reduziert wurde, muB die Kohlens~ure nunmehr ihren Platz in der Lichtreaktion erhalten. Dann entwickeln im Licht 3 Mole Lichtquanten 3 Mole Sauerstoff aus 3 Molen gebundener KohIen- s~ture

Hell: 3 [ChlCO~] + 3 No" h. v = 3 Chl + 3 C + 3 O2. (1)

Zwei Mole Sauerstoff reagieren in der induzierten Atmung zurfick

Dunkel: 2 C + 20~ = 2 C02 + 2. 100000 cal (2)

und liefern die Energie zur Bindung der Kohlens~ure und Wiederherstellung des Ausgangszustandes

Dunkel: 3 Chl + 3 CQ = 3 [ChlCO~]--2- ~00000cal. (3~

Addiert man die drei Gleichungen, so erh~lt man die Bilanz

Bilanz" t CO~ + 3 No" h. v -= 1 C + l O~ (4)

und damit im Rot den Energieumsatz

~t20oo ~2o00 e - - - t 0 0 = - - - t00

3 "Noh'r 3 �9 42000

112000 = ~ 2 6 0 0 ~ " 100 ~-= 8 9 % .

Die Energetik wird besonders einfach nnd anschaulich, wenn mall annimmt, dab die Bindung der Kohlens~ure in (3), dutch die Energie der induzierten Atmnng, eine reduktive Carboxylierung ist, also eine Reduktion der Kohlens~ure zur Stufe der Ameisens~ture. Die weitere Reduktion, zur Stufe des Kohlenhydrats, wfirde dann in der Lichtreaktion erfolgen, w~hrend der Sauerstoff

1) CONANT, JAMES B.: J. Amer. Chem. Soe. S3, 359, 1615, 2382, 3171 (t93t).

~) WARBURG, O., G. KRIPPAttL U. W. SCHR/SDER: Z. Natur- forsch. 9b, 164, 667 (1954); 10b, 631 (~955).

~) WARBURG, O.: Naturwiss. 42, 449 (1935).

aus beiden Reduktionsprozessen im Licht Ms mole- kularer Sauerstoff entwickelt wtirde. Ob man dabei die hydratisierten oder die nicht hydratisierten S~turen reagieren l~tl3t, ist fiir das Ergebnis gleichgtiltig.

Erl~uterungen Au]nahme der Intensitdtskurve mit dem Quantenaktinometer

In eill Manometriek~istchen yon etwa 16era 3 I l lhal t wurdell 3 rag Chlorophyllid, 200 mg Thioharllstoff und 7 era~ destillie~tes farbloses P~Mdill gegebell. Im Gasraum war L u f t . Es wurde dann im Thermostaten gesehfittelt und mi t einer 300 W:Lampe belichtet, die sieh in 20 cm Entfernung vor dem Thermostaten befand. DanI1 wurde ftir Betfiehsspannungen zwischell 50 und 220 V der Sauer- stoffverbrauch pro Minute im Aktinometer gemessen. Da das Aktinometer nut Licht absorbiert, das yon dem Chlorophyll absor- biert wird and da es n ich t die Energie, sondern die Quantenzatden migt , so ist es hier besonders zweckdielllieh und k(Snnte durch keill anderes Instrument ersetzt werden.

Die stOchiometrische Sauersto//entwicklung haben wir zum Tell mit eiller neuen ehemisehen Methode gemessen, bei der der im Licht entwickelte Sauerstoff mit Na~S~O4 absorbiert wird; zum Teil mit der 2-Gefiil3methode. Wir haben mit beiden Methoden die glMehen Elld-werte an Sauerstoff gefunden. Die 2-GefXBmlethode, die in den Hfmden yon EMERSOn, GAFFRON, BROWN und RABINOWITSCH oft falsehe Resultate gegebeu hat, ist damit durch eine unabh~llgige ehemlische Methode verifiziert worden. ()brigens haben wir hie eillgesehen, warum die Druekmessung in einem Gef~fl richtige Werte ergeben soll, w~ihrend die Werte falsch werden sollen, wenu man ein zweites gleichartiges Gef~iB im Thermo- staten danebenh~ingt, wie es die Chieagoer Gruppe seit 20 ffahren verktindet.

Die st6chiometrische KoMensdureentwicklung

Hier ist die saute Reaktion (PH 3,8) yon entseheidender Bedeu- tung, well nur die undissoziierte FluBs~iure in die lebende Chlorella eindringt. Man kann die Kohlensiiure auch mit vim kleilleren Mengen an Fluorid austreiben, als im Text angegeben ist; aber dann dauert die Austreibullg 1Anger. - - Bei der Bestimmung der funktionellen Kohlensgmre mi t Fluorid s~ttigt man die Zellen vorher mit reinem, COa-freiem Argon, um die Atmung auszuschalten und um yore Druck der Kohlensfiure abh~ngige andere Kohlens~ureverbindungen zu be- seitigen. - - S~ittigt man die Zellell mit t0Vol . -% COn, 30% 08, 60 % Argon, so erhfilt man bei Zugabe yon Fluorid auBer der iunk- tionellen Kohlens~ure aueh andere Kohlens~ure, insgesamt s tar t I Mol pro Mol Chlorophyll e twa t,8 Mole COs, aber nur I Mol da,~on ist mi t t0 -4 nFICN glat t hemmbar,

St6chiometrische Kohlensdureentwicklung im Licht

Da, wie bereits im Text erw~ihnt, die katalyt isch wenig wirk- samen Zellen ebensoviel funktiollelle Kohlens~ure enthalten wie die katalyt iseh hochwirksamen Zellen, so kann es nicht die Bindung der Kotilens~iure sein, durch die sieh die wenig wirksamen und die hoehwirksamen Zellen unterscheiden, sondern es muB die Wirkung des Liehts auf die gebundene Kohlens~ure sein. Tats~ichlieh ent- wickeln Zelien, die kata lyt iseh 12 Quanten pro Mol Sauerstoff be- ll6tigen, bei der st6chiometfischen Allordnung nicht 1 Mol, sondern nur I/4 Mol Sauerstoff pro Mol Chlorophyll. Sie entwickeln aber neben dem x/, Mol Sauerstoff auBerdem ~/4 Mole Kohlens~ure im Licht. Addiert man also Sanerstoff- und Kohlens~ureentwicklullg (ira Lieht), so erh~lt man wieder t Mol Gas pro Mol Chlorophyll. Dieses interessante quant i ta t ive Ergebnis zeigt, dab diejenige ge- bundene Kohlens~ture, die aus irgenclwelehen Mangelgrtmden im Lieht keinen Sauerstoff eiltwickeln kann, dutch Licht yon dem Chlorophyll wieder abgespalten wird.

Zi~chtung der Zellen

Aussaat: 0,t mml "~ Zellen pro em 3 KulturlSsung. Ernte nach 24 Std: 3 mm 3 Zellen pro cm 3 Kultur]6sung.

Max-Planck-Institut [iir Zelkphysiologie, Berlin- Dahtem

Eingegangen am 8. Mai 1956