Untersuchungen zum Zelldifferentialbild in Milch …...3.5.2.1.4 Bestimmung des Zellgehaltes im VGH.....49 3.5.2.2 Kieler Sedimentausstrich .....50 3.5.2.3 Separation der somatischen

Aus dem Zentrum für Lebensmittelwissenschaften

Zentrumsabteilung Hygiene und Technologie der Milch

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Untersuchungen zum Zelldifferentialbild in Milch und Blut unter

Berücksichtigung des Gesundheitsstatus der bovinen Milchdrüse

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer

DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Anke Schröder, geb. Heide

aus Bonn

Hannover 2003

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Dr. Jörn Hamann

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Dr. Jörn Hamann

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Martina Hoedemaker, PhD.

Tag der mündlichen Prüfung: 04. Juni 2003

Diese Arbeit wurde durch Mittel der Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH

gefördert.

Meinen Eltern

in Liebe und Dankbarkeit

Inhaltsverzeichnis

I

INHALTSVERZEICHNIS

1. EINLEITUNG ...................................................................................... 1

2. LITERATURÜBERSICHT ............................................................ 3

2.1 Mastitisdiagnostik............................................................................... 3 2.1.1 Zellgehalt in normaler und in Mastitismilch........................................... 3

2.1.2 Physiologische Einflüsse auf den Zellgehalt der Milch ........................ 4

2.1.3 Methoden zur Zellzählung ....................................................................... 4

2.1.3.1 Prescott und Breed .................................................................................... 4 2.1.3.2 Coulter Counter.......................................................................................... 5 2.1.3.3 Fossomatic................................................................................................. 5

2.1.4 NAGase-Aktivität ...................................................................................... 6

2.1.5 Elektrische Leitfähigkeit .......................................................................... 6

2.2 Mikroskopische Zelldifferenzierung ............................................. 8 2.2.1 Geschichte................................................................................................ 8

2.2.2 Methoden zur Herstellung von Milchausstrichen.................................. 9

2.2.2.1 Kieler Sedimentausstrich ........................................................................... 9 2.2.2.2 Cytospin .................................................................................................. 9

2.2.3 Zellmorphologie ..................................................................................... 10

2.2.3.1 Allgemeines.............................................................................................. 10 2.2.3.2 PMN ................................................................................................ 10 2.2.3.3 Eosinophile Granulozyten ........................................................................ 11 2.2.3.4 Basophile Granulozyten ........................................................................... 11 2.2.3.5 Lymphozyten............................................................................................ 11 2.2.3.6 Monozyten ............................................................................................... 11 2.2.3.7 Makrophagen ........................................................................................... 12 2.2.3.8 Epithelzellen............................................................................................. 12

2.2.4 Zelldifferentialbild in Milch einer gesunden Milchdrüse..................... 13

2.2.5 Zelldifferentialbild in Milch einer erkrankten Milchdrüse ................... 14

2.2.6 Zelldifferentialbild des Blutes ............................................................... 15

Inhaltsverzeichnis

II

2.3 Durchflußzytometrische Zelldifferenzierung ........................... 15 2.3.1 Differenzierung aufgrund der Zellmorphologie ................................... 15

2.3.2 Differenzierung mit Hilfe monoklonaler Antikörper ............................ 16

2.3.2.1 Herstellung monoklonaler Antikörper ....................................................... 16 2.3.2.2 Cluster of Differentiation........................................................................... 17 2.3.2.3 Haupthistokompatibilitätskomplex II ......................................................... 18 2.3.2.4 TCR1 ................................................................................................ 18 2.3.2.5 WC1 ................................................................................................ 19 2.3.2.6 CD4 ................................................................................................ 19 2.3.2.7 CD8 ................................................................................................ 19 2.3.2.8 CD14 (LPS-Rezeptor) .............................................................................. 20

2.3.3 Zelldifferentialbild einer gesunden Milchdrüse ................................... 20

2.3.3.1 Phagozyten .............................................................................................. 20 2.3.3.2 Lymphozyten............................................................................................ 21

2.3.4 Zelldifferentialbild einer erkrankten Milchdrüse.................................. 23

2.3.4.1 Phagozyten .............................................................................................. 23 2.3.4.2 Lymphoyzten............................................................................................ 24

2.3.5 Zelldifferentialbild des Blutes ............................................................... 24

2.3.5.1 Phagozyten .............................................................................................. 24 2.3.5.2 Lymphoyzten............................................................................................ 25

2.4 Zelluläre Abwehr der bovinen Milchdrüse ............................... 26 2.4.1 Phagozytose ........................................................................................... 26

2.4.2 Makrophagen.......................................................................................... 26

2.4.3 PMN ................................................................................................ 27

2.4.3.1 Lebenszyklus ........................................................................................... 27 2.4.3.2 Migration ................................................................................................ 27 2.4.3.3 Entzündung.............................................................................................. 28

2.4.4 Lymphozyten .......................................................................................... 29

2.4.4.1 T-Lymphozyten ........................................................................................ 29 2.4.4.2 B-Lymphozyten ........................................................................................ 30

2.5 Folgerung............................................................................................. 30

3. MATERIAL UND METHODEN ................................................ 31

3.1 Versuchstiere ..................................................................................... 31 3.1.1 Betrieb 1 ................................................................................................ 31

Inhaltsverzeichnis

III

3.1.2 Betrieb 2 ................................................................................................ 31

3.1.3 Versuchsreihen ...................................................................................... 32

3.1.3.1 Versuch 1: Orientierende Untersuchung auf der Basis einer randomisierten Tierauswahl ..................................................................... 32

3.1.3.2 Versuch 2: Methodische Fragestellungen ................................................ 32 3.1.3.3 Versuch 3: Untersuchungen zum Zelldifferentialbild auf der Basis einer

selektierten Tierauswahl .......................................................................... 33

3.2 Geräte ................................................................................................ 33

3.3 Material ................................................................................................ 35 3.3.1 Verbrauchsmaterialien .......................................................................... 35

3.3.2 Reagenzien ............................................................................................. 37

3.3.3 Antikörper und Nachweisreagenzien ................................................... 38

3.3.3.1 Antikörper für den Einsatz in der Membranimmunfluoreszenz................. 38 3.3.3.1.1 Monoklonale Primärantikörper ................................................................. 38 3.3.3.1.2 Sekundärantikörper.................................................................................. 40

3.3.4 Kulturmedien, Puffer und Lösungen .................................................... 40

3.3.4.1 Lösungen für die Zellanalytik.................................................................... 40 3.3.4.1.1 Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ............................................ 40 3.3.4.1.2 Wasch- und Verdünnungspuffer für die Membranimmunfluoreszenz (MIF-Puffer).............................................................................................. 40 3.3.4.2 Lösungen für die Durchflußzytometrie ..................................................... 41 3.3.4.2.1 Trägerflüssigkeit (Sheath fluid)................................................................. 41 3.3.4.2.2 Propidiumiodidlösung............................................................................... 41 3.3.4.2.3 To-Pro-3-Lösung...................................................................................... 41 3.3.4.2.4 Acridinorange-Lösung.............................................................................. 41 3.3.4.3 Färbelösungen für die Mikroskopie .......................................................... 42 3.3.4.3.1 Hemacolor ............................................................................................. 42 3.3.4.3.2 Toluidinblaulösung ................................................................................... 42 3.3.4.4 Fixationslösung für Rohmilch ................................................................... 42

3.4 Probenahme........................................................................................ 42 3.4.1 Blut ................................................................................................ 42

3.4.2 Milch ................................................................................................ 43

3.4.2.1 Vorgemelk................................................................................................ 43 3.4.2.2 Viertelanfangsgemelk (VAG).................................................................... 43 3.4.2.3 Viertelhandgemelk (VGH) ........................................................................ 44 3.4.2.3.1 Versuch 1: Orientierende Untersuchung auf der Basis einer

randomisierten Tierauswahl ..................................................................... 44 3.4.2.3.2 Versuch 2: Methodische Fragestellungen ................................................ 44

Inhaltsverzeichnis

IV

3.4.2.3.3 Versuch 3: Untersuchungen zum Zelldifferentialbild auf der Basis einer selektierten Tierauswahl .......................................................................... 44

3.5 Probenanalyse ................................................................................... 45 3.5.1 Blut ................................................................................................ 45

3.5.1.1 Klinische Labordiagnostik ........................................................................ 45 3.5.1.2 Leukozytenseparation .............................................................................. 46 3.5.1.3 Bestimmung und Einstellung der Zellkonzentration in der Zellsuspension ......................................................................................... 46

3.5.2 Milch ................................................................................................ 47

3.5.2.1 Mastitisdiagnostik..................................................................................... 47 3.5.2.1.1 Mikrobiologische Untersuchung ............................................................... 47 3.5.2.1.2 Messung der NAGase - Aktivität .............................................................. 48 3.5.2.1.3 Bestimmung des Zellgehaltes im VAG..................................................... 48 3.5.2.1.4 Bestimmung des Zellgehaltes im VGH..................................................... 49 3.5.2.2 Kieler Sedimentausstrich ......................................................................... 50 3.5.2.3 Separation der somatischen Milchzellen.................................................. 50 3.5.2.3.1 Versuch 1: Orientierende Untersuchung auf der Basis einer

randomisierten Tierauswahl ..................................................................... 50 3.5.2.3.2 Versuch 2: Methodische Fragestellungen ................................................ 51 3.5.2.3.3 Versuch 3: Untersuchungen zum Zelldifferentialbild auf der Basis einer

selektierten Tierauswahl .......................................................................... 51 3.5.2.4 Bestimmung und Einstellung der Zellkonzentration in der Zellsuspension ......................................................................................... 51 3.5.2.5 Ausstriche der ZSM („Kaffeemühle“)........................................................ 52

3.5.3 Durchflußzytometrische Analysen ....................................................... 52

3.5.3.1 Durchflußzytometrie ................................................................................. 52 3.5.3.2 Durchflußzytometrische Beurteilung der Zellvitalität ................................ 54 3.5.3.2.1 Prinzip ................................................................................................ 54 3.5.3.2.2 Probenvorbereitung und Messung ........................................................... 55 3.5.3.2.3 Auswertung .............................................................................................. 55 3.5.3.3 Membranimmunfluoreszenz..................................................................... 57 3.5.3.3.1 Prinzip ................................................................................................ 57 3.5.3.3.2 Durchführung ........................................................................................... 57 3.5.3.3.3 Auswertung .............................................................................................. 58

3.5.4 Datengruppierung und Statistik............................................................ 62

3.5.4.1 Versuch 1: Orientierende Untersuchung auf der Basis einer randomisierten Tierauswahl ..................................................................... 62

3.5.4.1.1 Datengruppierung .................................................................................... 62 3.5.4.1.2 Statistik ................................................................................................ 62 3.5.4.2 Versuch 2: Methodische Fragestellungen ................................................ 63 3.5.4.2.1 Einfluß von Probenahmegefäß und Untersucher auf das mikroskopische Zelldifferentialbild............................................................ 63

Inhaltsverzeichnis

V

3.5.4.2.2 Einfluss von Probenahmegefäß und Antikörper auf das durchflußzytometrische Zelldifferentialbild ............................................... 63

3.5.4.2.3 Vergleich von Kieler Sedimentausstrich und Ausstrich der Zellsuspension ......................................................................................... 64 3.5.4.2.4 Überprüfung der Wiederholbarkeit verschiedener Parameter .................. 65 3.5.4.3 Versuch 3: Untersuchungen zum Zelldifferentialbild auf der Basis einer

selektierten Tierauswahl .......................................................................... 65

4. ERGEBNISSE.................................................................................. 66

4.1 Versuch 1: Orientierende Untersuchung auf der Basis einer randomisierten Tierauswahl............................................... 66 4.1.1 Selektierte Kriterien der Eutergesundheit............................................ 66

4.1.2 Mikroskopisches Zelldifferentialbild .................................................... 69

4.1.3 Durchflußzytometrische Parameter...................................................... 71

4.2 Versuch 2: Methodische Fragestellungen................................ 75 4.2.1 Einfluß des Probenahmegefäßes und des Untersuchers auf das

mikroskopische Zelldifferentialbild ...................................................... 75

4.2.1.1 Einfluß des Probenahmegefäßes............................................................. 76 4.2.1.2 Einfluß des Untersuchers......................................................................... 77

4.2.2 Einfluß des Probenahmegefäßes und des Antikörpers auf das durchflußzytometrische Zelldifferentialbild......................................... 78

4.2.2.1 Einfluß des Probenahmegefäßes............................................................. 79 4.2.2.2 Einfluß des Antikörpers ............................................................................ 79

4.2.3 Vergleich von Kieler Sedimentausstrich und Ausstrich der Zellsuspension mit der „Kaffeemühle“ ................................................ 79

4.2.4 Untersuchungen zur Wiederholbarkeit der mikroskopischen und durchflußzytometrischen Zelldifferenzierung ..................................... 87

4.2.4.1 Wiederholbarkeit der Milchzelldifferenzierung.......................................... 87 4.2.4.2 Wiederholbarkeit der Blutzelldifferenzierung............................................ 90

4.3 Versuch 3: Untersuchungen zum Zelldifferentialbild auf der Basis einer selektierten Tierauswahl.................................. 92 4.3.1 Selektierte Kriterien der Eutergesundheit............................................ 92

4.3.2 Mikroskopisches Zelldifferentialbild in Milch ...................................... 94

4.2.3 Mikroskopisches Zelldifferentialbild des Blutes ................................. 96

4.2.4 Durchflußzytometrische Parameter der Milchzellsuspension ........... 97

4.2.5 Durchflußzytometrische Parameter der Blutzellsuspension............ 106

Inhaltsverzeichnis

VI

5. DISKUSSION ................................................................................. 110

5.1 Versuch 1: Orientierende Untersuchungen auf der Basis einer randomisierten Tierauswahl............................................. 110

5.1.1 Selektierte Kriterien der Eutergesundheit.......................................... 110

5.1.2 Mikroskopisches Zelldifferentialbild .................................................. 111

5.1.3 Durchflußzytometrische Parameter.................................................... 112

5.1.3.1 Zellvitalität .............................................................................................. 113 5.1.3.2 CD4 und CD8......................................................................................... 113 5.1.3.3 WC1 .............................................................................................. 114 5.1.3.4 MHC II .............................................................................................. 116

5.1.4 Folgerungen zu Versuch 1 .................................................................. 116

5.2 Versuch 2: Methodische Fragestellungen.............................. 117 5.2.1 Einfluß des Probenahmegefäßes und des Untersuchers auf das

mikroskopische Zelldifferentialbild .................................................... 117

5.2.1.1 Einfluß des Probenahmegefäßes........................................................... 117 5.2.1.2 Einfluß des Untersuchers....................................................................... 118

5.2.2 Einfluß des Probenahmegefäßes und des Antikörpers auf das durchflußzytometrische Zelldifferentialbild....................................... 118

5.2.2.1 Einfluß des Probenahmegefäßes........................................................... 118 5.2.2.2 Einfluß des Antikörpers .......................................................................... 119

5.2.3 Vergleich von Kieler Sedimentausstrich und Ausstrich der Zellsuspension mit der „Kaffeemühle“ .............................................. 120

5.2.4 Untersuchungen zur Wiederholbarkeit der mikroskopischen und durchflußzytometrischen Zelldifferenzierung ................................... 122


5.3 Versuch 3: Untersuchungen zum Zelldifferentialbild auf der Basis einer selektierten Tierauswahl................................ 123 5.3.1 Selektierte Kriterien der Eutergesundheit.......................................... 123

5.3.2 Mikroskopisches Zelldifferentialbild in Milch .................................... 125

5.3.3 Mikroskopisches Zelldifferentialbild des Blutes ............................... 126

5.3.4 Durchflußzytometrische Parameter der Milchzellsuspension ......... 127

5.3.4.1 Zellvitalität .............................................................................................. 127 5.3.4.2 CD4 und CD8......................................................................................... 127 5.3.4.3 TCR1 .............................................................................................. 128

Inhaltsverzeichnis

VII

5.3.4.4 Bo 116 .............................................................................................. 129 5.3.4.5 MHC II .............................................................................................. 130 5.3.4.6 CD14 (LPS-Rezeptor) ............................................................................ 130

5.3.5 Durchflußzytometrische Parameter der Blutzellsuspension............ 131

5.3.5.1 Zellvitalität .............................................................................................. 131 5.3.5.2 CD4 und CD8......................................................................................... 132 5.3.5.3 TCR1 .............................................................................................. 133 5.3.5.4 Bo 116 .............................................................................................. 133 5.3.5.5 MHC II .............................................................................................. 134 5.3.5.6 CD14 (LPS-Rezeptor) ............................................................................ 134


6. ZUSAMMENFASSUNG ............................................................ 139

7. SUMMARY ...................................................................................... 142

8. RESUME........................................................................................... 145

9. LITERATURVERZEICHNIS .................................................... 148

10. EPILOG ............................................................................................. 167

Tabellen

VIII

TABELLEN

Tab. 1: Zellmorphologie von Milchzellen .............................................................. 12

Tab. 2: Zelldifferentialbild in Milch einer gesunden Milchdrüse ............................ 13

Tab. 3: Größe der CD4+ und CD8+ Lymphozytensubpopulationen in Blut und Milch ................................................................................................ 22

Tab. 4: Durchflußzytometrisches Zelldifferentialbild der Phagozyten in Blut und Milch vor und nach einer intrazisternalen LPS-Injektion (PAAPE et al. 1996) ................................................................................. 23

Tab. 5: Verwendete monoklonale Antikörper zur Charakterisierung von zellulären Oberflächenstrukturen in der Membranimmunfluoreszenz ...... 39

Tab. 6: Klinische Laborparameter zur Beurteilung der Allgemeingesundheit ....... 45

Tab. 7: Histogramm Statistik zu FL3-H................................................................. 57

Tab. 8: Quadranten Statistik für die Auswertung der MIF..................................... 61

Tab. 9: Gruppierung der Daten in Versuch 1........................................................ 62

Tab. 10: Gruppierung der Daten für den Vergleich der Ausstricharten KSA und ZSM, für die Untersuchung zur Wiederholbarkeit und für Versuch 3 ....... 64

Tab. 11: Stichprobengröße n Viertel, Mittelwert X und Standardabweichung sd der selektierten Kriterien der Eutergesundheit in Versuch 1 .................... 67

Tab. 12: Signifikanzen (p-Werte) der selektierten Kriterien der Eutergesundheit zwischen den Gruppen in Versuch 1............................. 68

Tab. 13: Korrelationskoeffizienten der selektierten Kriterien der Eutergesundheit mit SCC VAG ........................................................................................... 68

Tab. 14: Signifikanzen für die einzelnen Zellarten zwischen den Gruppen ............ 70

Tab. 15: Korrelationskoeffizienten der einzelnen Zellarten mit SCC VAG.............. 70

Tab. 16: Stichprobengröße n Viertel, Mittelwert X und Standardabweichung sd der durchflußzytometrischen Parameter der ZSM in Versuch 1............... 72

Tab. 17a: Signifikanzen für die durchflußzytometrischen Parameter zwischen den Gruppen ................................................................................................ 73

Tab. 17b: Signifikanzen für die durchflußzytometrischen Parameter zwischen den Gruppen ............................................................................................ 74

Tab. 18a: Korrelationskoeffizienten der durchflußzytometrischen Parameter mit SCC VAG ................................................................................................ 74

Tab. 18b: Korrelationskoeffizienten der durchflußzytometrischen Parameter mit SCC VAG ................................................................................................ 75

Tabellen

IX

Tab. 19: Ergebnisse der mikroskopischen Zelldifferenzierung in Versuch 2: Einfluß von Probenahmegefäß und Untersucher ..................................... 76

Tab. 20: Signifikanzen des Gefäßvergleichs getrennt nach Untersucher............... 77

Tab. 21: Signifikanzen des Untersuchervergleiches .............................................. 77

Tab. 22: Ergebnisse der durchflußzytometrischen Zelldifferenzierung in Versuch 2: Einfluß von Probenahmegefäß und Antikörper ...................... 78

Tab. 23: Zelldifferentialbild getrennt nach Gruppen, Methode KSA ....................... 83

Tab. 24: Zelldifferentialbild getrennt nach Gruppen, Methode „Kaffeemühle“ ........ 83

Tab. 25: Signifikanzen des Vergleichs der Ausstrichmethoden, getrennt nach Zellart und Eutergesundheitsstatus.......................................................... 84

Tab. 26: Mittelwert X und Standardabweichung sd der Differenz KSA - ZSM........ 84

Tab. 27: Signifikanzen für die einzelnen Zellarten und Methoden zwischen den Gruppen ................................................................................................ 86

Tab. 28a: Ergebnisse zur Wiederholbarkeit der mikroskopischen und durchflußzytometrischen Milchzelldifferenzierung.................................... 87

Tab. 28b: Ergebnisse zur Wiederholbarkeit der mikroskopischen und durchflußzytometrischen Milchzelldifferenzierung.................................... 88

Tab. 28c: Ergebnisse zur Wiederholbarkeit der mikroskopischen und durchflußzytometrischen Milchzelldifferenzierung.................................... 89

Tab. 29a: Ergebnisse zur Wiederholbarkeit der mikroskopischen und durchflußzytometrischen Blutzelldifferenzierung...................................... 90

Tab. 29b: Ergebnisse zur Wiederholbarkeit der mikroskopischen und durchflußzytometrischen Blutzelldifferenzierung...................................... 91

Tab. 30: Selektierte Kriterien der Eutergesundheit in Versuch 3, Gruppen A, B1 und C1 ................................................................................................ 93

Tab. 31: Korrelationskoeffizienten der selektierten Kriterien der Eutergesundheit mit SCC VAG in Versuch 3 ...................................................................... 94

Tab. 32: Signifikanzen (p-Werte) der Zellarten zwischen den Gruppen in Versuch 3 ................................................................................................ 95

Tab. 33: Korrelationskoeffizienten der einzelnen Zellarten mit SCC VAG.............. 96

Tab. 34a: Durchflußzytometrisches Zelldifferentialbild in Versuch 3, Gruppen A, B1 und C1 .............................................................................................. 101

Tab. 34b: Durchflußzytometrisches Zelldifferentialbild in Versuch 3, Gruppen B2, C2 und C3.............................................................................................. 102

Tab. 35a: Signifikanzen für die durchflußzytometrischen Parameter zwischen den Gruppen in Versuch 3 ..................................................................... 103

Tabellen

X

Tab. 35b: Signifikanzen für die durchflußzytometrischen Parameter zwischen den Gruppen in Versuch 3 ..................................................................... 104

Tab. 36a: Korrelationskoeffizienten für die durchflußzytometrischen Parameter in Versuch 3 ........................................................................................... 105

Tab. 36b: Korrelationskoeffizienten für die durchflußzytometrischen Parameter in Versuch 3 ........................................................................................... 105

Tab. 36c: Korrelationskoeffizienten für die durchflußzytometrischen Parameter in Versuch 3 ........................................................................................... 106

Tab. 37: Durchflußzytometrische Parameter der Blutzellsuspension in Versuch 3 .............................................................................................. 108

Tab. 38a: Signifikanzen für die durchflußzytometrischen Parameter des Blutes zwischen den Gruppen in Versuch 3...................................................... 109

Tab. 38b: Signifikanzen für die durchflußzytometrischen Parameter des Blutes zwischen den Gruppen in Versuch 3...................................................... 109

Tab. 39: Vorkommen von γδ-T-Zellen in Milch ..................................................... 115

Tab. 40: Prozentuale Verteilung der Zellen in verschiedenen durch Zentrifugation gewonnenen Milchfraktionen nach DILBAT 1967 ........... 121

Tab. 41: Vergleichende Gegenüberstellung von Milchparametern in „gesunden“ (Referenz A, n = 50) und an Mastitis erkrankten Vierteln (n = 68) unter

der Berücksichtigung der Analytik auf der Basis einer Signifikanz von mind. p < 0,05 ....................................................................................... 136

Abbildungen

XI

ABBILDUNGEN

Abb. 1: Untersuchungsschritte für VAG und VGH................................................ 47

Abb. 2: Auswertung der Vitalitätsmessung........................................................... 56

Abb. 3: Auswertung der MIF am Beispiel der Lymphozyten ................................. 60

Abb. 4: Zelldifferentialbild unter Berücksichtigung der Eutergesundheit in Versuch 1 ................................................................................................ 69

Abb. 5: Milchzellausstriche A - H, mikroskopiert bei 1000 –facher Vergrößerung in Ölimmersion ............................................................. 81/82

Abb. 6: KSA – Zelldifferentialbild unter Berücksichtigung der Eutergesundheit.... 85

Abb. 7: ZSM („Kaffeemühle“) – Zelldifferentialbild unter Berücksichtigung der Eutergesundheit ....................................................................................... 85

Abb. 8: Zelldifferentialbild der Milch unter Berücksichtigung der Eutergesundheit in Versuch 3 ............................................................................................. 95

Abb. 9: Zelldifferentialbild im Blut unter Berücksichtigung der Eutergesundheit in Versuch 3 ............................................................................................. 97

Abb. 10: Veränderungen der prozentualen Bindungsrate von CD4 und Bo116 an Milchzellen unter Berücksichtigung der Eutergesundheit.................... 99

Abkürzungen und Termini technici

XII

ABKÜRZUNGEN UND TERMINI TECHNICI

AO Akridinorange

Aqua (mono)dest. Aqua (mono)destillata (einfach destilliertes Wasser)

Aqua tridest. Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser)

BASO B Basophile Granulozyten Blut

Bo116, Bo139 Bezeichnung für subklonierte Hybridome und die von ihnen produzierten monoklonalen Antikörper

C Complement (Komplement)

CD Cluster of Differentiation

DNS Desoxyribonukleinsäure

DVG Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft

EOS B Eosinophile Granulozyten Blut

EPI Epithelzellen

ER Eppendorf Reaktionsgefäß

EV Events (Messereignisse)

FITC Fluoresceinisothiocyanat

FL 1-4 Detektoren des Durchflußzytometers

FR FACS – Röhrchen

FSC Forward Scatter (Vorwärtsstreulicht)

G-CSF Granulocyte-Colonystimulating factor

(Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor)

hgr. hochgradig

IDF International Dairy Federation

Ig Immunglobulin

IL Interleukin

k Korrelationskoeffizient

KSA Kieler Sedimentausstrich

LF elektrische Leitfähigkeit

LOG Logarithmus zur Basis 10

LPS Lipopolysaccharid

LYM (B) Lymphozyten (Blut)


XIII

MAK Makrophagen

mAk monoklonaler Antikörper

mgr. mittelgradig

MHC Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex)

MIF Membranimmunfluoreszenz

min Minute

MNC Mononuclear Cells (mononukleäre Zellen)

MONO B Monozyten Blut

mS Milli-Siemens

MT Mikrotiterplatte

n Stichprobengröße

NAG(ase) N-Acetyl-ß-D-Glucosaminidase

NK Natural Killer Zellen

ns nicht signifikant

OL Oben links

OR Oben rechts

PBS Phosphate Buffered Saline (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung)

PE Phycoerythrin

PE–Cy5 Phycoerythrin–Cytochrom 5

PI Propidiumiodit

PMN (B) Polymorphkernige Neutrophile Granzulozyten (Blut)

s signifikant

SCC Somatic Cell Count (Somatische Zellzahl = Zellgehalt)

sd Standardabweichung

SSC Side Scatter (Seitwärtsstreulicht)

Tab. Tabelle

TCR T-Zellrezeptor (T-Cell-Receptor)

TMR Total Mixed Ration

TNF Tumor Nekrose Faktor

TSB Tryptic Soy Broth (Tryptische Soja Boullion)

UL Unten links

UR Unten rechts


XIV

US Untersucher

UV Ultraviolett

VAG Viertelanfangsgemelk

VGH Viertelhandgemelk

VIT Vitalität

WC Workshop Cluster

X Mittelwert, arithmetisch

xg Vielfaches der Erdbeschleunigung

Xm Mittlere Fluoreszenzintensität

ZSB Zellsuspension Blut

ZSM Zellsuspension Milch

% prozentuale Bindungsrate (Durchflußzytometrie) + positiv = Antigen auf der Zelloberfläche nachgewiesen - negativ = Antigen auf der Zelloberfläche nicht nachgewiesen

Einleitung

1

1. EINLEITUNG

Der Zellgehalt der Milch ist ein wichtiges, wenn nicht das wichtigste Kriterium der

Mastitisdiagnostik. Auch ist seit langem bekannt, daß sich durch eine Mastitis nicht

nur die Zahl der Zellen in der Milch erhöht, sondern auch das Verhältnis der

einzelnen Zellarten zueinander verändert wird. Vielfach wird der Zelldifferenzierung

sogar eine größere Aussagefähigkeit als der Zellzählung zugebilligt. Für den

Routineeinsatz ist das bisherige mikroskopische Differenzierungsverfahren jedoch zu

zeitaufwendig und fehlerbehaftet, wie aus den bisher hierzu veröffentlichten Daten

hervorgeht. Automatisierte Verfahren der Zelldifferenzierung auf der Basis der

Impedanzmessung, die vor allem auf die Bestimmung des Anteils der PMN

ausgerichtet waren, haben sich nicht durchsetzen können. Eine weitere Möglichkeit

für die Zelldifferenzierung stellt die Durchflußzytometrie dar. Das bisher

veröffentlichte Datenmaterial erlaubt keine Bewertung ihrer Eignung zur

Differenzierung von Milch- oder Blutzellen und der Aussagekraft der so ermittelten

Zelldifferentialbilder bezüglich der Eutergesundheit.

Die Durchflußzytometrie in Kombination mit der Membranimmunfluoreszenz hat sich

in der Humanmedizin in den letzten Jahren als Verfahren in der Routinediagnostik

etabliert. Sie ist in der Diagnostik von Immunschwächeerkrankungen sowie von

Tumoren der Immunhistologie, die mikroskopisch ausgewertet wird, überlegen, da

sie eine weitgehend untersucherunabhängige, schnellere und genauere Beurteilung

des Untersuchungsmaterials ermöglicht. Ihr Einsatz beschränkt sich nicht nur auf aus

Blut gewonnene Zellsuspensionen, sondern es können auch andere Proben, wie z.B.

Bronchoalveolarlavagen untersucht werden.

In der Veterinärmedizin findet diese Technik hauptsächlich im Rahmen der

Forschung – auf dem Arbeitsgebiet der Kleintiermedizin seit einiger Zeit auch in der

Diagnostik – Anwendung. Im Bereich der Milchkunde wird die Durchflußzytometrie

zur Zählung der Zellen in der Milch eingesetzt.

Einleitung

2

Vor diesem Hintergrund wurde mir im Rahmen der Mitarbeit in der Arbeitsgruppe

Mastitisfrüherkennung der Zentrumsabteilung Hygiene und Technologie der Milch die

Aufgabe übertragen, das Zelldifferentialbild in Milch und Blut unter Berücksichtigung

der Eutergesundheit zu ermitteln, wobei neben mikroskopischen Verfahren die

Durchflußzytometrie unter Einschluß der Membranimmunfluoreszenz Verwendung

finden sollte.

Diese Fragestellung beinhaltet nicht nur einen hohen wissenschaftlichen Anspruch,

sondern könnte zu einer Verbesserung der Mastitisdiagnostik unter Feldbedingungen

beitragen. Diese praxisorientierte Feststellung ist insbesondere vor dem Hindergrund

der häufig nicht befriedigenden Heilungsquoten nach Einsatz medikamentöser

Behandlung hervorzuheben.

Für die analytische Auseinandersetzung mit der gewählten Thematik sollten

mikroskopische und durchflußzytometrische Techniken für die Substrate Milch und

Blut miteinander verglichen werden.

Literaturübersicht

3

2. LITERATURÜBERSICHT

2.1 Mastitisdiagnostik

Zur sicheren Diagnose erkrankter Milchdrüsen sollten immer mindestens zwei

Kriterien (Erreger- und Entzündungsnachweis) herangezogen werden. Die DVG

(1994) empfiehlt, den Gehalt somatischer Zellen im Viertelanfangsgemelk mit dem

Nachweis mikrobiologischer Erreger zu kombinieren.

Nach GRABOWSKI (2000) sind u.a. die Parameter elektrische Leitfähigkeit,

somatische Zellen und N-Acetyl-ß-D-Glucosaminidase für die Erkennung von

Eutererkrankungen geeignet. Die zytomikrobiologische Untersuchung wurde kürzlich

von der DVG (2000) ausführlich beschrieben.

2.1.1 Zellgehalt in normaler und in Mastitismilch

Die Zählung der somatischen Zellen in der Milch wird als verläßliche und spezifische

Methode zur Mastitisdiagnostik angesehen (KITCHEN 1981, TOLLE 1970). 20.000

bis 50.000 Zellen pro ml Milch werden als der normale physiologische Zellgehalt von

Milch aus gesunden Drüsenkomplexen mit einem oberen Grenzwert von 100.000

Zellen pro ml Milch bezeichnet (DOGGWEILER u. HESS 1983, HAMANN u.

REICHMUTH 1990, HAMANN 1992, SMITH 1996, DVG 2002). Oberhalb eines

Zellgehaltes von mehr als 100.000 Zellen pro ml ändert sich die chemische

Milchzusammensetzung und die Milchleistung der Kuh nimmt ab (TOLLE 1970,

WOOLFORD 1985, SHOSHANI u. MERMAN 1977, KNIGHT u. PEAKER 1991).

Bakteriologisch positive Milchproben aus entzündeten Milchdrüsen enthalten einen

signifikant erhöhten Zellgehalt von bis zu mehreren Millionen Zellen/ml Milch

(BLACKBURN 1968, PAAPE et al. 1979, KEHRLI u. SHUSTER 1994, SMITH 1996,

LABOHM et al. 1998).

Literaturübersicht

4

2.1.2 Physiologische Einflüsse auf den Zellgehalt der Milch

Zu Laktationsbeginn und –ende sowie mit zunehmender Laktationsnummer kann ein

erhöhter Zellgehalt beobachtet werden (BLACKBURN 1968, LABOHM et al. 1998).

Nach der Kolostralphase gibt es jedoch keine physiologische Erhöhung der Zellzahl,

vielmehr treten mit fortschreitender Laktation und steigender Laktationsanzahl

vermehrt Mastitiden auf, die zu einer Zellzahlerhöhung führen (REICHMUTH 1975,

DOGGWEILER u. HESS 1983, SMITH 1996).

Auch die Rasse hat einen signifikanten Einfluß auf den Zellgehalt der Milch. Die

Schwankungsbreite gesunder Drüsenkomplexe ist aber mit < 5.000 Zellen/ml Milch

so gering, daß sie bei der Diagnostik für praktische Belange außer acht gelassen

werden kann (DOGGWEILER u. HESS 1983).

Streß in Form von Weideaustrieb, Impfung oder Brunst führt nur dann zu einer

Erhöhung des Gehalts somatischer Zellen in der Milch, wenn die Milchdrüse bereits

vorgeschädigt ist (HAMANN u. REICHMUTH 1990, HAMANN 1992).

Zur Beurteilung der Zellgehaltes spielt auch die Gemelksfraktion eine gewisse Rolle.

Innerhalb eines Melkvorganges sind das Anfangs- und das Endgemelk zellreicher als

das Hauptgemelk (PAAPE u. TUCKER 1966, ÖSTENSSON et al. 1988, HAMANN u.

GYODI 1999).

2.1.3 Methoden zur Zellzählung

2.1.3.1 Prescott und Breed

Die Methode von Prescott und Breed aus dem Jahr 1910 wird als Referenzmethode

angesehen. Es werden 0,01 ml Milch auf 1 cm2 ausgestrichen, fixiert, entfettet und

mit Methylenblau gefärbt. Anschließend werden mindestens 400 Zellen

mikroskopisch gezählt. Mit Hilfe der Anzahl der ausgezählten Felder wird der

Zellgehalt pro ml errechnet. Diese Methode ist sehr arbeitsaufwendig und mit vielen

Literaturübersicht

5

Fehlerquellen behaftet. Die Verteilung der Zellen auf dem Objektträger ist meistens

nicht homogen, und zur Ermittlung des Zellgehaltes pro ml muß mit einem relativ

großen Faktor multipliziert werden. Zudem ist die Entscheidung, ob ein gefärbtes

Objekt eine Zelle ist, subjektiv (TOLLE et al. 1971, HEESCHEN 1975, IDF 1984,

KITCHEN 1981).

2.1.3.2 Coulter Counter

Die erste Automatisierung der Milchzellzählung erfolgte mit dem Coulter Counter, der

mit dem Prinzip der Impedanzmessung arbeitet. Nach Fixierung der Zellen mit

Formalin wird die Milch mit einem Detergenz verdünnt, so daß unter Hitzeeinwirkung

die Fettmicellen zerstört werden. Die Zellen werden anschließend einzeln zwischen

zwei Elektroden hindurchgeleitet. Die Zellen verdrängen dort eine hochleitende

Flüssigkeit und vergrößern dadurch den elektrischen Widerstand. Es entstehen

Spannungsimpulse in Abhängigkeit von der Partikelgröße. Die Anzahl der Impulse

gibt die Anzahl der Partikel wieder, die die Elektroden passiert haben (TOLLE et al.

1968, HEESCHEN 1975, IDF 1984). Auch einige Blutanalysengeräte messen nach

diesem Prinzip die Anzahl von Leukozyten, Erythrozyten und Thrombozyten im Blut.

2.1.3.3 Fossomatic

Dieses Verfahren beruht auf der Zählung fluoreszierender Partikel. Die Milchprobe

wird dazu mit einem Puffer und einer Färbelösung vermischt. Als Farbstoff wird

Ethidiumbromid eingesetzt, das die DNS der Zellen anfärbt und unter UV- oder

Laseranregung fluoresziert. Ursprünglich wurde die Probe auf eine rotierende

Scheibe aufgesprüht und vollautomatisch mikroskopisch ausgewertet. Die neueren

Geräte arbeiten heute nach dem Prinzip der Durchflußzytometrie. Beiden Verfahren

ist gemeinsam, daß jedes fluoreszierende Partikel in einen elektrischen Impuls

umgewandelt wird, der nach Verstärkung registriert werden kann. Der Zellgehalt wird

Literaturübersicht

6

vom Gerät in Tausend pro ml angegeben (HEESCHEN 1975, IDF 1984, HEESCHEN

et al. 1993, UBBEN et al. 1997).

2.1.4 NAGase-Aktivität

N-Acetyl-ß-D-Glucosaminidase (NAGase) ist ein intra- und extrazellulär wirksames

lysosomales Enzym, für das eine gesteigerte Aktivität im Rahmen der

Infektionsabwehr, u.a. im Zusammenhang mit Mastitiden, nachgewiesen wurde

(SANDHOLM u. MATTILA 1985, SCHÜTTEL 1999, GRABOWSKI 2000). Als

Hauptquelle in der Milch gelten vor allem Makrophagen, aber auch PMN. Die

Aktivität des Enzyms im Substrat Milch kann im Falle einer Mastitis um das

Zehnfache ansteigen und korreliert relativ eng mit der Zellzahl. Sie ist daher auch als

Kriterium für das frühzeitige Erkennen einer subklinischen Mastitis geeignet und hier

der Zellzahl evtl. sogar überlegen. Zumindest kann ihre Aussagefähigkeit in der

Mastitisdiagnostik mit derjenigen der Zellzahl gleichgestellt werden (SCHULTZE

1985, HAMANN et al. 1999). Ein weiterer Vorteil dieses empfindlichen Indikators der

Eutergesundheit ist, daß er nicht von Allgemeinerkrankungen beeinflußt wird

(KRÖMKER et al. 1999).

Die Aktivitätsmessung erfolgt nach dem fluoreszenzoptischen Prinzip im

Mikrotiterplattenverfahren. Die Aktivität wird zunächst in nmol x min–1 x ml–1

angegeben. Da die Werte ähnlich wie die Zellzahl nicht normalverteilt sind, werden

sie für statistische Berechnungen logarithmiert (NOGAI et al. 1996, SCHÜTTEL

1999).

2.1.5 Elektrische Leitfähigkeit

Die elektrische Leitfähigkeit der Milch wird bestimmt durch die Konzentration und

Beweglichkeit der dissoziierten Ionen (vor allem Chlorid-, Kalium- und Natrium-Ionen)

in der Milch. Im physiologischen Gleichgewicht ist die Kaliumionenkonzentration in

Literaturübersicht

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der Milch höher als im Blut, während es sich für Natrium- und Chloridionen

umgekehrt verhält. Dieses Konzentrationsgefälle wird von der Blut/Euterschranke

aufrechterhalten. Wird diese durch eine Euterentzündung geschädigt, so erhöht sich

ihre Permeabilität, wodurch es zum Einstrom von Natrium- und Chloridionen in die

Milch kommt (SCHULTZE 1985, HAMANN 1999).

Schon unter physiologischen Bedingungen wird die elektrische Leitfähigkeit

maßgeblich von vielen Faktoren beeinflußt, darunter Laktationsstadium, Rasse und

Melkintervall. Auch der Fettgehalt der Milch spielt eine Rolle, da die Fettmicellen die

Ionenbeweglichkeit herabsetzen. Eine umfassende Literaturstudie zur Eignung der

elektrischen Leitfähigkeit für die Mastitisdiagnostik wurde 1998 von HAMANN und

ZECCONI veröffentlicht (IDF-Bulletin Nr. 334).

Die elektrische Leitfähigkeit ist zwar prinzipiell als Parameter für die Erkennung von

Eutererkrankungen geeignet, und oberhalb eines Grenzwertes von 6,5 mS/cm

besteht nur noch ein geringes Risiko für falsch positive Befunde. Aufgrund ihrer

hohen physiologischen Variabilität ist ihre diagnostische Aussagefähigkeit jedoch als

gering einzuschätzen. Die elektrische Leitfähigkeit sollte daher nur in Kombination

mit weiteren Parametern zur Mastitisdiagnostik eingesetzt werden (HAMANN 1999,

GRABOWSKI 2000, HAMANN u. ZECCONI 1998). Eine weitere Möglichkeit der

Bewertung dieses Parameters ist der Vergleich innerhalb der Euterviertel, da der

Wahrscheinlichkeit nach eine intramammäre Infektion die einzige Einflußgröße ist,

die nur ein einzelnes Viertel befällt (SCHULTZE 1985).

Die elektrische Leitfähigkeit kann einerseits mit Handgeräten als sogenannter „Cow

side test“, andererseits auch automatisch durch fest in die Melkeinheit integrierte

Sensoren gemessen werden (SCHULTZE 1985). In automatischen Melksystemen

wird diese Möglichkeit zur automatischen Überwachung der Eutergesundheit

eingesetzt.

Literaturübersicht

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2.2 Mikroskopische Zelldifferenzierung

2.2.1 Geschichte

Die Differenzierung von somatischen Milchzellen wird seit fast 100 Jahren durch-

geführt. Bis 1926 wurden keine prozentualen Verteilungen angegeben. Die

Unterscheidung erfolgte zwischen Leukozyten (heute PMN), Lymphozyten,

Makrophagen und Epithelzellen. Dabei ist zu beachten, daß sich die Bedeutung des

Begriffs „Leukozyten“ gewandelt hat: Heute bezeichnet er nicht mehr die Zellart der

neutrophilen Granulozyten oder PMN, sondern ist eine Sammelbezeichnung für alle

Abwehrzellen. Bis 1947 wurden fast alle großen Zellen den Makrophagen bzw.

Histiozyten zugerechnet, anschließend wurden sie fast ausschließlich als

Epithelzellen eingeordnet. Seit 1977 werden aufgrund elektronenmikroskopischer

Untersuchungen die mononukleären Zellen der Milch mit einer Größe von 8 – 30 µm

als Makrophagen identifiziert (MIELKE u. KOBLENZ 1980, LEE et al. 1980, PAAPE

et al. 1981). Auch der Anteil der PMN in normaler Milch schwankt in den

Untersuchungen zwischen 1 % und 58 %, wobei normale Milch nicht genau definiert

ist. Seit 1932 wurde bei der differenzierten Betrachtung der Milchzellen ein

Unterschied in der Zusammensetzung zwischen normaler und Mastitismilch

festgestellt, der sich in einem höheren Anteil PMN in Mastitismilch ausdrückt

(MIELKE u. KOBLENZ 1980). Bei der Betrachtung derartiger Zahlen sollten aber die

Schwankungen in der Definition normaler Milch bedacht werden. Der Grenzwert für

die Anzahl somatischer Zellen in Milch aus gesunden Milchdrüsen, der seit 1970 mit

100.000 Zellen pro ml definiert ist (TOLLE et al. 1971, DOGGWEILER u. HESS

1983, DVG 1994), wird bis heute in vielen Untersuchungen nicht berücksichtigt.

Häufig wird auch Milch mit einer Zellzahl größer 100.000 Zellen pro ml als normal

definiert (BLACKBURN 1968, LEE et al. 1980, MIELKE u. KOBLENZ 1980,

KITCHEN 1981, KURZHALS et al. 1985, CONCHA 1986, PARK et al. 1992,

LEITNER et al. 1995, LEUTENEGGER et al. 2000, SURIYASATHAPORN et al.

2000), oder es wird keine Definition der verwendeten Milch angegeben (LEE et al.

1980, HAGELTORN u. SAAD 1986, PAAPE et al. 1996)

Literaturübersicht

9

2.2.2 Methoden zur Herstellung von Milchausstrichen

Das Ziel der unter 2.1.3.1 beschriebenen Methode von PRESCOTT und BREED aus

dem Jahr 1910, die auf dem direkten Ausstrich der Milch beruht, ist die reine

Zellzählung. Für die Zelldifferenzierung wird zunächst durch Zentrifugation das

zellreiche Sediment der Milch gewonnen und dann mit unterschiedlichen Techniken

auf den Objektträger aufgebracht.

2.2.2.1 Kieler Sedimentausstrich

Dieses Ausstrichverfahren geht auf SELEMANN et al. (1936) zurück. Nach der

ursprünglichen Methode wird die Milch zunächst auf 85°C erhitzt, dann für zehn

Minuten zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Sediment wird mit einer Öse

auf einer Fläche von 3 cm2 ausgestrichen und nach Lufttrocknung für ca. 5 Sekunden

mit Toluidinblau oder für ca. 10 Minuten mit Methylenblau gefärbt. In späteren

Methodenbeschreibungen wurde die Erhitzung der Probe weggelassen. Hauptziel

dieses Ausstrichverfahrens war die semiquantitative Zellzahlbestimmung. Durch die

Automatisierung der Zellzählung in Milch hat es hier jedoch seine Bedeutung

verloren (DILBAT 1963, KRAFT 1994, HAMANN et al. 2001).

2.2.2.2 Cytospin

DULIN et al. (1982) haben eine heute weit verbreitete Methode zum Ausstreichen

des Milchsediments beschrieben. Cytospin ist eine Zentrifuge für Objektträger, auf

denen eine Probenkammer fixiert ist. Durch saugfähiges Papier ist direkt unter der

Kammer eine runde Fläche mit einem Durchmesser von ca. 5 mm begrenzt. Nur

diese Fläche wird später mikroskopiert.

Zur Gewinnung des Sediments werden 1 ml Milch mit 8 ml eiskaltem PBS für 10

Minuten bei 180 xg zentrifugiert. Je nach Pelletgröße wurde das Pellet in nur 0,2 ml

Literaturübersicht

10

TSB oder zusätzlich 2 ml PBS resuspendiert. 0,2 ml der Zellsuspension wurden in

die Cytospinkammer überführt und bei 225 xg für 10 Minuten zentrifugiert. Vor dem

Färben nach Wright werden die Ausstriche luftgetrocknet.

2.2.3 Zellmorphologie

2.2.3.1 Allgemeines

Die Anfertigung von Milchausstrichen zur Zelldifferenzierung ist schwierig, und es ist

unmöglich, die Qualität von Blutausstrichen zu erreichen (MIELKE u. KOBLENZ

1980, DULIN et al. 1982, MILLER et al. 1993). Entsprechend fehleranfällig ist die

Zelldifferenzierung, was sicherlich ein Grund für die z.T. sehr unterschiedlichen

Ergebnisse der einzelnen Forscher ist. Gerade Makrophagen und Epithelzellen sind

so nur schwer zu unterscheiden, weil sie gleich groß sind und beide Fetteinschlüsse

enthalten können. Des weiteren führt die Tatsache, daß nicht eindeutig

differenzierbare Zellen aus dem Zelldifferentialbild ausgeschlossen werden, ebenfalls

zu Verzerrungen (MIELKE u. KOBLENZ 1980, LEE et al. 1980). Diese Aspekte sind

stark vom Untersucher abhängig, da er, selbst nach gründlicher Einweisung,

letztendlich selber seine Kriterien für die Unterscheidung der Zellen festlegen muß.

Die folgende Beschreibung der unterschiedlichen Zellmorphologien basiert

hauptsächlich auf licht- und elektronenmikroskopischen Analysen von Milch-, aber

auch von Blutleukozyten (SCHÖNBERG 1956, PAAPE et al. 1979, MIELKE u.

KOBLENZ 1980, LEE et al. 1980, LUDEWIG 1996, LIEBICH 1993). In Tab. 1 sind

die Zellmorphologien schematisiert zusammengefaßt.

2.2.3.2 PMN

Neutrophile Granulozyten oder auch PMN (Polymorphonuclear Neutrophils) sind an

einem intensiv gefärbten, stabförmigen oder gelappten Kern und an kleinen dichten

Literaturübersicht

11

Granula im Zytoplasma zu erkennen. Ihre Größe beträgt 10 – 14 µm. Enthalten sie

jedoch Fettvakuolen, können sie einen ähnlichen Umfang wie Makrophagen

erreichen.

2.2.3.3 Eosinophile Granulozyten

Eosinophile Granulozyten haben die gleiche Zellgröße und Kernform wie PMN; sie

enthalten jedoch eosinophile Granula, die mit 0,5 – 1,5 µm etwas größer als die

neutrophilen Granula sind.

2.2.3.4 Basophile Granulozyten

Auch basophile Granulozyten haben einen gelappten Kern, sind mit 9 –12 µm

durchschnittlich aber etwas kleiner als PMN. Ihr Zytoplasma enthält 1,5 µm große

basophile Granula, die den Kern überlagern können.

2.2.3.5 Lymphozyten

Die 5 - 10 µm großen Lymphozyten zeichnen sich durch einen runden bis ovalen

Kern mit wenig oder keinem umgebenden Zytoplasma aus. Kern und Zytoplasma

sind dichter, d.h. intensiver gefärbt als bei kleinen Monozyten bzw. Makrophagen.

Aktivierte Lymphozyten können bis zu 25 µm groß werden. Obwohl Lymphozyten

funktionell eine sehr heterogene Zellpopulation sind, können sie im Ausstrich nicht

weitergehend unterteilt werden.

2.2.3.6 Monozyten

Monozyten sind 12 – 20 µm groß und haben einen runden bis nierenförmigen Kern.

Im schwach basophilen Zytoplasma liegen azurophile Granula.

Literaturübersicht

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2.2.3.7 Makrophagen

Makrophagen kommen in einer Größe von 8 - 30 µm vor und ihr Zellkörper ist 0,5 -

10 mal größer als der Kern. Das Zytoplasma enthält häufig nicht angefärbte

Vakuolen. Der Kern, der in sehr vielfältigen Formen vorkommt, besteht aus diffusem

Chromatin und wird daher schwächer angefärbt als der Kern von PMN oder

Lymphozyten. Ihre Größe nimmt mit der Menge phagozytierter (Fett-) Partikel zu und

kann auch deutlich über 18 µm liegen.

2.2.3.8 Epithelzellen

Epithelzellen kommen meist als Klumpen von 4-16 Zellen vor. Ihre Zellkerne sind

groß und rund; das Verhältnis zwischen Kern und Zytoplasma beträgt 1:2 - 3.

Tab. 1: Zellmorphologie von Milchzellen

Zellart Größe Kern Zytoplasma

PMN 10 – 14 µm intensiv gefärbt, stabförmig oder gelappt

dichte neutrophile Granula; 0,5 – 1 µm

Eosinophile Granulozyten

10 – 14 µm intensiv gefärbt, stabförmig oder gelappt

eosinophile Granula; 0,5 – 1,5 µm

Basophile Granulozyten

9 – 12 µm intensiv gefärbt, stabförmig oder gelappt

basophile Granula; 1,5 µm

Lymphozyten/ Blasten

5 – 10 µm bis 25 µm

intensiv gefärbt, rund bis oval

sehr wenig, intensiv gefärbt

Makrophagen 8 – 30 µm schwach gefärbt, vielfältige Formen

schwach gefärbt, oft nicht angefärbte Vakuolen

Epithelzellen 10 – 14 µm intensiv gefärbt, groß und rund

schwach gefärbt, nicht angefärbte Vakuolen

möglich

Literaturübersicht

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2.2.4 Zelldifferentialbild in Milch einer gesunden Milchdrüse

Seit den 1980er Jahren ist bekannt, daß die Makrophagen die größte Zellfraktion in

der Milch bilden, gefolgt von Lymphozyten, PMN und Epithelzellen. Wie aus Tab. 2

hervorgeht, herrscht noch keine Einigkeit darüber, wie groß der Anteil der einzelnen

Zellpopulationen in normaler Milch genau ist. Das von PAAPE et al. (1981)

veröffentlichte Zelldifferentialbild von 60 % Makrophagen, 28 % Lymphozyten, 10 %

neutrophile Granulozyten (PMN) und 2 % Epithelzellen wird von anderen Autoren am

häufigsten zitiert (CONCHA 1986, BURVENICH et al. 1995, KELLY et al. 2000).

Tab. 2: Zelldifferentialbild in Milch einer gesunden Milchdrüse

Zellart

Quelle MAK LYM PMN EPI

0 %1) 5 %1) 95 %1) Paape et al. 1979

3 %2) 22 %2) 75 %2)

Lee et al. 1980 80 % 16 % 3 % 1 %

Paape et al. 1981 60 % 28 % 10 % 2 %

Kurzhals et al. 1985 63 % 1,5 % 34 % 2,4 %

Wever u. Emanuelson 1989

48 % 15 % 37 %

Miller et al. 1991 30 % 24 % 26 % 19 %

Östensson 1993 74 % 14 % 12 %

1) Kühe MAK = Makrophagen, LYM = Lymphozyten 2) Färsen PMN = neutrophile Granulozyten, EPI = Epithelzellen

Des weiteren wird eine Abhängigkeit der Zellzusammensetzung von

Laktationsstadium und –nummer sowie der Gemelksfraktion beschrieben

(BLACKBURN 1966, PAAPE u. Tucker 1966, ÖSTENSSON et al. 1988, MILLER et

al. 1991, ÖSTENSSON 1993).

Literaturübersicht

14

So nimmt mit steigender Laktationsnummer der Gehalt somatischer Zellen in der

Milch zu, wobei die PMN die Hauptträger dieses Anstiegs sind und sich ihr Anteil an

der Gesamtzellzahl erhöht. (BLACKBURN 1966 u. 1968, BURVENICH et al. 1995,

LABOHM et al. 1998). Diese Beobachtungen entsprechen dem Zelldifferentialbild der

Milch während einer Euterentzündung (siehe 2.2.5), so daß der Einfluß der

Laktationsnummer eigentlich auf eine erhöhte Infektionsrate älterer Tiere

zurückzuführen ist (WEVER u. EMANUELSON 1989).

Ähnlich zu interpretieren ist die Darstellung, daß zu Laktationsbeginn der Anteil der

Makrophagen am größten ist und gegen Laktationsende sowohl der absolute

Milchzellgehalt als auch der PMN-Anteil ansteigen (BLACKBURN 1966, CONCHA

1986, BURVENICH et al. 1995). Die Dominanz der Makrophagen zu

Laktationsbeginn ist unbestritten, gegen Laktationsende findet in gesunden

Milchdrüsen jedoch ein gleich starker Anstieg von Lymphozyten und Epithelzellen

statt (ÖSTENSSON et al. 1988). Der Anteil der Epithelzellen von im Mittel unter 2 %

kann bei Färsen in den ersten 4 Laktationswochen auf bis zu 15 % steigen (MILLER

et al. 1991, BURVENICH et al. 1995).

2.2.5 Zelldifferentialbild in Milch einer erkrankten Milchdrüse

Die Hauptreaktion der Milchdrüse auf eine Infektion ist das schnelle Einströmen von

PMN, in weit geringerem Maß auch von Lymphozyten und Makrophagen, in die

Milch, wodurch der Zellgehalt der Milch auf einige Millionen Zellen pro ml steigen

kann. In der akuten Phase der Entzündung stellen die PMN bis zu 95 % der

somatischen Milchzellen (BLACKBURN 1968, PAAPE et al. 1979, KURZHALS et al.

1985, ÖSTENSSON 1993, BURVENICH et al. 1995, LABOHM et al. 1998).

Die Höhe des Zellinflux in ein infiziertes Viertel ist u.a. von der Erregerart abhängig.

Ab dem siebten Tag post infectionem nimmt der Anteil der PMN ab und derjenige der

Lymphozyten zu. Bei subklinischen und chronischen Mastitiden stellen auch die

Literaturübersicht

15

Makrophagen wieder einen größeren Anteil an den somatischen Zellen in der Milch

(CONCHA 1986, ÖSTENSSON 1993, LEITNER et al. 1995, LABOHM et al. 1998).

2.2.6 Zelldifferentialbild des Blutes

Im Blut des Rindes kommen physiologischer Weise 25 – 35 % PMN (Neutrophile

Granulozyten), 5 – 6 % Eosinophile Granulozyten, < 1 % Basophile Granulozyten,

55 – 65 % Lymphozyten und 5 – 10 % Monozyten vor. Die Morphologie der Zellen

entspricht der Beschreibung unter 2.2.2 (LIEBICH 1993). In der akuten Phase einer

bakteriellen Infektion sinkt zunächst der Anteil der PMN auf ca. 18 %, um nach

sieben Tagen über das physiologische Maß hinaus auf ca. 80 % anzusteigen. Nach

ca. zehn Tagen nimmt dann der Anteil der Lymphozyten zu, oft begleitet von einer

Eosinophilie (BICKHARDT 1992, BURVENICH et al. 1994).

2.3 Durchflußzytometrische Zelldifferenzierung

2.3.1 Differenzierung aufgrund der Zellmorphologie

Wie unter 2.1.3.3 beschrieben, mißt ein Durchflußzytometer prinzipiell leuchtende

Partikel. Ein auf die Zellanalytik ausgelegtes Gerät erfaßt zusätzlich zu

verschiedenen Farben noch Größe und Struktur der Zellen.

Die Anfärbung der DNS und RNS mit einer 0,0004 %igen Acridinorangelösung kann

genutzt werden, PMN, Lymphozyten, Makrophagen und Monozyten in Blut und Milch

zu unterscheiden (HAGELTORN u. SAAD 1986). Für die Messung wird die Milch

lediglich 1:200 mit der Färbelösung verdünnt. Im Gegensatz zu PMN und

Lymphozyten konnte in einem Koordinatensystem, in dem Partikelgröße gegen

Partikelstruktur dargestellt wurden, für Monozyten und Makrophagen keine Region

festgelegt werden. Mit Hilfe einer Sortiereinrichtung am Durchflußzytometer wird die

Zelldifferenzierung mikroskopisch bestätigt. Nach längerer Lagerung der Milchproben

Literaturübersicht

16

veränderte sich die Wolke der PMN derart, daß eine Abgrenzung gegen die

Lymphozyten erschwert wurde.

Wird für die Zelldifferenzierung auf die mikroskopische Kontrolle verzichtet, so kann

der Anteil der Makrophagen rechnerisch ermittelt werden, indem die Summe der

PMN und Lymphozyten von allen gemessenen Zellen abzogen wird (ÖSTENSSON

et al. 1988, ÖSTENSSON 1993).

Auch der DNS-Farbstoff Carboxydimethylfluoreszeindiazetat ist dafür geeignet,

intakte lebende Zellen von Zellfragmenten zu unterscheiden. Vor der

durchflußzytometrischen Analyse werden durch Zentrifugation die Zellen aus der

Milch separiert. Bisher wurde mit dieser Methode lediglich der Anteil der PMN

bestimmt (MILLER et al. 1993).

Durch die Kombination der DNS-Farbstoffe SYBR green 1 und Propidiumiodid

können durchflußzytometrisch durch Zentrifugation gewonnene Milchzellen in PMN

und mononukleäre Zellen differenziert werden. Diese Farbstoffkombination

ermöglicht es, nur lebende Zellen in der Auswertung zu berücksichtigen, wodurch die

Abgrenzung der Zellpopulationen verbessert wird (PILAI et al. 2000).

2.3.2 Differenzierung mit Hilfe monoklonaler Antikörper

2.3.2.1 Herstellung monoklonaler Antikörper

Monoklonale Antikörper werden mit Hilfe von tumorös entarteten Plasmazellen der

Maus, den Myelomzellen, hergestellt. Nach Immunisierung einer Maus gegen ein

bestimmtes Antigen werden Milzzellen dieser Maus mit Myelomzellen fusioniert.

Durch mehrere Schritte werden die so gewonnenen Hybridomzellen vereinzelt, so

daß Zellklone entstehen, die sich aus einer einzigen Zelle gebildet haben und nur

monoklonale Antikörper eines Isotyps und einer Spezifität produzieren. In weiteren

Schritten wird dann die genaue Spezifität des Antikörpers ermittelt, so daß er

analytisch eingesetzt werden kann. Solche Antikörper können durch chemische

Literaturübersicht

17

Reaktionen an ihrem unspezifischen Teil mit Fluorochromen, Enzymen oder anderen

Molekülen gekoppelt werden, um sie sichtbar zu machen (JANEWAY u. TRAVERS

1997). Zur Differenzierung einzelner Zellpopulationen und zellulärer Subpopulationen

werden diese Antikörper in der Membranimmunfluoreszenz eingesetzt (siehe

3.5.3.3).

2.3.2.2 Cluster of Differentiation

Die Oberflächenstrukturen von Zellen können in Haupthistokompatibilitätskomplex,

Antigenrezeptoren und Differenzierungsantigene unterteilt werden. Letztere werden

allgemein „Cluster of Differentiation“ (CD) genannt und durchnummeriert. Diese aus

der Humanmedizin stammende Bezeichnung wurde auch in der Tiermedizin

übernommen. Eine CD-Bezeichnung wird aber erst vergeben, wenn festgestellt

wurde, daß die gefundene Struktur mit der menschlichen übereinstimmt. Das

geschieht in internationalen Workshops. Konnte keine korrespondierende humane

Struktur gefunden werden, so erhält die Struktur beim Rind die Bezeichnung

„Workshop Cluster“ (WC1). Beide Bezeichnungen sagen nichts über die Funktion der

Oberflächenstruktur aus (MORRISON et al. 1991, JANEWAY u. TRAVERS 1997).

Die CD-Moleküle können auch polymorph vorkommen, wie dies z.B. für das bovine

CD4 beschrieben wurde. Durch den Vergleich von zwölf gegen CD4 gerichtete

Antikörper wurden unterschiedliche Bindungsverhalten festgestellt (BENSAID u.

HADAM 1991, MORRISON et al. 1991).

Im folgenden wird auf diejenigen Oberflächenstrukturen näher eingegangen, deren

Expression unter Berücksichtigung der Eutergesundheit mit Hilfe der

Membranimmunfluoreszenz im Rahmen der vorgelegten Arbeit untersucht wurde.

Literaturübersicht

18

2.3.2.3 Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II

Das bovine MHC (Major Histocompatibility Complex) Klasse II Molekül kann auf der

Oberfläche von professionellen antigenpräsentierenden Zellen nachgewiesen

werden. Dazu gehören u.a. B-Zellen, Makrophagen und dendritische Zellen.

Überdies werden diese Moleküle auf aktivierten Zellen exprimiert, z.B. aktivierten T-

Zellen. Die Expression wird durch Zytokine, v.a. Interferon-γ, reguliert (PASTORET et

al. 1998). Diese Präsentation von antigenen Peptiden ist ein wichtiger Bestandteil der

Immunregulation.

2.3.2.4. TCR1

Die im Mikroskop nicht weiter unterteilbare Population lymphoider Zellen der Milch

läßt sich anhand von Oberflächenstrukturen in drei große Subpopulationen einteilen:

B-Zellen, αβ-T-Zellen mit dem T-Zellrezeptor (TCR) 2 und γδ-T-Zellen mit dem TCR1

(WYATT et al. 1996).

Bovine γδ-T-Zellen sind eine heterogene Gruppe, deren Bedeutung noch nicht

abschließend geklärt ist. Es wird vermutet, daß sie ein Teil des angeborenen

Überwachungssystems sind, das insbesondere im Darmtrakt und in der Milchdrüse

eine wichtige Verteidigungslinie gegen Infektionen darstellt. Bei Jungtieren ist ihre

Population größer als bei adulten. γδ-T-Zellen werden vor allem in Schleimhäuten

nachgewiesen und sind in der Milz, der Milchdrüse und dem Darmepithel besonders

häufig zu finden. Dort sollen sie immunregulatorische Funktionen haben. In

Wiederkäuern rezirkuliert ein Großteil dieser Lymphozytenpopulation zwischen Blut,

Gewebe und Lymphe und ist in den peripheren Körperkompartimenten weit verteilt

(PARK et al. 1992, WYATT et al. 1994, DAVIS et al. 1996, MACHUGH et al. 1997,

FERENS et al. 1998, DAUBENBERGER et al. 1999, SOLTYS u. QUINN 1999)

Literaturübersicht

19

2.3.2.5 WC1

WC1 ist ein vom T-Zell-Rezeptor unabhängiger Marker für γδ-T-Zellen, dessen

Funktion noch ungeklärt ist. Es wird jedoch spekuliert, daß sie derjenigen von CD4

und CD8 ähnelt, d.h. daß dieses Molekül ein Korezeptor des T-Zellrezeptors ist

(DAUBENBERGER et al. 1999, VAN KAMPEN et al. 1999).

2.3.2.6 CD4

CD4 wird von einer großen Subpopulation der αβ-T-Zellen sowie einem kleinen Teil

der γδ-Lymphozyten als Korezeptor exprimiert. Die CD4-positiven (CD4+) T-

Helferzellen erkennen die von MHC Klasse II präsentierten Peptide und aktivieren

u.a. durch die Sekretion von Zytokinen die Makrophagen dazu, phagozytierte

Bakterien abzutöten (JANEWAY u. TRAVERS 1997, FERENS et al. 1998,

DAUBENBERGER et al. 1999, RIOLLET et al. 2000).

2.3.2.7 CD8

Analog zu CD4 wird auch CD8 von einer großen Subpopulation der αβ-T-Zellen

sowie einem kleinen Teil der γδ-Lymphozyten als Korezeptor exprimiert. CD8+ αβ-T-

Zellen können entweder zytotoxische oder suppressive Lymphozyten sein. Sie

reagieren auf von MHC Klasse I präsentierte Antigene. Zytotoxische Lymphozyten

töten viral oder tumorös entartete Zellen ab, während suppressive Lymphozyten

durch die Sekretion spezifischer Zytokine die Immunantwort herunterregulieren

(JANEWAY u. TRAVERS 1997, FERENS et al. 1998, DAUBENBERGER et al. 1999,

RIOLLET et al. 2000).

Literaturübersicht

20

2.3.2.8 CD14 (LPS-Rezeptor)

CD14 kommt auf der Oberfläche boviner Monozyten, Makrophagen und einer

Subpopulation der PMN vor. Er ist ein Rezeptor für den Komplex aus

Lipopolysaccharid (LPS) und LPS-Bindungsprotein. Die Bindung an diesen Rezeptor

löst in Monozyten und Makrophagen u.a. die Synthese von Interleukin (IL) -1, IL-6,

IL-8, dem Tumornekrosefaktor (TNF) α und dem Granulozytenkoloniestimulierenden

Faktor (G-CSF) aus.

Die Bindung an CD14 steht somit am Anfang einer Entzündungsreaktion. CD14 wird

auch als Marker für Makrophagen eingesetzt (ADLER et al. 1994, SOPP et al. 1996,

BERTHON u. HOPKINS 1996).

2.3.3 Zelldifferentialbild einer gesunden Milchdrüse

Bei der durchflußzytometrischen Zelldifferenzierung mit Hilfe von Antikörpern wird

nur selten der prozentuale Anteil von PMN, Lymphozyten und Makrophagen an allen

Zellen angegeben, sondern meistens werden Aussagen über die Expression von

Oberflächenstrukturen, das Reaktionsmuster von Subpopulationen bzw. ihr

Verhältnis zueinander gemacht.

2.3.3.1 Phagozyten

In der Milch normal laktierender Kühe konnte auf ca. 68 % der PMN CD14 und auf

ca. 80 % CD11b nachgewiesen werden. Für CD18 schwanken die Angaben

zwischen 65 und 88 % (PAAPE et al. 1996, RIOLLET et al. 2001).

35% der großen mononukleären Zellen (große MNC) tragen CD14 und 55 % CD18

auf ihrer Oberfläche. Für den Anteil der Makrophagen an den MNC besteht eine

Abhängigkeit vom Laktationsstadium: er ist mit 69 % peripartal am größten und sinkt

Literaturübersicht

21

im Laktationsverlauf auf 21 % (PARK et al. 1992, PAAPE et al. 1996, RIOLLET et al.

2001).

2.3.3.2 Lymphozyten

Durchschnittlich sind in der Milch 20 % der Lymphozyten B-Lymphozyten und 45 %

T-Lymphozyten, ihre Anteile sind jedoch erheblichen Schwankungen unterlegen

(CONCHA et al. 1978, PAAPE et al. 2000). Der Anteil der B-Lymphozyten zeigt

einen ähnlichen Verlauf wie derjenige der Makrophagen: er schwankt zwischen 25 %

peripartal und 7 % in der Laktation. Die T-Lymphozyten verhalten sich

entgegengesetzt: im Geburtszeitraum stellen sie 16 % der Lymphozyten, später

62 % (PARK et al. 1992, VAN KAMPEN u. MALLARD 1997). Mit Hilfe eines

Antikörpers gegen den B-Zellmarker CD21 können in der Lymphozytenpopulation

der Milch nur ca. 1 % B-Lymphozyten nachgewiesen werden, mit dem T-Zellmarker

CD2 aber ca. 60 % T-Lymphozyten (RIOLLET et al. 2001).

Tab. 3 stellt den Anteil der CD4+ und CD8+ Zellen an den T-Lymphozyten dar. Das

Verhältnis dieser beiden Zellarten (CD4/CD8) ist < 1 (YAMAGUCHI et al. 1999,

PAAPE et al. 2000). Beide Subpopulationen unterliegen einem Laktationseinfluß. In

der Frühlaktation ist der Anteil der CD8+ Zellen am größten und nimmt im

Laktationsverlauf ab. Bei den CD4+ Zellen verhält es sich genau umgekehrt (ASAI et

al. 1998).

Literaturübersicht

22

Tab. 3: Größe der CD4+ und CD8+ Lymphozytensubpopulationen in Blut und Milch

Antigen

Quelle CD4 CD8 Substrat Bezug

8 – 28 % 8 – 34 % Milch Lymphozytenmorphologie Park et al. 1992

25 – 31 % 16 – 21 % Blut Lymphozytenmorphologie

Schmaltz et al. 1996 35 – 42 % 58 – 65 % Milch CD3+ Lymphozyten

Taylor et al. 1997 32 – 33 % 47 – 49 % Milch T-Lymphozygen

10 – 27 % 35 – 40 % Milch CD3+ Lymphozyten Van Kampen et al.

1999 33 – 40 % 10 – 18 % Blut CD3+ Lymphozyten

24 ± 14 % 59 ± 13 % Milch CD2+ Lymphozyten Asai et al. 2000

67 ± 6,2 % 20 ± 3,6 % Blut CD2+ Lymphozyten

Riollet et al. 2001 33 % 21 % Milch Lymphozytenmorphologie

Die Population der γδ-T-Zellen bildet mit ca. 29 % die dritte große

Lymphozytenfraktion in der Milch, ca. 13 % davon sind CD8+ γδ-T-Zellen. Zur Geburt

sind ca. 20 % Lymphozyten in der Milch WC1+, in der Laktation geht ihr Anteil auf ca.

15 % (VAN KAMPEN et al. 1999) bzw. 5 % (RIOLLET et al. 2001) zurück.

MHC II wird von ca. 6 % der Lymphozyten exprimiert (RIOLLET et al. 2001).

Literaturübersicht

23

2.3.4 Zelldifferentialbild einer erkrankten Milchdrüse

Viele der im Folgenden aufgeführten Daten beruhen auf durch LPS- bzw.

Toxininstillation in die Milchdrüse künstlich hervorgerufenen Mastitiden oder aber auf

experimentellen Infektionen v.a. mit Staphylococcus (S.). aureus, nicht jedoch auf

Felduntersuchungen.

2.3.4.1 Phagozyten

PMN aus abnormaler Milch tragen kein CD14 auf ihrer Zelloberfläche, aber CD18

wird auf allen PMN nachgewiesen. Der Anteil CD11b exprimierender PMN liegt wie

in normaler Milch bei 80 %, die Expressionsdichte ist aber signifikant niedriger

(SOLTYS u. QUINN 1999, RIOLLET et al. 2001).

CD14 wird von 25 %, CD18 von 95 % der großen MNC exprimiert mit einer im

Vergleich zur gesunden Milchdrüse um das dreifache gestiegenen Expressionsdichte

(PAAPE et al. 1996).

In Tab. 4 werden die Ergebnisse einer Studie mit intrazisternaler LPS-Instillation

zusammenfassend für Blut und Milch dargestellt.

Tab. 4: Durchflußzytometrisches Zelldifferentialbild der Phagozyten in Blut und Milch vor und nach einer intrazisternalen LPS-Injektion (PAAPE et al. 1996)

CD14 vor CD14 nach CD 18 vor CD 18 nach

PMN Milch 68 % 0 % 65 – 88% 100 %

PMN Blut 3 % 0 % 93 % 90 %

große MNC Milch

35 % 25 % 55 % 95 %

große MNC Blut 63 % 61 % 95 % 99 %

Literaturübersicht

24

2.3.4.2 Lymphozyten

Durch eine Mastitis nimmt die Dichte der CD4-Moleküle auf der Zelloberfläche zu

und es erhöht sich der Anteil der T-Helferzellen (CD4+) innerhalb der

Lymphozytenpopulation und wird größer als derjenige der CD8+ Zellen. Dieser

Anstieg scheint jedoch je nach Infektionserreger unterschiedlich stark auszufallen.

So wurde beispielsweise beschrieben, daß im Vergleich zu Escherichia (E.) coli und

S. aureus bei durch Streptokokken verursachten Mastitiden ein geringer Anstieg des

Anteils der CD4+ Zellen stattfindet. Für CD8+ Zellen wurde sowohl eine Vergrößerung

als auch eine Verkleinerung dieser Lymphozytensubpopulation beschrieben,

während für die Expressionsdichte keine Veränderung gefunden wurde (LEITNER et

al. 1995, TAYLOR et al. 1997, SOLTYS u. QUINN 1999, RIVAS et al. 2000,

RIOLLET et al. 2001)

Der Anteil der γδ-T-Zellen an den Lymphozyten steigt auf ca. 14 % und scheint

unbeeinflußt von der Erregerspezies zu sein (SOLTYS u. QUINN 1999, RIOLLET et

al. 2000).

2.3.5 Zelldifferentialbild des Blutes

2.3.5.1 Phagozyten

Von den PMN im Blut exprimieren ca. 93 % CD18 und nur ca. 3 % CD14. Durch

LPS-Injektion in die Milchdrüse geht die Expression beider Strukturen um jeweils ca.

3 % zurück (PAAPE et al. 1996).

Im Blut schwankt der Anteil der Monozyten an den mononukleären Zellen im

Laktationsverlauf zwischen 15 % und 31 %, wobei der niedrigste Wert in der frühen

Trockenstehphase erreicht wird. Auf ca. 62 % der großen MNC konnte CD14

nachgewiesen werden. Der Anteil der CD18+ großen MNC stiegt durch LPS-Injektion

in die Milchdrüse von 95 % auf 99 % an (PARK et al. 1992, PAAPE et al. 1996).

Literaturübersicht

25

2.3.5.2 Lymphozyten

Im Blut laktierender Kühe besteht die Lymphozytenpopulation aus 23 % B-Zellen und

45 % T-Zellen (CONCHA et al. 1978). Zur Geburt findet innerhalb der

Lymphozytenpopulation ein signifikanter Anstieg der IgM tragenden B-Lymphozyten

und der MHC II+ Zellpopulationen statt (VAN KAMPEN u. MALLARD 1997), im

anschließenden Laktationsverlauf ändern sich die Anteile von B- und T-Lymphozyten

sowie NK Zellen dagegen kaum (PARK et al. 1992).

Im Blut laktierender Kühe sind 20 % der T-Lymphozyten CD8+. Für die

Lymphozytensubpopulation der T-Helferzellen (CD4+) gibt es unterschiedliche

Angaben: ca. 35 % (VAN KAMPEN et al. 1999) und ca. 67 % (ASAI et al. 2000).

Peripartal nehmen die Anteile der CD4+ und CD8+ an den Lymphozyten sowie die

mittlere Expressionsdichte dieser Oberflächenstrukturen ab und steigen in der

Frühlaktation nur langsam wieder an. Das Verhältnis von CD4/CD8 Lymphozyten,

das immer > 1 beträgt, zeigt ebenfalls eine Abhängigkeit von Laktationsstadium. Es

nimmt vom Laktationsbeginn zum Laktationsende hin ab (PARK et al. 1992, ASAI et

al. 2000). Nur die Größenschwankungen der CD8+ Lymphozytenpopulation scheinen

von Infektionen der Milchdrüse beeinflußt zu sein (VAN KAMPEN u. MALLARD

1997, VAN KAMPEN et al. 1999, RIVAS et al. 2000), wobei nicht in jeder Studie zu

diesem Themenkomplex eine Reaktion der Blutleukozyten auf eine Infektion der

Milchdrüse beobachtet werden konnte (RIOLLET et al. 2001).

Der Anteil der γδ-T-Zellen an der Lymphozytenpopulation im Blut beträgt ca. 3 %,

derjenige der CD8+ γδ-T-Zellen ca. 2 %. Die in ihrer Größe laktationsabhänige

Subpopulation der WC1+ γδ-T-Zellen zeigt ein den αβ-T-Zellen (CD4+ und CD8+)

genau entgegengesetztes Verhalten: ihr Anteil an den Blutlymphozyten ist zur Geburt

am niedrigsten und steigt während der Laktation an (VAN KAMPEN u. MALLARD

1997, VAN KAMPEN et al. 1999, ASAI et al. 2000).

Literaturübersicht

26

2.4 Zelluläre Abwehr der bovinen Milchdrüse

2.4.1 Phagozytose

Als Phagozytose wird das Erkennen und Aufnehmen fremder Partikel durch Zellen

bezeichnet. Phagozytose und anschließendes Abtöten der Bakterien stellen einen

wichtigen Schutzmechanismus des Euters gegen eindringende Mikroorganismen

dar. Ihre Ausprägung zeigt neben tierindividuellen Einflüssen eine Abhängigkeit von

Laktationsstadium und –nummer (VECHT 1985, GUIDRY et al. 1985).

Die Phagozytose wird durch die sogenannte Opsonisierung der Bakterien mit

Antikörpern, v.a. IgG und IgM, oder Komplementfaktoren, v.a. C3b, verbessert. Die

Phagozyten wiederum tragen auf ihrer Zelloberfläche Komplement- sowie Fc-

Rezeptoren für die Antikörper. Es wird jedoch vermutet, daß diese Rezeptoren durch

Milchbestandteile blockiert und dadurch inaktiviert werden. Komplement kommt in

der Milch nur in sehr niedrigen Konzentrationen vor. Die Menge von IgG1, IgG2, IgM

und IgA, die in normaler Milch gering ist, steigt im Rahmen einer Mastitis an. Die

Fähigkeit der Phagozyten in der Milch zu Phagozytose und intrazellulärem Abtöten

von Bakterien ist auch durch die Aufnahme von Fett, Eiweiß und anderen

Milchbestandteilen sowie die in der Milch geringen Konzentrationen von Sauerstoff

und Glucose im Vergleich zum Blut reduziert (JAIN 1976, PAAPE u. WERGIN 1977,

PAAPE et al. 1981, TARGOWSKI 1983, HOLMBERG u. CONCHA 1985, VECHT

1985, CONCHA 1986, BURVENICH et al. 1994, SORDILLO et al. 1997).

2.4.2 Makrophagen

Die Phagozyten in der Milch sind Makrophagen und PMN. Die Makrophagen, die in

normaler Milch die größte Zellfraktion bilden, begegnen als erste Phagozyten den ins

Euter eingedrungenen Bakterien (THOMAS et al. 1994). Sie bauen phagozytierte

Mikroorganismen ab und präsentieren sie auf ihrer Zelloberfläche in MHC II-

Molekülen. Aktivierte Makrophagen setzten zusätzlich verschiedenen Mediatoren

frei, durch die PMN angelockt und stimuliert werden. Durch Antigenpräsentation

Literaturübersicht

27

stimulieren sie auch Lymphozyten, die ebenfalls PMN-anlockende Lymphokine

freisetzen (TARGOWSKI 1983, HOLMBERG u. CONCHA 1985, VECHT 1985,

BURVENICH et al. 1994, SORDILLO et al. 1997).

2.4.3 PMN

2.4.3.1 Lebenszyklus

PMN werden als der wichtigste Schutz vor Mastitiden eingestuft. Neben den im Blut

zirkulierenden PMN gibt es noch Reserven, die marginal der Wand der Blutgefäße

angelagert sind, sowie einen weiteren Pool im Knochenmark. Aus diesen Reserven

wandern sie, angelockt durch Signale, die u.a. von Makrophagen ausgesandt

werden, als Barriere gegen das Eindringen von Mikroorganismen in Körperhöhlen

und Gewebe (JAIN 1976). Die Lebensspanne der PMN, nachdem sie nach einer

Reifungszeit von zehn bis zwölf Tagen das Knochenmark verlassen haben, beträgt

nur wenige Tage. Nach Ablauf dieser Frist werden sie apoptotisch und von

Makrophagen phagozytiert, so daß keine toxischen Substanzen ins Gewebe

gelangen können. Die PMN in der Milch werden gemeinsam mit den anderen Zellen

regelmäßig beim Melken aus dem Euter gespült und in der Blutbahn neu rekrutiert.

Die kontinuierliche Migration der PMN in die Milchdrüse stellt nach Ansicht vieler

Autoren die erste immunologische Barriere gegen eindringende Bakterien dar

(BURVENICH et al. 1994, 1995, PAAPE et al. 2000).

2.4.3.2 Migration

Verschiedene Mediatoren führen zu einer direkten und gerichteten Migration der

PMN zum Entzündungsort. Dies geschieht, indem die PMN dem

Konzentrationsgradienten der Chemoattraktinen wie z.B. C5a, Interleukin (IL) 8 oder

LPS zur höchsten Konzentration folgen, was Chemotaxis genannt wird

(TARGOWSKI 1983, BURVENICH et al. 1995, PAAPE et al. 2000). Andere

Literaturübersicht

28

Mediatoren wie CD11/CD18 lagern sich an die Zellmembran an und führen zu einer

Adhäsion der PMN an die Gefäßwand, bevor sie das Gefäß verlassen und durch die

Tight Junctions ins Gewebe gelangen.

2.4.3.3 Entzündung

Im Fall einer Mastitis gelangen innerhalb von acht bis zehn Stunden mehrere

Millionen Zellen in die Milch, ein erster signifikanter Anstieg des Zellgehaltes ist

sogar schon nach vier Stunden meßbar (JAIN 1976, PAAPE et al. 1976,

BURVENICH et al. 1994, PRIN-MATHIEU et al. 2002). Das Ausmaß der PMN-

Infiltration hängt u.a. von der Erregerspezies ab (CONCHA 1986, LEITNER et al.

1995). Der Erfolg dieser PMN-Rekrutierung steht in direktem Zusammenhang mit der

erfolgreichen Bekämpfung einer Euterinfektion. Die kann dadurch erklärt werden,

daß, wie unter 2.4.1 beschrieben, die Phagozytosefähigkeit der PMN in der Milch

stark eingeschränkt ist und für eine erfolgreiche Abwehr sehr viel PMN notwendig

sind. Dennoch konnten Eigenschaften von vor einer Infektion aus Blut isolierten PMN

mit der Schwere der anschließenden experimentellen Mastitis in Verbindung

gebracht werden (BURVENICH et al. 1994).

In der Milch phagozytieren die PMN die eingedrungenen Erreger und töten sie

intrazellulär ab. Dies kann sauerstoffabhängig durch die Bildung radikaler

Sauerstoffspezies geschehen oder sauerstoffunabhängig durch Säuren, Lactoferrin,

Lysozym oder kationische Proteine. Beide recht unspezifischen Mechanismen stellen

auch eine Gefahr für das umgebende körpereigene Gewebe dar, indem sie zu

dessen Fibrosierung und damit zum Verlust der Funktionalität führen (TARGOWSKI

1983, THOMAS et al. 1994, BURVENICH et al. 1995, SHUSTER et al. 1996,

SORDILLO et al. 1997, PAAPE et al. 2000).

Literaturübersicht

29

2.4.4 Lymphozyten

Die Lymphozyten spielen eine wichtige Rolle bei der Modulation der Immunantwort

und halten das Immunsystem im Gleichgewicht. Ihre Reaktionsfähigkeit scheint in

der Milch jedoch herabgesetzt zu sein. Wie bei den PMN besteht auch die gerichtete

Migration der Lymphozyten, die durch Oberflächenstrukturen, den Homing-

Rezeptoren, gesteuert wird, aus Adhäsion an und Diapedese durch das

Gefäßendothel (PAAPE et al. 2000).

2.4.4.1 T-Lymphozyten

T-Helferzellen (CD4+) werden MHC II-restringiert durch spezifische Antigene

angeregt und sezernieren daraufhin stimulierende sowie hemmende Mediatoren, die

die Chemotaxis, die Migration und die Phagozytose beeinflussen (HOLMBERG u.

CONCHA 1985, CONCHA 1986, SORDILLO et al. 1997, PAAPE et al. 2000).

Die T-Suppressorzellen (CD8+) haben vermutlich immunmodulierende Aufgaben,

indem sie hemmend auf die Immunantwort wirken. Für die CD8+ Zellen aus Milch

konnte eine hemmende Wirkung auf die Proliferation von CD4+ Lymphozyten

nachgewiesen werden (PARK et al. 1993, PAAPE et al. 2000).

Den zytotoxischen T-Zellen wird eine das Epithel schützende Funktion

zugeschrieben, indem sie über MHC I-Vermittlung alte oder beschädigte

sekretorische Zellen beseitigen (TARGOWSKI 1983). Bisher wurde im Euter jedoch

noch keine Aktivität von zytotoxischen T-Zellen beobachtet (BURVENICH et al.

1995).

Die Funktion der γδ-T-Zellen ist noch nicht abschließend geklärt. Es wird vermutet,

daß sie MHC-abhängig und -unabhängig Zytotoxizität und die zytotoxischen T-Zellen

modulieren können. Es ist denkbar, daß sie durch Entfernung geschädigter Zellen

eine Schutzfunktion für das Epithel ausüben (SORDILLO et al. 1997, PAAPE et al.

2000).

Literaturübersicht

30

Die Natural Killer (NK) Zellen sind in ihrer Antigenerkennung nicht an MHC

gebunden, sie tragen jedoch Fc-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche. Mit diesen

Rezeptoren binden sie an mit Antikörpern opsonisierte Zellen/Bakterien und töten sie

ab. Es wird daher vermutet, daß sie an der Beseitigung von Bakterien aus dem Euter

beteiligt sein könnten, was bisher aber noch nicht nachgewiesen werden konnte

(SORDILLO et al. 1997, PAAPE et al. 2000).

2.4.4.2 B-Lymphozyten

B-Lymphozyten können Antigen aufnehmen und in MHC II-Molekülen den T-

Helferzellen präsentieren, die dadurch zur Zytokinausschüttung angeregt werden.

Diese Zytokine führen entweder dazu, daß die B-Lymphozyten sich zu Plasmazellen

entwickeln und Antikörper produzieren oder aber zu Gedächtniszellen werden. Die

Antikörperproduktion konnte auch für Plasmazellen aus der Milch nachgewiesen

werden (CONCHA 1986). Die Antikörper fungieren nicht nur als Opsonine, sondern

sie können auch Toxine neutralisieren (TARGOWSKI 1983, CONCHA 1986,

SORDILLO et al. 1997).

2.5 Folgerung

Die breite Streuung der Zelldifferentialbilder spiegelt wider, daß die mikroskopische

Zelldifferenzierung bei Milchzellen methodisch und in der Aussagekraft an ihre

Grenzen stößt. Der Einsatz spezifischer monoklonaler Antikörper und die

Durchflußzytometrie bieten hier neue und weiterreichende Möglichkeiten. Wie aus

der Literaturübersicht deutlich wird, ist jedoch mit dem bisher veröffentlichten

Datenmaterial ein direkter Vergleich zwischen der mikroskopischen und der

durchflußzytometrischen Zelldifferenzierung, insbesondere ihrer Aussagekraft

hinsichtlich der bovinen Mastitis, nicht möglich. Genau dieser Vergleich ist das Ziel

der vorliegenden Arbeit.

Material und Methoden

31

3. MATERIAL UND METHODEN

3.1 Versuchstiere

Die Versuche wurden mit Kühen des Lehr– und Forschungsguts Ruthe der

Tierärztlichen Hochschule Hannover (Betrieb 1) und des Landwirtes Thomas Meldau

in Adelheidsdorf (Betrieb 2) durchgeführt. Vereinzelt wurden auch Patienten der

Kliniken für Geburtshilfe und Gynäkologie des Rindes und für Rinderkrankheiten

beprobt.

3.1.1 Betrieb 1

Auf dem Lehr- und Forschungsgut Ruthe der Tierärztlichen Hochschule Hannover

wurden ca. 80 Kühe der Rasse Deutsche Holstein Farbrichtung Schwarzbunt mit

einer durchschnittlichen Jahresleistung von 9.500 kg gemolken. Es wurden nur

Proben von dem Teil der Herde gewonnen, der in einem Tiefstreustall mit Freßgitter

aufgestallt ist und in einem Doppel-Vierer Autotandem Melkstand der Firma DeLaval

zweimal täglich von 4.30 – 6.30 Uhr und 14.30 – 16.30 Uhr gemolken wurde. Die

Fütterung der Herde setzte sich zusammen aus der Grundversorgung durch eine

aufgewertete Mischration sowie der leistungsorientierten Kraftfuttergabe am

Automaten; Wasser stand ad libitum zur Verfügung.

3.1.2 Betrieb 2

Auf dem Betrieb des Landwirtes Thomas Meldau wurden ca. 80 Kühe der Rasse

Deutsche Holstein Farbrichtung Schwarzbunt zweimal täglich um 5.30 Uhr und um

17.00 Uhr in einem Doppel-Sechser Fischgrätenmelkstand der Firma Westfalia

gemolken. Die Herde, die in einem Boxenlaufstall mit Spaltenboden, im Sommer mit


32

Weidegang, gehalten wurde, hatte eine durchschnittliche jährliche Milchleistung von

ca. 8.000 kg. Das Grundfutter bestand aus Grassilage und wurde mit Kalk und

Mineralfutter ergänzt. Ein Kraftfutterautomat stand für die Leistungsfütterung zur

Verfügung, Wasser war ad libitum für die Tiere zugänglich.

3.1.3 Versuchsreihen

3.1.3.1 Versuch 1: Orientierende Untersuchung auf der Basis einer

randomisierten Tierauswahl

Für den Versuch 1 wurden Milchproben von 21 Kühen gewonnen, darunter 1 Tier mit

nur drei funktionellen Drüsenkomplexen (Dreistrich). Die Auswahl der Versuchstiere

wurde spontan vom Probenehmer vorgenommen ohne Berücksichtigung von

Laktationsnummer oder –stadium und ohne Vorkenntnis über die Eutergesundheit.

3.1.3.2 Versuch 2: Methodische Fragestellungen

Die Selektion der Kühe für diesen Versuch basierte auf den Daten zur Zellzahl aus

den monatlich durchgeführten Milchleistungsprüfungen des Landeskontrollverbandes

Niedersachsen–Bremen e.V. für die Betriebe Ruthe und Meldau. Es wurde darauf

geachtet, daß sowohl Färsen als auch Kühe mit höherer Laktationszahl vertreten

waren. Auf Ebene der Eutergesundheit war es das Ziel, Proben von auf allen Vierteln

eutergesunden Tieren (SCC < 30.000 Zellen / ml), von mittelgradig (mgr.) erkrankten

(SCC 100.000 – 400.000 Zellen / ml Milch) bis hin zu hochgradig (hgr.) erkrankten

(SCC > 400.000 Zellen / ml Milch) Drüsenkomplexen zu erhalten.

Um Aussagen über die Wiederholbarkeit der untersuchten Parameter zu erhalten,

wurden insgesamt 10 Tiere an drei aufeinanderfolgenden Tagen sowie ein viertes

Mal mit einer Woche Abstand beprobt.


33

3.1.3.3 Versuch 3: Untersuchungen zum Zelldifferentialbild auf der Basis einer

selektierten Tierauswahl

Im Rahmen von Versuch 3 wurden Blut- und Milchproben von 37 Kühen gewonnen,

darunter 4 Dreistriche. Die Versuchstiere in Ruthe wurden anhand von

Viertelgemelksuntersuchungen, die im dreiwöchigen Abstand durchgeführt wurden,

gezielt nach ihrer Eutergesundheit ausgewählt. Im Betrieb Meldau wurde über 3

Wochen in einer Anamnesephase die Eutergesundheit potentieller Versuchstiere

erhoben, um anhand dieser Daten die Kühe für den Versuch zu selektieren. Die

Kriterien entsprachen den in 3.1.3.2 aufgeführten. Die eutergesunden Tieren waren

von der Abkalbung bis zur Beprobung nicht an einer klinischen oder subklinischen

Mastitis erkrankt und zum Beprobungszeitpunkt tragend. Auch die mgr. euterkranken

Tiere waren tragend, im Fall der hgr. Erkrankungen rückte dieses Kriterium dagegen

in den Hintergrund. Allgemeinerkrankungen wurden durch eine adspektorische

Allgemeinuntersuchung sowie die Erhebung des unter 3.5.1.1 aufgeführten

Blutbildes ausgeschlossen.

3.2 Geräte

Aqua dest. Aufbereitungsanlage GFL-Wasserdestillierapparat (Metall),

Gesellschaft für Labortechnik, Hannover

Aqua tridest. Aufbereitungsanlage Quarzdestillierapparat Destamet,

Heraeus, Hanau

Autoklav Varioklav Dampfsterilisator, H + P

Labortechnik GmbH, Oberschleißheim

Blutanalysegerät Hematology Analyzer, Modell MEK –

6108G für Veterinärmedizin NIHON

KOHDEN, Bad Homburg


34

Eismaschine Typ UBE 30-10 Ziegra, Isernhagen

Elektrische Pipettierhilfe pipetus® - akku, Hirschmann®

Laborgeräte, Eberstadt

Elektrische Zählhilfe Assistent Counter AC – 8

Karl Hecht Assistent GmbH, Altnau TG,

Schweiz

Fluoreszenz-Durchflußzytometer, Becton Dickinson, Heidelberg Modell FACSCalibur® , mit angeschlossener Computereinheit

Heißluftsterilisator Rubarth Apparate GmbH, Hannover

Kühlzentrifuge Omnifuge 2.ORS Heraeus, Hanau

Kühlzentrifuge Sigma 4K-1 Sigma, Osterode

Laborwaage L310 Sartorius GmbH, Göttingen

Leitfähigkeitsmeßgerät Mastitron®, Milku, Uelzen

Lichtmikroskop Zeiss Axiolab, Zeiss, Oberkochen

Multipette® plus Eppendorf, Hamburg

Pipetten, einstellbar von Eppendorf Research, Eppendorf, Hamburg

100 -1000 µl, 20-200 µl,

0,5 -10 µl

Pipetten, Fixvolumen 50µl, 10 µl Eppendorf Research, Eppendorf, Hamburg

Schüttler MS Minishaker IKA®, Landgraf

Laborgeräte OHG, Langenhagen;

Heidolph Reax top, Landgraf

Laborgeräte OHG, Langenhagen


35

Staukette nach Hauptner Eikemeyer, Tuttlingen

Zentrifuge für Deckgläschen Eigenbau der ZA Hygiene und

(„Kaffeemühle“) Technologie der Milch auf Basis einer

Krups Kaffeemühle, Hannover

3.3 Material

3.3.1 Verbrauchsmaterialien

Auslaufpipetten 10 ml Sarstedt (86.1254), Nümbrecht

Babyflaschen 250 ml aus Glas Fa. Eggers, Ronnenberg

Combitips plus 2,5 ml Eppendorf (0030069.242), Hamburg

Deckgläschen 18 x 18 mm IDL (190001818), Nidderau

Einmalösen 10 µl Landgraf Laborgeräte OHG (1000 158),

Langenhagen

Glasflaschen 1 L, Duran Omnilab (9.072010), Bremen

mit Schraubverschluß

Kanülen 38 mm, 20 G 1 ½’’, steril Becton Dickinson (360215), Heidelberg

Nylonsiebgewebe, w 50 µm HLL (610050), Landgraf Laborsysteme

GmbH, Langenhagen

Objektträger 76 x 26 mm IDL (190000004), Nidderau

Reagenzglas Duran 10 ml Landgraf Laborgeräte OHG, Langenhagen

Röhrchen, 15 ml und 50 ml Sarstedt (62.554.502 und 62.547.254),

Nümbrecht


36

Röhrchen, 13 ml Sarstedt (55.468), Nümbrecht

Röhrchen für die Becton Dickinson (35 2008), Heidelberg

Durchflußzytometrie, 5 ml

(FACS-Röhrchen)

Rundboden-Mikrotiterplatten, Nunc (163320), Wiesbaden

96 Vertiefungen, steril

Safe–Lock-Tubes 1,5 ml Eppendorf (0030120.086), Hamburg

(Eppendorf Reaktionsgefäße)

Standardtips, gelb und blau Eppendorf (0030003.004 und

0030015.002), Hamburg

Sterilfilter, 0,22 µm Porenweite Renner (06001), Darmstadt

Transferpipetten 3,5ml Sarstedt (86.1171.010), Nümbrecht

Vacutainer Adapters Becton Dickinson (364887), Heidelberg

Vacutainerröhrchen, 7 ml, Becton Dickinson (367655), Heidelberg

mit 0,084 ml 0,34 M EDTA


ohne Zusatz


mit Na - Fluoridzusatz

Weithalsflaschen 250 ml Omnilab (9.073014), Hannover

aus Polyethylen mit

Schraubverschluß


37

3.3.2 Reagenzien

Acridinorange (C.I. 46005) Merck Eurolab GmbH (1.15931.0025),

Darmstadt

Albumin, bovin, Fraktion V, Roth (80762), Karlsruhe

98% pulverisiert

(BSA, bovines Serumalbumin)

Bronopol Merck Eurolab GmbH (8.17017.0250),

Darmstadt

Einbettmittel Corbit®, I. Hecht, Kiel - Hassesee

Ethanol 94 % Vol, denaturiert CG Chemikalien, Laatzen

(Brennspiritus)

Färbesystem Hemacolor Merck Eurolab GmbH, Darmstadt

Fixierlösung Nr. 1.11955.2500

Farbreagenz rot Nr. 1.11956.2500

Farbreagenz blau Nr. 1.11957.2500

NaCl Trockenpulver Oxoid GmbH (L 5), Wesel

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung Sigma Aldrich Chemie GmbH (1000 – 3),

(PBS), pH 7,4 ohne Ca ++/Mg ++ Steimheim und Biochrom (L18210), Berlin

Propidiumiodid (PI) Sigma Aldrich Chemie GmbH (28.707 – 5),

Steimheim

Toluidinblau (C.I. 52040) Merck Eurolab GmbH (1.15930.0025),

Darmstadt

TO–PRO–3–Iodide Molekular Probes (T – 3605), Leyden,

Niederlande


38

3.3.3 Antikörper und Nachweisreagenzien

3.3.3.1 Antikörper für den Einsatz in der Membranimmunfluoreszenz

3.3.3.1.1 Monoklonale Primärantikörper

Tab. 5 gibt eine Übersicht über die in der Membranimmunfluoreszenz eingesetzten

primären monoklonalen Antikörper (mAk), sowie deren Isotypen und Spezifitäten.

Verdünnungen der verwendeten primären Antikörper wurden mit MIF-Puffer (siehe

3.3.4.1.2) hergestellt.

Der mAk Bo116 ist spezifisch für polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN),

das von ihm erkannte Antigen ist bisher jedoch noch nicht charakterisiert (RÖNSCH

1992). Der mAk Bo139 ist spezifisch für BoLA-DR-Produkte (LANGE 1995), d.h. für

bovine MHC Klasse II Moleküle.

Die Hybridome, welche die murinen mAk Bo116 (IgM) und Bo139 (IgG3)

produzieren, wurden in der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen

Hochschule Hannover nach der Immunisierung von Mäusen mit bovinen

lymphoblastoiden Zellen des Rindes (nach Transformation mit Theileria annulata)

hergestellt (REBESKI 1990, VON DER OSTEN 1990, RÖNSCH 1992).


39

Tab. 5: Verwendete monoklonale Antikörper zur Charakterisierung von zellulären Oberflächenstrukturen in der Membranimmunfluoreszenz

mAk Donor/Isotyp Verdünnung Eingesetztes

Volumen Spezifität Versuch

Bo 1391) Maus IgG3 unverdünnt 20 µl Bovine MHC II (BoLA–DR) 3

Bo 1161) Maus IgM unverdünnt 20 µl Neutrophile

Granulozyten* 3

CC8 (FITC)2)

[CD4-S] Maus IgG2a 1:20 10 µl Bovines CD4 1,2,3

3w–086 CACT83A1)

[CD4-I] Maus IgM 1:5 20 µl Bovines CD4 2

CC58 (RPE)

2) Maus IgG1 1:2 10 µl

Bovines CD8b

1,3

TuK4 (RPE-Cy5)2)

Maus IgG2a 1:14 10 µl

Humanes CD14,

Kreuzrkt. u.a. mit Rind

3

CC1012) Maus IgG2a 1:2 10 µl Bovine WC 1 1,2

GB21A3) Maus IgG2b 1:20 10 µl Boviner

TcR1-N24 2,3

* Das erkannte Molekül auf der Zelloberfläche ist noch nicht charakterisiert

1) Arbeitsgruppe Immunologie, Tierärztliche Hochschule Hannover

2) Firma Serotec, Co., Großbritannien

3) Firma vmrd, Inc., Pullman, WA, USA


40

3.3.3.1.2 Sekundärantikörper

F(ab’)2 Kaninchen gegen Maus IgG, Kreuzreaktion mit IgM: Fluoresceinisothiocyanat

(FITC)-konjugiert

Firma Serotec, Co. (STAR9B), Großbritannien

3.3.4 Kulturmedien, Puffer und Lösungen

Alle Puffer und Lösungen wurden, wenn nicht anders angegeben, in Aqua tridest.

angesetzt.

3.3.4.1 Lösungen für die Zellanalytik

3.3.4.1.1 Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)

Hierzu wurde die PBS-Trockensubstanz (s. 2.3.2) in Aqua tridest. gelöst. Der Puffer

hatte einen pH-Wert von 7,4. Die Konzentrationen der Bestandteile waren:

NaCl 137,0 µmol/ml Na2HPO4 8,1 µmol/ml

KCl 2,7 µmol/ml KH2PO4 1,12 µmol/ml

Für die doppelt konzentrierte Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (2 x PBS) wurde

doppelt soviel Trockensubstanz pro Volumen Aqua tridest. eingesetzt.

3.3.4.1.2 Wasch- und Verdünnungspuffer für die Membranimmunfluoreszenz

(MIF-Puffer)

BSA 2,5 g und NaN3 0,05 g

gelöst in 500 ml PBS, aufbewahrt bei 4°C


41

3.3.4.2 Lösungen für die Durchflußzytometrie

3.3.4.2.1 Trägerflüssigkeit (Sheath fluid)

Als Trägerflüssigkeit für das Durchflußzytometer wurde sterilfiltriertes (0,2 µm) PBS

mit 0,1 mg/ml NaN3 (Natriumazid) verwendet.

3.3.4.2.2 Propidiumiodidlösung

1 mg/ml Propidiumiodid gelöst in PBS wurde als Stammlösung in aliquoten Teilen bei

–28°C gelagert.

Zum Anfärben toter Zellen wurde die Stammlösung 1:5 verdünnt (Gebrauchslösung).

Der Probe wurden 30 µl Propidiumiodidgebrauchslösung pro ml zugesetzt

(Endkonzentration 6 µg/ml).

3.3.4.2.3 To-Pro-3-Lösung

To-Pro-3 wurde in der Konzentration 1 mmol/ml gelöst in DMSO tiefgefroren

geliefert. Diese Stammlösung wurde 1:1000 mit MIF-Puffer verdünnt und die

Gebrauchslösung in aliquoten Teilen bei –28°C gelagert. Der Probe wurden 20 µl

Gebrauchslösung, die erst kurz zuvor aufgetaut worden war, zugesetzt

(Endkonzentration 0,1 µmol/ml).

3.3.4.2.4 Acridinorange-Lösung

Acridinorange 200 mg

NaCl 425 mg

gelöst in 500 ml Aqua monodest. (Stammlösung: 0,4 %)


42

Durch Verdünnung mit PBS um den Faktor 1000 wurde die Gebrauchslösung

(0,0004 %) hergestellt. Beide Lösungen wurden lichtgeschützt bei 4°C gelagert.

3.3.4.3 Färbelösungen für die Mikroskopie

3.3.4.3.1 Hemacolor

Das System Hemacolor besteht aus gebrauchsfertigen Lösungen, die unverändert

eingesetzt wurden.

3.3.4.3.2 Toluidinblaulösung

Toluidinblau 2 mg/ml gelöst in Aqua monodest.

3.3.4.4 Fixationslösung für Rohmilch

Bronopol 10 mg/ml gelöst in Aqua tridest, aufbewahrt bei 4°C

Zur Fixation von 10 ml Milch wurden 60 µl der Bronopollösung benötigt

(Endkonzentration 1% Bronopol).

3.4 Probenahme

3.4.1 Blut

Die Entnahme und Untersuchung von Blutproben wurden nur in Versuch 3

durchgeführt.

Aus der mit einer Staukette angestauten Vena jugularis wurden nach Desinfektion

der Punktionsstelle mit 70 %-igem Ethylalkohol ca. 30 ml gerinnungsgehemmtes


43

(EDTA) Vollblut und 10 ml Blut zur Gewinnung des Blutserums entnommen.

Aufgrund von unterschiedlichen Betriebsabläufen wurde im Betrieb 1 das Blut nach

dem Melken, im Betrieb 2 vor dem Melken gewonnen.

Die Blutproben wurden während des Transports und bis zur weiteren Verarbeitung

im Labor bei 4°C gekühlt.

3.4.2 Milch

Es wurde jedes funktionelle Euterviertel der Versuchstiere während der

Morgenmelkzeit beprobt. Die Milchproben wurden durch Handmelken gewonnen und

umgehend ins Labor gebracht, wo sie bis zum Beginn der Zellisolation bei 4°C

gelagert wurden. Im Sommer erfolgte der Transport der Proben mit Kühlelementen in

einer Kühlbox. Die Entnahme von Vorgemelk und Viertelanfangsgemelk wurde in

jedem Versuch auf die gleiche Weise durchgeführt, die Entnahme der

Viertelhandgemelke dagegen wurde in den einzelnen Versuchen modifiziert.

3.4.2.1 Vorgemelk

Die ersten ca. 5 ml wurden aus dem nicht gereinigten und unstimulierten Euterviertel

in die Messkammer des Gerätes Mastitron® gemolken und nach der Messung der

elektrischen Leitfähigkeit (LF) unschädlich entsorgt.

3.4.2.2 Viertelanfangsgemelk (VAG)

Nach trockener Reinigung des Euters und der Zitzen mit Haushaltspapier folgte eine

gründliche Desinfektion besonders der Zitzenkuppe mit Haushaltspapier, das mit

70%-igem Ethylalkohol getränkt war. Anschließend wurden 10 ml Milch (VAG) in ein

steriles Glasröhrchen gemolken.


44

3.4.2.3 Viertelhandgemelk (VGH)

Nach Gewinnung des VAG wurden je nach Versuch 250 oder 500 ml Milch (VGH) je

Euterviertel in ein Probenahmegefäß mit Schraubverschluß gemolken.

3.4.2.3.1 Versuch 1: Orientierende Untersuchung auf der Basis einer


Ermelken von 250 ml aus jeder funktionellen Zitze in eine Weithalsflasche aus

Polyethylen mit Schraubverschluß.

3.4.2.3.2 Versuch 2: Methodische Fragestellungen

Ermelken von 500 ml aus jeder funktionellen Zitze in eine Duran Glasflasche mit

Schraubverschluß.

Nach Durchmischung Umfüllen der Probe in eine Weithalsflasche aus Polyethylen

mit Schraubverschluß und eine sterile Babyflasche aus Glas sofort nach der

Probenahme.

3.4.2.3.3 Versuch 3: Untersuchungen zum Zelldifferentialbild auf der Basis einer


Ermelken von 500 ml aus jeder funktionellen Zitze in je zwei sterile Babyflaschen aus

Glas.


45

3.5 Probenanalyse

3.5.1 Blut

3.5.1.1 Klinische Labordiagnostik

Um den allgemeinen Gesundheitszustand der Versuchstiere beurteilen zu können,

wurden im klinischen Labor der Klinik für Rinderkrankheiten der Tierärztlichen

Hochschule Hannover die in Tab. 6 dargestellten Parameter untersucht.

Tab. 6: Klinische Laborparameter zur Beurteilung der Allgemeingesundheit

Parameter Einheit Parameter Einheit

Leukozyten / µl Eosinophile %

Erythrozyten x106 / µl Segmentkernige %

Hämoglobin g / dl Lymphozyten %

Hämatokrit % Monozyten %

MCV1) µg3 Glucose mmol / l

MCH2) pg Freie Fettsäuren µmol / l

MCHC3) g / dl ß - Hydroxybutyrat mmol / l

Plättchen / µl Harnstoff mmol / l

1) MCV = Mean corpuscular volume (mittleres korpuskuläres Volumen)

2) MCH = Mean corpuscular hemoglobin (mittlerer korpuskulärer Hämoglobingehalt)

3) MCHC = Mean corpuscular hemoglobin concentration (mittlere korpuskuläre Hämoglobinkonzentration)


46

3.5.1.2 Leukozytenseparation

10 ml Vollblut (EDTA) wurden in ein 50–ml–Röhrchen gegeben und für 15 min bei

1000 xg und 4°C ohne Bremse zentrifugiert. Das Plasma (obere Phase) wurde bis

knapp über dem Buffy Coat abgesaugt und bis auf 1 ml verworfen. Dieser 1 ml wurde

für die spätere Anfertigung der Milchzellausstriche (siehe 3.5.2.5) in einem

Eppendorf Reaktionsgefäß (ER) kühl gelagert. Anschließend wurden die pelletierten

Zellen durch Rütteln vom Röhrchenboden gelöst und die Erythrozyten durch

hypotone Lyse entfernt. Dazu wurden 20 ml Aqua tridest. zu den Zellen gegeben und

das Röhrchen für 20 sec sanft geschwenkt. Durch Zugabe von 20 ml doppelt

konzentriertem PBS wurde die Isotonie wieder hergestellt. Es folgte eine

Zentrifugation für 10 min bei 1000 xg und 4°C mit Bremse. Nach Dekantieren des

Überstandes und Aufrütteln des Zellpellets wurde die Lyse mit je 10 ml Aqua tridest.

und doppelt konzentriertem PBS wiederholt. Abschließend wurden 10 ml PBS zu den

Zellen pipettiert und diese für 5 min bei 1000 xg und 4°C zentrifugiert. Das nach

Abgießen des Überstandes gewonnene Zellpellet wurde aufgerüttelt, in 500 µl PBS

resuspendiert und in ein ER überführt. Das Röhrchen wurde mit weiteren 500 µl PBS

nachgespült. Die so gewonnene Zellsuspension Blut (ZSB) wurde bis zur weiteren

Untersuchung auf Eis gelagert.

3.5.1.3 Bestimmung und Einstellung der Zellkonzentration in der Zellsuspension

50 µl Zellsuspension wurden in einem ER 1 : 2 mit PBS verdünnt. Nach gründlichem

Schwenken des ER saugte das Gerät Hematology Analyzer 50 µl an, verdünnte sie

mit isotonischer Lösung und zählte die Zellen nach dem Prinzip einer

Impedanzmessung mit Hilfe von Kapillaren. Das Gerät gab die Zellkonzentration

unter der Bezeichnung WBC in 103 Zellen pro µl an, was 106 Zellen pro ml entspricht.

Da die Zellsuspension zuvor 1 : 2 verdünnt wurde, mußte das vom Gerät

ausgegebene Ergebnis verdoppelt werden, um die wahre Zellkonzentration zu

erhalten. Sie war Ausgangswert für die Verdünnung der Zellsuspension mit PBS auf

die Arbeitskonzentration von ca. 4 x 106 Zellen pro ml.


47

3.5.2 Milch

Abb. 1 gibt eine Übersicht über die mit Milch durchgeführten Untersuchungen.

Abb. 1: Untersuchungsschritte für VAG und VGH

3.5.2.1 Mastitisdiagnostik

3.5.2.1.1 Mikrobiologische Untersuchung

Die mikrobiologische Untersuchung wurde aus dem VAG durchgeführt. Nach

Durchmischung der Probe wurden mit einer Einmalöse 10 µl Milch auf einer halben

Blutagarplatte mit Äskulinzusatz ausgestrichen. Die Platten wurden nach 24 und 48

Stunden beurteilt. Wenn es für die Differenzierung nötig war, wurden Subkulturen

einzelner Bakterienkolonien angelegt.

Die erste Einordnung der Erreger erfolgte aufgrund von Koloniemorphologie,

Wachstumsgeschwindigkeit, Hämolyseeigenschaften und Äskulinspaltung. Zur

weiteren Ausdifferenzierung wurden dann Nativpräparate, Gramfärbung, der

VAG

Mikrobiologie NAGase SCC

VGH

SCC NAGase KSA Zellseparation

ZSM

Kaffeemühle Zellvitalität MIF


48

Nachweis von Gruppenantigenen sowie biochemische und enzymatische Reaktionen

herangezogen.

3.5.2.1.2 Messung der NAGase - Aktivität

Für die fluoreszenzspektroskopische Messung der Aktivität des Enzyms N-Acetyl-ß-

D-glucosaminidase (NAGase) nach dem von KITCHEN et al. (1978), LINKO-

LÖPPÖNEN u. MÄKINEN (1985) und NOGAI et al. (1996) etablierten

Mikrotiterplatten-Verfahren wurde je 1 ml des VAG und des VGH in einem ER bei

-20°C eingefroren. Das Enzym NAGase hydrolysiert das nichtfluoreszierende

Substrat 4-Methyl-umbelliferyl-N-acetyl-ß-D-glucosaminidin (4-MeUNAG) in N-

Acetylglucosamin (GlcNAc) und in die fluoreszierende Substanz 4-Methyl-

umbelliferon (4-MeU), die dann als Meßgröße in einem Fluorometer detektiert wird.

Die Enzymaktivität wurde in nmol × min-1 × ml-1 angegeben und für die statistischen

Berechnungen logarithmisch transformiert.

3.5.2.1.3 Bestimmung des Zellgehaltes im VAG

Nachdem die Proben für die mikrobiologische Untersuchung und die Messung der

NAGase – Aktivität entnommen wurden, wurde das VAG mit 60 µl Bronopollösung

(10 %) fixiert und bei 4°C gekühlt. Die Anzahl somatischer Zellen (Somatic Cell

Count = SCC) im VAG wurde nach fluoreszenzoptischem Prinzip mit dem Gerät

Fossomatic ® , Firma Foss Elektrik, Dänemark, im Zentrum für Tiergesundheit, Milch

und Lebensmittelanalytik des Ahlemer Instituts der Landwirtschaftskammer

Hannover bestimmt.


49

3.5.2.1.4 Bestimmung des Zellgehaltes im VGH

Der Zellgehalt des VGH wurde indirekt mit dem institutseigenen Durchflußzytometer

bestimmt. Dazu wurden 10 µl Milch mit 990 µl Akridinorange (AO) -lösung (0,0004 %)

1:100 verdünnt. AO interkaliert sowohl mit RNS als auch mit DNS, so daß mit diesem

Farbstoff somatische Zellen gefärbt werden können. Nach Anregung mit Laserlicht

mit einer Wellenlänge von λ = 488 nm emittiert AO Fluoreszenzlicht, das sowohl im

ersten als auch im zweiten Detektor des Durchflußzytometers gemessen werden

kann (siehe 3.5.3.1). Anhand dieser Fluoreszenz konnte mit dem Durchflußzytometer

zwischen somatischen Zellen und Fettmizellen, die ebenfalls korpuskulär sind,

unterschieden werden. Im Durchflußzytometer wurden dann über genau 10 Minuten

die Zahl der korpuskulären Teilchen gemessen, die innerhalb eines definierten

Intensitätsbereiches Licht im Bereich des ersten Detektors emittierten.

3.5.2.2 Kieler Sedimentausstrich

10 ml VGH wurden in ein Röhrchen (13 ml) pipettiert und für 10 min bei 1400 xg und

10°C mit Bremse zentrifugiert. Im Anschluß wurde der Fettpfropf in der

Bunsenbrennerflamme erwärmt und zusammen mit dem Überstand verworfen. Die

Röhrchen wurden einige Minuten mit der Öffnung nach unten in einen Ständer

gestellt, damit der Überstand möglichst vollständig auslaufen konnte. Als nächstes

wurde ein Tropfen sterile physiologische Kochsalzlösung zum Sediment gegeben,

das mit einer ausgeglühten Öse resuspendiert wurde. Dann wurden 2 – 4 Ösen einer

Probe auf einer Fläche von ca. 2 cm2 auf einem Objektträger ausgestrichen. Nach

Lufttrocknung wurden die Ausstriche in Toluidinblaulösung für wenige Sekunden

gefärbt und die überschüssige Farbe vorsichtig unter einem weichen Wasserstrahl

abgespült, wonach der Ausstrich wieder an der Luft trocknete. Die mikroskopische

Zelldifferenzierung erfolgte unter Ölimmersion bei 1000facher Vergrößerung und mit

einer Zählhilfe. Wurden nach 20 min nicht mindestens 20 differenzierbare Zellen

gefunden, so wurde die Auswertung abgebrochen und der Ausstrich von der

späteren Datenanalyse ausgeschlossen.


50

3.5.2.3 Separation der somatischen Milchzellen

3.5.2.3.1 Versuch 1: Orientierende Untersuchung auf der Basis einer


Die Milchzellen wurden aus dem VGH (200 ml) separiert. Dazu wurde jede Probe

1 : 2 mit PBS (4°C) verdünnt, auf 8 Röhrchen (Volumen 50 ml) aufgeteilt und für 15

Minuten bei 1000 xg und 4°C zentrifugiert. Die Zentrifuge wurde für diese erste

Zentrifugation so eingestellt, daß sie am Ende frei auslaufen konnte. Das sich oben

absetzende Fett wurde mit einem Metallspatel vom Rand gelöst und verworfen. Der

Überstand wurde abgegossen, die Röhrchen für einige Minuten auf den Kopf gestellt

und anschließend das restliche Fett am Rand mit einem saugfähigen Papier entfernt.

Nach Zugabe von 1 ml kaltem PBS wurde das Sediment mit einer Pipette durch

mehrmaliges Aufziehen und Ablassen resuspendiert und in eines der Röhrchen, die

zu einer Probe gehören, überführt. Die Röhrchen wurden nachgespült, indem

nochmals 1 ml kaltes PBS mehrmals aufgezogen und wieder abgelassen und am

Ende in das „Sammelröhrchen“ pipettiert wurde. Nachdem das Röhrchen mit kaltem

PBS auf 50 ml aufgefüllt worden war, wurde es für 15 min bei 400 xg und 4°C mit

Bremse zentrifugiert. Wie zuvor wurde der Überstand abgegossen und das Sediment

in PBS resuspendiert. Anschließend wurde es in ein kleineres Röhrchen (15 ml)

überführt, wobei erneut das große Röhrchen nachgespült wurde. Das kleine

Röhrchen wurde mit PBS auf 10 ml aufgefüllt und für 15 min bei 300 xg und 4°C mit

Bremse zentrifugiert. Es folgte nochmals das Abgießen des Überstandes und das

Resuspendieren des Sedimentes, die abschließende Zentrifugation fand bei 200 xg

statt. Nach Dekantieren des Überstandes wurde das Sediment nun in 250 µl PBS

resuspendiert und in ein Eppendorfreaktionsgefäß (ER) überführt, wobei das kleine

Röhrchen mit weiteren 250 µl PBS nachgespült wurde. Die so erhaltene

Zellsuspension Milch (ZSM) wurde bis zur weiteren Analyse auf Eis gelagert.


51

3.5.2.3.2 Versuch 2: Methodische Fragestellungen

Die Zellseparation wurde grundsätzlich so wie unter 3.5.2.3.1 beschrieben

durchgeführt. Das 1 : 2 mit PBS (4°C) verdünnte VGH (250 ml) wurde nun jedoch in

einem Zentrifugenbecher zentrifugiert. Die einzelnen Zentrifugationen erfolgten unter

den gleichen Bedingungen wie zuvor. Nach der ersten Zentrifugation wurden das

Sediment einer Probe in ein Röhrchen (50 ml) überführt, wobei der

Zentrifugenbecher wie beschrieben nachgespült wurde. Das Resuspendieren und

Überführen wurde hier mit einer Transferpipette durchgeführt. Nach der zweiten

Zentrifugation wurde die Probe in ein kleines Röhrchen (15 ml) pipettiert (siehe

3.5.2.3.1). Die dritte und vierte Zentrifugation sowie die Überführung der Probe in ein

ER erfolgten wie in Versuch 1.

3.5.2.3.3 Versuch 3: Untersuchungen zum Zelldifferentialbild auf der Basis einer


Es wurde genauso verfahren wie in Versuch 2 (siehe 3.5.2.3.2). Da das

Probenvolumen in Versuch 3 500 ml betrug, wurden je Probe zwei Zentrifugenbecher

angesetzt und die Probe nach der ersten Zentrifugation in einem Röhrchen (50 ml)

zusammengeführt.

3.5.2.4 Bestimmung und Einstellung der Zellkonzentration in der Zellsuspension

Die Zellkonzentration in der ZSM wurde genauso bestimmt wie in der ZSB (siehe

3.5.1.3). Wurde die erwünschte Arbeitskonzentration von ca. 4x106 Zellen / ml

überschritten, so wurde die ZSM ebenfalls mit PBS entsprechend verdünnt.


52

3.5.2.5 Ausstriche der ZSM („Kaffeemühle“)

40 µl der unverdünnten ZSM wurden mittig auf ein Deckgläschen pipettiert, auf dem

kurz zuvor Blutplasma (siehe 3.5.1.2) aufgetragen wurde. Dieses Deckgläschen

wurde für ca. 5 sec und mit bis zu ca. 200 xg in der Zentrifuge für Deckgläschen

„Kaffeemühle“ zentrifugiert und anschließend mit Corbit® so auf einen Objektträger

aufgeklebt, daß die Zellen oben lagen. Nach der Lufttrocknung wurden die

Ausstriche mit dem Schnellfärbesystem Hemacolor® gefärbt. Dazu wurden die

Objektträger für jeweils 10 sec ins Methanol – Fixierbad, in die rote und in die blaue

Färbelösung getaucht. Abschließend wurde die überschüssige Farbe vorsichtig unter

einem weichen Wasserstrahl abgespült. Nach erneuter Lufttrocknung wurden die

Ausstriche im Mikroskop mit Ölimmersion bei 1000facher Vergrößerung und mit einer

Zählhilfe differenziert. Wie beim Kieler Sedimentausstrich (siehe 3.5.2.2) wurde die

Differenzierung abgebrochen, wenn nach 20 min nicht mindestens 20 Zellen

registriert wurden. In diesem Fall wurde der Ausstrich von der weiteren Analyse der

Daten ausgeschlossen. Dieses Ausstrichverfahren wird im weiteren Text als

„Kaffeemühle“ bezeichnet.

3.5.3 Durchflußzytometrische Analysen

3.5.3.1 Durchflußzytometrie

Die Durchflußzytometrie basiert darauf, daß in Suspension befindliche Partikel

(Zellen) durch besondere Führung in einer Trägerflüssigkeit vereinzelt werden, so

daß sie nacheinander einen bzw. zwei Laserstrahlen passieren. Dabei streuen die

Zellen das einfallende Laserlicht ohne Veränderung von dessen Wellenlänge zum

einen in Verlängerung des Strahls (Vorwärtsstreulicht, Forward Scatter, FSC) und

zum anderen im rechten Winkel dazu (Seitwärtsstreulicht, Side Scatter, SSC).

Dieses Streulicht wird von zwei Detektoren aufgefangen, in ein elektronisches Signal

umgewandelt und an die angeschlossene Computereinheit weiter geleitet. Das

Ausmaß des FSC spiegelt die Größe des Partikels wieder und ist von seinem


53

Refraktionsindex abhängig, während das SSC von der Komplexität, die sich aus

Oberflächenbeschaffenheit und Granularität der Zelle zusammensetzt, beeinflußt

wird.

Das für die Untersuchungen eingesetzte Durchflußzytometer FACSCalibur (Becton

Dickinson, Heidelberg) verfügt über zwei Laser. Der Argonlaser erzeugt Licht der

Wellenlänge 488 nm, der ihm zeitlich nachgeschaltete Diodenlaser Licht der

Wellenlänge 635 nm. Dem Argonlaser sind zusätzlich zu den Streulichtdetektoren

drei Fluoreszenzdetektoren zugeordnet. Der Detektor „FL1“ nimmt Licht im

Wellenlängenbereich von 500 – 560 nm (Grünfluoreszenz) auf, der Detektor „FL2“

arbeitet bei 543 – 627 nm (Orangefluoreszenz) und „FL3“ registriert Licht im Bereich

von ≥ 650 nm (Rotfluoreszenz). Dem Diodenlaser ist der Detektor „FL4“ zugeordnet,

der Ereignisse erfaßt, die Licht im Bereich von 645 – 676 nm emittieren und die in

definiertem zeitlichen Abstand nach der Passage des Argonlasers auftreten. So

können pro Partikel, das die beiden Laser passiert, bis zu 6 Parameter (FSC, SSC,

FL1 – FL4) erfaßt werden. Sie bilden mit einer bestimmten Geräteeinstellung in

Abhängigkeit von den optischen Eigenschaften dieses Partikels ein Datenmuster,

das ihn als Meßereignis definiert. Die Einstellung des Gerätes, die Kontrolle der

Messung, das Abspeichern der Meßdaten und ihre Auswertung erfolgen über die

angeschlossene Computereinheit mit dem Programm CellQuestPro der Firma

Becton Dickinson, Heidelberg (ORMEROD 2000).

Das Programm CellQuestPro ermöglicht u.a. die Darstellung eines einzelnen

Parameters gegen die Zahl der gemessenen Ereignisse (Histogramm) oder die

Darstellung zweier Parameter gegeneinander in einem Koordinatensystem

(Punktdiagramm, Dot Plot). Die Lage der Ereignisse in den Darstellungen ist

abhängig von den Geräteeinstellungen während der Meßung. Um Daten

verschiedener Meßungen miteinander vergleichen zu können, wurde daher immer

mit den gleichen Einstellungen gemessen. Für die Auswertung der Meßdaten ist es

weiterhin nötig, Untergruppen gezielt selektieren zu können. Dies ist sowohl im

Histogramm als auch im Punktdiagramm durch das Setzen von elektronischen

„Fenstern“ (gates) möglich. Durch das Einrichten mehrerer Gates und ihrer logischen


54

Verknüpfung lassen sich verschiedene statistische Aussagen über die

Meßparameter treffen. Es können u.a. die Anzahl bestimmter Meßereignisse, ihr

prozentualer Anteil an einer selektierten Ereignisgruppe sowie der mittlere Wert

eines Parameter für diese Untergruppe angegeben werden. Werden FSC und SSC

in einem Punktdiagramm gegeneinander aufgetragen, so stellen sich morphologisch

ähnliche Zellen als zusammenhängende Wolke dar. Werden aus Blut isolierte Zellen

untersucht, so bilden ruhende lymphoide Zellen, Blasten und Monozyten sowie

Granulozyten drei voneinander abgrenzbare Wolken. Da vor allem Phagozyten im

Milieu der Milch ihre Morphologie verändern, bilden hier häufig nur lymphoide Zellen

eine homogene Wolke. Selbst in aus Blut stammenden Zellsuspensionen lassen sich

Eosinophile Granulozyten nicht rein morphologisch von Neutrophilen Granulozyten

(PMN) unterscheiden. In der Korrelation von FL2 mit SCC stellen sich diese beiden

Zellarten aber durch die höhere rotorange Autofluoreszenz der Eosinophilen als

getrennte Wolken dar.

3.5.3.2 Durchflußzytometrische Beurteilung der Zellvitalität

3.5.3.2.1 Prinzip

Geschädigte und/oder abgestorbenen Zellen weisen Defekte in der Zellmembran auf

und zeigen im Vergleich zu gesunden Zellen Veränderungen in Größe und

Komplexität. Zur Färbung solcher Zellen sind Fluorochrome wie Propidiumiodid (PI)

oder TO-PRO-3 geeignet. Diese Farbstoffe gelangen durch defekte Zellmembranen

ins Zellinnere und interkalieren dort mit der DNS–Doppelhelix. PI wird vom ersten

Laser mit λ = 488 nm angeregt und die PI–positiven Zellen werden im Detektor FL3

gemessen, während TO-PRO-3 Signale nach Anregung durch den zweiten Laser mit

λ = 635 nm hauptsächlich in FL4 registriert werden. Zellen mit intakter Membran

werden in diesen Detektoren nicht registriert. Ist der Zelluntergang so weit

fortgeschritten, daß keine DNS–Reste in den Zellen oder gar nur noch

Zellbruchstücke vorhanden sind, können diese mit derartigen Fluorochromen nicht

markiert werden. Es können mit dieser Methode also nur tote kernhaltige Zellen mit


55

Membrandefekten erkannt und von der Analyse ausgeschlossen werden, nicht aber

kernlose Zellen und Zellbruchstücke.

3.5.3.2.2 Probenvorbereitung und Messung

Im Versuch 1 wurde keine getrennte Bestimmung der Zellvitalität durchgeführt. Sie

war hier Teil der Auswertung der Messungen der MIF (siehe 3.5.3.3). Die Messung

der Zellvitalität erfolgte so erst nach Inkubation und mehrmaligem Waschen.

Im Versuch 3 wurde die Messung mit einem eigenen Ansatz unabhängig von der MIF

durchgeführt. Dazu wurden 50 µl der auf die Arbeitskonzentration eingestellten

Zellsuspension zu 150 µl PBS mit PI in ein FACS–Röhrchen (FR) pipettiert.

Anschließend wurden 10.000 zelluläre Ereignisse je Probe im FACS gemessen.

3.5.3.2.3 Auswertung

Die Auswertung der Messungen erfolgte in allen Versuchen nach dem gleichen

Schema. Zunächst wurden in der morphologischen Darstellung FSC/SSC die

Meßereignisse, die nach ihrer Größe keine Zellen sein konnten, von der weiteren

Auswertung ausgeschlossen. Für die gewählten Geräteeinstellungen waren das

diejenigen Meßereignisse, die im Punktediagramm im FSC sowie im SSC kleiner als

50 relative Achseneinheiten waren (siehe Abb. 2 A + B). Dann wurde das Signal des

Farbstoffes (FL4 im Versuch 1, FL3 im Versuch 2) in einem Histogramm dargestellt.

Mit Hilfe von Gates, deren Lage für die Auswertung der Messungen nicht verändert

wurde, und der Statistikfunktion von CellQuestPro wurde nun der Anteil der

farbstoffnegativen Zellen bestimmt. Der Auswertungsgang ist in Abb. 2 dargestellt.


56

A B

C D

Abb.2 Auswertung der Vitalitätsmessung

A: Vorwärts (FSC)- gegen Seitwärts (SSC)- Streulicht Darstellung aller gemessenen Partikel

B: FSC/SSC Darstellung nach Ausschluß des Debris in der linken unteren Ecke; nur diese Zellen wurden berücksichtigt.

C: FL3/SSC Darstellung der roten Fluoreszenz, in der sich nicht angefärbte lebende Zellen (links) von angefärbten toten (rechts) unterscheiden.

D: FL3 Histogramm – mit der Histogramm Statistik in Tab. 7 wurde die Vitalität der Zellen in % bestimmt: M1 = vitale Zellen, M2 = tote Zellen, Xm = mittlere Fluoreszenzaktivität in FL3.

M1 M2


57

Tab. 7: Histogramm Statistik zu FL3-H

Marker Events % Xm

All 9056 100,00 609,80

M1 7203 79,54 15,45

M2 1868 20,63 2897,50

3.5.3.3 Membranimmunfluoreszenz

3.5.3.3.1 Prinzip

Die Membranimmunfluoreszenz (MIF) weist Oberflächenstrukturen von Zellen mit

Hilfe von Antikörpern nach, die spezifisch an diese Strukturen binden. Im Fall der

direkten MIF ist bereits an diesen spezifischen Antikörper (Primärantikörper) ein

Fluorochrom gekoppelt, die indirekte MIF benötigt einen zweiten,

fluorochrommarkierten Antikörper (Sekundärantikörper), der den Primärantikörper

erkennt.

3.5.3.3.2 Durchführung

Die Membranimmunfluoreszenz wurde sowohl mit Milch- als auch mit Blutproben

durchgeführt. Es wurden aus jeder Probe 100 µl Zellsuspension (4 x 106 Zellen / ml)

je Antikörper sowie 100 µl für den Kontrollansatz in eine Vertiefung der

Mikrotiterplatte (MT) pipettiert. Anschließend wurde die MT, genau wie beim späteren

Waschen, für 4 min bei 350 xg und 10°C mit Bremse zentrifugiert, der Überstand

wurde dekantiert und die Zellen durch Rütteln der Platte auf dem Minishaker vom

Plattenboden gelöst. Dann wurden 10 bzw. 20 µl eines spezifischen monoklonalen

Antikörpers (siehe Tab. 5) und als Kontrollansatz gegen unspezifische Bindungen

des Sekundärantikörpers auch einmal je Probe 10 µl PBS zu den Zellen pipettiert


58

und durch kurzes Rütteln mit den Zellen vermischt. Für die 20minütige Inkubation im

Kühlschrank wurde die MT mit einem Deckel abgedeckt. Im Anschluß daran wurden

die Zellen zweimal gewaschen (jeweils Zugabe von 150 µl MIF–Puffer,

Abzentrifugieren 4 min, 350 xg, 10°C, Bremse, Überstand dekantieren, Zellen

aufrütteln). Die Zellen, die mit direkt markierten Antikörpern inkubiert wurden, wurden

nun in 100 µl PBS aufgenommen, für die anschließende Messung in FACS–

Röhrchen (FR) überführt und dunkel gelagert. In den FR waren 100 µl PBS mit 20 µl

TO-PRO-3 vorgelegt. Zu den in der MT verbliebenen Zellen wurden 30 µl FITC–

konjugierter Sekundärantikörper pipettiert und es folgte eine weitere 20minütige

Inkubation im Kühlschrank. Nach erneutem zweimaligen Waschen wurden auch

diese Zellen in 100 µl PBS aufgenommen und in FR überführt. Die Probe wurde so

lange im Durchflußzytometer gemessen, bis - wenn vorhanden – in der Region der

lymphoiden Zellen 5000 Events erfaßt waren.

3.5.3.3.3 Auswertung

Obwohl die durchflußzytometrische Messung der MIF stets mit den gleichen

Geräteeinstellungen erfolgte, mußten für die Auswertung die mitgeführten

Negativkontrollen miteinbezogen werden, da der Sekundärantikörper in der ZSM zu

geringgradiger, unspezifischer Bindung neigte. Durch Setzen eines Gates in FL4

(siehe 3.5.3.1) wurden tote, membrandefekte Zellen, die durch TO-PRO-3 markiert

waren (rechts im Punktdiagramm), von der weiteren Auswertung ausgeschlossen.

Das Fluorochrom Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC), mit dem die Antikörperbindung

markiert wird, wird mit 488 nm, der Wellenlänge des ersten Lasers, angeregt und

emittiert im Bereich des Fluoreszenzdetektors FL1, während Phycoerythrin (PE) bei

gleicher Anregung von FL 2 detektiert wird. Das dritte eingesetzte Fluorochrom,

Phycoerythrin–Cytochrom 5 (PE–Cy5) wird vom dritten Detektor FL 3 gemessen. Die

Analyse der Antikörperbindung erfolgte in einem Punktediagramm, in dem ein

Fluoreszenzkanal gegen SSC aufgetragen wurde. Im Fall einer

Doppelfluoreszenzanalyse, d.h. in einem Ansatz wurden zwei verschieden markierte

Antikörper eingesetzt, wurden zusätzlich zur oben beschriebenen Auswertung die


59

zwei Fluoreszenzkanäle miteinander korreliert. Mit einer Quadrantenanalyse wurden

der prozentuale Anteil fluoreszenzpositiver Zellen und die mittlere

Fluoreszenzintensität ermittelt (siehe Abb. 3 E). Für die Auswertung der

lymphozytenspezifischen mAk wurden durch Setzen entsprechender Gates

ausschließlich lymphoide Zellen selektiert, für die Auswertung der anderen mAk

dagegen wurden die Lymphozyten von der Auswertung ausgeschlossen.


60

A B

C D

E

Abb. 3: Auswertung der MIF am Beispiel der Lymphozyten, Beschriftung siehe folgende Seite


61

A: FSC/SSC Darstellung; der Debris in der linken unteren Ecke wurde während der Messung ausgeschnitten.

B: FL4/SSC Darstellung; nur die links liegenden, nicht angefärbten vitalen Zellen werden in der weiteren Auswertung berücksichtigt.

C: FSC/SSC Darstellung nach Ausschluß der angefärbten toten Zellen; nun erfolgt die Selektion der Lymphozyten für die Beurteilung der Antikörperbindung.

D: FL1/SSC Darstellung der Lymphozyten; die markierten (rechts) und nicht markierten (links) Lymphozyten grenzen sich deutlich voneinander ab. Mit der Quadrantenstatistik werden der prozentuale Anteil der Zellen, die den Antikörper gebunden haben (% UR) sowie ihre mittlere Fluoreszenzintensität (Xm UR) ermittelt (siehe Tab. 8).

E: FL1/FL2 Darstellung von Lymphozyten, die gleichzeitig mit 2 Antikörpern markiert wurden. Mit Hilfe der Quadrantenstatistik wird der prozentuale Anteil der Zellen, die keine (% UL), nur einen (% UR und % OL) oder beide Antikörper (% OR) gebunden haben, erhoben (siehe Tab. 8).

Tab. 8: Quadranten Statistik für die Auswertung der MIF

Einfarbenfluoreszenz Doppel-fluoreszenz

Qua-drant

Events % Xm Events %

OL 0 0 - 472 40,34

OR 0 0 - 34 2,91

UL 696 63,91 3,44 623 53,26

UR 393 36,09 92,05 41 3,50

OL = oben links, OR = oben rechts, UL = unten links, UR = unten rechts, Events = ausgewertete Zellen, % = Anteil der Zellen in einem Quadranten an allen ausgewerteten Zellen, Xm = mittlere Fluoreszenzintensität der Zellen in einem Quadranten


62

3.5.4 Datengruppierung und Statistik

3.5.4.1 Versuch 1: Orientierende Untersuchung auf der Basis einer


3.5.4.1.1 Datengruppierung

Die Kühe bzw. Euterviertel wurden nach dem in Tab. 9 dargestellten Schema in vier

Gruppen eingeteilt. Ausschlaggebend war der Zellgehalt pro ml im

Viertelanfangsgemelk (SCC VAG). Gruppe A umfaßt selektiv die Euterviertel der

Kühe, die auf allen vier Drüsenkomplexen weniger als 100.000 Zellen/ml Milch

aufwiesen und somit als eutergesund eingestuft werden konnten.

Tab. 9: Gruppierung der Daten in Versuch 1

Zellen x 1000 / ml Milch

Alle Viertel < 100

Mindestens 1 Viertel > 100

Einteilung Kuh A B oder C


< 100 < 100 100 – 400 > 400

Einteilung Viertel A BC1 BC2 C3

3.5.4.1.2 Statistik

Die statistischen Berechnungen wurden mit dem Programm SAS Version 8e 2002,

SAS Institute Inc., Cary, NY durchgeführt. Die Normalverteilung wurde optisch mit

dem Verfahren PROC CHART geprüft. Nicht normalverteilte Daten wurden

logarithmisch transformiert und nochmals geprüft. Mittelwert und

Standardabweichung wurden mit dem Programm PROC MEANS, die einfaktorielle


63

Varianzanalyse für unabhängige Stichproben mit PROC GLM und die Korrelation der

Parameter mit der Zellzahl mit PROC CORR berechnet.

3.5.4.2 Versuch 2: Methodische Fragestellungen

3.5.4.2.1 Einfluß von Probenahmegefäß und Untersucher auf das mikroskopische

Zelldifferentialbild

Alle Berechnungen wurden getrennt für die drei Zellarten PMN, Lymphozyten und

Makrophagen durchgeführt. Der Einfluß des Probenahmegefäßes wurde zusätzlich

für jeden der drei Untersucher separat berechnet, während umgekehrt zur

Berechnung des Untersuchereinflusses die Probenahmegefäße einzeln betrachtet

wurden.

Zunächst wurden die Daten optisch auf Normalverteilung geprüft (siehe 3.5.4.1.2)

Für Mittelwert und Standardabweichung wurde das Verfahren PROC MEANS

eingesetzt, die Berechnung der zweifaktoriellen Varianzanalyse für wiederholte

Messungen erfolgte mit PROC GLM des Programms SAS.

3.5.4.2.2 Einfluß von Probenahmegefäß und Antikörper auf das

durchflußzytometrische Zelldifferentialbild

Der Einfluß des Probenahmegefäßes wurde für Bindungsrate (%) und mittlere

Fluoreszenzintensität (Xm) der vier in diesem Versuch eingesetzten Antikörper

berechnet. Umgekehrt wurde der Vergleich zwischen den Antikörpern getrennt nach

Art des Probenahmegefäßes durchgeführt.

Die Statistik wurde analog zu 3.5.4.2.1 berechnet.


64

3.5.4.2.3 Vergleich von Kieler Sedimentausstrich und Ausstrich der Zellsuspension

Die Einteilung der Proben für die statistischen Berechnungen ist in Tab. 10

dargestellt. Sie erfolgte wie unter 3.5.4.1.1 anhand des SCC VAG.

Tab. 10: Gruppierung der Daten für den Vergleich der Ausstricharten KSA und ZSM, für die Untersuchung zur Wiederholbarkeit und für Versuch 3


Alle Viertel <100

Mindestens 1 Viertel 100 – 400

Mindestens 1 Viertel > 400

Einteilung Kuh A B C


< 100 < 100 100 – 400 < 100 100 – 400 > 400

Einteilung Viertel

A B1 B2 C1 C2 C3

Alle Berechnungen erfolgten getrennt für die Zellarten PMN, Lymphozyten und

Makrophagen. Die Ausstricharten wurden jeweils innerhalb einer Gruppe miteinander

verglichen. Dazu wurde nach der optischen Prüfung auf Normalverteilung eine

zweifaktorielle Varianzanalyse für wiederholte Messungen eingesetzt (vgl. 3.5.4.2.1).

Für den Vergleich der Gruppen A bis C3 innerhalb einer Ausstrichart wurde der

Ryan-Einot-Gabriel-Welsch Multiple Range Test mit PROC GLM des Programms

SAS angewendet. Um beurteilen zu können, welche Zellarten mit der jeweiligen

Methode angereichert wurden, erfolgte eine Berechnung von Mittelwert und

Standardabweichung der Differenz KSA – ZSM.


65

3.5.4.2.4 Überprüfung der Wiederholbarkeit verschiedener Parameter

Für diese Fragestellung wurde keine Datengruppierung vorgenommen. Ob zwischen

den Werten der aufeinanderfolgenden drei Tage signifikante Unterschiede bestehen,

wurde mit einer zweifaktoriellen Varianzanalyse berechnet. Diese Rechnung wurde

unter Einbeziehung des vierten Untersuchungstages wiederholt.

3.5.4.3 Versuch 3: Untersuchungen zum Zelldifferentialbild auf der Basis einer


Die Datengruppierung ist in Tab. 10 dargestellt und unter 3.5.4.2.3 kurz erläutert.

Das statistische Vorgehen entspricht den zu Versuch 1 unter 3.5.4.1.2

beschriebenen Berechnungen.

Ergebnisse

66

4. ERGEBNISSE

Ziel dieser Arbeit war es, mikroskopisch und durchflußzytometrisch die

Veränderungen des Zelldifferentialbildes in Abhängigkeit von der Eutergesundheit zu

untersuchen. Zunächst wurde mit einer orientierenden Untersuchung festgestellt, ob

und in welcher Form diese Veränderungen zu erfassen waren. Da weder für die

Mikroskopie noch für die Durchflußzytometrie auf praktische Erfahrung

zurückgegriffen werden konnte, wurden auch die Methoden selbst exemplarisch

überprüft. Auf der Basis dieser Untersuchungen wurde die Abhängigkeit des

Zelldifferentialbildes von der Eutergesundheit in Blut und Milch mikroskopisch und

durchflußzytometrisch analysiert.

4.1 Versuch 1: Orientierende Untersuchung auf der Basis einer


4.1.1 Selektierte Kriterien der Eutergesundheit

Die Gruppeneinteilung erfolgte anhand des Zellgehaltes (SCC) des VAG (SCC VAG)

als Leitparameter für die Eutergesundheit (siehe 3.5.4), aber es wurden in diesem

Zusammenhang noch weitere Parameter erhoben. Tab. 11 gibt die

Stichprobengrößen, Mittelwerte und Standardabweichungen für die elektrische

Leitfähigkeit (LF) sowie den SCC und die NAGase-Aktivität (NAGase) in VAG und

VGH in den einzelnen Gruppen wieder. Insgesamt war für alle Meßgrößen ein

Anstieg der Werte von A über BC1 und BC2 zu C3 zu beobachten. Obwohl für die

Gruppen A und BC1 der gleiche SCC-Grenzwert galt, war der Zellgehalt in BC1

signifikant höher als in A. Kein anderes selektiertes Kriterium der Eutergesundheit

zeigte diese signifikante Differenz. SCC VAG war auch die einzige Meßgröße, in der

sich BC1 und BC2 signifikant unterschieden. C3 hat im Vergleich mit den übrigen

Gruppen (A, BC1 u. BC2) in den Parametern LF, SCC VAG, SCC VGH, NAGase

Ergebnisse

67

VAG und NAGase VGH signifikant die höchsten Werte. In Tab. 12 sind die

Signifikanzen im einzelnen aufgeführt.

Tab. 11: Stichprobengröße n Viertel, Mittelwert X und Standardabweichung sd der selektierten Kriterien der Eutergesundheit in Versuch 1

Gruppe A BC1 BC2 C3

Parameter n X sd n X sd n X sd n X sd

LF 35 6,27 0,62 12 6,28 0,65 18 6,57 0,73 18 8,13 1,98

LOG SCC VAG 35 4,04 0,60 12 4,40 0,50 18 5,33 0,17 16 6,07 0,43

LOG SCC VGH 34 2,53 0,22 12 2,78 0,44 18 3,07 0,31 18 3,81 0,75

LOG NAG VAG 35 0,39 0,23 12 0,43 0,19 18 0,65 0,22 18 1,13 0,47

LOG NAG VGH 35 0,40 0,28 12 0,41 0,26 16 0,57 0,22 16 1,02 0,47

Alle selektierten Kriterien der Eutergesundheit korrelierten hochsignifikant

(p < 0,0001) mit SCC VAG. SCC VGH korrelierte am stärksten, gefolgt von NAGase

VAG und VGH. Die elektrische Leitfähigkeit zeigte die schwächste Korrelation. In

Tab. 13 sind die Korrelationskoeffizienten aufgeführt.

Ergebnisse

68

Tab.12: Signifikanzen (p-Werte) der selektierten Kriterien der Eutergesundheit zwischen den Gruppen in Versuch 1

Gruppe LF SCC VAG

SCC VGH

NAGase VAG

NAGase VGH

A/BC1 ns * ns ns ns

A/BC2 ns *** *** ** ns

A/C3 *** *** *** *** ***

BC1/BC2 ns *** ns ns ns

BC1/C3 *** *** *** *** ***

BC2/C3 *** *** *** *** ***

allgemein *** *** *** *** ***

*: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,001, ns = nicht signifikant

Tab. 13: Korrelationskoeffizienten der selektierten Kriterien der Eutergesundheit mit SCC VAG

Kriterium LF SCC VGH NAGase VAG NAGase VGH

k 0,54209 0,77418 0,69042 0,59946

k = Korrelationskoeffizient

Ergebnisse

69

***

***

***

***

* *

*

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

% PMN ZSM % LYM ZSM % MAK ZSM

%

A

BC1

BC2

C3

4.1.2 Mikroskopisches Zelldifferentialbild

In diesem Versuch wurde das Zelldifferentialbild der ZSM erhoben. Die Ausstriche

hierfür wurden mit der „Kaffeemühle“ hergestellt. Zur Differenzierung wurden PMN,

Lymphozyten und Makrophagen herangezogen.

Das Zelldifferentialbild zeigte einen ähnlichen Trend in Abhängigkeit der

Eutergesundheit wie die selektierten Kriterien. BC2 hatte jedoch den höchsten Anteil

PMN und den niedrigsten Anteil Lymphozyten, die Werte für C3 lagen etwas

niedriger bzw. höher. Der Anteil der Makrophagen zeigte keinerlei Reaktion auf eine

Veränderung der Eutergesundheit (siehe Abb. 4). Zusammenfassend wurde für

eutergesunde Milchdrüsen (A) ein Zelldifferentialbild von ca. 37 % PMN, 46 %

Lymphozyten und 17 % Makrophagen, für hochgradig erkrankte Drüsenkomplexe

(C3) eines von ca. 57 % PMN, 24 % Lymphozyten und 19 % Makrophagen

festgestellt. Tab. 14 zeigt die Signifikanzen des Gruppenvergleichs.

Abb. 4. Zelldifferentialbild unter Berücksichtigung der Eutergesundheit in Versuch 1

Ergebnisse

70

Tab. 14: Signifikanzen für die einzelnen Zellarten zwischen den Gruppen

Gruppe %

PMN %

Lymphozyten %

Makrophagen

A/BC1 ns ns ns

A/BC2 *** *** ns

A/C3 *** *** ns

BC1/BC2 * * ns

BC1/C3 ns * ns

BC2/C3 ns ns ns

allgemein *** *** ns


Die PMN zeigten eine positive und Lymphozyten eine etwa gleichstarke negative

hochsignifikante (p ≤ 0,0002) Korrelation mit SCC VAG. Die Korrelationskoeffizienten

sind in Tab. 15 dargestellt.

Tab. 15: Korrelationskoeffizienten der einzelnen Zellarten mit SCC VAG

Zellart PMN Lymphozyten Makrophagen

k 0,41064 - 0,46139 0,17311


Ergebnisse

71

4.1.3 Durchflußzytometrische Parameter

Mit dem Durchflußzytometer wurden für jeden Antikörper zum einen die prozentuale

Bindungsrate (%), zum anderen die Bindungshäufigkeit pro Zelle (mittlere

Fluoreszenzintensität Xm) bestimmt. Die prozentuale Bindungsrate gibt den Anteil

der Lymphozyten, an die der Antikörper gebunden hat, an allen lymphoiden Zellen

wieder. Die Bindungshäufigkeit ermöglicht eine Aussage über die Expressionsdichte

des erkannten Antigens auf der Zelloberfläche. Die prozentuale Angabe der vitalen

Zellen (% Vitalität) bezieht sich auf alle Zellen.

Nur wenige der durchflußzytometrischen Parameter zeigten eine Abhängigkeit von

der Eutergesundheit.

Die Vitalität zeigte ein ähnliches Verhalten wie die PMN, jedoch waren nur die

Differenzen zwischen A und BC1 bzw. BC2 signifikant. Die Zellen, die CD4 bzw. CD8

exprimierten, schienen durch Änderungen in der Eutergesundheit unbeeinflußt zu

bleiben. WC1 wurde insgesamt von nur sehr wenigen lymphoiden Zellen exprimiert,

der Anteil dieser Zellen nahm aber bei hgr. Mastitis (C3) signifikant ab. Die

Zellpopulationen, die CD8 und WC1 gleichzeitig exprimierten, sowie die MHC II

tragenden Zellen, verhielten sich in Abhängigkeit von der Eutergesundheit ähnlich.

Ihre Bindungsrate war in A am niedrigsten, gefolgt von BC2. In BC1 und C3 war ihr

Anteil am größten. Die Expressionsdichte von MHC II war im unveränderten Sekret

(A) am geringsten und stieg mit dem Schweregrad der Mastitis an. Im einzelnen sind

die Ergebnisse in Tab. 16 und die Signifikanzen in Tab. 17a+b dargestellt.

Ergebnisse

72

Tab. 16: Stichprobengröße n Viertel, Mittelwert X und Standardabweichung sd der durchflußzytometrischen Parameter der ZSM in Versuch 1

Gruppe A BC1 BC2 C3

Parameter n X sd n X sd n X sd n X sd

% VIT 35 43,67 20,49 12 49,52 18,97 18 59,48 20,07 18 57,70 26,26

% CD4 33 34,60 14,26 12 36,92 12,85 17 36,42 13,11 16 32,60 16,04

Log Xm CD4

33 2,09 0,16 12 2,06 0,11 17 2,07 0,09 16 2,07 0,07

% CD8 35 37,22 10,80 12 32,99 8,57 18 36,77 9,91 18 36,82 11,75

Xm CD8 35 942,17 502,22 12 1091,19 354,22 18 1072,10 266,61 18 975,03 243,47

%CD4/% CD8

33 0,98 0,42 12 1,26 0,68 17 1,19 0,58 16 0,98 0,54

Log % γδ 35 0,26 0,35 12 0,35 0,33 18 0,23 0,25 17 -0,01 0,33

Log Xm γδ 35 2,07 0,19 12 1,92 0,12 18 2,02 0,11 17 2,04 0,19

Log % CD8+γδ 34 -0,68 0,34 12 -0,87 0,44 18 -0,66 0,35 15 -1,00 0,44

% Bo139 35 2,43 1,21 12 4,57 3,83 18 3,43 1,75 17 4,45 3,34

Log Xm Bo139

35 2,21 0,11 12 2,13 0,18 18 2,31 0,10 17 2,33 0,12

Ergebnisse

73

Tab.17a: Signifikanzen für die durchflußzytometrischen Parameter zwischen den Gruppen

Gruppe % Vit % CD4 log Xm CD4

% CD8 Xm CD8 CD4%/ CD8%

A/BC1 ns ns ns ns ns ns

A/BC2 * ns ns ns ns ns

A/C3 * ns ns ns ns ns

BC1/BC2 ns ns ns ns ns ns

BC1/C3 ns ns ns ns ns ns

BC2/C3 ns ns ns ns ns ns

allgemein * ns ns ns ns ns


Die Korrelationsanalyse bestätigte die oben beschriebenen Beobachtungen, daß nur

die Parameter % Vit, log % WC1, log % WC1+CD8 und log Xm Bo139 von der

Eutergesundheit beeinflußt werden. Sie korrelierten signifikant mit SCC VAG, dem

Leitparameter für die Eutergesundheit (siehe Tab. 18a+b).

Ergebnisse

74

Tab.17b: Signifikanzen für die durchflußzytometrischen Parameter zwischen den Gruppen

Gruppe log % WC1

log Xm WC1

log % CD8+WC1

% Bo139 log Xm Bo139

A/BC1 ns * ns ** *

A/BC2 ns ns ns ns **

A/C3 ** ns ** ** **

BC1/BC2 ns ns ns ns ***

BC1/C3 ** ns ns ns ***

BC2/C3 * ns * ns ns

allgemein * ns * * ***


Tab. 18a: Korrelationskoeffizienten der durchflußzytometrischen Parameter mit SCC VAG

Parameter % Vit % CD4 log Xm

CD4 % CD8 Xm CD8 CD4%/ CD8%

k 0,37918 0,01661 0,01648 0,01774 0,02557 0,03181


Ergebnisse

75

Tab. 18b: Korrelationskoeffizienten der durchflußzytometrischen Parameter mit SCC VAG

Parameter log % WC1

log Xm WC1

log % CD8+ WC1

% Bo139 log Xm Bo139

k - 0,33721 - 0,10151 0,05388 0,21267 0,31350


Mit den Parametern % PMN, % LYM, % VIT, log % WC1, log % WC1+CD8 und log

Xm Bo139 konnten sowohl im mikroskopischen als auch im durchflußzytometrischen

Zelldifferentialbild signifikante Veränderungen der Zellpopulationen in Abhängigkeit

von der Eutergesundheit beobachtet werden.

4.2 Versuch 2: Methodische Fragestellungen

4.2.1 Einfluß des Probenahmegefäßes und des Untersuchers auf das

mikroskopische Zelldifferentialbild

In diesem Versuch wurden aus 40 Milchproben, die jeweils in zwei verschiedenen

Probenahmegefäßen (Plastik und Glas) gewonnen wurden (siehe 3.4.2.3.2) die

Zellen separiert und mit der „Kaffeemühle“ ausgestrichen. Alle 80 Ausstriche wurden

von drei verschiedenen Untersuchern differenziert. Für jeden Untersucher wurde

über die 40 Ausstriche, die zu einem Gefäß gehören, der arithmetische Mittelwert

getrennt nach Zellart berechnet. Diese Mittelwerte wurden dann für die Vergleiche

der Gefäße bzw. Untersucher herangezogen. Tab. 19 zeigt die Ergebnisse dieser

Zelldifferenzierung in Form von Mittelwert X, Standardabweichung sd und

Stichprobengröße n.

Ergebnisse

76

Tab. 19: Ergebnisse der mikroskopischen Zelldifferenzierung im Versuch 2: Einfluß von Probenahmegefäß und Untersucher

Gefäß Plastik Glas

Untersucher US1 US2 US3 US1 US2 US3

X 61,37 67,30 67,10 58,53 63,56 65,49 PMN

sd 24,87 18,43 19,20 24,70 21,29 20,51

X 13,47 14,83 5,10 12,00 14,44 5,67 LYM

sd 13,32 10,99 4,42 11,29 13,59 4,99

X 23,11 16,63 27,49 28,10 21,23 28,38 MAK

sd 16,42 11,52 17,39 16,42 11,70 17,77

Proben n 38 40 39 39 39 39

PMN = Polymorphkernige Neutrophile Granulozyten

LYM = Lymphozyten

MAK = Makrophagen

4.2.1.1 Einfluß des Probenahmegefäßes

Das Material des Probenahmegefäßes beeinflußte den Anteil der Phagozyten,

insbesondere der Makrophagen, signifikant. Es wurden mehr PMN und

Makrophagen aus dem Glasgefäß als aus dem Kunststoffgefäß isoliert (siehe Tab.

19). Die Signifikanzen für die Untersucher sind in Tab. 20 aufgeführt.

Ergebnisse

77

Tab. 20: Signifikanzen des Gefäßvergleichs getrennt nach Untersucher

Untersucher

Zellart US1 US2 US3

PMN ns * ns

LYM ns ns ns

MAK * * ns


4.2.1.2 Einfluß des Untersuchers

Tab. 21: Signifikanzen des Untersuchervergleiches


Unter-sucher

US1 / US2

US1 / US3

US2 / US3

US1 / US2

US1 / US3

US2 / US3

PMN ** ** ns *** *** ns

LYM ns *** *** ns *** ***

MAK ** ** *** ** ns ***


Mit der Varianzanalyse konnte einerseits für jede Zellart allgemein der Einfluß des

Untersuchers gesichert werden, es wurden aber auch alle Untersucher einzeln

miteinander verglichen. Hierbei traten nicht für jede Zellart zwischen allen

Untersuchern signifikante Differenzen auf, aber Übereinstimmungen zwischen zwei

Ergebnisse

78

Untersuchern beschränkten sich nur auf eine Zellart. Die Signifikanzen im einzelnen

sind Tab. 21 zu entnehmen.

4.2.2 Einfluß des Probenahmegefäßes und des Antikörpers auf das


Zu dieser Fragestellung wurden zwei Antikörperpaare hinsichtlich Bindungsrate (%)

und mittlerer Fluoreszenzintensität (Xm) untersucht. Das eine Paar (CD4 I und

CD4 S) war gegen die gleiche Oberflächenstruktur gerichtet, während zwei

verschiedene Strukturen der γδ-T-Lymphozyten die Antigene für das andere Paar

(WC1 und GB21A) waren. Die Untersuchungen wurden mit den unter 4.2.1

beschriebenen Proben bzw. Zellsuspensionen durchgeführt, so daß auch der Einfluß

des Probenahmegefäßes mit berücksichtigt werden konnte. Die Berechnungen

erfolgten ebenfalls wie unter 4.2.1 beschrieben. Mittelwerte X, Standardabweichung

sd und Stichprobengröße n sind in Tab. 22 dargestellt.

Tab.22: Ergebnisse der durchflußzytometrischen Zelldifferenzierung in Versuch 2: Einfluß von Probenahmegefäß und Antikörper


mAk CD4S CD4I WC1 GB21A CD4S CD4I WC1 GB21A

X 31,84 4,49 4,58 12,77 31,14 4,91 4,96 13,65 %

sd 9,99 3,28 3,03 6,51 10,68 3,04 2,71 6,87

X 127,98 287,30 305,33 337,67 127,01 346,59 235,99 343,43 Xm

sd 18,94 204,95 276,75 73,20 17,27 309,27 151,38 153,15

Proben n 40 40 39 40 40 40 33 39

Ergebnisse

79


Schon ohne Statistik fiel auf, das sich für jeden Parameter die Mittelwerte der beiden

Gefäße auf dem gleichen Niveau bewegten. Die Varianzanalyse bestätigte, daß die

Probenahmegefäße das durchflußzytometrische Zelldifferentialbild nicht signifikant

(p > 0,05) beeinflußten.

4.2.2.2 Einfluß des Antikörpers

Der eingesetzte Antikörper übte einen starken und hochsignifikanten (p < 0,0001)

Einfluß auf die prozentuale Bindungsrate und damit den Anteil einer Subpopulation

an der Gesamtpopulation aus (siehe Tab. 18). Das gegen CD4 gerichtete

Antikörperpaar zeigte auch signifikante (p < 0,0001) Unterschiede in der mittleren

Fluoreszenzintensität.

4.2.3 Vergleich von Kieler Sedimentausstrich und Ausstrich der

Zellsuspension mit der „Kaffeemühle“

Anhand von 146 doppelt angefertigten Milchzellausstrichen wurde überprüft, ob die

Anzahl der Zentrifugationsschritte und die Technik, die Zellen auf dem Objektträger

aufzutragen, zu unterschiedlichen Zelldifferentialbildern führen. Die Auswertung

erfolgte separat für die unterschiedlichen Eutergesundheitsklassen (siehe 3.5.4.2.3).

Dadurch konnte ermittelt werden, ob sich trotz eventueller Unterschiede ein ähnlicher

Einfluß der Eutergesundheit auf das Zelldifferentialbild erkennen läßt. Durch

Betrachtung der mittleren Differenz KSA – „Kaffeemühle“ konnte beurteilt werden,

welche Zellarten durch eine Methode angereichert bzw. reduziert wurden.

Ergebnisse

80

Den Tabb. 23 und 24 können die mittleren Zelldifferentialbilder und ihre

Schwankungsbereiche entnommen werden. Es fiel auf, daß im KSA in allen Gruppen

weniger PMN, aber mehr Lymphozyten gefunden wurden als in der ZSM, die

Makrophagen sich aber auf dem gleichen Niveau befanden. Die Varianzanalyse

(Tab. 25) bestätigte, daß mit der Ausnahme PMN C2 für PMN und Lymphozyten in

allen Gruppen ein signifikanter Unterschied zwischen den Zelldifferentialbildern, d.h.

zwischen den Ausstrichmethoden bestand. Die Makrophagen zeigten eine solche

signifikante Differenz nur bei hgr. Mastitis (C3). Die Mittelwerte der Differenzen KSA

– „Kaffeemühle“ (Tab. 26) unterstützten die Annahme, daß durch die vermehrte

Zentrifugation Lymphozyten verloren bzw. PMN angereichert wurden. Für die

Makrophagen ließ sich kein Trend ablesen.

Auch wenn signifikante Unterschiede (siehe Tab. 25) zwischen den

Differenzierungsergebnissen beider Ausstricharten bestanden, so spiegelten doch

beide eine analoge Veränderung des Zelldifferentialbildes in Abhängigkeit von der

Eutergesundheit wieder. In Abb. 6 und 7 zeichnete sich für beide Ausstricharten ein

Anstieg der PMN und eine Abnahme der mononukleären Zellen (Lymphozyten und

Makrophagen) ab. Die statistische Untersuchung dieser Veränderungen ergab, daß

mit der Methode „Kaffeemühle“ geringfügig mehr Signifikanzen gefunden wurden.

Dieses Ergebnis unterstützt den subjektiven, nicht dokumentierten Befund des

Untersuchers, daß mit der „Kaffeemühle“ ein besser interpretierbarer Ausstrich

erreicht wurde (siehe auch Abb. 5)

Ergebnisse

81

PMN Kaffeemühle (A) PMN KSA (B)

Lymphozyt Kaffeemühle (C) Lymphozyt KSA (D)

Makrophage Kaffeemühle (E) Makrophage KSA (F)

Abb. 5: Milchzellausstriche A - H, mikroskopiert bei 1000 –facher Vergrößerung in Ölimmersion (Bilder E1 u. E2 siehe folgende Seite)

Ergebnisse

82

Makrophage Kaffeemühle (E1 oben + E2 unten)

Ergebnisse

83

Tab. 23: Zelldifferentialbild getrennt nach Gruppen, Methode KSA

A B1 C1 B2 C2 C3

X 19,54 28,90 47,67 57,00 63,35 62,00 % PMN

sd 17,31 16,67 20,16 12,99 23,48 22,70

X 45,56 30,14 26,75 17,73 19,75 16,94 % LYM

sd 22,10 17,60 10,38 8,22 15,07 14,39

X 34,53 36,71 25,50 24,40 16,85 20,73 % MAK

sd 14,89 13,46 14,29 8,22 10,31 10,83

Viertel n 45 21 12 15 20 33

Tab. 24: Zelldifferentialbild getrennt nach Gruppen, Methode „Kaffeemühle“

A B1 C1 B2 C2 C3

X 33,03 43,15 66,42 68,18 67,00 79,91 % PMN

sd 20,17 21,84 17,35 14,50 26,20 16,07

X 24,82 19,20 11,23 7,20 11,05 6,33 % LYM

sd 15,35 9,75 10,99 3,00 10,13 9,42

39,05 34,95 19,84 24,53 21,75 12,94 % MAK

sd 17,60 18,54 8,45 14,55 16,65 8,36

Viertel n 45 21 12 15 20 33

Ergebnisse

84

Tab. 25: Signifikanzen des Vergleichs der Ausstrichmethoden, getrennt nach Zellart und Eutergesundheitsstatus

A B1 B2 C1 C2 C3

PMN *** *** ** ** ns ***

LYM *** ** *** ** *** ***

MAK ns ns ns ns ns ***


Tab. 26: Mittelwert X und Standardabweichung sd der Differenz KSA - ZSM

A B1 B2 C1 C2 C3

X -13,50 -14,25 -11,07 -18,75 -3,65 -17,91 PMN

sd 17,04 15,34 13,33 19,63 15,96 16,22

X 20,74 10,94 10,53 15,52 8,70 10,61 LYM

sd 17,96 13,67 8,43 12,68 9,94 7,91

X -4,52 1,76 -0,13 5,66 -4,90 7,79 MAK

sd 17,83 17,07 12,56 14,40 13,19 10,52

Proben n 45 21 15 12 20 33

Ergebnisse

85

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

PMN LYM MAK

%

AB1C1B2C2C3

Abb. 6: KSA – Zelldifferentialbild unter Berücksichtigung der Eutergesundheit

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

PMN LYM MAK

%

AB1C1B2C2C3

Abb. 7: ZSM („Kaffeemühle“) – Zelldifferentialbild unter Berücksichtigung der Eutergesundheit

Ergebnisse

86

Tab. 27: Signifikanzen für die einzelnen Zellarten und Methoden zwischen den Gruppen

% PMN KSA

% PMN ZSM

% LYM KSA

% LYM ZSM

% MAK KSA

% MAK ZSM

A/B1 ns ns ns ns ns ns

A/C1 s s s s ns s

A/B2 s s s s ns ns

A/C2 s s s s s s

A/C3 s s s s s s

B1/C1 s s ns ns ns ns

B1/B2 s s ns s ns ns

B1/C2 s s ns ns s ns

B1/C3 s s ns s s s

C1/B2 ns ns ns ns ns ns

C1/C2 ns ns ns ns ns ns


B2/C2 ns ns ns ns ns ns

B2/C3 ns ns ns ns ns ns


s = signifikant, ns = nicht signifikant

Ergebnisse

87

4.2.4 Untersuchungen zur Wiederholbarkeit der mikroskopischen und

durchflußzytometrischen Zelldifferenzierung

Um zu klären, ob tierindividuelle Tagesschwankungen oder aber methodisch

bedingte Tagesvariationen die Ergebnisse beeinflussen, wurden 10 Tiere an drei

aufeinanderfolgenden Tagen sowie ein weiteres Mal im Abstand von einer Woche

beprobt. Aufgrund einer adspektorischen Allgemeinuntersuchung sowie der

klinischen Laboruntersuchung wurde sichergestellt, daß der allgemeine

Gesundheitszustand der Kühe im Beprobungszeitraum unverändert blieb. Es wurden

zwei getrennte Varianzanalysen für die drei aufeinanderfolgenden Tage bzw. alle 4

Untersuchungstage gerechnet. In Tabb. 28a-c sind die Ergebnisse für die

Milchparameter, in Tabb. 29a+b für die Blutparameter aufgeführt.

4.2.4.1 Wiederholbarkeit der Milchzelldifferenzierung

Tab. 28a: Ergebnisse zur Wiederholbarkeit der mikroskopischen und durchflußzytometrischen Milchzelldifferenzierung

Milch 3 Tage Milch 4 Tage

Parameter n X sd p n X sd p

LF 40 5,80 0,61 ns 40 5,74 0,69 ns

LOG SCC VAG 40 4,74 0,56 ns 40 4,75 0,57 ns

Log EV VGH 40 2,76 0,53 ns 40 2,73 0,56 ns

LOG NAG VAG 40 0,25 0,23 ns 40 0,26 0,23 ns

LOG NAG VGH 40 0,26 0,25 ns 40 0,26 0,25 ns

Ergebnisse

88

Tab. 28b: Ergebnisse zur Wiederholbarkeit der mikroskopischen und durchflußzytometrischen Milchzelldifferenzierung



% PMN KSA 40 46,63 25,66 ns 40 44,74 24,87 ns

% LYM KSA 40 22,23 20,86 ns 40 23,14 19,55 ns

% MAK KSA 40 23,60 15,43 ns 40 26,19 15,69 *

% PMN ZSM 40 49,72 28,91 ns 40 48,86 28,47 ns

% LYM ZSM 40 13,36 11,20 ns 40 13,84 11,61 ns

% MAK ZSM 40 34,83 22,94 ns 40 35,40 23,25 ns

% VIT 40 74,45 13,20 ns 40 72,96 15,89 ns

% CD4 40 26,50 9,02 ns 40 27,24 9,12 ns

Log Xm CD4 40 2,04 0,07 ns 40 2,06 0,12 ns

% CD8 40 43,36 12,60 ns 40 43,60 12,22 ns

CD8 Xm 40 1030,27 481,86 * 40 1026,92 496,27 ns

%CD4/%CD8 40 0,69 0,35 ns 40 0,70 0,35 ns

Log %γδ 40 1,00 0,19 ns 40 0,99 0,21 ns

Log Xm γδ 40 2,34 0,22 ** 40 2,34 0,23 ***

Log % CD8+ γδ 40 0,65 0,27 ns 40 0,62 0,33 ns

% Bo116 40 10,86 9,09 ns 40 10,53 9,43 ns

Xm Bo116 40 77,21 43,05 ns 40 83,26 46,38 ns

Ergebnisse

89

Tab. 28c: Ergebnisse zur Wiederholbarkeit der mikroskopischen und durchflußzytometrischen Milchzelldifferenzierung



% Bo139 113 7,14 5,60 ns 150 7,12 5,46 ns

Log Xm Bo139 113 2,36 0,25 ns 150 2,36 0,26 ns

% CD14 120 21,54 11,18 ns 160 20,81 11,15 ns

Log Xm CD14 120 3,01 0,15 ns 160 2,99 0,16 *

%Bo139+CD14 119 2,41 2,34 ** 156 2,29 2,26 **

Insgesamt wies die Milchzelldifferenzierung kaum Tagesschwankungen auf. Die

Betrachtung über drei Tage ergab lediglich für 3 Parameter (Xm CD8, Log Xm γδ und

% Bo139 + CD14) signifikante Differenzen, mit der zweiten Betrachtung über vier

Tage kamen noch % MAK KSA sowie Log Xm CD14 dazu, wogegen Xm CD8 hier

wegfiel.

Ergebnisse

90

4.2.4.2 Wiederholbarkeit der Blutzelldifferenzierung

Tab. 29a: Ergebnisse zur Wiederholbarkeit der mikroskopischen und durchflußzytometrischen Blutzelldifferenzierung

Blut 3 Tage Blut 4 Tage


LOG NAGase PLASMA

27 0,61 0,30 ns 37 0,59 0,30 ns

LOG NAG ZSB

27 0,19 0,09 ns 37 0,19 0,12 ns

% PMN B 30 46,87 10,72 ns 40 46,12 10,70 ns

% EOS B 30 5,62 2,89 ns 40 5,61 2,69 ns

% BASO B 29 0,60 0,56 ns 39 0,61 0,55 ns

% LYM B 30 45,51 10,93 ns 40 46,27 10,66 ns

% MONO B 30 1,48 1,12 ns 40 1,48 1,08 ns

% VIT 30 97,89 1,16 ns 39 97,62 1,73 ns

% CD4 30 19,69 5,77 ns 40 19,75 6,61 ns

Log Xm CD4 30 93,47 22,34 ns 40 98,07 31,61 ns

% CD8 30 20,21 6,55 ns 40 19,96 7,06 ns

CD8 Xm 30 760,66 293,23 ns 40 757,36 324,1 ns

%CD4/%CD8 30 1,08 0,51 ns 40 1,11 0,55 ns

Ergebnisse

91

Tab. 29b: Ergebnisse zur Wiederholbarkeit der mikroskopischen und durchflußzytometrischen Blutzelldifferenzierung

Blut 3 Tage Blut 4 Tage


Log %γδ 30 0,94 0,36 ns 40 0,98 0,36 ns

Log Xm γδ 30 2,37 0,19 ns 40 2,35 0,19 ns

Log % CD8+ γδ 30 0,22 0,39 ns 40 0,20 0,37 ns

% Bo116 30 33,70 8,62 ns 40 32,18 9,90 ns

Xm Bo116 30 56,10 21,41 ns 40 55,19 20,64 ns

% Bo139 30 47,48 13,25 ns 40 45,80 12,59 ns

Log Xm Bo139

29 2,25 0,11 ns 39 2,21 0,16 *

% CD14 30 5,59 2,68 ns 40 5,86 2,93 ns

Log Xm CD14 30 2,37 0,09 ns 40 2,36 0,10 ns

%Bo139+ CD14

30 5,18 3,75 ns 40 4,53 3,67 *

Das Zelldifferenzialbild der Blutleukozyten zeigte eine noch geringere

Schwankungsbreite als dasjenige der Milchzellen. Lediglich im Fall der viertägigen

Betrachtung konnten für zwei Parameter (Log Xm Bo139 und % Bo139 + CD14)

signifikante Unterschiede festgestellt werden.

Ergebnisse

92

4.3 Versuch 3: Untersuchungen zum Zelldifferentialbild auf der

Basis einer selektierten Tierauswahl


Wie zu Versuch 1 unter 4.1.1 beschrieben, erfolgte die Gruppeneinteilung anhand

des Zellgehaltes (SCC) im VAG. Die Einteilungskriterien sind unter 3.5.4.2.3 in

Tab.12 dargestellt. Auch in diesem Versuch wurden neben diesem Leitparameter der

Eutergesundheit noch andere Parameter in VAG und VGH untersucht.

Stichprobengröße n Viertel, Mittelwert X und Standardabweichung sd sind in Tab. 30

zusammengefaßt.

In den drei „eutergesunden“ Gruppen war ein Anstieg der Leitfähigkeit und des

Zellgehaltes in VAG von A über B1 zu C1 zu beobachten. Die NAGase-Aktivität im

VAG war in B1 am höchsten, der SCC VGH dagegen am niedrigsten. Die NAGase

im VGH war in allen Gruppen gleich groß. Mit einer Ausnahme (SCC VAG A/C1)

waren die Unterschiede dieser Kriterien zwischen eutergesunden Gruppen nicht

signifikant.

Die Differenzen zwischen den eutergesunden und den euterkranken sowie innerhalb

der euterkranken Gruppen waren bis auf wenige Ausnahmen signifikant. Die

Gruppen B2 und C2 unterschieden sich nur im Parameter elektrische Leitfähigkeit.

Dies war auch der einzige Parameter, der nicht in C3 sonder in C2 seinen höchsten

Wert erreichte. Auffällig war, daß der Anstieg der NAGase-Aktivität von B2 und C2 zu

C3 hin nicht signifikant war, also nicht den signifikanten Anstieg der Zellzahl

widerspiegelte. Die Signifikanzen sind einzeln in Tab. 30 aufgeschlüsselt.

Ergebnisse

93

C3

***

***

***

ns

ns

sd

0,18

0,24

0,28

0,32

0,41

0,32

C2

***

**

**

ns

B2

***

**

**

X

0,2

0,2

0,19

0,5

0,5

0,58

C1

ns

ns

B1

ns

LOG

NA

H V

GH

n 50

21

13

15

20

33

A

C3

***

***

***

ns

ns

sd

0,15

0,25

0,22

0,22

0,39

0,32

C2

***

**

***

ns

B2

*** * **

X

0,24

0,37

0,25

0,56

0,59

0,68

C1

ns

ns

B1

ns

LOG

NA

G V

AG

n 50

21

13

15

20

33

A

C3

***

***

***

**

**

sd

0,42

0,37

0,57

0,28

0,35

0,52

C2

***

***

***

ns

B2

***

***

**

X

2,58

2,49

2,69

3,22

3,26

3,61

C1

ns

ns

B1

ns

LOG

SC

C V

GH

n 50

21

13

15

20

33

A

C3

***

***

***

***

***

sd

0,27

0,32

0,29

0,13

0,17

0,24

C2

***

***

***

ns

B2

***

***

***

X

4,35

4,45

4,54

5,36

5,36

5,89

C1 * ns

B1

ns

LOG

SC

C V

AG

n 50

21

13

15

19

33

A

C3

*** * ns

ns

*

sd

0,59

0,84

0,37

0,89

1,78

0,94

C2

***

***

***

**

B2

ns

ns

ns

X

5,66

5,78

5,82

6,11

7,11

6,41

C1

ns

ns

B1

ns

LF

n 50

21

13

15

20

33

A

Tab

. 30:

Sel

ektie

rte

Krit

erie

n de

r E

uter

gesu

ndhe

it in

Ver

such

3, G

rupp

en A

, B1

und

C1

A

B1

C1

B2

C2

C3

Sig

nifi-

kanz

en

A

B1

C1

B2

C2


Ergebnisse

94

Die vier hier beschriebenen Parameter zeigten eine hochsignifikante (p < 0,0001)

Korrelation mit SCC VAG als Leitparameter. Die elektrische Leitfähigkeit korrelierte

am schwächsten, die Zellzahl im VGH am stärksten. Die einzelnen

Korrelationskoeffizienten können Tab. 31 entnommen werden.

Tab. 31: Korrelationskoeffizienten der selektierten Kriterien der Eutergesundheit mit SCC VAG in Versuch 3

Kriterium LF SCC VGH NAGase VAG NAGase VGH

k 0,39131 0,76422 0,63146 0,57559


4.3.2 Mikroskopisches Zelldifferentialbild in Milch

Wie in Versuch 1 wurde das Zelldifferentialbild der ZSM anhand von Ausstrichen

erhoben, die mit der „Kaffeemühle“ hergestellt worden sind. Die Zellen wurden in

PMN, Lymphozyten, Makrophagen und Epithelzellen differenziert. Da aber nur in

einem Bruchteil der Ausstriche Epithelzellen gefunden wurden, wurden sie in der

Auswertung nicht berücksichtigt.

Für Milch aus eutergesunden Vierteln (A) wurde folgendes Zelldifferentialbild

ermittelt: ca. 34 % PMN, 25 % Lymphozyten (LYM) und 39 % Makrophagen (MAK).

Schon von A über B1 zu C1 ließ sich eine Verdopplung des Anteils der PMN und

eine entsprechende Abnahme von Lymphozyten und Makrophagen beobachten. Die

Gruppen C1, B2 und C2 lagen jeweils mit allen Zellarten in etwa auf dem gleichen

Niveau, während zu C3 hin eine weitere Erhöhung (PMN) bzw. Abnahme (LYM und

MAK) der Anteile stattfand. Bei hochgradiger Mastitis (C3) wurde folgendes

Zelldifferentialbild gefunden: ca. 80 % PMN, 7 % LYM und 13 % MAK.

Ergebnisse

95

Im Gegensatz zu Versuch 1 zeigten hier auch die Makrophagen Veränderungen in

Abhängigkeit von der Eutergesundheit.

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

% PMN ZSM % LYM ZSM % MAK ZSM

%

A

B1

C1

B2

C2

C3

Abb.8: Zelldifferentialbild der Milch unter Berücksichtigung der Eutergesundheit in

Versuch 3

Tab.32: Signifikanzen (p-Werte) der Zellarten zwischen den Gruppen in Versuch 3

% PMN % LYM % MAK

A B1 C1 B2 C2 C3 A B1 C1 B2 C2 C3 A B1 C1 B2 C2 C3

A ns *** *** *** *** *** *** *** *** *** ns ** * *** ***

B1 ns *** *** *** ns * ns ** * ** *** ***

C1 ns ns ** ns ns * ns ns ns

B2 ns ns ns ns ns ns

C2 ns ns ns

Allg. *** *** ***


Ergebnisse

96

A unterschied sich im Anteil der Lymphozyten signifikant von allen anderen Gruppen,

für PMN und Makrophagen war nur die Differenz zwischen A und B1 nicht signifikant.

Auch B1 hatte nur wenige nicht signifikante Abweichungen von den anderen

Gruppen. Die Unterschiede zwischen C1 und B2 sowie C2 waren überwiegend nicht

signifikant. Die Einzelheiten hierzu sind in Tab. 32 dargestellt.

Die PMN korrelierten positiv, Lymphozyten und Makrophagen negativ mit SCC VAG.

Alle Zellarten zeigten hochsignifikante (p < 0,0001) Korrelationen, wobei die der PMN

am stärksten und die der Makrophagen am schwächsten war. Die einzelnen

Korrelationskoeffizienten sind in Tab. 33 dargestellt.

Tab. 33: Korrelationskoeffizienten der einzelnen Zellarten mit SCC VAG

Zellart PMN Lymphozyten Makrophagen

k 0,65019 - 0,56160 - 0,48742


4.2.3 Mikroskopisches Zelldifferentialbild des Blutes

Das mikroskopische Zelldifferentialbild des Blutes wurde im Klinischen Labor der

Klinik für Rinderkrankheiten im Rahmen der klinischen Labordiagnostik mit ermittelt.

Da nur ein Datensatz pro Tier und Untersuchungstag erhoben werden konnte,

wurden die Daten in drei und nicht in sechs Gruppen eingeteilt (siehe 3.5.4.2.3).

Ergebnisse

97

0

10

20

30

40

50

60

% PMN B % EOS B % LYM B % MON B

%

ABC

Abb.9 Zelldifferentialbild im Blut unter Berücksichtigung der Eutergesundheit in Versuch 3

Im Blut konnte analog zur Milch ein Anstieg der PMN und der Eosinophilen bzw. ein

Abfall der Lymphozyten und Monozyten beobachtet werden (siehe Abb. 9).

Signifikant (p < 0,05) war diese Veränderung allerdings nur zwischen A und C3 für

Eosinophile und Monozyten.

4.2.4 Durchflußzytometrische Parameter der Milchzellsuspension

Wie in Versuch 1 (siehe 4.1.3) wurden mit dem Durchflußzytometer für jeden

Antikörper die prozentuale Bindungsrate (%) und die Bindungshäufigkeit pro Zelle

(mittlere Fluoreszenzintensität Xm) bestimmt. In diesem Versuch wurden jedoch

zusätzlich zu den gegen Lymphozyten gerichteten Antikörpern noch zwei gegen

Phagozyten gerichtete eingesetzt: ein Antikörper gegen den LPS-Rezeptor CD14

sowie der gegen PMN gerichtete Antikörper Bo116. Im Gegensatz zu Versuch 1

wurde hier die prozentuale Vitalität aller in der Zellsuspension vorhandenen Zellen in

einem eigenen Ansatz unabhängig von der MIF gemessen.

Ergebnisse

98

Nicht für alle durchflußzytometrischen Parameter konnten Veränderungen in

Abhängigkeit von der Eutergesundheit gefunden werden.

Die Zellvitalität war in A, B1, C1 und C3 (!) mit 73 – 79 % auf einem niedrigeren

Niveau als in B2 und C2 (ca. 83%). Zwischen A und B2/C2 sowie C1 und C2 war

dieser Niveaunterschied auch signifikant.

CD4 hatte in A eine signifikant niedrigere Bindungsrate (20 %) und höhere

Bindungsintensität (log Xm 2,08) als in den meisten anderen Gruppen. Die

Bindungsrate stieg von A über B1 zu C1 und B2 (37 %) an, um in C2 und C3 wieder

abzufallen (siehe Abb. 10). Die Bindungsintensität zeigte dagegen einen

gleichmäßigen Abwärtstrend; C3 hatte einen signifikant niedrigeren Wert als A, B1

und B2.

Die Bindungsrate von CD8 zeigte grob betrachtet einen zu CD4 entgegengesetzten

Trend. A hatte den höchsten Wert (45 %), C3 den signifikant niedrigsten (35 %). Die

Bindungsintensität war dagegen in A signifikant am niedrigsten (Xm 641), während

sie sich in allen anderen Gruppen auf einem annähernd gleichen Niveau bewegte

(ca. 900).

Durch die Bildung des Quotienten % CD4/% CD8 wurde vor allem die Abstufung in

den Gruppen A, B1 und C1 verstärkt, wobei der Quotient in A den signifikant

niedrigsten Wert annahm.

Die γδ-T-Zellen schienen in den gesunden Gruppen einen größeren Anteil an der

Lymphozytenpopulation zu haben als in den kranken, dies konnte jedoch nicht

statistisch gesichert werden. Die Bindungsrate des Antikörpers an den T-Zellrezeptor

1 war in C2 und C3 signifikant niedriger als in A, B1 und C1, zeigte insgesamt aber

nur einen sehr schwachen Abwärtstrend.

Ergebnisse

99

Der prozentuale Anteil der mit CD8 und GB21A doppelt markierten Zellen reagierte

nicht auf Veränderungen der Eutergesundheit.

0

5

1015

20

25

30

3540

45

50

% CD4 % Bo116

%

AB1C1B2C2C3

Abb. 10: Veränderungen der prozentualen Bindungsrate von CD4 und Bo116 an Milchzellen unter Berücksichtigung der Eutergesundheit

Für die Bo116 markierten PMN konnte ein mit dem mikroskopischen

Zelldifferentialbild vergleichbarer Anstieg der Bindungsrate von 5 % auf 24 %

festgestellt werden (siehe Abb. 10), der in weiten Teilen statistisch gesichert werden

konnte. Die Bindungsintensität nahm im Gegensatz dazu signifikant von Xm 118 auf

Xm 33 ab.

MHC II (Bo139) zeigte weder in der Bindungsrate noch in der Bindungsintensität eine

Abhängigkeit von der Eutergesundheit.

Ergebnisse

100

Der LPS-Rezeptor (CD14) wurde in B1 (25 %) auf signifikant mehr Zellen exprimiert

als in A (19 %). In C3 (12 %) wurde er, ebenfalls signifikant, am seltensten

nachgewiesen. In seiner Expressionsdichte waren keine nennenswerten

Schwankungen zu beobachten.

Die gegen MHC II und CD14 doppelt markierten Zellen waren in A und B1 (3 %)

etwa gleich oft zu finden, während sie in den anderen Gruppen (1 %) signifikant

seltener vorkamen.

In Tabb. 34a+b können alle oben kurz dargelegten Ergebnisse in Form von

Stichprobengröße n Viertel, Mittelwert X und Standardabweichung sd nachgelesen

werden. Die Ergebnisse der Varianzanalyse (Signifikanzen) sind in Tabb. 35a+b

dargestellt.

Ergebnisse

101

Tab. 34a: Durchflußzytometrisches Zelldifferentialbild in Versuch 3, Gruppen A, B1 und C1

Gruppe A B1 C1

Parameter n X sd n X sd n X sd

% VIT 46 73,46 13,01 21 79,10 10,44 13 73,90 21,90

% CD4 49 20,43 9,05 21 28,77 7,09 11 36,80 10,57

Log Xm CD4 49 2,08 0,16 21 2,00 0,10 11 1,99 0,09

% CD8 49 45,38 13,73 21 43,07 12,36 13 38,26 13,44

CD8 Xm 49 641,15 448,89 21 857,24 533,84 13 920,75 448,78

%CD4/%CD8 49 0,50 0,29 21 0,76 0,40 11 1,14 0,67

Log % γδ 49 1,00 0,41 21 1,03 0,50 10 1,06 0,34

Log Xm γδ 49 2,25 0,16 21 2,29 0,24 10 2,15 0,16

Log % CD8+γδ 46 0,57 0,47 21 0,65 0,19 11 0,77 0,31

% Bo116 50 5,29 5,36 21 10,13 7,50 13 12,61 11,53

Xm Bo116 50 118,55 76,88 21 105,48 33,75 13 48,61 25,38

% Bo139 50 7,02 5,49 21 7,96 5,10 11 7,54 4,83

Log Xm Bo139 49 2,25 0,24 21 2,27 0,23 11 2,32 0,28

% CD14 50 19,36 10,56 21 24,51 11,23 13 19,51 8,41

Log Xm Cd14 50 2,85 0,20 21 2,98 0,15 13 2,87 0,16

% Bo139+CD14 50 2,66 2,77 21 2,72 1,40 11 0,65 0,30

Ergebnisse

102

Tab. 34b: Durchflußzytometrisches Zelldifferentialbild in Versuch 3, Gruppen B2, C2 und C3

Gruppe B2 C2 C3


% VIT 15 82,84 7,55 20 84,49 7,83 33 78,44 19,94

% CD4 15 37,90 11,71 20 32,94 7,40 33 33,18 7,27

Log Xm CD4 15 2,03 0,07 20 1,98 0,11 33 1,91 0,14

% CD8 15 41,79 13,70 20 42,73 15,26 32 34,74 14,34

CD8 Xm 15 1023,19 442,21 20 886,57 363,19 32 936,32 319,74

%CD4/%CD8 15 1,03 0,50 20 0,96 0,32 32 1,16 0,67

Log % γδ 15 0,88 0,14 20 0,90 0,20 31 0,88 0,19

Log Xm γδ 15 2,28 0,28 20 2,12 0,16 31 2,10 0,18

Log % CD8+γδ 15 0,56 0,15 19 0,64 0,19 32 0,52 0,28

% Bo116 15 23,64 8,45 20 20,07 10,86 33 24,23 13,83

Xm Bo116 15 68,99 32,45 20 40,79 24,13 33 33,06 15,21

% Bo139 15 6,60 7,46 20 5,70 3,99 33 7,87 5,30

Log Xm Bo139 15 2,37 0,16 20 2,23 0,18 33 2,31 0,17

% CD14 15 16,53 5,92 20 17,12 6,77 33 12,10 6,12

Log Xm CD14 15 2,95 0,09 20 2,91 0,14 33 2,88 0,15

% Bo139+CD14 15 1,52 0,71 20 1,57 1,78 32 0,97 1,22

Ergebnisse

103

Tab.35a: Signifikanzen für die durchflußzytometrischen Parameter zwischen den Gruppen in Versuch 3

% Vit %

CD4 log Xm

CD4 %

CD8 Xm CD8

CD4%/CD8%

log % GB21A

log Xm GB21A

A/B1 ns *** * ns ns ** ns ns

A/C1 ns *** * ns ** *** ns ns

A/B2 * *** ns ns * *** ns ns

A/C2 ** *** ** ns * *** ns *

A/C3 ns *** *** *** ** *** ns **

B1/C1 ns *** ns ns ns ns ns ns

B1/B2 ns *** ns ns ns ns ns ns

B1/C2 ns ns ns ns ns ns ns **

B1/C3 ns ns * * ns ns ns ***

C1/B2 ns ns ns ns ns ns ns ns

C1/C2 * ns ns ns ns ns ns ns

C1/C3 ns ns ns ns ns ns ns ns

B2/C2 ns ns ns ns ns ns ns *

B2/C3 ns ns *** *** ns ns ns **


allgemein ns *** *** * * *** ns ***


Ergebnisse

104

Tab.35b: Signifikanzen für die durchflußzytometrischen Parameter zwischen den Gruppen in Versuch 3

Log % CD8+GB21A

% Bo116

Xm Bo116

% Bo139

Xm Bo139

% CD14

Log Xm CD14

% Bo139+CD14

A/B1 ns ns ns ns ns * ** ns

A/C1 ns *** *** ns ns ns ns **

A/B2 ns * *** ns ns ns * *

A/C2 ns *** *** ns ns ns ns *

A/C3 ns *** *** ns ns *** ns ***

B1/C1 ns ns ** ns ns ns ns **

B1/B2 ns *** * ns ns ** ns ns

B1/C2 ns ** *** ns ns ** ns ns

B1/C3 ns *** *** ns ns *** * **

C1/B2 ns ** ns ns ns ns ns ns

C1/C2 ns * ns ns ns ns ns ns

C1/C3 ns *** ns ns ns * ns ns

B2/C2 ns ns ns ns ns ns ns ns

B2/C3 ns ns * ns ns ns ns ns

C2/C3 ns ns ns ns ns * ns ns

allgemein ns *** *** ns ns *** * ***


Ergebnisse

105

Die Korrelation der Parameter des durchflußzytometrischen Zelldifferentialbildes und

der Zellvitalität mit dem Leitparameter der Eutergesundheit SCC VAG gab ein

ähnliches Bild wie die zuvor beschriebene Varianzanalyse. Bo 116 korrelierte mit

beiden Größen am stärksten, gefolgt von CD4. Einige Parameter zeigten noch eine

schwache Korrelation, während für Bo139 und log Xm CD14 überhaupt kein

Zusammenhang mit der Zellzahl gefunden werden konnte. Die einzelnen

Korrelationskoeffizienten und Signifikanzen sind in Tabb. 36a-c aufgeführt.

Tab.36a: Korrelationskoeffizienten für die durchflußzytometrischen Parameter in Versuch 3

Parameter % Vit % CD4 log Xm CD4 % CD8 Xm CD8

CD4%/CD8%

k 0,18647 0,42408 -0,33296 -0,18162 0,27795 0,36620

Signifikanz * *** *** * *** ***



Tab.36b: Korrelationskoeffizienten für die durchflußzytometrischen Parameter in Versuch 3

Parameter log %

GB21A log Xm GB21A

Log % CD8+GB2

1A % Bo116

Xm Bo116

k - 0,34718 - 0,23218 - 0,19541 0,64215 - 0,52980

Signifikanz *** ** * *** ***



Ergebnisse

106

Tab.36c: Korrelationskoeffizienten für die durchflußzytometrischen Parameter in Versuch 3

Parameter %

Bo139 Xm

Bo139 % CD14 Log Xm CD14

% Bo139+C

D14

k 0,02527 0,11580 - 0,29728 0,02993 - 0,29013

Signifikanz ns ns *** ns ***



Wie in Versuch 1 konnten auch in diesem Versuch im mikroskopischen wie im

durchflußzytometrischen Zelldifferentialbild der Milch Veränderungen in Abhängigkeit

von der Eutergesundheit beobachtet werden.

4.2.5 Durchflußzytometrische Parameter der Blutzellsuspension

Es wurden die gleichen Parameter wie in der Milchzellsuspension erhoben und

hinsichtlich ihrer Veränderungen in Abhängigkeit von der Eutergesundheit analysiert

Die Vitalität war in A leicht niedriger als in B und C.

Die Bindungsrate von CD4 hatte in B den höchsten Wert (22 %), während die

Bindungshäufigkeit von A (Xm 113) über B zu C (Xm 77) abfiel. Die Unterschiede zu

A konnten statistisch gesichert werden. Die Häufigkeit CD8 positiver Zellen fiel von A

(21 %) zu C (15 %) ab, die Fluoreszenzintensität nahm dagegen zu. Der Quotient

% CD4/% CD8 stieg mit zunehmender Beeinträchtigung der Eutergesundheit an.

Die Häufigkeit der γδ-T-Zellen schwankte um 10 %, die Häufigkeit des TCR1 auf der

einzelnen Zelle nahm von A zu C ab. Die Differenz zwischen A und C war signifikant.

Ergebnisse

107

Die CD8 und TCR1 doppelt positiven Zellen konnten in C nicht nachgewiesen

werden, in A waren sie seltener als in B.

Der Anteil der mit Bo116 markierten PMN nahm von A (25 %) zu B und C (36 %)

signifikant zu, während im Gegenzug die Bindungshäufigkeit dieses Antikörpers von

A (Xm 76) zu C (Xm 30) signifikant abnahm.

MHC II (Bo139) wurde in A am seltensten (40 %), in C signifikant am häufigsten

(50 %) exprimiert, die mittlere Fluoreszenzintensität zeigte dagegen keine

Schwankungen.

Der Anteil der Zellen mit LPS-Rezeptor (CD14) bewegte sich in allen Gruppen um

4%, die Häufigkeit dieses Rezeptors auf der einzelnen Zelle veränderte sich

ebenfalls kaum.

Die Zellpopulation, die MHC II und CD14 auf ihrer Oberfläche trägt, war in A

signifikant am größten (5 %), in B und C ungefähr auf gleichem Niveau (1 %).

Die Ergebnisse sind im einzelnen in der gleichen Form wie bisher in Tab. 37

dargestellt, die Signifikanzen in Tabb. 38a+b.

Ergebnisse

108

Tab. 37: Durchflußzytometrische Parameter der Blutzellsuspension in Versuch 3

Gruppe A B C


% VIT 12 95,27 4,11 9 98,12 1,10 16 97,44 4,05

% CD4 13 16,62 8,00 9 22,14 10,82 16 15,65 7,06

Xm CD4 13 113 59 9 80 16 16 77 19

% CD8 13 20,97 8,82 9 19,96 7,33 16 15,06 7,18

Xm CD8 13 469 257 9 562 322 16 624 240

% CD4/%CD8 13 0,88 0,54 9 1,21 0,60 16 1,21 0,61

Log % γδ 13 0,97 0,30 9 1,12 0,13 16 1,06 0,16

Log Xm γδ 13 2,38 0,18 9 2,29 0,18 16 2,23 0,11

Log % CD8+γδ 12 0,24 0,23 9 0,41 0,28 16 0,00 0,31

% Bo116 13 25,39 10,60 9 35,43 8,58 16 36,86 7,36

Xm Bo116 13 76 65 9 51 22 16 30 10

% Bo139 13 40,34 8,91 9 43,68 10,77 16 49,87 11,55

Log Xm Bo139 13 2,15 0,14 9 2,12 0,16 16 2,10 0,11

% CD14 12 4,50 5,41 9 3,73 1,62 17 4,90 2,74

Log Xm CD14 12 2,39 0,15 9 2,34 0,10 17 2,34 0,09

% Bo139+CD14 13 4,68 5,21 9 1,79 1,47 16 1,39 1,18

Ergebnisse

109

Tab.38a: Signifikanzen für die durchflußzytometrischen Parameter des Blutes zwischen den Gruppen in Versuch 3

% Vit %

CD4 log Xm

CD4 %

CD8 Xm CD8

CD4%/CD8%

log % GB21A

log Xm GB21A

A/B ns ns * ns ns ns ns ns

A/C ns ns * ns ns ns ns *

B/C ns ns ns ns ns ns ns ns


Tab.38b: Signifikanzen für die durchflußzytometrischen Parameter des Blutes zwischen den Gruppen in Versuch 3

Log % CD8+GB21A

% Bo116

Xm Bo116

% Bo139

Xm Bo139

% CD14

Log Xm CD14

% Bo139+CD14

A/B ns * ns ns ns ns ns *

A/C * * * * ns ns ns *

B/C * ns ns ns ns ns ns ns


Diskussion

110

5. DISKUSSION

Ziel dieser Arbeit war der direkte Vergleich der mikroskopischen mit der

durchflußzytometrischen Zelldifferenzierung. Darüber hinaus sollte die

Aussagefähigkeit des mikroskopischen und des durchflußzytometrischen

Zelldifferentialbildes in Blut und Milch hinsichtlich einer Entzündung der bovinen

Milchdrüse untersucht werden. Gemäß diesen Vorgaben werden nachfolgend die

Ergebnisse der Versuche kritisch diskutiert.

5.1 Versuch 1: Orientierende Untersuchungen auf der Basis

einer randomisierten Tierauswahl


Die durchschnittliche Zellzahl (SCC) im VAG der Gruppe A lag mit ca. 11.000

Zellen/ml deutlich unter dem Modalwert von 20.000 – 50.000 Zellen/ml, der dem

Zellgehalt von Milch aus Milchdrüsen mit normaler Sekretion entspricht

(DOGWEILER u. HESS 1983, HAMANN u. REICHMUTH 1990). Auch die

logarithmierte NAGase-Aktivität (NAGase) in VAG (0,39) und VGH (0,40) lag

innerhalb der von GRABOWSKI (2000) ermittelten physiologischen Referenz von

0,31 +/- 0,19. Die elektrische Leitfähigkeit (LF) war mit 6,27 mS/cm im Vergleich zu

den Literaturangaben, in denen Werte < 6 mS/cm genannt werden, erhöht (HAMANN

u. ZECCONI 1998, GRABOWSKI 2000). Sie lag jedoch unterhalb des von HAMANN

(1999) vorgeschlagenen Grenzwertes von 6,5 mS/cm.

Augrund der Übereinstimmung der Werte der Gruppe A, in der die Kühe auf allen

Vierteln als eutergesund eingestuft wurden, mit den Literaturangaben erschien es

gerechtfertigt, innerhalb der eigenen Untersuchungen die Gruppe A als Referenz für

die übrigen Gruppen einzusetzen.

Diskussion

111

Gemessen an dieser Referenz konnte für SCC VGH sowie NAGase in VAG und

VGH im Falle einer Euterentzündung (Gruppen BC2 und C3) eine Erhöhung der

Werte festgestellt werden (siehe Tab. 11). Diese Beobachtung steht in Einklang mit

den Beobachtungen von SCHÜTTEL (1999), PICCININI et al. (1999) und

GRABOWSKI (2000). Bemerkenswert ist, daß die als gesund eingestuften Viertel

euterkranker Kühe (BC1) im Vergleich zur Referenz (A) einen signifikant erhöhten

logarithmierten SCC VAG von 4,40 aufwiesen. Ähnliches wurde schon im Rahmen

experimenteller Infektionen mit E. coli und S. aureus beobachtet (WEVER u.

EMANUELSON 1989, BURVENICH et al. 1994, LEITNER et al. 1995). SCC VAG

sowie NAGase VAG und VGH zeigten ein ähnliches Verhalten, das jedoch nicht

statistisch gesichert werden konnte. Für den Parameter NAGase wurde dies schon

von SCHÜTTEL (1999) beschrieben und von EBLING et al. (2001) bestätigt. Die

elektrische Leitfähigkeit in Gruppe BC1 (6,28 mS/cm) unterschied sich nicht von der

Referenz A (6,27 mS/cm) und nur C3 (8,13 mS/cm) zeigte einen signifikant erhöhten

Wert. Diese im Vergleich zum Zellgehalt geringere diagnostische Aussagefähigkeit

wurde bereits dokumentiert (HAMANN u. GYODI 1999). Die mehr als 70%-ige

Übereinstimmung der Werte für die Parameter elektrische Leitfähigkeit, NAGase-

Aktivität und Zellzahl gesunder Euterviertel von insgesamt eutergesunden Kühen und

denen euterkranker Tiere (GRABOWSKI 2000) wird durch die eigenen Ergebnisse

nicht in Frage gestellt. Für die Bewertung dieser Parameter hinsichtlich der

Eutergesundheit erscheint eine solche Betrachtung jedoch wenig hilfreich zu sein.

Die signifikanten Korrelationen der hier dargestellten Parameter elektrische

Leitfähigkeit (k = 0,54) und NAGase (k = 0,69) mit SCC VAG (siehe Tab. 13)

bestätigen die Ergebnisse von GRABOWSKI (2000).

5.1.2 Mikroskopisches Zelldifferentialbild

Obwohl das für Gruppe A ermittelte Zelldifferentialbild von 37 % PMN, 46 %

Lymphozyten und 17 % Makrophagen in deutlichem Widerspruch zu den

Literaturangaben steht (siehe 2.2.4, Tab. 2), wurde es als Referenz für „normale

Diskussion

112

Sekretion“ eingesetzt. Da die selektierten Kriterien der Eutergesundheit wie unter

5.1.1 dargelegt durchaus der physiologischen Norm entsprachen, wurde vermutet,

daß der überhöhte Anteil der Lymphozyten und der sehr niedrige Anteil der

Makrophagen technisch bedingt waren. Die Vergleichbarkeit der Zelldifferenzierung

innerhalb dieses Versuches war dennoch gegeben, weil alle Ausstriche mit der

gleichen Technik hergestellt und ausgewertet wurden.

Die Dominanz des Anteils der PMN in den Gruppen BC2 und C3 stimmte mit den

Literaturangaben überein (siehe 2.2.5), auch wenn sie deutlich geringer ausfiel. Dies

könnte daran gelegen haben, daß vor allem Tiere mit chronischen Mastitiden beprobt

wurden, bei denen ein höherer Anteil mononukleärer Zellen zu erwarten ist (siehe

2.2.5). Die überwiegende Beprobung chronischer Mastitiden ist auch ein möglicher

Grund, warum die Korrelation von SCC VAG mit PMN und Lymphozyten deutlich

schwächer ausfiel als mit den selektierten Kriterien der Eutergesundheit.

Analog zu den Gruppen BC2 und C3 konnten auch in BC1 für PMN und

Lymphozyten Veränderungen beobachtet werden (siehe Abb. 4), die als eine

Reaktion dieser als gesund eingestuften Milchdrüsen auf die Erkrankung

benachbarter Viertel gewertet werden könnte. Bisher konnte eine solche

Beeinflussung des Zelldifferentialbildes durch ein infiziertes Nachbarviertel nicht

dokumentiert werden (WEVER u. EMANUELSON 1989).

5.1.3 Durchflußzytometrische Parameter

Auch für diese Parameter wurde der Einfluß von Mastitiden anhand der Werte der

Gruppe A bestimmt. Die eigenen Referenzwerte in die Literatur einzuordnen war nur

sehr bedingt möglich, da die Angaben z.T. stark voneinander abweichen (siehe

2.3.3.2, Tab. 3).

Diskussion

113

5.1.3.1 Zellvitalität

Der Anteil vitaler Zellen in der ZSM war in an Mastitis erkrankten Vierteln (Gruppen

BC2 und C3) signifikant erhöht (p < 0,05), in den benachbarten, als gesund

eingestuften Milchdrüsen konnte der Anstieg der Zellvitalität nicht statistisch

gesichert werden. Sowohl die Größenordnung des Anteils vitaler Zellen (40 – 60 %)

als auch die Erhöhung dieses Anteils im Rahmen einer Mastitis bestätigten die

Befunde von PICCININI et al. (1999). Für den prozentualen Anteil vitaler Zellen in der

ZSM wird je nach Laktationsabschnitt ein Bereich von 25 – 80 % angegeben. In der

Frühlaktation treten die niedrigsten und in der Spätlaktation die höchsten Werte auf

(VANGROENWEGHE et al. 2000). Der SCC, der für die untersuchte Milch als

physiologischer Grenzwert eingesetzt wurde, lag mit 200.000 Zellen/ml deutlich über

der physiologischen Norm (siehe 2.1.1), und das Infektionsalter sowie der bisherige

Infektionsverlauf der untersuchten Kühe waren nicht bekannt. Daher ist davon

auszugehen, daß die erhöhten Werte in der Spätlaktation mit der erhöhten

Mastitisinzidenz in diesem Zeitraum im Zusammenhang standen. Der große Anteil

vitaler Zellen in der Milch spiegelt vermutlich den während einer Entzündung

erhöhten Zellinflux ins Euter wider, durch den der Anteil von Zellen, die sich erst kurz

im relativ unwirtlichen Milieu der Milch befinden, vergrößert ist. Entscheidender als

die Zellvitalität für die Einschätzung der Abwehr des Euters wäre allerdings die

direkte Untersuchung der Zellfunktionen wie Phagozytose oder die Bildung radikaler

Sauerstoffspezies (siehe 2.4.1 und 2.4.3.3).

Das Datenmaterial des Versuchs 1 war nicht umfangreich genug, um es hinsichtlich

des Laktationseinflusses auszuwerten.

5.1.3.2 CD4 und CD8

Für die als Referenz betrachteten Anteile der CD4+ (35 %) und CD8+ (37 %) T-Zellen

(Gruppe A) konnten in der Literatur entsprechende Werte gefunden werden (siehe

Diskussion

114

2.3.3.2, Tab. 3). Die Werte der mittleren Fluoreszenzintensität (Xm) waren nicht

vergleichbar, da sie vom Durchflußzytometer und dessen Einstellungen abhängen.

Entgegen den Literaturangaben (siehe 2.3.4.2), die auch Untersuchungen über

natürliche Infektionen einschließen, konnten unter Berücksichtigung der

Eutergesundheit für keine dieser beiden Subpopulationen Veränderungen

beobachtet werden. Dies könnte daran gelegen haben, daß eventuell sehr

unterschiedliche Infektionsstadien und Erregerarten in den Mastitisgruppen

zusammengefaßt wurden, deren unterschiedliche Zelldifferentialbilder sich im

Mittelwert aufhoben. Für eine durch Staphylokokken verursachte Mastitis ist belegt,

daß sich das Verhältnis CD4+/CD8+ T-Zellen im Vergleich zur normalen Sekretion

umkehrt. Sind Streptokokken das zugrundeliegende Agens, so überwiegen wie im

physiologischen Eutersekret die CD8+ T-Lymphozyten (LEITNER et al. 1995,

SOLTYS u. QUINN 1999).

5.1.3.3 WC1

Schon der als Referenz verwendete logarithmierte prozentuale Anteil der WC1+ T-

Zellen von 0,26 lag unter dem niedrigsten in der Literatur genannten Wert von 0,69

(RIOLLET et al. 2001). Im Falle einer hochgradigen Mastitis (Gruppe C3) sank er

sogar auf –0,01 ab. Andere Untersucher haben dagegen einen Anstieg der WC1+

Zellpopulation beobachtet (SOLTYS u. QUINN 1999, RIOLLET et al. 2001). Neben

den unter 5.1.3.2 aufgeführten Gründen für die Differenzen zwischen den eigenen

Ergebnissen und den in der Literatur genannten Daten könnte auch die Tatsache

eine Rolle spielen, daß in den veröffentlichten Studien Antikörper aus anderen

Zelllinien eingesetzt wurden, die trotz gleicher Spezifität ein abweichendes

Bindungsverhalten zeigen.

Unabhängig von diesen Überlegungen bleibt jedoch festzuhalten, daß ein Antikörper

gegen WC1 entgegen der Praxis einiger Untersucher (VAN KAMPEN et al. 1999,

RIOLLET et al. 2001) nicht für die Untersuchung der γδ-T-Zellen der Milch geeignet

Diskussion

115

ist. WC1+ Zellen stellen eine in der Milch nur in geringen Mengen nachweisbare

Subpopulation dar und dürfen nicht mit den γδ-T-Zellen gleichgesetzt werden.

Die Literaturangaben zu dieser Zellart sind in Tab. 39 zusammengefaßt.

Tab. 39: Vorkommen von γδ-T-Zellen in Milch

Quelle WC2 WC1

Morrison et al. 1991 WC1+ und WC2+ Zellen haben eine ähnliche Gewebeverteilung im Körper

Okada et al. 1993 WC2 = TCR1 = γδ-T-Zellrezeptor

Struktur auf der Oberfläche von γδ-T-Zellen

Wyatt et al. 1994, Machugh et al. 1997

kommt nur sehr selten auf den γδ-T-Zellen in der Milch vor

Soltys u. Quinn 1999 8 % der Leukozyten in der Milch sind γδ-T-Zellen

Van Kampen et al. 1999 3 – 9 % der T-Zellen in der Milch sind WC1+

Asai et al. 2000 29 % der Lymphozyten in der Milch TCR1+, davon 13 % CD8+

Riollet et al. 2001

normale Sekretion: 5 % der Lymphozyten WC1+; Mastitis: 7 % der Lymphozyten WC1+

Da also in der Milch die WC1+ Zellen nicht mit den γδ-T-Zellen gleichzusetzen sind,

konnte der in den eigenen Untersuchungen beobachtete Anstieg des Anteils CD8+

WC1+ Zellen im Mastitisfall nicht mit den Literaturangaben über CD8+ γδ-T-Zellen

verglichen werden. Zu CD8+ WC1+ Zellen in Milch wurden keine Veröffentlichungen

gefunden.

Diskussion

116

5.1.3.4 MHC II

Der als Referenz eingesetzte Anteil MHC II+ Zellen aus Gruppe A (2,43 %) war

niedriger als der in der Literaturangabe genannte (6 %), aber die beobachtete

Zunahme dieser Zellpopulation durch eine Euterentzündung steht ebenso mit der

Literatur in Einklang wie die unveränderte Expressionsdichte (RIOLLET et al. 2001).

Die Niveauunterschiede könnten erneut durch die Herkunft der eingesetzten mAk

von verschiedenen Zellklonen bedingt sein (siehe 5.1.3.3).

5.1.4 Folgerungen zu Versuch 1

Insgesamt betrachtet waren die eingesetzten mikroskopischen und

durchflußzytometrischen Techniken geeignet, Aussagen über das Zelldifferentialbild

unter Berücksichtigung der Eutergesundheit zu treffen. Um die Vergleichbarkeit mit

den Literaturangaben zu verbessern, sollte die Methodik zur Herstellung der

mikroskopischen Ausstriche überprüft und gegebenenfalls modifiziert werden. Auch

der Bereich der Probenahme und der dabei verwendeten Gefäße sollte beachtet

werden. Im Bereich der Durchflußzytometrie könnte durch den Einsatz eines

geeigneten Antikörpers gegen TCR1 und ein insgesamt breiteres

Antikörperspektrum, das auch die Phagozyten mit umfaßt, die Aussagefähigkeit

optimiert werden.

Trotz der technischen Mängel ließ sich ein erster gemeinsamer Trend erkennen: Die

vier Viertel eines Euters zeigten eine funktionelle Abhängigkeit voneinander. Eine

ausführliche Diskussion dieses Aspektes erfolgt unter 5.3.6.

Diskussion

117

5.2 Versuch 2: Methodische Fragestellungen

5.2.1 Einfluß des Probenahmegefäßes und des Untersuchers auf das

mikroskopische Zelldifferentialbild


Die Makrophagen als vorrangig unspezifische Phagozyten zeigen eine starke

Adhäsion, sogar an Stoffe mit glatten Oberflächen wie Glas. Diese Eigenschaft wird

zur Charakterisierung und Isolierung von Makrophagen genutzt (LEE et al. 1980,

MIELKE 1980, DESIDERIO u. CAMPBELL 1980, ELLIS et al. 1988). Kunststoff mit

seiner im Vergleich zu Glas rauheren Oberfläche gibt den Makrophagen noch mehr

Anlagerungsmöglichkeiten. So wurde bei einer vergleichenden Untersuchung über

die Anhaftung von Peritonäalzellen der Ratte an Glas und Plastik nachgewiesen, daß

diese Zellen tendenziell stärker an Plastik adhärieren. Zusätzlich zeigte sich, daß an

Glas anhaftende Makrophagen eine größere Kapazität hatten, verschiedene Partikel

zu binden, als Makrophagen auf einer Plastikoberfläche (GARROUSTE et al. 1982).

Vor diesem Hintergrund wurde untersucht, ob das Material des Probenahmegefäßes

sich auf das Zelldifferentialbild auswirkt.

Der Einfluß des Materials des Probenahmegefäßes beschränkte sich auf die

Phagozyten, insbesondere die Makrophagen. In den in Kunststoffgefäßen

transportierten Milchproben wurden signifikant (p < 0,05) weniger Makrophagen, in

einem Fall auch PMN, gefunden als in den Proben aus Glasflaschen. Dieses

Ergebnis, ebenso wie die zuvor dargelegte Neigung der Makrophagen zur Adhäsion,

läßt sich durch die Funktion dieser Zellarten, der Phagozytose, erklären. Um

überhaupt etwas aufnehmen zu können, müssen sich diese Zellen an das Partikel

anlagern. Dieser Prozeß wird zwar durch die Opsonisierung unterstützt, ist aber nicht

von ihr abhängig, wie die Phagozytose von Fett und Eiweiß in Milch zeigt (siehe

2.4.1 und 2.4.2).

Diskussion

118

5.2.1.2 Einfluß des Untersuchers

Auch der Einfluß des Untersuchers auf das Zelldifferentialbild stellte sich als

signifikant (p < 0,05) heraus. Der starke Unterschied zwischen den Ergebnissen

bestätigte die praktische Erfahrung vieler Laboratorien, daß nur Zelldifferentialbilder,

die von demselben Untersucher ermittelt wurden, miteinander verglichen werden

können. Daher sollten mikroskopische Untersuchungen nur von einer Person

durchgeführt werden. Untersuchungsergebnisse aus verschiedenen Instituten

können nicht miteinander verglichen werden (DILBAT 1963, DULIN et al. 1982).

Schon die alleinige mikroskopische Zellzählung wird stark subjektiv beeinflußt, und

es kommen Variationskoeffizienten bis 19 % vor (TOLLE et al. 1971, KITCHEN

1981).

5.2.2 Einfluß des Probenahmegefäßes und des Antikörpers auf das



Aufgrund des signifikanten Einflusses des Gefäßmaterials auf die mikroskopische

Zelldifferenzierung wurde beispielhaft anhand von vier gegen Lymphozyten

gerichteten Antikörpern untersucht, ob auch die durchflußzytometrische

Zelldifferenzierung durch den Faktor Material beeinflußt wird. Es wurden Antikörper

(CD4-S und WC1) ausgewählt, die in Versuch 1 ein unerwartetes Verhalten gezeigt

hatten, sowie jeweils ein Alternativantikörper (CD4-I und GB21A). Die Lymphozyten

waren den durch Adhäsion aktivierten Makrophagen und den von ihnen

ausgeschütteten Mediatoren nur kurze Zeit ausgesetzt. Daher waren im

durchflußzytometrischen Zellbild keine Veränderungen zu erwarten, was durch

diesen Versuch bestätigt wurde.

Diskussion

119

5.2.2.2 Einfluß des Antikörpers

In Anbetracht der unerwarteten Ergebnisse der durchflußzytometrischen

Lymphozytendifferenzierung in Versuch 1 wurde das Bindungsverhalten zweier

Antikörper mit dem von Alternativantikörpern verglichen. Für die Oberflächenstruktur

CD4 wurde ein von einem anderen Zellklon produzierter Antikörper mit gleicher

Spezifität eingesetzt, während für die Zielzellart γδ-T-Zellen die Alternative zum mAk

gegen WC1 in einem direkt gegen den TCR1 gerichteten Antikörper bestand. Es

stellte sich heraus, daß CD4-S und GB21A signifikant (p < 0,05) höhere

Bindungsraten an aus Milch isolierte Lymphozyten zeigten als der jeweilige

Vergleichsantikörper.

Der Antikörper CD4-I lag mit einer durchschnittlichen Bindungsrate von 5 % weit

unter den in der Literatur genannten Werten und erschien daher ungeeignet für die

Analyse von Milchlymphozyten. Wenn auch in Veröffentlichungen keine Angaben

über das Bindungsverhalten verschiedener Antikörper gegen CD4 an aus Milch

isolierten Zellen gefunden wurden, so gibt es doch Hinweise auf mögliche Ursachen

für Unterschiede. Anhand von aus Blut isolierten Lymphozyten wurde ein

Polymorphismus von CD4 beschrieben (MORRISON et al. 1991). Des weiteren

wurden bei der Analyse von 12 verschiedenen Antikörpern gegen CD4 Unterschiede

im Bindungsverhalten festgestellt (BENSAID u. HADAM 1991). In diese

Untersuchung wurden neben Lymphozyten aus Blut lediglich noch diejenigen aus

den peripheren lymphatischen Organen mit einbezogen, Lymphozyten aus dem

Euter dagegen nicht. Die Berücksichtigung anderer Organe bei der Analyse des

Bindungsverhaltens von Antikörpern zeigte jedoch, daß durch die selektive

Verteilung der Lymphozyten im Körper ausgehend von den Eigenschaften der

Blutlymphozyten Rückschlüsse auf andere Organe nicht ohne weiteres möglich sind.

Der Einsatz eines Antikörpers gegen WC1 zur Untersuchung von γδ-T-Zellen in Milch

wurde bereits unter 5.1.3.3 diskutiert. Mit dem gegen den TCR1 gerichteten

Antikörper GB21A konnte ein γδ-T-Lymphozytenanteil von 14 % nachgewiesen

Diskussion

120

werden, der sich damit im unteren Bereich der Literaturangaben bewegt (siehe

2.3.3.2).

5.2.3 Vergleich von Kieler Sedimentausstrich und Ausstrich der

Zellsuspension mit der „Kaffeemühle“

Durch Einsatz der „Kaffeemühle“ in Versuch 1 wurde versucht, die Zellen der ZSM

auf der relativ kleinen Fläche eines Deckgläschens zu konzentrieren. Mit dieser

Technik gelang es, relativ gut auszuwertende Ausstriche herzustellen, jedoch

standen die Ergebnisse im Widerspruch zu den Literaturangaben (siehe 5.1.2).

Daher wurde dieses Verfahren mit einem gebräuchlichen – dem Kieler

Sedimentausstrich (KSA) – verglichen. Neben der eigentlichen Ausstreichtechnik

unterschieden sie sich vor allem in der Anzahl der vorangegangenen

Zentrifugationen.

Unabhängig vom SCC der Milch wurden signifikant (p < 0,05) unterschiedliche

Differenzierungsergebnisse für PMN und Lymphozyten gefunden, bei einem SCC >

400.000 Zellen/ml auch für Makrophagen. Diese Unterschiede beruhten auf einer

Anreicherung der PMN bzw. einem Verlust der Lymphozyten in der ZSM. Mit beiden

Methoden konnten – parallelverschoben – Veränderungen des Zelldifferentialbildes

unter Berücksichtigung der Eutergesundheit beobachtet werden.

Ob nur der Direktausstrich von Milch ein unverfälschtes Bild der Milchzellen

ermöglicht (DILBAT 1967) oder der Sedimentausstrich vorzuziehen ist, war

umstritten (JÜRGENS 1939). Heute ist allgemein anerkannt, daß der Direktausstrich

von Milch keine geeignetes Routineverfahren ist, da gerade bei Milch mit niedrigem

Zellgehalt mehr Gesichtsfelder ausgezählt werden müssen und dennoch oft nicht

genügend Zellen für eine genaue Aussage gefunden werden (TOLLE et al. 1971,

KITCHEN 1981, DULIN et al. 1982). Daher wird das Sediment nach 10-minütiger

Zentrifugation von 10 ml Milch untersucht. Unterschiede gibt es lediglich in der

Methode, die Zellen auf einem Objektträger zu verteilen. Dies kann nach Art des

Diskussion

121

Blutausstriches geschehen, in dem 1 Tropfen Sediment auf den Rand eines

Objektträgers aufgetragen und mit einem zweiten Objektträger verteilt wird. Eine

weitere Möglichkeit ist der Kieler Sedimentausstrich, bei dem das Sediment mit einer

Öse verteilt wird (siehe 2.2.2.1). Die Cytospin-Zentrifuge konzentriert mit Hilfe der

Zentrifugalkraft die Zellen auf einer sehr begrenzten Fläche. Beim Vergleich der

Cytospinausstriche mit Direktausstrichen der Milch konnten keine signifikanten

Unterschiede festgestellt werden (DULIN et al. 1982).

Im Rahmen einer Dissertation wurde unter Berücksichtigung des Laktationsstadiums

das Zelldifferentialbild in verschiedenen durch Zentrifugation gewonnenen Fraktionen

untersucht (DILBAT 1967). Während im Sediment, im Rahm und in der Milch etwa

das gleiche Zelldifferentialbild beobachtete wurde, reicherten sich in der Magermilch

die großen mononukleären Zellen an (siehe Tab. 40). Angesichts einer weiteren

Untersuchung zu diesem Thema, bei der im Rahm nur Makrophagen nachgewiesen

wurden (LEE et al. 1980), liegt die Vermutung nahe, daß das Zelldifferentialbild durch

die Zentrifugation der Milch verändert wird.

Tab. 40: Prozentuale Verteilung der Zellen in verschiedenen durch Zentrifugation gewonnenen Milchfraktionen nach DILBAT 1967

Fraktion % Epithelzellen % PMN % Lymphozyten

Sediment 33 – 43 26 – 38 23 – 41

Magermilch 57 – 72 7 – 22 11 – 36

Rahm 39 – 56 17 – 44 17 – 27

Milch 38 – 49 16 – 38 23 – 34

Auch wenn keine weiteren Veröffentlichungen konkret zu diesem Thema gefunden

wurden, so sind doch mit unterschiedlichen Methoden ermittelte Zelldifferentialbilder

in der Literatur zu finden (siehe Tab. 2). Im Vergleich mit durchflußzytometrisch

ermittelten Zelldifferentialbildern (WEVER U. EMANUELSON 1989, ÖSTENSSON et

Diskussion

122

al. 1993) findet bei dem auf Zentrifugation basierenden Verfahren Cytospin eine

Anreicherung der Lymphozyten statt (MILLER et al. 1991), d.h. die Literaturangaben

ergeben ein den eigenen Ergebnissen widersprechendes Bild. Es läßt sich somit

keine Aussage treffen, ob die in der Literatur sowie in dieser Arbeit gefundenen

Unterschiede durch die Anzahl der Zentrifugationen oder andere Komponenten des

Ausstrichverfahrens bedingt sind. Es bleibt jedoch festzuhalten, daß die mit der

„Kaffeemühle“ in Kombination mit in Glasflaschen transportierten Milchproben

erzielten Ergebnisse den Literaturangaben entsprechen und die „Kaffeemühle“ daher

für weitere Untersuchungen die Methode der Wahl ist.

5.2.4 Untersuchungen zur Wiederholbarkeit der mikroskopischen und

durchflußzytometrischen Zelldifferenzierung

Mit diesem Versuchsaufbau sollte näherungsweise eine Aussage über die

technische Wiederholbarkeit der Methoden zur Zelldifferenzierung ermöglicht

werden. Die Probengewinnung und Verarbeitung der Milchvolumina, die für die

Zellgewinnung für Mehrfachansätze nötig gewesen wären, waren arbeitstechnisch

nicht durchführbar.

Da in Milch und Blut nur bei sehr wenigen Parametern Abweichungen gefunden

wurden, kann grundsätzlich von einer akzeptablen Wiederholbarkeit der Methoden

ausgegangen werden. Die Aussagefähigkeit dieser Analyse wurde jedoch durch die

Verteilung über mehrere Untersuchungstage eingeschränkt, da die untersuchten

Tiere einer sich laufend verändernden Umwelt ausgesetzt waren. Die

Umweltveränderungen spiegeln sich wiederum im Immunsystem wider. Daher sind

Veränderungen der untersuchten Parameter, die ja die Abwehrlage des

Immunsystems widerspiegeln, nicht zwangsläufig der Methode anzulasten. Vor allem

die signifikanten (p < 0,05) Veränderungen der Blutparameter sind auf diese

Zusammenhänge zurückzuführen.

Diskussion

123

5.2.5 Folgerungen aus Versuch 2

Milchproben für die mikroskopische Zelldifferenzierung sollten in Glasgefäßen

genommen werden, da Kunststoff zu einer Verringerung des Anteils der Phagozyten,

insbesondere der Makrophagen führt. Des weiteren können nur die durch denselben

Untersucher mit der identischen Methode ermittelten Zelldifferentialbilder miteinander

verglichen werden.

Bei der Auswahl der spezifischen monoklonalen Antikörper muß jeweils überprüft

werden, ob er für die Markierung von Milchzellen geeignet ist.

5.3 Versuch 3: Untersuchungen zum Zelldifferentialbild auf der

Basis einer selektierten Tierauswahl

Bei diesem Versuch wurde – soweit es das Tiermaterial zuließ – darauf geachtet,

durch gezielte Auswahl nachweislich tragender Tiere vor allem in der Gruppe A

insbesondere hormonbedingte, aber auch laktationsbedingte Variationen der

untersuchten Parameter zu umgehen. Die Tiere der Referenzgruppe A waren

außerdem bis zur Probenahme nicht euterkrank. Des weiteren wurden zwei Klassen

der Eutererkrankung definiert (siehe 3.5.4.2.3 Tab. 10) und der Einfluß der

erkrankten Milchdrüsen auf benachbarte Euterviertel analysiert.

.


Die durchschnittliche Zellzahl (SCC) im VAG der Gruppe A bewegte sich mit ca.

22.000 Zellen/ml deutlich am unteren Rand des physiologischen Bereiches von

20.000 – 50.000 Zellen/ml (siehe 5.1.1). Die logarithmierte NAGase-Aktivität

(NAGase) in VAG (0,24) und VGH (0,20) lag sogar unterhalb der von GRABOWSKI

(2000) ermittelten physiologischen Referenz von 0,31 +/- 0,19. Auch die elektrische

Diskussion

124

Leitfähigkeit (LF) befand sich mit 5,66 mS/cm im physiologischen Bereich von

< 6 mS/cm (HAMANN u. ZECCONI 1998, GRABOWSKI 2000).

Es erschien daher gerechtfertigt, die Werte der Gruppe A, in der die Kühe seit der

Abkalbung auf allen Vierteln als eutergesund eingestuft wurden, als Referenz für die

übrigen Gruppen einzusetzen.

Analog zu Versuch 1 konnte auch hier eine Erhöhung von SCC VAG und NAGase

VAG und zusätzlich auch der LF der gesunden Viertel euterkranker Kühe (B1 und

C1) festgestellt werden, die jedoch nur bei SCC VAG und hochgradiger

Eutererkrankung (C1) signifikant war (p < 0,05). Wie unter 5.1.1 berichtet, wurden

auch schon in anderen Arbeiten ähnliche Resultate beobachtet. Der Grad der

Erkrankung der Nachbarviertel scheint beim Ausmaß der Erhöhung eine Rolle zu

spielen. Im VGH übt dagegen – anders als in Versuch 1 – der Gesundheitszustand

der benachbarten Euterviertel keinen Einfluß auf die hier betrachteten Parameter

aus.

Die Erhöhung der Werte in durch Entzündung veränderter Milch für alle selektierten

Kriterien der Eutergesundheit untermauerte die Ergebnisse aus Versuch 1. Die

anhand des Leitparameters der Euterentzündung SCC VAG getroffene Unterteilung

in unterschiedliche Schweregrade der Mastitis wird durch SCC VGH sowie NAGase

in VAG und VGH unterstützt, indem sich die Gruppen B2 und C2, für die der gleiche

Grenzwert von SCC VAG < 400.000 Zellen/ml galt, in diesen Parametern nicht

unterschieden und in Gruppe C3 (SCC VAG > 400.000 Zellen/ml) die höchsten

Werte zu finden waren. Dementsprechend konnte die von GRABOWSKI (2000)

beschriebene signifikante Korrelation von SCC VGH, NAGase VAG und VGH sowie

LF mit SCC VAG erneut bestätigt werden.

Diskussion

125

5.3.2 Mikroskopisches Zelldifferentialbild in Milch

Nach den Erkenntnissen aus Versuch 2 (siehe 5.2) wurden nun – zusätzlich zu einer

gezielten Auswahl der Versuchstiere – die Milchproben in Glasflaschen genommen

und transportiert. Die Herstellung der Ausstriche selbst blieb unverändert.

Im Versuch 3 fügte sich das Zelldifferentialbild der Gruppe A (34 % PMN, 25 %

Lymphozyten und 39 % Makrophagen) in neuere Literaturangaben ein (WEVER u.

EMANUELSON 1989, MILLER et al. 1991). Diese Werte wurden analog zur

bisherigen Vorgehensweise als Referenz betrachtet.

Wie in der Literatur beschrieben (siehe 2.2.5) und durch Versuch 1 bestätigt, stellten

die PMN in der Milch erkrankter Euterviertel (B2, C2, C3) die größte Zellfraktion,

wobei ihr Anteil in C3 mit 80 % am höchsten war. Dieser Anteil war um 23 % größer

als der korrespondierende Wert in Versuch 1, obwohl dort die mittlere Zellzahl und

die NAGase-Aktivität auf ein stärkeres Entzündungsgeschehen schließen ließen.

Über die Gründe lassen sich nur Vermutungen anstellen, da aufgrund zu kleiner

Stichprobengrößen keine erregerabhängige Auswertung durchgeführt werden

konnte. Die Bestimmung des Infektionsbeginns ist bei der Untersuchung von

natürlichen Infektionen ebenfalls problematisch und schränkt daher auch deren

Aussagefähigkeit ein (RIVAS et al. 2000). Es ist aber möglich, daß in Versuch 3 der

Anteil akuter Mastitiden größer als in Versuch 1 war. Wie unter 2.2.5 dargelegt,

nimmt bei chronischen Mastitiden der Anteil der mononukleären Zellen zu. Nach

RIOLLET et al. (2001) ist das Zelldifferentialbild bei chronischen Euterentzündungen

auch vom Erreger abhängig. Bei durch S. aureus verursachten Mastitiden liegt der

PMN-Anteil zwischen 55 – 96 %, während bei E. coli als Erreger schon nach 13

Tagen die mononukleären Zellen überwiegen (HILL et al. 1984). Zusätzlich zu einer

signifikanten Vergrößerung des Anteils der PMN im Rahmen einer Euterinfektion

wurde, unabhängig von der Eutergesundheit, ein deutlicher Herdeneinfluß auf das

Zelldifferentialbild der Milch beschrieben (PICCININI et al. 1999).

Ebenso wie für die selektierten Kriterien der Eutergesundheit spiegelte sich die

anhand des SCC VAG vorgenommene Abstufung des Erkrankungsgrades im

Diskussion

126

Zelldifferentialbild wider, es war aber keine klare Abgrenzung zum nach dem SCC

VAG als gesund definierten Bereich möglich.

Die Veränderung des Zelldifferentialbildes in den als gesund eingeordneten

Milchdrüsen euterkranker Kühe, wie sie in Versuch 1 beobachtet wurde, konnte

erneut bestätigt und statistisch untermauert werden (siehe Abb. 4. u. 8). Wie schon

für die selektierten Kriterien der Eutergesundheit konnte auch hier eine Abstufung

der Veränderungen in Abhängigkeit vom Erkrankungsgrad festgestellt werden. Der

PMN-Anteil in der nach klassischen Kriterien als eutergesund eingestuften Gruppe

C1 war genauso groß wie der in den als mittelgradig entzündet eingestuften Gruppen

B2 und C2. Damit wurden die Ergebnisse von WEVER u. EMANUELSON (1989)

widerlegt, die keine gegenseitige Beeinflussung benachbarter Euterviertel

dokumentierten. Die mikroskopische Zelldifferenzierung erwies sich somit im

Vergleich mit der Zellzählung als die sensiblere diagnostische Maßnahme.

5.3.3 Mikroskopisches Zelldifferentialbild des Blutes

Die anhand des SCC VAG diagnostizierten Mastitiden und ihr Schweregrad

spiegelten sich zwar im Zelldifferentialbild des Blutes wider, die Veränderungen

ließen sich jedoch nur für Eosinophile Granulozyten und Monozyten zwischen den

Gruppen A und C statistisch absichern (p < 0,05). Die aufgetretenen Änderungen

entsprachen denen der Milchleukozyten. Eine sich hier andeutende Neutrophilie im

Blut kombiniert mit einer Lymphopenie kann als Indiz für eine bakterielle Infektion

gewertet werden (KRAFT u. SCHILLINGER 1997). Es wurde bereits beobachtet, daß

die Gesamtleukozytenzahl auf Änderungen der Eutergesundheit reagiert, und dabei

nicht unbeträchtliche tierindividuelle Schwankungen auftreten (REDETZKY 2000).

Eine eingehendere Analyse, die härtere Aussagen ermöglicht, konnte aufgrund der

zu geringen Stichprobengröße nicht vorgenommen werden.

Diskussion

127

5.3.4 Durchflußzytometrische Parameter der Milchzellsuspension


Der Anteil vitaler Zellen war in Versuch 3 – unabhängig von der Eutergesundheit –

höher als in Versuch 1, was auf die veränderte Bestimmungsmethode

zurückzuführen ist. Dabei wurde nicht nur ein anderer Farbstoff eingesetzt, sondern

die Zellen wurden vor der Messung auch deutlich geringeren Belastungen

unterworfen. Die Höhe der Zellvitalität schien die von VANGROENWEGHE et al.

(2000) gefundenen Werte zu bestätigen (siehe 5.1.3.1). Auch wenn im eigenen

Versuch das Laktationsstadium kein Auswahlkriterium war, befanden sich die

Versuchstiere doch aufgrund des Kriteriums „nachgewiesene Trächtigkeit“ in einem

fortgeschrittenen Laktationsstadium.

Die in Versuch 1 beobachtete Erhöhung der Zellvitalität in den gesunden Vierteln

euterkranker Kühe konnte nur für eine mittelgradige Eutererkrankung (B1) bestätigt

werden. Analog zur bisherigen Beobachtung zeigten die Gruppen B2 und C2 die

höchsten Werte, während die Zellvitalitäten in C1 und C3 derjenigen in einer

gesunden Milchdrüse entsprachen. Dies könnte ein Indiz dafür sein, daß in

hochgradig erkrankten Milchdrüsen (C3) die PMN nach Phagozytose und Zerstörung

der Erreger zugrundegegangen und zu Eiter geworden sind (LIEBICH 1993).

5.3.4.2 CD4 und CD8

Die als Referenz (Gruppe A) betrachteten prozentualen Anteile von CD4+ (20 %) und

CD8+ (45 %) unterschieden sich deutlich von den Ergebnissen aus Versuch 1,

stimmten aber mit der Mehrheit der Literaturangaben überein (siehe 2.3.3.2 und

Tab. 3). Wie bereits unter 5.1.3.2 erwähnt, waren die Werte der mittleren

Fluoreszenzintensität (Xm) nicht mit Angaben in der Literatur vergleichbar, da sie

vom Durchflußzytometer und dessen Einstellungen abhängen.

Diskussion

128

Alle Gruppen zeigten einen im Vergleich zur Referenz signifikant (p < 0,05) erhöhten

Anteil CD4+ Lymphozyten, auch die eutergesunden Viertel an Mastitis erkrankter

Kühe. Damit stimmten die eigenen Ergebnisse mit den Literaturangaben überein

(siehe 2.3.3.2). Der Abfall der CD4-Expressionsdichte auf der Zelloberfläche

bestätigte die von RIOLLET et al. (2001) gemachten Beobachtungen und widerlegt

damit die Ergebnisse von RIVAS et al. (2000).

Der Anteil der CD8+ T-Zellen hatte dagegen eine rückläufige Tendenz, die aber nur

für C3 statistisch gesichert werden konnte. Diese Beobachtung steht im Einklang mit

SOLTYS u. QUINN (1999) und RIVAS et al. (2000). Die Expressionsdichte dieser

Struktur war in der Referenzgruppe signifikant niedriger als in allen anderen

Gruppen, was den Ergebnissen von RIOLLET et al. (2001) entspricht, während

RIVAS et al. (2000) einen – wenn auch nicht signifikanten – Aufwärtstrend

beschrieben.

5.3.4.3 TCR1

Mit dem gegen den γδ-T-Zellrezeptor (TCR1) direkt gerichteten Antikörper GB21A,

der in Gruppe A 10 % der Lymphozyten markiert hat, konnte der in der Literatur als

physiologisch angesehene Anteil der γδ-T-Lymphozyten (8 %) bestätigt werden.

Auch der in Versuch 1 beobachtete Abwärtstrend bei zunehmender Schwere der

Mastitis wurde bestätigt. Bei hochgradiger Mastitis konnte zusätzlich eine signifikante

Verringerung der Expressionsdichte beobachtet werden. Untersuchungen mit dem

ebenfalls direkt gegen den TCR1 gerichteten mAk (GD3.8) ergaben dagegen bei

einer Mastitis eine signifikante Vergrößerung der γδ-T-Zellpopulation (SOLTYS u.

QUINN 1999). Wie schon mehrfach erwähnt, können mit Antikörpern

unterschiedlicher Herkunft erzielte Ergebnisse nur bedingt miteinander verglichen

werden. Da keine Veröffentlichungen gefunden werden konnten, in denen die

Lymphozytensubpopulationen der Milch unter Berücksichtigung der Eutergesundheit

mit dem mAk GB21A untersucht wurden, ist eine über die Ausführungen unter

5.1.3.3 hinausgehende Einordnung der eigenen Befunde nicht möglich. Bezüglich

Diskussion

129

der Expressionsdichte des TCR1 wurden ebenfalls keine veröffentlichten Daten

gefunden.

Bei den CD8+ γδ-T-Zellen konnte unter Berücksichtigung der Eutergesundheit keine

Veränderung beobachtet werden. Für diese Lymphozytensubpopulation kann weder

die Referenz noch das Verhalten unter Berücksichtigung der Eutergesundheit

eingeordnet werden. Die bisher bekannten Daten sind nicht mit den eigenen

Ergebnissen vergleichbar. Sie beziehen sich auf CD2+ T-Zellen, während dieser mAk

in den eigenen Untersuchungen nicht eingesetzt wurde. Auch wurde bisher nur Milch

aus gesunden Milchdrüsen untersucht (ASAI et al. 2000).

5.3.4.4 Bo 116

Für den gegen PMN gerichteten Antikörper Bo116 liegt bisher noch keine

abschließende Charakterisierung seines Antigens vor (RÖNSCH 1992). Die

Expression dieses Antigens auf PMN ist an deren Funktionszustand gekoppelt

(SCHUBERTH 2001). Für aus Milch isolierte PMN sind keine Vergleichsdaten

vorhanden.

Gemessen an der Referenzgruppe A (5 %, Xm = 119) zeigten die PMN aus Milch

infizierter Viertel eine signifikant (p < 0,05, z.T. p < 0,001) höhere Expressionsrate

(20 – 24 %) und geringere –dichte (Xm = 33 – 69). Ein entsprechender Trend war

auch bei den gesunden Vierteln euterkranker Kühe zu beobachten. Es ist

hervorzuheben, daß – analog zu dem mikroskopisch ermittelten Anteil der PMN –

auch der Unterschied zwischen den vorgenannten gesunden Vierteln und den als

krank definierten Vierteln signifikant war (B1: p < 0,05, C1: p < 0,001). Die

Korrelation von SCC VAG mit der Expressionsrate war genauso eng wie für NAGase

VAG und % PMN.

Der Antikörper Bo116 kann daher als geeigneter Indikator der Eutergesundheit

eingestuft werden.

Diskussion

130

5.3.4.5 MHC II

Anders als in Versuch 1 stimmte in Versuch 3 der als Referenz eingesetzte Anteil

MHC II+ Zellen aus Gruppe A (7 %) mit der Literaturangabe (6 %) überein (RIOLLET

et al. 2001). Die in dieser Veröffentlichung beschriebene und in Versuch 1 bestätigte

Veränderung sowohl der Expressionsrate als auch der Expressionsdichte konnte in

Versuch 3 jedoch nicht bestätigt werden. Da zur Expression von MHC II auf

Milchleukozyten außer der erwähnten Veröffentlichung keine anderen Daten

gefunden wurden, sind für die Aufklärung der Widersprüche weitere Untersuchungen

angezeigt.


Auch unter Berücksichtung der Tatsache, daß bei der Auswertung der MIF nicht

zwischen PMN und Makrophagen unterschieden, sondern alle Phagozyten

gemeinsam betrachtet wurden (siehe 3.5.3.3.2), war der höchste nachgewiesene

Anteil CD14-tragender Zellen (25 % in B1) niedriger als die in der Literatur

gefundene Angabe: 68 % der PMN, 35 % der großen MNC (siehe 2.3.3.1, Tab. 4).

Analog zu PAAPE et al. (1996) sank der Anteil CD14+ Zellen bei hochgradiger

Mastitis (C3) signifikant. Bei Betrachtung der Bindungsraten in den einzelnen

Gruppen waren im Vergleich zum Anteil der Makrophagen nur schwache

Parallelitäten zu beobachten. Dies könnte daran liegen, daß CD14 auch von bovinen

PMN exprimiert wird, wodurch seine Eignung als Marker für Makrophagen in Milch in

Frage zu stellen ist.

Um die PMN von dieser Betrachtung auszuschließen, wurde auch der Anteil

CD14+MHC II+ Zellen erhoben. Er war mit 0,7 – 3 % sehr niedrig, es ließen sich

jedoch deutlichere Parallelen zum Anteil der Makrophagen feststellen. In der

Korrelation mit SCC VAG zeigte sich kein Unterschied zur Einzelbetrachtung von

CD14, und sie war schwächer als diejenige der Makrophagen.

Diskussion

131

Weder CD14 allein noch die Doppelmarkierung mit MCH II scheint daher geeignet zu

sein, bei der durchflußzytometrischen Zelldifferenzierung die Makrophagen zu

erfassen. Dabei sollte bedacht werden, daß der eingesetzte Antikörper gegen

humanes CD14 gerichtet ist und aufgrund seiner Kreuzreaktion mit bovinen Zellen

hier eingesetzt wurde. Es ist denkbar, daß mit einem direkt gegen das bovine CD14

erzeugten mAk eine bessere Markierung der Makrophagen erzielt werden kann.

Auch ÖSTENSONN (1993) konnten mit ihrer durchflußzytometrischen Methode der

Zelldifferenzierung, die auf rein morphologischen Kriterien beruht, die Makrophagen

nicht positiv identifizieren, sondern mußten ihren Anteil rechnerisch ermitteln.

Auch wenn zum Zeitpunkt der Versuche keine optimale Auswahl an Antikörpern für

die durchflußzytometrische Differenzierung von Milchzellen zur Verfügung stand, so

lassen einige Befunde erkennen, daß diese Methode in Bezug auf die

Eutergesundheit ähnlich genaue Aussagen erlaubt wie die mikroskopische

Zelldifferenzierung. Angesichts der schnell voranschreitenden Entwicklung neuer

monoklonaler Antikörper gegen bovine Zellen ist zu hoffen, daß einige von ihnen für

den Einsatz in der Milchzelldiagnostik besser geeignet sind. Bis die

Durchflußzytometrie zur Routinediagnostik eingesetzt werden kann, müssen jedoch

für definierte Antikörper Referenzen unter der Berücksichtigung von

Laktationsstadium und –nummer sowie evtl. der Erreger erarbeitet werden. Das

eigene Datenmaterial war für diesen Zweck nicht umfangreich genug.

5.3.5 Durchflußzytometrische Parameter der Blutzellsuspension


Je nach Gruppe konnten in den eigenen Untersuchungen 95 – 98 % vitale Zellen aus

dem Blut isoliert werden. Ähnliche Angaben sind in der Literatur für eutergesunde

(DOSOGNE 1998) und an Mastitis erkrankten Kühe zu finden (HOEBEN 1999). In

den eigenen Untersuchungen deutete sich an, daß – ähnlich wie bei Milchzellen –

die durchschnittliche Zellvitalität der Blutleukozyten bei euterkranken Kühen erhöht

Diskussion

132

ist. Wie bereits unter 5.1.3.1 erwähnt, hat die direkte Untersuchung verschiedener

Zellfunktionen von direkt aus Milch isolierten Zellen eine stärkere Aussagekraft.

5.3.5.2 CD4 und CD8

Der Anteil der im Blut nachgewiesenen CD4+ Zellen (16 – 22 %) bewegte sich am

unteren Rand der diesbezüglich sehr unterschiedlichen Literaturangaben (siehe Tab.

3), und auch der Anteil der CD8+ Zellen (15 – 21 %) entsprach den

Veröffentlichungen. Andererseits war das Verhältnis CD4/CD8 im Gegensatz zu den

Veröffentlichungen auf die Seite der CD8+ Lymphozyten verschoben (siehe 2.3.4.2).

Die Schwankungsbreite des Anteils der T-Helferzellen könnte am Polymorphismus

der bovinen CD4 liegen sowie an der unterschiedlichen Herkunft der in den Studien

eingesetzten Antikörper, für die in Vergleichsstudien unterschiedliche

Bindungsverhalten nachgewiesen wurden (BENSAID u. HADAM 1991, MORRISON

et al. 1991). Am Beispiel der Milchlymphozyten konnten im Rahmen der eigenen

Untersuchungen exemplarisch für zwei gegen CD4 gerichtete Antikörper ebenfalls

unterschiedliche Bindungsverhalten nachgewiesen werden (siehe 5.2.2.2).

Der Anteil der T-Helferzellen schien nicht von der Eutergesundheit abhängig zu sein,

aber die Expressionsdichte von CD4 im Blut war während einer Mastitis signifikant

(p < 0,05) erniedrigt. Für den Anteil der CD8+ Zellen im Blut deutete sich während

einer Mastitis eine Vergrößerung, für die Expressionsdichte dagegen eine

Verringerung an. Diese Beobachtungen stehen zum Teil im Widerspruch zu

bisherigen Untersuchungen, nach denen zumindest die T-Helferzellen im Blut von

einer Euterinfektion nicht beeinflußt werden. Für Veränderungen der CD8+ Zellen im

Blut wurde dagegen ein Zusammenhang mit dem Gesundheitszustand

nachgewiesen (siehe 2.3.5.2).

Diskussion

133

5.3.5.3 TCR1

Der im Blut nachgewiesene Anteil der γδ-T-Zellen bestätigte die in der Literatur

gefundenen Angaben. Dagegen wich die Beobachtung, daß die Expressionsdichte

dieser Struktur bei hochgradiger Mastitis signifikant verringert war, von der Literatur

ab (siehe 2.3.4.2). Die eigenen Ergebnisse ließen sich jedoch nur bedingt mit der

Literatur vergleichen, weil die Untersuchungen, die diese Zellart im Blut unter

Berücksichtigung des Gesundheitszustands untersuchten, einen Antikörper gegen

WC1 eingesetzt haben, in den eigenen Untersuchungen aber ein direkt gegen den

TCR1 gerichteter mAk verwendet wurde (siehe auch 5.1.3.3).

Etwa die Hälfte der γδ-T-Zellen in Gruppe A war CD8+; dieses Verhältnis bestätigte

die von ASAI et al. (2000) gemachten Angaben. Im Blut hochgradig an Mastitis

erkrankter Kühe konnte diese Zellpopulation nicht nachgewiesen werden.

5.3.5.4 Bo 116

Analog zur Milch nahm der Anteil Bo116+ Zellen im Blut an Mastitis erkrankter Kühe

zu, die Expressionsdichte auf der einzelnen Zelle dagegen ab (siehe 4.2.4. und

5.3.4.4). Dies bestätigte die Beobachtung von SCHUBERTH (2001), daß die

Expression dieses Antigens vom Funktionszustand der PMN abhängt. Um diesen

Zusammenhang zu präzisieren, wären Untersuchungen zur Zellfunktionalität – z.B.

Phagozytose, Apoptose oder Sauerstoffradikalbildung – unter Berücksichtigung der

Bo116 Expression hilfreich.

Der Anteil der markierten PMN (25 – 37 %) lag deutlich unter der von RÖNSCH

(1992) gemachten Angabe von 75 – 92 %. In den eigenen Untersuchungen wurde

der identische – inzwischen also ca. zehn Jahre alte – Antikörper eingesetzt. Es ist

denkbar, daß durch die lange Lagerung viele Antikörpermoleküle zerfallen sind oder

sich zumindest so stark verändert haben, daß sich ihre Spezifität verändert hat oder

aber der Sekundärantikörper nicht mehr bindet. Beides würde zu einer Verringerung

Diskussion

134

des Anteils Bo116+ Zellen führen. Innerhalb dieses Versuches kann aber wiederum

von einer Vergleichbarkeit der Ergebnisse ausgegangen werden.

5.3.5.5 MHC II

Bei den eutergesunden Kühen wurde auf ca. 40 % der Zellen MHC II nachgewiesen,

bei den hochgradig mastitiskranken Tieren stieg der Anteil auf ca. 50 %, während die

Expressionsdichte einen leichten Abwärtstrend zeigte. In Bezug auf die

Expressionsrate konnten die Literaturangaben bestätigt werden. Zur

Expressionsdichte wurden keine veröffentlichten Daten gefunden. Die Erhöhung des

Anteils MHC II tragender Zellen kann als Zeichen einer Aktivierung des

Immunsystems gedeutet werden.


Es konnten ca. 4 % CD14+ Zellen im Blut nachgewiesen werden. Weder die

Expressionsrate noch die –dichte veränderten sich in Abhängigkeit von der

Eutergesundheit. Das entspricht in etwa den von PAAPE et al. (1996)

veröffentlichten Resultaten für PMN (siehe Tab. 4), auch wenn die Daten nur bedingt

miteinander verglichen werden können. In der Veröffentlichung wurden PMN und

große MNC getrennt ausgewertet, während in der eigenen Untersuchung diese

Zellarten gemeinsam betrachtet wurden. Im untersuchten Blut betrug der Anteil der

Monozyten allerdings nur ca. 2 %, so daß die Bindungsrate und –dichte

hauptsächlich auf die PMN zurückzuführen sind.

Der Anteil der CD14+MHC II+ Zellen, der bei gesunden Tieren gleich groß wie

derjenige der CD14+ war, war bei hochgradig euterkranken Kühen – analog zum

mikroskopisch ermittelten Anteil der Monozyten – signifikant (p < 0,05) erniedrigt.

Anders als bei den aus Milch isolierten Zellen schien in einer Blutzellsuspension die

Diskussion

135

Kombination dieser beiden Antikörper durchaus dafür geeignet zu sein, Monozyten

durchflußzytometrisch zu erfassen.

Wie schon unter 4.3.4.6 erwähnt, kann die heute verfügbare Auswahl an Antikörpern

nicht als optimal für die Differenzierung boviner Zellen angesehen werden. Dennoch

wurde erkennbar, daß eine Euterentzündung Auswirkungen auf das

Blutzelldifferentialbild hat. Das Basiswissen über die mastitisbedingten

Veränderungen der untersuchten Oberflächenstrukturen der Blutleukozyten ist

jedoch noch sehr lückenhaft, so daß keine Einschätzung des diagnostischen Wertes

dieser Befunde möglich ist. Die geringe Datenmenge, die bei diesem Versuch

erhoben wurde, läßt nur die Beschreibung von Tendenzen zu.

5.3.6 Folgerungen aus Versuch 3

Die zu Versuch 1 getroffene Feststellung, daß sich sowohl mikroskopisch als auch

durchflußzytometrisch Aussagen über das Zelldifferentialbild der Milch unter

Berücksichtigung der Eutergesundheit treffen lassen, wurde durch Versuch 3

bestätigt (siehe Tab. 41). Durch die in Versuch 2 ermittelten Modifikationen konnte im

mikroskopischen Bereich eine Übereinstimmung mit den in der Literatur

veröffentlichten Ergebnissen erreicht werden.

Die in Tab. 41 dargestellten Werte der prozentualen Bindungsraten zeigen auch, daß

die Ergebnisse der durchflußzytometrischen, auf die Markierung mit monoklonalen

Antikörpern gestützten Zelldifferenzierung nicht mit den mikroskopisch ermittelten

Ergebnissen vergleichbar sind. Unter der Voraussetzung, daß geeignete Antikörper

gefunden und eingesetzt werden, ermöglicht die Durchflußzytometrie jedoch eine

eigenständige Zelldifferenzierung, die über eine diagnostische Aussage hinaus

vielleicht auch Hinweise für die Therapie enthält. Außerdem wäre der Einfluß

verschiedener Erreger auf das Zelldifferentialbild zu analysieren, was jedoch mit dem

vorhandenen Datensatz nicht möglich war.

Diskussion

136

Das Bindungsverhalten fast aller Antikörper (besonders Bo116 und CD4) an Zellen

der ZSM wurde vom Eutergesundheitsstatus beeinflußt. Um diese Veränderungen

jedoch hinsichtlich ihrer Bedeutung für die Infektionsabwehr einschätzen zu können

und ihre Eignung als diagnostisches Kriterium der Eutergesundheit zu beurteilen,

muß das Immunsystem der bovinen Milchdrüse noch eingehender erforscht werden.

Tab. 41 Vergleichende Gegenüberstellung von Milchparametern in „gesunden“ (Referenz A, n = 50) und an Mastitis erkrankten Vierteln (n = 68) unter der Berücksichtigung der Analytik auf der Basis einer Signifikanz von mind. p < 0,05

Analytik Parameter (Zellart) Referenz Mastitis Mastitisbedingte Änderung

% PMN 34 80 ▲

% LYM 25 7 ▼ Mikroskop

% MAK 39 13 ▼

% Bo116 (PMN) 5 20 – 24 ▲

Xm Bo116 (PMN) 119 69 – 33 ▼

% CD4 (LYM) 20 33 – 38 ▲

Log Xm CD4 (LYM) 2,1 1,9 – 2 ▼

% CD8 (LYM) 45 35 – 43 ▼

Xm CD8 (LYM) 641 887 – 1023

▲

Log Xm γδ (LYM) 2 2,1 – 2,3 ▲

% CD14 (MAK) 19 12 – 17 ▼

MIF

% VIT 73 78 – 84 ▲

Mastitisviertel: B2 (n = 15), C2 (n = 20), C3 (n = 33)

Diskussion

137

Die Folgerung aus Versuch 1, daß die Euterviertel einer Milchdrüse sich funktionell

gegenseitig beeinflussen, wurde in Versuch 3 bestätigt. Damit wurden auch die für

andere Parameter bereits festgestellte funktionelle Abhängigkeit der Euterviertel

einer Milchdrüse (siehe 2.5) bestätigt und die Ergebnisse von WEVER u.

EMANUELSON (1989), das Zelldifferentialbild sei durch erkrankte Nachbarviertel

unbeeinflußt, widerlegt. Diese Beeinflussung ist auch eine mögliche Erklärung für die

von EMANUELSON u. WEVER (1989) beschriebene Feststellung, daß das

Zelldifferentialbild weniger geeignet sei als der Zellgehalt, um zwischen infizierten

und nicht infizierten Milchdrüsen zu unterscheiden.

Wie die eigenen Ergebnisse zeigen, erweist sich vielmehr in diesem Punkt das

Zelldifferentialbild im Vergleich zum Zellgehalt als der sensiblere diagnostische

Parameter. Ebenso wird der Unterschied zwischen klinischer und subklinischer

Mastitis bei Schafen durch das mikroskopische Zelldifferentialbild – vor allem den

Anteil der PMN – besser widergespiegelt als durch den Zellgehalt der Milch

(MORGANTE et al. 1996). Im Rahmen experimenteller Infektionen mit S. aureus

zeigen die Expressionsrate und –dichte von CD4, die durchflußzytometrisch

gemessen werden, in Milch infizierter Euterviertel im Gegensatz zum Zellgehalt und

zum bakteriologischen Nachweis in allen Fällen Veränderungen (RIVAS et al. 2000).

Damit die Zelldifferenzierung auch in der Routinediagnostik genutzt werden kann,

muß sie automatisierbar sein. Mit Hilfe der Durchflußzytometrie kann außerdem eine

deutlich weitergehende Kategorisierung der Eutergesundheit im Vergleich zur

derzeitigen Evaluierung des Gehaltes an somatischen Zellen erwartet werden.

Auch die Ergebnisse der Blutuntersuchung legen nahe, daß eine Mastitis nicht als

ausschließlich lokales Geschehen angesehen werden kann. Sie können vielmehr als

Hinweis gelten, daß die Kommunikation zwischen den Drüsenkomplexen eines

Euters auf dem Blutweg stattfindet. Aber auch hier ist unabdingbar, daß die

Regulation der Immunabwehr im Euter zunächst noch eingehender erforscht wird. Es

ist sogar vorstellbar, daß mit der Durchflußzytometrie eine Beurteilung der

Eutergesundheit anhand einer Blutprobe möglich wird. Bei der Suche nach einem

geeigneten Parameter muß zusätzlich zu Laktationsstadium, -nummer und

Diskussion

138

Erregerart der Einfluß anderer Erkrankungen des Tieres ausführlich untersucht

werden.

Über die Bedeutung der Abhängigkeit der Euterviertel einer Milchdrüse voneinander

liegen nur wenige wissenschaftlichen Erkenntnisse vor (HAMANN et al. 2002). Es

wäre jedoch möglich, daß durch die Reaktion des Immunsystems in den nicht

erkrankten Milchdrüsenkomplexen deren Funktionsfähigkeit sichergestellt werden

soll. Biologisch betrachtet wäre dadurch, wie auch durch die beschriebene

Kompensation der Milchleistung (HAMANN u. REICHMUTH 1990), die Ernährung

des Nachwuchses weitgehend gewährleistet.

Die Datenerhebung war, wie aus Kapitel 3 hervorgeht, von der Probenahme bis zur

Datenanalyse arbeits- und zeitintensiv. Daher war es nicht möglich, eine größere

Probenzahl zu untersuchen, die zusätzliche Aussagen hinsichtlich Laktations- und

Erregereinfluß auf das Zelldifferentialbild erlaubt hätte.

Zusammenfassung

139

6. ZUSAMMENFASSUNG

Anke Schröder

Untersuchung zum Zelldifferentialbild in Milch und Blut unter Berücksichtigung

des Gesundheitsstatus der bovinen Milchdrüse

Das Differentialbild der Milchzellen ist ein seit langem bekanntes Kriterium für die

Diagnose von Mastitiden. Die wechselvolle Geschichte der Zuordnung der großen

mononukleären Zellen zu den Epithelzellen oder den Makrophagen belegt die

praktische Erfahrung vieler Untersucher, daß aufgrund der im Vergleich zum Blut

geringen Qualität der Ausstriche eine objektive mikroskopische Zelldifferenzierung

erschwert ist.

In dieser Arbeit wurden die Aussagefähigkeit des Zelldifferentialbildes in Milch und

Blut unter Berücksichtigung von Eutergesundheit und labortechnischen

Fragestellungen überprüft. Zu diesem Zweck wurde das Zelldifferentialbild nicht nur

mikroskopisch, sondern auch durchflußzytometrisch mit Hilfe monoklonaler

Antikörper ermittelt.

Wie die dargestellten Daten belegen, ist das Zelldifferentialbild – unabhängig davon,

ob es mikroskopisch oder durchflußzytometrisch erstellt wurde – den selektierten

Kriterien der Eutergesundheit (Zellgehalt, NAGase, elektrische Leitfähigkeit) in der

Mastitisdiagnostik überlegen. Dies zeigte sich bei der differenzierten Betrachtung des

Zelldifferentialbildes unter Berücksichtigung der Eutergesundheit darin, dass

signifikante (p < 0,05) Unterschiede zwischen der physiologischen Referenz und den

nach selektierten Kriterien als gesund definierten Vierteln euterkranker Kühe

bestanden. Das bedeutet wiederum, dass die zu einer Milchdrüse gehörenden

Euterviertel sich gegenseitig funktionell beeinflussen und nicht unabhängig

voneinander reagieren.

Zusammenfassung

140

Als physiologische Referenz wurde ein mikroskopisches Zelldifferentialbild von 34 %

PMN, 25 % Lymphozyten und 39 % Makrophagen ermittelt. Bei hochgradiger

Mastitis wurden dagegen 80 % PMN, 7 % Lymphozyten und 13 % Makrophagen

nachgewiesen. Bo116, ein Antikörper gegen eine nicht näher charakterisierte

Oberflächenstruktur der PMN, zeigt eine mastitisbedingte signifikante (p < 0,05)

Erhöhung der Expressionsrate von 5 % auf 24 % und eine parallele Verringerung der

Expressionsdichte. Ebenso konnten signifikante (p < 0,05) Einflüsse der

Eutergesundheit auf die Zellvitalität sowie auf die Expressionsrate und –dichte von

CD4, CD8, TCR1 für Lymphozyten und CD14 für Makrophagen beobachtet werden.

Vor allem die durchflußzytometrisch, aber auch die mikroskopisch beobachteten

Veränderungen ergaben sich tendenziell auch für die Blutleukozyten.

Wie die Untersuchungen zu analytischen Fragestellungen zeigten, sind für die

mikroskopische Ermittlung des Zelldifferentialbildes folgende Bedingungen für

Probenahme und Präparation einzuhalten:

• Die Proben sollten in Glasgefäßen genommen und transportiert werden, da

Kunststoff zu einer Verringerung des Anteils der Phagozyten, vor allem der

Makrophagen, führt.

• Nur Ergebnisse desselben Untersuchers sollten miteinander verglichen

werden.

• Nur mit identischer Technik hergestellte Ausstriche ermöglichen vergleichbare

Ergebnisse.

Die Herstellung von Kieler Sedimentausstrichen beruht auf einer einmaligen

Zentrifugation und dem Ausstreichen des zellreichen Sediments mit einer Öse. Im

Vergleich zur „Kaffeemühle“ werden mit dieser Technik bei der Zelldifferenzierung

signifikant (p < 0,05) mehr Lymphozyten und weniger PMN festgestellt. Im

Gegensatz zur Präparation des Kieler Sedimentausstrichs wird bei dem Verfahren

„Kaffeemühle“ das nach der ersten Zentrifugation erhaltene Sediment dreimal

gewaschen und dann mit Hilfe der Zentrifugalkraft auf einem Deckgläschen verteilt.

Zusammenfassung

141

Die Durchflußzytometrie in Kombination mit der Membranimmunfluoreszenz, d.h. der

Markierung von Zelloberflächenstrukturen mit Hilfe fluorochrommarkierter

spezifischer Antikörper, eröffnet die Möglichkeit einer objektiven und im Vergleich

zum Mikroskop weitergehenden Zelldifferenzierung, die über die Zellartbestimmung

hinaus den Funktionstyp und –zustand der Zelle beschreiben kann. Die

Untersuchungen zur Aussagefähigkeit des derart ermittelten Zelldifferentialbildes

lassen unter Berücksichtigung von Eutergesundheit und technischen

Voraussetzungen folgende Aussagen zu:

• Das durchflußzytometrisch ermittelte Zelldifferentialbild ist nicht direkt mit dem

mikroskopisch ermittelten vergleichbar, solange die eingesetzten Antikörper

nicht an alle Entwicklungsstadien ausschließlich einer Zellart binden.

• Die Durchflußzytometrie ermöglicht eine eigenständige Differenzierung der

Milchzellen, die über die rein morphologische Betrachtung hinaus auch

Veränderungen der Zelloberfläche sowie der Zellvitalität mit einschließt.

• Die Auswahl der monoklonalen Antikörper ist von großer Bedeutung, d.h. nicht

alle im bovinen System zur Verfügung stehenden Antikörper sind für die

Markierung von Milchzellen geeignet. Für die Lymphozyten liegt dies zum

einen an der unterschiedlichen Gewebeverteilung der Subpopulationen. So

tragen zwar im Blut fast alle γδ-T-Lymphozyten WC1 auf ihrer Oberfläche, in

der Milch dagegen nur ein sehr kleiner Teil. Zum anderen konnte für CD4

dargelegt werden, dass Antikörper mit der gleichen Spezifität, aber

verschiedener Herkunft, an einen signifikant unterschiedlich großen Anteil der

Milchlymphozyten binden.

Summary

142

7. SUMMARY

Anke Schröder

Cell Differentiation in Milk and Blood with Consideration of the Health Status of

the Bovine Mammary Gland

As to the diagnosis of mastitis the differential cell count is a well known criterion. The

classification of the big mononuclear cells as either epithelial cells or macrophages

has a long and varied history, just as in the practical experience of many researchers

an objective microscopical cell differentiation proves to be complicated by the low

quality of milk smears in comparison to blood ones.

This study was focused on the relevance of cell differentiation in milk and blood with

consideration of udder health and technical questions concerning laboratory work.

For this purpose, the cell differentiation was done not only microscopically, but also

by flow cytometry using monoclonal antibodies.

As the presented data confirm, the differential cell count – regardless of microscopic

or flow cytometric origin – is superior to selected criteria of udder health (somatic cell

count, NAGase, electrical conductivity) in the diagnosis of mastitis. This became

evident in the further analysis of the differential cell count with consideration of the

udder health, which revealed significant (p < 0,05) differences between the

physiological reference and those udder quarters of mastitic cows which were

defined as healthy according to selected criteria of udder health. On the other hand,

this proves that mammary quarters of one bovine udder influence each other

functionally and do not react independently.

By microscope a differential cell count of 34 % PMN, 25 % lymphocytes and 39 %

macrophages were determinded as physiological reference. In case of severe

mastitis, 80 % PMN, 7 % lymphocytes and 13 % macrophages were found. Bo116,

Summary

143

an antibody which binds to a not yet characterized structure on the surface of PMN,

shows – due to mastitis – a significant (p < 0,05) rise in the proportion of positive

cells of 5 % to 24 % in combination with a parallel decrease in the expression

density. Other parameters which were significantly (p < 0,05) influenced by the udder

health status were cell viability as well as the proportion of positive cells and the

expression density of CD4, CD8, TCR1 for lymphocytes and CD14 for macrophages.

Above all, the changes of the parameters measured by means of flow cytometry, but

also the changes observed by microscope showed the same tendency when blood

was examined.

As the study on analytical questions showed, the following conditions of sampling

and preparation should be observed for microscopic cell differentiation:

• Samples should be taken and transported in glass containers, as plastic leads

to a reduction of the phagocyte population, especially of macrophages.

• Only results obtained by the same person are comparable.

• Only smears prepared with identical technique give comparable results.

The preparation of the “Kieler Sedimentausstrich” is based on a single centrifugation

followed by spreading the cell-enriched sediment with a loop. In comparison to

“Kaffeemühle” this technique leads to significantly (p < 0,05) more lymphocytes and

less PMN in the differential cell count. In contrast to the “Kieler Sedimentausstrich” in

the procedure “Kaffeemühle”, the sediment obtained by the first centrifugation is

washed thrice and then spread on a cover glass with the aid of centrifugal force.

Flow cytometry in combination with membrane immunofluorescence, i.e. the staining

of structures on the cell surface using fluorochrom-conjugated specific antibodies,

opens the possibility of an objective and in comparison to the microscopic evaluation

preciser cell differentiation, which cannot only describe the cell type but functional

type and state of the cell as well.

Summary

144

The research into the relevance of the differential cell count thus obtained allows the

following statements with consideration to udder health and technical conditions:

• The results of the flow cytometric cell differentiation may not be compared

directly to those gained by microscope, as long as the antibodies used do not

bind to all stages of development of exclusively one cell type.

• Flow cytometry allows an independent cell differentiation, which includes

beyond a strictly morphological view changes on the cell surface and of the

cell viability.

• The selection of the monoclonal antibodies is of great importance, i.e. not all

antibodies available in the bovine system can be used to stain milk cells. In

case of lymphocytes, one cause is the varying tissue distribution of

subpopulations. On the surface of almost all γδ-T-lymphocytes in blood, WC1

can be observed, whereas in milk this structure can only be detected on a

small population of γδ-T-lymphocytes. As to CD4 it was shown that antibodies

of the same specificity, but of different origin, will bind to a significantly

different proportion of milk lymphocytes.

Résumé

145

8. RESUME

Anke Schröder

Recherches sur la différenciation des cellules du lait et du sang compte tenu

de l’état sanitaire de la glande mammaire bovine

La différenciation des cellules du lait est un critère de diagnostic des mammites

connu depuis longtemps. L’histoire mouvementée de la classification des grandes

cellules mononucléaires en cellules épithéliales ou en macrophages confirme

l’expérience pratique de beaucoup de chercheurs ayant constaté qu’une

différenciation microscopique objective, en comparaison avec le sang, est difficile en

raison de la mauvaise qualité des enduits.

Le présent essai consiste à vérifier la pertinence de la différenciation des cellules du

lait et du sang, compte tenu de l’état sanitaire de la mamelle et des techniques de

laboratoire appliquées. C’est dans ce but que la différenciation des cellules n’a pas

seulement été réalisée au microscope, mais aussi par cytométrie de flux à l’aide des

anticorps monoclonaux.

Comme le confirment les données présentées, la différenciation des cellules –

réalisée au microscope ou par cytométrie de flux – est plus pertinente pour le

diagnostic des mammites que les critères sélectionnés (nombre de cellules, activité

du NAGase, conductivité électrique). Ceci a été mis en évidence lors de l’observation

approfondie de la différenciation des cellules en fonction de l’état sanitaire de la

glande mammaire, qui montrait qu’il existe des différences significatives (p < 0,05)

entre la référence physiologique et les quartiers de la mamelle d’une vache atteinte

d’une mammite, définis comme sains. Cela signifie que les quartiers d’une mamelle

s’influencent mutuellement dans leur fonction et ne réagissent donc pas

indépendamment les uns des autres.

Résumé

146

La référence physiologique relative à la répartition des populations cellulaires a été

définie au microscope comme suit : 34 % de PMN, 25 % de lymphocytes et 39 % de

macrophages. En cas de mammite d’un degré élevé, il a été relevé 80 % de PMN,

7 % de lymphocytes et 13 % de macrophages. L’anticorps Bo116, de liaison d’une

structure de la surface des PMN non encore caractérisée, se lie, en raison d’une

mammite, à une plus grande partie de PMN (5 % / 24 %) avec diminution parallèle

de la densité de l’expression. De la même manière, il a pu être décrit des

modifications significatives causées par une mammite s’appliquant autant à la vitalité

des cellules qu’au taux et à la densité d’expression de CD4, CD8, TCR1 pour les

lymphocytes et CD14 pour les macrophages. Les modifications observées par

cytométrie de flux en particulier, mais aussi au microscope, peuvent également

s’appliquer aux leucocytes du sang (la tendance y étant cependant plus faible).

Comme l’ont montré les essais relatifs aux questions analytiques, il est impératif que,

pour effectuer la différenciation des cellules au microscope, les conditions suivantes

d’échantillonnage et de préparation soient remplies :

• les échantillons doivent être transportés dans du verre, la matière plastique

entraînant une réduction du pourcentage de phagocytes, en particulier des

macrophages.

• seuls les résultats d’un même chercheur doivent être comparés.

• seuls les enduits préparés par application d’une même technique donnent des

résultats comparables.

La méthode du "Kieler Sedimentausstrich" repose sur une seule opération de

centrifugation et sur l’enduit du sédiment riche en cellules sur une lame à l’aide d’un

œillet. Comparée à la méthode "Kaffeemühle", les enduits préparés avec cette

technique contenaient significativement plus de lymphocytes et moins de PMN

(p < 0,05). Contrairement à la préparation du "Kieler Sedimentausstrich", lors du

Résumé

147

procédé "Kaffeemühle", le sédiment obtenu après la première centrifugation est lavé

trois fois puis diffusé sur une lamelle par la force centrifuge.

La cytométrie de flux en combinaison avec la technique d’immunofluorescence de la

membrane, c’est-à-dire lors de laquelle les structures de la surface des cellules sont

marquées par des anticorps spécifiques colorés au fluorochrome, permet une

différenciation objective des cellules plus approfondie que celle réalisée au

microscope et à même de décrire, au-delà de la détermination du type des cellules,

le type et l’état de leurs fonctions. Les recherches sur la pertinence de la

différenciation des cellules par cytométrie de flux compte tenu de l’état sanitaire de la

mamelle et des conditions techniques permettent d’affirmer que :

• les résultats de la différenciation des cellules par cytométrie de flux ne sont

pas comparables avec ceux réalisés au microscope, si les anticorps utilisés

ne sont pas capables d’identifier tous les stades de développement d’un seul

type de cellule bovine.

• la cytométrie de flux permet la différenciation spécifique des cellules qui, au-

delà de toute considération purement morphologique, comprend également

des transformations de la surface ainsi que de la vitalité des cellules.

• la sélection des anticorps monoclonaux est d’une grande importance, c’est-à-

dire que parmi les anticorps disponibles dans le système bovin, seuls certains

sont aptes au marquage des cellules du lait. En ce qui concerne les

lymphocytes, cela est dû en partie aux différentes répartitions des sous-

populations dans le tissu. On trouve, par exemple, WC1 à la surface de

presque tous les lymphocytes T γδ du sang, mais rarement à la surface de

ceux du lait. Pour CD4, on a pu documenter que les anticorps de la même

spécificité, mais d’origine différente, se lient à une quantité significative

différente de lymphocytes du lait.

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Epilog

167

10. EPILOG

Während der Arbeit habe ich Rat und Unterstützung von vielen Seiten erfahren,

wofür ich allen Beteiligten Dank schulde.

Insbesondere danke ich Herrn Prof. Dr. Jörn Hamann für die Anregung des Themas,

die Schaffung der guten Arbeitsbedingungen und die vielfältig gewährten

Hilfestellungen auf dem Gebiet der Milchhygiene. Herr PD Dr. Hans-Joachim

Schuberth hat mir bei der Bewältigung des immunologischen Teils der Arbeit zur

Seite gestanden.

Des weiteren gilt mein Dank allen Mitarbeitern der Zentrumsabteilung Hygiene und

Technologie der Milch, die ihren nicht geringen Teil zum Gelingen der Arbeit

beigetragen haben. Vor allem haben Christa Borchers und Dr. Nils Grabowski viel

Geduld bei den langwierigen Zellzählungen am Durchflußzytometer bewiesen, und

die tatkräftige Mitarbeit von Roswitha Merle bei der Gewinnung der Zellsuspensionen

hat mir den Laboralltag erheblich erleichtert.

Die Mitarbeiter der Arbeitsgruppe Immunologie Udo Rabe und Silke Schöneberg

haben große Mengen an PBS und Trägerflüssigkeit fürs Durchflußzytometer

produziert und jederzeit für labortechnische Fragen zur Verfügung gestanden.

Bei der statistischen Analyse der erhobenen Daten haben mir Manfred Krückeberg

sowie die Mitarbeiter des Instituts für Biometrie, Epidemiologie und

Informationsverarbeitung Dr. Martin Beyerbach sowie Bettina Wandt geholfen.

Auch die gute Zusammenarbeit mit den Mitarbeitern des Lehr- und Forschungsgutes

Ruthe sowie dem Landwirt Thomas Meldau (Adelheidsdorf) soll nicht unerwähnt

bleiben.

Céline Barchewitz hat mich mit Geduld und Verständnis bei der französischen

Übersetzung der Zusammenfassung unterstützt. Meinem Vater möchte ich für seine

Bereitschaft danken, die Korrektur des Manuskripts zu übernehmen.

Documents

Untersuchungen zum Zelldifferentialbild in Milch …...3.5.2.1.4 Bestimmung des Zellgehaltes im VGH.....49 3.5.2.2 Kieler Sedimentausstrich .....50 3.5.2.3 Separation der somatischen