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Entwicklung eines neuen in vitro Tests aufdermale Phototoxizitat mit einem Modellmenschlicher Epidermis (EpiDerm TM)Manfred Liebsch, Christa Barrabas, Dieter Traue und Horst SpielmannZEBET/BgVV, D-12277 Berlin

ZusammenfassungWir berichten uber die Ergebnisse von versuchen, die fur dasVollhautmodell Skin' von ZEBET entwickelte Methode derPhototoxisitatsprufung auf das Epidermismodell Epilrerm'" ruiibertragen. Im neuen Epilrerm'" Phototoxiziuitstest wird dieZytotoxizitai von Prufsubstanzen, die auf die Oberflache desHautmodells aufgetragen werden, bei funf Kotuentrationenbestimmt. Dies erfolgt in einem Parallelexperiment in Gegen-wart und Abwesenheit einer nicht zytotoxischen Dosis vonUVA und sichtbarem Licht (Sonnensimulator}. Die Zvtotoxiri-tat wird am ndchsten Tag im MTT- Test gemessen. Experimentezur Optimierung der Testbedingungen werden dargestellt. DiePriifung bekannter phototoxischer und nicht phototoxischerTestsubstanzen reigte, da./3ein Epidermismodell, wie z.B.Epilrerm'", in del' gleichen weisejur die in vitro Phototoxiri-tatsprufung geeignet ist wie ein komplettes Hautmodell.

Summary: Development of a new in vitro test for dermalphototoxicity using a model of reconstituted human epidermis(EpiDerm/M).Results are reported using the human epidermis model(Epilrerm/") in a test protocol that was adopted from themethod developed by ZEBET for phototoxicity testing with themodel Skin'. In the new phototoxicity test the cytotoxicity oftest materials applied topically to EpiDerm™ is determined atfive concentrations in the absence and presence of a non-cytotoxic dose of UVA and visible light (sun simulation).Cytotoxicity is determined one day after irradiation in the MTTassay. Experiments performed to optimise test conditions arepresented. Using appropriate phototoxic and non-phototoxictest chemicals our results demonstrate that a reconstructedhuman epidermal model, e.g. Epilrerm'", can be used inphoto toxicity testing in the same way as a full skin model.

Key words: in vitro testing, dermal phototoxicity, human epidermal model, Epiiierm'"

1 Einleitung

1.1 HintergrundZEBET hat 1993 an der Entwieklung ei-nes in vitro Phototoxizitatstests mit demrnensehliehen Hautmodell Skin? der Fir-ma Advanced Tissue Sciences (La Jolla,USA) gearbeitet (Edwards et aI., 1994;Liebseh et al., 1995). Dieser Test wurdeim Rahmen des EU/COLIPA Validie-rungsprojektes yon in vitro Phototoxizi-tatstests experimentell pravalidiert. EndeOktober 1996 wurde die Produktion yonSkin- iiberraschend eingestellt. Aufgrundder guten Ergebnisse des Skin! Phototo-xizitatstests und des Bedarfes an einemTest, del' auf einern Hautrnodell basiert,hat sich ZEBET daraufhin entschlossen,aufbauend auf den mit Skirr' gewonnenenErfahrungen, einen neuen Test mit demkornmerziell hergestellten mensehliehenEpidermisrnodell EpiDerm ™ der FirrnaMatTek (Ashland, USA) zu entwiekeln.Irn Gegensatz zu Skin? handelt es sieh beiEpiDerm™ nicht um ein Vollhautmodell,

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sondern um ein dreidimensionales, diffe-renziertes Modell der mensehliehen Epi-dermis. Da die Kerati nozyten der Epider-mis die relevanten Zielzellen fiir photo-toxisehe Reaktionen an del' Haut sind,konnte eine Gleichwertigkeit beider Mo-delle angenomrnen werden. Die Ergebnis-se unserer Untersuchungen sollen hiererstmals vorgestellt werden, urn zu bele-gen, daf eine Methodik nieht allein da-durch verlorengeht, daB eine Firma dieProduktion eines speziellen Hautmodellseinstellt. U nsere Ergebnisse belegen viel-mehr, daB allgemeine toxikologische Ei-gensehaften mit jedem mensehliehenHautmodell gepriift werden konnen, so-fern es bestimmte morphologisehe Krite-rien erfiillt.

1.2 ZielsetzungUnter Phorotoxizitat versteht man toxi-sche Sofortreaktionen, die nach einrnali-ger Applikation eines chemischen Stof-fes und anschlieBender Bestrahlung mitLicht oder UV-Bestrahlung hervorgeru-

fen werden. Phototoxiz itat k.ann auchnaeh systemischer Aufnahme des Stoffesund anschliebender Lichtexposition her-vorgerufen werden. Voraussetzung fiirphototoxische Reaktionen eines Stoffesist, daB er bestimmte Anteile des Lichtes(UV Licht und bei Farbstoffen siclubares

Licht) absorbiert, dadureh einen energie-reicheren, angeregten Zustand erreichtund auf diese Weise reaktionsfahigerwird. Bei der phototoxischen Reaktioneines Stoffes wird auf zellularer Ebene dieEnergie auf andere Molekiile iibertragen,so daf diese verandert werden. Dabeikonnten auf molekularer Ebene verschie-dene phototoxische Reaktionswege iden-tifiziert werden, wie z.B. die Oxidationyon Molekulen, die Bildung yon Radika-len und reakti ver Metabol iten (Spielmannet al., 1994a). Der ECVAM Workshop No.2 "In Vitro Phototoxicity Testing" hat frii-here Untersuchungen bestatigt, nach de-nen pnototoxische Reaktionen hauptsach-lich durch UVA verursacht werden, unddeshalb empfohlen, bei del' Tcstung auf

165

LIEBSCH ET AL. 1":"\_________________________ ~h~--CC.'

Methodik des EpiDerm ™ Phototoxizitatstests

24 EpiDerm TM Gewebe (= 1 kit) von Transport Agarose auf Medium setzen

Inkubation: 1 Std. (37°C, 5% CO,)

'"Medium wechseln•••• ••••r-----------------------, r-----------------------,

Praparation von 5 Konzentrationender Testsubstanz

(01 oder H20)

Applikation von 50 IJIjederKonzentration auf je 2 Gewebe

(5 Konz. + 1 Vehikel) x 2 = 12 Gewebe

'"

Praparation von 5 Konzentrationender Testsubstanz

(01 oder H20)

Appllkation von 50 IJIjederKonzentration auf je 2 Gewebe

(5 Konz. + 1 Vehikel) x 2 = 12 Gewebe

'"Inkubation uber Nacht: 21 Std. (37"C, 5% co,)

Bestrahlungsexperiment12 Gewebe mit 6 J/cm' bestrahlen

(= 60 M.in mit 1.7 mW/cm')Raumtemperatur

Medium wechseln

I Gewebe in MTT-medium umsetzen

'"Inkubation: 3 Std. (37°C. 5% CO,)Umwandlung von MTT (gelb) in Formazan (b/au) entsprechend Zel/vita/itat

'" '"r----G-ew-e-b-e-m-i-t-PB-S--w-as-c-h-e-n---, r--~G-ew--eb-e-m-i-t-P-BS--w-a-sc-h-e-n---'

Zugabe Yon Isopropanol zur Zugabe von Isopropanol zurExtraktion des Formazans Extraktion des Formazans

Gewebe mit PBS waschenMedium wechseln

Gewebe in MTT-medium umsetzen

'"

'"Schutteln bei Raumtemperatur: 2 Std.Extraktion des Formazans

Optische Dichte (OD) der 12Extrakte be; 570 nm messen

00 der Vehikelkontrolle = 100%

Optische Oichte (~O) der 12Extrakte bel 570 nm messen

00 der Vehikelkontrolle = 100%

Abbildung 1: Die Abbildung zeigt den experimentellen Ablaut des EpiDermTM Phototo-xizitiitstests. Je zwolf Gewebe eines EpiDermTM Kits (24 Gewebe) werden dabei miteiner Vehikelkontrolle und fiint Konzentrationen der Testsubstanz behandelt. Zwei iden-tische parallele Testansatze werden an den beiden folgenden Tagen in gleicher Weisebehandelt, jedoch wird ein Versuchsansatz am Tag nach der Substanzapplikation miteinem Sonnensimulator (+UVA)bestrahlt, und der andere (-UVA)verbleibt wiihrend die-ser Zeit im Dunkeln.

Phototoxizitat Son nen Iichtsirnulatorenunter EinsehluB yon UVA undAussehluByon UVB zu verwenden (Spielmann et a!.,1994a). AIle bekannten phototoxischenReaktionen chernischer Stoffe fiihrenletztlich zu Zellschtidigungen, die sich ameinfachsten in Zytotoxizi tatstests an denuntersehiedliehsten Zellen erfassen las-sen. So hat sich del' im Rahmen eines EU/

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COLIPA Projektes entwickelte in vitroPhotozytotoxizitatstest mit der 3T3 Fibro-blastenzellinie der Maus in Validierungs-studien als gut reproduzierbar und pradik-tiv zur Vorhersage des phototoxischenPotentials chemischer Stoffe erwiesen(z.B. Spielmann et al., 1994b, 1994c;1997). Nach der erfolgreich abgeschlos-senen Yalidierung wird dieser Photozy-

totoxizitatstest yon den beteiligten Wis-senschaftlern und auch yom Wissen-schaftlichen Beirat (ESAC) des EU Vali-dierungszentrums ECVAM als validierteAlternativrnethode angesehen. Sie soli dieGrundlage fur eine OECD Richtlinie zurPrilfung auf phototoxische Eigenschaftenbilden (ECYAM, 1997).

In del' Praxis werden auch Stoffe, dieein phototoxisches Potential aufweisen,in geeigneter Zubereitung ohne Risiko fiirden Verbraucher eingesetzt, 1m Rahmendes ECVAM Workshops No.2 "In VitroPhototoxicity Testing" (Spielmann et a!.,1994a) wurde eine Teststrategie entwik-kelt, bei del' zuerst mit einem in vitro Testgepruft wird. Falls in einern in vitro Testein phototoxisehes Potential festgestelltwird und del' Stoff am Menschen ange-wendet werden soli, sieht auch die yonECVAM vorgeschlagene Teststrategie ineinern solchen Fall vor der Anwendungam Menschen einen Tierversuch zur Er-mittlung des "no effect levels (NOEL)"VOl'. Zum Ersatz eines solchen Tierversu-ches bieten sich in vitro Tests mit biotech-nologisch hergestellten menschlichenHautmodellen an, da sie wichtige Zielzel-len des phototoxischen Geschehens ent-halten (Keratinozyten der Haut) und ge-nau wie menschliche Haut eine Penetra-tionsbarriere aufweisen. Hinweise fur dieVerwendbarkeit yon rekonstituierter Epi-dermis fur den Nachweis phototoxiseherund photoprotektiver Eigenschaften lie-gen YOI' (Rouget et aI., 1994).

1.3 Bedarf fur den EpiDermTMPhototoxizitatstestWie oben besehrieben, zeigt del' yon EU/ECVAM, COLTPA und ZEBET gemein-sam entwickelte und validierte 3T3 NRUPhototoxizitatstest (3T3 NRU PT) beirnLaborvergleieh eine fast lOO%ige Repro-duzierbarkeit und eine ebenso groBe Si-cherheit bei der Vorhersage des phototo-xischen Potentials yon Stoffen (Spiel-mann et al., 1997). Die Ermittlung spezi-eller toxiseher Eigenschaften eines Stof-fes errnoglicht es jedoeh nieht zu entsehei-den, ob er in verbrauchernahen Produk-ten und Zubereitungen in ungefahrlichenKonzentrationen eingesetzt werden kann.Dies ist unter anderem bei Kosmetika einwichtiges Problem: So sind z.B. einigeParfumole phototoxisch, werden aber ingeringen und deshalb unbedenklichenKonzentrationen eingesetzt, in denen das

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in LIEBSCH ET AL.--~~--------------------------------~~~

phototoxische Potential nicht zum Tragenkornmt. (Beispiele fur photoioxische Par-fumole sind Bergamot 01 und Musk Am-brette, die jedoch heute nicht mehr inKosmetika eingesetzt werden.) Damitaueh die Unbedenkliehkeit kosmetiseherFormulierungen ktinftig vor der Prtifungam Menschen in vitro getestet werdenkann, ist ein Test notwendig, der sowohldie Barrierefunktion als auch die Zielzel-len der mensehliehen Haut einsehlieBt.Diese Risikoabschatzung ist in einem ein-faehen Photozytotoxizitatstest, wie dem3T3 NRU PT Test, nieht moglich.

1.4 AufgabenstellungAufbauend auf den mit dem Vollhautmo-dell gewonnenen Erfahrungen waren fol-gende Experimente erforderlieh, um dasTestprotokoll zu optimieren und urn zuzeigen, daB del' neue Test so reproduzier-bar ist, daf er im Rahmen einer Validie-rungsstudie in mehreren Laboratorien ge-pruft werden kann:l)Testung der UVA-Empfindlichkeit desModells EpiDermTM zur Ermittlung ei-ner optimalen Liehtdosis fur den Test.Diese muf ausreichend hoch fur diephysikalische Aktivierung der Testsub-stan zen sein, darf aber allein noch kei-ne toxische Wirkung auf die Zellen desEpidermismodells im MTT-Zytotoxizi-tatstest zeigen.

2)Tcchnische Anpassung der Skin-Me-thodik auf die spezifischen Anforderun-gen des Epidermismodells Bpilzerml>'.

3)Optimierung des Tests hinsichtlich derExpositionsdauer mit der PrufsubstanzVOl'der Bestrahlung. Diese Zeitspanneist abhangig von den Barriereleistun-gen des Epidermismodells.

4) Vergleich der Empfindlichkeit des Epi-Derm™ Tests mit dem Skin' Test. Dasich ein mit dem Skin? Test vergleich-bares Testprotokoll auch als optimal furEpiDerm™ erwies, sollte hier anhandeiner Referenzsubstanz gepruft werden,ob die in beiden Tests erzielten Ergeb-nisse aueh vergleiehbar sind.

5)Testung des Einflusses des verwende-ten Losungsmittels ! Vehikels. DiesePriifungen sollen zeigen, weJchen Ein-fluf verschiedene Tragerrnedien einesphototoxisehen Stoffes auf das Tester-gebnis haben.

6)Entwicklung einer Standard Arbeitsvor-schrift (SOP), die sowohl Kriterien furdie Prufung der Qualitat des Tests ent-

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halten mull, als auch ein vorlaufigesVorhersagemodeJl (Pradi ktionsmodell)fur die Umsetzung del' in vitro Ergeb-nisse in cine Bcurteilung der phototo-xischen Eigenschaften von Stoffen.

7)Erarbeitung einer Datenbasis, die eineBeurteilung del' Testleisumgen erlaubt,Dabei soli ten iiberwiegend Stoffe ge-testet werden, fur die aueh schon Er-gebnisse von Skin? vorliegen, um einenvergleich zwischen den im Hautmodellund den im Epidermismodell erhalte-nen Daten zu ermoglichen.

2 Material und Methoden

Die Entwicklung der Methodik wird inden fruheren Publikationen unserer Ar-beitsgruppe mit dem Modell Skin? aus-fiihrlieh besehrieben (Edwards et al.,1994; Liebseh et al., 1994, 1995). Sie solihier deshalb nur kurz sehematisch anhanddes in Abbildung I besehriebenen Test-ablaufes erlautert werden. Der Test istdem in vivo Test auf der Haut yon Ver-suchstieren sehr ahnlich, das heiBt Test-substanzen werden topiseh auf die Horn-sehieht del' Epidermis (stratum corneum)aufgetragen und naeh einer ausreichen-den Einwirkungszeit mit einem Sonnen-simulator (UVA + siehtbares Licht; Lam-pe SOL 500 und dem H-l Filter der Fir-ma Dr. Houle, D-Martinsried) bestrahlt,wie in den Arbeiten mit Skin? heschrie-ben. Auf das EpiDerm™ Modell konnensowohl Losungen als auch stabile Suspen-sionen appliziert werden.

Das Testprinzip besteht aus dem Ver-gleieh der Zytotoxizitat, die ein Stoff beiidentisehen Testkonzentrationen in einemParallelversueh mit Bestrahlung (+UVA)und ohne Bestrahlung (-UVA) in den Ke-ratinozyten des Epidermismodells zeigt.Toxikologischer Endpunkt des Tests istder MTT-Zytotoxizitatstest (Mosmann eta!., 1983), bei dem photometriseh eineZellstoffwechselleistung der Mitochon-drien gemessen wird. Die Zellschadigungwird als Verminderung dieser Stoffweeh-selleistung im Vergleieh zu nur mit Lo-sungsmitteln oder Vehikeln (HP oder 01)behandeltem Kontrollgewebe ausge-driiekt.

Das im Rahmen del' Testentwieklungerarbeitete, endgultige Test-Design undder Zeitablauf sind in Abbildung I wie-dergegeben. Wichtig ist dabei, daB Epi-Derm ™ per Luftfraeht uber N acht aus den

USA so abgestimmt gelicfert wird, dafes am Dienstag im Testlabor eintrifft undab Miuwoch friih im Test verwendet wird.Der erste Medienwechsel naeh einer Stun-de, also bevor der eigentliche Test be-ginnt, ist essentiell, urn das Modell Epi-Denu'>' nach dem Transport einheitlichzu konditionieren.ln dieses Medium wer-den die wahrend des Transports akkumu-lierten Stoffwechselprodukte, Mediatorenund Zellfragmente abgesioben.

3 Ergebnisse und Diskussion

3.1 Testung der UVA-Empfindlich-keit des Modells EpiDerm ™ (ModellEPI.200)Die wichtigste Voraussetzung fiir die Ent-wicklung von Phototoxizitatstests ist dieBestimmung einer nieht toxisehen UVA-Dosis rnit den Zellen bzw. Geweben, diein dem Test eingesetzt werden. Zur Prii-fung del' UVA-Empfindliehkeit des Epi-Derm">' Gewebes wurde es in der fur denPhototoxizitatstest vorgesehenen, kon-stanten Bestrahlungsstarke yon 1,7 mW/em- in Zeitreihen bei zunehmender Be-strahlungszeit mit UVA-Dosen von 3 bis21 Joule/em- bestrahlt (je 3 Gewebe proUVA-Dosis), 21 Std. sparer wurde einMTT-Test durchgefuhrt. Das Experimentwurde an vier versehiedenen EpiDel'm™Chargen aus verschiedenen Wochen wie-derholt. Die Ergebnisse der Experimentesind in den Abbildungen 2a und 2b dar-gestellt und zeigen deutlich, daB eineDosis yon 6 Jrcm" die hochste UVA-Do-sis ist, bei der eine zytotoxische Wirkungausgeschlossen werden kann, wenn dieZytotoxizitat im MTT- Test bestimmtwird. Diese Dosis ist vergleiehbar mit derim 3T3 NRU PT Test verwendeten UVADosis (Spielmann eta!., J994b, c). DieseDosis ist damit sicherlich stark genug, urnphototoxisehe Stoffe ausreiehend mitUVA zu aktivieren. AuBerdem liegt dieseDosis im Bereich del' im Tierversuch zurPrufung der Phototoxizitat ehemiseherStoffe verwendeten UVA Dosen (Spiel-mann et a!., 1994a).

3.2 Technische Anpassung der Skirr'Methodik an die spezifischen Anforde-rungen des Hautmodells Epifrerml?'Del' mit Skin? bei ZEBET entwickeltePhototoxizitatstest wurde zunachst hin-siehtlich der Expositionszeit und des toxi-kologischen Endpunktes Zytotoxizitat im

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LIEBSCH ET AL. ~I-'\-------------------------------h~--

~~t

A

Viabilitat(%)120

EPIDERM (Epi-200) PHOTOTOXIZITATS- TESTTestentwicklung

EPI-200 UVA Sensltlvltat4 unabhangige Experimente(3 Gewebe pro UVA-Dosis)

80

60

40

20

o 10 15 25 30Joule/cm2

B

Viabilitat(%)140

205

EPIDERM (Epi-200) PHOTOTOXIZITATS- TESTTestentwicklung

120 EPI-200 UVA Sensitivitiit4 unabhanqiqe Experimente(3 Gewebe pro UV-Dosls)

100

80

60

40

20

01-,-,-,-,-,-,-,-"",,-,-,-,-.-,-.-,-'-''-'o 2 4 8 10 12 14 16 18 20 22

Joule/cm26

MTT- Test ohne Veranderungen auf dasEpiDenn™ Modell Ubertragen. Die Expo-sitionszeit war aueh bei EpiDerm™ opti-mal, jedoch waren folgende technischenAnpassungen notwendig:~ Die EpiDerm ™ Gewebe sind nieht wieSkin/ auf einem Tragernetz angewachsenund werden daher auch nicht in Stucke

geschnitten geliefert. Die EpiDermTM Ge-webe wachsen wahrend der Herstellungauf einer semipermeablen, beschichtetenPolycarbonatmembran auf dem Bodenvon 10 mm Millicell" Gef'aheinsatzen(Topfchen). Die Einsatze stehen in 24-wellZellkulturschalen im Kulturmedium.Wahrend des gesamten EpiDermlM Pho-

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Abbildungen 2a und 2b: Die Darstellungzeigt Experimente zur UVA Empfindlich-keit von EpiDermTM zur Ermittlung derh6chsten nicht zytotoxischen UVA Dosisim Phototoxizitatstest, Abbildung 2a zeigtvier unabhanqlqe Tests an verschiedenenEpiDerm™ Chargen (jeder Kurvenpunktreprasentlert den Mittelwert aus drei Ge-weben). Abbildung 2b zeigt pro UVA Do-sis aus den zw61f getesteten Geweben denMittelwert, die Standardabweichung (Box)und die Extremwerte (Minima, Maxima).Danach ist die Bestrahlung mit 6 J/cm2 dieh6chste im EpiDermTM Modell sicher nichtzytotoxische UVA-Dosis. Diese Dosis ent-spricht den bei in vivo Versuchen verwen-deten Dosen und reicht tur die Anregungphototoxischer Stoffe aus.

totoxizitatstests bleiben die Gewebe indiesen Einsatzen, d. h. ein Gewebetrans-fer in ein neues Milieu beinhaltet immerden Transfer des gesamten 10 mm Ein-satzgefafies. Aus diesem Grunde muBtenvor allem die Waschprozedur zum Entfer-nen der Testsubstanz und die FormazanExtraktion im MTT- Test angepaBt werden.~ ZEBET hat mit Skin ' die Erfahrunggesammelt, daB der Konditionierung derGewebe nach dem Uberseetransport einehohe Bedeutung zukommt. Dazu werdendie Gewebe vor Testbeginn auf Mediumgesetzt, in welches sie die beim Transportauf Agarose akkumulierten Stoffwechsel-produkte entlassen konnen. Erst nach ei-nem Umsctzcn auffrisches Medium kannmit der Testung begonnen werden. BeiSkin2 wurde diese Konditionierung uberNacht vorgenommen. Da die Firrna Mat-Tek nur am Montag jeder Woche Epi-Derrnf?" in den USA verschickt, komrnendie Gewebe nicht vor Dienstagabend indie Europaischen Laboratorien. Der Epi-Derm ™ Phototoxizitatstcst dauert 3 Tageund mug daher am Mittwoch fruh begon-nen werden. Es wird deshalb eine Kendi-tionierung von nur einer Stunde durch-gefiihrt (s. Abbildung 1). Dies reicht of-fensichtlich aus, da sich bei ZEBET dieVitalitat der Gewebe der unbehandeltenKontrollen (absolute MTT-OD57o) nichtvon den beim Hersteller in den USA ge-messenen Werten unterscheidet.

3.3 Optimierung des Tests hinsicht-lich der Expositionsdauer mit derPrtifsubstanz vor der BestrahlungNachdem die optimale UVA-Dosis mit 6I/em! (= 60 min bei 1,7 mw/cm-) ermit-telt war, wurde die Dauer der Vorbehand-

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____ ~-------------------------------------------------L-IE-BS-C-H-E-T-A-L.~6

lung rnit den Pnifsubstanzen variiert. InAbbildung 3 sind die Ergebnisse fur diebeiden bekannten phototoxischen StoffeBergamot 01 und Anthraccn bei 3sli.indi-ger, 6stilndiger und 21 stilndiger Vorbe-handlungsdauer wiedergegeben. Die Er-gebnisse zeigen bei diesen beiden Stof-fen, daf die phototoxischen Eigenschaf-ten bei einem Einwirken der Priifsubstan-zen uber 21 Stun den am empfindlichstensind. Dieselbe Behandlungsdauer hauesich aueh beim Skin? Modell als optimalerwiesen.

3.4 Vergleich der Empfindlichkeit desEplljerm">' Tests mit dem Skin- TestEin Vergleieh der Empfindliehkeit derbeiden Hautmodelle bei der Phototoxi-zitatsprufung wurde mit Chlorpromazindurchgefuhrt, das klassischerweise alspositive Standardsubstanz eingesetztwird. Die Skin? Ergebnisse in Abbildung4 wurden 1994/95 innerhalb der Eu/CO-LIPA Validierungsstudie bei ZEBET er-hoben, die Ergebnisse mit EpiDenn™ indel' vorliegenden Studie. Abbildung 4zeigt fur identisehe Vorbehandlungszei-ten von 21 Std. und identische Chlorpro-mazin- Konzentrationen fast identiseheErgebnisse. Dieses Ergebnis bestatigt, daBdie bei ZEBET fur das Hautmodell Skin?erarbeitete Methode ZUI' Phototoxizitats-bestimmung ohne grundsatz liche Ande-rungen aueh beim Epidermismodell Epi-Derm™ anwendbar ist. Dieses Ergebnisbestatigt unsere Arbeitshypothese, dafeine fur kunstliche Hautmodelle entwik-kelte toxikologisehe Priifrnethode niehtfur jedes Modell neu entwickelt werdenmuB bzw. daB sie mit dem Verschwindendes Modells vom Markt nieht verlorengeht.

Abbildung 3: Die DarsteJlung zeigt Expe-rimente zur Ermittlung der optimalen Be-handlungszeit mit den Testchemikalienvor der UVA Bestrahlung mit den beidenphototoxischen Stoffen Bergamott 01 undAnthracen. Die schwarzen Balken zeigendie mittlere Viabilitat der unbestrahltenGewebe und die grauen Balken die mitt-lere Viabilitat der bestrahlten Gewebe, je-weils im Verhiitnis zur mittleren Vlabilitatder Vehikelkontrollen. Fur beide Stoffeergab sich bei einer Vorbehandlungszeituber Nacht (21 Stunden) eine bessereEmpfindlichkeit als bel kurzaren Vorbe-handlungszeiten (3 und 6 Stunden).

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3.5 Testung des Einflusses desverwendeten Losungsmittels 1VehikelsUm zu prufcn, welehen EinfluB das Ve-hikel bzw. Losungsmittel bei Applikati-on auf die Haut unter Standardbedingun-gen auf die phototoxischen Eigensehaf-ten im EpiDermTM Modell hat, wurdewiederum Chlorpromazin, das gut was-serloslich ist, im Konzentrationsbereichvon 0,001-1 %iger Losung in Wasser, ineiner Wasser-in-Ol Suspension sowie in01 (Sesarnol) appliziert. Die in Tabelle 1wiedergegebenen Ergebnisse bestatigen,daf Chlorpromazin als wasserloslicheSubstanz in zwei Wiederholungsexperi-menten bereits bei einer Konzentration

von 0,002% phototoxiseh wirkte. BeiVerwendung der Wasser-m-Ol Suspensi-on waren phototoxische Eigenschaftenerst bei 0,2% naehweisbar, also einer100fach hohcrcn Konzentration, undwenn eine Losung in ell gewahlt wurde,trat diese Wirkung erst bei einer 1%igenLosung auf. Dieses Ergebnis macht deut-lieh, daB der Test geeignet ist, den Ein-fluB des Losungsmittels bzw. Vehikels beitopiseher Applikation irn Epi Dcrrn P"

Hautmodell auf das Penetrationsverhal-ten abzuschatzen.

Tabelle I zeigt aufierdem ahnliche Un-tersuchungen zum Einfluf des Losungs-mittels auf die phototoxischen Eigen-

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Phototoxische Wirkung von Chlorpromazin

1994/95 EU/COLIPA Phase II Skin'

i~

~

~ 70~Iso l-='"~ 10

0,001 0.005 0.05 0,1",

1997 Testentwicklung EpiDerm

Abbildung 4: Am Beispiel des phototoxl-sehen Stoffes Chlorpromazin (CPZ) zeigtdie Darstellung einen Vergleich der 1994195 mit dem Hautmodell Skin" erhaltenenErgebnisse mit den unter gleiehen Bedin-gungen (Vorbehandlungszeit und Stoff-konzentrationen) 1997 mit EpiDerm™ er-haltenen Ergebnisse. Die schwarzen Bal-ken zeigen die mittlere Viabilitiit der unbe-strahlten Gewebe und die weiBen Balkendie mittlere Viabilitiit der bestrahlten Ge-webe, jeweils im Verhiitnis zur mittlerenViabiliti:it der Vehikelkontrollen. In beidenModellen wurde ab 0,01% eine phototoxi-sehe Reaktion ermittelt.

schaften mit Promethazin (PMZ), dasgenau wie Chlorpromazin wasserloslichist und phototoxisch wirkt. Auch hierwaren phototoxische Eigenschaften wie-derum in sehr niedrigen Konzentrationenin wassriger Losung nachweisbar, bei oli-ger Losung erst bei hoheren Konzentra-tionen

3.6 Entwicklung einer StandardArbeitsvorschrift (SOP)Es wurde eine 21 seitige Standard Arbeits-vorschrift (Standard Operating Procedure= SOP) entwickelt, die neben einer de-taillierten Darstellung der Testprozedurinklusive der Kalibrierung des verwende-ten Sonnen simulators auch samtliche Kri-terien festlegt, mit denen die Qualitat je-des einzelncn Tests gesichert wird. DieseKriterien umfassen eine Angabe der Min-destvitali tat der un behandelten Epi-DermP" Gewebe (d.h. des mindestens zuerzielenden MTT Urnsatzes), sowie einen

170

Akzeptanzbereich fur die Positivkontrol-Ie und sehlieBlich als Ablehnungskriteri-um das Uberschreiten yon mchr als 30%Differenz zwischen den beiden unbehan-delten Kontrollgeweben. Die SOP enthaltweiterhin ein Dokumentationsblatt, aufdem alle experimenteJlen Rahmenbedin-gungen nach den Regeln der Guten La-bor Praxis (GLP) festgehalten werden,sowie ein MS-EXCEL Spreadsheet, dasnach Import del' Daten aus dem Photo-meter alle Bereehnungen ausfuhrt undeine Graphik erstellt. Die SOP ist in eng-lischer Sprache abgefaBt, da sie so einer-seits direkt an die INVITTOX Datenbank(FRAME, UK) weitergegcben werdenkonnte, und andererseits international mitdieser SOP Partnerlaboratorien fur dieanstehende Pravalidierung gesucht wer-

den konnten. Derzeit ist bei FRAME nurdas Protokoll des Skin? Phototoxizitats-tests erhaltlich (JNVITTOX Protocol no.83, 1994). Die EpiDermTM SOP und daserwahnte Spreadsheet konnen bei ZEBET(siehe Korrespondenzadresse) angefor-dert werden.

Das in der SOP enthaltene Pradiktions-modell fiir die Vorhcrsage phototoxiseherEigenschaften klassifiziert die Gewebe-reaktion als Phototoxizitat, wenn die be-strahlien Gewebe gegenUber den mit glei-eher Konzentration eines Teststoffes be-handelten unbestrahlten Gewebe eine ummindestens 30% reduzierte MTT-Umset-zung zeigen. Eine dosisabhangige Stei-gerung dieser Hernmung unterstutzt diepositive Klassifizierung. Das Pradiktions-model! ist noeh vorlaufig, es muB in ei-

Teststoff Vehikel Teststoff- EpiDermTM Eplfrerm'""konzentration -UVA +UVA% % %

Chlorpromazin H,O 0,001 90 71(1. Experiment) 0,002 89 58

0,01 84 270,Q2 83 160,1 15 15

Chlorpromazin H,G 0,001 107 102(Wiederholung) 0,002 116 76

0,01 101 480,Q2 91 130,1 21 18

Chlorpromazin H,G/OI 0,1 91 540,2 87 301 10 102 II 910 12 19

Chlorpromazin 01 0,01 98 910,02 98 1020,1 91 950,2 91 85I 91 24

Promethazin H,G 0,003 9R 910,01 98 580.3 88 160,1 9 70,3 7 6

Promethazin H,O/Ol 0,1 118 960,2 40 11

I 57 202 47 2910 16 16

Tabelle 1: Testung der in vivo phototoxischen Stoffe Chlorpromazin und Promethazinin versehiedenen Triigern.

= niedrigste Konzentration mit phototoxiseher Wirkung auf EpiDermTM.Eine Viabilitatshemmung der bestrahlten Gewebe von 2: 30% im Vergleich zu den unbestrahl-ten Geweben gleicher Konzentration fuhrt zur Einstufung .phototoxisch".

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zr:'\ LTEBSCH ET AL.

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Tabelle 2: Testung von Lichtschutzfilterst-offen, die in vivo nicht phototoxisch sind,im EpiDerm TM_Phototoxizitatstest.Eine Viabilitatshemmung der bestrahltenGewebe von :::30 % im Vergleich zu den un-bestrahlten Geweben gleicher Konzentrationfuhrt zu der Einstufung .ohototoxisch",

ner Pravalidierungsstudie bestatigt odermodifiziert werden.

3.7 Erarbeitung einer Datenbasis3.7.1 In vivo nicht phototoxischeStoffeDa im Skin? Phototoxizitatstest nicht pho-totoxische Stoffe immer richtig als sol-che erkannt wurden, wurden im Epi-Derm™ Phototoxizitatstest nur vier nichtphototoxische Stoffe getestet. Ein vonSkin" abweichendes Ergebnis hinsichtlichdieser Leistung konnte aufgrund des Test-Designs nicht erwartet werden. Bei denvier getesteten negativen Stoffen handeltes sich urn UV-Lichtschutzfilter, alsoStoffe, die aufgrund ihrer UV-Absorpti-on das Potential fur eine falsch positiveAntwort bieten.

Tabelle 2 zeigt, daB die vier UV-Licht-sehu tzfilter para-Ami nobenzoesaure(PABA), Benzophenone-3, Methoxy Cin-namate und Mexoryl SX mit dem Epi-Derm'?" Phototoxizitatstest aile richtig alsnieht phototoxiseh eingestuft wurden. Dieeinheitlich bei allen 4 Stoffen getesteteKonzentrationsreihe von 0,1 % -10% ent-spricht den Konzentrationen, mit denendie Stoffe im Tierversuch und am Men-schen getestet wurden und in kosmeti-scherr Zubereitungen zur Anwendungkommen. Interessant ist, daB der UV-Fil-ter PABA in der hochsten Testkonzentra-tion von 10% Zel lschadigung ausloste(keine Phototoxizitat, denn die Schadenwurden aueh in den unbestrahlten Gewe-ben festgestellt), wahrend die ubrigen dreiUV-Filter, die sich heute in vielen Son-nencremes finden, auch bei 10% Konzen-tration keinerlei Schaden an den Kerati-nozyten des Ep.Derm'P" Modells auslo-sten.

3.7.2 In vivo phototoxische StoffeVon den acht in vivo phototoxischen Stof-fen wurden vier ausgewahlt, die starkephototoxische Eigenschaften zeigen (5-MOP, 8-MOP, CPZ und PMZ), und vier

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Teststoff Vehikel ~ EpiDerm'" Epiljerm''" ~ Viabilitiitka1lBinfu1 -UVA +UVA ±UVA% % % %

para-Aminobenzoe- 01 0,1 103 94saure 0.2 84 96(1. Experiment) 1 92 89

< 302 85 6510 24 22

para-Aminobenzoc- 61 0,1 104 118saure 0,2 89 103(Wiederholung) 1 95 105 < 30

2 70 7410 41 12

Benzophenon-3 61 0,1 103 III0,3 100 117

1 96 114 < 303 109 119

10 117 124Methoxy-cinnamat 61 0,1 100 100S28 0,3 101 105

I 100 105 < 303 102 104

10 96 98Mexoryl SX 61 0,1 101 91S71 0,3 99 58

1 96 16 < 303 95 710 81 6

Stoffe, die im Skin- Phototox izitatstestentweder falsch negative oder sehwacheErgebnisse gezeigt haben (6-MC, Anthra-cen und die Parfumole Musk Ambretteund Bergamot (1).

3.7.2.1 5-Methoxipsoralen (5-MOP)und 8-Methoxipsoralen (8-MOP)In vivo sind beide Psoralene phototoxisch,jedoch lost 8-MOP im Tierversuch photo-toxische Reaktionen schon bei 10-1OOfachniedrigeren Konzentrationen aus. Von den7 Experirnenten (vier mit 5-MOP und dreimit 8-MOP) sind in Tabellc 3 nul' die 5 Ex-perimente dargestellt, in denen mit einerLichtdosis von 6 Jzcm? gearbeitet wurde.

5-MOP zeigt in den Experimenten einephototoxische Wirkung ab 0,1-0,2% undzeigt im dritten Experiment bei noch nied-rigeren Testkonzentrationen (0,00001-0,001 %) keine Wirkung. 8-MOP zeigt inbeiden Experimenten bis zur niedrigstenTestkonzentration von 0,000001% (!) einekonstante phototoxische Wirkung. Unse-re Ergebnisse bestatigen, daB der Epi-Derm™ Phototoxizitatstest beim Ver-gleich der phototoxischen Eigenschaftenvon 5-MOP und 8-MOP dasselbe Ergeb-

nis erbringt wie die Testung in vivo, narn-lieh daf 8-MOP die erheblich starker pho-totoxische Substanz ist.

3.7.2.2 Chlorpromazin (CPZ)Chlorpromazin (CPZ) wird bei Phototo-xizitatsstudien als positive Referenzsub-stanz eingesetzt. Die mit CPZ erhaltenenErgebnisse sind bereits in Kapitel 3.5 de-tailliert beschrieben. Danach wurde CPZin jedem Fall richtig als phototoxisch er-kannt; die phototoxischen Grenzkonzen-trationen warenjedoch abhangig vom Ve-hike!. Dieses Ergebnis zeigt deutlich denGewinn an zusatzlicher Information ge-genuber einem einfachen Test mit kulti-vierten Zellen: Der gleiche Stoff weist inunterschiedlichen Zubereitungen auf derHaut unterschiedlich starke phototoxischeEigensehaften auf. Dabei ist das Konzen-trations-Zeitverhalten der Aufnahme je-der Zubereitung in die Haut fur die Star-ke der Reaktion verantwortlich. Tn einemZellkulturtest muf CPZ in Losung gete-stet werden; damit sind keine Ruckschlus-se iiber den Ei nfluB der Praparationauf die phototoxisehen Eigenschaftenmoglich.

l71

LIEBSCH ET AL. r:'\--------------------------------~~--~c,.'

TeststotT Vehikel Teststoff- EpiDerm™ EpiDerm™konzentration -UVA +UVA% % %

5-MOP 01 0,01 91 330,D2 84 350,1 86 370,2 90 341 95 43

5-MOP 01 0,001 97 1030,002 100 830,01 99 1000,02 94 590,1 91 38

5-MOP 01 0,00001 121 1340,00002 114 1140,0001 106 1050,0002 106 1300,001 99 106

8-MOP 01 0,00001 91 330,000002 84 35

0,0001 86 370,0002 90 340,001 95 43

8·MOP 01 0,000001 104 470,000002 106 390,00001 103 410,00002 99 420,0001 102 46

3.7.2.3 Promethazin (PMZ)Promethazin ist ein wasserloslicher, pho-totoxischer Stoff. Er zeigte nach den inTabelle 1 dargestellten Daten im Epi-DermO! Phototoxizitatstest in Wasser be-reits in einer Konzentration von 0,0 1%phototoxische Eigenschaften. Bei Appli-kation in einer Wasser/Ol Suspension wa-ren erst IOOfach hohere Konzentrationen,namlich die I%ige Uisung phototoxischwirksam. Bei j 0% Konzentration vonPMZ waren bestrahlte und unbestrahlteGewebe gleichermaBen geschadigt.

3.7.2.4 AnthracenAnthracen verhielt sich im EpiDermlMPhototox izitatstest wie erwartet proble-matisch. Es wurde zwischen 0, I% undmaximal 10% in 01 getestet. In zwei Ex-perimenten zeigte sich eine positive Re-aktion ab 2 bzw. ab 3%iger Stoffkonzen-tration, in den beiden anderen Experimen-ten war Anthracen bis hin zur hochstenKonzentration von 10% negativ.

Anthracen wurde zusatzlich mit 3sti.in-diger und mit 6stiindigcr Applikation vordel' Bestrahlung, wie bereits in Abbildung3 dargesteJlt, getestet. Die kurzere Ein-

172

wirkungszeit sollte ausschlieBen, daB An-thracen im Veri auf der 21 stundigen Ap-plikation vor del' Bestrahlung bereitsdurch das Epi Derrn'?" Gewebe in das dar-unter befindliche Medi um gewandcrt seinkonnte und dies die Reaktion geschwachthaben konnte. Bei beiden Applikations-zeiten war Anthracenje einmal positiv ab3,16% Stoffkonzentration und je einmalnegativ. Die Ergebnisse der insgesamt 10Experimente legen den Schluf nahe, daBdie in vivo Datenbasis fur diesen Stoffnoch einmal grundlich recherchiert wer-den mub.

3.7.2.5 Bergamot 01Bergamot 01 wurde in vier Experimen-ten je einmal mit Einwirkungszeiten von3 Std. und 6 Std. getestet und zweimalmit der in der SOP angegebenen StandardApplikationszeit von 21 Std .. Wie Abbil-dung 3 zeigt, deckten die Testkonzentra-tionen in allen Experimenten den Bereichvon 0,1% bis 10% ab. Bergamot 01 wur-de in allen Experimenten richtig als pho-totoxisch erkannt. Die jeweils niedrigstenKonzentrationen von Bergamot 01, in de-nen phototoxische Reaktionen auftraten,

Tabelle 3: Vergleich der relativen photot-xischen Potenz der beiden in vivo photo-toxischen Psoralene 5-Methoxypsoralenund 8-Methoxypsoralen.

= niedrigste Konzentration mit photo-toxischer Wirkung auf EpiDerm™ Eine Via-bilitatshernmunq der bestrahlten Gewebe von~ 30 % im Vergleich zu den unbestrahltenGeweben gleicher Konzentration tuhrt zu derEinstufung .phototoxisch".

waren 1% bzw. 3,16% bei 21 Std. Appli-kation sowie 3,16% bei 6 Std. Applikati-on und 10% bei 3 Std. Applikationszeit.Neben der Tatsache, daf bereits eine Ein-wirkungsdauer von 3 Std. vor der Bestrah-lung bei Praparation in 01 fur die Pene-tration durch das stratum corneum aus-reicht, bestatigen die Ergebnisse, daf liasEpil.iermt>' Modell bei der in der SOPvorgegebenen 21 stundigen Einwirkungs-dauer am empfindlichsten reagiert.

3.7.2.6 Musk AmbretteMusk Ambrette wurde in vier Experi men-ten je einmal mit 3 Std. bzw. 6 Std. Ap-plikation getestet und zweimal mit der inder SOP angegebenen Standard Applika-tionszeit von 21 Std .. Die Testkonzentra-tionsreihen lagen einheitlich zwischen0,1% und 10%. In allen vier Experimen-ten wurde Musk Ambrette klar als nichtphotoioxisch eingestuft. In TabcJle 4 wirdbeispielhaft eines dieser Experimentevorgestcllt, Das Ergebnis deckt sich mitden Erfahrungen bei Skirr', laBt sich aberdennoch derzeit nicht hinreichend erkla-ren. Eine Erklarung konnte sein, dafMusk Ambrette sich in den bisher vorlie-genden Daten vom Menschen und ausTierversuchen als ein Photoallergen mitnur sehr geringen akut phototoxischenEigenschaften gezeigt hat. Im in vitro 3T3NRU PI Test zeigt Musk Ambrette eineindeutig positives phototoxisches Poten-tial (Spielmann et aI., 1994b, c; 1997).

3.7.2.7 6-Methylcoumarin (6-MC)Tabelle 4 gibt die drei Experimente wie-der, die mit 6-MC durchgefuhrt wurden.Irn ersten Experiment zeigte 6-MC beikeiner Testkonzentration zwischen 0,1%und 10% in 01 eine positive Reaktion. Diehochste Testkonzentration van 10% wirk-te mit und ohne UVA-Bestrahlung glei-chermaBen zytotoxisch, d.h. der Stoff

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-~ LIEBSCH ET AL.

--h~-----------------------------~~~

wurde ausreichend von den Zellen desEpiDermTM Modells aufgenommen. Da 6-MC im Skin- Phototoxizitarstest bei topi-scher AppJikation keine positive Reakti-on zeigte, wohl aber in einem einmaligenExperiment bei quasi "systemischer" Ap-plikation (in DMSO gelost iiber das un-ter den Geweben befindliche Medium),wurde auch im EpiDermTM Modell dieseApplikationsart getestet, Die zwei in Ta-belle 4 aufgefiihrten Experimente mit "sy-stemischer Applikation" zeigen, daB 6-MC in beiden Experimenten keine pho-totoxischen Eigenschaften zeigte.

6-MC ist ein Parfiimstoff, der in vivostarke photoallergene und schwache pho-totoxische Eigenschaften besitzt. Das Ab-sorptionsmaximum von 6-MC liegt imUVB Bereich, und es ist in def Literatur(Gerberick and Ryan, 1990) beschrieben,daB UVB zur Auslosung positiver Photo-reaktionen essentiell ist. Da der UVB An-teil des im EpiDermTM Phototoxizitatstestverwendeten Sonnensimulators zu 100%ausgefiltert war, bietet dies eine Erklarungfur die negativen Ergebnisse. Es wird der-zeit hei ZEBET getestet, wie EpiDerm™sich verhalt, wenn aus dem Sonnenspek-trum nicht aile UVB Anteile ausgefiltertwerden.

4 SchluHfolgerungen

1m vorliegenden Forschungsprojekt wur-de ein neuer Test fur die Vorhersage pho-totoxischer Eigenschaften bei topischerApplikation auf der Ham mit demmenschlichen Epidermis-Modell Epi-Derm™ EPI-200 entwickelt. Mit Ausnah-me del' Substanz Anthracen erwies sichder Epi Dermv" Phototoxizitatstest imZEBET Labor als gut reproduzierbar. Viereindeutig am Menschen nicht phototoxi-sche Stoffe wurden richtig als solche er-kannt, ebenso vier eindeutig phototoxi-sche Stoffe. Del' Test erlaubt auBerdem beiphototoxischen Stoffen direkte Schlusseuber wirksame und unwirksame Konzen-trationen, wie am Beispiel der verglei-chenden Pri.ifung von 8-MOP und 5-MOPgezeigt werden konnte. Weiterhin wurden4 Stoffe gepruft, die im Skin? Phototoxi-zitatstest negative Ergebnisse lieferten,obwohl am Menschen uber phototoxischeEigenschaften berichtet wird. Drei dieserStoffe (Anthracen, 6-MC und Musk Am-brette) zeigten auch im Epiljerrn'>' Pho-totoxizitatstest "borderline" oder negati-ve Ergebnisse, ein Stoff (Bergamot OJ)wurde unter allen Testbedingungen alsphototoxisch erkannt. FUr 6-MC und

Teststoff Vehikel Teststoff- Epilrerm"! Epifrerm"?' Ll Viabilitatkonzentratioo -UVA +UVA ±UVA% % % %

6-Methylcuumarin 01 0,1 95 1210,2 98 1091 85 III < 302 80 6110 7 10

6-Methylcoumarin DMSO 0,0001 94 1130,0002 93 114

"systemisch" iiber 0,001 93 90 < 30das Medium 0,002 73 65

0,01 8

6-Methylcoumarin DMSO 0,001 121 1340,002 114 114

"systemisch" iiber 0,01 106 105 < 30das Medium 0,Q2 106 130

0,1 99 106

Musk Ambrette 01 0,1 109 1120,3 9S 112I 108 110 < 303 102 10910 1\0 109

Tatlelle 4: Testung der Photoallergene 6-Methylcoumarin und Musk Ambrette.Eine Viabilitatshemmung der bestrahlten Gewebe von ~ 30 % im Vergleich zu den unbestrahl-ten Geweben gleicher Konzentration fuhrt zu der Einstufung .pnotctoxlscn".

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Musk Ambrette gibt es Erklarungsmog-Iichkeiten fur das negative Testergebnis,nicht aber [ilr Anthracen.

Der neue Epil'ierm'>' Phototoxizitats-test ist einfach durchzufiihren und liefertschon beiAnwendung von Standard-Test-konzentrationen bei vielen Stoffen inner-halb einer Woche ein brauchbares Ergeb-nis. Da mil diesem kommerziell vertrie-benen menschlichen Hautmodell auch fer-tige Zubereitungen getestet werden kon-

nen und die bei den Testsubstanzen er-mittelten wirksamen Konzentrationen diein vivo Verhaltnisse der topischen Appli-kation gut widerspiegeln, ist der Test sehrwichtig neben dem hochpradiktiven 3T3NRU PI Zellkulturtest. In diesem konnennamlich die Wirkkonzentrationen fiir dieTestung am Menschen nicht ermittelt wer-den, sondern nur das .phototoxische Po-tential" del' Prufsubstanzen. Durch dievorliegenden Daten und die Erarbeitungeiner Testvorschrift (SOP) konnten kurz-lich zwei Laboratorien der internationa-len Kosmetikindustrie (Procter & Gam-ble, Cincinnati) und Beiersdorf AG (Ham-burg) dafur gewonnen werden, sich kurz-fristig an einer Pravalidierung des neuenTests unter Anleitung von ZEBET und mitForderung durch ECVAM zu beteiligen.Aufgrund der vertraglichen Rahmenbe-dingungen muB die Pravalidierung bisEnde 1997 abgeschlossen sein. Ohne dasmit Hilfe zweier Schweizer Organisario-nen erarbeitete Standard Testprotokollund die Datenbasis dazu hatte der Test indem von ECVAM geforderten Pravalidie-rungsprogramm nicht mehr berucksich-tigt werden konnen.

Danksagung

Wir mochten uns an dieser Stelle fur diegro Bzu g ige Unre rsr tttz.u ng du rch denschweizerischen Verband "Tierrechts-signet" (Biel) bedanken, die durch Ver-mittlung des Fonds fur versuchstierfreieForschung (FFVFF, ZUrich) zustandekam. Das "Tierrechtssignet" hat die iiber-wiegenden Kosten fur die kunstl ichemenschliche Haut der Firma MatTek unddie Personalkosten fur unsere Arbe itgetragen.Unser Dank geht auch an FrauSchroteler, Frau Knietzsch und Frau Wil-helm (Senator Airfreight Gmbl-l, Berlin),die seit 6 Jahren personlich dafur sorgen,daB Haurmoc\elle aus den USA ptinktlichdas ZEBET Labor erreichen.

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Was ist Leben?50 Jahre nach

Erwin Schrodinger

Eine alte Fragein neuem Licht-',0 Jahre nach EII,in Schr6dinger

Michael P. Murphy / Luke A. O'Neill (Hrsg.)

Was ist Leben?Die Zukunft der BiologieEine alte Frage in neuem Licht -50 Jahre nach Erwin Schrodinger

In der Nachfolge von Erwin SchrodingerseinfluBreichem Bueh Was ist Leben? stell ensieh in diesern Band - 50 Jahre Jahre sparer-fuhrende Biologen und Physiker erneut jenerSchliisselfrage der Biologie. Ihre Antworteniiberspannen ein Themenspektrum von derchernischen Evolution bis zur Chaostheorie,von der Entwicklungsbiologie bis zur Physikdes Bewulitseins. Sie gewahren nicht nurfaszinierende Einblicke in das Oenken bedeu-tender Wissenschaftler unserer Tage, sondernzeigen auch, wohin sieh die Biologie in dennachsten 50 Jahren entwickeln konnte,C(I. 224 S., geb.DM 48,-/05 35J,-/sFr 46,-ISBN 3-8274-0120-8

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Vangcrowstr. 20, D-69 J IS Heidelberg

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KorrespondenzadresseDr. Manfred LiebschZEBET (Zentralstelle zur Erfassung undBewertung von Ersatz- und Erganzungs-methoden zum Tierversuch) im Bundes-institut fiir gesundheitlichen Verbraucher-schutz (BgVV)Diedersdorfer Weg 1D-12277 BerlinTel. +49-30-8412-2275;Fax +49-30-8412-2958;E-mail: zebet@bgvv.de

ALTEX J4, 4/97