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Steve K. Alexander / Dennis Strete
Mikrobiologisches Grundpraktikum:
Ein Farbatlas
Deutsche Bearbeitung von Erika Kothe
Aus dem Amerikanischen von Hans W. Kothe und Erika Kothe
3Färbetechniken für Bakterien
Anwendung im Labor: Vorbereitung der Zellen für die Färbung . . . . . . . . . . . . . . . . 36Ziel .und .Vorgehensweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36Tipps .für .die .Praxis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36Zu .erwartende .Resultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
Darstellung morphologischer Merkmale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
Anwendung im Labor: Einfachfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37Ziel .und .Vorgehensweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37Tipps .für .die .Praxis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37Zu .erwartende .Resultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
Anwendung im Labor: Negativkontrastierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38Ziel .und .Vorgehensweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38Tipps .für .die .Praxis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38Zu .erwartende .Resultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
Differenzierende Färbungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
Anwendung im Labor: Gram-Färbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39Ziel .und .Vorgehensweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39Tipps .für .die .Praxis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40Zu .erwartende .Resultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
Anwendung im Labor: Säurefestigkeitsfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44Ziel .und .Vorgehensweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44Tipps .für .die .Praxis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45Zu .erwartende .Resultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
Färbung von Zellstrukturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
Anwendung im Labor: Kapselfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46Ziel .und .Vorgehensweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46Tipps .für .die .Praxis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46Zu .erwartende .Resultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
Anwendung im Labor: Endosporenfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47Ziel .und .Vorgehensweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47Tipps .für .die .Praxis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48Zu .erwartende .Resultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
Anwendung im Labor: Geißelfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49Ziel .und .Vorgehensweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49Tipps .für .die .Praxis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49Zu .erwartende .Resultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
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3 Färbetechniken FÜr bakterien
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Anwendung im Labor: Vorbereitung der Zellen für die Färbung
Zu erwartende Resultate
Nach .der .Färbung .ähnelt .ein .gutes .Ausstrichpräparat .der .Aufnahme .aus .EAbb. 3.1 . .Da .die .die .Dichte .der .Zellen .am .Rande .normalerweise .etwas .geringer .ist, .beginnt .man .mit .der .mikroskopischen .Untersuchung .am .besten .in .der .Mitte .und .fährt .von .dort .nach .außen, .bis .man .eine .Stelle .gefunden .hat, .wo .die .Zellen .nicht .mehr .übereinander .liegen .
Werden .Bakterien .vor .der .mikroskopischen .Untersuchung .angefärbt, .erkennt .man .ihre .typischen .Merkmale .zumeist .sehr .viel .besser, .etwa .die .genaue .Größe, .die .Form .und .die .Anordnung .der .Zellen, .aber .oft .auch .bestimmte .chemische .Eigenschaften . oder . andere . Besonderheiten . des . untersuchten .Bakteriums . .Dadurch .ist .es .dann .in .vielen .Fällen .
sehr .viel .leichter, .die .entsprechenden .Mikroorganismen .zu .bestimmen . .In .diesem .Kapitel .sollen .die .wichtigsten .Färbemethoden .für .Bakterien .vorgestellt .werden, .die .man .in .mikrobiologischen .Labors .routinemäßig .zur .Untersuchung .von .Bakterien .verwendet .
Abb. 3.1 Ein hitzfixierter und mit Kristallviolett gefärbter Bakterienausstrich auf einem Objektträger. Die Mitte solcher Präparate ist für die Untersuchung zumeist ungeeignet, weil die Zellen dort zu dicht liegen, so dass man sich am besten eine Stelle in den äußeren Bereichen heraussucht.
Ziel und Vorgehensweise
Sowohl .aus .der .Natur .isolierte .Bakterien .als .auch .bakterielle .Krankheitserreger .aus .der .klinischen .Praxis .werden .normalerweise .auf .Agar-Nährböden .oder .auch .in .Flüssig-medien .kultiviert .(siehe .Kapitel .4) . .Um .diese .Organismen .anfärben .zu .können, .muss .man .zunächst .Ausstrichpräpa-rate .anfertigen, .das .heißt, .man .überträgt .Teile .der .Kultur .mit . einer . sterilen . Impföse . auf . einen . Objektträger . . Dazu .müssen .Zellen, .die .von .festen .Nährböden .stammen, .sorgfältig .in .einen .kleinen .Wassertropfen .auf .dem .Objektträger .gemischt .werden, .bis .die .Flüssigkeit .eine .leicht .milchige .Farbe .angenommen .hat, .während .man .aus .einer .hoch .gewachsenen .Flüssigkultur .einfach .einen .Tropfen .Flüssigkeit .entnimmt .und .diesen .auf .den .Objektträger .überführt . .Anschließend .lässt .man .die .Flüssigkeit .an .der .Luft .eintrocknen .und .zieht .den .Objektträger .dann .mehrmals .durch .die .Flamme .eines .Bunsenbrenners, .um .die .Zellen .fest .auf .dem .Glas .zu .fixieren .(Hitzefixierung) .
Tipps für die Praxis
. . Bringen .Sie .die .Flüssigkeitstropfen .in .der .Mitte .des .Objektträgers .auf, .damit .Sie .die .Objekte .beim .Färben .und .bei .der .mikroskopischen .Untersuchung .leichter .finden .
. . Achten .Sie .darauf, .dass .die .Objekte .auf .einen .kleinen .Bereich . beschränkt . bleiben, . damit . das . Färbemittel .auch .alle .Zellen .erreicht . .
. . Versuchen .Sie .ein .Zusammenklumpen .der .Zellen .zu .vermeiden, .weil .das .Färbemittel .die .Bakterien .im .Inneren .eines .solchen .Haufens .zumeist .nicht .erreicht .
Darstellung morphologischer Merkmale
Darstellung morphologischer Merkmale
Um .morphologische .Merkmale .von .Bakterien .darzustellen, .werden . entweder . die . Zellen . oder . auch . der . Hintergrund .des .Präparates .gefärbt, .weil .man .dadurch .normalerweise .genauere .Informationen .über .Zellgröße .oder .Form .und .Anordnung .der .Objekte .erhält . .Grundsätzlich .lassen .sich .die .verwendeten . Farbstoffe . in . zwei . Gruppen . unterteilen: . In .basische, .positiv .geladene .und .saure, .negativ .geladene .Färbemittel . .Der .Unterschied .besteht .darin, .dass .sich .basische .Farbstoffe .an .negativ .geladene, .also .basophile .(saure) .Komponenten . des . Untersuchungsobjektes . anlagern, . während .
es .bei .sauren .Farbstoffen .die .positiv .geladenen, .also .azidophilen . (basischen) . Komponenten . sind . . Daher . gilt . bei .Bakterienfärbungen: .basische .Farbstoffe .färben .die .negativ .geladene .Bakterienzellwand, .während .saure, .negativ .geladene .Färbemittel .abgestoßen .werden . .Dadurch .nehmen .die .Zellen . im .erstgenannten .Fall .die .Farbe .des .Färbemittels .an, .während .im .zweiten .Fall .nur .die .Umgebung .der .Zelle .gefärbt .wird, .was .allerdings .die .Umrisse .der .Bakterien .deutlicher .hervortreten . lässt . (Negativfärbung) . .Typische, .basische .Farbstoffe .sind .Kristallviolett, .Methylenblau .und .Safranin; .zu .den .sauren .Farbstoffen .gehören .Kongorot, .Nigrosin .und .Eosin .
Anwendung im Labor: Einfachfärbung
Ziel und Vorgehensweise
Im .einfachsten .Fall .werden .Bakterien .mit .nur .einem .Farbstoff .gefärbt, .um .Größe, .Form .und .Anordnung .der .Zellen .besser .erkennen .zu .können . .Das .Färbemittel .wird .auf .das .hitzefixierte .Präparat .getropft .und .anschließend .mit .Wasser .wieder .abgespült . .Nach .dem .Trocknen .kann .das .Präparat .dann .im .Mikroskop .untersucht .werden .
Tipps für die Praxis
. . Achten . Sie . darauf, . dass . das . Färbemittel . über . den .gesamten .Ausstrich .verteilt .ist .
. . Drücken . Sie . beim . Spülen . des . Präparats . mit . der .Spritzflasche .nicht .zu .stark, .damit .die .Objekte .nicht .abgewaschen .werden .
. . Spülen .Sie .das .Präparat .so .lange, .bis .sich .keine .Farbwolken .mehr .lösen .
. . Wischen .Sie .das .Präparat .keinesfalls .ab, .sondern .lassen .Sie .es .an .der .Luft .trocknen .
Zu erwartende Resultate
Die .EAbb. 3.2 bis 3.4 .zeigen .Bakterien, .die .mit .Kristallviolett .oder .Methylenblau .gefärbt .wurden . .Da .die .Zellen .die .Farbe .des .jeweiligen .Färbmittels .angenommen .haben, .sind .Größe, .Form .und .Anordnung .besser .zu .erkennen .
Abb. 3.2 Mit Kristallviolett gefärbte, kugelförmige Zellen von Staphylococcus aureus (x 2.500).
Abb. 3.3 Mit Methylenblau gefärbte, stäbchenförmige Zellen von Escherichia coli (x 2.500).
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3 Färbetechniken FÜr bakterien
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Anwendung im Labor: Negativkontrastierung
Ziel und Vorgehensweise
Bestimmte . Bakterien, . etwa . Spirillen . oder . Spirochäten, .lassen . sich . mit . basischen . Farbstoffen . nur . sehr . schlecht .anfärben, .so .dass .man .bei .ihnen .normalerweise .eine .Negativfärbung .mit .sauren .Farbstoffen .durchführt . .Dabei .nimmt .die .Umgebung .der .Zellen .die .Farbe .des .Färbemittels .an, .mit .dem .Ergebnis, .dass .die .Größe, .Form .und .Anordnung .der . Bakterien . deutlicher . hervortritt . . Die . Negativkontrastierungen .haben .aber .noch .einen .weiteren .Vorteil: .Da .bei .ihnen .keine .Hitzefixierung .notwenig .ist .und .zudem .keine .Färbung .der .Zellen .selbst .erfolgt, .ist .die .Veränderung .der .Bakterien .durch .äußere .Einflüsse .deutlich .geringer, .so .dass .sich . die . Form . und . Größe . der . Untersuchungsobjekte . zumeist .sehr .viel .genauer .bestimmen .lässt . .
Zur .Präparation .werden .die .Bakterien .in .einen .Tropfen .Nigrosin . (oder .eine .andere .saure .Färbelösung) .auf .einen .Objektträger . überführt . . Anschließend . streicht . man . den .Tropfen .mit .einem .zweiten .Objektträger .zu .einem .dünnen .Film .aus .und .lässt .das .Präparat .an .der .Luft .trocknen . .Danach .kann .die .mikroskopische .Untersuchung .dann .durchgeführt .werden .
StäbchenKokken
Abb. 3.4 Mit Methylenblau gefärbte Mischkultur von kugelförmigen Staphylococcus aureus und stäbchenförmigen Escherichia coliZellen (x 2.500).
Tipps für die Praxis
. . Verwenden .Sie .unbedingt .sehr .saubere, .fettfreie .Objektträger . .
. . Überführen .Sie .die .Bakterien .in .einen .möglichst .kleinen .Tropfen .Nigrosin .
. . Setzen . Sie . die . Kante . des . zweiten . Objektträgers . an .den . Rand . des . Tropfens, . damit . die . Flüssigkeit . sich .kapillar . am . Glas . verteilt, . und . ziehen . sie . ihn . dann .über .den .unteren .Objektträger . .Durch .Schieben .wird .eine .schlechte .Verteilung .erzielt .
. . Führen .Sie .keine .Hitzefixierung .durch, .sondern .lassen .Sie .das .Präparat . vollständig . an .der .Luft . trocknen .
Zu erwartende Resultate
Nach . einer . Negativfärbung . erscheint . die . Umgebung . der .Zellen .farbig, .während .die .Zellen .selbst .ungefärbt .bleiben . .Das .Resultat .einer .solchen .Färbung .zeigt .EAbb. 3.5 .
Differenzierende Färbungen
Differenzierende Färbungen
Mit .Hilfe .differenzierender .Färbungen, .zu .denen .die .Gram-Färbung .und .die .Säurefestigkeitsfärbung .gehören, .lassen .sich .Bakterien .anhand .der .unterschiedlichen .Zusammensetzung .ihrer .Zellwand .einordnen . .Zur .Durchführung .einer .solchen .Färbung .werden .zwei .verschiedene .Färbelösungen .
benötigt, .von .denen .man .die .erste .für .die .Primärfärbung .und . die . zweite . für . die . Gegenfärbung . nimmt; . außerdem .wird . zwischen . den . beiden . Färbungen . ein . Entfärbungsschritt .durchgeführt . .Abhängig .vom .Zellwandtyp .der .Bakterien .findet .dabei .eine .Entfärbung .statt .und .es .kann .eine .Gegenfärbung .erfolgen, .oder .die .Primärfärbung .bleibt .trotz .des .Entfärbungsschrittes .erhalten .
Abb. 3.5 Durch die Negativfärbung des BacillusPräparates mit Nigrosin treten die stäbchenförmigen Zellen deutlicher hervor (x 3.600).
Anwendung im Labor: Gram-Färbung
spült .wurde, .mit .einer .Jodlösung .behandelt . .Anschließend .entfärbt .man .die .zu .untersuchende .Probe .mit .96%igem .Alkohol .und .macht .dann .eine .Gegenfärbung .mit .Safranin . .Die .sichtbaren .Unterschiede .entstehen .dadurch, .dass .die .grampositiven .Bakterien .wegen .der .dicken .Peptidoglykanschicht .nach .der .Alkoholbehandlung .nicht .mehr .entfärbt .werden .können, .sondern .weiterhin .das .Kristallviolett .des .ersten .Färbungsschrittes .enthalten, .während .das .Färbemittel .bei .gramnegativen .Bakterien .durch .den .Alkohol .ausgewaschen .wird, .so .dass .sie .sich .anschließend .durch .Safranin .anfärben .lassen . .Durch .eine .GramFärbung .enthält .man .aber . nicht . nur . Hinweise . auf . den . Bau . der . Bakterienzellwand, .sondern .man .kann .die .Größe, .Form .und .Anordnung .der .Zellen .auch .besser .erkennen .
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Ziel und Vorgehensweise
Die .Zellwand .der .meisten .Eubakterien .besteht .aus .Pepti-doglykan, .wobei .grampositive Bakterien .bis .zu .40 .Peptidoglykanschichten .besitzen, .während .bei gramnegativen Bakterien . nur . eine . dünne . Peptidoglykanschicht, . dafür .aber . zusätzlich . eine . äußere . Membran . mit . Lipopolysac-chariden . vorliegt . . Diese . Unterschiede . lassen . sich . durch .die .GramFärbung .sichtbar .machen, .so .dass .man .mit .Hilfe .dieser .Methode .zwei .verschiedene .Gruppen .unterscheiden .kann . .Verwendung .findet .diese .Methode .vor .allem .bei .der .Identifizierung .unbekannter .Isolate .aus .der .Natur .oder .aus .dem .klinischen .Bereich .
Bei . der . GramFärbung . wird . der . fixierte . Ausstrich . zunächst .mit .Kristallviolett .gefärbt .und .dann, .nachdem .ge
3 Färbetechniken FÜr bakterien
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Abb. 3.6 Ein handelsüblicher Objektträger mit einer grampositiven Kontrolle (oben) und einem Gramnegativen Vergleichsorganismus (unten).
Abb. 3.7 24 Stunden alte Kultur von Staphylococcus aureus nach einer GramFärbung. Alle Bakterien sind tiefviolett gefärbt, zeigen also eine grampositive Reaktion.
Tipps für die Praxis
. . Beenden .Sie .das .Spülen .mit .Alkohol, .wenn .die .ablaufende .Flüssigkeit .klar .bleibt .
. . Benutzen .Sie .Präparate .von .bekannten .Stämmen .zum .Vergleich .Ihrer .Färbungen . .Solche .Kontrollpräparate .sind .im .Fachhandel .erhältlich .(EAbb. 3.6); .man .kann .sie .sich .aber .auch .selbst .anfertigen . .
. . Führen .Sie .die .GramFärbung .mit .Ansätzen .durch, .die . etwa . 24 . Stunden . gewachsen . sind, . da . man . bei .älteren . Kulturen . häufig . uneinheitliche . Ergebnisse .
erhält . .So .sind .beispielsweise .24 .Stunden .alte .Zellen .von .Staphylococcus aureus .nach .einer .GramFärbung .erwartungsgemäß . durchgehend . grampositiv . gefärbt .(EAbb. 3.7), .während .man .in .48 .Stunden .alten .Kulturen .bereits .einige .Bakterien .findet, .die .die .GramFärbung .nicht .aufgenommen .haben .(EAbb. 3.8), .und .nach . 72 . Stunden . hat . dieser . Anteil . noch . deutlich .zugenommen(EAbb. 3.9) . .Auf .der .anderen .Seite .sind .24 .Stunden .alte .Escherichia coliZellen .durchgehend .gramnegativ .(EAbb. 3.10), .während .es . in .48 .und .72 .Stunden . gewachsenen . Kulturen . zahlreiche . Zellen .gibt, . die . die . Gegenfärbung . schlecht . angenommen .haben .(EAbb. 3.11 und 3.12) .
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Abb. 3.8 Eine Gramgefärbte, 48 Stunden alte Kultur der grampositiven BakterienArt Staphylococcus aureus. Zwar zeigen die meisten Zellen in diesem Präparat die erwartete violette Färbung, es gibt aber auch eine Reihe von Bakterien, die rötlich aussehen, was einer gramnegativen Reaktion entspricht (x 3.600).
Abb. 3.9 Bei dieser 72 Stunden alten Kultur der grampositiven BakterienArt Staphylococcus aureus zeigen fast ebenso viele Zellen eine gramnegative wie eine grampositive Reaktion (x 3.600).
Abb. 3.10 Eine Gramgefärbte, 24 Stunden alte Kultur des gramnegativen Bakteriums Escherichia coli. Das Ergebnis ist eindeutig, denn alle Zellen sind stark rötlich gefärbt (x 3.600).
Zu erwartende Resultate
Grampositive .Bakterien .zeigen . im .mikroskopischen .Bild .eine . tiefviolette . Färbung . . Färbt . man . eine . Mischkultur, .dann .lassen .sich .grampositive .und .gramnegative .Bakterien .gut .voneinander .unterscheiden .(EAbb. 3.13), .und .das .gilt .auch .für .klinische .Abstriche .(EAbb. 3.14) . .Neben .der .bereits .mehrfach .erwähnten .Art .Staphylococcus .aureus .gehören .u .a . .Bacillus .cereus .(EAbb. 3.15), .Enterococcus .faecalis .(EAbb. 3.16), .Micrococcus .luteus .(EAbb. 3.17) .und .Staphylococcus .epidermidis .(EAbb. 3.18) .zu .den .grampositiven .Bakterien .
Gramnegative .Bakterien .sind .im .mikroskopischen .Bild .rötlich . gefärbt . . Einige . Beispiele . gramnegativer . Bakterien .sind: .Escherichia coli .(EAbb. 3.10), .Alcaligenes .faecalis .(EAbb. 3.19), .Enterobacter .aerogenes .(EAbb. 3.20), .Pseudomonas .aeruginosa .(EAbb. 3.21) .und .Serratia .marcescens .(EAbb. 3.22) .
Anwendung im Labor: Gram-Färbung
3 Färbetechniken FÜr bakterien
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Abb. 3.11 Auch in diesem Gramgefärbten Präparat, das mit einer 48 Stunden alten Escherichia coliKultur hergestellt wurde, haben die meisten Zellen eine kräftige, rosa Farbe, aber es gibt eine Reihe von Bakterien, die nur schwach gefärbt sind (x 3.600).
Abb. 3.12 Eine Gramgefärbte, 72 Stunden alte Kultur von Escherichia coli. Es sind nur noch wenige Zellen kräftig rosa gefärbt, wogegen die meisten Bakterien eine untypisch helle Färbung zeigen (x 3.600).
Abb. 3.13 In diesem Präparat wurde eine Mischkultur aus der grampositiven Art Staphylococcus aureus und dem gramnegativen Bakterium Escherichia coli einer GramFärbung unterzogen.
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Anwendung im Labor: Gram-Färbung
Epithelzelle grampositiveStäbchen
grampositiveStreptokokken
grampositiveStaphylokokken
Hefe-zellen
Abb. 3.14 Gramgefärbtes Abstrichpräparat von menschlichen Zähnen. Wie unschwer zu erkennen ist, überwiegen die grampositiven Bakterien (x 3.600).
Tetraden
Abb. 3.15 GramFärbung bei Bacillus cereus, einem stäbchenförmigen, grampositiven Bakterium (x 2.500).
Abb. 3.16 Gramgefärbtes Präparat von Enterococcus faecalis, einem grampositiven Kokkus. Typisch für diese Art ist die Bildung von Zellketten (x 2.500).
Abb. 3.17 Präparat von Micrococcus luteus, einem kugelförmigen, grampositiven Bakterium nach einer GramFärbung. Typisch für diese Art ist die Tetradenbildung (x 2.500).
Abb. 3.18 Gramgefärbtes Präparat von Staphylococcus epidermidis, einem kugelförmigen, grampositiven Bakterium. Charakteristisch für die Gruppe der Staphylokokken ist die traubenartige Zusammenlagerung mehrerer Zellen (x 2.500).
3 Färbetechniken FÜr bakterien
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Anwendung im Labor: Säurefestigkeitsfärbung
denen .der .hohe .Anteil .an .hydrophoben .Substanzen .fehlt, .lassen .sich .dagegen .durch .das .SäureEthanolGemisch .entfärben .und .mit .Methylenblau .nachfärben . .Solche .Bakterien .werden .als .nicht säurefest .bezeichnet . .Eingesetzt .wird .diese .Form .der .Färbung .vor . allem .zur . Identifizierung .von .säurefesten .Arten .aus .der .Gattung .Mycobacterium, .darunter .Mycobacterium tuberculosis, . des . Erregers . der . Tuberkulose .und .Mycobacterium leprae, .einer .Art, .die .Lepra .verursacht .
Abb. 3.19 GramFärbung bei einer Kultur von Alcaligenes faecalis, einer gramnegativen Art, bei der die kurzen Stäbchen alle etwa die gleiche Länge haben (x 2.500).
Abb. 3.21 Gramgefärbtes Präparat von Pseudomonas aeruginosa, einem gramnegativen Bakterium. Bei dieser Art sind die stäbchenförmigen Zellen etwa 1,5 bis 2Mal so lang wie die von Alcaligenes faecalis (Abb. 3.19; x 2.500).
Abb. 3.20 Präparat von Enterobacter aerogenes, einem gramnegativen Bakterium. Bei dieser Art sind einige der stäbchenförmigen Zellen so kurz, dass man sie leicht für Kokken halten könnte (x 2.500).
Abb. 3.22 Bei einer Kultur von Serratia marcescens durchgeführte GramFärbung. Bei dieser Art sind die stäbchenförmigen Zellen ebenfalls so kurz, dass man sie leicht mit Kokken verwechseln kann (x 2.500).
Ziel und Vorgehensweise
Mit .Hilfe .der .Säurefestigkeitsfärbung .lassen .sich .eine .Reihe . von . Bakterien . zuordnen, . die . einen . hohen . Gehalt . an .hydrophoben .Substanzen .(Wachsen) .in .der .Zellwand .aufweisen .und .daher .auf .eine .herkömmliche .GramFärbung .nicht .ansprechen . .Dafür .wird .allerdings .Karbolfuchsin .aufgenommen .und .auch .durch .Waschen .mit .einem .SalzsäureEthanolGemisch .nicht .wieder .freigesetzt, .so .dass .man .solche .Bakterien .als .säurefest .bezeichnet . .Andere .Arten, .
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Anwendung im Labor: Säurefestigkeitsfärbung
Bei .der .Säurefestigkeitsfärbung .nach .ZiehlNeelsen, .der .am .häufigsten .verwendeten .Form .dieser .Methode, .wird .ein .Ausstrichpräparat . mit . Fließpapier . bedeckt, . das . man . anschließend .mit .Karbolfuchsinlösung .tränkt . .Danach .wird .der .Objektträger .vorsichtig .über .einem .Wasserbad .erhitzt, .bevor .man .das .Fließpapier .entfernt .und .den .Ausstrich .mit .Wasser . spült . . Schließlich . entfärbt . man . das . Präparat . mit .einem .SalzsäureEthanolgemisch .und . führt .zum .Schluss .eine .Gegenfärbung .mit .Methylenblau .durch .
Tipps für die Praxis
. . Wenn .die .zu .untersuchenden .Bakterien .bei .der .Präparation . mit . Ovalbumin . vermischt . werden, . haften .sie .besser .am .Objektträger .
. . Während .der .Hitzefixierung .sollte .weiteres .Karbolfuchsin .zugegeben .werden, .um .ein .völliges .Austrocknen .des .Präparates .zu .verhindern .
. . Das . Auswaschen . mit . dem . SäureEthanolgemisch .kann .beendet .werden, .wenn .die .Flüssigkeit .klar .abfließt .
Zu erwartende Resultate
Säurefeste .Bakterien .wie .Mycobacterium .tuberculosis .sehen .unter . dem . Mikroskop . rötlich . aus . (EAbb. 3.23), . während .nicht .säurefeste .Arten .blau .gefärbt .sind .(EAbb. 3.24) .
Säurefeste Stäbchen Nicht säurefeste Stäbchen
Abb. 3.23 Gefärbtes Präparat von Mycobacterium tuberculosis. Die säurefesten, stäbchenförmige Zellen erscheinen im Mikroskop rötlich gefärbt (x 3.600).
Abb. 3.24 Pseudomonas aeruginosa ist eine nicht säurefeste Art. Die stäbchenförmigen Zellen erscheinen im Mikroskop blau gefärbt (x 3.600).
3 Färbetechniken FÜr bakterien
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Färbung von Zellstrukturen
Einige . Färbungen . lassen . sich . verwenden, . um . spezielle .Zellstrukturen . im . Mikroskop . sichtbar . zu . machen, . etwa .Kapseln, .Endosporen .oder .Geißeln . .Das .ist .insofern .wichtig, .als .diese .Bestandteile .wichtige .Merkmale .für .die .Bestimmung .sein .können .
Anwendung im Labor: Kapselfärbung
Ziel und Vorgehensweise
Einige .Bakterien .scheiden .während .Wachstums .Polysaccharide .und .Polypeptide .aus .und .bilden .so .außerhalb .der .Zelle .charakteristische .Schleimkapseln . .Zu .den .Arten .mit .solchen . Kapseln . gehören . auch . einige . Krankheitserreger, .darunter .Klebsiella .pneumoniae .und .Streptococcus .pneumoniae, .die .Lungenentzündung .verursachen .können . .Für .diese .Bakterien .spielen .die .Kapseln .eine .wichtige .Rolle, .denn .sie .schützen . die . Zelle . vor . Phagozytose . durch . Makrophagen .im .Wirt .
Da . sich . Bakterienkapseln . nicht . anfärben . lassen, . färbt .man .die .Zelle .und .den .Hintergrund .des .Präparates, .um .die .Kapseln .deutlich .hervortreten .zu .lassen . .Verwendet .wird .dazu .eine .Kombination .aus .Negativ .und .Einfachfärbung, .wobei .man .eine .saure .Färbelösung .wie .Kongorot, .Nigrosin .oder .Tusche .(India .Ink) .benutzt, .um .den .Hintergrund .zu .färben, .während .die .Zelle .mit .einem .basischem .Farbstoff .wie .Kristallviolett .oder .Karbolfuchsin .angefärbt .wird .
Tipps für die Praxis
. . Damit . auch . tatsächlich . eine . Kapselbildung . erfolgt, .sollten .Sie .die .entsprechenden .Bakterien .auf .Mager-milch-Agar .wachsen .lassen .
. . Führen . Sie . keine . Hitzefixierung . durch, . weil . die .Bakterien .dabei .leicht .schrumpfen, .so .dass .sich .ein .falsches .Bild .der .Kapsel .ergeben .kann .
. . Spülen .Sie .die .Präparate .sehr .vorsichtig, .damit .die .Zellen .nicht .abgewaschen .werden .
. . Dehnen .Sie .das .Spülen .nicht .unnötig .aus, .denn .das .Kapselmaterial .ist .wasserlöslich .
Zu erwartende Resultate
Im .mikroskopischen .Bild .erscheinen .die .Kapseln .als .helle .Zonen .zwischen .den .aufgrund .der .Einfachfärbung .farbig .erscheinenden .Zellen .und .dem .durch .eine .Negativfärbung .ebenfalls .farbigen .Hintergrund . .EAbb. 3.25 .zeigt .eine .Kapselfärbung .bei .Klebsiella .pneumoniae .
Stäbchen-förmigeZellenKapseln
Gefärbter Hintergrund
Abb. 3.25 Kapselfärbung bei Klebsiella pneumoniae, einer BakterienArt mit stäbchenförmigen Zellen.
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Anwendung im Labor: Endosporenfärbung
Ziel und Vorgehensweise
Einige .grampositiven .Bakterien .können .unter .bestimmten .Bedingungen .sehr .widerstandsfähige .Sporen, .so .genannte .Endosporen, .bilden .(EAbb. 3.26) . .Sie .entstehen .durch .vergleichsweise . komplexe . Differenzierungsprozesse . in . den .vegetativen .Zellen .der .Bakterien .und .werden .freigesetzt, .wenn .diese .absterben . .Die .freigesetzten .Sporen .sind .außerordentlich . robuste .Strukturen, .die .Bedingungen .überstehen .können, .unter .denen .vegetative .Bakterienzellen .längst .abgestorben .wären . .Verbessern .sich .die .Wachstumsbedingungen .für .die .Organismen, .dann .findet .eine .Keimung .der .Endosporen .und .eine .erneute .Bildung .vegetativer .Bakterienzellen .statt .
Da .Endosporen .und .ihre .intrazelluläre .Lage .in .der .Mutterzelle .recht .unterschiedlich .sein .können, .sind .sie .wichtige .Merkmale . für .die .Vertreter .bestimmter .Bakteriengattungen, .vor .allem .Bacillus .und .Clostridium . .So .bildet .Bacillus .anthracis, .der .Erreger .des .Milzbrands, .ovale .Endosporen .in .der .Mitte .der .vegetativen .Zellen, .während .sie .bei .Clostridium . botulinum, . einem . der . häufigeren . BotulismusVerursacher, .deutlich .zu .einer .der .Seiten .verschoben .sind . .Bei .Clostridium .tetani, .dem .Tetanuserreger, .sitzen .die .Sporen .an .einem .Ende .der .Zellen . . .
Anwendung im Labor: Endosporenfärbung
Vegetative Zelle
Vegetative Zelle
Endospore
Sporenbildung
Freie Endo-spore
Sporen-keimung
Auskeimende Spore
Endosporen
Wegen .ihres .speziellen .Aufbaus, .aber .auch .aufgrund .ihrer . chemischen . Zusammensetzung . nehmen . Endosporen .kein .Methylenblau .auf . .Daher .kann .man .die .Sporen .nach .einer .Einfachfärbung .entsprechender .Bakterien . auch .gut .als .ungefärbte, .stark .lichtbrechende .Objekte .innerhalb .der .gefärbten .Zellen .erkennen .(EAbb. 3.27) . .Noch .besser .lassen .sich .Endosporen .aber .durch .eine .spezielle .Sporenfärbung .sichtbar .machen . .
Eine .häufig .verwendete .Methode .zum .Anfärben .von .Endosporen .ist .die .Sporenfärbung .nach .SchaefferFulton . .Dazu .bedeckt .man .ein .Ausstrichpräparat .mit .Fließpapier .und .tränkt .dieses .mit .einer .Malachitgrünlösung . .Anschließend .wird . der . Objektträger . vorsichtig . über . einem . Wasserbad .erhitzt, .und .nach .dem .Abkühlen .und .dem .Entfernen .des .Fließpapiers .mit .Wasser .gespült . .Dabei .wird .der .Farbstoff, .der .durch .die .Hitzeeinwirkung .in .die .Endosporen .eingedrungen .ist, .nicht .mit .ausgewaschen, .so .dass .die .Sporen .anschließend .gefärbt .sind . .Zum .Schluss .erfolgt .dann .noch .eine .Gegenfärbung .der .Zellen .mit .Safranin .
Abb. 3.26 Lebenszyklus eines Endosporen bildenden Bakteriums.
Abb. 3.27 Ungefärbte Endosporen in den gefärbten, vegetativen Zellen einer BacillusArt (x 3.600).
3 Färbetechniken FÜr bakterien
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Tipps für die Praxis
. . Tropfen . Sie . während . des . Erhitzens . weiteres . Malachitgrün . auf . das . Fließpapier, . damit . das . Präparat .nicht .austrocknet .
. . Spülen .Sie .das .Präparat .nach .der .Malachitgrünfärbung .sehr .sorgfältig .aus, .weil .die .Zellen .sonst .kein .Safranin .mehr .aufnehmen .
Zu erwartende Resultate
Nach . Durchführung . der . Färbung, . sind . die . runden . oder .ovalen .Sporen .als .grünliche .Objekte .deutlich .zu .erkennen, .so . dass . sich . Endosporen . bildende . Bakterien . mit . dieser .Methode .leicht . identifizieren .lassen .(EAbb. 3.28 bis 3.30) . .Damit . auch . ausreichend . Sporen . vorhanden . sind, . sollte .man .ältere .Kulturen .verwenden, .die .auf .nährstoffarmem .Medium . gezogen . wurden . . Wie . unterschiedlich . die . Zahl .der .Endosporen .in .Abhängigkeit .vom .Alter .der .Kulturen .sein .kann, .zeigen .die .EAbb. 3.28 bis 3.30 . .Bei .einer .Bakterienart, .die .keine .Endosporen .ausbilden .kann, .sind .nach .einer . SchaefferFultonSporenfärbung . im . Präparat . keine .grünlich . gefärbten . Endosporen . vorhanden, . sondern . nur .rötlich .aussehende, .vegetative .Zellen .(EAbb. 3.31) .
Endospore Vegetative Zellen Vegetative Zellen Freie Sporen
Abb. 3.28 Sporenfärbung bei einer 12 Tage alten Kultur von Bacillus cereus, einem Endosporenbildner. Diese junge Kultur enthält viele vegetative Zellen, aber nur wenige Endosporen (x 4.250).
Abb. 3.29 Sporenfärbung bei einer 34 Tage alten Kultur von Bacillus cereus. In diesem Präparat sind immer noch viele vegetative Zellen vorhanden, aber auch schon zahlreiche, teilweise frei gewordene Endosporen (x 4.250).
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Vegetative Zellen Freie Sporen
Abb. 3.30 Sporenfärbung bei einer 57 Tage alten Kultur von Bacillus cereus. In diesem Präparat sind nur noch wenige vegetative Zellen zu erkennen, dafür aber viele freie Endosporen (x 4.250).
Abb. 3.31 Sporenfärbung bei einer Kultur von Escherichia coli, einem Bakterium, das keine Endosporen bildet. In dem Präparat sind ausschließlich rot gefärbte Stäbchen zu erkennen, aber keine grünlichen Endosporen (x 4.250).
Anwendung im Labor: Geißelfärbung
Ziel und Vorgehensweise
Einige . Bakterien . besitzen . der . Beweglichkeit . dienende, . .fadenartige .Anhänge, .die .Geißeln oder Flagellen .genannt .werden . .Im .Mikroskop .sind .diese .sehr .feinen .Strukturen .nur .zu .erkennen, .wenn .zuvor .eine .Quellung .und .Beizfärbung .durchgeführt .wurde . .
Um .bewegliche .Bakterien .präparieren .zu .können, .muss .man .zunächst .eine .bewachsene .Agarplatte .mit .Flüssigmedium .überschichten, .um .darin .bewegliche .Zellen .aufzufangen . .Anschließend .wird .die .Flüssigkeit .abgesaugt .und .mit .niedriger .Geschwindigkeit .zentrifugiert, .bis .ein .deutlicher .Niederschlag .(Pellet) .am .Boden .des .Zentrifugenröhrchens .zu .erkennen .ist . .Dieses .Pellet .nimmt .man .in .10%igem .Formalin .auf, .und .überträgt .davon .einen .Tropen .auf .einen .Objektträger . .Dieser .wird .anschließend .etwas .geneigt, .damit .der .sich .Tropfen .auf .dem .Glas .verteilen .kann . .Nach .dem .Trocknen .an .der .Luft .überschichtet .man .die .entsprechende .Stelle .dann .mit .einer .Pararosanilinlösung, .und .spült .das .Präparat .mit .Wasser, .sobald .sich .ein .goldfarbener .Film .an .der .Oberfläche .des .Färbemittels .sowie .ein .sichtbarer .Niederschlag .gebildet .hat .
Tipps für die Praxis
. . Verwenden .Sie .unbedingt .sehr .saubere .Objektträger .
. . Führen . Sie . die . beschriebenen . Schritte . möglichst .vorsichtig .durch, .denn .Geißeln .sind .außerordentlich .empfindliche .Strukturen, .die .leicht .abbrechen .
. . Suchen .Sie .das .Präparat .im .Mikroskop .sehr .gründlich .ab, .da .nicht .alle .Zellen .noch .Geißeln .besitzen .werden . .Vergleichsweise .häufig .findet .man .begeißelte .Stadien .in .den .Randbereichen . .
Zu erwartende Resultate
Bei .Bakterien .gibt .es .vier .Begeißelungstypen .(EAbb. 3.32), .die . sich . in . vielen . Fällen . zur . Bestimmung . verwenden . .lassen . .
So .besitzt .die .Art .Pseudomonas .aeruginosa .nur .eine .Geißel, .ist .also .monotrich begeißelt .(EAbb. 3.33), .während .Spirillum .volutans . Flagellen . an . beiden . Seiten . aufweist . und . somit .
Anwendung im Labor: Geißelfärbung
3 Färbetechniken FÜr bakterien
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Monotrich
Lophotrich
Amphitrich
Peritrich
(siehe Abb. 3.33)
(siehe Abb. 3.34)
(siehe Abb. 3.35)
(siehe Abb. 3.36)
Abb. 3.32 Begeißelungstypen bei Bakterien. Monotrich begeißelte Arten haben eine einzelne Geißel an einem ihrer Zellpole, beim amphitrichen Begeißelungstyp sitzt an beiden Enden je eine Geißel. Bei Bakterien mit einem lophotrichen Begeißelungstyp sind an einem Ende mehrere Geißeln vorhanden, und bei peritrich begeißelten Arten sitzen die Fortbewegungsorgane überall auf der Zelloberfläche.
Geißeln
Geißeln
Geißeln
Geißel
Abb. 3.33 Monotriche Begeißelung bei Pseudomonas aeruginosa (x 3.600).
Abb. 3.35 Lophotriche Begeißelung bei Pseudomonas marginalis (x 3.600).
Abb. 3.34 Amphitriche Begeißelung bei Spirillum volutans (x 3.600).
Abb. 3.36 Peritriche Begeißelung bei Proteus vulgaris (x 3.600).
amphitrich begeißelt .ist .(EAbb. 3.34) . .Pseudomonas .marginalis .hat .mehrere .Flagellen .an .einer .Seite, .weist .also .eine .lophotriche Begeißelung .auf .(EAbb. 3.35), .während .Proteus .vulgaris rundum, .also .peritrich .begeißelt .ist .(EAbb. 3.36) .