Aus deln Chemiseh-physikalischen Institut der Bundesforschungsanstalt fiir Fleischwirtschaft in Kulmbach, Bayern

[Jber die Bestimmung yon Calcium, Magnesium, Zink und Eisen in tierischem Gewebe

Von

Reiner Harem

(Eingelangt am 26. Mi~rz I955)

I m Zusammenhang mit Untersuchungen fiber die Hydra ta t ion der Muskelproteine erwies es sich als notwendig, diejenigen mineralisehen Bestandteile des Muskelgewebes analytisch zu erfassen, die die Hydra ta - tion des Fleischeiweil~es herabzusetzen vermSgen. Als solehe kommen im Muskel lediglich Calcium (ca. 5 rag%), Magnesium (ca. 25 rag%), Zink (ca. 3 mg~o) und Eisen (ca. 3 mg%) in Betracht. Ich mSchte in Kiirze fiber unsere Bemiihungen berichten, diese Elemente in der LSsung einer ein- zigen Veraschung quanti tat iv zu erfassen.

Der rascheste Weg zur Bestimmung yon Calcium, Magnesium und Zink schien uns die bekannte, yon Schwarzenbach und MitarbeitGrn 1 ein- gefiihrte und vor allem von Flaschka ~ weiter entwickelte Methode der komplexometrischen Titration mit Athylendialnintetraaeetat zu sein. Die- ses Verfahren wnrde bereits auf die Analyse yon Pflanzenaschen und Milch, nicht aber yon tierischen Geweben angewendet, die ihres relativ hohen Phosphat- und Eisengeha]tes wegen Sehwierigkeiten eigener Art bereiten. Da Phosphat, gleichgfiltig, ob es als Ortho-, Meta- oder Pyrophosphat vor- liegt, durch F~tllung bzw. Komplexbildung der Erdalkalien die komplexo- metrische Titrat ion stSrt, muB es zuvor abgetrennt werden, t t ierzu Grwies sich der bereits yon Mason a b e i Pfianzenaschen beschrittene Weg fiber Kationenaustauscher als geeignet. Gibt man die LSsung yon Muskelasche in 0,1-n Salzs~Lure durch den Kationenaustauscher Lewati t S ]00 (H+-Form), so werden Calcium, Magnesium und Zink quant i ta t iv zurfick- gehalten, wghrend sich das gesamte Phosphat im Durchlauf finder. Durch zweimaliges Eluieren mit 5-n Salzsiiure und lgachwaschen mit Wasser werden die Kationen quanti tat iv eluiert. W~hrend die direkte komplexo-

R. tIamm : Bestfinmung yon Calcium, ~Iagnesium, Zink u. Eisen 269

metrische Titration des Calciums mit 0,01-m Titriplex gegen Murexid Ms [ndikator keinerlei Schwierigkeiten bereitet, stSrt die mit der Elutions- sgure eingeffihrte hohe Chlorionenkonzentration die Titration yon Ca ~- Mg Jr Zn gegen Eriochromsehwarz T empfindlich, indem sic durch Verfi~rbung ein Erkennen des Umsehlagpunktes nahezu unmSglieh maeht. Diese stSrende Wirknng 1/~6t sieh beseitigen, wenn man den gegen Erio- chromsehwarz zu titrierenden aliquoten Teil des Eha te s auf dem Sandbad znr Troekene einengt, mit 0,1-n Salzs/iure aufnimmt and dann titriert. Nimmt man nach Schwarzenbach 1 diese Titration in Gegenwart yon Ka- liumeyani d vor, so warden infolge Komplexbindung des Zinks nut Cal- cium und Magnesium erfal3t. Indem man dann naeh Erreiehen des Um- schlagpunktes naeh Angaben yon P ~ i b i l Chlora]hydrat zusetzt, wird der Zinkeyanidkomplex zerstSrt und man kann nunmehr aueh das Zink mit )~thylendiamintetraaeetat bis zum erneuten Umschlag titrieren. Es sind also zur Erfassung yon Calcium, Magnesium und Zink zwei Titra- tionen erforderlich.

Die Methode von KSrSs 4, zun~iehst Calcium gegen Murexid zu titrieren, dann' das Murexid mit 5-n Salzs~ture zu farblosen Abbauprodukten zu zer- setzen, um dann in derselben LSsung nach Zugabe yon Erioehromsehwarz Calcium-~ Magnesium zu titrieren, scheitert naeh unseren Erfahrungen an dem stSrenden Einflul~ der hohen Chlorionenkonzentration,

Wit titrierten mit 0,01-n TitriplexlSsung (Merck) aus der 200 t,el fassen- den Mikrobiirette naeh Gorbach 5, wobei pro Titrationsansatz etwa 10 ,ug Ca (ca. 25,u 1), 50,ug Mg (ca. 200/tl) und 6 bis 7 ,ug Zn (ca. 10 ,ul) vorlagen. Die Erkennnng des Umsehlagpunktes erfordert einige Ubung. Es ist hierbei wichtig, dab stats gegen eine VergleichslSsung mit der Farbe des reinen Indikators titriert wird.

Eisen-II- und Eisen-III-Ionen werden aus 0,1-n salzsaurer LSsung quantitativ gegen die H-Ionen des Kationenaustauschers ansgetauseht und dutch 5-n Salzs~nre wieder eluiert. Gibt man jedoeh die L6sung einer Troekenasche yon Muskelgewebe in 0,1-n Salzsaure dutch die Austauseher- saule, so finder sich nahezu alles Eisen im Durehlauf wieder. Wie wir an Hand yon Modellversuchen feststellten, beruht dieses Verhalten auf der Anwesenheit yon Phosphat. W~ihrend Orthophosphat dan Austausch des Eisens nieht beeintr~iehtigt, bildet Eisen mit dem in der Muskelasehe stets im UbersehuB vorhandenen Pyrophosphat Natrium-Eisen-Pyrophosphat- Komplexe, die so stabil sind, dab sic bei p}~ 2,0 und dariiber Eisen nicht gegen die I t -Ionen des Kunstharzes auszntauschen vermSgen. 90 bis 95% dos eingesetzten Eisens finden sieh im Durehlauf, der Rest (5 bis 10%) zu- sammen mit Ca, Mg und Zn im stark salzsanren Eluat (p~ 1,2). Der Ge- samt-Eisengehalt 1/il3t sieh ohne weiteres in einer einzigen Bestimmung er- fassen, wenn man Miquote Teile yon Durchlauf und Eluat vereinigt und dann mit o-Phenanthrolin die Eisemnenge photometrisch ermittelt.

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Hierbei ist allerdings zu beriicksichtigen, dab das fibllche Phenan- throlin-Vert'ahren nach Heilmeyer 6 durch Pyrophosphat (nicht dnreh Orthophosphat) dutch starke u der Farbentwicklung emp- findlich gestSrt wird. Diese Schwierigkeit lii•t sich durch Anwendung der 1VIethode yon Bandemer und Schaible 7 leicht umgehen, bei der man Phenan- throlin und I-Iydrochinon in starker saurem Milieu zusetzt und erst dann mit Citratpuffer auf p}~ 3 bis 5 einstellt.

Die Tatsache, dab dutch Behandeln mit dem I<ationenaustauseher der weitaus grS~te Tell des Eisens yon Erdalkalien und Zink abgetrennt wird, ist fiir die komplexometrische Titration dieser Elemente yon groSem Vor- teil, denn bekanntlich wird der Farbumsch]ag bel Gegenwart yon Eisen unscharf. Die iiblichen Kunstgriffe zur Maskierung des Eisens sind hier also unnStig.

Im Znsammenhang mit diesen Untersuchungen fanden wir, dal~ ganz allgemehl eine quantitative Trennung des ]~isens yon den zweiwertigen Ionen Calcium, Magnesium und Zink mSglieh ist, wenn man der Analysen- 15sung Alkalil0yrophosphat ira ~bersehu$ zusetzt -- in der Asehe yon Muskelgewebe ist dieses yon t t a u s aus enthalten --, auf p}~ 4 einstellt und durch den Kationenaustauseher gibt. ]:)ann finder sich das gesamte Eisen im Durchlauf, wiihrend die fibrigen Kationen naeh Elution mit 5-n Salz- s~ure quanti tat iv erfal~t werden kSnnen.

Es sei noch hingewiesen auf die Wahl der richtigen Verasehungs- methode, deren Bedeutung h~iufig untelsch~itzt wird. Fiir die gemein- same Bestimmung yon Ca, ~g , Zn und }~e kommt nur die trockene Ver- aschung in Platinschalen in Betracht, bei Ver~vendung yon Quarz- schalen erhielten wir zu niedrige Eisenwerte. Vermutlieh bildet das Eisen mit dem Tiegelmaterial sehwer 15sliche l~eaktionsl0rodukte. W~hrend Standardmischungen ans den entsprechenden Xationen und Phosphat nach troekener Veraschung (in Platinschalen) nur teilweise in 0,1-n Salz- s~ure 15slich sind, 15st sich Fleischasche sehr leieht. Vielleicht wirken hier bestimmte, in der Asehe anwesende Alkalisalze als LSsungsvermittler, so wie man z. B. sehwer 15sliche polymere Metaphosphate durch Zusatz yon Alkaliphosphaten oder -sulfaten in LSsnng bringen kann. Ein Salpeter- sgureznsatz zur Besehleunigung der Verasehung verbietet sich wegen der Bildung stark gelb gef~irbter, isolierbarer l~itroverbindungen, deren Eigen- farbe zu hohe Eisenwerte ergibt. Aus ~hnliehen Grfinden erhiilt man -- nach unseren Erfahrungen -- bei nasser Veraschung mit Schwefelsgnre- Salpetersgure zu hohe Eisenwerte. }tierbei ist die Xonzentration an I~itro- verbindungen meist so gering, dab ihre Farbe zwar mit blol~em Auge nieht mehr erkannt, wohl aber yon dem Photometer registriert wird.

Absehliel~end sei der bespr0chene Analysengang noeh einmal kurz zu- sammengefal~t: 1 bis 5 g Gewebe werden in Platinsehalen bei 550~ im Muffelofen veraseht, die Asehe in 0,1-n Salzs~ure gelSst, dutch eine S~ule

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nit 1 bis 1,5 g Lew~tit S 100 gegeben und mit Wasser naehgew~schen -= ,,Durchlauf"). Sodann wird mit 5-n Salzs/~ure eluiert und wiederum nit Wasser naehgewasehen (-~ , ,Eluat"). In einem aliquoten Tefl des ~luats wird dureh Titrat ion gegen ~urex id das Calcium, in einem wei- ;eren aliquoten Teil naeh Eindampfen zur Troekene und Aufnehmen mit ),l-n Salzs~ure durch Titrat ion gegen Erioehromsehwarz in Gegenwart Ton Kaliumcyanid Calcium -b ~I~gnesium und nach Zusatz yon Chloral- lydi'at das Zink komplexometrisch ermittelt. Ferner wird je ein aliquoter Ueil des Durehlaufes und des Eluates zusammengegeben und darin das ~isen mit o-Phenanthrolin naeh der ~e thode yon Bandemer uncl Schaible ~ ~hotometriseh best immt.

Dem Fleisch zugesetztes Calcium, ~agnesium, Zink und Eisen wurden laeh dieser ~e thode quant i ta t iv wiedergefunden. Der mittlere FehIer be- ief sieh bei Calcium, Magnesium und Eisen ~uf 4- 1,5%, bei Zink ~uf j= 2,6%. Diese Fehlerbreite umfaBt allerdings aueh die Sehwankungen, iie mit der m~ngelnden Homogenit~t des Untersuchungsmaterials zusara- menhgngen und somit nieht in der Analysenmethode begrfindet liegen. Der fiir die Auf~rbeitung der Asehen Und die Best immungen no~wendige geit~ufwand betr~gt etw~ einea halben Tag. Dureh Anwendung einer ]erie yon Austausehersgulen lassen sieh innerhalb eines Tages yon einer [~erson bequem 10 Aschel5sungen aufarbeiten.

Es ist somit mSglieh, in einer einzigen VeraschungslSsung den Cal- ,'ium-, 3/Iagnesium-, Zink- und Eisengehalt in Gewebe nach Abtrennung tes Phosphats dureh zwei Titrationen und eine kolorimetrische Bestim- nung zu ermitteln.

Znsammenfassung

Es wird fiber ein Verfahren beriehtet, den Calcium-, Magnesium-, Zink- m d Eisengehult tierisehen Gewebes (1 bis 5 g) in einer einzigen Ver- ~schungslSsung zu bestimmen. Die salzsaure L5sung der Trockenasehe ~ird dureh eine Kationenaustauseher-S~ule gegeben und hierdurch Phos- ~hat und 90 bis 95% des Eisens yon Calcium, Magnesium und Zink ge- ~rennt. Die drei letzteren Elemente werden yon der Sgule unter Austausch 'urfickgeh~lten und n~eh Elution mit 5-n Salzsgure durch zwei komplexo- netrische Ti~rationen bestimmt. In dem mit dem Eluat vereinigten Dureh- auf wird Eisen mittels der o-Phen~nthrolin-Re~ktion erf~B~. Auf die Ver- ~sehungsbedingungen und die Eisenbestimmung mit Phenanthrolin wird l~her eingegangen.

Summary A report is given of a method of determining the calcium, magnesium,

~inc, and iron content of an animal tissue (1 to 5 g) in a single incineration solution. The hydrochloric acid solution of the dry ash is passed through

cation exchange column. In this manner, phosphate and 90 to 95~o of bhe iron is separated from calcium, magnesium, and zinc. The three latter

272 R.. Harem : Bestimmung yon Calcium, Magnesium, Zink u. Eisen

elements are retained by the column by exchange. After elution with 5 N hydrochloric acid they are determined by two complexometrie titrations. Iron is determined in the eluate combined with %he rinsings; the o-phenan- throline reaction is employed. Details are given of the incineration conditions and the determination of the iron by means of phenanthroline.

tt6sumg

On ddcrit une mdthode qui permet de ddterminer sur une solution unique provenant de la calcination de tissus animaux (1 k 5 g) les teneurs en calcium, magndsium, zinc et fer. La solution chlorhydrique des cendres sgches est trait4e sur une colonne d 'un dchangeur de cathions ce qui permet de s@arer les phosphates et le fer (ce dernier dans s_ne proportion de 90 5, 95%), du calcium, du magn4sium et du zinc.

Les trois derniers 41dments sont retenus par dchange sur la eolonne et, aprgs dlution par l'acide chlorhydrique 5 N, ils sent dosds au moyen de deux titrages complexom4triques. Dans le liquide qui s'est 4could de la colonne, auquel on r4unit l'41uat, on dose le fer par la rdaction ~ l 'orthophdnanthroline. Les conditions de la calcination et le dosage du fer par la phdnantro]ine sont l 'objet de prdcisions ddtailldes.

Disknssion

I-I. A . Holasek (Graz): Sic linden Nitroverbindungen, wiewohl sic troeken veraschen; welche Temperaturen verwenden Sie dabei ?

I-I. R . Harem: Wit haben bei 550 ~ verascht. Das hat uns zun~chst auch iiber- rascht; deswegen haben wit dann die Substanzen isoliert and nachgewiesen.

I-I. A . HolasJc: Wir finden bei der Veraschung yon Leichenteilen in schwe- felsaurer L6s~mg mit Perchlors/iure und Salpeters~ure 6fter, dab solche Ver- bindungen aueh der Schwefels/iure widerstehen. Nun hSre ich zum ersten N[al, dab dies auch bei der trockenen Veraschung der Fall ist.

Literatnr

1 G. Schwarzenbach, W. B iedermann und F. Bangerter, Heir. Chim. Acta 29, 811 (1946). G. Schwarzsnbach und H. Ackermann , I-Ielv. Chim. Aeta 80, 1798 (1947).

2 H. Flasch/ca, Mikrochem. 89, 38 (1952); Z. analyt. Chem. 188, 332 (1953); Chemist-Analyst. 4 . ~ 56, 84 (1953). H. 2'laschka und A . Holasek, Z. physiol. Chem. 288, 244 (1951); R6ntgen- and Laboratorinmspraxis 6, 72 (1953). H. Flaschka und R. Pi~schel, Z. analyt. Chem. 148, 771 (1954). A. Holasek und H. Flaschka, Z. physiol. Chem. 9.90, 57 (1952).

8 A . C. Mason , Analyst 77, 529 (1952). E. Kgrgs, U13gar. Z. Chem. 59, 137 (1953), zitiert naeh Chem. Zbl. 19~5,

1805. 5 G. Gorbach, Chem. Fabrik 14, 387 (1941)~ s L. Hei lmeyer and H. Pl6tner, Das Serumeisen und die Eisenmangel-

krankheit. Jena: 1937. S. 8. L. Hei lmeyer, W. Keoderl ing und G. Sti~rne, Kupfer und Eisen als kSrpereigene Wirkstoffe und ihre Bedeutung beim Krankheitsgeschehen. gena: 1941.

7 S. L. Bandemer und P. J . Schaible, Ind. Eng. Chem., Analyt. Ed. 16, 317 (1944).

s R. P~ibi l , zitiert nach H. ~laschlca, Chemist-AnMyst. 42, 84 1958).