Technologisches Arsenal der Molekularbiologie
Atomebene
Molekülebene
Zellebene
Gewebeebene
Organebene
Organsystemebene
Individuumebene Ökosystem
Die zwei Sinne der Molekularbiologie
2. Ein technologisches System
1. Untersuchung der Lebensvorgänge zwischen den Ebenen der DNA und der Zelle
1. Untersuchung oder Umwandlung eines Moleküls oder weniger Molekülen
2. Gleichzeitige Untersuchung von vielen Molekülen (Genomik)
3. Komplexe Techniken
(werden in anderen Vorträgen besprochen)
INHALT:
INHALT (1. Untersuchung oder Umwandlung eines Moleküls oder weniger Molekülen):
1. Molekulare Klonierung 2. Polymerase Kettenreaktion (PCR) 3. Gelelektrophorese 4. Detektion von Makromolekülen 5. Gelretardation 6. Footprint-Analyse 7. Immunhistochemie 8. In-situ-Hybridisierung 9. FRET 10. Durchflusszytometrie 11. Facs
1. Molekulare Klonierung
a. Restriktionsendonukleasen b. DNA-Ligasen c. Plasmidvektoren d. Klonierung durch Restriktion/Ligation e. Weitere Enzyme
Restriktionsendonukleasen 1
Restriktionsendonukleasen 1
5’ überhängendes
Ende (z. B. EcoRI)
VOR DEM SCHNITT NACH DEM SCHNITT
3’ überhängendes
Ende (z. B. KpnI)
gerades Ende (z. B.
SmaI)
RESTRIKTIONS-MODIFIKATIONSSYSTEM
EcoRI Methylase EcoRI schneidet nicht
DNA-Ligase
Ein DNA-Molekül Zwei DNA-Moleküle
DNA-Ligase
DNA-Ligase
2
3
Plasmide 1. Kleine Plasmide mit grosser
Kopienzahl
2. Grosse Plasmide mit kleiner
Kopienzahl
1. Fertilitätsfaktoren
2. Resistenzfaktorenk
3. Virulenzfaktoren
Plasmidvektoren
multiple Klonierungsstelle
3
Plasmidvektoren
Plasmidvektor
Rekombinantes Plasmid
3
Molekulare Klonierung 4
Originale DNA-Moleküle:
EcoRI Stelle EcoRI Stelle
EcoRI Enzym
Rekombinantes DNA-Molekül:
Ligase
Molekulare Klonierung Plasmidvektor DNA-Fragment Rekombinantes Plasmid
Herstellung von einem rekombinanten Plasmid
durch Ligation
Transformation (in Bakterienzellen)
Multiplizierung in der Zelle
Multiplizierung der Bakterienzellen
Eine Kolonie stammt aus einer einzigen Zelle
4
DNA DNA lacZ lacI O lacY lacA C E P rep
Galactose
indoxyl
T
- X-Gal chromogenes Substrat
Repressor CAP site pol binding site Operator Strukturgene Terminator
IPTG
X-Gal
LacZ Gen 4
DNA DNA lacZ lacI O lacY lacA C E P
trans- acetylase
permease
rep
-gal
T
pol
Repressor CAP site pol binding site Operator Strukturgene Terminator
- X-Gal chromogenes Substrat LacZ Gen 4
Repressor CAP-Stelle pol-Bindestele Operator Strukturgene Terminator
DNA DNA
lacZ Gen in Klonierung
fremde DNA
lacZ -Fragment
lacZ lacZ
4
lacZ
Andere Enzyme in Klonierung
EcoRI Schnitt
Dephosphorylierung
- Klenow-Fragment
- S1 Nuklease
- Alkalische Phosphatasen
5
2. PCR: Polymerase Chain Reaction
Polymerase-Kettenreaktion
1. Zyklus 2. Zyklus
3. Zyklus
Denaturation Annealing Synthese
Forward Primer
Reverse Primer
1993
6
Kary Mullis
In vitro Methode zur
Vervielfältigung
(Amplifizierung)
von DNA
6
PCR Nötig für die PCR:
1. DNA-Template
2. DNA-Polymerase
3. Zwei Primer
4. dNTPs
5. Puffer
Menge der DNA wird in jedem Zyklus
verdoppelt (unter optimalen Umständen)
Primer neue DNA
alte DNA
Denaturation
(2 DNA Stränge
trennen sich)
Erhitzen auf
94-96 ºC
Annealing
(Primer bindet
einzelsträngige DNAs)
Abkühlen
auf 60-65 ºC
Synthese
(DNA-Polymerase
bildet neuen DNA-
Strang ab den Primer)
Erhitzen
auf 68-72 ºC
theoretisch: exponentieller Anstieg der gewünschten DNA praktisch: Plateau-Phase
3. Gelelektrophorese
a. Agarose Gelelektrophorese
b. Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(PAGE)
7
DNA-Fragmente sind negativ geladen, dafür wandern Sie in einem elektrischen Feld von der Katode in die Richtung der Anode
Agarose Gelelektrophorese
Molekulargewichtmarker
7
Laufphasen
Auftragpuffer: Probe ist in einer Glycerollösung mit einem Farbstoff (z.B. Bromphenolblau)
7 Agarose Gelelektrophorese
Färbung mit Ethidium-Bromide
DNA-Banden fluoreszieren
horizontal
Anwendung: Trennung von Nukleinsäuren mit einem gröβeren Molekulargewicht.
Transilluminator
Polyacrylamid Gelelektrophorese 7
Molekulargewichtmarker
40 Nucleotid
10 Nucleotid Gel
(polymerisiertes Acrylamid)
Anwendung: Trennung von Nukleinsäuren mit einem kleinen Molekular-gewicht, Trennung von Proteinen
vertikal
7 SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat – Polyacrylamid-Gelelektrophorese
2 Untereinheiten des Proteins
gekoppelt durch Disulphidbrücke Protein aus einer Untereinheit
Negativ geladene
SDS-Moleküle
SDS: denaturiert die Proteine und maskiert ihre eigenen Ladungen.
4. Detektierung von Makromolekülen
a. Southern Blot
b. Northern Blot
c. Western Blot
d. Eastern Blot
Southern Blot 8
DNA
Restriktionsverdauung
Ge
lele
ktr
op
ho
rese
Filterpapier
Nitrocellulose
Gel
alkalische Lösung
Nitrocellulose-membran
Autoradiogram
Hybridisierung mit radioaktiv
markierter Probe
DNA-Transfer mit Hilfe von Kapillarkraft vom Gel auf die Nitrocellulose-Membran
Anwendung: für die Nachweis einer bestimmten DNA-Sequenz in einem komplexen DNA-Gemisch.
Southern Blot 8
(A) DNA-Transfer vom Gel auf die Membran
DNA-Marker
verdaute DNA
Agarosegel Puffer
Papierhandtuch
Nylonmembran
Gel
Nylonmembran
(B) Hybridisierungsanalyse
Nylonmembran
markierte DNA-Probe
Röntgenfilm
hybridisierte Banden
9
Zellen, Geweben
RNA-Extrakt
RNA
Agarose Gelelektrophorese
RNA-Marker RNA-Probe
(Heterogenität der Moleküle)
Blotten
Filterpapier Nitrocellulose
Gel
Hybridisierung und Autoradiographie
Northern Blot
Anwendung: z.B. für die Detektion der Expression eines Gens unter unterschiedlichen Umständen.
9 Northern Blot
Zellen
RNA-Extrakt
Gelelektrophorese
RNA-Probe
Blotten, Northern-Hybridisierung, Autoradiographie
Hybridisierung der DNA-Probe mit dem komplementären RNA-Molekül
Elektroblot
10 Western Blot (A) Elektrophorese/Transfer
Elektrischer Strom
Inkubation mit Antikörper-1: Ab1 ( )
(B) Antikörperreaktion
Inkubation mit Enzym-gekoppeltem
Antikörper: Ab2
Zugeben des Substrats
(C) Farbreaktion
SDS-PAGE Membran
Anwendung: für die Detektion von spezifischen Proteinen in einer Probe.
5. Gelretardierungsanalyse Anwendung: für die Detektion von DNA-Protein Wechselwirkungen
Bestimmung, ob irgendeines Protein (z.B. Transkriptionsfaktor) zu einem
gegebenen DNA-Abschnitt bindet.
11
Restriktionsfragmente Restriktionsfragmente + Kernproteine
DNA-Marker
Retardierte Bande
Prinzip: die mit Protein gebundene DNA wandert im Gel langsamer
12 6. Footprint-analyse Anwendung: für die Detektion von DNA-Protein Wechselwirkungen
am Ende markierte Restriktionsfragmente
- Zellkernextrakt
am Ende markierte Restriktionsfragmente
+ Zellkernextrakt
DNA-bindendes Protein
partielle DNA-Verdauung
Gelelektrophorese, Autoradiographie
Footprint
Footprint
13 7. Immunhistochemie - Immunfluoreszenz
fluoreszierende Farbe
anti-C Antikörper
Zellkern Zellkern
Cytoplasma Cytoplasma
Zelloberflächenantigene
Cytoplasmatische Antigene Cytoplasmatische Antigene
Zelloberflächenantigene
Direkte Methode Indirekte Methode
Anti-Hase Sekundärantikörper aus Ziege anti-C Primärantikörper
aus Hase
Anwendung: Bestimmung, in welchen Geweben das untersuchte Protein vorhanden ist, in welchem Kompartiment der Zelle es lokalisiert ist.
7. Immunhistochemie - Immunperoxidase-Methoden
13
Peroxidase
anti-Hase Antikörper (Sekundärantikörper)
anti-C Antikörper Peroxidase
Anti-Hase Sekundärantikörper aus Ziege
anti-C Primärantikörper aus Hase
Zellkern
Cytoplasma
Zelloberflächenantigene
Cytoplasmatische Antigene
Indirekte Methode anti-C Antikörper
Peroxidase
Peroxidase Peroxidase
Biotin
anti-Hase Antikörper (Sekundärantikörper) Avidin
- Peroxidase – Diamino-Benzidin (in der Anwesenheit von Peroxid): brauner Ausschlag
- Biotin – Avidin – Peroxidase
13 7. Immunhistochemie - Immunperoxidase-Methoden
ABC-Methode (ABC= Avidin-Biotin Komplex)
Avidin
Biotin Peroxidase anti-Hase Anti-körper (Sekundär-antikörper)
Primärantikörper
Antigen
Rolle: Signalverstärkung
1 Proteinmolekül wird hier mit vielen Enzymen markiert, die eine viel intensivere Farbreaktion ermöglichen.
7. Immunhistochemie - alkalische Phosphatase
- Digoxigenin – anti-Digoxigenin – alkalische Phosphatase
- Substrat X-Phosphat wird gespaltet, was
zu einer Farbreaktion führt (Indoxyl)
alk. Phosphatase
alk. Phosphatase
alk. Phosphatase
alkalische Phosphatase
Zellkern
Cytoplasma
Zelloberflächenantigene
Cytoplasmatische Antigene
anti-Hase Antikörper
anti-C Antikörper
Anti-Hase Sekundär-antikörper aus Ziege
anti-C Primärantikörper aus Hase
anti-Hase Antikörper
anti-C Antikörper anti-C Antikörper
13
8. In-situ-Hybridisierung – Detektierung von DNA oder mRNA Markierung der Probe:
1. radioaktiv (S35)
2. nicht-radioaktiv
- fluoreszent
- enzymatisch
14
radioaktiv
Peroxidase
enzymatisch
anti-DIG Antikörper
DIG anti-DIG Peroxidase
ZielDNA
Probe
anti-DIG Antikörper
Fluoreszenz
fluoreszenter Farbstoff
DIG
fluoreszenter Farbstoff
Streptavidin
Biotin
Probe (DNA oder RNA)
ZielDNA
fluoreszent (FISH) Avidin
Biotin
9. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung 14
Objektglas
sich teilende Zelle
Metaphasechromosom
DNA wird denaturiert
Fluoreszente Markierung
9. FRET 15 Fluorescence resonance energy transfer
Zyan fluoreszierendes Protein (CFP) Gelb fluoreszierendes Protein (GFP)
keine Proteinwechselwirkung Proteinwechselwirkung
UV Licht Blaues Licht
UV Licht Gelbes Licht
Protein X Protein Y
Anregung mit UV-Licht
Emission: blaues Licht
Anregung mit blauem Licht
Emission: gelbes Licht
FRET: Die Energie eines angeregten Fluoreszenz-farbstoffs wird auf einen zweiten Fluoreszenz-farbstoff strahlungsfrei übertragen.
Anwendung: Aufklärung von Signaltransduk-tionswegen
10. Durchflusszytometrie 16
PMT4
PMT3 PM: Photomultiplier (Verstärkung der eingehenden Signale)
PMT2
PMT1 Filter
zweifarbige Filter
Laser
Zellen werden einzeln durch eine Kapillare gesaugt, streuen einen Teil des Lichts
Probe
Scatter Detektoren
Sortierung
Emission von optischen Signalen seitens der Zelle, wenn diese einen monochromatischen Laserstrahl passiert.
Die Menge des gestreuten Lichts korreliert mit der Gröβe und Komplexität.
Fluoreszente Farbstoffe, die an bestimmte Bestandteile der Zellen binden, oder fluoreszent markierte Antikörper können auch verwendet werden.
Anwendung: z.B. Diagnose von Läukemie, Trennung von Spermien mit X oder Y Chromosom
11. FACS 17 Fluorescence activated cell sorting
Probe
Laser
Detektionsscheiben
Rote Fluoreszenz
Grüne Fluoreszenz
Sammelröhrchen
Füllkragen
Hüllenflüssigkeit
90 Lichtwerfer (Granularität)
„Vorne” Lichtwerfer (Gröe)
Geeignet für die Auftrennung von biologisch heterogenen Zellpopulationen.