Jg. 30, Heft 27/28 KV~T SCHaEfEr, BALvAKADELIS und TA~SJA ZA~SKa: Ausscheidung yon Cortis0n-~hnliohen Steroiden. 657 15. Juli 1952

~BER DIE AUSSCItEIDUNG YON CORTISON-~HNZICHEN STEROIDEN IN URIN. Von

KV~T Sctn~EIEtg~ BALVA KADELIS u n d TAISSA ZARSKA.

Aus der Universit~ts-Kinderldinik tteidelberg (Direktor: Prof. Dr. PH. BA~B~GE~).

Seit der Entdeekung und teilweisen therapeuti- sehen Anwendnng der Nebennierenrindenhormone ge- winnt die Bestimmung dieser Substanzen im biologi- sehen Substrat steigendes Interesse. Die Isolierung und Definition versehiedener Nebennierenrindensteroide ist besonders J. J. SCHSEDE~ ZU danken, weleher riesige Urinmengen (1000 Liter und mehr) aufarbei- fete. Ffir die Kliniker sind derartige Untersuehungen nur insoferne yon Interesse, als sie das Vorhandensein der Hormone bzw. ihrer Umbauprodukte beweisen und auBerdem das Bestreben anregen, mit Methoden, welehe im klinischen Laboratorinm durehfiihrbar sind, quantitat ive Hormonbestimmungen zu ermSgliehen. Auch uns beseh~ftigt seit t~ngerer Zeit die Erprobung yon Verfahren vor allem zur Cortisonbestimmung im Urin (ScR~mEI~ und M/~LLE~). Von den versehie- denen MSgliehkeiten das Problem anzugreifen, streb- ten wit zungehst an, mit den Methoden der Vertei- lungsehromatographie weiterzukommen. Derartige Versuehe sind yon mehreren Autorengruppen bereits mitgeteilt worden (el, s, is, 18). Unsere eigenen Erfah- rungen und die mehrerer anderer Autoren (z. B. Bo s , GIOVANNI) ergaben abet, dag die Methodik noch zahl. reiehe Komplikationen aufweist, so dab sine breitere Amvendung noah nieht in Frage kommt, da vor allem aueh die quantitat ive Auswertung noah reeht unsieher ist. Als weitere MSgliehkeit besteht die Austestung der mehr oder weniger gereinigten Extrakte am Tier (es sind 3/Iethoden besehrieben, welehe Waehstum, ~ber- lebenszeit, Arbeitsleistung, Natriumretention, K~Ite- widerstandsf~higkeit usw. bestimmen). Die exak- testen Ergebnisse liefert offenbar dis Bestimmung des Leberglykogens bei adrenMektomierten M~usen und die Eosinophilenz~hlung (VExsr~NG bzw. COPE usw.). Es bedarf wohl kaum eines Hinweises, dab diese ,,bioassais" zwar ,,riehtige" Resultate tiefern, aber dab wegen des hohen Aufwandes an Zeit und Getd eine Einfiihrung als Routinemethoden unmSglieh er- seheint. Es bleiben noah die kolorimetrisehen Be- stimmungen. Diese Methoden rufen sofort Zweifel ob ihrer Spezifit/it hervor. Bei der so nahen ehemisehen Verwandtsehaft der Steroidhormone ist ein vSllig spe- zifisehes Verfahren und besonders eine derartige Farb- reaktion nieht sehr wahrseheinlieh. Alle his jetzt mit- geteilten Methoden sind deshalb aueh nut Gruppen- reaktionen (Literatur bei BON'GIOVANNI, ferner STAU- m~GER USW.). Als wir daher die yon PO:aTEa und SILBE~ publizierte Schwefels~urephenylhydrazinreak- tion aufgriffen, waren wir uns bewul3t, dab diese Ein- sehrankung in einem gewissen Grade aueh fiir dieses Verfahren zutreffen wird. Die Autoren selbst hat ten bereits festgestellt, dab neben Cortison aueh 17-Oxj~- cortieosteron (Compound F) eine wenn aueh wait weniger intensive gelbe Farbe mit dem l~eagens liefert. Nun hat, zwar SCH~mDE~ ziem]ieh eindeutig gezeigt, dal~ die Ausseheidung dieses Hormons im Urin ,,er- staunlieh" niedrig ist, so dab eine St5rung dureh dieses Steroid zumindest sehr gering sein misfire; aber man kann ohne weiteres annehmen, dab alle 17-Oxyeortieo- steronderivate oder zumindest ihre Umwandlungs- and Abbauprodukte noah gar nieht bekannt, sind. Wahr-

Klinisehe Wochenschrift. 30. Jahrg.

seheinlieh werden wohl alle diese Substanzen eine gewisse Reaktion mit Phenythydrazinsehwefels/~ure ze~gen. Dazu gehSren aueh die erstmalig im Urin ge- fundenen Hydrierungsprodukte yon Compound E und F (ScHnEIDEr), welche naeh KINSELLA USW. einen posi- tiven Porter-Silbertest geben. Als Test ffir die Spezi- first nnd damit Brauehbarkeit der Phenylhydrazin- methode ffir die Bestimmung der eortison~hnlichen Hormone im Urin bleibt derzeit nur der Vergleieh mit den Verfahren, welehe die ,,eehten" Werte liefern. Da- bei ergab sieh zu unserer [reudigen Oberrasehung, dag die mit dem yon uns fiir den Urin ausgearbeiteten Ver- fahren gewonnenen Werte gut mit denen der Tierver- suehe tibereinstimmen. Die ganz wanigan ehromato- graphiseh bestimmten Mengen an reinem Cortison liegen durehaus in der gleiehen Gr6Benordnung (ScitNEIDEI~ gibt 53 Y bzw. 55 7 je Liter Urin ftir ge- sunde Erwaehsene an), wenn der Urin so aufgearbeitet wurde, wie wit es durchffihren. Die etwas niedrigeren Werte v o n ZAFFARONI kSnnen unseres Eraehtens durch Hormonverluste bei den mehrfaehen Wasehungen be- dingt sein. Unser Verfahren gestattet also zumindest dis eortisonwirksamen Substanzen im Urin zu be- stimmen. Da es naeh den bis jetzt vorliegenden Unter- suehungen ziemlieh wahrseheinlieh ist, dab das wesent- liehe Ausseheidungswodukt das Cortison selber bzw. seine Umbauprodukte ist, seheint es fiir die Belange der Klinik gereehtfertigt, yon der Cortisonbestimmung im Urin zu spreehen.

Bevor die ~e thodik in ihren Einzelheiten mitge- teilt wird, sei noah auf 2 grunds~tzliche Fragen hin- gewiesen. Die erste erheischt die Beantwortung, ob die Urinausseheidung parallel zum ]~lutspiegel ver- lguft und ob die Eliminierung im Urin Ausdruek des jeweiligen Funktionszustandes der Nebennierenrinde ist. Unseres Wissens Iiegen Untersuehungen fiber den Meehanismus der Sekretion bzw. tf.tiekresorption der Steroide in der Niere nieht vor. Man wird aber an- nehmen diirfen, dab ghnlieh wie bei den Aminos~uren eine physiologisehe Steroidurie besteht, welehe in pathologisehen F~llen im Sinne eines over-flow-Meeha- nismus gesteigert ist. Ob ein ,,stress" mit einem er- hShten Verbraueh yon l~indenhormonen einhergeht - - so dab die Urinausseheidung trotz vermehrter Produk- tion normal sein kann - - ist noah unbekannt. Naeh den his jetzt vorliegenden Untersuehungen stimmen abet die im Urin ausgesehiedenen Cortieoidmengen mit der SEnYEsehen Theorie reeht gut iiberein (s. dagegen VC'ElSSBECKE~ !), SO dab sieh doeh wertvotle Einblieke in das Gesehehen im Hormonhaushalt des Organismus aus der Urinuntersuehung tun lassen. Obrigens erm6glicht die Reaktion naeh POt~TE~ und SI:]:~E~, wie einige tastende eigene Versuehe ergeben haben und wie es aueh NELSON und Mitarbeiter festgestellt haben, erstmalig aneh Hormonbestimmungen in relativ geringen Blutmengen (unter 50 era3).

Von groger Bedeutung ist noah die Untersuehung der veresterten Steroide neben den ,,freien" (PATE~- SON USW. unterscheiden s~urelabile und -stabile Steroid- verbindungen). SCH~EtDE~ hat gezeigt, dab die An- s~uerung bis zu p~ 1 nur relativ geringe Mengen (etwa

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658 Kv~T SC~R~t~, Banv~ K ~ ) ~ s und T~s~A Z n ~ s ~ : Ausscheidung yon Cor~ison 4hnliehen Steroiden. Klinische Woehenschrif~

15%) weiteren Steroidmaterials i:reisetzt. E ine lang- dauernde t Iydrolyse der Corticoide verbie te t sich aber, da diese schon naeh kurzer Zeit zum Tell restlos zer- stSrt werden. Es bleibt demnach nu r noch die Zweck- m~l~igkei~ der enzymat ischen Spal~ung mi t f l -Gheu- ronidase zu erforschen. Wir haben mi t Enzymun te r - suehungen bereits begonnen. Die Ausscheidung an ge- [¢.

~0 --" [ ° COr/l'~on, w/'edePqefunden im A~./o desf. I ' / ~

0 20 40 ~O 80 100 /20 lgO /60 ~80 200 220 Z40 Z60 2 Ca.1/son

Abb. 1. Wiederfindun~sversuehe yon zu i~ua desfilla~a und Urin g Aqua zugese~z~en Cortisonmengen.

paar tem Cortison ist e~wa 30--50real so hoeh wie die E l imin ie rung des ffeien S~eroids (eigene Versuehe). Es besteht ja die ~Sglichkei t , dab die zus~itzliche Be- s t immung der Cortisonester weitere wertvolle Ergeb- nisse lie~ert.

Methodik. 200 era. ~ eines frischen (!)Tagesurins* werden filtriert und mi~ konzen~rie~er H~SOa auf p~ 1 gebracht.

Tabelle 1. Cortisonausscheidun im Tagesurin gesunder Personen

Siiug!inge Kinder ~Iiinner ~

• Ausscheidung Aider

Jahre

Ausseheidung Alter

1 Woche 15 1 Woche 17 2 Monate 2 Monate 24 3 Monate 20 3 Monate 25 3 ~Ionate 31 3 Monate 30 3~/~ Monate 20 6 Monate 2] 8 Monate 17 9 MenaCe 24

20,9

1. Tag 2. Tag a

77 2!

31 37 13 17 31

4

8 8 9 9 9 9

10 10 12

14

14

L Tag 2. Tag

23

2~ 82 ~ 62 70 40 48 70 102 96 5O

82 100 6O

75 - - 95 - -

~us- Alter scheidung

Jahre 1. Tag

21 135 22 142 20 8 3 44 115 47 73 49 58 52 60 53 132 56 120 60 51 62 110

(Kontrolle mi~ Indicatorpapier ,,Merck"). Fiir ei~e mflde Hydrolyse wird der Urin ~/~--1 Std stehengelassen und dann 5mM mit je 30 cm ~ Chloroform in einem Scheide~richter min- destens 1 min gesehfittelt. Die entstehende :Emulsion wird jewei]s gewonnen und in tier Zenh~fuge (bei mindes&ens 3000 Touren) in ihre Koraponenten zerlegt. Die Urinreste werden mit der Wasserstrahlpumpe vorsichtig abgesaugt. Dcr Riickstand (Chloroform) wird ffltriert und die Zentri~ugen- gl~ser sowie die Schleimreste im Filter werden dann mit Chloro- form nachgewaschen. Die vereinigten Chloroformphasen wer- den mit 60 cm ~ einer n/10 NatriumcarbonatlSsung einmal ge- w~schen, wobei tier gr58~e Tell der ehromogenen Substanzen ex~Lrahiert wird. Die Sodaphase wird 2real mit je 15 cm ~ Chloro-

* Der Urin daft keine Medikamente oder ~hnliehes enlhalten.

form nachgewaschen. Die vereinigten Chloroformex~rakte werden zur Entfernung der Sodares~e mit Aqua destillata naehgewaschen nnd dieses noch einmal mit Chloroform extrahiert. Der result.ierende Chloroformextrak~ wird genau in 2 Teile geteilt und beide werden in einer Schliffapparatnr (Voltglas) bei verminder~em Druck (Wasserstrahlpumpe) ein- gedampft, wobei die Wasserbadtemperatur 500 Cnicht fiber, steigen daft.

In' den einen Kolben kommt dann ] cm ~ Methanol und 8 cm 3 Phenylhydrazinschwefets~ure, die jeden Tag ffiseh be- reitet wird (65 mg aus Xthylalkohol umkristallisierten Phenyl- hydrazinhydrochlorids werden in 100 em 3 folgender HsSO~ gel6st: 190 em a Aqua dest + 310 em a H2SOa cone. pro analysi Merck).

In den anderen Kolben kommt 1 ems Methanol Und 8 cm a der obigen Sehwdelsgure ohne Phenylhydrazin. Die Wgnde der Kolben werden griindlich gesptilt; eventuell angetrocknete Riiekstgnde werden mit einem Glasstab gelSst. Die I~sungen werden dann in l~gensgI~ser fiberffihrt und auJBerdem Reagentienleerwerte (Methanol ~- Sehwefelsi~ure mit und ohne Phenylhydrazin) angelegt. Man stellt die Gl~schen 20 rain in ein Wasserbad yon 60 ° C =[= 1 ° (!) ~, Naeh Abktihlung in flieBendem Wasser werden die LSsungen bei 4500 Umdre- hungen 7 rain lang zenirifugiert. Ablesung im Stufenphoto- meter (~lter S 42) oder im elektrisehen Colorimeter (410 #/~). Standardkurven mit bekannten Cor~isonmengen **.

Gegenfiber unserer ersten Mitteihng haben wir don Zusatz yon Kohle fallen gelassen, da es sieh ergab, dab vor ~llem in Urinen mit niedrigem spezifischen Gewicht zum Tell betr~eht- fiche Cortisonverluste auftraten. Dcr Versuch einer ,,Bela- dung" der Kohle mit verschiedenen Steroiden ffihrte zu keinen br~uchbaren Resultaten.

Beim Vergleich der S tandardkurve , welche mi~ bekann~en Cort isonmengen in Reagensgl~sern erhal- t en wurde, mi t de n Ex t ink t ionswer ten gleich hoher Cort isonmengen nach Durehlaufen dutch das ganze Verfahren, ergibt sich, dab die Hormonver lns te auBer-

ordenflieh gering sind u n d 5% wohl nich~ in Gamma. fiberschreiten.

I n der Tabe]le 1 sind die mi t dieser Methode bes t immten Ausscheidungswerte gesunder S~uglinge, K inde r u n d Er- wachsenen zusammengestel l t .

Zu unseren Un te r suchungen liegen naturgem~l~ Vergleichswerte in der Litera- fur n icht vet . Mit Hilfe biologischer Me- thoden fanden V ~ : ~ usw. im Uri~ yon Neugeborenen 4 - -17 y ; bei 5~/~--Tj~hrigen lag die Ausseheidung yon Ghcoeort icoi- den bereits in der HShe der Erwachsenen- werte (es hande l t sich allerdings n u t u m ganz wenige Untersuchungen) . 14 nor- male M~nner sehieden zwischen 40 u n d

98,1 85 ~, 14 gleichaltrige F r a u e n zwisehen 24 u n d 65 y im Tagesur in aus. S ~ c H ~ l and mi t der gleichen Methode bei M~n- ne rn eine Ausseheidung bis zu 133 y. Neben diesen beiden Aug&ben kSnnen lediglich noch die yon Cor~ und ~Iit- arbeiter gewonnenen Werte herangezogen

werden. Sie l inden bei ruhenden Erwaehsenen zwi- schen 40 u n d 120 y im 24-Std-Urin, Wn~SS~CKn~ gibt dagegen als Norma]wert tier Ghcocort icoid- ausscheidung 5 0 0 - - 6 0 0 y an. W k diirfen also her- vorheben, dai~ die yon uns modifizierte Me~hode yon P O ~ T ~ und S ~ t offenbar in geradezu erstaun- licher Weise die im biologischen Test als Ghcocor t i - eoide erfal~baren Steroide im Ur in bes t immL Bei der Durchsich~ der Werte mag t i b e r r a ~ c h e n , dal3 bei Si~nglingen bereits so hohe Cor~isonmengen im U r i n

** Wit verwende~en Cortison CIBA, weIehes uns in dankenswerter Weise zur Verfiigung ges~e11~ wurde.

Wit sind Herrn Prof. Dr. BAY, Oberarz~ der Universi~ii~s-Kervenklinik Heidelberg ftir seine freundiiehe Unterstli~zung zu Dank verpflich~e~.

DoPt)elversuche '~fit gleichem Urin ergaben eine S~reuung yon =l:5%. Dagegen ftihr~ eine geringe )[nderung des Zus~andes und Verhal~ens tier Individuen zu Tages- sehwankungen.

Jgls.30'JuliKeft195227/28 KURT SOHREIEI~, BAI~VA KADELm u n d TA~SZA Z A ~ S ~ : A u s s c h e i d u n g y o n Cor~ i son4hn l i chen Steroiden. 659

Tabelle 2. Cortisenausscheldung bel einigen patltologlschen Zustgnde)~ im Kindesalter und yon Erwachsenen.

Alter Diagnose Ausscheidung in ~, Jahre

12 9

I1

8 9 9 7

10

c? 45 # 48

Adiposogigantismus Adiposogig~ntismus Adiposogigantismus

Endokrine Fettsueht ? Diphtherie Diphtherie Diphtherie

Asthm~ bronchiale Diabetes insipidns

Cushing Verdacht ~uf ADDIS0Nsohe

Krankheit

60i 78 80 93 115 68 50 78

192 73 60 96 42 9i 115

175 475

51 i (ohne Therapie) 305 (nach mehr-

t~giger DCA- Behandlung)

68 220

80 55

t10

4801425

erscheinen, w~hrend doeh bekanntl ieh die 17-Keto- steroidausseheidung sehr niedrig ist. Diese yon uns erhobenen Befunde s t immen aber mit den Ergebnissen der Cort ieoidausseheidungsbest immungen yon READ und Mitarbeiter (Formaldehydmethode) und TALBOT USW. (Kupferredukt ionsmethode) fiberein. Beide Au- torengruppen fanden eine betr~ehtliehe Kons tanz in den Eliminierungswerten der Cortieoide in Bezie- hung zur t(6rperoberfi~ehe, wobei in den ersten Le- bensmonaten die }Verte dig Tendenz zar Streuung naeh oben zeigen. Es ist ja bekannt , (lag die Neben- niere des Neugeborenen nieht nur eine deutliehe Hy- perplasie aufweist, sondern aueh in ihrer anatomisehen S t ruk tur sieh yon der Driise der sp~teren Lebensalter unterseheidet. Wi~hrend der ersten 2 Woehen des pos tnata len Lebens verliert das Organ oft mehr als die t I~lf te des Gewiehts und erreieht das , ,Geburts- gewieht" erst wieder um das 12. Lebensjahr he rum {HAt~T~L~aV und B]~OWS~I~LL).

Wi t sind dabei das Verhal ten der eortisonahn- lichen Substanzen naeh der Geburt und besonders bei den versehiedenen Insul ten wahrend des Siiuglings- alters (Dyspepsie, Infekte usw.) genauer zu analy. sieren.

~rir haben aus den uns vor]iegenden zahlreiehen Einzetbes t immungen tier Cortisonausseheidung bei verschiedensten Krankhe i t en zun~ehst nur d iese aus- gewahlt , um Beobachtungen, welehe wir bis je tz t maehen konnten, kurz zu streifen. Dazu geh6rt die Feststellung, dab offenbar die Urinmenge die Elimi- nierung der Glucocorticoide s tark beeinfluBt. Dies ist auch APt,]~L b e i seinen Untersuchungen aufgefa]len. Nur so mSehten wir zun/~chst den hohen Wer t bei unseren Pa t ien ten mi t Diabetes insipidus deuten. W/ihrend bei der benignen kindliehen Fe t t such t die Cortisonausscheidung etwa normal zu sein scheint, manifestieren sich endokrine Adiposi tasformen u. a. durch Ver~nderungen der Hormonausseheidung. DaB beim Cushing-Syndrom die Cort isonausscheidung hoeh sein wiirde, s tand zu erwarten. In teressant ist sehlieBlich der Befund, dab nach Zufuhr yon DCA cortisonahnliche Steroide im Urin erscheinen. Dies wird verstandlich durch die Untersuchungen yon HAYANO, DORF~rAh- USW., welehe nachwelsen konnten, dag l~indernebennierenhomogenate DCA in glueo- genetisches Material umwandeln. I n Gewebskutturen ha t t en CEN~OA USW. die Oxyda t ion yon DCA in Corti- son festgestellt.

Aut~erdem studier ten wit bei einigen graviden Frauen die Cortisbneliminierung vor, w~ihrend und nach der Geburt. Darfiber wird an anderer Stelle aus- Ifihrlich berichtet werden (zusammen mit MAN~tI~Z und PFAU). Es sei nur soviel vorweggenommen, dab die Ausseheidung in den letzten Tagen der Sehwanger- sehaft sehr hoeh ist und naeh der Gebur t zum Tell raseh abnimmt. Aneh wir fanden bei F rauen sons~ deutlieh niedrigere Wer te als bei gleiehaltrigen M~in- nern. Zum Sehlug m6ehten wir noeh in einem Kurven- bild den Verlauf der Cor~isonausscheidung bei einem 8j~hrigen Jungen mit einem frisehen Sehub einer sub- ehronisehen Polyarthr i t is demonstrieren.

Zusammen]assung. 7 Cor/iso n Es wird fiber Erfah- 240 rungen mit einem 2z~ ~ eigenen (naeh Po~:rE~ / N k und S~m~R modifizier- see ten) Verfahren zur Be- 78o I s t immungder eortison- ze0 ~hnlichen Steroide be- 2 richter. Die mit dieser 7g0 / Methode gewonnenen 72o I 1 /

' W e r t e s t i m m e n g u t m i t 100 I T / denen der biologisehen Teste und der Chroma- so 1 :-- 2 2 .W- qg ~z/ ~ tographie fiberein. 8o Aer//

Es werden die Aus- ~o t I seheidungswerte yon z ~. s. ~. 5. ¢. ZTag unveres ter tem Corti- Abb. 2. Cortisonausscheidung im Urtn

wS~hrend der ACTH-Behandhmg. son - - denn um dieses handel t es sieh fast nur - - ffir die verschiedenen Lebens- alger mitgeteilt. Die Durchsehni t tswerte fiir das erste Lebensjahr liegen um 20 y, die des Kindesalters zwi- sehen 30 und 90 y und erreichen dami t im Sehulalter bereits die untere Grenze der Erwaehsenenwerte .

An H a n d der Ausseheidung bei einigen pathologi- sehen F~llen, wird auf Besonderheiten kurz hingewiesen.

SchlieBlieh wird in einem Kurvenbi ld die Cortison- eliminierung nach ACTI-I-Behandlung eines jugend- Hehen Polyarthr i t ikers demonstriert .

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