Vakzinationsversuche gegen Tuberkulose

Aus dem Hygieniscben Institut der Tierarztlichen Hochschule Hannover Direktor: Profesior Dr. Dr. h. c. Wagener

Vakzinationsversuche gegeii Tuberkulose

Von

E. MITSCHERLICH

Fur die Entwicklung von Schutzimpfungsverfahren zur Bekampfung der Rindertuberkulose war bislang die These maiigebend, dafi eine Immunitat gegen Tuberkulose nur so lange besteht, wie sich lebende Tuberkelbakterien im Organismus befinden (POPP, 1950; RAMON, 1952). Auf dieser These grun- det sich die Forderung, dafi wirksame Tuberkulosevakzinen lebende Tuberkel- bakterien enthalten mussen. Dieser Forderung haben bislang alle Vakzinen entsprochen, die zur Impfung der Rinder gegen Tuberkulose angewandt worden sind wie z.B.: Tauruman (KOCH, ScHu-rz, NEUFELD und MIESSNER), Bovovaccin (v. BEHRING), Vakzine mit lebenden Geflugeltuberkelbakterien (MCFADYEAN, SHEATHER, EDWARDS und MINETT), Schilfsackchenvakzine (HEYMANS), Tb 18 (UHLENHUTH), Antiphymatol (KLIMMER), BCG (CAL- METTE, GUERIN und FRITZSCHE), P-Stamm (GRAuB) , Vole-Stamm (WELLS, GRIFFITH, DALLING und PAGEL, 1940).

Bei Anwendung der Lebendvakzinen ergaben sich generell zwei Erkennt- nisse von grundlegender Bedeutung:

I . Durch Impfung mit geeigneten Lebendvakzinen kann bei Rindern cin deutlicher Schutz gegen Reinfektionen erzeugt werden. Der durch die Impfung erzeugte Schutz ist nicht absolut. Er wird durch massive Reininfektion durch- brochen.

2. Die Impflinge reagieren nach der Impfung mitunter bis zu 1 Jahr positiv auf Tuberkulin.

Aus der ersten Erkenntnis ergibt sich, dafi eine Tilgung der Rindertuber- kulose mit derartigen Impfverfahren allein nicht erreicht werden kann. Sie miifiten dazu in ihrer Wirkung durch hygienische Mafinahmen unterstutzt werden.

Aus der zweiten Erkenntnis folgt jedoch, dai3 die Impfung die Durch- fuhrung hygienischer Mafinahmen erschwert, weil es nunmehr nicht mehr so leicht ist, mit Hilfe der Tuberkulinprobe die als Ansteckungsquelle fungieren- den, naturlich infizierten Tiere zu erkennen und auszumerzen.

FRITZSCHE wies nach, daR in einem mit BCG-Vakzine geimpften Re- stande die Unterscheidung von geimpften und natiirlich infizierten Tieren durch gleichzeitige Anwendung von gereinigtem Rindertuberkulin und BCG- Tuberkulin bei Ausfuhrung der Tuberkulinprobe moglich ist. Angesichts der Tatsache aber, dai3 beim Rinde eine humane urid eine bovine Infektion nicht mit Sicherheit durch gleichzeitige Anwendung von humanem und bovinem Tuberkulin unterschieden werden kann (FROMM und WIESMANN; PLUM), erscheint es durchaus denkbar, dafi in der breiten Praxis oftmals auch naturlich infizierte Tiere durch gleichzeitige Anwendung von Rindertuberkulin und

Vakzinationsversuche gegen Tuberkulose 555

BCG-Tuberkulin nicht von Tieren unterschieden werden konnen, die rnit BCG-Vakzine geimpft wurden. Die Folge davon ware, dai3 naturlich infizierte Tiere durch die Tuberkulinprobe nicht mehr erfaBt werden und als Infektionsquellen im Bestande verbleiben. Es mui3 weiteren Untersuchungen vorbehalten bleiben, wieweit der von FRITZSCHE aufgezeigte Weg in der Praxis gangbar ist.

Zunachst erscheint jedoch die Auffassung berechtigt, dai3 die beiden MaB- nahmen zur Bekampfung der Rindertuberkulose, Impfung mit lebenden Er- regern und Ausmerzung der tuberkulinpositiven Tiere, nicht miteinander kom- biniert werden konnen.

Die staatliche Seuchenbekampfung mui3 unter diesen Umstanden heute auf eine Impfung mit Lebendvakzinen verzichten und die Tilgung der Tuber- kulose mit hygienischen Maanahmen unter Anwendung der Tuberkulinprobe anstreben. Diese Mafinahmen haben iiberall dort, wo sie folgerichtig nach der amerikanischen ,,stamping out"-Methode oder nach dem BANG'schen Ver- fahren ausgefuhrt wurden, wie in USA, Kanada, Danemark und Skandina- vien, zu groi3en Erfolgen gefiihrt. Es kann jedoch nicht verkannt werden, dai3 dieser Weg lang und muhevoll ist. In USA ist der Prozentsatz der positiven Reagenten in 32 Jahren von durchschnittlich 5 0 / 0 auf 0,53°/~1 herabgedruckt worden. In Danemark ist in 11 Jahren der Prozentsatz der verseuchten Herden von 73,50/0 auf 0,8°/0 gesunken. Auch wir in Deutschland werden lange Jahre gebrauchen, um die Tuberkulose alleine mit hygienischen Ma& nahmen zu tilgen.

Damit erhebt sich die Frage, ob es nicht moglich ist, Impfstoffe auszu- arbeiten, die bei den Impflingen wohl eine gewisse Immunitat aber keine Tuberkulinempfindlichkeit wie die Lebendvakzinen auslosen. Impfverf ahren, die die Durchfuhrung der Tuberkulinprobe nicht beeintrachtigen, wurden zusammen mit den derzeitigen hygienischen Mafinahmen Anwendung finden und sie wesentlich unterstiitzen konnen. Bei diesen Impfstoffen kann es sich nur um tote Impfstoffe handeln, die die immunogenen Bestandteile des Tu- berkelbakteriums enthalten und frei sind von den Bestandteilen, die die Tuberkulinempfindlichkeit bedingen.

Die Entwicklung derartiger Impfstoffe hat jedoch die Klarung von zwei wichtigen Grundfragen zur Voraussetzung:

1. 1st es moglich mit abgestorbenen Tuberkelbakterien ein Immunitat zu erzeugen? Die allgemeine Auffassung geht dahin, dai3 die Immunitat an die Anwesenheit lebender Tuberkelbakterien im Organismus gebunden ist.

2. Wenn es moglich ist, lassen sich die immunogenen Bestandteile des Tuberkelbakteriums von denen trennen, die die Tuberkulinempfindlichkeit bedingen?

Tatsachlich sind im Schrifttum zahlreiche Untersuchungen veroffentlicht worden, aus denen hervorgeht, dafi es moglich ist, durch Injektion abgetoteter Tuberkelbakterien eine gewisse Immunitat gegen kunstliche Infektionen init virulenten Erregern zu erzeugen. Eine derartige Schutzwirkung wurde u. a. bei der Verwendung von Vakzinen gesehen, die in folgender Weise behandelte Tuberkelbakterien enthielten:

A. Durch Warme abgetotete Tb-Bakterien ohne weitere besondere Zusatze beim Menschen von: WELLS, FLAHIFF und SMITH (1944), beim Rind von: CALMETTE und G U ~ R I N (1914), beim Kaninchen von: HOLTH (1930), FREUND und ONE (1937), RAW (zit. n. BERGER, 1931), Meerschweinchen von: PETROFF, BRANCH und JENNINGS S O W k RAW (Zit. n.BERGER, 1931), CALMETTE

37'

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(zit. n. KLIMMER, 1933), BRANCH und ENDERS (1935), BOQUET und LAPORTE (1937).

Durch Warme abgetotete Tb-Bakterien unter Zusatz von Formol beim Meerschweinchen von LAGRANGE und LAGRANGE (1935).

Durch Warme abgetotete Tb-Bakterien unter Zusatz von Mineralolen bzw. Lanolin, beim Meerschweinchen: COULAUD (1935/37), SAENZ (1937), GWAN (1939), SHUN-ICHI-Ro-YAMADA (1950).

B. Durch Formol abgetotete Tb-Bakterien beim Meerschweinchen: BRANCH und ENDERS (1935).

C. Mit Petrolather extrahierte Tb-Bakterien beim Kalb von: VALLEE (zit. n. CALMETTTE, 1936), beim Meerschweinchen von: HELMERT (1951).

D. Mit Ather und Aceton extrahierte Tb-Bakterien beim Kaninchen von: MACHEBOEUF und DIERYCK (1936).

E. Durch Ultraschallwellen abgetotete Tb-Bakterien beim Meerschwein- chen: KRESS (1948).

F. Durch ultraviolette Bestrahlung abgetotete Tb-Bakterien beim Meer- schweinchen: OLSON, HABEL und PJGOTT (1 947), PATERSON, CROMBIE und COLES (1949), SARBER, NUNGESTER urid STIMPERT (1950).

G. Durch Altersvorgange abgestorbene Tb- Bakterien beim Meerschwein- chen: LOWENSTEIN (zit. n. BERGER, 1931).

Die Erkenntnis, dai3 Tuberkulinempfindlichkeit und Tuberkuloseimmii- riitat unabhangig voneinander entstehen, hat heute durch zahlreiche experimentelle Untersuchungen belegt nahezu uneingeschrankt Anerkennung gef un- den (v. BEHRING zit. n. LOWENSTEIN, 1928; SEIFFERT, 1938; CORPER, 1940; CORPER und COHN, 1943; WEILAND, 1948; RAFFEL, 1950; van DEINSE, 1951; RAMON, 1952, u. a.).

Die Frage jedoch, welche chemischen Fraktionen der Tuberkelbakterien fur die Entstehung der Tuberkulinempfindlichkeit und Immunitat verantwortlich zu machen sind, ist noch nicht geklart. Die Losung dieses Problems erscheint deshalb besonders schwierig, weil die betreffenden Wirkstoffe wahr- scheinlich sehr komplexer Natur sind und u. LJ. bei einer chemischen Auf- schliei3ung der Tuberkelbakterien zerstort werden. So weist NEGRE (1950) darauf hin, da13 in vivo das antigene Vermogen der intakten abgetoteten Tuberkelbakterien bei weitem die Summe der antigenen Wirksamkeit ihrer chemischen Fraktionen ubertrifft.

Fur die Entstehung der Tuberkulinallergie ohne gleichzeitige Ausbildung einer Immunitat ist nach RAFFEL (1950) von den Leibessubstanzen der Tuber- kelbakterien ein Komplex verantwortlich zu machen, der sich aus einem Lipo- polysaccharid und Eiwei8 zusammensetzt.

Fur die Entstehung der Immunitat ohne gleichzeitige Ausbildung einer Tuberkulinallergie sind u. a. verantwortlich gemacht worden:

I . Die in Methylalkohol loslichen Substanzen abgetoteter nud zuvor mit Aceton extrahierter Tuberkelbakterien (BoQuET und NEGRE, 1922; NEGRE, 1950). Diese Fraktion durfte im wesentlichen Phosphatide enthalten. Es erscheint jedoch unwahrscheinlich, dai3 sie alle immunogenen Substanzen der Tuberkelbakterien urnfafit, da der nach einer Extraktion der Tuberkelbakte- rien mit Aceton und Ather verbleibende Ruckstand immunisierende Fahig- keiten besitzt (MACHEBOEUF und DIERYCK, 1936).

2. Die in Athylalkohol unlosliche Fraktion eines Ather-Athylalkohol- extraktes abgetoteter Tuberkelbakterien (KROPP und FLOYD, 1947/48). Sie besteht aus einem proteinfreien Kohlehydrat-Lipoidkomplex.


3. Die in Chloroform losliche Fraktion eines Prazipitates, das aus einem Paraffinolextrakt abgetoteter Tuberkelbakterien, durch Zusatz von Dioxan gewonnen wird (CHOUCROUN, 1947). Die Fraktion besteht nach CHOUCROUN aus Polysaccharidestern der Mykolsaure.

Eigene Untersuchungen

Eigene Untersuchungen sollten nunmehr dazu dienen, nachzuweisen, ob Lei kleinen Versuchstieren eine aktive Immunitat gegen Tuberkulose erzeugt werden kann:

1. Durch Injektion abgetoteter Tuberkelbakterien. 2 . Durch Injektion des Methylantigens von BOQUET und N ~ G R E ohne

gleichzeitige Sensibilisierung gegenuber Tuberkulin. 3. Durch Injektion des von KROIJP und FLOYD beschriebenen Kohle-

hydrat-Lipoidkomplexes zusammen mit keimfreien Filtraten flussiger Kul- turen ohne gleichzeitige Sensibilisierung gegeniiber Tuberkulin.

LaJt sich durch Injektion abgetoteter Tuberkelbakterien eine lmmunitat gegen Tuberkulose erzeugen?

Zur Prufung der Frage wurde eine Vakzine verwandt, die durch Ultra- schallwellen und ultraviolette Bestrahlung abgetotete Tuberkelbakterien enthielt. Bei der Herstellung von Vakzinen kommt der Auswahl gut immunisie- render Stamme und geeigneter Adjuvantien, die die Wirksamkeit der immunisierenden Substanzen im Organismus fordern, eine besondere Bedeutung zu. In der vorliegenden Arbeit wurden aus technischen Grunden keine besonders ausgewahlten Stamme zur Vakzineherstellung verwandt. Als Adjuvans diente Aluminiumhydroxyd.

Zur Herstellung der Vakzine wurden Tuberkelbakterien des humanen Stammes ,,Washington I" aus 17-, 26- und 49tatigen Glyzerinbouillonkulturen abfiltriert, auf dem Filter ausgewaschen und darauf in einer Schuttelflasche mit physiologischer Kochsalzlosung und Glasperlen zu einer homogenen Sus- pension verarbeitet. Die Suspension wurde in Erlenmeyerkolben 6 Stunden mit einem Ultraschallgerat der Fa. Siemens & Schuckert't) (Frequenz 350 kHz, Ultraschalleistung maximal 6,5 W/qcm) beschallt. Bei der Beschallung stieg die Temperatur in dem Kolben auf 65" C an. Die Tuberkelbakterien biiflten zu 90°/0 ihre Saurefestigkeit ein. Nach der Beschallung wies die Suspension mit physiologischer Kochsalzlosung 1 /12,5 verdunnt dieselbe Trubung auf wie eine Mischung von 0,3 ccm einer lO/oigen Bariumchloridlosung rnit 9,7 ccm einer 10/oigen Schwefelsaure. Zu 105 ccm der unverdunnten beschallten Sus- pension wurden 35 ccm Aluminiumhydroxydsuspension hinzugefugt. Die Mischung blieb uber Nacht stehen, wurde anschliei3end durch Zentrifugieren auf 90 ccm eingeengt und darauf zur abschlieflenden Sterilisierung in flacher Schicht in Petrischalen 10 Minuten ultraviolett rnit einem HQS-Brenner 100 bestrahlt. Die Vakzine erwies sich kulturell und im Meerschweinchenversuch als steril. Sie erzeugte bei Meerschweinchen nach der subkutanen Injektion von 0,3 und 0,5 ccm in l4tagigem Abstand eine deutliche Allergie gegenuber Tu- berkulin. Sie wurde nunmehr vergleichend mit dem BCG-Impfstoff im Meer- schweinchen- und Hamsterversuch auf ihre immunisierende Wirksamkeit uber- pruft.

Der Meerschweinchenversuch gliederte sich in 3 Versuchsgruppen. Die 1. Gruppe umfaflte 12 Tiere, von denen jedes 0,3 ccm und 14 Tage spater

:)) Fur die Uberlassung des Ultraschallgerates sei der Fa. Siemens & Schuckert auch an dieser Stelle bestens gedankt.

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0,5 ccm der beschallten und bestrahlten Vakzine subkutan injiziert erhielt. Die 2. Gruppe bestand aus 13 Meerschweinchen, die je 0,042 mg und 14 Tage spater 0,083 mg lebender BCG-Bakterien in 0,5 ccm physiologischer Koch- salzlosung subkutan erhielten. Die 3. Gruppe umfat3te 15 Tiere. Sie dientm als Kontrollen und wurden nicht vakziniert. Alle Tiere wurden 2 Monate nach der 1. Impfung mit O,1 mg lebender Tuberkelbakterien einer Iltagigen Glyzerinbouillonkultur des Stammes ,,Washington I" subkutan infiziert. Die Infektionsdosis enthielt auf Grund einer gleichzeutigen Austitrierung im Meer- schweinchenversuch ca. 1 Million Tuberkelbakterien.

Der Hamsterversuch wurde in analoger Weise wie der Meerschweinchen- versuch angesetzt. Gruppe 1 umfat3te 18 Tiere. Jedes Tier erhielt 0,3 ccm und 14 Tage spater O,I ccm der beschallten und bestrahlten Vakzine subkutan injiziert. Die 2. Gruppe bestand aus 16 Tieren, von denen jedes 0,042 mg und 14 Tage spater 0,083 mg BCG-Bakterien in 0,5 ccm physiologischer Kochs.ilz- losung subkutan erhielt. Die 3 . Gruppe umfafite 21 Tiere, die als Kontrolle unbehandelt blieben. Alle Tiere wurden 2 Monate nach der 1. Impfung gleichzeitig mit den Meerschweinchen mit I ,5 mg (1 5 Millionen) Tuberkelbakterien desselben Infektionsmaterials subkutan infiziert.

Als maflgebend fur die Beurteilung des Wertes der beiden Vakzinations- verfahren wurde die Uberlebensdauer der Tiere in den vakzinierten Gruppen im Vergleich zu den nicht geimpften Kontrollgruppen angesehen (LOWEN- STEIN, 1928; CORPER und COHN, 1943; SWEDBERG, 1951). Das Ergebnis beider Versuche ist in Tabelle I zusammengefafit.

Aus Tabelle 1 ergibt sich, dat3 die unvorbehandelten Kontrolltiere der Infektion am schnellsten erliegen. Die rnit BCG-Vakzine geimpften Tiere

T a b e l l e 1

H u n d e r t s a t z d e r U b e r l e b e n d e n ? r n i t B C G , r n i t e i n e r b e s c h a l l t e n u n d u l t r a v i o l e t t b e s t r a h l t e n V a k z i n e g e i m p f t e n u n d u n v o r - b e h a n d c 1 t e n k u n s t I i c h e r

I n f e k t i o n M e e r s c h w e i n c h e n u n d H a m s t e r n a c h

~~

Wochen nach dcr

Infektion

1 3 5 7 9

11 13 15 17

H u n d e r t s a t z d e r i i b e r l e b e n d e n T i e r e

M e e rs c h w e i n c h c '1 v e rs u c 11 vorbehandelt mit

beschallter 1 un- BCG und bcstrahl- 1 vor-

Vakzine , ter Vakzine behandelt I I

100 ~ 100 1 100 100 100 1 100 100 100 I 5 3 100 100 46 100 92 I 40

85 67 3 3 85 I 50 20 85 33 I 13 77 17 7

H a ni s t e r v e r s u c h

vorbehandelt niit beschalltcr ' un-

1 und bestrahl- vor- ter Vakzine behandelt

100 100 I 100

B(3G

100 100 96 9 5 91

77 95 90 67

84 1 48 38

38 19 39 0

widerstanden der Infektion erheblich langer als die Kontrollen. Die mit der beschallten und bestrahlten Vakzine geimpften Hamster wiesen gegenuber der Infektion dieselbe Widerstandskraft auf wie die mit BCG geimpften. Die mic beschallten und bestrahlten Vakzine geimpften Meerschweinchen widerstanden der Infektion langer als die Kontrolltiere, wenn auch nicht so lange wie die


rnit BCG geimpften Meerschweinchen. Aus dem Versuch mui3 geschlossen werden, dai3 die Vakzine, die durch Beschallung und Bestrahlung abgetotete Tuberkelbakterien enthielt, bei Hamstern dieselbe und bei Meerschweinchen eine etwas geringere immunisierende Wirkung entfaltete als der BCG-Impf- stoff, daneben erzeugte sie eine Allergie gegenuber Tuberkulin.

Labt sich d,urch lnjektion des Methyiantigens von BOQUET und NEGRE ohne gleichzeitige Sensibilisierung gegenuber Tuberkulin eine Immunitat gegen

Tuberkulose erzeugen? Zur Prufung der Frage wurde eine Methylantigenvakzine mit und eine

ohne Aluminiumhydroxyd hergestellt und auf ihre immunisierende Wirkung im Meerschweinchenversuch untersucht. Von 8 Wochen alten flussigen HENLEY- Kulturen eines humanen Stammes wurden die Tuberkelbakterien abfiltriert und getrocknet. 4 g getrocknete Bakterien wurden zunachst 5 Tage mit 200 ccm Aceton bei Zimmertemperatur extrahiert, darauf abfiltriert, getrocknet und nunniehr 10 Tage mit 200 ccm Methylalkohol bei Zimmertem- peratur extrahiert. Der so gewonnene Methylalkoholextrakt wurde durch Seitz EK-Schichten filtriert zur weitgehenden Entfernung seines Alkohol- gehaltes auf seines Volumens durch Verdunsten eingeengt und danach durch langsames Zufugen von physiologischer Kochsalzlosung wieder auf sein altes Volumen aufgefullt. Zur Herstellung der ersten aluminiumhydroxydhaltigen Vakzine wurde der Extrakt nunmehr mit gleichen Teilen einer Alu- miniumhydroxydsuspension und zur Herstellung der zweiten aluminiumhydroxydfreien Vakzine mit gleichen Teilen physiologischer Kochsalzlosung versetzt. Beide Vakzine wurden anschlieaend mit 0,5O/o Phenol konserviert. Sie erwiesen sich in Kultur- und Meerschweinchenversuch als steril. Bei Meer- schweinchen losten beide Impfstoffe nach subkutaner Injektion von 1 ccm und 1,5 ccm im Abstand von 14 Tagen keine Tuberkulinallergie aus.

Zur Prufung der immunisierenden Wirkung wurden mit der aluminiumhydroxydhaltigen Vakzine 17 Meerschweinchen geimpft. Sie erhielten je Tier 1 ccm und 2, 11, 21 und 29 Wochen spater nochmals 1,5 ccm Vakzine subkutan injiziert. Mit der aluminiumhydroxydfreien Vakzine wurden 15 Meer- schweinchen in gleicher Weise behandelt. Zur Kontrolle blieben 20 Meer-

Wochen nach der Infektion

12 14

H u n d e r t s a t z d e r i i b c r l e b e n d e n T i e r e vorbehandelt mit

A1 (OH),-haltiger 1 A1 (OH), - freier I un- Vakzine vorbehandelt Vakzine

100 100 , 95 8 8 100 95 I

16 18 20 22 24 26 28 30

76 70 70 65 53 41 35 18

100 94 81 81 75 63 56 56

95 I 85

80 80 80 70 60 45

I

560 MITSCHERLICH

schweinchen unbehandelt. Alle Tiere wurden 4 Wochen nach Versuchsbeginn mit 0,0001 mg Tuberkelbakterien subkutan infirziert. Die Infektionsdosis enthielt auf Grund einer gleichzeitig angesetzten Titration am Meerschweinchen ca. 10 000 Tuberkelbakterien. In den beiden vakzinierten Gruppen wurden die Impfungen nach der Infektion in den genannten Zeitintervallen fort- gesetzt, weil das Methylantigen nach NEGRE (1950) auch therapeutisch wirk- Sam ist.

Die Bewertung der Wirksamkeit beider Vakzine erfolgte wiederum auf Grund der Oberlebensdauer der Tiere in den drei Versuchsgruppen. Das Ergebnis des Versuches ist in Tabelle 2 zusammengefai3t.

Aus Tabelle 2 ergibt sich, dafl die mit der aluminiumhydroxydfreien Vakzine geimpften Versuchstiere etwa so schnell der Infektion erlagen wie die unvorbehandelten Kontrollen. Die mit der aluminiumhydroxydhaltigen Vakzine geimpften Versuchstiere erlagen der Infektion noch etwas fruher.

Eine immunisierende und allergisierende Wirkung konnte somit bei beiden methylantigenhaltigen Vakzinen nicht nachgewiesen werden.

LaJ t sich durch Injektion des v o n KROPP und FLOYD beschriebenen Kohle- hydrat-Lipoidkomplexes zusammen mit keirnfrt+em Filtrat flissiger Kulturen ohne gleichzeitige Sensibilisierung gegenuber Tuberkulin eine Immunitat gegen

Tuberkulose erzeugen? Zur Prufung der Frage wurde an Meerschweinchen und Hamstern die

immunisierende Wirkung einer Aluminiumhydroxydvakzine gepruft, die neben dem Kohlehydrat-Lipoidkomplex von KROPP und FLOYD keimfreies Filtrat 8 Wochen alter Glyzerinbouillonkulturen enthielt. Das Kulturfiltrat wurde zur Bereitung der Vakzine mitverwandt, weil es nicht ausgeschlossen erschien, dai3 es immunisierende Substanzen enthielt. Zur Bereitung der Vak- zine wurden 8 Wochen alte Glyzerinbouillonkulturen des Laboratoriumstam- mes 9828 durch Seitz EK-Schichten filtriert und das erhaltene Filtrat rnit 0,5O/0 Formalin konserviert. Darauf wurde das Filtrat im Verhaltnis von 14 : 1 mit einer Aluminiumhydroxydsuspension versetzt, iiber Nacht stehen gelassen und am folgenden Morgen auf l/S seines ursprunglichen Volumens durch Zentrifugieren eingeengt. Die auf dem Filter verbleibenden Bakterien wurden in 45 Minuten bei 110" C im Autoklaven abgetotet und darauf getrocknet. 10 g getrocknete Bakterien wurden rnit 200 ccm einer Mischung von Ather sulfuricum und Alcoholus absolutus etm a 14 Tage bei Zimmertemps- ratur extrahiert. Der Extrakt wurde durch Seitz EK-Schichten filtriert und im Wasserbad abdestilliert bis ein gelblichbrauner, zahfliissiger Ruckstand verblieb. Der Ruckstand wurde mit Ather extrahiert bis keine gelbliche Farbe mehr in Losung ging. Der so erhaltene Extrakt wurde mit absolutem Alkohol versetzt, worauf ein Niederschlag auftrat, der abzentrifugiert und getrocknet wurde. Er stellte das von KROPP und FLOYD beschriebene Kohlehydrat- Lipoidantigen dar. Zur Bereitung der Vakzine wurde unter leichter Erwar- mung zu 100 ccm des Aluminiumhydroxydkulturfiltrates 100 mg Antigen hinzugefugt und gut geschiittelt. Die Vakzine erwies sich im Kultur- und Meerschweinchenversuch als steril. Sie loste bei Meerschweinchen nach zwei- maliger Injektion von 1 ccm im Abstand VOII 14 Tagen keine Tuberkulin- allergie aus.

Zur Prufung der immunisierenden Wirksamkeit erhielten 28 Meer- schweinchen je 0,5 ccm und 18 Hamster je 0,3 ccm Vakzine subkutan injiziert. Die Impfung wurde nach 14 Tagen in gleicher Dosierung wiederholt. Weitere 24 Meerschweinchen und 16 Hamster blieben zur Kontrolle unbehandelt. Vier Wochen nach Versuchsbeginn wurden die Meerschweinchen mit


0,000 001 mg (ca. 10) Tuberkelbakterien und die Hamster mit 0,001 mg (ca. 10 000) Tuberkelbakterien subkutan infiziert. Die Zahl der in der Infektions- dosis enthaltenen lebenden Tuberkelbakterien wurde durch eine gleichzeitig angesetzte Titration im Meerschweinchenversuch bestimmt. Fur die Bewertung der Wirksamkeit der Vakzine war wie in den vorhergehenden Versuchen die Oberlebensdauer der Versuchstiere mai3gebend. Das Ergebnis des Versuches ist in Tabelle 3 zusammengefai3t.

Aus Tabelle 3 geht hervor, dai3 die vakzinierten Meerschweinchen und Hamster der Infektion genau so rasch erlagen wie die nicht geimpften Kon-

T a b e l l e 3

H u n d e r t s a t z d e r u b e r l e b e n d e n , m i t e i n e r K u l t u r f i l t r a t u n d K o h l e h y d r a t - L i p o i d e d e r T u b e r k e l b a k t e r i e n e n t h a l t e n e n V a k - z i n e g e i m p f t e n u n d u n v o r b e h a n d e l t e n M e e r s c h w e i n c h e n u n d

H a m s t e r n a c h k u n s t l i c h e r I n f e k t i o n

nach der Infektion

H u n d e r t s a t z d e r u b e r l e b c n d e n Wochen I

M e e r s c h w e i n c h e n H a m s t e r

vakziniert ~ unvorbehandelt vakziniert unvorbehandelt

6 8

10 12 14 16 18 20 22 24 26

~~~~ ~~

100 100 96 I 96 89 87 96 96

92 79 59

73 69 93 29 37 75

0 19 65 34 21

6 - 0 17

- 14 8 4 8 0 8

4

i 28 I

-

- - - - - - - -

Zusammenfassung Bei der Bekampfung der Rindertuberkulose stoi3t die Anwendung von

Vakzinen, die lebende Erreger enthalten, auf besondere Schwierigkeiten. Einer- seits ist der durch sie erzeugte Impfschutz nicht so groi3, dai3 die Seuche allein mit ihrer Hilfe getilgt werden kann. Zum anderen sensibilisieren sie die Impf- linge gegen Tuberkulin und verhindern so eine erfolgreiche Seuchentilgung durch die Erfassung und Ausmerzung der naturlich infizierten Tiere auf Grund einer Tuberkulinisierung der Bestande.

In einer Schrifttumsiibersicht wird darauf hingewiesen, dai3 auch Vak- zinen, die tote Tuberkelbakterien enthalten, Immunitat erzeugen und dai3 Tuberkuloseimmunitat und Tuberkulinallergie in ihrer Entstehung auf ver- schiedene, wenn auch z. T. noch unbekannte, Leibessubstanzen der Tuberkel- bakterien zuriickzufuhren sind. So sol1 eine immunisierende Wirkung gegen Tuberkulose ohne Sensibilisierung gegenuber Tuberkulin u. a. folgenden Fraktionen der Tuberkelbakterien zukommen:

1. Dem Methylantigen nach BOQUET und N ~ G R E ; 2. einem Kohlehydrat-Lipoidkomplex nach KROPD und FLOYD; 3 . Polysaccharidestern der Mykolsaure nach CHOUCROUN.

562 MITSCHERLICH

Damit eroffnet sich die Moglichkeit, zur Bekampfung der Rindertuber- kulose Vakzinen zu entwickeln, die die Impflinge nicht gegen Tuberkulin sensibilisieren und die so zusammen mit hygienischen Mafinahmen, die sich auf der Tuberkulinisierung der Bestande grundeii, angewandt werden konnen.

In eigenen Versuchen zeigte eine Vakzine, die durch Ultraschall und ultraviolette Bestrahlung abgetotete Tuberkelbakterien enthielt, bei Hani- stern die gleiche und bei Meerschweinchen eine etwas geringere immunisierende Wirkung als der BCG-Impfstoff. Meerschweinchen reagierten nach der Vakzination positiv auf Tuberkulin.

Eine immunisierende Wirkung des Methylantigens von BOQUET und NEGRE konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Zwei Vakzinen, die das nach BOQUET und N ~ G R E aus Tuberkelbakterien gewonnene Methylantigen enthielten und von denen die eine mit und die andere ohne Aluminium- hydroxyd hergestellt worden war, zeigten im Meerschweinchenversuch weder eine allergisierende noch eine immunisierende Wirkung.

Ebenso konnte eine immunisierende Wirkung des von KROPP und FLOYD angegebenen Kohlehydrat-Lipoidkomplexes der Tuberkelbakterien nicht nachgewiesen werden. Eine Vakzine, die den nach KROPP und FLOYD aus Tuber- kelbakterien gewonnenen Kohlehydrat-Lipoidkomplex, keimfreies Kultur- filtrat 8 Wochen alter Glyzerinbouillonkulturen und Aluminiumhydroxyd enthielt, liefi im Meerschweinchenversuch weder eine allergisierende noch eine immunisierende Wirkung erkennen.

Summary

Experiments in vaccination against tuberculosis In the fight against bovine tuberculosis, particular difficulties are en-

countered when vaccines containing live bacteria are used. First, the protection afforded by them is not enough to eradicate the disease. Moreover the vac- cinated animals become sensitive to tuberculin and thus prevent the use of tuberculin-testing . . of herds to recognise and eliminate naturally affected animals.

In the Dresent exDeriments. a vaccine containing tubercle bacteria which had been killed by ulirasound and ultraviolet rays &owed the same immunizing effect as the BCC-vaccine when used on hamsters and slightly less on guinea-pigs. After vaccination the guinea-pigs showed a positive tuberculin reaction.

The immunizing effect of the methyl-antigen of BOQUET and NEGER could not be proved. Two vaccines containing methyl-antigen taken from tubercle bacteria according to the method of BOQUET and NEGRE were used, one being made with aluminium-hydroxide and the other without, but in the guinea-pig experiment they showed neither allergic nor immunizing effect.

Nor could the immunizing effect of the carbohydrate-lipoid complex from the tubercle bacteria (KROPP and FLOYD) be proved. A vaccine containing the KROPP and FLOYD carbohydrate-lipoicl complex, germ-free filtrate of eight weeks old glycerine bouillon culture and aluminium hydroxide showed neither allergic nor immunizing effect on the guinea-pigs.

Resume

Essais de vaccination contre la tuberculose

Dans la lutte contre la tuberculose bovine l’emploi de vaccins contenant des germes vivants rencontre de strieuses difficultis. D’une part, la protec-


tion qu’ils confkrent n’est pas assez grande pour que l’on puisse venir A bout de la maladie par ce seul moyen. Et d’autre part, ils sensibilisent les animaux vaccinks envers la tuberculine et emptchent ainsi l’extermination efficace de la maladie par la dkcouverte et l’klimination des animaux naturellement in- fectks, au moyen de la tuberculinisation des effectifs.

Dans nos expkriences personelles, un vaccin contenant des bacilles tuberculeux tuks par des radiations ultra-violettes et ultrasoniques f i t preuve chez le hamster de la m&me activitk et chez le cobaye d’une activitk immunisante un peu plus faible que le vaccin BCG. Les cobayes rkagirent, aprks vaccination, positivement B la tuberculine.

Une activitk immunisante de l’antigkne (Methylantigen) de BOQUET et NEGRE ne put pas t t re constatke. Deux vaccins contenant l’antigkne obtenu d’aprks le prockdk de BOQUET et NEGRE B partir des bacilles de KOCH et dont l’un fut prkpark avec de l’hydroxyde d’aluminium et l’autre sans, ne provo- qukrent, dans l’essai sur le cobaye ni allergie, ni immunitk.

De mtme aucune activitk immunisante ne put ttre dkcelke avec le complexe hydrates de carbone-lipoides des bacilles tuberculeux indiqut par KROPP et FLOYD. Un vaccin contenant ce complexe (d’aprks KROPP et FLOYD), un filtrat stkrile de cultures vieilles de 8 semaines dans du bouillon B la glycerine et de l’hydroxyde d’aluminium, ne permit d’obtenir, dans l’essai sur le cobaye ni allergie, ni immunitk.

Resumen

Ensayos de vacunaci6n frente a la tuberculosis

En la lucha contra la tuberculosis bovina, la utilizaci6n de vacunas que contienen agentes etiol6gicos vivos tropieza con especiales dificultades. Por una parte, la protecci6n producida por ella no es tan grande como para extin- guir la epizootia con su h i c a ayuda. Por otra parte, sensibilizan a 10s vacu- nados frente a la tuberculina e impiden asi la erradicacibn eficaz ed la epizootia abarcando y eliminando 10s animales naturalmente infectados, some- tiendo a kstos a la tuberculinizaci6n.

En algunas experiencias una vacuna, que contenia bacterias tuberculosas muertas por ultrasonido y rayos ultravioleta, mostr6 en 10s hamsters la misma acci6n que la vacuna del BCG y algo menor en el cobaya. Los cobayas re- accionaban positivamente frente a la tuberculina despuks de la vacunacion.

Sin embargo, no se pudo demostrar una acci6n inmunizante del antigeno metilico de BOQUET y NEGRE. Dos vacunas, que contenian el antigeno metilico obtenido de bacterias tuberculosas s e g h la tkcnica de BOQUET y NEGRE y de las cuales una habia sido obtenida con hidr6xido de aluminio y la otra sin el, no mostraron en la experiencia del cobaya ni una acci6n alergizante ni inmunizante.

Igualmente no se pudo demostrar una accion inmunizante del complejo hidrato de carbono-lipoide citado por KROPP y FLOYD en 10s bacilos de KOCH. Una vacuna que contenia el complejo carbohidrato - lipoide obtenido de bacilos tuberculosos s e g h la tkcnica de KROPP y FLOYD, filtrado de cultivo libre de gkrmenes, obtenido a partir de cultivos en caldo glicerinado de 8 se- manas de edad, e hidr6xido aluminico, no permiti6 reconocer en la experiencia con 10s cobayas una accion alergizante ni inmunizante.

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564 MITSCHERLICH

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Vakzinationsversuche gegen Tuberkulose