Claudia Kohlert Systemische Verfügbarkeit und ...Pharmazeutische Biologie, die durch ihre Hilfe einen wertvollen Beitrag zu einem sehr angenehmen Arbeitsklima leisteten. Meinen Kollegen

Claudia Kohlert

Systemische Verfügbarkeit und Pharmakokinetik von Thymol nach oraler Applikation einer

thymianhaltigen Zubereitung im Menschen

Systemische Verfügbarkeit und Pharmakokinetik von Thymol nach oraler Applikation einer

thymianhaltigen Zubereitung im Menschen

Dissertation zur Erlangung des

naturwissenschaftlichen Doktorgrades

der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg

vorgelegt von

CLAUDIA KOHLERT aus Bad Kissingen

Würzburg 2001

Eingereicht am: 28.08.01

Mitglieder der Promotionskommission:

Vorsitzender: Prof. Dr. W. Goebel

Gutachter: PD Dr. M. Veit

Gutachter: Prof. Dr. H. Derendorf

Tag des Promotionskolloquiums:

Doktorurkunde ausgehändigt am:

MEINER FAMILIE

Manchmal sieht unser Schicksal aus

wie ein Fruchtbaum im Winter.

Wer sollte bei diesem traurigen Ansehen desselben

wohl denken, daß diese starren Äste,

diese zackigen Zweige im nächsten Frühjahr

wieder grünen, blühen, sodann

Früchte tragen könnten; doch wir

hoffen`s, wir wissen`s.

Goethe

DANKSAGUNGEN Zum Gelingen dieser Arbeit hat das wissenschaftliche und persönliche Engagement von Herrn Privatdozent Dr. Markus Veit, Herrn Professor Hartmut Derendorf, unseren Kooperationspartnern, Freunden und Kollegen maßgeblich beigetragen. Deshalb möchte ich mich ganz herzlich bedanken bei:

Meinem Doktorvater, Herrn Privatdozent Dr. Markus Veit, für sein

wissenschaftliches Interesse und Engagement und nicht zuletzt für seine Ermutigung, den Weg zu Ende zu gehen. Durch ihn lernte ich selbständig zu arbeiten, Verantwortung zu tragen und konnte mir Durchsetzungsvermögen erwerben. Auch für mein weiteres Leben - nicht nur in Bezug auf Fachliches - hat er mir viel mit auf den Weg gegeben.

Meiner Co-Betreuerin, Frau Privatdozentin Dr. Gudrun Abel für ihre

wissenschaftliche Unterstützung, die Bereitstellung eines Arbeitsplatzes und ihren persönlichen Einsatz, der maßgeblich zum Gelingen dieser Arbeit beitrug. Durch den Aufenthalt in der Abteilung "Forschung und Entwicklung" der Bionorica AG konnte ich wertvolle Erfahrungen für mein weiteres Berufsleben sammeln.

Meinem Co-Betreuer Herrn Prof. Dr. Hartmut Derendorf für seine

wissenschaftliche Unterstützung in Fragen der pharmakokinetischen Auswertung und für die Weiterbildung, die er mir während meines Aufenthaltes in seinem Arbeitskreis an der University of Florida ermöglichte.

Herrn Dr. Volker Christoffel für die Bereitstellung eines Arbeitsplatzes in seiner

Abteilung während meines Aufenthaltes bei der Bionorica AG. Herrn Prof. Dr. Franz-Christian Czygan für die Bereitstellung eines

Arbeitsplatzes an seinem Institut, seine Diskussionsbereitschaft und seine Anregungen, sich auch über die Wissenschaft hinaus zu bilden.

Meinen Kollegen Frau Dr. Ulrike Gräfe und Herrn Jörg Wittig, ohne deren

fachlichen und persönlichen Beistand das Anfertigen dieser Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Sie haben mich während der Zeit am Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie in "guten und schlechten" Zeiten begleitet. Durch ihre Bereitschaft, Kritik zu üben und kompromißlos für den Anderen einzustehen, haben sie diese Zeit unvergeßlich gemacht.

Frau Dr. Irmgard van Rensen für die wissenschaftliche Unterstützung und

Diskussionsbereitschaft und allen anderen Mitarbeitern des Lehrstuhls für

Pharmazeutische Biologie, die durch ihre Hilfe einen wertvollen Beitrag zu einem sehr angenehmen Arbeitsklima leisteten.

Meinen Kollegen der Abteilung "Forschung und Entwicklung" der Bionorica AG,

insbesondere Frau Eleonora Schmid und Frau Susanna Heidmann für ihr Interesse und für ihre stete Hilfsbereitschaft.

Herrn Dr. med. Benno Brinkhaus und Herrn Dr. med. Gernot Schindler von der

Medizinischen Klinik I mit Poliklinik, Abteilung Naturheilverfahren, der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg für ihr Engagement bei der Durchführung der klinischen Studien, das maßgeblich zum Gelingen dieses Projektes beigetragen hat.

Herrn Dr. Reinhard März von der Bionorica AG, dessen großem Engagement

und Interesse wir die großzügige finanzielle Unterstützung durch die Firma Bionorica verdanken. Er stand stets mit Rat und Tat zur Seite, die Kooperation mit ihm in diesem Projekt hat mich sehr bereichert.

Herrn Holger Pforte vom Deutschen Institut für Ernährungsforschung in

Potsdam für die Durchführung der LC-Messungen im Rahmen der Plasmaanalytik. Herrn Dr. Feigl von Bayern Innovativ, ohne dessen umfangreiche finanzielle

Unterstützung unseres Projektes die Durchführung dieser Arbeit nicht möglich gewesen wäre.

A&M (Labor für Analytik und Metabolismusforschung, Bergheim) für die

Durchführung der LC-MS/MS Messungen. Frau Dr. Ulrike Gräfe, Herrn Jörg Wittig, Frau Ingrid Leipolz-Wittig und

besonders Dr. Peter Schupp für die persönliche Betreuung, Toleranz und Unterstützung, und nicht zuletzt für die Korrektur dieser Arbeit.

Meiner Familie für den persönlichen Beistand und die aufopfernde

Unterstützung während dieser Arbeit in "Krisenzeiten".

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung.......................................................................................................... 1

1.1 Ätherische Öle ............................................................................................... 3

1.2 Die Gattung Thymus in Pharmazie und Medizin............................................ 4

1.2.1 Botanik und Inhaltsstoffe ....................................................................... 4

1.2.2 Pharmakologische Aktivität ................................................................... 5

1.2.2.1 Antiphlogistische Wirkung ............................................................. 5

1.2.2.2 Sekretolytische Wirkung................................................................ 6

1.2.2.3 Antibakterielle Wirkung ................................................................. 6

1.2.2.4 Antivirale Wirkung ......................................................................... 7

1.2.2.5 Antioxidative Wirkung.................................................................... 7

1.2.2.6 Toxikologie.................................................................................... 8

1.2.3 Klinische Wirksamkeit............................................................................ 8

1.3 Kenntnisstand zu Bioverfügbarkeit und Pharmakokinetik von Ätherisch-Öl-

Komponenten ................................................................................................ 9

1.3.1 Resorption ............................................................................................. 9

1.3.2 Verteilung ............................................................................................ 13

1.3.3 Pharmakokinetik.................................................................................. 16

1.3.4 Elimination........................................................................................... 18

1.4 Methoden und Analytik ................................................................................ 26

1.5 Zielsetzung .................................................................................................. 28

2 Material und Methoden .................................................................................. 29

2.1 Chemikalien ................................................................................................. 29

2.2 Materialien und Geräte ................................................................................ 30

2.3 Studiendesign der Pilotstudien zur systemischen Verfügbarkeit und

Pharmakokinetik von Thymol....................................................................... 36

2.4 Entwicklung und Validierung der analytischen Methoden zur Plasmaanalytik

der Pilotstudien ............................................................................................ 36

2.4.1 Methodenentwicklung der Pilotstudien ................................................ 40

2.4.2 Validierung der Methode für die Pilotstudien ....................................... 42

2.4.3 Strukturabsicherung von Thymol im Plasma nach enzymatischer

Spaltung mittels GC-MS...................................................................... 45

Inhaltsverzeichnis II

2.5 Studiendesign der Hauptstudie zur systemischen Verfügbarkeit und

Pharmakokinetik von Thymol....................................................................... 46

2.5.1 Probanden........................................................................................... 46

2.5.2 Ein- und Ausschlußkriterien................................................................. 46

2.5.3 Prüfpräparat ........................................................................................ 48

2.5.4 Dosierung ............................................................................................ 48

2.5.5 Studienablauf ...................................................................................... 49

2.5.6 Unerwünschte Ereignisse.................................................................... 50

2.6 Prüfpräparat der Hauptstudie....................................................................... 51

2.6.1 Extraktion von Thymol aus BronchipretTP Filmtabletten ................... 51

2.6.2 Trennung und Detektion ...................................................................... 51

2.6.3 Kalibrierung und Quantifizierung ......................................................... 52

2.7 Analytik der Plasma- und Urinproben vor enzymatischer Hydrolyse............ 53

2.7.1 Detektion von Thymolsulfat und Thymolglucuronid in Plasma und

Urin mittels LC-MS/MS........................................................................ 53

2.7.1.1 Probenaufarbeitung .................................................................... 53

2.7.1.2 Trennung und Detektion.............................................................. 54

2.7.2 Detektion von freiem Thymol im Plasma ............................................. 55



2.7.3 Detektion von freiem Thymol im Urin................................................... 56



2.8 Entwicklung und Validierung der analytischen Methoden zur Plasma-

analytik für die Hauptstudie.......................................................................... 58

2.8.1 Validierung der Analytik zur Auswertung der Hauptstudie................... 61

2.8.1.1 Identifizierung und Quantifizierung der Referenzsubstanz

Thymol; Interkalibrierung des Arbeitsstandards .......................... 61

2.8.1.2 Lebensdauer der Fasern............................................................. 63

2.8.1.3 Spezifität ..................................................................................... 63

2.8.1.4 Einstellung des Gleichgewichtszustandes .................................. 65

2.8.1.5 Kalibrierfunktion: Linearität und Bestimmungsgrenze ................. 65

2.8.1.6 Richtigkeit und Wiederholpräzision ............................................. 67

Inhaltsverzeichnis III

2.8.1.7 Stabilität ...................................................................................... 69

2.8.1.8 Qualitätssicherung während der Probenmessung ...................... 70

2.8.1.9 Wiederfindung............................................................................. 71

2.8.1.10 Strukturabsicherung von Thymol im Plasma nach enzymatischer

Spaltung mittels GC-MS.............................................................. 71

2.9 Entwicklung und Validierung der analytischen Methoden zur Urinanalytik .. 72

2.9.1 Methodenentwicklung.......................................................................... 72

2.9.2 Validierung .......................................................................................... 73

2.9.2.1 Spezifität ..................................................................................... 73

2.9.2.2 Einstellung des Gleichgewichtszustandes .................................. 75

2.9.2.3 Kalibrierfunktion: Linearität und Bestimmungsgrenze ................. 75

2.9.2.4 Richtigkeit und Wiederholpräzision ............................................. 77

2.9.2.5 Stabilität ...................................................................................... 78

2.9.2.6 Qualitätssicherung während der Probenmessung ...................... 79

2.9.2.7 Wiederfindung............................................................................. 80

2.9.2.8 Strukturabsicherung von Thymol im Urin nach enzymatischer

Spaltung mittels GC-MS.............................................................. 80

2.10 Synthese von Thymolglucuronid als Referenzsubstanz............................... 81

2.11 Pharmakokinetische Analysen..................................................................... 85

2.11.1 Nichtkompartiment Analyse................................................................. 85

2.11.2 Kompartiment Analyse ........................................................................ 86

3 Ergebnisse...................................................................................................... 87

3.1 Analytik der Plasma- und Urinproben vor enzymatischer Spaltung der

Konjugate .................................................................................................... 87

3.2 Ergebnisse der Pilotstudien ......................................................................... 92

3.2.1 Plasmakonzentrationen nach enzymatischer Spaltung der

Konjugate nach Applikation einer Tablette BronchipretTP ................ 92

3.2.2 Plasmakonzentrationen nach enzymatischer Spaltung der

Konjugate nach therapeutischer Dosierung......................................... 94

3.2.3 Plasmakonzentrationen nach enzymatischer Spaltung der Konjugate -

Einzeldosis BronchipretTP – verlängerter Meßzeitraum.................... 95

Inhaltsverzeichnis IV

3.3 Ergebnisse der Hauptstudie......................................................................... 96

3.3.1 Plasmakonzentrationen nach enzymatischer Spaltung der Konjugate

nach Applikation einer Tablette BronchipretTP.................................. 96

3.3.2 Renale Elimination von Thymol in Form seiner Phase-II-Metabolite ... 98

3.3.3 Pharmakokinetik in Nichtkompartiment-Modellen.............................. 100

3.3.4 Pharmakokinetik in Kompartiment-Modellen ..................................... 101

3.4 Pharmakokinetische Auswertung der Thymolkonzentrationen im Urin nach

enzymatischer Spaltung der Konjugate ..................................................... 104

4 Diskussion.................................................................................................... 106

4.1 Analytische Methoden................................................................................ 106

4.2 Metabolismus und Pharmakokinetik von Thymol....................................... 109

4.2.1 Metabolismus .................................................................................... 109

4.2.2 Pharmakokinetik................................................................................ 112

4.2.3 Beurteilung der potentiellen Wirksamkeit .......................................... 116

5 Zusammenfassung ...................................................................................... 118

6 Summary....................................................................................................... 121

7 Literaturverzeichnis ..................................................................................... 123

8 Anhang.......................................................................................................... 132

9 Abbildungsverzeichnis................................................................................ 158

10 Tabellenverzeichnis ..................................................................................... 162

11 Abkürzungsverzeichnis............................................................................... 165

1 Einleitung 1

1 Einleitung

Pflanzen, die Ätherische Öle enthalten, werden seit Jahrhunderten in der

Volksmedizin zur Behandlung und Linderung verschiedenster Krankheiten, wie z.B.

von gastrointestinalen Beschwerden, Schmerzen, Erkältungskrankheiten und

Bronchitis eingesetzt.

Die Wirksamkeit von Ätherischen Ölen und daraus hergestellten Zubereitungen hat

sich in langer Tradition - sprich empirisch - erwiesen und konnte in klinischen Studien

bestätigt werden. Zusätzlich wurden in In-vitro-Assays diverse pharmakologische

Eigenschaften Ätherischer Öle oder daraus isolierter Einzelkomponenten festgestellt.

Es ist allerdings häufig nicht klar, welche Substanzen im Körper für die beobachteten

Effekte verantwortlich sind. Untersuchungen zur systemischen Verfügbarkeit liefern

erste Anhaltspunkte, ob die in vitro getesteten Verbindungen auch für die in vivo

beobachteten Effekte bzw. die klinische Wirksamkeit einer Verbindung oder daraus

hergestellten Zubereitungen verantwortlich sind. Darüber hinaus sind

Untersuchungen zu Resorption, Verteilung und Metabolismus wünschenswert. Zum

einen, um die systemische Verfügbarkeit der betreffenden Verbindung am Zielorgan

abzuklären und zum anderen, um die Arzneimittelsicherheit und –unbedenklichkeit

im Rahmen von Zulassungs- und Nachzulassungsverfahren auch bei pflanzlichen

Arzneimitteln zu gewährleisten.

Trotz der großen Anzahl pflanzlicher Arzneimittel, die Ätherische Öle oder natürlich

vorkommende Verbindungen aus Ätherischen Ölen enthalten, existieren nur einige

wenige Studien zur systemischen Verfügbarkeit und Pharmakokinetik. Dies zeigt, wie

groß der Bedarf an weiteren Untersuchungen zur Pharmakokinetik und

Bioverfügbarkeit ist.

Verläßliche Daten zur Pharmakokinetik am Menschen könnten helfen zu klären, ob

eine Substanz oder deren Metabolite zur Therapie bestimmter Krankheiten beitragen

kann, und würden somit auch einen Beitrag zur größeren Sicherheit in der

Anwendung pflanzlicher Arzneimittel leisten.

Das im Rahmen des im folgenden beschriebenen Projektes verwendete

Fertigarzneimittel BronchipretTP, eine Kombination aus Thymiantrockenextrakt und

Primelwurzeltrockenextrakt, wird zur Therapie der akuten Bronchitis eingesetzt.

Untersuchungen zur systemischen Verfügbarkeit sollen jedoch zunächst klären, ob

1 Einleitung 2

Thymol, das den Hauptbestandteil des ätherischen Thymianlös darstellt, für die

Wirksamkeit (mit)verantwortlich sein kann.

Derartige Untersuchungen liefern nicht nur Daten, die ein rationales Konzept in der

Phytotherapie untermauern können, sondern sind auch national und international

richtungsweisend für Wirksamkeitsprüfungen von Phytopharmaka, die bei

Atemwegserkrankungen eingesetzt werden.

1 Einleitung 3

1.1 Ätherische Öle

Ätherische Öle sind Gemische lipophiler, bei Raumtemperatur meist flüssiger,

flüchtiger, sehr intensiv riechender Verbindungen, die von Pflanzen produziert

werden. Ein natürliches Ätherisches Öl setzt sich aus einer Vielzahl lipophiler

Einzelsubstanzen zusammen. Bisher sind ca. 3000 Verbindungen beschrieben, die

hauptsächlich aus dem Terpen- und auch dem Phenylpropanstoffwechsel stammen.

Aufgrund der chemischen Struktur der Verbindungen neigen Ätherische Öle zur

Autoxidation und sollten daher vor Licht und Sauerstoff geschützt aufbewahrt werden

(TEUSCHER, 1997).

Ätherische Öle bzw. daraus isolierte Verbindungen werden vielfältig in der

Lebensmittelindustrie verwendet, beispielsweise als Aromastoffe zur Herstellung von

Zahnpasten, Bonbons, Kaugummis oder Getränken. Darüber hinaus sind sie in

Bohnerwachs, Schuhcremes und Raumsprays zu finden.

In der Medizin werden die Ätherischen Öle in langer Tradition verwendet

(GILDEMEISTER und HOFFMANN, 1956). Ätherische Öle bzw. einzelne isolierte

Verbindungen werden auf Grund ihrer sekretolytischen, expektorierenden,

spasmolytischen, antitussiven und antibakteriellen Eigenschaften zur Therapie von

Erkältungskrankheiten eingesetzt. Zur Wirksamkeit von 1,8-Cineol (GRIMM, 1987;

DOROW, 1989; MAHLO et al., 1990), Thymianextrakt (KNOLS et al., 1994; ERNST et al.,

1997) und Myrtol (FEDERSPIL et al., 1997) liegen Studien zur klinischen Wirksamkeit

vor. Einige Ätherische Öle bzw. Ätherisch-Öl-Komponenten, wie beispielsweise

Terpentinöl oder Campher zeigen bei äußerlicher Anwendung hyperämisierende

Eigenschaften (SCHILCHER, 1986), Pfefferminzöl wirkt schmerzlindernd bei

Kopfschmerzen vom Spannungstyp (GÖBEL et al., 1996) und nach oraler Applikation

bei Reizdarmsyndrom (LIU et al., 1997; PITTLER und ERNST, 1998) und Dyspepsie

(MAY et al., 1996).

Zum Wirkmechanismus Ätherischer Öle ist jedoch noch wenig bekannt. Es wird

postuliert, daß die Einzelkomponenten auf Grund ihrer geringen Molekülgröße und

Lipophilie mit Zellmembranen in Wechselwirkungen treten können. Die Reizwirkung

könnte, ähnlich wie bei Lokalanästhetika, bei hohen Konzentrationen durch

Membranschädigung entstehen, während mittlere Konzentrationen membran-

1 Einleitung 4

stabilisierend wirken (TEUSCHER et al., 1990). Bei geringeren Konzentrationen treten

Effekte durch spezifische Wechselwirkungen mit Enzymen, Carriern, Ionenkanälen

oder Rezeptoren, die in der Zellmembran lokalisiert sind, auf (SCHILCHER, 1986;

TEUSCHER et al., 1990). Ätherisch-Öl-Komponenten können auf Grund ihrer

strukturellen Eigenschaften die Blut-Hirn-Schranke überwinden. Diese Tatsache

macht sich auch die Aromatherapie zunutze, bei der man nach Applikation

Ätherischer Öle einen Einfluß auf die Gehirnaktivität feststellen kann (BUCHBAUER,

1998).

1.2 Die Gattung Thymus in Pharmazie und Medizin

Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen wurden mit einem

Fertigpräparat vorgenommen. Dabei handelt es sich um Bronchipret®TP

Filmtabletten, die Thymian- und Primelwurzeltrockenextrakt enthalten.

1.2.1 Botanik und Inhaltsstoffe

Thymus vulgaris (Abb. 1.1) L. gehört zur Familie der Lamiaceae. Der bis zu 50 cm

hoch werdende Strauch mit lanzettlich eingerollten Blättern und rötlich-violetten

Blüten wächst auf den Macchien der Berge in Italien, Südfrankreich und Spanien

(HÄNSEL et al., 1994; CZYGAN, 1997; HÄNSEL et al., 1999).

Abb. 1.1 Thymus vulgaris, L.

1 Einleitung 5

Thymiankraut (Thymi herba), bestehend aus den getrockneten Laubblättern und

Blüten, ist schon in den alten „Arzneibüchern“ als probates Mittel bei Infektionen der

Atemwege bekannt. Bereits im Jahre 1543 beschreibt Leonhart Fuchs in seinem

„New Kreüterbuch“ die heute noch genutzte Wirksamkeit gegen Husten (CZYGAN und

HÄNSEL, 1993). Volksmedizinisch wird Thymian unter anderem bei Asthma, Laryngitis

und Tonsillitis verwendet.

Im Europäischen Arzneibuch sind sowohl Thymus vulgaris als auch Thymus zygis als

offizinelle Drogen geführt (EUROPÄISCHES ARZNEIBUCH, 1997). Thymus vulgaris führt

1-2,5 % Ätherisches Öl, dessen Hauptbestandteil mit 30-70 % das Thymol darstellt.

Neben Thymol sind das isomere Carvacrol mit 3-15 % und 1,8-Cineol mit 2-14 % zu

finden. Neben dem Ätherischen Öl finden sich Flavonoide, Gerbstoffe, Bitterstoffe

und Triterpene (HÄNSEL et al., 1994; CZYGAN, 1997).

1.2.2 Pharmakologische Aktivität

Thymian in einer Dosis von 1-2 g Droge auf eine Tasse als Aufguß mehrmals täglich

oder in Form von Fluidextrakt (1-3 mal täglich 1-2 g) wird zur Therapie von

Bronchitis, Keuchhusten und Katarrhen der oberen Luftwege eingesetzt. Es sind

bronchospasmolytische, expektorierende und antibakterielle Wirkungen beschrieben

(BUNDESANZEIGER, 1992).

Die im folgenden aufgeführten pharmakologischen Aktivitäten wurden z.T. nach

Applikation verschiedener Zubereitungen (Thymianextrakt, Ätherisches Thymianöl

oder einzelne Ätherisch-Öl-Komponenten des Thymianöls) beobachtet. Es muß

deshalb jeweils die unterschiedliche stoffliche Zusammensetzung der verwendeten

Zubereitungen berücksichtigt werden.

1.2.2.1 Antiphlogistische Wirkung

Im Carrageenin-induzierten Rattenpfotenödemmodell wurde eine dosisabhängige,

antiphlogistische Wirkung für Thymianextrakt nach oraler Applikation (162 mg/kg

Körpergewicht) gezeigt. Da das Maximum der Hemmung vor allem in der frühen

Phase beobachtet wurde (0,5 – 2 h nach Applikation), nahm man an, daß die

entzündungshemmende Wirkung vor allem auf die Hemmwirkung gegenüber

1 Einleitung 6

Histamin und Serotonin zurückzuführen war (MORGENSTERN, 1998). Primel-

wurzelextrakt, der neben Thymianextrakt Bestandteil der BronchipretTP

Filmtabletten ist, zeigte in demselben Modell zwar ebenso antiphlogistische Wirkung,

jedoch leistete Thymian den hauptsächlichen Beitrag (MORGENSTERN, 1998).

1.2.2.2 Sekretolytische Wirkung

Thymianöl zeigt eine sekretolytische, sekretomotorische und broncholytische

Wirkung (WEIß, 1991). Durch die vermehrte Bildung seröser Interziliarflüssigkeit,

sowie die gleichzeitige Steigerung der Ziliartätigkeit an den Bronchien, wird das

Abhusten erleichtert (HÄNSEL et al., 1994; CZYGAN, 1997). Die dosisabhängige,

sekretolytische Wirkung des Thymianextraktes wurde außerdem in verschiedenen

Sekretolysemodellen am Kaninchen bzw. an der Ratte belegt (LESLIE, 1978; Curle et

al., 1991).

1.2.2.3 Antibakterielle Wirkung

Die bakteriostatische Wirkung verschiedener Thymianöle bzw. einzelner

Komponenten, unter anderem auch gegen Erreger, die bei akuten und chronischen

Atemwegserkrankungen am häufigsten nachgewiesen wurden, ist zahlreich in der

Literatur beschrieben (CRESPO et al., 1990; DIDRY et al., 1993; PANIZZI et al., 1993;

SHAPIRO et al., 1994; PATTNAIK et al., 1996; MARINO et al., 1999).

In einer Untersuchung von Panizzi et al. zeigte ein Thymianöl mit 31,4 % Thymol,

12,4 % Carvacrol sowie gamma-Terpinen (11,1 %) und p-Cymen (17,0 %) eine

minimale Hemmkonzentration (MHK) gegenüber Staphylococcus aureus von

5 µg⋅mL-1 Flüssigmedium. Gegenüber Escherichia coli, Bacillus subtilis und

Saccharomyces cerevisiae betrug die MHK jeweils 2 µg⋅mL-1, gegenüber Candida

albicans nur 1 µg⋅mL-1 (PANIZZI et al., 1993).

Die Wirkung der Ätherisch-Öl-Fraktion der phenolreichen spanischen Thymus-Art

Thymus serpylloides ssp. gadorensis wurde an sechs grampositiven und

gramnegativen Bakterienstämmen mit der Methode der Filterplättchendiffusion

getestet (CRESPO et al., 1990). Neben der Ätherisch-Öl-Fraktion wurden auch

1 Einleitung 7

synthetische Mischungen der in dem Öl enthaltenen Kohlenwasserstoffe, Alkohole,

Acetate und Phenole untersucht. Am stärksten wirksam war die Mischung der

Phenole und der Alkohole.

Im Test gegen 9 gramnegative und 6 grampositive Bakterien zeigte sich

Thymianöl vor allem gegen grampositive Bakterien als biostatisch wirksam

(MARINO et al., 1999). Im Vergleich zu anderen Entwicklungsstadien erwies sich das

zur Blütezeit gewonnene Öl als das wirksamste.

1.2.2.4 Antivirale Wirkung

Eine antivirale Wirkung konnte für Thymianextrakt im Plaque-Reduktions-Test

gegenüber Influenza-A-Viren und dem Respiratory-Syncytical-Virus (RS-Virus)

gezeigt werden. Für die Hemmung von Influenza-A-Viren wurde eine IC50 von 15 µg

Trockenmasse⋅mL-1 ermittelt. Die IC50 für Amantadin als Referenzsubstanz lag bei

1 µg Trockenmasse⋅mL-1 (SCHWENK, 1998).

1.2.2.5 Antioxidative Wirkung

Neben dem Einsatz als alt bewährtes Hustenmittel interessiert sich die Wissenschaft

in jüngster Zeit auch auf anderen Ebenen für den Thymian bzw. das Ätherische

Thymianöl.

Der antioxidative Effekt des Thymianöls bzw. von Thymol alleine konnte in Ratten

nachgewiesen werden. Nach Applikation von Thymianöl bzw. Thymol war die

Aktivität antioxidativ wirksamer Enzyme (Superoxiddismutase und Glutathion-

peroxidase) gegenüber den Kontrolltieren signifikant erhöht. Der Gehalt mehrfach

ungesättigter Fettsäuren in cerebralen Phospholipiden sowie anderen Geweben, die

für eine normale Hirntätigkeit, vor allem im Alter notwendig sind, blieb auf einem

deutlich höheren Niveau als bei den Kontrolltieren. Der Hauptbeitrag zu dem

beobachteten antioxidativen Effekt wurde offenbar durch Thymol geleistet (YOUDIM

und DEANS, 1999; YOUDIM und DEANS, 2000).

1 Einleitung 8

1.2.2.6 Toxikologie

Weder Thymianextrakt noch Thymianöl zeigten in Tierversuchen mit Ratten und

Mäusen akute Toxizität nach oraler Gabe (LESLIE und SALMON, 1979; QURESHI et al.,

1991). Für die Applikation von Thymianöl (Thymus Kotschyanus) lag die LD50 für

kleinere Labortiere bei 1000-1200 mg⋅kg-1 Körpergewicht. Für Kaninchen gelang die

Bestimmung der LD50 auf Grund der offensichtlich fehlenden Toxizität nicht

(GUSEINOW et al., 1987).

1.2.3 Klinische Wirksamkeit

In einer randomisierten Doppelblindstudie an 60 Patienten mit produktivem Husten

wurde die vergleichbare sekretolytische Wirksamkeit von Thymianextrakt und

Bromhexin gezeigt (KNOLS et al., 1994).

Der Vergleich von Bronchipret Filmtabletten mit anderen Sekretolytika in einer

Multicenter Studie im Hinblick auf die klinische Wirksamkeit bei akuter Bronchitis

belegte, daß Bronchipret Filmtabletten sowohl gegenüber anderen pflanzlichen als

auch synthetischen Sekretolytika relevante therapeutische Vorteile, vor allem bei der

Behandlung Erwachsener, aufwies (ERNST et al., 1997). So wurde durch die

Bronchipret Therapie die Menge, Viskosität und Eigenschaften des Sputums positiv

beeinflußt. Die Hustenhäufigkeit tagsüber sowie nachts und der Schmerz während

des Hustens nahmen unter der Therapie ab. Ebenso verringerte sich die Auskultation

auch während des Hustens. Bei den Nebenwirkungen wurden lediglich

gastrointestinale Störungen beobachtet, die aber gegenüber synthetischen

Sekretolytika eine geringere Rate aufwiesen. Somit erwies sich Bronchipret in der

symptomatischen Behandlung akuter Bronchitis als sichere und effektive

Formulierung.

1 Einleitung 9

1.3 Kenntnisstand zu Bioverfügbarkeit und Pharmakokinetik von Ätherisch-Öl-Komponenten

Die Pharmakokinetik natürlicher, terpenoider Verbindungen ist noch nicht

ausreichend untersucht. Für einige Monoterpene liegen sehr detaillierte Daten vor,

aber vor allem zu Untersuchungen am Menschen fehlen zufriedenstellende

pharmakokinetische Daten. Ergebnisse aus Tierexperimenten sind zwar nicht ohne

weiteres auf den Menschen übertragbar, jedoch sind sie angesichts der spärlichen

Datenlage zu dieser Thematik ein wertvoller Anhaltspunkt.

Leider wurden in den vorliegenden Arbeiten meistens keine oder nur sehr wenige

Angaben zu den jeweils verwendeten analytischen Methoden gemacht. Deshalb

mußte die Bewertung der Ergebnisse der Studien vorsichtig vorgenommen werden,

da die verwendeten analytischen Methoden den Anforderungen einer

entsprechenden Validierung nicht genügen könnten.

1.3.1 Resorption

Dermale Applikation

Zubereitungen aus Eukalyptusöl und Latschenkiefernöl, die α- und β-Pinen,

Campher, 3-Caren, und Limonen enthielten, wurden für die meisten Studien zur

Untersuchung der dermalen Resorption Ätherischer-Öl-Komponenten herangezogen.

(Strukturformeln der im folgenden beschriebenen Verbindungen siehe Abb. 1.2).

Diese Monoterpene wurden nach dermaler Applikation auf Grund ihrer lipophilen

Eigenschaften und der geringen Molekülgröße ohne weiteres resorbiert (RÖMMELT et

al., 1974; SCHÄFER und SCHÄFER, 1982; SCHUSTER et al., 1986).

Die Haut stellte keine Barriere für die Resorption der betrachteten Verbindungen dar

(RÖMMELT et al., 1974; SCHÄFER und SCHÄFER, 1982). Die Applikation Ätherischer-Öl-

Verbindungen in Form einer Salbe bei Menschen (SCHUSTER et al., 1986;

LANGENECKERT, 1998) als auch in Form eines Bades bei Mäusen (SCHÄFER und

SCHÄFER, 1982) führte zu einem raschen Anstieg der Plasmakonzentrationen der

untersuchten Verbindungen.

Die ebenfalls mögliche pulmonale Resorption flüchtiger Verbindungen wurde in allen

Studien mit externer Luftzufuhr der Probanden während der Versuche vermieden.

1 Einleitung 10

Dieses Verfahren schien sinnvoll, denn in den von Langeneckert durchgeführten

Untersuchungen zeigte sich, daß ein erheblicher Teil der Verbindungen bei dermaler

Applikation auch pulmonal resorbiert wurde (LANGENECKERT, 1998). Maximale

Plasmakonzentrationen wurden innerhalb von 10 min für α-Pinen (SCHUSTER, 1986)

bzw. nach 1 h für 1,8-Cineol (LANGENECKERT, 1998) beobachtet. Es konnte gezeigt

werden, daß das Ausmaß der Resorption von der Größe des behandelten

Hautareals (SCHÄFER und SCHÄFER, 1982), den Hauteigenschaften, den

verabreichten Konzentrationen, sowie der Expositionszeit abhing (RÖMMELT et al.,

1974). Die zuletzt genannten Ergebnisse wurden in einer Studie mit nur einem

Probanden erhalten und erlauben deshalb nur begrenzte Schlußfolgerungen (Details

siehe Tab. 1.1 und Tab. 1.2).

Orale Applikation

Nur wenige Studien beschäftigten sich mit der Resorption flüchtiger Verbindungen

nach oraler Applikation. In drei Studien mit Ratten wurde mit Hilfe von radioaktiv

markiertem 14C-Citral und [1-14C]-trans-Anethol die aufgenommene Menge über die

in Urin, Faeces und Ausatemluft wiedergefundene Menge an Radioaktivität

abgeschätzt (SANGSTER et al., 1984b; DILIBERTO et al., 1988; BOUNDS und CALDWELL,

1996). Es wurden 80-95 % der ursprünglich verabreichten Radioaktivität

wiedergefunden.

In einer pharmakokinetischen Studie wurden Probanden Weichgelatinekapseln

verabreicht, die ein definiertes Gemisch aus Limonen, 1,8-Cineol und α-Pinen

enthielten (ZIMMERMANN et al., 1995). Es wurden zerkleinerte Kapseln (entsprach der

Verabreichung in flüssiger Form) mit intakten Kapseln verglichen. Bei beiden

Probandengruppen, konnten annähernd gleiche AUC-Werte beobachtet werden. Die

Differenz der AUC-Werte betrug weniger als 7 %. Die Cmax-Werte der Probanden, die

die zerkleinerten Kapseln erhalten hatten, waren mehr als 25 % höher und tmax war

0,75 h verglichen mit 2,5 h in der Gruppe der ganzen Kapseln. Diese Daten deuteten

darauf hin, daß der obere Teil des Gastrointestinaltraktes keinen signifikanten Einfluß

auf die Resorption von 1,8-Cineol hatte.

1 Einleitung 11

Abb. 1.2 Strukturformeln von Ätherisch-ÖL-Komponenten (SCHNEIDER, 1998).

OH

OH

p-Cymen Thymol Carvacrol

OMe OH

OMe

t-Anethol Eugenol (+)-α-Pinen

OH (-)-α-Pinen (-)-ß-Pinen (-)-Borneol

O

O

OH

L(-)-Campher 1,8-Cineol (-)-Menthol

OH

O

H

(+)-Limonen Linalool t-Citral (=Geranial)

1 Einleitung 12

OH

CO2H

OH

(+)-3-Caren (-)-Isobornylacetat (-)-Myrtenal

CH2OH

OH

O

(-)-Myrtenol Pinocarveol (-)-Verbenon

Pulmonale Resorption

Flüchtige Monoterpene sind ganz besonders zur Inhalation geeignet, beispielsweise

zur Therapie von Infektionen des Respirationstraktes. Nach Inhalation können die

Substanzen durch die Lunge resorbiert werden und somit systemisch verfügbar sein.

54-76 % der mit dem Inhalat verabreichten Dosis von α-Pinen, Campher und

Menthol wurden durch die Lunge aufgenommen (RÖMMELT et al., 1978; RÖMMELT et

al., 1988; LEVIN et al., 1992). Die Berechnung der absorbierten Menge erfolgte

jedoch durch die Bildung der Differenz von eingeatmeter und ausgeatmeter Menge.

Diese Methode brachte jedoch einige Unsicherheiten mit sich, wie beispielsweise

Ablagerungen der Verbindungen auf der Schleimhaut sowie Metabolismus vor der

Resorption; auch die Verteilung in andere Kompartimente wurde somit nicht

berücksichtigt. Diese Bedenken wurden durch eine Studie bestätigt, bei der nur 4-

6 % der durch Inhalation verabreichten Menge im Blut wiedergefunden wurden

(RÖMMELT et al., 1978).

Vielfältige Faktoren schienen das Ausmaß der inhalativen Resorption zu

beeinflussen. Römmelt et al. (1988) zeigten, daß die pulmonale Resorption von der

Art der Verbindung und der Atemmechanik der Probanden abhing (RÖMMELT et al.,

1988). Außerdem konnte gezeigt werden, daß der Übergang der Verbindungen aus

dem Wasser in die Gasphase Temperatur abhängig war. Bei 80°C konnten nach

1 Einleitung 13

15 min zwar 12 % Campher aber nur 5 % Menthol in der Gasphase detektiert

werden. Offensichtlich korrelierte der Anteil der pulmonalen Resorption mit der

Flüchtigkeit der Verbindungen (LANGENECKERT, 1998) (Details siehe Tab. 1.2).

1.3.2 Verteilung

Der Metabolismus von Ätherisch-Öl-Komponenten ist durch ihre individuelle

chemische Struktur bedingt, weshalb keine generellen Aussagen getroffen werden

können. Metaboliten entstehen sowohl durch Phase-I- als auch durch Phase-II-

Reaktionen.

Bereits 1979 wurden von Takada et al. Untersuchungen zum Metabolismus von

Thymol in Kaninchen und am Menschen durchgeführt (TAKADA et al., 1979). Im Urin

von 3 Kaninchen wurde nach oraler Applikation von Thymol in einer Dosis von

0,5 g⋅kg-1 Körpergewicht der Anteil an Glucuronsäure und Schwefelsäure vor

Applikation des Thymols mit dem Gehalt nach der Applikation verglichen. Aus

diesem Vergleich folgerten die Autoren, daß Thymol bzw. Oxidationsprodukte des

Thymols hauptsächlich an Glucuronsäure konjugiert wurden. Ob der Urin vor der

Bestimmung mit Glucuronidase bzw. Sulfatase behandelt wurde, war nicht

ersichtlich.

Aus Urin von 2 Probanden wurde nach oraler Applikation von 0,6 g Thymol

Thymohydrochinon und Thymolglucuronid isoliert und durch den Vergleich mit

synthetisierten Referenzsubstanzen die Identität bestätigt. Die Existenz von

Thymolsulfat wurde auf Grund von Experimenten mit Flüssig-Flüssig-Extraktion

postuliert. Die Strukturabsicherung der Komponenten mittels Massenspektrometrie

fehlte jedoch.

Austgulen et al. (1987) konnten nach Applikation von 1 mmol⋅kg-1 Thymol per

Magensonde im Rattenurin 6 Phase-I-Metabolite detektieren (Abb. 1.3) (AUSTGULEN

et al., 1987). Hierbei handelte es sich um Oxidationsprodukte. Die Oxidation fand

sowohl am Aromaten als auch an der aliphatischen Seitenkette statt. Die massen-

spektrometrische Strukturaufklärung der Thymolmetabolite erfolgte jedoch nicht an

Hand von Referenzsubstanzen, sondern im Vergleich mit Fragmentierungsmustern

des strukturell ähnlichen p-Cymens, dessen Metabolite in einer früher durchgeführten

Studie bestimmt wurden.

1 Einleitung 14

OH

OH

OH

OH

OHO

OH

OH

OH

OH

OH

O

OH

OH

OH

OH

ThymolThymohydrochinon

Abb. 1.3 Phase-I-Metaboliten von Thymol im Rattenurin (AUSTGULEN et al., 1987).

Der Metabolismus von trans-Anethol wurde sowohl bei Nagern als auch bei

Menschen untersucht (SANGSTER et al., 1984a; SANGSTER et al., 1984b; SANGSTER et

al., 1987). Die Bestimmung renaler Metabolite deutete darauf hin, daß 14C-trans-

Anethol im Menschen vollständig über den Weg der oxidativen O-Demethylierung

und Oxidation der Seitenkette an unterschiedlichen Stellen abgebaut wurde

(SANGSTER et al., 1987). Es wurde kein freies trans-Anethol im Urin detektiert. Das

Metabolitenmuster renaler Metabolite beim Menschen unterschied sich nur

quantitativ von dem der Ratten. Eine Dosisabhängigkeit in der Bildung renaler

Metabolite war sowohl für t-Anethol in Nagern als auch für 14C-Eugenol in Ratten zu

beobachten (SUTTON et al., 1985). Für trans-Anethol war die Bildung der Phase-I-

1 Einleitung 15

Metabolite dosisabhängig (SANGSTER et al., 1984a), wohingegen 14C-Eugenol eine

Dosisabhängigkeit bei der Bildung von Phase-II-Metaboliten zeigte.

Metaboliten von Menthol wurden in einigen Humanstudien untersucht (BELL et al.,

1981; SOMERVILLE et al., 1984; KAFFENBERGER und DOYLE, 1990; LANGENECKERT,

1998). Nach oraler Applikation von L-(-)-Menthol bzw. Pfefferminzöl wurden 35-80 %

des ursprünglichen Mentholgehaltes renal als Glucuronid eliminiert. Nur in der von

Bell et al. (1981) durchgeführten Studie wurde die Menge an freiem Menthol und

Mentholglucuronid separat untersucht (BELL et al., 1981). Es konnte kein freies

Menthol detektiert werden und Mentholsulfat wurde nur in Spuren nachgewiesen.

Die großen interindividuellen Schwankungen bezüglich der ausgeschiedenen Menge

an Menthol könnten auf Unterschiede in der Resorption und die unterschiedlichen

Eßgewohnheiten zurückzuführen sein (KAFFENBERGER und DOYLE, 1990). Nach

Verabreichung von Pfefferminzölkapseln an Ileostomiepatienten war die Elimination

von Mentholglucuronid um 6 % geringer als nach Verabreichung an gesunde

Probanden. Dies ließ vermuten, daß der Großteil der Mentholresorption in oberen

Darmabschnitten stattfand (SOMERVILLE et al., 1984).

Andere Bestandteile des Ätherischen Pfefferminzöls wie Menthon oder

Menthylacetat wurden in diesen Studien jedoch nicht untersucht. Diese

Verbindungen könnten aber zu Menthol metabolisiert werden und als

Mentholglucuronid ausgeschieden werden.

Der Metabolismus von Menthol wurde detailliert in Ratten nach oraler Applikation

untersucht (MANS und PENTZ, 1987; YAMAGUCHI et al., 1994). Das Oxidationsmuster

war dem des Thymols ähnlich. Mentholglucuronid stellte mit einem Anteil von 60 %

im Rattenurin ebenfalls den Hauptmetaboliten dar (MANS und PENTZ, 1987).

Untersuchungen zu Citral (Isomerengemisch aus Neral und Geranial) in Ratten

zeigten einen vollständigen und stereoselektiven Metabolismus (DILIBERTO et al.,

1990). Zusätzlich zur Leber waren noch andere Organe am Metabolismus beteiligt.

Der Vergleich der Eliminationswege nach oraler, intravenöser und dermaler

Applikation ließen einen cutanen first-pass Effekt vermuten (DILIBERTO et al., 1988)

(Details siehe Tab. 1.3).

1 Einleitung 16

1.3.3 Pharmakokinetik

Aus der zur Verfügung stehenden Literatur zur Pharmakokinetik Ätherischer-Öl-

Komponenten ging hervor, daß die meisten Ätherischen Öle bzw. einzelne

Verbindungen daraus durch ein mindestens biphasisches Plasmakonzentrationsprofil

gekennzeichnet waren (KLEINSCHMIDT et al., 1985; KOVAR et al., 1987; FALK und

HAGBERG, 1990; JAGER et al., 1996). Dies deutete darauf hin, daß die Verbindungen

zunächst in andere Gewebe verteilt wurden. Eine hohe Clearance und kurze

Eliminationshalbwertszeiten ließen jedoch eine Kumulation unwahrscheinlich

erscheinen.

Der beste Ansatz, grundlegende pharmakokinetische Parameter einer Verbindung

(Halbwertszeit, Verteilungsvolumen und Clearance) zu erhalten, ist die Beobachtung

der Plasmakonzentrationen nach intravenöser Injektion. Es wurde jedoch nur eine

Studie nach intravenöser Applikation von Kleinschmidt et al. (1985) durchgeführt, bei

der den Probanden ein bronchosekretolytisches Gemisch von Terpenen (Ozothin®:

Myrtenal, Myrtenol, Pinocarveol, Verbenon, Terbinhydrat) injiziert wurde und

anschließend Plasmakonzentrationen als Gesamtterpenkonzentration bestimmt

wurden. Die kurze Halbwertszeit in der α-Phase von 3 bis 4 min deutete auf eine

rasche Verteilung der Terpene in Gewebe hin. Die Eliminationshalbwertszeit in der β-

Phase von 60-65 min wurde auf Metabolismus und Ausscheidung zurückgeführt

(KLEINSCHMIDT et al., 1985).

Pharmakokinetische Kenndaten von α-Pinen wurden nach oraler, dermaler und

pulmomaler Applikation bestimmt (SCHUSTER et al., 1986; FALK und HAGBERG, 1990;

LANGENECKERT, 1998). Nach oraler Applikation ergab sich eine Halbwertszeit von

202 min. Nach dermaler Applikation hingegen wurde eine mit ca. 5 min sehr kurze

Halbwertszeit in der α-Phase, gefolgt von einer längeren Halbwertszeit in der β-

Phase (26 bis 38 min) beobachtet. In der Studie von Falk und Hagberg (1990) wurde

eine dritte γ-Phase mit einer Eliminationshalbwertszeit von 695 min bestimmt (FALK

und HAGBERG, 1990). Hierbei wurde die Wichtigkeit langer Blutabnahmezeiten und

die Notwendigkeit sensitiver Methoden zur Bestimmung pharmakokinetischer

Parameter deutlich. Das hohe Verteilungsvolumen von α-Pinen deutete auf

1 Einleitung 17

Verteilung der Verbindung in Kompartimente hin, was wiederum auf die Affinität zu

lipophilen Geweben zurückzuführen sein könnte.

Trotz des hohen Verteilungsvolumens sprach die hohe Clearance für eine schnelle

Elimination von α-Pinen, weshalb es auch bei Langzeitapplikation nicht zu einer

Kumulation kommen dürfte. In dieser Studie wurden hohe Standardabweichungen

beobachtet, was durch das gemischte Probandenkollektiv (weibliche und männliche

Probanden) bedingt gewesen sein könnte (SCHUSTER et al., 1986).

Nach Inhalation von 1,8-Cineol konnte ein erheblicher Unterschied in der

Eliminatioshalbwertszeit zwischen weiblichen und männlichen Probanden beobachtet

werden (JAGER et al., 1996). Obwohl pulmonale Resorption und tmax annähernd

gleich waren, zeigte sich für die weiblichen Probanden eine doppelt so lange

Eliminationshalbwertszeit von 18 h. Auf Grund dessen nahm man an, daß das

subcutane Fettgewebe einen wichtigen Einfluß auf die Elimination von 1,8-Cineol

ausübte. Nach oraler Applikation von 1,8-Cineol wurde eine Halbwertszeit von 5,86 h

ermittelt (LANGENECKERT, 1998).

Die relative Bioverfügbarkeit von 1,8-Cineol und pharmakokinetische Kenndaten von

Myrtol (Gemisch aus 30 mg 1,8-Cineol, 30 mg Limonen und 8 mg α-Pinen) wurden

nach oraler Applikation intakter und zerkleinerter Kapseln bestimmt (ZIMMERMANN et

al., 1995). Vergleiche der 1,8-Cineol Plasmakonzentrationen zeigten eine relative

Bioverfügbarkeit von ca. 100 % für die intakten Kapseln. Wie erwartet, blieben die

1,8-Cineol Plasmakonzentrationen nach Applikation der intakten Kapseln länger auf

einem höheren Niveau. Die Komponenten Limonen und 1,8-Cineol konnten nur in

einigen wenigen Probanden detektiert werden.

Daten zur Elimination von Menthol und Campher nach Inhalation wurden in ein

Zweikompartiment-Modell eingepaßt (RÖMMELT et al., 1988). Die Eliminations-

halbwertszeit betrug für Menthol 35,5 und für Campher 39,9 min. Dies deutete darauf

hin, daß selbst nach Dauermedikation nicht mit einer Kumulation zu rechnen sein

würde (Details siehe Tab. 1.1).

1 Einleitung 18

1.3.4 Elimination

Die Elimination Ätherischer-Öl-Komponenten wurde im Urin, Faeces und in der

Ausatemluft untersucht. Die Verbindungen bzw. deren Metabolite wurden

hauptsächlich renal und pulmonal eliminiert. Geringe Mengen wurden über die

Faeces ausgeschieden. Unmetabolisiert konnten jedoch nur Spuren in Urin und

Faeces nachgewiesen werden. Für Menthol und Linalool wurde ein

enterohepatischer Kreislauf angenommen, der die Exkretion der Substanzen

verzögerte (PARKE et al., 1974; YAMAGUCHI et al., 1994).

Auf Grund ihrer Flüchtigkeit war anzunehmen, daß Ätherisch-Öl-Komponenten oder

deren Metabolite abgeatmet werden können. Es konnten jedoch nur 1,5 bis 5 % der

intravenös verabreichten Monoterpene unmetabolisiert in der Atemluft wieder

gefunden werden. 75-95 % dieser Fraktion wurden in den ersten 40 min abgeatmet

(RÖMMELT et al., 1974; KLEINSCHMIDT et al., 1985). Die abgeatmete Menge nahm mit

zunehmendem Siedepunkt der Terpene ab (RÖMMELT et al., 1974). Der

hauptsächliche Teil der Verbindungen wurde offenbar metabolisiert und als CO2

abgegeben, oder renal als Konjugate eliminiert (Römmelt et al., 1974; KLEINSCHMIDT

et al., 1985; LEVIN et al., 1992) (Details siehe Tab. 1.5).

Die vollständige Elimination der verabreichten Dosis wurde nur für radioaktiv

markiertes Citral und t-Anethol untersucht (SANGSTER et al., 1984b; DILIBERTO et al.,

1988; BOUNDS und CALDWELL, 1996). Die renale Ausscheidung stellte mit mehr als

50 % der applizierten Dosis den Hauptausscheidungsweg dieser Verbindungen dar,

gefolgt von pulmonaler Elimination (SANGSTER et al., 1984b; DILIBERTO et al., 1988).

Der Ausscheidung über die Faeces kam die geringste Bedeutung zu.

Nach oraler Applikation von 14C-t-Anethol an Menschen wurden ca. 60 % der

Metabolite renal eliminiert (SANGSTER et al., 1987; CALDWELL und SUTTON, 1988). Ein

geringerer Anteil wurde metabolisiert und über die Lunge als 14CO2 abgegeben.

Kumulative Ausscheidungskurven zeigten die komplette Elimination nach 24 h an.

Höhere Dosen hatten keinen Einfluß auf die Eliminationswege von t-Anethol

(CALDWELL und SUTTON, 1988).

Im Gegensatz dazu wurden eine Dosisabhängigkeit der Eliminationswege für 14C-t-

Anethol in Ratten und für α-Pinen im Menschen beobachtet (SANGSTER et al., 1987;

1 Einleitung 19

LEVIN et al., 1992). Bei niedrigen Dosen wurde ein Großteil der applizierten

radioaktiven Dosis als 14CO2 wiedergefunden, was darauf hindeutete, daß bei Ratten

oxidative O-Demethylierung vorherrschte. Im Gegensatz dazu nahm der prozentuale

Anteil an renal eliminiertem α-Pinen (Hauptmetabolit: Verbenol) mit abnehmender

Dosis zu (LEVIN et al., 1992). Diese Ergebnisse könnten auf Sättigung der für die

entsprechenden Reaktionen verantwortlichen Enzyme zurückzuführen gewesen sein.

Veränderung im Exkretionsprofil in Bezug auf die Art der Applikation wurden für Citral

beobachtet. Die Unterschiede nach oraler und intravenöser Applikation wurden als

Folge des Abbaus durch die Darmflora oder einen first-pass Effekt gesehen. Für

Citral wurde keine Verschiebung des Eliminationsprofils bei veränderter Dosis

beobachtet (DILIBERTO et al., 1988) (Details siehe Tab. 1.4 und Tab. 1.5).

1 Einleitung 20

Tab. 1.1 Pharmakokinetik Ätherischer-Öl-Verbindungen (Fortsetzung s. Seite 21).

Verbindung Ozothin1 (+)-α-Pinen, (-)-α-Pinen Menthol Campher Probanden Probanden Probanden Probanden Probanden Probanden n 9 und 27 8 ♂ 6♂, 6♀ 8♂ 10♂

oral Inhalation Applikation intravenös

2 h Inhalation, leichte körperliche Betätigung in einem Expositionsraum

dermal Salbe, Fläche: 400 cm2

10 min Inhalation aus einer Salbe aus

Wasser (500 mL; 80°C)

Dosis 10 mL 450 mg⋅m-3; 225 mg⋅m-3

450 mg⋅m-3 (-)-α-Pinen 2 g 83 mg 61 mg 5 g Salbe

α-Phase n=9

β-Phase n=27

α-Phase

β-Phase

γ-Phase

450 mg⋅m-3 ; 225 mg⋅m-3

4,8

38 695

450 mg⋅m-3 (-)-α-Pinen

Verteilungs- und Eliminations- halbwertszeit (min)

3-4 60-65

5,6 40 555

26 202 121 35,5 39,9

Verteilungs- volumen (L⋅kg-1)

8425

t max (min) 120

6,3 105 12

c max

(ng⋅mL-1) 7,4 48,5 50,0

Cl4h (l⋅h-1⋅ kg-1)

1,4 1,3

1,4

Clearance

Cl21h (l⋅h-1⋅kg-1)

14186 (L⋅h-1)

1,1 1,1 1,2 Erstautor(en) KLEINSCHMIDT et al.,

1985 FALK und HAGBERG, 1990 SCHUSTER

et al., 1986 LANGENECKERT, 1998 RÖMMELT et al., 1988

1 Ozothin: Myrtenal, Myrtenol, Pinocarveol, Verbenon, Terpinhydrat

1 Einleitung 21

Tab. 1.1 Pharmakokinetik Ätherischer-Öl-Verbindungen (Fortsetzung von Seite 20). Verbindung 1,8-Cineol Probanden Mäuse Probanden Probanden Probanden

n 5 20♂, 19-42 Jahre 2♀ 2♂ 8 ♂ 1 h Inhalation

oral Applikation

Rosmarinöl Kapsel zerkleinerte Kapsel

20 min Inhalation dermal Inhalation oral

cross over Dosis 0,5 mL 120

mg2 300 mg3

120 mg2

300 mg3

4 g 1165 mg 219 mg 292 mg

α- β- Phase

α-Phase

β-Phase

α-Phase

β-Phase

Verteilungs-

und Eliminations- halbwertszeit

(min)

6 45 92 221 100 206 2,0 4,8 31 33 6,9 13 73 282 157 106 351

Verteilungs- volumen (L⋅kg-1)

t max (min) 138 154 42 65 19 14 14 15 60 10 75 c max

(ng⋅mL-1) 72 168 108 205 868 1135 701 459 22 296 601

Erstautor(en) KOVAR et al.,

1987 ZIMMERMANN et al., 1995 JAGER et al., 1996 LANGENECKERT, 1998

2 Myrtol: 8 mg α-Pinen, 30 mg Limonen, 30 mg 1,8-Cineol 3 Myrtol: 20 mg α-Pinen, 75 mg Limonen, 75 mg 1,8-Cineol

1 Einleitung 22

Tab. 1.2 Resorption in Tier und Mensch. Verbindung(en) Campher, Menthol, α-Pinen,

Isobornylacetat, Limonen radioaktiv markiert, Haupt-

komponenten von Pinimenthol-Bad

α-Pinen, Campher, β-Pinen, Limonen

14C-Citral 14C- t-Anethol radioaktiv markiert

α-Pinen Limonen Campher Borneol Menthol Campher (+)-α-Pinen

(-)-α-Pinen

Probanden/Tiere Mäuse Probanden Ratten Ratten, Mäuse Probanden, Alter 20-30 Probanden Alter: 20-45 Probanden Alter: durchschn. 31 n 3 ♂ 3 ♂ 1 > 3 6♂, 6♀

6 ♂ und ♀

10 ♂ 2 ♂

Lösung/Bad Rasierte Haut

Darreichungsform

3 cm2 1,5, 3, 6 cm2

Lösung/Bad intravenös

oral und intravenös

oral Inhalation 10 min Inhalation aus Wasser

(500 mL; 80°C)

Inhalation während leichter körperlicher Betätigung

2 h Exposition

450 225 10 450

Dosis 20 mL Badekonzentrat mit einer radioaktiv markierten

Verbindung, in 100 L Wasser

450 L Wasser, 30 min, 150 mL Latschenkiefernöl i.v.:0,6 µg⋅kg-1

oral: 5, 50, 500 mg⋅kg-1

i.v.:50 mg⋅kg-1

250 mg⋅kg-1 10 %ige wäßrige Lösung der betreffenden Verbindungen

5 g Salbe

mg⋅m-3

61 % 66 % 54 % 58 % 58 % 60 % 40 % 58 %

Prozentsatz unmetabolisiert im Blut

Resorption keine Verbindung bevorzugt resorbiert

absorbierte Menge von

behandeltem Hautareal abhängig

abhängig von Expositionszeit,

Größe des Hautareals,

Konzentration

80-95 % Resorption

>95 % Wiederfindung

der Radioaktivität im 24 h Urin 5,6 % 4,6 % 7,5 % 6,5 %

76 % 67 %

Erstautor(en) SCHÄFER und SCHÄFER, 1982 RÖMMELT et al.,

1974 DILIBERTO et

al., 1988 BOUNDS und CALDWELL,

1996

RÖMMELT et al., 1978 RÖMMELT et al., 1988 LEVIN et al., 1992

1 Einleitung 23

Tab. 1.3 Metabolismus in Tier und Mensch. Verbindung Thymol Carva-

crol Citral t-Anethol Eugenol Menthol

Probanden/ Tiere

Probanden Kanin-chen

Ratten Ratten Ratten Probanden Ratten Mäuse Ratten/Mäuse Ratten Probanden Probanden

Ileostomie Patienten

Probanden Ratten Probanden

n 2 3 ♂ ♂ >3 2 ♂ ♀ ♂ ♀ ♂ ♀ 20 4♂, 2♀ 3♂, 3♀ 4♂ ♂ 8 ♂ oral Darreich-

ungsform oral oral Magen-

sonde Magen-sonde

oral, intravenös,

dermal

oral oral/ intraperitoneal

oral/intra-venös

Magen-sonde

oral

Kap- seln

besch. Kap.

Kap- seln

besch. Kap.

oral magensaft-resistente Kapseln

oral der-mal

Inha-la-tion

oral

Menthol Menthol Dosis 0,6 g

0,5 g⋅kg -1

1 mmol⋅

kg-1

1 mmol⋅ kg-1

500 mg⋅kg-1, 5, 50 mg⋅kg-1

1 mg 50 mg⋅kg-1 0,05 5, 50, 1500

mg⋅kg-1

0,05- 1000

mg⋅kg-1

500 mg Menthol

0,4 mL Pfefferminzöl 95 mg Menthol

180 mg Pfeffer-minzöl

0,1-1,0; 0,5 mg⋅kg-1

297 mg

56 mg

73 mg

Phase-I-Metabolismus Urin Thymo-

hydro-quinone

Siehe Abb. 1.3

4-MBA2 3%

ω-Oxidation: Zimtsäure-Derivate;

Dosisabhän-gigkeit

Reduktion der

Doppelbin-dung

Oxidation der Methin- und

Methylstruktur

Oxidations-produkt

Reduktion und

Hydroxylie-rung der 2,3- Doppelbindung;

Oxidation der Aldehyd-

funktion; stereoselek-

tiv an C8

Oxidation der olefinischen

Doppelbindung

Spuren unmetabolisierte

n Menthols

Phase-II-Metabolismus Berechnet als Prozentsatz des ursprünglichen Mentholgehaltes nach GS-Spaltung4:

nach GS-Spaltung4:

nach GS-Spaltung4:

Glucuro-nid

+ + 1 + + + + hohe Dosen

vor und nach

GS-Spal-tung4: 50 %

in 24 h

35 % in 24 h

40 % in 24 h

17 % in 24 h

29 % in 24 h

40 % in 14 h

nach GS-Spaltung4:

60 % 1 % 5 % 80 %

Sulfat + +1 + geringe Dosen

Spuren

weitere Konjugate

cutaner first-pass

Metabolismus

Glycin- Konjugate 4-MHA3

56%

Glycin- Konjugate,

Gluthathion- Konjugate

Anzahl der Metaboliten

6 7 7 11 10 14

Erst-autor(en)

TAKADA et al., 1979

AUSTGULEN et al., 1987

DILIBERTO et al., 1988;

DILIBERTO et al., 1990

SANGSTER et al., 1987

SANGSTER et al., 1984a

SANGSTER et al., 1984b

SUTTON et al., 1985

BELL et al., 1981

SOMERVILLE et al., 1984 KAFFEN-BERGER

und DOYLE, 1990

MANS und PENTZ, 1987; YAMAGUCHI et

al., 1994

LANGENECKERT, 1998

1indirekte Bestimmung 24-MBA: 4-Methoxybenzoe Säure 34-MHA: 4-Methoxyhippur Säure4GS-Spaltung: Glucuronidase und Sulfatase Spaltung

1 Einleitung 24

Tab. 1.4 Elimination bei Nagern. Verbindung Menthol Linalool Citral t-Anethol Eugenol Proband/ Tier

Ratten Ratten

Ratten Ratten Ratten Mäuse Ratten

n 3♂ 2♂ > 3 ♂ ♀ ♂ ♀ Darreich-ungsform

oral Magen-sonde

oral intra-venös

dermal oral/intavenös Magensonde

Dosis 500 mg⋅kg-1 500 mg⋅kg-1 5, 50, 500 mg⋅kg-1

5 mg⋅kg-1

5-50 mg⋅kg-1

0,05 mg⋅kg-1

1500 mg⋅kg-1

0,05 mg⋅kg-1

1500 mg⋅kg-1

0,05- 1000 mg⋅kg-1

Elimina-tionsweg

renal 19% bevorzugt an Tag 2

7% 51% 58% 8,5% 56% 32% 72% 35% 75-80%

pulmonal 23% CO2 17% CO2 8% CO2 3,3% CO2 28% 57% 20% 67% unmetabolisiert 0,48% 0,33% 2,84% faecal 26%

bevorzugt an Tag 1

67% biliär 12% 7% 3,48% 1% 1% 10%

enterohe-patischer Kreislauf

+ +

Ende der Detektion

48 h 72 h 72 h 72 h 24 h

Erst-autor(en)

MANS und PENTZ, 1987; YAMAGUCHI et al., 1994

PARKE et al., 1974

DILIBERTO et al., 1988 SANGSTER et al., 1984b SUTTON et al., 1985

1 Einleitung 25

Tab. 1.5 Elimination beim Menschen. Verbindung α-Pinen Campher β-Pinen Limonen Ozothin 14C-t-Anethol (+)-α Pinen (-)-α Pinen Proband/Tier Probanden Probanden Proban-

den Probanden Probanden

n 1♂

27 und 9♂ 3♂ 5♂ 2♂

oral oral Darreichungs-form

intravenös oder Bad

intra-venös

Inhalation 2 h Exposition

Dosis intravenös: 0,6 µg⋅kg-1; Bad: 150 mL Latschenkiefernöl in 450 L Wasser

10 mL 1 mg 1 mg 50 mg 250 mg 450 mg⋅m-3 225 mg⋅m-3 10 mg⋅m-3 450 mg⋅m-3

1,7%

Verbenol 2%

Verbenol 3,8%

Verbenol 1,5%

Verbenol Eliminations-weg

renal 60 % 60,1 % 68,6 % 53,9 %

0,001% unmetabolisiert im Urin

intravenös: 5-7% 20 % 13,5 % 17 % 13,8 %

5 % unmet.1 3 % unmet. 1 3,6 % unmet. 1 1,4 % unmet. 1 unmet. 1 als CO2 als CO2 75% eliminiert nach:

10-15 min 10-15 min 10-15 min 20-30 min Bad

pulmonal

2 h nach Bad: % des max. detektierten Wertes:

7,7 % nicht bestimmt

nicht bestimmt

7,7%

60 % 60 % 60 % 40 % Ende der Detektion

nach 45 min: 90 % eliminiert

60 min 8 h 48 h 2 h

Erstautor(en) RÖMMELT et al., 1974 KLEIN-SCHMIDT et al., 1985

SANG-STER et

al., 1987

CALDWELL und SUTTON, 1988

LEVIN et al., 1992

1unmetabolisiert

1 Einleitung 26

1.4 Methoden und Analytik

Für die Analytik flüchtiger, terpenoider Verbindungen bzw. deren Metabolite in

biologischen Matrices sind entsprechend sensitive und selektive Detektions-

methoden unabdingbare Voraussetzung. Auf Grund ihrer Flüchtigkeit sind die

Ätherisch-Öl-Komponenten für die GC-Analytik geeignet. In Kombination mit

entsprechender Detektion stellt die GC ein sehr sensitives Verfahren dar, mit dem im

unteren ng⋅mL-1 Bereich gearbeitet werden kann.

Die Bestimmung von Ätherisch-Öl-Komponenten in Plasma bzw. Blut, Urin oder in

der Atemluft wurde in den meisten der vorliegenden Arbeiten per GC in Kombination

mit der sehr sensitiven Flammenionisationsdetektion (RÖMMELT et al., 1974;

RÖMMELT et al., 1978; KLEINSCHMIDT et al., 1985; RÖMMELT et al., 1988; FALK und

HAGBERG, 1990; ZIMMERMANN et al., 1995; JAGER et al., 1996) bzw. Detektion per MS

(SCHUSTER et al., 1986) durchgeführt. Dabei wurden je nach Extraktionsverfahren

Nachweisgrenzen von 0,1 ng⋅mL-1 (RÖMMELT et al., 1988) bis 10 ng⋅mL-1 (FALK und

HAGBERG., 1990) erzielt. Die Bestimmung von Phase-I-Metaboliten radioaktiv

markierter Ätherischer-ÖL-Komponenten, die durch die Metabolisierung ihre

Flüchtigkeit verloren haben, wurde häufig per HPLC in Kombination mit

Flüssigszintillationsdetektion vorgenommen (SANGSTER et al., 1984b; SUTTON et al.,

1985; DILIBERTO et al., 1988). Die Verwendung radioaktiv markierter Verbindungen

bot zwar den Vorteil hoher Empfindlichkeit, jedoch lieferte sie keine Informationen zur

Identität der Verbindungen.

Weitere Angaben zur Validierung der jeweils verwendeten analytischen Methode

(Richtigkeit, Präzision) fanden sich nur bei Kleinschmidt et al. (1985) und

Zimmermann et al. (1995) (KLEINSCHMIDT et al., 1985; ZIMMERMANN et al., 1995).

Angaben zur Selektivität fehlten jedoch bei den meisten der oben aufgeführten

Studien.

Als selektivstes und gleichzeitig äußerst sensitives Detektionssytem gilt heute GC-

MS oder GC-MS/MS in Verbindung mit SIM- oder SRM-Experimenten. Diese

Techniken standen jedoch für die o.g. Arbeiten z.T. noch nicht zur Verfügung und

sind heute auf Grund ihrer Kostenintensität nicht für die Routineanalytik einsetzbar.

1 Einleitung 27

In den veröffentlichten Arbeiten wurden bereits mehrere Methoden zur Extraktion

Ätherischer-Öl-Komponenten bzw. deren Phase-I-Metaboliten aus biologischen

Matrices beschrieben. Bei der konventionellen Probenaufarbeitung mittels Flüssig-

Flüssig- (BELL et al. 1981; KLEINSCHMIDT et al., 1985; KAFFENBERGER et al., 1990;

ZIMMERMANN et al., 1995) und Festphasenextraktion (LEVIN et al., 1992) bzw. beim

Einengen der Proben durch Verdampfen könnte ein undefinierbarer Anteil der

flüchtigen Analyten verloren gehen. Gerade bei erwartungsgemäß geringen

Konzentrationen des Analyten waren Methoden ohne vorzeitige Verluste erforderlich.

Die Bestimmung im gewünschten Konzentrationsbereich konnte somit z.T. erst durch

zeit- und materialintensive Anreicherungsverfahren erreicht werden. Hierbei wurden

die Ätherisch-Öl-Komponenten auf Adsorbentien angereichert, um die Nachweis-

grenze abzusenken (RÖMMELT et al., 1974; KLEINSCHMIDT et al., 1985; SCHUSTER et

al., 1986; RÖMMELT et al., 1988). Idealerweise wurden die Verbindungen direkt aus

dem Gasraum über der Probe analysiert, wobei der Verlust flüchtiger Analyten

minimiert bzw. ausgeschlossen wurde (LEVIN et al., 1992).

Zur Bestimmung der Ätherisch-Öl-Komponenten in der Atemluft wurden die

Verbindungen an Adsorbentien gebunden (RÖMMELT et al., 1974; RÖMMELT et al.,

1988) oder direkt in der Atemluft bestimmt (FALK und HAGBERG, 1990). Mit der von

Falk und Hagberg entwickelten Methode konnte sowohl die Konzentration im Inhalat

als auch in der Ausatemluft mit Infrarotspektrometrie gemessen werden (FALK und

HAGBERG, 1990). Abgeatmetes radioaktiv markiertes CO2 wurde in alkalischen

Lösungen gefällt oder an Kohle gebunden, wodurch unter Umständen zu geringe

Gehalte erzielt worden sein könnten (CALDWELL und SUTTON, 1988; SANGSTER et al.,

1984b).

Da in den meisten Fällen keine näheren Angaben zur Validierung der verwendeten

Methoden gemacht wurden, könnten die in vergleichbaren Studien zum Teil

divergierenden Ergebnisse auf die Anwendung unterschiedlicher analytischer

Methoden zurückzuführen sein.

1 Einleitung 28

1.5 Zielsetzung

Die in den pharmakokinetischen Studien eingesetzten BronchipretTP Filmtabletten

sind indiziert zur Behandlung akuter Bronchitis. Die Wirkstoffe sollten also letztlich im

Respirationstrakt ihre Wirkung über die systemische Verfügbarkeit entfalten.

Zur Bioverfügbarkeit und Pharmakokinetik dieser Präparation nach oraler Applikation

am Menschen fehlten jedoch bislang verläßliche Untersuchungen an Hand

pharmakokinetischer Studien. Erst diese Untersuchungen zur systemischen

Verfügbarkeit lieferten Hinweise, ob die im Thymianextrakt enthaltenen Ätherisch-Öl-

Komponenten - insbesondere Thymol - auch für die klinische Wirksamkeit

(mit)verantwortlich sein könnten.

Die Ziele der vorliegenden Arbeit waren somit, die systemische Verfügbarkeit und

Pharmakokinetik sowie den Metabolismus von Thymol im Menschen zu

untersuchen.

Für diese Untersuchungen war zunächst die Erarbeitung einer Probenauf-arbeitungsmethode zur Bestimmung des Thymols in den biologischen Matrices

Plasma und Urin notwendig. Zur Quantifizierung mußte eine entsprechend selektive

und sensitive analytische Meßmethode entwickelt werden. Um einen hohen

Probendurchsatz zu erzielen, wurde die Methode automatisiert. Somit war es

möglich, die Methode internationalen Anforderungen entsprechend validieren zu

können.

Da zur routinemäßigen Bestimmung des Thymolgehaltes die Spaltung der Phase-II-

Konjugate erfolgen mußte, war eine separate Methode zur Identifizierung der Phase-II-Metabolite erforderlich.

2 Material und Methoden 29

2 Material und Methoden

2.1 Chemikalien

Thymol „GC“ Fluka, 89330

Thymol (1H-NMR, Lot 377452/1) Zentralinstitut Arzneimittel-

forschung GmbH, Sinzig

o-Cresol Merck, 809692

t-Anethol HWI Analytik, 2974

Uridin-5`-Diphosphoglucuronyl-Transferase, Sigma, U4502

Type III from bovine liver

β-Glucuronidase/Sulfatase, Type B-1 Sigma, G0251

β-Glucuronidase, Type HP2 from Helix pomatia Sigma, G7017

>7500 Units/mL Sulfatase Aktivität;

100000 Units/mL Glucuronidase Aktivität

Sulfatase, Type H1 from Helix pomatia Sigma, S9626

10 Units/mg Sulfatase Aktivität

300 Units/mg Glucuronidase Aktivität

Ethanol unvergällt Chemikalienausgabe

L(+)-Ascorbinsäure p.a. Merck, 127

Natriumacetat p.a., wasserfrei Merck, 106268

Methanol, LIChroSolv für die Chromatographie Merck, 106007

Natriumchlorid suprapur Merck, 106406

Natriumchlorid Merck, 106404

ortho-Phosphorsäure 85% Merck, 159382

Wasser deionisiert „Milli Q“ aus Millipore Anlage

Tris HCl Puffer Sigma, T 3253

Mercaptoethanol Merck, 115433

Eisessig 100% Merck, 100058

Magnesiumchlorid Grüssing, 12088

Aceton LiChroSolv Merck, 100020

NaOH Plätzchen Merck, 106482


Ammoniumacetat Merck, 159039

Heptan p.a. Merck, 104379

Acetonitril Merck, 100030

Ammoniumacetat Merck, 101116

Ethylacetat Riedel de Haen, 34858

Ameisensäure Riedel de Haen, 33015

Water LIChrosolv Merck, 115333

Natriumdihydrogenphosphat-Dihydrat Merck, 106345

Natriumhydrogenphosphat-Dodecahydrat Merck, 106579

2.2 Materialien und Geräte

für die Durchführung der Messungen während der Pilotstudien

pH-Meter Knick, Typ 646

Wasserbad Hartenstein, HWR

Ultraschallbad Bransonic, 221

Waagen Mettler AT200

Mettler P1600

Sartorius Micro MC 5

Zentrifugen Minifuge GL; Heraeus Christ

Du Pont Sorvall, RC-5B;

Laborzentrifuge Sigma, 2-15

Metallblockthermostat Liebisch, Typ 2099-DA

für die Durchführung der Messungen während der Hauptstudie

Ultraschallbad Branson 5210

Waagen Mettler AE163,

Mettler 6000

Laborheizblock Thermomix comfort Eppendorf

Zentrifuge Minifuge GL; Heraeus Christ

Schüttler Heidolph REAX 2000

Eppendorf Microdistiller Eppendorf, 5325 V1.20


GC-Apparatur für die Messungen während der Pilotstudien

Gaschromatograph Carlo Erba Strumentazione HRGC 5300

Mega Series

Gase Messer, Griesheim

Säule HP Innowax (Crosslinked Polyethylenglycol)

Innendurchmesser 0,2 mm x 50 m, Filmdicke

0,2 µm

Combi-PAL Autosampler CTC Analytics

Trägergas Helium

Flow 1 mL⋅min-1

Wasserstoff 30 ml⋅min-1

Luft 400 mL⋅min-1

Injektor Split/Splitless-Injektor, 220°C

Detektor Flammenionisationsdetektor, 250°C

Injektion manuell nach Festphasenmikroextraktion,

automatisiert durch Combi-PAL

Liner 0,75 mm I.D., Supelco

Septen Thermogreen LB-2-Septen, Supelco

GC-MS Kopplung für die Messungen während der Pilotstudien

Gaschromatograph GC 8000 CE Instruments

Detektor MD1000; Anregung 70 eV

Injektor Split-Splitless, 220°C



0,2 µm

Trägergas Helium

Flow 1,0 mL⋅min-1



GC Apparatur für die Messungen während der Hauptstudie (SPME, Wiederfindung,

Interkalibrierung)

Gaschromatograph Hewlett Packard 5890 Series II

Gase Linde, Nürnberg



0,2 µm

Combi-PAL Autosampler CTC Analytics

Single Magnet Mixer und Heater Chromtech

Trägergas Helium

Flow 1 mL⋅min-1


Luft 397 mL⋅min-1

Make up gas (Stickstoff) 32 mL⋅min-1

Injektor Split/Splitless-Injektor, Temperatur 220°C

Detektor Flammenionisationsdetektor, 250°C

Injektion manuell nach Festphasenmikroextraktion,

automatisiert durch CTC Combi-PAL

Autosampler



Liner Art.-Nr.: 5183-4647, Agilent

GC-MS-Kopplung für die Messungen während der Hauptstudie und Bestimmung des

freien Thymols im Urin, GC-FID Bestimmung des Thymolgehaltes im Prüfpräparat

Gaschromatograph Hewlett Packard HP 6890 Series

Gase Linde, Nürnberg

Trägergas Helium

Flow 1 mL⋅min-1


Luft 450 mL⋅min-1


Make up Gas (Stickstoff) 45 mL⋅min-1

Injektor Split/Splitless-Injektor, Temperatur 220°C

Detektor Flammenionisationsdetektor 250 °C

Detektor Hewlett Packard 5973 MSD; Anregung 70 eV

Injektion manuell nach Festphasenmikroextraktion



Liner Art.-Nr.: 5183-4647, Agilent

HPLC-UV/VIS Apparatur zur Überprüfung der Thymolglucuronid-Synthese

Pumpen Beckman Pumpenmodul 126, 116

Säulenofen Gynkotek Säulenthermostat, 20°C

Injektion Beckman Autosampler 502;

20 µL-Probenschleife

Steuerung Hochdruckseitige Gradientensteuerung

(Beckman Gold Software Supports Version

7.0)

Detektor Beckman Photodiodenarraydetektor 168

Trennsäule Knauer Eurospher 100 C18, 250x4 mm

Flow 1 mL⋅min-1

HPLC-UV/VIS Apparatur zur Interkalibrierung

Gerät HPLC 1100 von Hewlett Packard mit PDA

Trennsäule Knauer Eurospher 100 C18, 250x3 mm

Säulentemperatur 40°C

Flow 0,8 mL⋅min-1


HPLC-MS/MS Apparatur (durchgeführt von A+M, Labor für Analytik, Bergheim)

HPLC Pumpe 1100 Series Binary Pump, Agilent

Technologies

Autosampler 1100 Series Autosampler, Agilent

Technologies

UV-Detektor SPD-10A, Shimadzu

Degaser Dagasys DG-1210, uniflow,

Vorsäule Lichrospher RP 18 ADS (Merck) mit 6-port

switching valve

Fluß 0,3 mL⋅min-1, 0% Fließmittel B für 10 min,

Elution: backflush

Säule BDS-Hypersil RP18, 100x2,1 mm

Massenspektrometrie Massenspektrometer LCQ classic, ThermoQuest

Probenaufgabe HPLC (0,3 mL⋅min-1)

Post-column-split 1:3 (MS:Abfall); Abfall:

0-5 min

Ionisationsinterface Electrospray Ionisation (ESI)

Analysator Ion trap (LCQ Classic, ThermoQuest)

Ionisations-Modus negativ

Massenbereich 150-600amu

Kapillarspannung -4,0 V

Kapillartemp. 220°C

Spray Spannung 4,2 kV

Tube Lens 0 V


HPLC coulometrische Array Detektion zur Bestimmung freien Thymols im Plasma

Pumpen Merck Hitachi L6200A

Steuerung Hochdruckseitige Gradientensteuerung,

(Interface Modul D 6000)

Detektor ESA Inc. Elektrochemischer 12 Kanal

CoulArray Detektor

Degaser Merck Hitachi ERC 3114

Injektion Merck Hitachi, AS 2000A, 100 µL

Injektionsvolumen 100 µL

Säule Macherey-Nagel Nucleosil RP 18,

250x4,6 mm

Festphasenmikroextraktion

SPME-Fasern 100 µm Polydimethylsiloxan, Supelco

57300-U

85 µm Polyacrylat, Supelco 57304

65 µm Polydimethylsiloxan-Divinylbenzen,

Supelco 57311

Fiber Holder Supelco, 57330-U

Stirrer/Hot Plate Corning

SPME Sampling Stand/Vial Puck Supelco

SPME Stativ Supelco, 57357-U

Plasma

Aufbewahrung von Plasma- und Urinproben

9 mL S-Monovetten KE Sarstedt, 02.1066.001

Zentrifugenröhrchen, steril, 50 mL Nunc

Eppendorfcaps 1,5 mL Eppendorf


2.3 Studiendesign der Pilotstudien zur systemischen Verfügbarkeit und Pharmakokinetik von Thymol

Um eine Vorstellung davon zu bekommen, mit welchen Thymol-

Plasmakonzentrationen nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP zu rechnen

sein würde bzw. über welchen Zeitraum nach Applikation Thymol im Plasma

detektierbar sein würde, wurden zunächst 3 Pilotstudien durchgeführt. Die aus den

Pilotstudien resultierenden Ergebnisse waren notwendig, um die Hauptstudie

hinsichtlich des Messzeitraumes und der Messintervalle entsprechend planen zu

können.

Die erste Pilotstudie erfolgte mit 4 männlichen, gesunden Probanden. Nach

Applikation einer Tablette Bronchipret®TP wurden über 4 Stunden Blutproben zu

folgenden Zeitpunkten genommen: t= 0´, 10´, 20´, 30´, 40´, 50´, 60´, 70´, 80´, 90´,

100´, 120´, 130´, 2,5 h, 3 h, 3,5 h.

In der zweiten Pilotstudie wurden Messungen im Steady State vorgenommen, d.h. 2

männliche, gesunde Probanden nahmen 1 Woche lang 3 mal täglich eine Tablette

BronchipretTP ein. Nach Einnahme einer weiteren Tablette wurden wiederum, wie

oben aufgeführt, Blutproben gewonnen.

In der dritten Pilotstudie wurde die Verweildauer des Thymols im Plasma nach

Einnahme einer Tablette BronchipretTP untersucht. Es wurden solange

Plasmaproben genommen, bis kaum noch Thymol im Plasma detektierbar war.

Für die oben aufgeführten Pilotstudien gelten die unter Absatz 2.5.1 bis 2.5.6

aufgeführten Bedingungen mit Abweichungen bezüglich der Blutentnahmezeitpunkte.

2.4 Entwicklung und Validierung der analytischen Methoden zur Plasmaanalytik der Pilotstudien

Zur Bestimmung der systemischen Verfügbarkeit und Pharmakokinetik von Thymol

war die Entwicklung einer sehr sensitiven Methode notwendig, die die Detektion von

Thymol in humanem Plasma im unteren ng⋅mL-1 Bereich ermöglichte. Aus der

Literatur war bekannt, daß Thymol sowohl im menschlichen Urin als auch im Urin

von Kaninchen zu einem Großteil nicht in freier Form, sondern in Form seiner Phase-


II-Konjugate vorlag (TAKADA et al., 1979; AUSTGULEN et al., 1987). Um Thymol aber

für die sehr sensitive Detektion per Flammenionisation zugänglich zu machen, war

die enzymatische Spaltung notwendig, die Thymol aus seinen Phase-II-Konjugaten

freisetzte, um es somit in der Gasphase detektieren zu können.

Nach enzymatischer Spaltung des Phase-II-Konjugates Thymolsulfat (siehe Absatz

3.1) und anschließender Festphasenmikroextraktion erfolgte die gaschromato-

graphische Trennung mit nachfolgender Flammenionisationsdetektion.

Thymol gehört in die Stoffklasse aromatischer Monoterpene und liegt in reiner Form

im Gegensatz zu den meisten Ätherisch-Öl-Komponenten in fester Form vor. Der

Siedepunkt liegt bei 233,4°C. Bedingt durch die für Ätherisch-Öl-Komponenten eher

ungewöhnliche Phenolpartialstruktur weist Thymol zwar auch lipophile Eigenschaften

auf, löst sich aber im Verhältnis 1:1100 in Wasser (HUNNIUS, 1986).

Die Flüchtigkeit des Thymols gab zwar die Möglichkeit zur gaschromatographischen

Bestimmung, jedoch waren dadurch die Möglichkeiten der Probenaufarbeitung

eingeschränkt (siehe Absatz 1.4). In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb die

Headspace-Festphasenmikroextraktion (headspace solid-phase microextraction; HS-

SPME) zur Probenaufarbeitung gewählt. Sie ermöglichte Extraktion, Anreicherung

und Probenaufgabe in einem einzigen Arbeitsschritt und es konnte dadurch auf den

Einsatz oftmals teurer, giftiger oder carcinogener Lösungsmittel verzichtet werden.

Die HS-SPME ist ein noch wenig etabliertes, schnelles und einfaches Verfahren zur

Aufarbeitung vorwiegend wässeriger Proben, die flüchtige Verbindungen enthalten.

Mit Hilfe beschichteter Quarzfasern werden Analyten aus der Gasphase über der

Probenmatrix extrahiert (PAWLISZYN, 1997). Im Gegensatz zu anderen

konventionellen Extraktionsmethoden basiert die SPME nicht auf einer

erschöpfenden Extraktion der Probe, sondern auf einer Gleichgewichtseinstellung

des Analyten in der Probe, der Gasphase über der Probe und der Faserbeschichtung

(Abb. 2.1). Da die Gesamtmenge des Analyten während der Extraktion konstant

bleibt, gilt folgende Beziehung:


C0*V2 = C1∞*V1 + C2

∞*V2 + C3∞*V3

Dabei gilt:

C0 : Anfangskonzentration des Analyten in der Probe

C1∞: Gleichgewichtskonzentration des Analyten in der Faser

C2∞: Gleichgewichtskonzentration des Analyten in der Probe

C3∞: Gleichgewichtskonzentration des Analyten in der Gasphase

V1, V2 und V3: Volumen der Faserbeschichtung, der Probe und der Gasphase

(ZHANG und PAWLISZYN, 1993).

Demnach war eine konstante Gleichgewichtslage des gesamten Systems Vor-

bedingung für eine reproduzierbar durchzuführende Analytik. Diese Aspekte mußten

bei der Methodenerstellung sorgfältig berücksichtigt werden, um eine gute

Methodenleistung bei möglichst kurzen Analysenzeiten zu erhalten. Die Zeitspannen

bis zum Erreichen der stabilen Gleichgewichtslage waren dabei von dem jeweils

gewählten Fasermaterial, den chemisch-physikalischen Eigenschaften des Analyten,

sowie von der Probenmatrix- und temperatur abhängig.

Die beschichtete Faser wurde dem Gasraum über der Probe solange ausgesetzt, bis

sich das Gleichgewicht eingestellt hatte. Danach wurde die Faser in den

Injektorblock des Gaschromatographen eingebracht und die Analyten thermisch

desorbiert.


PlasmaRührfisch

FaserProbengefäß

NadelNadelführung

Septum

Heizung

Abb. 2.1 Schematische Darstellung der Headspace-Festphasenmikroextraktions-methode.

Gerade in letzter Zeit wurde die SPME bzw. HS-SPME neben der Anwendung im

Bereich der Umweltanalytik, Nahrungsmittelanalytik und Biologie (ALPENDURADA,

2000) zunehmend zur Analytik von Arznei- und Suchtstoffen aus biologischen

Matrices, wie beispielsweise Plasma, Urin und Speichel sowie zur Haaranalytik

eingesetzt (KROGH et al., 1995; ISHII et al., 1996; KUMAZAWA et al., 1996; ULRICH und

MARTENS, 1997; HALL et al., 1998; KROLL und BORCHERT, 1998; LEE et al., 1999;

ULRICH et al., 1999; NAMERA et al., 2000; THEODORIDIS et al., 2000; MILLS und

WALKER, 2001).

Für die Bestimmung von Phenolen, wie beispielsweise Thymol, wirkten sich Erhitzen,

niedriger pH-Wert und der Zusatz von Salz positiv auf die Geschwindigkeit der

Gleichgewichtseinstellung aus, da dadurch die Löslichkeit des Thymols in der Matrix

herabgesetzt und der Analyt somit in die Gasphase gezwungen wurde (BUCHHOLZ

und PAWLISZYN, 1993; BUCHHOLZ und PAWLISZYN, 1994). Rühren bewirkte eine

gleichmäßige Durchmischung der Probe und beeinflußte ebenfalls die


Gleichgewichtseinstellung positiv, so daß die Analysenzeiten verkürzt werden

konnten.

2.4.1 Methodenentwicklung der Pilotstudien

Behandlung der Blutproben

Das den Probanden mit Hilfe von S-Monovetten abgenommene Blut wurde 10 min

bei ca. 3900 g zentrifugiert, das Plasma in Eppendorf-Caps zu 500 µL aliquotiert und

zur Stabilisierung mit jeweils 20 µL Essigsäure 0,58 M versetzt. Danach wurden die

Proben tiefgefroren bei –20°C aufbewahrt.

Konditionierung der PDMS-Fasern

Für die Untersuchungen im Rahmen der Pilotstudien wurde zunächst die 100 µm

Polydimethylsiloxan-Faser (PDMS) verwendet. Vor der Verwendung der SPME-

Fasern mußten diese gereinigt werden, um zu gewährleisten, daß sich vor Beginn

der Verwendung keine Kleberbestandteile oder andere unerwünschte Substanzen

auf der Faser befanden. Dazu wurden die PDMS-Fasern 60 min bei 250°C im

Injektor bei geöffnetem Splitventil konditioniert. Diese Vorgehensweise erwies sich

bei allen getesteten Fasern verschiedener Chargen als ausreichende

Konditionierung.

Probenaufarbeitung

Nach dem Auftauen der Plasmaproben wurden zu 520 µL Plasma nochmals 40 µL

Essigsäure 0,58 M gegeben. Somit wies das Plasma einen pH-Wert von 5 auf, was

dem pH-Optimum der β-Glucuronidase entsprach. 50 µL β-Glucuronidase (Sigma

G7017) wurden hinzupipettiert und das Plasma 30 min bei 37°C inkubiert. Weder die

Verwendung einer β-Glucuronidase anderer Herkunft, einer Sulfatase, der Zusatz

weiterer Enzymeinheiten noch eine Verlängerung der Inkubationszeit konnten die

Menge des freigesetzten Thymols erhöhen. Nach Durchführung des Enzymassays

wurden 50 µL Interne Standardlösung (o-Cresol 4 µg⋅mL-1, s.u.) hinzupipettiert und

die Probe in ein 4 mL SPME-Probengefäß überführt. Bei der Überführung wurden


keine Verluste beobachtet. Die SPME-Probengefäße wurden zuvor mit 0,5 g NaCl,

jeweils 50 µL Phosphorsäure 85 % sowie einem Rührfisch versehen. Nach dem

luftdichten Verschließen der SPME-Probengefäße wurden die Proben für 5

Sekunden auf den Vortex-Rührer homogen durchmischt.

Nach 10minütigem Inkubieren bei 80°C auf dem Wasserbad wurde die Probe auf

dem Rührer (750 rpm) für 20 min auf 68°C erhitzt und dabei die Faser dem Gasraum

ausgesetzt. Anschließend wurde die Faser in den Injektorblock überführt. Die Faser

blieb bei geschlossenem Splitventil für 5 min im Injektor. Um Carryover-Effekte auf

der Faser zu vermeiden, wurde diese nach der Desorption für 2 min im Injektorblock

bei geöffnetem Splitventil gereinigt.

Analytische Säule

Zur chromatographischen Trennung der interessierenden Analyten neben

zahlreichen anderen flüchtigen Plasmabestandteilen wurde eine Kapillartrennsäule

verwendet. Die für Ätherisch-Öl-Komponenten und Phenole geeignete, 50 m lange

HP Innowax Säule (0,2 mm I.D., 0,2 µm Filmdicke; quervernetztes Polyethylenglykol)

bot eine ausreichende Trennleistung.

Interner Standard

Um den interessierenden Analyten aus einer komplexen biologischen Matrix mit

entsprechender Reproduzierbarkeit und Präzision quantifizieren zu können, war der

Zusatz eines Internen Standards notwendig. Ein idealer Interner Standard zeichnet

sich durch Ähnlichkeit zum Analyten bezüglich chemischer und physikalischer

Eigenschaften aus. Deshalb greift man bei der Suche nach einem geeigneten

Internen Standard auf strukturell ähnliche Substanzen mit ausreichender chemischer

Stabilität zurück. Für die Quantifizierung von Thymol erwies sich o-Cresol als

geeignet. Der Gleichgewichtszustand des o-Cresols war bei allen Methoden

innerhalb der Expositionszeit erreicht. Dies ist die Grundvoraussetzung für die

Verwendung einer Substanz als Internen Standard in der SPME.


Standardlösungen

Zur Herstellung der Standardlösungen des Analyten als auch des Internen Standards

wurden die Substanzen jeweils in Methanol (2 % des späteren Endvolumens)

vorgelöst und dann mit Wasser auf das Endvolumen aufgefüllt. Durch die

Verdünnung mit Wasser wurde gewährleistet, daß die so entstandene Matrix im

wesentlichen dem Plasma ähnlich blieb und damit eine Beeinflussung des

Gleichgewichtes minimiert wurde. Die Lösungen wurden bei Nichtgebrauch im

Kühlschrank bei 2-8°C aufbewahrt.

Temperaturprogramm

Optimale Trennbedingungen zeigten sich bei folgendem Temperaturprogramm: die

Starttemperatur von 80°C wurde für 5 min gehalten, danach wurde mit 4°C pro min

auf 220°C aufgeheizt und diese Temperatur für 10 min konstant gehalten. Danach

kühlte das System wieder auf 80°C ab. Unter diesen Bedingungen eluierte o-Cresol

nach ca. 35 min und Thymol nach ca. 40 min. Eine wesentliche Verkürzung des

Temperaturprogrammes durch steileres Aufheizen konnte keine ausreichende

Trennung der Peaks von Plasmapeaks mehr gewährleisten.

2.4.2 Validierung der Methode für die Pilotstudien

Auf Grund der Tatsache, daß die Probenaufgabe während des Vermessens der

Proben der Pilotstudien manuell erfolgen mußte, konnte eine Validierung in dem

nach dem Entwurf der FDA Guideline zur Validierung bioanalytischer Methoden

(BIOANALYTICAL METHODS VALIDATION, 1998) gefordertem Umfang, wie sie später bei

der automatisierten Probenaufgabe vorgenommen wurde, nicht durchgeführt werden.

Es wurden die im folgenden aufgeführten Parameter überprüft.


Spezifität

Die Spezifität der Methode wurde anhand von 3 Plasmaproben unterschiedlicher

Probanden, jeweils im 0-Wert und mit Thymol versetzt, belegt. Mit der unter 2.4.1

beschriebenen Methode konnten weder für den Internen Standard noch für Thymol

störende Interferenzen detektiert werden.

Einstellung des Gleichgewichtszustandes

Der erste Schritt der Methodenvalidierung war die Ermittlung des Peakflächen-

Zeitprofils, also die Bestimmung des Zeitpunktes, zu dem sich das Gleichgewicht

zwischen Probe, Gasraum und der Faserbeschichtung eingestellt hatte. Das

Peakflächen-Zeitprofil für Thymol bei einer Temperatur von 68°C ist in Abb. 2.2

dargestellt. Als Expositionszeit wurden 20 min gewählt.

02000400060008000

1000012000140001600018000

0 10 20 30 40 50 60 70

Zeit [min]

Peak

fläch

e

Abb. 2.2 Peakflächen-Zeitprofil für Thymol bei 68°C, MW aus Doppelbestimmung.

Kalibrierfunktion: Linearität und Bestimmungsgrenze

Die Linearität wurde anhand von 7 Konzentrationen im Bereich von 14,6 bis

470 ng⋅mL-1 gezeigt. Es wurde anhand von mit Thymol versetzten Plasmaproben

jeweils eine 6fach Bestimmung jeder Konzentration durchgeführt. Aus den

Peakflächenverhältnissen Analyt zu Internem Standard wurde mittels linearer


Regression eine Kalibriergerade erstellt. Die Parameter der Kalibrierfunktion sind in

Tab. 2.1 aufgeführt.

Tab. 2.1 Kalibrierfunktion für Thymol im Plasma. Konzentrationen: 14,6; 24,0; 48,0; 52,4; 69,2; 99,0; 192,0; 570,0 ng⋅mL-1

Steigung Achsenabschnitt R2

0,00584 -0,00674 0,9896

Die Bestimmungsgrenze einer Methode ist diejenige Konzentration, die noch mit

akzeptabler Präzision und Richtigkeit bestimmt werden kann (SHAH et al., 1992). Für

Thymol lag die Bestimmungsgrenze (LOQ) mit der unter Absatz 2.4.1 beschriebenen

Methode bei 14 ng⋅mL-1. Detektierbar (Signal-Rausch-Verhältnis 3:1) waren ca.

5 ng⋅mL-1. Dies entsprach der Nachweisgrenze der Methode.

Wiederholpräzision und Richtigkeit

Die Daten zu Präzision und Richtigkeit wurden mit den Werten aus der

Kalibrierfunktion gewonnen. Die Präzision der Methode wurde durch den

Variationskoeffizienten (CV(%)) angegeben. Die Richtigkeit wurde durch den

relativen Fehler (RE), also der prozentualen Abweichung des Mittelwertes vom

Sollwert beschrieben (SHAH et al., 1992).

Tab. 2.2 Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Thymol in humanem Plasma. Variationskoeffizient und Relativer Fehler wurden jeweils aus den Meßpunkten einer Konzentration bestimmt.

Konzentration „soll“ [ng⋅mL-1]

Konzentration „ist“, Mittelwert [ng⋅mL-1]

Variationskoeffizient [%]

Relativer Fehler [%]

n

14,6 14,79 17,52 1,33 5 24 35,50 28,98 47,90 6 48 52,19 22,40 8,74 5

52,4 62,13 12,03 18,56 6 69,2 72,59 23,36 4,90 6 99 109,64 6,92 10,75 6 192 147,20 7,16 -23,33 5 570 581,90 12,06 2,09 5


Die in Tab. 2.2 gezeigten Daten zu Präzision und Richtigkeit machten deutlich, daß

diese nur z.T. den geforderten Kriterien (CV und RE am LOQ ≤ 20 %, bei höheren

Konzentrationen ≤ 15 %; siehe auch Absatz 2.8.1.6) entsprachen. Damit war die

manuelle HS-SPME Methode für die Durchführung der Hauptstudie insuffizient. Dies

dürfte hauptsächlich auf den manuellen Betrieb der HS-SPME Methode

zurückzuführen gewesen sein, wodurch die Expositionszeit, Temperatur, Rühr-

geschwindigkeit und Eintauchtiefe der Faser ins Probengefäß nicht exakt genug

eingehalten werden konnten. Dies wurde beim Vergleich mit den Validierungs-

parametern, die mit der automatisierten Methode erhalten wurden, um so deutlicher

(siehe Absatz 2.8.1). Die Automatisierung der Methode war also alleine im Hinblick

auf die Einhaltung der Validierunsparameter unerläßlich.

2.4.3 Strukturabsicherung von Thymol im Plasma nach enzymatischer Spaltung mittels GC-MS

Um sicher zu gehen, daß es sich bei dem per GC-FID detektierten Peak auch

tatsächlich um Thymol handelte, wurde die Struktur per GC-MS abgesichert. Der

Flammenionisationsdetektor (FID), der zur Quantifizierung von Ätherischen-Öl-

Komponenten eingesetzt wird, weist eine sehr hohe Empfindlichkeit auf und zeichnet

sich durch Linearität über einen großen Bereich aus. Er ist aber insofern sehr

unselektiv, als er alle kohlenwasserstoffhaltigen Verbindungen verbrennt und damit

detektiert. Man hat zwar die Möglichkeit, die Identität einer Verbindung über

Vergleich der Retentionszeiten mit Referenzsubstanzen abzuklären, aber mit der

massenspektrometrischen Analyse steht ein wesentlich selektiveres Instrument zur

Verfügung.

Die Strukturabsicherung des Thymols nach enzymatischer Spaltung im Plasma

erfolgte im Rahmen der Pilotstudien jeweils durch den Vergleich der Massenspektren

von mit Thymol versetzten Plasmaproben und Proben, die nach Applikation einer

BronchipretTP Tablette gewonnen wurden. Die Massenspektren von Thymol

wurden wie unter Absatz 2.4.1 beschrieben, jeweils nach manueller

Festphasenmikroextraktion und gaschromatographischer Trennung aufgenommen.

Die Ionisierung wurde mit Elektronenstoßionisation (EI, 70 eV) durchgeführt, die

Spektren wurden im Totalionenstrom aufgenommen. In den Massenspektren von


Thymol waren als charakteristische Massenpeaks m/z 150, 135, 115 und 91

detektierbar.

2.5 Studiendesign der Hauptstudie zur systemischen Verfügbarkeit und Pharmakokinetik von Thymol

Die klinischen Prüfungen der Pilotstudien sowie der Hauptstudie wurden an der

Medizinischen Klinik I mit Poliklinik der Friedrich-Alexander–Universität Erlangen-

Nürnberg, Abteilung für Naturheilverfahren und Komplementärmedizin, unter der

Leitung von Prof. Dr. med. G. Hahn durchgeführt. Als Prüfärzte waren

Dr. med. Benno Brinkhaus und Dr. med Gernot Schindler an den Studien beteiligt.

Die Studie wurde bei der Ethikkomission der Universität Erlangen-Nürnberg

eingereicht und positiv beurteilt (Nr. 2142; akzeptiert am 02.02.2000). Die Probanden

wurden über Nutzen und Risiken der Studie informiert. Zu Beginn der

Voruntersuchung erklärte jeder der Probanden schriftlich sein Einverständnis zur

Teilnahme und den damit verknüpften Bedingungen der Studie. Die Durchführung

der Untersuchungen erfolgte in Anlehnung an GCP (Good Clinical Practice).

2.5.1 Probanden

Die Hauptstudie wurde mit 12 männlichen, gesunden Probanden im Alter zwischen

25 und 48 Jahren durchgeführt. Das Gewicht der Probanden variierte zwischen 72 kg

und 92 kg, die Körpergröße zwischen 178 cm und 192 cm. Weitere demographische

Daten finden sich im Anhang in Tab. 8.1.

2.5.2 Ein- und Ausschlußkriterien

Einschlußkriterien

• Alter: 20 bis 50 Jahre

• Männliches Geschlecht

• Klinische Untersuchung ohne relevante path. Befunde:


Kopf/Hals, Schilddrüse, Lunge, Herz, Abdomen, Nieren, Wirbelsäule, Haut

• Laboruntersuchungen ohne relevante path. Befunde:

Hämoglobin, Erythrozyten, Leukozyten, Thrombozyten, Hämatokrit, MCV,

Blutzucker, Natrium, Kalium, Calcium, Chlorid, Kreatinin, Harnstoff, GOT, GPT,

Gamma-GT, AP, Cholinesterase, LDH, CK, Alpha-Amylase, Bilirubin,

Gesamteiweiß, Albumin, Harnsäure, Triglyceride und Gesamtcholesterin, CRP,

Quickwert, PTT, TSH, U-Stix

• Körpergewicht im Bereich von (Körpergröße (cm)-100) [kg] ± 15 %

• Durchführungsbedingungen beachtet

• Einverständniserklärung

Ausschlußkriterien

• Atemwegs- und Lungenerkrankungen

• Magen- und Darmerkrankungen

• Gallenwegs- und Lebererkrankungen

• Nierenerkrankungen

• Kardiale Erkrankungen

• Stoffwechsel- und endokrinologische Erkrankungen

• Symptomat. allergische Erkrankungen (z.B. Allerg. Rhinitis)

• Infektionserkrankungen

• Tumorerkrankungen

• Psychiatrische Erkrankungen

• Suchterkrankungen einschl. Alkoholerkrankung

• Intelligenzminderung (F70- F73 nach ICD-10)

• Betreuung

• Sonstige schwere Erkrankungen

• Regelmäßiges Rauchen (mehr als 10 Zigaretten täglich)

• Teilnahme an einer anderen klinischen Studie innerhalb der

letzten 8 Wochen oder im Prüfungszeitraum

• Prüfungsstreß (z.B. Staatsexamen innerhalb von 4 Wochen)

• Andere schwerwiegende Ereignisse (sog. “life events”)

• Bekannte Überempfindlichkeit gegen Inhaltsstoffe des Prüfpräparats


2.5.3 Prüfpräparat

Präparat: BronchipretTP Filmtabletten

Chargennummer: 2143801

Zusammensetzung:

60 mg Primelwurzeltrockenextrakt (6,0-7,0:1), Auszugsmittel Ethanol 47 %(V/V),

160 mg Thymiantrockenextrakt (5,9-10,0:1), Auszugsmittel Ethanol 70 % (V/V).

Sonstige Bestandteile:

Dimeticon, Magnesiumstearat, Methylhydroxypropylcellulose, Pfefferminzaroma,

Poly(1-vinyl-2-pyrrolidon) ringöffnend vernetzt, lösliches Polyvinylpyrrolidon,

Poly(ethylacrylat-methylmethacrylat), Propylenglycol, Saccharin-Natrium 2 H2O,

Talkum, Farbstoffe: E101, E141, E171

Hersteller: Bionorica AG

Verfall: 01/2003

Gehalt an Thymol im Prüfpräparat: 1,08 mg (siehe Absatz 2.6)

2.5.4 Dosierung

Wie es die therapeutische Einmaldosierung vorsah, wurde eine BronchipretTP

Tablette morgens eingenommen. Um zu gewährleisten, daß keine anderen

Ätherisch-Öl-Komponenten die Analytik beeinträchtigten, verzichteten die Probanden

für die Zeit der Studiendauer auf den Verzehr bzw. die Verwendung aller Ätherisch-

Öl-haltigen Produkte, wie z.B. Kaugummis, Zahnpasten, Rasierwasser, Badezusätze

und Gewürze, insbesondere aus der Familie der Lamiaceae. Um den Einfluß auf die

Resorption durch Nahrungsmittel zu standardisieren, waren die Probanden bei

Einnahme der Tablette nüchtern. Die Tabletten wurden jeweils mit 250 mL Wasser

eingenommen.


2.5.5 Studienablauf

Die Probanden erschienen am jeweiligen Studientag morgens nüchtern in der Klinik.

Medikamenteneinnahme innerhalb der letzten Woche, extreme sportliche Betätigung

(ab 3 Tage vor Studienbeginn), größere Mengen Alkohol in den letzten 3 Tagen vor

Studienbeginn, Rauchen (an den Studientagen), xanthinhaltige Nahrungsmittel (z.B.

Kaffee, Tee, Schokolade), Ätherische Öle (z.B. Hustenbonbon, Zahnpaste,

24 Stunden vor Studienbeginn) waren untersagt. Die Probanden brachten am

1. Studientag ihren Morgenurin in den bei der Voruntersuchung ausgehändigten

Behältern mit.

Vor Beginn der Applikation der Studienmedikation wurde jeder Proband nach

unerwünschten Ereignissen gefragt, die gegebenenfalls zu Protokoll genommen

wurden. Für den Rest des jeweils ersten Studientages waren die Probanden in der

Klinik untergebracht und wurden dort auch mit Nahrungsmitteln versorgt. In den

beiden folgenden Studientagen gingen die Probanden ihrer alltäglichen

Beschäftigung nach und kamen lediglich zur Blutabnahme und zur Abgabe des in

Fraktionen gesammelten Urins in die Klinik. Bei jeder Blutabnahme wurden die

Probanden zu unerwünschten Ereignissen sowie zu der von ihnen aufgenommen

Nahrung befragt.

Blutentnahmen

Die Blutproben von jeweils 9 mL wurden mit Hilfe eines Abbocath zum Zeitpunkt t=0;

0,25; 0,5; 0,75; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 14; 24; 31; 38; 48; 55;

62 und 72 Stunden nach Applikation der Studienmedikation in S-Monovetten®

abgenommen. Somit wurden den Probanden innerhalb von 26 Blutentnahmen

insgesamt jeweils 234 mL Blut abgenommen.

Urinsammlung

Die Gefäße zur Urinsammlung wurden vor Beginn eines jeden Sammelintervalls

gereinigt und zur Stabilisierung mit 800 mg Ascorbinsäure versehen. Zur Gewinnung

der Urinproben wurde der Urin vor Applikation, sowie in den Zeitintervallen 0 bis 3,


3 bis 6, 6 bis 9, 9 bis 14, 14 bis 24, 24 bis 31, 38 bis 48, 48 bis 55, 55 bis 62 und 62

bis 72 Stunden gesammelt.

Nach Beendigung des Sammelintervalls wurde die Urinmenge notiert und jeweils zu

50 mL in sterilen Zentrifugenröhrchen aliquotiert. Die Proben wurden zunächst sofort

auf Trockeneis eingefroren und später bei –20°C gelagert.

Probenkodierung

Die in der Hauptstudie anfallenden Plasmaproben wurden wie folgt kodiert:

- Probandenbezeichnung: A bis L

- Blutentnahmezeitpunkte 1 = Nullwert; 2 = 0,25 h; 3= 0,5 h; 4 = 0,75 h; 5 = 1 h;

6 = 1,5 h; 7 =2 h; 8 = 2,5 h; 9 = 3 h; 10 = 3,5 h; 11 = 4 h; 12 = 5 h; 13 = 6h;

14 = 7 h; 15 = 8 h; 16 = 9 h; 17 = 10 h; 18 = 12 h; 19 = 14 h; 20 = 24 h;

21 = 31 h; 22 = 38 h; 23 = 48 h; 24 = 55 h; 25 = 62 h; 26 = 72h.

Bei den Urinproben folgte auf Probandenbezeichnung das Zeitintervall, numeriert in

der Reihenfolge der Sammelperioden (0h = 1, 0 bis 3 h = 2, 3 bis 6 h = 3, 6 bis 9 h =

4, 9 bis 14 h = 5, 14 bis 24 h = 6, 24 bis 31 h = 7, 38 bis 48 h = 8, 48 bis 55 h = 9, 55

bis 62 h = 10 und 62 bis 72 h = 11).

2.5.6 Unerwünschte Ereignisse

Unter unerwünschten Ereignissen versteht man alle im Verlauf einer klinischen

Prüfung beobachteten Befindlichkeitsstörungen, subjektiven und objektiven

Krankheitssymptome, Krankheiten und Unfälle, unabhängig von möglichen

ursächlichen Zusammenhängen mit der verabreichten Studienmedikation.

Im Rahmen dieser Studie traten bei 2 Probanden unerwünschte Ereignisse auf. Die

Probanden klagten bereits zu Beginn der Studie über geringe Kopfschmerzen, die

sich aber im Verlauf des 2. Studientages besserten. Die Studie wurde von allen

Probanden bis zum Ende durchgeführt, und es traten keine schwerwiegenden

unerwünschten Ereignisse auf.


2.6 Prüfpräparat der Hauptstudie

Für die Berechnung pharmakokinetischer Kenndaten mußte die verabreichte Dosis

genau bekannt sein. Die Bestimmung des Thymolgehaltes im Prüfpräparat wurde

mittels Mikrodestillation und anschließender gaschromatographischer Bestimmung

vorgenommen. Die hierzu verwendete Methode wurde nach den folgenden ICH

Guidelines CPMP/ICH/381/95 und CPMP/ICH/281/95 validiert. Die Daten zur

Validierung liegen bei der Firma Bionorica AG vor (Prüfvorschrift Nr. FE03805,

Version 1.1).

2.6.1 Extraktion von Thymol aus BronchipretTP Filmtabletten

Ca. 0,4 g gepulverte Probe (genau gewogen) wurden in ein 20 ml Probengefäß

eingewogen, mit 10,0 mL destilliertem Wasser und mit einer Universal-Glasfritte für

kontrollierte Destillation versetzt und mit dem zugehörigen Septum verschlossen. In

den Auffangkolben wurden 0,5 g NaCl eingewogen, mit 4,0 mL t-Anethol Interner

Standardlösung und Siliconentschäumer versetzt und mit dem Schraubverschluß

inklusive geschlitztem Septum verschlossen.

Die beiden Gefäße wurden mit der Universal-Destillationskapillare miteinander

verbunden, in den Eppendorf Microdistiller eingesetzt und das Programm (mit

20°C⋅min-1 wurde auf 110°C aufgeheizt, diese Temperatur für 10 min gehalten,

danach wiederum mit 20°C⋅min-1 auf 112°C aufgeheizt, diese Temperatur für 65 min

gehalten und anschließend mit 2°C min-1 auf 20°C abgekühlt) gestartet. Nach Ablauf

der Prozeßzeit wurden die Phasen kräftig geschüttelt. Die Heptanphase diente nach

erfolgter Phasentrennung als Untersuchungslösung.

2.6.2 Trennung und Detektion

Für die gaschromatographische Trennung und Detektion per FID von Thymol aus

BronchipretTP Filmtabletten wurde folgende GC-Methode herangezogen: Nach der

Aufgabe von 1,0 µL Untersuchungslösung (Split 90:1) wurde ausgehend von 80°C

mit 20°C⋅min-1 auf 220°C aufgeheizt und diese Temperatur für 12 min konstant

gehalten.


2.6.3 Kalibrierung und Quantifizierung

Die verwendete Kalibrierfunktion zur Quantifizierung des Thymolgehaltes des

Prüfpräparates ist in Tab. 2.3 dargestellt. Der Thymolgehalt von 1,08 mg pro Tablette

wurde an Hand des Durchschnittsgewichtes einer Tablette (427,90 mg = MW aus 10

Tabletten) und einer Doppelbestimmung (2 Tabletten) vorgenommen.

Tab. 2.3 Kalibrierfunktion für Thymol, als Interner Standard wurde t-Anethol verwendet.


1,024336 0,010605 1,00000


2.7 Analytik der Plasma- und Urinproben vor enzymatischer Hydrolyse

2.7.1 Detektion von Thymolsulfat und Thymolglucuronid in Plasma und Urin mittels LC-MS/MS

Die unter Absatz 2.7.1 aufgeführten Arbeiten wurden von A&M, Labor für Analytik

und Metabolismusforschung Service GmbH, Kopernikusstraße 25, 50126 Bergheim

durchgeführt.

Die Identifizierung der nicht flüchtigen Phase-II-Metabolite Thymolglucuronid und

Thymolsulfat wurde mit der sehr empfindlichen und äußerst selektiven Tandem-

Massenspektrometrie nach Trennung per HPLC vorgenommen. Mit diesem

Verfahren bietet sich die Möglichkeit, durch eine zweite Ionisierung Tochterspektren

zu erhalten, die charakteristisch für die jeweilige Verbindung sind. Somit kann die

Identität einer Verbindung exakt abgeklärt werden, ohne daß notwendigerweise

Referenzsubstanzen zur Verfügung stehen.

2.7.1.1 Probenaufarbeitung

Plasma

Zu 550 µL Plasma wurde 550 µL Acetonitril pipettiert, für ca. 20 Sekunden stark

geschüttelt und anschließend für 4 min bei 7825 g zentrifugiert. Bei 40°C wurde das

Lösungsmittel unter Stickstoff eingeengt. Der Rückstand wurde in 5 µL Acetonitril

und 45 µL 2 mM NH4OAc mit Hilfe eines Ultraschallbades aufgenommen. Nach

Zentrifugieren für 4 min bei 7825 g wurde der Überstand (20 µL) zur HPLC-Analyse

verwendet.

Urin

Direkteinspritzung (nach Einnahme von 10 Tabletten):

1,4 mL Urin wurden bei 7825 g für 4 min zentrifugiert und der Überstand zur HPLC

Analytik verwendet (100 µL).


Ethylacetatextraktion (nach Einnahme einer Tablette):

4 mL Urin wurden mit 8 µL Ameisensäure versetzt. Nach Zusatz von 14 mL

Ethylacetat wurde die Lösung für 2 min stark geschüttelt. Um die organische Phase

abzutrennen, wurde die Lösung für 3 min bei 7825 g zentrifugiert und der Überstand

wurde bei 40°C unter Stickstoff eingeengt. Der Rückstand wurde in 12 µL Acetonitril

und 108 µL 2 mM NH4OAc mit Hilfe eines Ultraschallbades gelöst. 20 µL davon

wurden zur HPLC-Analyse verwendet. Von den Referenzlösungen wurden jeweils 5 -

30 µL zur Analyse verwendet.

2.7.1.2 Trennung und Detektion

Für die Trennung und Detektion der Phase-II-Metabolite wurde folgender Gradient

verwendet: Zeit [h] % Fließmittel B

0 0

2 0

2,01 10

15 42

15,01 50

25 80

25,01 0

Fließmittel A: 2 mM NH4OAc, MeCN 95+5 (V+V)

Fließmittel B: MeCN+1mM NH4OAc+H2O, 95+4,8+0,2 (V+V+V)

Die Detektion in der UV-Spur erfolgte bei 212 nm.

Die Detektion erfolgte per LC-ESI-MS zunächst mit den entsprechenden

Ionenspuren und anschließend an Hand der MS/MS-Spektren der betreffenden

Signale (siehe auch Absatz 3.1 sowie Abb. 8.6, Abb. 8.7, Abb. 8.8 und Abb. 8.9). Die

Quantifizierung von Thymolsulfat im Plasma bzw. von Thymolsulfat und

Thymolglucuronid im Urin erfolgte im SIM Modus.


2.7.2 Detektion von freiem Thymol im Plasma


400 µL Plasma (pH 5) wurden mit 50 µL Interner Standardlösung o-Cresol

(4 µg⋅mL-1), 50 µL Wasser und 500 µL Methanol versetzt. Nach 10minütigem

Schütteln wurde bei 7825 g für 10 min zentrifugiert und der Überstand für die

Trennung per HPLC mit anschließender coulometrischer Arraydetektion verwendet.


Die aufgearbeiteten Plasmaproben wurden am Deutschen Institut für

Ernährungsforschung, Bergholz-Rehbrücke, analysiert.

Die chromatographischen Bedingungen zur Detektion vom Thymol in humanem

Plasma waren wie folgt:

Fließmittel A: 0,1 M Natrium-Dihydrogenphosphatlösung: Wasser im Volumen-

verhältnis 1:4 angesetzt, mit o-Phosphorsäure auf pH 3,4 eingestellt, steril filtriert.

Fließmittel B: 0,1 M Dihydrogenphosphatlösung mit o-Phosphorsäure auf pH 1,4

eingestellt, mit 4 Teilen Methanol aufgefüllt, steril filtriert.

Die Detektion von Thymol im Plasma erfolgte mit coulometrischer Arraydetektion bei

825 mV. Zur Trennung per HPLC wurde folgender Gradient verwendet: t [h] Fließmittel A

0,0 70,0 linear bis

40,0 20,0 linear bis

45,0 0,0 isokratisch bis

50,0 0,0 linear bis

52,0 70,0 isokratisch bis

65,0 70,0 Ende

Mit dieser Methode ergaben sich die in Abb. 2.3 dargestellten Chromatogramme.

Unterhalb der Bestimmungsgrenze von 1,4 ng⋅mL-1 war weder nach Einnahme einer

noch nach 10 Tabletten BronchipretTP freies Thymol detektierbar. Die zu Grunde

liegende Kalibrierfunktion ist in Tab. 2.4 dargestellt.


Tab. 2.4 Kalibrierfunktion (Konzentrationen: 1,4; 14,0; 28,0; 140,0 ng⋅mL-1) für die Bestimmung von Thymol im Plasma.


0,0136 0,0206 0,9991

Abb. 2.3 0-Wert Plasma mit Thymol versetzt (1,4 ng⋅mL-1) (blau), Plasma nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP (grün).

2.7.3 Detektion von freiem Thymol im Urin


Jeweils 500 µL Urin (pH 5) wurden mit 250 µL n-Heptan versetzt und für 20 min bei

350 rpm geschüttelt. Der Überstand wurde abgenommen und für die GC-MS Analytik

verwendet.


Für die Trennung und Quantifizierung von Thymol aus Urin wurde folgende GC-

Methode herangezogen: nach der Aufgabe von 3,0 µL Untersuchungslösung im

Splitless Modus wurde die Ausgangstemperatur von 80°C für 1 min gehalten und

anschließend mit 20°C⋅min-1 auf 220°C aufgeheizt. Diese Temperatur wurde für

48.0 49.0 50.0 51.0 52.0

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

Retention time (minutes)

Res

pons

e (n

A)

211 12 Claudi2.008

2 12 Claudi2.012# Ch File [825 mV]

[825 mV]

Thymol ↓


5 min konstant gehalten und dann erneut mit 20°C⋅min-1 auf 260°C aufgeheizt. Die

Endtemperatur wurde für 5 min konstant gehalten. Mit dieser Methode ergaben sich

die in Abb. 2.4 und Abb. 2.5 dargestellten Chromatogramme. Die Quantifizierung

erfolgte im SIM Modus. Unterhalb der Bestimmungsgrenze von 2,1 ng⋅mL-1 ließ sich

im Urin nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP kein freies Thymol nach-

weisen. Die zu Grunde liegende Kalibrierfunktion ist in Tab. 2.5 dargestellt.

Tab. 2.5 Kalibrierfunktion (Konzentrationen: 2,12; 5,3; 10,6; 21,2; 53,0; 106,0; 212,0 ng⋅mL-1) zur Bestimmung von Thymol im Urin.


12998 1474,1 0,9998

Abb. 2.Bronchip

Abb. 2.4

↓ Thymol

5 IonenspurchromatograretTP.

Ionenspurchromatogramm von 0-Wert Urin mit Thymol (2,1 ng⋅mL-1) versetzt.

min

min

mm von Urin nach Einnahme einer Tablette


2.8 Entwicklung und Validierung der analytischen Methoden zur Plasmaanalytik für die Hauptstudie

Um die bei der Hauptstudie anfallende große Probenanzahl bewältigen zu können

und eine den internationalen Anforderungen gerechte Validierung der HS-SPME

Methode durchführen zu können (BIOANALYTICAL METHODS VALIDATION, 1998), war die

Anschaffung eines Autosamplers, der die automatisierte Probenaufgabe

gewährleistete, unerläßlich (Abb. 2.6). Im Zuge der Anpassung der manuellen HS-

SPME an die automatisierte HS-SPME, mußten jedoch einige Parameter der unter

2.4.1 beschriebenen manuellen HS-SPME Methode wie folgt abgeändert werden.

Abb. 2.6 Combi-Pal Autosampler.

Änderung der Probengefäßgröße

Durch die durch den Combi-PAL Autosampler vorgegebene bzw. eingeschränkte

Probengefäßgröße (2, 10 oder 20 mL), konnte nicht mit den 4 mL Probengefäßen,

die während der manuellen Methode verwendet wurden, weiter gearbeitet werden.

Da die 2 mL Probengefäße ein zu kleines Volumen aufwiesen, um zu verhindern,

daß beim Exponieren der Faser Probenmaterial auf die Faser gelangte und sie damit

beschädigte, wurde im folgenden mit 10 mL Probengefäßen gearbeitet. Daraus

Bakeout

Tray

Injektor

SPME Faser

Single Magnet Mixer/Heater


resultierten größere Headspacevolumina, die wiederum einen Verlust an

Empfindlichkeit bedeuteten.

Einsatz einer speziellen Heiz- und Rührvorrichtung

Bei manueller HS-SPME wurde die Probe geheizt und gleichzeitig mit einem

Rührfisch gerührt. Das Rühren stellte einen wichtigen Einflußfaktor auf die

Einstellung des Gleichgewichtszustandes dar. Dieses intensive Rühren war jedoch

mit dem Combi-PAL Autosampler nicht möglich. Hier fand lediglich ein Schütteln - mit

variabler Umdrehungszahl, bevor die Faser exponiert wurde – und mit definierter,

langsamer Umdrehung, während der Exposition, statt.

Hierdurch kam es zu einer inakzeptablen Verlängerung der Analysenzeit. Zusätzlich

spritzte durch die Schüttelbewegung Probenmaterial auf die Faser, was die

Lebensdauer der Faser erheblich reduzierte und die Reproduzierbarkeit des

Verfahrens einschränkte. Durch die Entwicklung einer Vorrichtung, die das

gleichzeitige Heizen und Rühren der Probe mit einem Rührfisch ermöglichte (Single

Magnet Mixer/Heater, Fa. Chromtech), konnten diese Probleme behoben werden.

Änderung der Faserbeschichtung

Um den durch Einsatz der 10 mL Probengefäße entstandenen Verlust an

Empfindlichkeit auszugleichen, wurde statt der bisher verwendeten 100 µm

Polydimethylsiloxan-Faser eine 85 µm Polyacrylat-Faser eingesetzt. Diese war

empfindlicher für polarere Verbindungen und zeigte gegenüber der

Polydimethylsiloxan-Faser eine höhere Affinität zu Thymol. Die Polyacrylat-Faser

jedoch tolerierte die bei der Probenaufarbeitung zugesetzte Säure, insbesondere

Essigsäure nicht, so daß nach einigen Injektionen die Faserbeschichtung zerstört

wurde.

Deshalb wurde im folgenden mit einer zu diesem Zeitpunkt neu entwickelten 65 µm

Polydimethylsiloxan-Divinylbenzen-Faser (PDMS-DVB) gearbeitet. Sie zeichnete

sich durch eine wesentlich bessere Verträglichkeit niedriger pH-Werte aus und wies

dabei die notwendige Empfindlichkeit für den Analyten auf. Der hohe

Konzentrationsfaktor (Peakfläche durch SPME-Faser resultierend / Peakfläche durch

Headspace resultierend) von Thymol zur 65 µm PDMS-DVB-Faser wurde auch von


Bicchi et al. bestätigt (BICCHI et al., 2000). Die für die Methodenentwicklung

verwendeten 65 µm PDMS-DVB-Fasern waren, ebenso wie die zuvor verwendeten

Fasertypen mit einem angeklebten Septum versehen, das die Verflüchtigung der

Analyten verhinderte. Im Zuge dessen, daß der Hersteller die Zusammensetzung des

Klebers, mit dem die Septen fixiert wurden, veränderte, lösten sich die Septen

während des Gebrauches ab. Als Alternative wurden nun sog. ‚crimped fibers‘

entwickelt. Hier wurde das Septum nicht mehr geklebt, sondern mit einem

Metallmantel befestigt.

Konditionierung der SPME-Fasern

Zur Konditionierung der PDMS-DVB-Fasern wurden die Fasern zunächst 60 min bei

270°C in der Bakeout-Vorrichtung konditioniert, danach für 1 min in Methanol

gereinigt und anschließend für weitere 30 min bei 220°C im Injektor des GC

(geöffnetes Splitventil) belassen. Diese Vorgehensweise erwies sich bei allen

getesteten Fasern verschiedener Chargen als ausreichende Konditionierung.

Probenaufarbeitung

Die Probenaufarbeitung wurde gegenüber der manuellen SPME-Methode

folgendermaßen modifiziert: die eingesetzten Reagenzien wurden an die größeren

Probengefäße (10 mL) angepaßt. Demnach wurden 1040 µL Plasma mit 40 µL

Essigsäure 0,58 M und 100 µL β-Glucuronidaselösung (Sigma G7017) versetzt und

wie unter 2.4.1 beschrieben inkubiert. Anschließend wurden jeweils 50 µL Interne

Standardlösung (o-Cresol: 4 µg⋅mL-1) und Wasser hinzupipettiert. In ein 10 mL

Probengefäß wurden 1,0 g NaCl eingewogen, 100 µL Phosphorsäure 85 %

hinzupipettiert und mit einem Rührfisch versehen. Danach wurde das enzymatisch

behandelte Plasma hinzugefügt und das Probengefäß luftdicht (mit magnetischer

Kappe und PTFE Septum) verschlossen. Verluste des Analyten durch die

Pipettierschritte wurden nicht beobachtet.

Die folgenden Schritte wurden vom Combi-PAL Autosampler durchgeführt: jede

Probe wurde für 35 min bei 80°C unter Rühren bei 750 rpm im Magnet Mixer/Heater

geheizt. Während dieser Zeit wurde eine crimped 65 µm PDMS-DVB-Faser dem

Gasraum über der Probe ausgesetzt. Anschließend wurde die Faser in den


Injektorblock überführt und dort für 5 min desorbiert. Um carryover auszuschließen,

wurde die PDMS-DVB-Faser zu Beginn jeder weiteren Exposition bei 270°C für

10 min in der Bakeout-Vorrichtung gereinigt.

Die Herstellung der Standardlösungen, sowie die Kapillarsäule des GC wurden wie in

Absatz 2.4.1 aufgeführt, beibehalten. Das Temperaturprogramm wurde dahingehend

modifiziert, daß mit 4°C⋅min-1 auf 240°C aufgeheizt wurde und diese Temperatur für

10 min beibehalten wurde.

2.8.1 Validierung der Analytik zur Auswertung der Hauptstudie

Die Validierung der Analytik zur Hauptstudie wurde in Anlehnung an einen

Richtlinienentwurf „Bioanalytical Methods Validation for Human Studies – Draft

Guidance“ des U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug

Administration, Center for Drug Evaluation and Research, vorgenommen

(BIOANALYTICAL METHODS VALIDATION, 1998).

2.8.1.1 Identifizierung und Quantifizierung der Referenzsubstanz Thymol; Interkalibrierung des Arbeitsstandards

Die Identität der Referenzsubstanz Thymol (Lot 377452/1) wurde im Zentralinstitut

Arzneimittelforschung GmbH im Rahmen einer Zertifizierung der Substanz als

Primärstandard mittels 1H-NMR-, 13C-NMR-, Massen-, Infrarot- und

Ultraviolettspektren, sowie an Hand des Schmelzpunktes und per

Dünnschichtchromatographie bestimmt. Die Reinheit wurde mit quantitativer 1H-NMR-Spektroskopie (Wasser- und Lösungsmittelrückstände), Gaschromato-

graphie (100 % Peakflächenmethode) und Titration nach USP24/NF19 bestimmt.

Dabei ergab sich ein Thymolgehalt von 97,3 %, wobei als Verunreinigung

hauptsächlich Wasser auftrat. Lösungsmittelrückstände wurden nicht detektiert.

Zusätzlich wurde die Anwesenheit nicht flüchtiger Bestandteile mit 0,07 % ermittelt.

Die vollständige Dokumentation des Primärstandards Thymol liegt im Zentralinstitut

Arzneimittelforschung GmbH, Sinzig, vor.


Interkalibrierung des Arbeitsstandards

Das als Arbeitsstandard verwendete Thymol (Fluka, 89330) wurde per HPLC und GC

mit dem Primärstandard interkalibriert.

Für die per GC vorgenommene Quantifizierung wurden die unter Absatz 2.8

verwendeten chromatographischen Parameter verwendet. Die Aufgabemenge im

Splitless Modus betrug 1 µL.

Der zur Quantifizierung mittels HPLC verwendete Gradient war folgender: t [h] Fließmittel B [%]

0 30

20 70

22 100

25 100

27 30

Lösungsmittel A: Phosphorsäure 0,085 %; Lösungsmittel B: Acetonitril.

Injektionsvolumen: 5 µL, Detektionswellenlänge 274 nm.

Für den Arbeitsstandard bezogen auf den Primärstandard ergaben sich die in Tab.

2.6 angegeben Gehalte.

Tab. 2.6 Interkalibrierung des Arbeitstandards mit dem Primärstandard.

Konzentrations- Testkonzentration Steigung Achsen- R2 Gehaltbereich abschnitt

HPLC 20,76 bis 415,2 µg.mL-1 107 µg.mL-1 5333,3 11,53 0,99995 96,90%n=5 n=2

GC 7,74 bis 154,8 ng.mL-1 61,5 ng.mL-1 4383,72 -1618,58 0,99984 98,86%n=4 n=2


2.8.1.2 Lebensdauer der Fasern

Aufgrund der Azidität der Probenlösung ergab sich im Vergleich zu anderen HS-

SPME Methoden eine relativ kurze Lebensdauer (40 Injektionen) der Fasern. Die

Fasern verfärbten sich mit zunehmender Anzahl an Extraktionen und die

Chromatographie verschlechterte sich. Zusätzlich wurde eine abnehmende

Wiederfindung beobachtet, das Peakflächenverhältnis blieb jedoch relativ konstant.

2.8.1.3 Spezifität

Die Spezifität der Methode wurde an Hand von Plasmen sechs verschiedener

Probanden belegt. Im Plasma dieser Probanden befand sich jeweils genau zur

Retentionszeit des Thymols ein Peak, je nach Proband im Bereich von 1927 bis 2602

Flächeneinheiten. Verschiedene Säulenmaterialien sowie zahlreiche Änderungen in

Bezug auf das chromatographische System, konnten jedoch nicht dazu beitragen,

diesen Peak abzutrennen. Deshalb wurde die Bestimmungsgrenze auf 8,1 ng⋅mL-1

festgesetzt. Dies entsprach durchschnittlich 3990 Flächeneinheiten und lag damit

deutlich über dem durch den Störpeak hervorgerufenen Signal. Die Existenz des

interferierenden Peaks beeinflußte jedoch in keiner Weise die Gesamtaussagekraft

der Daten. Unter den oben beschriebenen Bedingungen erhielt man die in Abb. 2.7

und Abb. 2.8 gezeigten Chromatogramme.


Abb. 2.7 Chromatogramm nach Einnahme einer Tablette Bronchipret®TP (oben) und einer mit Thymol versetzten Probe (unten).

Abb. 2.8 Chromatogramm nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP (oben) und einer 0-Wert Probe (unten).

o-Cresol

↓

Thymol

↓

o-Cresol

↓

Thymol

↓

o-Cresol

↓

Thymol

↓


2.8.1.4 Einstellung des Gleichgewichtszustandes

Das Peakflächen-Zeitprofil für Thymol (Konzentration: 61,5 ng⋅mL-1) bei einer

Temperatur von 80°C ist in Abb. 2.9 dargestellt. Die ermittelte optimale

Expositionsdauer lag damit bei 35 min.

0

5000

10000

15000

20000

25000

0 10 20 30 40 50 60 70

Zeit [min]

Pekf

läch

e

Abb. 2.9 Peakflächen-Zeitprofil für Thymol bei 80°C, MW aus 2 Messungen.

2.8.1.5 Kalibrierfunktion: Linearität und Bestimmungsgrenze

Die Linearität wurde an 3 Tagen mit 3 verschiedenen Fasern anhand von 9

Konzentrationen im Bereich von 8,14 bis 40,07 ng⋅mL-1 und 30,54; bis 203,5 ng.mL-1

gezeigt (Tab. 2.7). Da bei der Verwendung einer Kalibrierfunktion, die den gesamten

Konzentrationsbereich abdeckte, im unteren Konzentrationsbereich keine den

Anforderungen genügenden Werte bezüglich Richtigkeit und Wiederholpräzision

erzielt werden konnten, wurden diese beiden Konzentrationsbereiche separat

kalibriert. Aus den Verhältnissen der Peakflächen von Analyt zu Internem Standard

wurde jeweils mittels linearer Regression die Kalibriergerade erstellt. In Abb. 2.10

und Abb. 2.11 sind exemplarisch die beiden den Arbeitsbereich abdeckenden

Kalibriergeraden dargestellt. Tab. 2.7 zeigt die Ergebnisse der Kalibrierfunktionen


bezüglich Steigung, Achsenabschnitt und Korrelationskoeffizienten. Die

Bestimmungsgrenze für Thymol lag bei 8,1 ng⋅mL1.

0

1

2

0 10 20 30 40 50Konzentration [ng.mL-1]

Peak

fläch

enve

rhäl

tnis

Abb. 2.10 Kalibriergerade für den unteren Konzentrationsbereich des Arbeitsbereiches.

01234567

0 50 100 150 200 250

Konzentration [ng.mL-1]

Peak

fläch

enve

rhäl

tnis

Abb. 2.11 Kalibriergerade für den oberen Bereich des Arbeitsbereiches.


Tab. 2.7 Parameter der Kalibrierfunktionen für Thymol. Konzentrationen: 8,14; 10,18; 20,36; 30,54; 40,07; 50,9; 101,8; 152,7; 203,5 ng.mL-1

Lauf Steigung Achsenabschnitt R2

8,14 bis 40,07 ng.mL-1 1 0,01700 0,49720 0,99854 30,54 bis 203,5 ng.mL-1 0,03280 -0,10450 0,99730

8,14 bis 40,07 ng.mL-1 2 0,03293 0,2556 0,97138 30,54 bis 203,5 ng.mL-1 0,02718 0,33653 0,99319

8,14 bis 40,07 ng.mL-1 3 0,02635 0,21208 0,97794 30,54 bis 203,5 ng.mL-1 0,02227 0,43056 0,99036

2.8.1.6 Richtigkeit und Wiederholpräzision

Die Daten zu Präzision und Richtigkeit wurden an 3 Tagen bestimmt. Dazu wurden

jeweils 5 Plasmaproben 3 verschiedener Thymolkonzentrationen bestimmt. Die

Konzentrationen wurden so gewählt, daß sie sich über den gesamten

Konzentrationsbereich verteilten (Tab. 2.8 und Tab. 2.9).

Die „intra-day precision“ drückt die Präzision aus, die man durch

Mehrfachbestimmung einheitlicher Proben innerhalb eines kurzen Zeitraumes erhält.

Die „between-day precision“ dagegen beschreibt die Präzision bei der Bestimmung

einheitlicher Proben u.a. an verschiedenen Tagen. Die „between-day precision“

wurde aus den Mittelwerten der „intra-day precision“ der jeweiligen Konzentration

berechnet. Sowohl „intra-day“- als auch „between-day precision“ wurden durch den

Variationskoeffizienten (CV(%)) beschrieben. Die prozentuale Abweichung des

Mittelwertes vom wahren Wert gab die Richtigkeit der Methode an (SHAH et al., 1992;

BIOANALYTICAL METHODS VALIDATION, 1998).

Bedingt durch die begrenzte Lebensdauer der SPME Fasern, wurden die

Untersuchungen zu Richtigkeit und Wiederholpräzision jeweils mit verschiedenen

Fasern durchgeführt. Da die Peakflächen der einzelnen Fasern sogar innerhalb einer

Charge z.T. erheblich variierten, wurde jede Faser zunächst separat kalibriert.


Tab. 2.8 Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Thymol während der Validierung („intra-day precision“). Konzentration Tag MW CV RE n

[ng.mL-1] [ng.mL-1] [%] [%]

8,14 1 9,26 18,26 13,72 5 2 6,66 12,23 -18,15 5 3 9,66 9,72 18,70 5

61,5 1 59,69 3,87 -2,94 5 2 55,55 9,30 -9,68 5 3 61,78 11,98 0,45 5

203,5 1 174,57 8,01 -14,22 5 2 192,97 6,32 -5,17 5 3 192,49 13,48 -5,41 5

Tab. 2.9 Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Thymol während der Validierung („between-day precision“), berechnet aus den Mittelwerten der „intra-day precision“.

Konzentration MW CV RE

[ng.mL-1] [ng.mL-1] [%] [%]

8,14 8,53 19,10 4,76

61,5 59,01 5,37 -4,06

203,5 186,68 5,62 -8,27

Der Variationskoeffizient (CV) sowie der relative Fehler (RE) waren sowohl für die

„intra-day precision”, als auch für die „between-day precision“, für die mittlere und

hohe Konzentration kleiner als 15 %, für die Bestimmungsgrenze kleiner als 20 %

(Tab. 2.8 und Tab. 2.9).


2.8.1.7 Stabilität

Stabilität der Plasmaproben

Die Stabilität der bei –20°C tief gefrorenen Plasmaproben wurde nach 2, 4, 6, und 12

Wochen überprüft. Es zeigte sich während des beobachteten Zeitraumes keine

Abnahme der ursprünglich vorhandenen Konzentration (Tab. 2.10). Auf die

Überprüfung der Stabilität in Einfrier- und Auftauzyklen wurde verzichtet, da die

Proben direkt nach Blutentnahme zu jeweils 500 µL aliquotiert wurden.

Tab. 2.10 Stabilität von Thymolsulfat im Plasma bei Lagerung bei -20°C. Die Werte entsprechen jeweils den Mittelwerten aus 2 Messungen, Gehalt in [%].

Woche 0 Woche 2 Woche 4 Woche 6 Woche 12

100 103,3 101,9 99,5 101,1

Stabilität der Plasmaproben im Autosampler

Um zu überprüfen, ob die zur Analytik vorbereiteten Plasmaproben nach längerem

Stehen (maximal 24 Stunden) im Autosampler noch die notwendige Stabilität

aufwiesen, wurden jeweils 4 Proben mit einer mittleren Thymol Konzentration

(41 ng⋅mL-1) sofort und nach 24stündigem Warten im Autosampler vermessen (Tab.

2.11). Es zeigte sich, daß der Thymolgehalt während der Zeit im Autosampler nicht

abnahm (Tab. 8.2 im Anhang).


Tab. 2.11 Stabilität der Plasmaproben im Autosampler (n=4).

Zeit [h] MW SD[ng.mL-1] [ng.mL-1]

0 37,36 0,49

24 39,59 2,29

2.8.1.8 Qualitätssicherung während der Probenmessung

Es wurden Plasmaproben von 12 Probanden in 12 Analysenserien analysiert. Die

Ergebnisse der Messungen (Kalibrierfunktionen und Qualitätskontrollproben) sind im

Anhang (Tab. 8.3 und Tab. 8.4) aufgeführt.

Kalibrierfunktionen

Durch die begrenzte Lebensdauer der SPME-Fasern wurde jede Analysenserie mit

einer neuen Faser durchgeführt. Mit jeder Analysenserie wurden 9 Kalibrierproben

(Plasmaproben mit Thymol versetzt) zur Erstellung zweier Kalibriergeraden (siehe

Absatz 2.8.1.5) analysiert. Die Kalibrierfunktionen für Thymol waren im jeweiligen

Konzentrationsbereich alle linear. Die Korrelationskoeffizienten lagen für den unteren

Konzentrationsbereich zwischen 0,95873 und 0,99715, für den oberen

Konzentrationsbereich zwischen 0,97750 und 0,99907 (Tab. 8.3).

Qualitätskontrollproben

Um den jeweiligen Ablauf einer Analysenserie zu überprüfen, wurden als

Qualitätskontrollproben (QCs) ebenfalls Plasmaproben (mit Thymol versetzt),

eingesetzt. Mit jeder Analysenserie wurden 6 über die gesamte Sequenz verteilte

Qualitätskontrollproben ausgewertet. Davon befanden sich je 2 im unteren (≤ 3

LOQ), im mittleren (ca. 50 % der größten Standardkonzentration) und oberen (75-

90 % der größten Standardkonzentration) Konzentrationsbereich des

Arbeitsbereiches. Mindestens 4 dieser QCs sollten nicht mehr als 20 % vom


tatsächlichen Wert abweichen. 2 dieser QCs konnten außerhalb dieses Bereiches

liegen, sofern sie nicht beide derselben Konzentration angehörten. Diese Kriterien

wurden ebenfalls erfüllt. Die jeweiligen Ergebnisse der QCs finden sich im Anhang

(Tab. 8.4).

2.8.1.9 Wiederfindung

Um festzustellen, welcher Anteil des Analyten (Thymol) durch die SPME Fasern aus

der Probe extrahiert wurde, wurde die Wiederfindung bestimmt. Dabei wurden die

Peakflächen, die durch direktes Einspritzen des Analyten (Thymol in Methanol)

erhalten wurden, mit den Peakflächen, die nach Festphasenmikroextraktion erhalten

wurden, verglichen. Dabei entsprach die Menge des Analyten in der Plasmaprobe

der Menge, die auf die Säule per Flüssigaufgabe aufgegeben wurde. Die

Wiederfindung bei 3 Konzentrationen sind in Tab. 2.12 dargestellt.

Tab. 2.12 Wiederfindung für verschiedene Konzentrationen von Thymol aus humanem Plasma für Headspace-Festphasenmikroextraktion.

aufgegebene Menge bzw. Menge pro mL Plasma [ng]

8.1 61.5 203.5

Wiederfindung [%] 4,9 ± 0,7 5,3 ± 0,7 4,5 ± 0,3

Variationskoeffizient [%] 14,1 12,5 5,9

2.8.1.10 Strukturabsicherung von Thymol im Plasma nach enzymatischer Spaltung mittels GC-MS

Die Strukturabsicherung für Thymol nach enzymatischer Spaltung im Plasma im

Rahmen der Hauptstudie, erfolgte mit der manuellen Festphasenmikroextrak-

tionsmethode (80°C, 750 rpm, 35 min Expositionszeit), da die Umrüstung des GC-

MS mit dem Combi-PAL Autosampler nicht durchführbar war. Die anderen

Parameter wurden wie in Absatz 2.8 beschrieben beibehalten. Die Ionisierung

erfolgte mit 70 eV. Die Spektren wurden sowohl im TIC (Totalionenstrom), als auch


im SIM Modus aufgenommen, woraus eine wesentlich höhere Empfindlichkeit

resultierte.

Bei der Analyse der Plasmaproben der Hauptstudie ergab sich jeweils eine

Übereinstimmung des im SIM Modus aufgenommenen Spektrums mit dem der

Referenzsubstanz bei m/z 150, 135 ,115 und 91. In Abb. 8.1 und Abb. 8.2 im Anhang

sind im Vergleich die typischen Fragmentierungsmuster von einer mit Thymol

versetzten Plasmaprobe und von Plasma nach Einnahme einer Tablette

BronchipretTP dargestellt. Die prozentualen Verhältnisse der entsprechenden

Fragmente wichen kaum von denen der Referenzsubstanz ab (Tab. 8.15).

2.9 Entwicklung und Validierung der analytischen Methoden zur Urinanalytik

2.9.1 Methodenentwicklung

Die Methodenentwicklung zur Bestimmung von Thymol in humanem Urin nach

enzymatischer Spaltung der Phase-II-Metabolite Thymolsulfat und Thymolglucuronid

(siehe Absatz 3.1) basierte auf der unter 2.8 beschriebenen Methode zur

Bestimmung von Thymol in humanem Plasma. Sie unterscheidet sich lediglich in der

Probenaufarbeitung; alle anderen unter 2.8 aufgeführten Parameter wurden

beibehalten. Auf den Zusatz eines Internen Standards wurde verzichtet, die

Validierungskriterien, wie in Absatz 2.9.2 dargestellt, konnten dennoch erfüllt werden.

Probenaufarbeitung

1000 µL Urin wurden mit 20 µL Essigsäure 0,58 M auf pH 5 eingestellt, mit 100 µL β-

Glucuronidase (Sigma G7017) versetzt und wie unter Absatz 2.4.1 beschrieben

inkubiert. Eine größere Menge Enzym und/oder längere Inkubationszeiten führten zu

keiner vermehrten Freisetzung. Nach der Inkubation wurden dem Urin 50 µL Wasser

zugesetzt. In ein 10 mL Probengefäß wurden 1,0 g NaCl eingewogen, 100 µL

Phosphorsäure 85 % und ein Rührfisch hinzugefügt. Der behandelte Urin wurde

hinzugegeben und das Probengefäß wurde luftdicht verschlossen. Verluste beim

Transferieren des Urins wurden nicht beobachtet. Nach 25minütigem Inkubieren bei


80°C und gleichzeitigem Rühren mit 750 rpm, wurde die Faser in den Injektorblock

überführt und dort ebenfalls für 5 min desorbiert.

2.9.2 Validierung

Die Validierung der Methode wurde ebenfalls nach den unter Absatz 2.8

beschriebenen Kriterien vorgenommen.

2.9.2.1 Spezifität

Die Spezifität der Methode wurde an Hand von zu unterschiedlichen Zeitpunkten

gesammelten Urinproben von 6 Probanden, sowie am Tagesprofil des Urins von 3

Probanden belegt. Im Urin aller Probanden befand sich zu jedem Zeitpunkt zur

Retentionszeit des Thymols ein Peak, der aber keiner nennenswerten tageszeitlichen

Schwankung unterlag. Je nach Proband und Sammelzeitpunkt lag die Peakfläche im

Bereich von 2777 bis 6331 Flächeneinheiten.

Die Bestimmungsgrenze wurde somit auf 10,2 ng⋅mL-1 festgesetzt. Dies entsprach

durchschnittlich 15500 Flächeneinheiten und lag damit deutlich über dem durch den

Störpeak hervorgerufenen Signal. Unter den o.g. Bedingungen ergaben sich die in

Abb. 2.12 und Abb. 2.13 dargestellten Chromatogramme.


Abb. 2.12 Chromatogramm nach Einnahme einer Tablette Bronchipret®TP (oben) und einer mit Thymol versetzten Urinprobe (unten).

Abb. 2.13 Chromatogramm nach Einnahme einer Tablette Bronchipret®TP (oben) und einer 0-Wert Urinprobe (unten).

← Thymol

← Thymol

← Thymol


2.9.2.2 Einstellung des Gleichgewichtszustandes

Das Peakflächen-Zeitprofil für Thymol (101,8 ng⋅mL-1) bei einer Temperatur von 80°C

ist in Abb. 2.14 dargestellt. Die ermittelte optimale Expositionsdauer lag damit bei

25 min.

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

0 10 20 30 40 50 60 70

Zeit [min]

Peak

fläch

e

Abb. 2.14 Peakflächen-Zeitprofil für Thymol bei 80°C, MW aus 2 Messungen.

2.9.2.3 Kalibrierfunktion: Linearität und Bestimmungsgrenze

Linearität und Bestimmungsgrenze wurden, wie unter Absatz 2.8.1.5 beschrieben, im

Bereich von 10,2 bis 219,0 und von 164,25 bis 755,0 ng⋅mL-1 bestimmt (Tab. 2.13).

Im Gegensatz zur Plasmaanalytik wurde hier auf den Zusatz eines Internen

Standards verzichtet, da Reproduzierbarkeit und Richtigkeit der Methode auch ohne

Internen Standard zufriedenstellende Ergebnisse lieferten. In Abb. 2.15 und Abb.

2.16 sind exemplarisch die beiden den Arbeitsbereich abdeckenden Kalibriergeraden

dargestellt. Tab. 2.13 zeigt die Ergebnisse der ermittelten Kalibrierfunktionen. Die

Bestimmungsgrenze lag bei 10,2 ng⋅mL-1.

Im Zuge der Urinprobenauswertung zeigte sich, daß ein kleinerer Arbeitsbereich von

10,2 bis 328,5 ng.mL-1 ausreichend war. Im folgenden wurde mit nur einer

Kalibrierfunktion im genannten Bereich gearbeitet .


0

50000

100000

150000

200000

250000

0 50 100 150 200 250

Konzentration Thymol [ng.mL-1]

Peak

fläch

e

Abb. 2.15 Kalibriergerade für den unteren Konzentrationsbereich des Arbeitsbereiches.

0100000200000300000400000500000600000700000

0 200 400 600 800

Konzentration Thymol [ng.mL-1]

Peak

fläch

e

Abb. 2.16 Kalibriergerade für den oberen Konzentrationsbereich des Arbeitsbereiches.

Tab. 2.13 Parameter der Kalibrierfunktionen für die Bestimmung von Thymol im Urin.

Lauf Steigung Achsenabschnitt R2

10,95 bis 219,0 ng.mL-1 1 857,82 5755,51 0,99795164,25 bis 755,0 ng.mL-1 736,37 22965,79 0,99304

10,95 bis 219,0 ng.mL-1 2 701,02 9845,12 0,99443164,25 bis 755,0 ng.mL-1 636,94 19511,77 0,99044

10,95 bis 219,0 ng.mL-1 3 635,011 8638,99 0,99233164,25 bis 755,0 ng.mL-1 641,37 11964,06 0,99001

Konzentrationen: 10,95; 54,75; 109,5; 164,25; 219; 328,5; 438; 547,5; 755 ng.mL-1


2.9.2.4 Richtigkeit und Wiederholpräzision

Die Bestimmung von Präzision und Richtigkeit wurde analog zu Absatz 2.8.1.6

durchgeführt. Die erzielten Werte sind in Tab. 2.14 und Tab. 2.15 dargestellt. Der

Variationskoeffizient, sowie der relative Fehler waren für die mittlere und hohe

Konzentration < 15 %, für die Bestimmungsgrenze < 20 %.

Tab. 2.14 Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Thymol während der Validierung („intra-day precision“).

Konzentration Tag MW CV RE n[ng.mL-1] [ng.mL-1] [%] [%]

10,95 1 10,89 10,70 -0,52 52 8,83 7,21 -19,353 8,83 19,38 -19,33

219,0 1 215,61 2,93 -1,55 52 226,67 7,03 3,503 202,74 3,64 -7,42

547,5 1 510,35 2,41 -6,79 52 485,53 10,80 -11,323 559,82 5,95 2,25

Tab. 2.15 Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Thymol während der Validierung („between-day precision“), ermittelt aus den Mittelwerten der „intra-day precision“.

Konzentration MW CV RE[ng.mL-1] [ng.mL-1] [%] [%]

10,95 9,52 12,50 -13,07

219,0 215,01 5,57 -1,82

547,50 518,57 7,29 -5,28


2.9.2.5 Stabilität

Stabilität der Urinproben

Wie in Absatz 2.8.1.7 für die Plasmaproben beschrieben, wurde ebenfalls die

Stabilität der Urinproben überprüft. Auch hier war über den Zeitraum von 12 Wochen

keine Abnahme der Ausgangskonzentration zu verzeichnen .

Tab. 2.16 Stabilität der Thymol-Konjugate im Urin bei Lagerung bei -20°C. Die Werte entsprechen jeweils den Mittelwerten aus 2 Messungen, Gehalt in [%].

Woche 0 Woche 2 Woche 4 Woche 6 Woche 12

100 101,43 100,56 99,08 100,3

Stabilität der Urinproben im Autosampler

Nach 24stündiger Wartezeit der Urinproben im Autosampler mit einer Konzentration

von 109 ng⋅mL-1 zeigte sich, daß der Thymolgehalt während der Zeit im Autosampler

nicht abnahm (Tab. 2.17). Die genauen Daten sind in Tab. 8.5 im Anhang aufgeführt.

Tab. 2.17 Stabilität der Urinproben im Autosampler (n=4).

Zeit [h] MW SD

[ng.mL-1] [ng.mL-1]

0 119,96 12,99

24 122,54 5,39


2.9.2.6 Qualitätssicherung während der Probenmessung

Es wurden Urinproben von 12 Probanden in 5 Analysenserien analysiert. Die

Ergebnisse der Messungen sind im Anhang (Tab. 8.6 und Tab. 8.7) aufgeführt.

Kalibrierfunktionen

Durch die begrenzte Lebensdauer der SPME-Fasern wurde für jede Analysenserie

(Urinproben von 2-3 Probanden) eine neue Faser eingesetzt und mit jeder

Analysenserie 9 bzw. 6 Kalibrierproben (Urinproben mit Thymol versetzt) zur

Erstellung der Kalibriergeraden analysiert (SHAH et al., 1992; BIOANALYTICAL METHODS

VALIDATION, 1998). Wie in Absatz 2.9.2.3 erwähnt, wurde im Laufe der

Probenauswertung der Arbeitsbereich verkleinert und mit einer Kalibrierfunktion von

10,2 bis 328,5 ng.mL-1 gearbeitet. Die Kalibrierfunktionen für Thymol waren alle linear

im jeweiligen Konzentrationsbereich. Die Korrelationskoeffizienten lagen für den

unteren Konzentrationsbereich zwischen 0,99476 und 0,99850, für den oberen

Konzentrationsbereich zwischen 0,97537 und 98155 und für die Kalibrierung im

verkleinerten Arbeitsbereich zwischen 0,98724 und 0,99301. Die Angaben zu den

Kalibrierfunktionen befinden sich im Anhang (Tab. 8.6).

Qualitätskontrollproben

Zur Kontrolle des Ablaufes jeder Analysenserie wurden als Qualitätskontrollproben

(QCs) mit Thymol versetzte Urinproben eingesetzt. Anzahl und Thymolkonzentration

der Proben wurden wie unter 2.8.1.8 beschrieben festgelegt. Da jedoch die Anzahl

der Proben pro Sequenz z.T. erheblich geringer waren als die der Plasmaproben,

wurde die Anzahl der QCs bei geringerem Probenumfang der Sequenz auf 3

reduziert. Im Zuge der Verkleinerung des Arbeitsbereiches wurden die

Konzentrationen der QCs entsprechend angepaßt. Die entsprechenden

Akzeptanzkriterien wurden, wie unter 2.8.1.8 aufgeführt, beibehalten und erfüllt. Die

jeweiligen Ergebnisse der QCs finden sich im Anhang, Tab. 8.7.


2.9.2.7 Wiederfindung

Um festzustellen, welcher Anteil des Analyten (Thymol) durch die SPME-Fasern aus

der Urinprobe extrahiert wurde, bestimmte man die Wiederfindung. Dabei wurde wie

unter Absatz 2.8.1.9 beschrieben vorgegangen. Die Wiederfindung bei 3

Konzentrationen sind in Tab. 2.18 dargestellt.

Tab. 2.18 Wiederfindung für verschiedene Konzentrationen von Thymol aus humanem Urin für Headspace-Festphasenmikroextraktion. aufgegebene Menge bzw. Menge pro mL Urin [ng]

10,95 219 547,5

Wiederfindung [%] 24,9 ± 0,67 16,9 ± 1,3 15,24 ± 0,5

Variationskoeffizient [%] 10,9 7,9 3,3

2.9.2.8 Strukturabsicherung von Thymol im Urin nach enzymatischer Spaltung mittels GC-MS

Die Strukturabsicherung für Thymol nach enzymatischer Spaltung im Urin im

Rahmen der Hauptstudie erfolgte mit der manuellen Festphasenmikroextrak-

tionsmethode (80°C, 750 rpm, 25 min Expositionszeit), da die Umrüstung des GC mit

dem Combi-PAL Autosampler nicht durchführbar war. Die anderen Parameter

wurden wie in Absatz 2.9 beschrieben beibehalten.

Die Ionisierung erfolgte mit 70 eV. Die Spektren wurden sowohl im TIC

(Totalionenstrom) als auch im SIM Modus aufgenommen (Abb. 8.3 und Abb. 8.4 im

Anhang). Die prozentualen Verhältnisse der entsprechenden Fragmente wichen

kaum von denen der Referenzsubstanz ab (Tab. 8.16).


2.10 Synthese von Thymolglucuronid als Referenzsubstanz

Die Synthese des Thymolglucuronides (Abb. 2.17) erfolgte durch die Übertragung

von Glucuronsäure auf Thymol mit Hilfe des Enzyms Uridin-5`-Diphosphoglucuronyl-

Transferase.

OHO

OHOH

HOOCO

Abb. 2.17 Thymolglucuronid.

Zunächst wurden folgende Lösungen hergestellt:

A. 1000 mM Tris HCl Puffer, pH 8, 37°C

B. 30 mM Uridin-5`-Diphosphoglucuronsäure (UDPGA)

C. Thymol, 21,9 mg in EtOH zu 10 mL gelöst

D. 1000 mM Magnesiumchlorid

E. 10 % (m/V) Bovines Serum Albumin

F. 200 mM 2-Mercaptoethanollösung

G. Uridin-5`-Diphosphoglucuronyl-Transferase, Enzymlösung, 100-200 mg/mL

H. EtOH unvergällt

Die Lösungen (Ausnahme Lsg.C) wurden alle mit Nanopur-Wasser hergestellt.


Durchführung

Folgende Reagenzien wurden in einem geeigneten Reaktionsgefäß vereinigt:

Nanopur-Wasser: 17,00 mL

Reagenz A: 20,00 mL

Reagenz C: 2,0 mL

Reagenz D: 3,0 mL

Reagenz E: 20,00 mL

Reagenz F: 1,00 mL

Das Reaktionsgemisch wurde auf 37°C gebracht und auf pH 8 eingestellt (HCl 0,1 M

oder NaOH 0,1M).

6,3 mL des o.g. Reaktionsgemisches wurden mit 88 µL der Enzymlösung versetzt

und ebenfalls auf 37°C gebracht, anschließend wurden 211 µL Reagenz B zugesetzt

und für 60 min. bei 37°C inkubiert. Um die Reaktion zu stoppen, wurden jeweils

500 µL des Reaktionsansatzes zu 1 mL EtOH gegeben. Nach Abzentrifugieren der

gefällten Proteine befand sich die glucuronidierte Substanz im Überstand.

Das Reaktionsgemisch wurde vor Zugabe der Enzymlösung in 2 Aliquots geteilt, um

1 Aliquot ohne Uridin-5`-Diphosphoglucuronyl-Transferase als Vergleich zu

untersuchen. Der Überstand wurde per HPLC-PDA analysiert, um den Ablauf bzw.

das Ergebnis der enzymatischen Reaktion zu überwachen.

Als Fließmittel dienten A: Phosphorsäure, pH 2 und B: Methanol. Der Gradient, der

bei einem Fluß von 1 mL⋅min-1 die Trennung des Thymolglucuronides von Thymol

ermöglichte, ist in Tab. 2.19 abgebildet.


Tab. 2.19 Gradient zur Trennung von Thymol und Thymolglucuronid. t [h] Fließmittel A [%]

0 100 Isokratisch bis

3,6 65 linear bis

5,6 65 isokratisch bis

10 50 linear bis

12 50 isokratisch bis

20 40 linear bis


30 15 linear bis

35 15 isokratisch bis

38 0 linear bis


55 100 linear bis


65 Ende

Da Thymol ein Absorptionsmaximum λmax=274 nm besitzt, wurde bei 274 nm

detektiert. Es zeigte sich, daß sich nach einer Stunde Inkubationsdauer die

Peakfläche des Thymols wesentlich verringert hatte, während ein neuer Peak mit

kürzerer Retentionszeit entstand (Abb. 2.18).

Abb. 2.18 Chromatogramme des Reaktionsgemisches ohne (schwarz) und mit Uridin-5`-Diphosphoglucuronyl-Transferase (rot) nach 60minütigem Inkubieren bei 37°C.

23.571 31.368Time (min)


Der neu entstandene Peak zeigte ein dem Thymol sehr ähnliches UV-

Absorptionsspektrum. Das Absorptionsmaximum für Thymol lag bei λmax=274 nm,

das des neu entstandenen Peaks bei λmax=270 nm (1. Ableitung der UV-

Absorptionsspektren im Anhang, (Abb. 8.5)). Diese hypsochrome Verschiebung

könnte dem Verlust der freien OH-Funktion zuzuschreiben sein. Zudem eluierte die

neu entstandene Verbindung früher, d.h. sie war hydrophiler als Thymol, was durch

das Anfügen der Glucuronsäure erreicht wurde.

Die Struktur des Thymolglucuronides wurde per LC-MS/MS abgesichert. Das Molion

[M – H]¯ = 325 amu wurde mittels SRM zu folgenden Tochterionen fragmentiert: 307

(Wasserverlust), 175 (Glucuronsäure), 149 (Thymol) und 113. Das MS bzw. MS/MS-

Spektrum findet sich im Anhang, Abb. 8.6.


2.11 Pharmakokinetische Analysen

2.11.1 Nichtkompartiment Analyse

Die nichtkompartimentelle Analyse wurde mit Hilfe von Microsoft Excel 97

durchgeführt. Die Berechnung der pharmakokinetischen Kenndaten wurde wie folgt

vorgenommen (DERENDORF und GARRETT, 1987):

Die terminale Eliminationskonstante ke wurde jeweils aus einem semi-

logarithmischen Graphen der Thymol-Plasmakonzentrationen gegen die Zeit

ermittelt. Mittels linearer Regression durch die letzten 4 Datenpunkte (siehe

individuelle Graphen, Abb. 8.10) ergab sich ke als ke= - Steigung⋅2,303.

t ½ (Eliminationshalbwertszeit) = ln 2/ke

AUC cum (area under the curve) wurde aus dem Konzentrations-Zeitverlauf mit Hilfe der

sog. Trapezregel von t=0 bis t=t last berechnet

AUC last (terminaler Flächenabschnitt) wurde berechnet als Clast/ke

AUC tot Summe aus AUC cum und AUC last

% AUC last prozentualer Anteil des terminalen Flächenabschnittes an der Gesamtfläche:

% AUC last= (AUC last * 100)/(AUC cum + AUC last)

AUMC cum (area under the first moment curve) wurde aus dem Produkt von

Plasmakonzentration und Zeit gegen die Zeit von t=0 bis t=t last mit Hilfe der

Trapezregel berechnet: (c1 * t1 + c2 * t2) * (t2 – t1)/2

AUMC last berechnet als:(clast * tlast)/ke + (c last/ke2)

AUMC tot ist die Summe aus AUMC cum und AUMC last

MRTabs (mean residence time after extravascular administration) wurde berechnet als:

MRT abs=AUMC tot/AUC tot

ka wurde erhalten aus der Beziehung tmax=ln(ka/ke)/ka-ke) unter Verwendung der

Excel Solver Funktion

MAT (mean absorption time) wurde berechnet nach: MAT=1/ka

Cl/f (Clearance/bioverfügbarer Anteil) berechnet nach: Cl/f=D/AUC tot

Vdss/f (Verteilungsvolumen im Steady-State-Zustand/bioverfügbarer Anteil berechnet

nach: Vdss/f =[(f * D * AUMC tot)/AUC tot2] – (f * D)/(AUC tot * ka)

Vdarea/f (Verteilungsvolumen im Pseudo-Steady-State-Zustand/bioverfügbarer Anteil

berechnet nach: Vdarea/f = CL/f / ke


2.11.2 Kompartiment Analyse

Die kompartimentelle Analyse wurde mit Hilfe von Kinetika 2000 Version 3.0

(InnaPhase Corporation, Philadelphia, USA) durchgeführt. Die durch die Software

vorgegebenen pharmakokinetischen Parameter sind im folgenden definiert. Für die

zugrunde liegenden Berechnungen siehe Tab. 8.8 im Anhang.

Ccalc berechnete Konzentration

Residuals Residuale

Weight Wichtung

Weighted Res. gewichtete Residuale

ka Absorptionskonstante

Tlag Resorptionsverzögerungszeit

Vc Volumen im zentralen Kompartiment

ke Eliminationskonstante vom zentralen Kompartiment

k12 Transferkonstante vom zentralen ins periphere Kompartiment

k21 Transferkonstante vom peripheren ins zentrale Kompartiment

AUC partielle Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve

AUMC partielle Fläche unter der Moment Kurve

MRT mittlere Verweildauer

Lz kleinste (langsamste) Eliminationskonstante

Cmax calc berechnete maximale Plasmakonzentration

tmax calc Zeitpunkt der berechneten maximalen Plasmakonzentration

A Koeffizient

Alpha Exponent

B Koeffizient

Beta Exponent

Tabs Resorptionsdauer

t ½ ka Resorptionshalbwertszeit

t ½ alpha Eliminationshalbwertszeit von Alpha

t ½ beta Eliminationshalbwertszeit von Beta

t ½ Lz Eliminationshalbwertszeit assoziiert mit der terminalen Steigung

t ½ ke Eliminationshalbwertszeit von ke

Vss apparentes Verteilungsvolumen im Steady State

Vz apparentes Verteilungsvolumen während der terminalen Phase (Lz)

Cl Gesamtclearance

3 Ergebnisse 87

3 Ergebnisse

3.1 Analytik der Plasma- und Urinproben vor enzymatischer Spaltung der Konjugate

Wie in Absatz 1.4 ausgeführt, wurde aus analytischen Gründen der

Gesamtthymolgehalt nach enzymatischer Spaltung der Konjugate bestimmt. Die

pharmakokinetische Auswertung auf dieser Basis war jedoch nur dann zulässig,

wenn der Zusammenhang zwischen den im Plasma bzw. im Urin vorliegenden

Konjugaten und dem per HS-SPME bestimmten Gesamtthymolgehalt bekannt war.

Deshalb wurde die Beziehung der detektierten Thymolkonjugate zum

Gesamtthymolgehalt nach enzymatischer Hydrolyse untersucht. Für die LC-MS/MS

Analysen wurden exemplarisch Plasma- (tmax bzw. t=0 bis t=5 h) und Urinproben

(cmax bzw. t=0 bis t=24 h) von zwei verschiedenen Probanden herangezogen.

Zusätzlich zu Proben nach Einnahme einer Tablette Bronchipret®TP wurden jeweils

auch Proben nach Einnahme von 10 Tabletten untersucht, um zu gewährleisten, daß

die Nachweisgrenze nicht den limitierenden Faktor bei den Messungen darstellen

würde.

Plasma

Im Plasma konnte sowohl nach Einnahme einer als auch nach 10 Tabletten

Bronchipret®TP nur Thymolsulfat detektiert werden (Abb. 3.1). In der Ionenspur

wurde Thymolsulfat mit einer Masse von 229 ([M - H]¯) detektiert. Das Molion

[M - H]¯ = 229 amu (ESI negativ) wurde mittels SRM fragmentiert und im MS/MS-

Spektrum sind die typischen Tochterionen 211 (Wasserverlust), 201, 165 (Verlust

von SO2), 149 (Thymol) und 80 (SO3-) zu finden, Abb. 8.7.

Der Frage, ob neben Thymolsulfat auch unkonjugiertes Thymol im Plasma vorlag,

wurde ebenfalls nachgegangen. Oberhalb einer Bestimmungsgrenze von 1,4 ng⋅mL-1

wurde mit der in Absatz 2.7.2 beschriebenen Methode kein freies Thymol detektiert.

3 Ergebnisse 88

R T : 0 . 0 0 - 3 5 . 0 0 S M : 1 5 B

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5T i m e ( m i n )

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

3 5

4 0

4 5

5 0

5 5

6 0

6 5

7 0

7 5

8 0

8 5

9 0

9 5

1 0 0

Re

lati

ve

Ab

un

da

nc

e

3 3 . 1 2 N L :1 . 3 7 E 6B a s e P e a k m / z = 1 4 8 . 0 0 - 1 5 0 . 0 0 +2 2 8 . 0 0 - 2 3 0 . 0 0 +3 2 4 . 0 0 - 3 2 6 . 0 0 M S P l a s m a G 0

R T : 0 . 0 0 - 3 5 . 0 0 S M : 1 5 B

0 5 1 0 1 5T i m

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

3 5

4 0

4 5

5 0

5 5

6 0

6 5

7 0

7 5

8 0

8 5

9 0

9 5

1 0 0

Re

lati

ve

Ab

un

da

nc

e

T h y m o l - s u l p h a t e

1 5 . 0 1

3 3 . 0 5

N L : 9 . 2 2 E 5B a s e P e a k m / z = 1 4 8 . 0 0 - 1 5 0 . 0 0 +2 2 8 . 0 0 - 2 3 0 . 0 0 +3 2 4 . 0 0 - 3 2 6 . 0 0 M S I C I S P l a s m a G 1 a

R T : 0 . 0 0 - 3 5 . 0 0 S M : 1 5 B

0 5 1 0 1 5T i m

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

3 5

4 0

4 5

5 0

5 5

6 0

6 5

7 0

7 5

8 0

8 5

9 0

9 5

1 0 0

Re

lati

ve

Ab

un

da

nc

e

T h y m o l - g l u c u r o n i d e

1 3 . 0 0

1 5 . 2 1

Abb. 3.1 IonenspurchromatogrammEinnahme einer Tablette BronchiprTablette Bronchipret®TP mit Thymo

Thymolglucuronid →
← Thymolsulfat
2 0 2 5 3 0 3 5e ( m i n )

2 0 2 5 3 0 3 5e ( m i n )


3 2 . 9 5

N L : 1 . 0 3 E 6B a s e P e a k m / z = 1 4 8 . 0 0 - 1 5 0 . 0 0 +2 2 8 . 0 0 - 2 3 0 . 0 0 +3 2 4 . 0 0 - 3 2 6 . 0 0 M S I C I S P l a s m a G 1 B s p i k e

e (neg. LC-ESI) von 0-Wert Plasma (oben), nach et®TP (mitte) und Plasma nach Einnahme einer lglucuronid versetzt (unten).

← Thymolsulfat

3 Ergebnisse 89

Der Konzentrations-Zeitverlauf des Thymolsulfates entsprach dem Verlauf des

Gesamtthymolgehaltes, der nach enzymatischer Behandlung der Plasmaproben per

HS-SPME ermittelt wurde (Abb. 3.2) (siehe Absatz 3.3.1). Die Abwesenheit freien

Thymols, die Ergebnisse der LC-MS Messungen, sowie der parallele Verlauf des

enzymatisch freigesetzten Thymols mit dem des Thymolsulfates deuteten darauf hin,

daß Thymol nur in Form einer Verbindung – nämlich als Thymolsulfat bioverfügbar

war.

0

20

40

60

80

100

120

140

0 1 2 3 4 5 6

Zeit [h]

Abb. 3.2 Konzentrations-Zeit-Verlauf des Gesamtthymolgehaltes nach enzymatischer Spaltung mittels HS-SPME ( ) und des per LC-MS ermittelten Thymolsulfates (�). Beschriftung der Y-Achse: : cp [ng⋅mL-1]; �: Thymolsulfat [Peakfläche/250000], 1 Proband.

Urin

Im Urin konnten sowohl nach Einnahme einer als auch nach 10 Tabletten

Bronchipret®TP beide Phase-II-Metabolite - Thymolsulfat und Thymolglucuronid -

detektiert werden (Abb. 3.3). Thymolglucuronid wurde in der Ionenspur mit 325 amu

([M - H]¯) detektiert (ESI negativ). Das MS/MS-Spektrum des Molions [M - H]¯ = 325

amu zeigt die typischen Tochterionen 307 (Wasserverlust), 175 (Glucuronsäure), 149

(Thymol) und 113, Abb. 8.8. Diese sind auch im Vergleich mit dem Spektrum der

Referenzsubstanz, Abb. 8.6 zu erkennen. Die Zuordnung des Thymolsulfatpeaks

erfolgte wie für das Plasma beschrieben, Abb. 8.9. Das Verhältnis der Peakflächen

3 Ergebnisse 90

der beiden Verbindungen blieb in den verschiedenen Sammelintervallen konstant

(Abb. 3.4) und glich dem Verlauf des mit SPME bestimmten Ausscheidungsmusters

an Gesamtthymol nach enzymatischer Spaltung (siehe Abb. 3.11). Freies Thymol

konnte im Urin oberhalb einer Bestimmungsgrenze von 2,1 ng⋅mL-1 mit der in Absatz

2.7.3 beschriebenen Methode ebenfalls nicht detektiert werden.

R T : 0 . 0 0 - 3 5 . 0 0 S M : 1 5 B

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5T i m e ( m i n )

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

3 5

4 0

4 5

5 0

5 5

6 0

6 5

7 0

7 5

8 0

8 5

9 0

9 5

1 0 0

Re

lati

ve

Ab

un

da

nc

e

1 3 . 0 9

1 2 . 8 21 5 . 3 3

1 1 . 7 91 1 . 6 8

N L : 1 . 3 6 E 5B a s e P e a k m / z = 1 4 8 . 0 0 - 1 5 0 . 0 0 +2 2 8 . 0 0 - 2 3 0 . 0 0 +3 2 4 . 0 0 - 3 2 6 . 0 0 M S I C I S U r i n E R I I I 1 . 0

R T : 0 . 0 0 - 3 5 . 0 0 S M : 1 5 B

0 5 1 0 1 5T i m

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

3 5

4 0

4 5

5 0

5 5

6 0

6 5

7 0

7 5

8 0

8 5

9 0

9 5

1 0 0

Re

lati

ve

Ab

un

da

nc

e


T h y m o l - g l u c u r o n i d e

1 5 . 2 7

1 2 . 7 4

N L : 2 . 2 3 E 6B a s e P e a k m / z = 1 4 8 . 0 0 - 1 5 0 . 0 0 +2 2 8 . 0 0 - 2 3 0 . 0 0 +3 2 4 . 0 0 - 3 2 6 . 0 0 M S I C I S U r i n E R I I I 1 . 1

Abb. 3.3 Ionenspurenchromatogramnach Einnahme von 10 Tabletten Br

← Thymolsulfat

Thymolglucuronid →

2 0 2 5 3 0 3 5e ( m i n )

me (neg. LC-ESI) von 0-Wert Urin (oben) und onchipretTP (unten).

3 Ergebnisse 91

0

50

100

150

200

250

300

350

3 6 9 14Zeit [h]

Peak

fläch

e/15

0000

00

ThymolsulfatThymolglucuronid

Abb. 3.4 Kumulative renale Ausscheidung von Thymolsulfat und Thymolglucuronid, 1 Proband.

3 Ergebnisse 92

3.2 Ergebnisse der Pilotstudien


nach Applikation einer Tablette BronchipretTP

Die Plasmaproben der Pilotstudien wurden mit der unter Absatz 2.4 beschriebenen

Methode analysiert. Zunächst stand die Ermittlung des notwendigen Meßzeitraums

für die geplante Hauptstudie im Vordergrund.

Die Resorption von Thymol fand offenbar in den oberen Darmabschnitten statt, denn

schon nach 10 bis 20 min war Thymolsulfat im Plasma detektierbar. Nach 0,6 bis 3 h

wurden mit 64 bis 109 ng⋅mL-1 maximale Plasmaspiegel erreicht. Wie in Abb. 3.5 und

Abb. 3.6 erkennbar, fand kein rascher Anstieg der Plasmakonzentrationen statt.

Vielmehr stiegen sie langsam an und gingen in eine Plateauphase über, die erst

gegen Ende des Meßzeitraumes langsam abfiel. Die Eliminationsphase des Thymols

bzw. seiner Metabolite wurde offensichtlich in diesem Zeitraum der Probennahme

noch nicht erfaßt. Berechnungen pharmakokinetischer Kenndaten waren auf Grund

des zu kurzen Meßzeitraumes von 3,5 h zu diesem Zeitpunkt deshalb nicht möglich.

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4

Zeit [h]

Cp

[ng. m

L-1]

Proband 1Proband 2Proband 3Proband 4

Abb. 3.5 Individuelle Plasmakonzentrations-Zeitprofile für Thymolsulfat nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP.

3 Ergebnisse 93

01020304050607080

0 1 2 3 4Zeit [h]

Cp

[ng. m

L-1]

Abb. 3.6 Plasmakonzentrations-Zeitprofil (Median, n=4) für Thymolsulfat nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP.

3 Ergebnisse 94

3.2.2 Plasmakonzentrationen nach enzymatischer Spaltung der Konjugate nach therapeutischer Dosierung

Um festzustellen, wie die therapeutische Dosierung (3 x 1 Tablette

BronchipretTP / Tag, 1 Woche lang) die Plasmaspiegel beeinflußte, wurden hier die

Plasmakonzentrations-Zeitprofile im Steady State aufgenommen. 12 Stunden nach

der letzten Tabletteneinnahme konnte Thymol im „0-Wert“ noch mit 35 bzw.

70 ng⋅mL-1 detektiert werden (Abb. 3.7). Nach Einnahme einer weiteren Tablette war

innerhalb der ersten Stunde ein Anstieg der Plasmakonzentrationen zu verzeichnen.

Danach stellten sich Plasmakonzentrationen auf die – wie auch nach Einnahme einer

Tablette beobachtete - Plateauphase ein. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, daß

Thymolsulfat über einen wesentlich längeren, als den bislang beobachteten Zeitraum

im Plasma detektierbar war.

0

2040

6080

100120

140160

0 1 2 3 4Zeit [h]

Cp

[ng. m

L-1]

Proband 1

Proband 2

Abb. 3.7State na
↑
Individuelle Plasmakonzentrations-Zeitprofile für Thymolsulfat im Steady ch Einnahme einer Tablette BronchipretTP. ↑ : erneute Tabletteneinnahme.

3 Ergebnisse 95

3.2.3 Plasmakonzentrationen nach enzymatischer Spaltung der Konjugate -

Einzeldosis BronchipretTP – verlängerter Meßzeitraum

Die Hinweise auf eine lange Eliminationsphase aus den beiden vorhergehenden

Pilotstudien, konnten mit dieser Studie bestätigt werden. Nach 1,8 h wurden mit

58 ng⋅mL-1 maximale Plasmaspiegel erreicht. Es zeigte sich die schon vorher

beobachtete Plateauphase, danach fielen die Plasmaspiegel zunächst rasch ab, um

dann nur noch langsam zu sinken (Abb. 3.8). Die sich aus den letzten 4

Datenpunkten des terminalen, linearen Abschnittes der Kurve ergebende

Halbwertszeit betrug 22,4 h. Thymolsulfat war nach Einnahme einer Tablette bis zu

52 h im Plasma detektierbar. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde der

Beobachtungszeitraum für die Hauptstudie angepaßt und bis t = 72 h ausgedehnt.

0

10

20

30

40

50

60

70

0 10 20 30 40 50 60

Zeit [h]

Cp

[ng. m

L-1]

Abb. 3.8 Plasmakonzentrations-Zeitprofil für Thymolsulfat nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP, 1 Proband.

3 Ergebnisse 96

3.3 Ergebnisse der Hauptstudie


nach Applikation einer Tablette BronchipretTP

Die Plasmaproben der Hauptstudie wurden mit der hierfür entwickelten,

automatisierten und validierten HS-SPME Methode analysiert (s. Absatz 2.8). Von

den ursprünglich 12 Probanden konnten nur 11 zur Auswertung herangezogen

werden. Bei einem Probanden (Proband E) wurden bereits im 0-Wert (Plasma und

Urin) sehr hohe Thymolkonzentrationen festgestellt, so daß dieser bei der

Berechnung von Mittelwerten und Median nicht mit einbezogen wurde.

Nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP wurde Thymol frühzeitig resorbiert.

Bereits nach 20 min war bei 4 Probanden Thymolsulfat detektierbar. Bei 6

Probanden war Thymolsulfat innerhalb von 30 min detektierbar, bei einem

Probanden waren Plasmaspiegel erst 1,5 h nach Tabletteneinnahme detektierbar

(Abb. 3.9). Die Plasmakonzentrations-Zeitprofile waren sehr homogen, was sich

auch in den geringen Standardabweichungen der einzelnen Abnahmezeitpunkte

ausdrückte (Abb. 3.10). Maximale Plasmaspiegel (cmax = 93,1±24,5 ng⋅mL-1) wurden

frühestens nach 50 min erreicht (tmax= 1,97±0,77 h). Danach blieben die

Plasmaspiegel - wie bereits in den Pilotstudien beobachtet - für ca. 2 h auf einer

Plateauphase, um dann zunächst rasch und gegen Ende sehr langsam abzufallen.

Eine Übersicht über die mittleren Plasmakonzentrationen zum jeweiligen

Abnahmezeitpunkt ist in Tab. 3.1 gegeben. Die individuellen Daten jedes Probanden

finden sich im Anhang in Tab. 8.9, Tab. 8.10 und Tab. 8.11. Der kinetische Verlauf

der Plasmakonzentrationen war biphasisch, unterteilt in eine schnellere Verteilungs-

und eine langsamere Eliminationsphase (Abb. 3.10).

3 Ergebnisse 97

0

20

40

60

80

100

120

140

0 5 10 15 20 25 30 35 40Zeit [h]

cp [n

g. mL-1

]

Proband AProband BProband CProband DProband FProband GProband HProband IProband JProband KProband L

Abb. 3.9 Graphische Darstellung der individuellen Plasmakonzentrationen für Thymolsulfat nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP.

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20 25 30 35 40Zeit [h]

Cp

[ng. m

L-1]

MWMedian

Abb. 3.10 Graphische Darstellung der mittleren und medianen Plasma-konzentrationen für Thymolsulfat nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert dar, n=11.

3 Ergebnisse 98

Tab. 3.1 Thymolsulfat-Plasmakonzentrationen der Probanden A-D, F-L, MW=arithmetischer Mittelwert (n=11), SD=Standardabweichung, Min=Minimalwert, Max=Maximalwert, GEO=Geometrisches Mittel.

T [h] MW SD Min Median Max GEO nCp [ng.mL-1] Cp [ng.mL-1] Cp [ng.mL-1] Cp [ng.mL-1] Cp [ng.mL-1] Cp [ng.mL-1]

0 0 0 0 0 0 _ _

0,25 11,85 15,21 0 0 38,72 24,39 50,5 34,52 23,25 0 32,29 76,11 32,29 100,75 53,40 34,62 0 43,97 122,41 51,78 10

1 61,13 38,37 0 55,90 125,82 58,34 101,5 69,41 33,92 6,04 62,42 125,39 56,78 112 82,81 19,82 52,73 90,04 110,87 80,50 11

2,5 82,06 18,98 53,31 79,19 113,87 80,04 113 77,93 17,93 51,76 80,39 104,33 75,95 11

3,5 71,20 19,10 45,26 67,87 107,66 68,95 114 66,41 17,01 43,62 62,06 94,37 64,45 115 55,69 18,23 28,79 55,25 98,16 53,20 116 45,08 14,04 24,17 45,87 66,57 42,91 117 37,67 13,16 24,46 37,01 67,32 35,82 118 34,06 11,83 20,04 30,34 54,51 32,30 119 29,92 10,06 17,20 28,50 48,33 28,42 11

10 27,10 9,25 16,30 23,30 39,67 25,66 1112 22,11 5,35 15,12 22,05 30,65 21,51 1114 20,44 6,14 13,40 18,34 34,54 19,72 1124 11,08 4,07 6,82 10,55 19,13 10,47 1131 4,12 4,14 0 4,96 10,18 7,99 638 2,08 3,70 0 0 10,11 7,41 3

3.3.2 Renale Elimination von Thymol in Form seiner Phase-II-Metabolite

Die Bestimmung des Thymols in Form seiner Phase-II-Metabolite mit intaktem

Thymolgrundgerüst erfolgte nach enzymatischer Spaltung wie in Absatz 2.9

beschrieben.

Bereits nach 24 h konnte Thymolsulfat bzw. Thymolglucuronid nicht mehr im Urin

nachgewiesen werden. Ein Großteil der renal eliminierten Menge wurde bereits

3 Ergebnisse 99

innerhalb der ersten 6 Stunden nach Applikation ausgeschieden (Abb. 3.11).

Individuelle Daten siehe Tab. 8.12 im Anhang.

0

5

10

15

20

25

3 6 9 14 24 31 38

Zeit [h]

% d

er D

osis

Abb. 3.11 Kumulative Urinausscheidung in % der verabreichten Dosis (MW+SD) von Thymol nach enzymatischer Spaltung der Konjugate (n=11).

Da die renale Elimination von Thymol bzw. seiner Konjugate bei allen Probanden

innerhalb der Urinsammelperiode von 31 h abgeschlossen war, konnte somit der

renal eliminierte prozentuale Anteil der verabreichten Dosis bestimmt werden. Der

mittlere, renal eliminierte prozentuale Anteil der Dosis mit intaktem

Thymolgrundgerüst betrug durchschnittlich 16,2 %. Die individuellen prozentualen,

renal eliminierten Anteile sind in Tab. 3.2 dargestellt.

Tab. 3.2 Renale Elimination von Thymol (in Form seiner Phase-II-Konjugate) in Prozent der applizierten Dosis (1,08 mg Thymol). MW=arithmetischer Mittelwert (n=11), SD=Standardabweichung, Min=Minimalwert, Max=Maximalwert, GEO=Geo-metrisches Mittel.

A B C D E F G H I J K L MW SD Min Median Max GEO n

20,24 23,83 14,97 13,33 30,64 12,28 24,06 12,38 17,24 13,02 13,45 13,45 16,20 4,50 12,28 13,45 24,06 15,70 11

Proband

3 Ergebnisse 100

Pharmakokinetische Auswertung der Thymolkonzentrationen im Plasma nach

enzymatischer Spaltung der Konjugate

Basierend auf dem Ergebnis, daß Thymol im systemischen Kreislauf nur in Form

seines Phase-II-Metaboliten Thymolsulfat zirkulierte, wurde der nach enzymatischer

Hydrolyse des Plasma erhaltene Thymolgehalt zur pharmakokinetischen Auswertung

herangezogen.

Thymolsulfat-Plasmakonzentrationen konnten bei allen Probanden über einen

Zeitraum von mindestens 24 h bestimmt werden. Um die Eliminationsphase so exakt

wie möglich bestimmen zu können, wurden Peaks, die zwar unterhalb der

Bestimmungsgrenze von 8,1 ng⋅mL-1 lagen, aber dennoch detektiert werden konnten,

mit einbezogen. Jeweils der Wert, der zum ersten Mal unter dem LOQ von

8,1 ng⋅mL-1 lag, wurde als letzter Meßwert berücksichtigt.

3.3.3 Pharmakokinetik in Nichtkompartiment-Modellen

Die pharmakokinetischen Parameter der Nichtkompartiment-Analyse sind in Tab. 3.3

dargestellt. Die jeweiligen individuellen Plasmakonzentrations-Zeitprofile sind im

Anhang in Abb. 8.10 dargestellt, die entsprechenden Daten dazu in Tab. 8.13.

3 Ergebnisse 101

Tab. 3.3 Pharmakokinetische Parameter der Nichtkompartiment-Analyse (Definition der Parameter in Absatz 2.11.1); MW=Mittelwert (n=11), SD=Standardabweichung, Min=Minimalwert, Max=Maximalwert, GEO=Geometrisches Mittel.

MW SD Min Median Max GEO n

cmax [ng/mL] 93,11 24,47 55,90 99,01 125,82 90,04 11

tmax [h] 1,97 0,77 0,80 2,03 3,13 1,81 11

ke [1/h] 0,069 0,009 0,054 0,070 0,084 0,069 11

t1/2 [h] 10,2 1,4 8,3 9,9 12,9 10,1 11

AUCcum [ng*h/mL] 837,3 278,5 456,7 835,8 1281,6 793,6 11

AUClast [ng*h/mL] 96,4 19,2 46,2 98,1 118,1 94,1 11

AUCtot [ng*h/mL] 963,5 274,1 608,6 943,8 1341,3 928,1 11

%AUClast 10,6 3,2 5,8 9,9 15,9 10,1 11

AUMCcum [h2*ng/mL] 7478,0 4246,1 2694,4 6626,9 15797,8 6435,0 11

AUMClast [h2*ng/mL] 4300,0 1125,3 2012,4 4294,6 6491,9 4146,0 11

AUMCtot [h2*ng/mL] 12062,0 3831,3 7965,7 10850,1 19808,9 11553,5 11

MRTabs [h] 12,6 2,1 8,1 12,5 15,2 12,4 11

solver tmax [h] 1,83 0,07 1,71 1,84 1,91 1,82 11

ka [1/h] 1,89 0,14 1,70 1,85 2,17 1,88 11

MAT [h] 0,53 0,04 0,46 0,54 0,59 0,53 11

MRTiv [h] 12,1 2,1 7,5 12,0 14,7 11,9 11

Dose [mg] 1,08

CLtot/f [L/h] 1,21 0,35 0,81 1,14 1,77 1,16 11

Vdss/f [L] 14,72 5,09 6,05 13,85 23,29 13,85 11

Vd area/f [L] 17,70 5,64 10,81 17,16 29,51 16,95 11

3.3.4 Pharmakokinetik in Kompartiment-Modellen

Die individuellen Plasmakonzentrations-Zeitkurven von Thymol wurden an ein

Zweikompartiment-Modell angepaßt. Nur die Plasmakonzentrations-Zeitkurve von

Proband L ließ sich besser mit einem Einkompartiment-Modell beschreiben. Die

Mittelwerte und Mediane der Plasmakonzentrationen wurden ebenfalls an ein

Zweikompartiment-Modell angepasst (Abb. 3.12 und Abb. 3.13). Die entsprechenden

3 Ergebnisse 102

Fits mit den dazugehörigen Ergebnissen finden sich im Anhang in Abb. 8.11 bzw.

Tab. 8.14.

Abb. 3.12 Graphische Darstellung des Fittings des Mittelwertes der Thymolsulfat- Plasmakonzentrationen.

Abb. 3.13 Graphische Darstellung des Fittings des Medians der Thymolsulfat- Plasmakonzentrationen .

3 Ergebnisse 103

Tab. 3.4 Pharmakokinetische Parameter der Kompartiment-Analyse (Definition der Parameter siehe Absatz 2.11.2) nach Anpassung des Mittelwertes und des Medianes an ein Zweikompartiment-Modell.

Mean Median

dose mg 1,08 1,08

ka [1/h] 0,69 0,62Tlag [h] 0,15 0,23Vc [L] 6,21 5,90ke [1/h] 0,21 0,22k12 [1/h] 0,27 0,24k21 [1/h] 0,28 0,17AUC [ng*h/mL] 813,19 824,95

AUMC [h2*ng/mL] 8628,61 10322,90MRT [h] 9,02 10,66

Lz [1/h] 0,09 0,07Cmax calc [ng/mL] 79,81 79,84tmax calc [h] 2,08 2,25

A [ng/mL] 117,21 145,41Alpha [1/h] 0,67 0,56

B [ng/mL] 56,58 37,47Beta [1/h] 0,09 0,07t ½ ka [h] 1,00 1,13

tabs [h] 4,99 5,63t ½ alpha [h] 1,04 1,24t ½ beta [h] 7,82 10,45t ½ Lz [h] 7,82 10,45t ½ ke [h] 3,24 3,13

Vz [L] 14,98 19,74

Cl [L/h] 1,33 1,31

Conc. Unit [ng/mL]

3 Ergebnisse 104

3.4 Pharmakokinetische Auswertung der Thymolkonzentrationen im Urin nach enzymatischer Spaltung der Konjugate

Wie in Absatz 3.3.2 gezeigt, wurde der Urin solange gesammelt, bis keine Thymol-

Konjugate mehr im Urin nachgewiesen werden konnte. Dies ermöglichte die

Berechnung verschiedener pharmakokinetischer Parameter an Hand der Urindaten.

Da U∞ bekannt war, ergab sich aus der Gleichung U U (1 e )tket= ⋅ −∞

− ⋅ durch

Umformen die folgende Gleichung (DERENDORF und GARRETT, 1987):

log(U Ut) logUk

2,303t

e∞ ∞− = −

Die graphische Darstellung dieser Gleichung bezeichnet man als Sigma-Minus-Plot.

In Abb. 8.12 sind die Sigma-Minus-Plots für die renale Elimination von Thymol

dargestellt. Die Eliminationshalbwertszeit wurde analog zu den Plasma-

konzentrations-Zeitkurven aus der jeweiligen Steigung der Geraden während der

terminalen Eliminationsphase ermittelt (Tab. 3.5).

Zur Bestimmung der renalen Clearance wurde die kumulative Thymolmenge (nach

enzymatischer Spaltung der Konjugate) im Urin (Ut cum) gegen die jeweilige

kumulative Fläche unter der Plasmaspiegelkurve (AUCt cum) aufgetragen. Die renale

Clearance wurde aus der Steigung der resultierenden Geraden ermittelt. Die

jeweiligen Plots finden sich im Anhang (Abb. 8.13). Die Ergebnisse sind in Tab. 3.6

dargestellt.

3 Ergebnisse 105

Tab. 3.5 Bestimmung der Eliminationshalbwertszeit aus den

jeweiligen Sigma-Minus-Plots. MW=Mittelwert (n=11),

SD=Standardabweichung, Min=Minimalwert, Max=Maximalwert,

GEO=Geometrisches Mittel.

Tab. 3.6 Bestimmung der renalen Clearance aus den jeweiligen Clearance-

Plots. MW=Mittelwert (n=11), SD=Standardabweichung,

Min=Minimalwert, Max=Maximalwert, GEO=Geometrisches Mittel.

Proband t1/2 [h]

A 5,83B 4,15C 3,89D 4,85E 5,54F 6,83G 5,33H 4,36I 3,80J 2,50K 3,78L 2,85

MW 4,38SD 1,27Min 2,50

Median 4,15Max 6,83GEO 4,21

n 11

Proband Cl ren [L/h]

A 0,321B 0,633C 0,148E 0,115D 0,209F 0,246G 0,493H 0,144I 0,200J 0,240K 0,181L 0,160

MW 0,271SD 0,156Min 0,144

Median 0,209Max 0,633GEO 0,240

n 11

4 Diskussion 106

4 Diskussion

4.1 Analytische Methoden

Da bei einer verabreichten Dosis von ca. 1 mg Thymol mit Plasmakonzentrationen im

unteren Nanogramm-Bereich zu rechnen war, waren entsprechend empfindliche und

selektive Verfahren notwendig, um Thymol nach internationalen Anforderungen an

die Validierung pharmakokinetischer Studien in biologischen Matrices quantifizieren

zu können.

Bei den in der Literatur beschriebenen analytischen Methoden zur Quantifizierung

von Komponenten Ätherischer Öle aus biologischen Matrices, wurde eine

Bestimmungsgrenze im unteren Nanogrammbereich nur durch aufwendige

Probenaufarbeitung erreicht, die aber für den Einsatz in der Routineanalytik

ungeeignet war. Die Headspace-Festphasenmikroextraktion stellte das Verfahren der

Wahl dar, da sie Probenaufarbeitung, Anreicherung und Probenaufgabe in einem

einzigen Schritt ermöglichte. Gekoppelt mit anschließender gaschromatographischer

Trennung und Detektion mittels FID, stand so ein ausreichend sensitives Meßsystem

zur Verfügung.

Auch im Hinblick auf die Entwicklung weiterer Methoden zur Durchführung von

Bioverfügbarkeits- bzw. pharmakokinetischen Studien wäre ein selektiveres

Meßsystem wie beispielsweise GC-MS bzw. LC-MS/MS wünschenswert gewesen.

Dadurch könnten vorhandene Metabolite bzw. im „Vielstoffgemisch Phyto-

pharmakon“ vorhandene Verbindungen untergeordneter Bedeutung ebenfalls

detektiert werden. Jedoch sind derartige Geräte auf Grund ihrer Kostenintensität

bislang nicht für die Routineanalytik zugänglich. Die durch den FID eingeschränkte

Selektivität bei der Durchführung der Routinemessungen wurde sowohl für Plasma

als auch für Urin durch die Strukturabsicherung per GC-MS ausgeglichen. Die

Identifizierung der Phase-II-Metabolite erfolgte ebenfalls exemplarisch per LC-

MS/MS.

Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Methoden zur Bestimmung von Thymol in

Plasma und Urin konnten nur durch die Automatisierung des Verfahrens nach

Entwürfen für internationale Richtlinien zur Validierung bioanalytischer Methoden

validiert werden (BIOANALYTICAL METHODS VALIDATION, 1998). Dies zeigte der

4 Diskussion 107

Vergleich mit der für die Pilotstudien entwickelten manuellen HS-SPME Methode, die

in Bezug auf die Parameter Präzision und Richtigkeit insuffizient war. Durch die

Automatisierung war eine bessere Einhaltung der Methodenparameter wie

Expositionszeit, Temperatur und Rühren gegeben, außerdem wurde so ein hoher

Durchsatz für die im Rahmen der Studie anfallenden Proben ermöglicht. Mit den

bislang kommerziell erhältlichen HS-SPME Geräten war jedoch nur das Schütteln

der Probe und nicht das Rühren möglich. Schütteln der Probe mit hoher Frequenz

war nur vor der Faserexposition möglich, wohingegen während der Exposition nur

mit geringer Frequenz geschüttelt werden konnte. Dies bedeutete jedoch eine

inakzeptable Verlängerung der Expositionszeit. Außerdem spritzte während des

Schüttelns Probenmaterial auf die Faser, was wiederum die Wiederfindung und die

Lebensdauer der Fasern erheblich beeinträchtigte. Insofern war also nur eine

ungenügende Anpassung der HS-SPME Parameter möglich, weshalb ein

zusätzliches Gerät (Magnet Mixer/Heater) entwickelt wurde, welches gleichzeitiges

Heizen und Rühren der Probe ermöglichte.

Daß die zur Routineanalytik entwickelte, automatisierte Methode schließlich zur

Durchführung der pharmakokinetischen Studie geeignet war, wurde durch das

Erfüllen der Validierungskriterien deutlich. Die Linearität der Methoden konnte sowohl

für die Plasma- als auch für die Urinanalytik im jeweiligen Arbeitsbereich gezeigt

werden. Die Expositionszeit der Fasern von 25 bzw. 35 min bis zum Erreichen des

Gleichgewichtszustandes lag in einem vernünftigen zeitlichen Rahmen, wenn man

berücksichtigt, daß die chromatographische Trennung ohnehin 55 min in Anspruch

nahm. Zur Bestimmung der Richtigkeit und Präzision wurde an jedem Tag jeweils

eine neue Faser eingesetzt, so daß man von einer inter-Faser Präzision sprechen

kann, wobei die „between-day precision“ trotzdem noch < 20 % bei der geringsten

getesteten Konzentration war. Die Peakflächen variierten z.T. erheblich zwischen

den einzelnen Fasern, obwohl diese derselben Charge entstammten. Deshalb wurde

jede neu verwendete Faser separat kalibriert. Die „between-day precision“ von knapp

20 % bei der geringsten Konzentration des Arbeitsbereiches konnte somit als

Hinweis auf die Bestimmungsgrenze bei dieser Konzentration angesehen werden.

Die geringe Wiederfindung von nur 5 % für die Bestimmung aus Plasma war evtl.

zum Teil auf den Zusatz des Enzyms zurückzuführen, welches für die Spaltung der

4 Diskussion 108

Phase-II-Konjugate unabdingbar war. Nach Zusatz des Enzyms war – während der

Validierung in mit Thymol versetzten Plasmaproben - eine erhebliche Abnahme der

Thymolpeakflächen zu beobachten, im Vergleich zu Proben ohne Enzymzusatz.

Dieser Effekt hätte unter Umständen ohne Ansäuern und Erhitzen gravierender

ausfallen können. Für Lidocain, das bei pH 9,5 zu 74 % an Plasmaproteine

gebunden war, wurde gezeigt, daß die Wiederfindung durch Ansäuern bedeutend

verbessert werden konnte (KOSTER et al., 2000). Auch in früheren Untersuchungen

konnte festgestellt werden, daß die hohe Proteinbindung von Antidepressiva und

Clozapin der limitierende Faktor für die Geschwindigkeit der Gleichgewichts-

einstellung und die Wiederfindung darstellte (ULRICH und MARTENS, 1997; ULRICH et

al., 1999). Durch Ansäuern < pH 1 und gleichzeitiges Erhitzen dürfte die

Plasmaproteinbindung zu einem erheblichen Teil reduziert worden sein.

Daß eine geringe Wiederfindung nicht notwendigerweise eine schlechte Präzision

zur Folge hat, zeigte der Vergleich der Validierungsparameter zu Präzision und

Richtigkeit von Plasma- und Urinanalytik. Obwohl sich der Einfluß der Matrix in

Bezug auf die Anwesenheit von Fetten und Proteinen im Plasma deutlich auf die

Wiederfindung auswirkte, (Wiederfindung aus Urin 16 %, aus Plasma 5 %)

unterschieden sich die Werte für Präzision und Richtigkeit nicht wesentlich.

Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit validierten automatisierten HS-SPME

Methoden erwiesen sich somit als geeignet zur routinemäßigen Analytik von Thymol

aus Plasma und Urin.

4 Diskussion 109

4.2 Metabolismus und Pharmakokinetik von Thymol

4.2.1 Metabolismus

Plasma

Im Plasma konnte nach Verabreichung einer Tablette Bronchipret®TP nur

Thymolsulfat detektiert werden. Selbst nach einmaliger Einnahme von 10 Tabletten

konnte kein Thymolglucuronid nachgewiesen werden. Auch die Untersuchung der

Meßzeitpunkte t=0 bis t=5 h auf Thymolglucuronid waren negativ. Ähnliches wurde

auch für das Phenol Creosol beobachtet. Nach oraler Verabreichung einer Mischung

aus Phenol, Guaiacol, p-Cresol und Creosol (je 15-32 mg) an Menschen, wurde für

Creosol ebenfalls die Bildung nur eines Phase-II-Metaboliten, nämlich des

Glucuronides beobachtet, während die anderen Verbindungen sowohl das Sulfat als

auch das Glucuronid bildeten (OGATA et al., 1995).

In Plasma, das mit enzymatisch synthetisiertem Thymolglucuronid versetzt und mit

derselben Methode aufgerbeitet wurde, war Thymolglucuronid jedoch detektierbar,

was darauf hindeutete, daß die verwendete Methode zur Bestimmung von

Thymolglucuronid im Plasma ausreichend selektiv war. Sollte das Plasma tatsächlich

Thymolglucuronid enthalten haben, das einer Bestimmung entgangen war, wäre

zumindest nach Einnahme von 10 Tabletten mit der Detektion des Glucuronides mit

der sehr sensitiven LC-MS/MS Methodik zu rechnen gewesen.

Die Abwesenheit des Thymolglucuronides könnte durch eine wesentlich höhere

Enzymaktivität hepatischer Sulfotransferase im Vergleich zu UDP-

Glucuronyltransferase zu erklären sein. In diesem Fall würden Sulfatierung und

Glucuronidierung konkurrieren und nur nach Verabreichung extrem höherer Dosen

würde Glucuronid gebildet werden (OGATA et al., 1995).

Freies Thymol wurde im Plasma nicht detektiert. Dies steht im Einklang mit den

Untersuchungen von Ogata et al., die trotz der erheblich höheren verabreichten

Dosen nur sehr geringe Mengen unkonjugierter Phenole im Plasma nachweisen

konnten (< 4 % von Cmax) (OGATA et al., 1995). Die vorliegenden Ergebnisse

belegen, daß nach Einnahme von BronchipretTP nicht Thymol, sondern

ausschließlich dessen Phase-II-Metabolit Thymolsulfat bioverfügbar war.

4 Diskussion 110

Urin

Im Urin konnte sowohl Thymolglucuronid als auch -sulfat bestimmt werden. Dies

bestätigte die Ergebnisse einer anderen Arbeitsgruppe. Nach oraler Applikation von

Thymol wurden sowohl im Urin von Menschen als auch im Urin von Ratten beide

Metabolite detektiert (TAKADA et al., 1979). Jedoch wurden diese Untersuchungen

ohne Strukturabsicherung per MS durchgeführt.

Für Phenol, i.v. an Mäuse verabreicht, wurden im Urin ebenfalls beide Phase-II-

Metabolite detektiert, mit Phenolsulfat als Hauptmetabolit. Mit steigender Dosis

verschob sich das Verhältnis von Sulfat zu Gunsten des Glucuronides (KENYON et al.,

1995). Auch für Phenol, Guaiacol, p-Cresol und Creosol wurde die Existenz beider

Phase-II-Metabolite im Urin bestätigt. Für alle Verbindungen wurde das Glucuronid

und mit Ausnahme des Creosols, das Sulfat detektiert (OGATA et al., 1995). Das

Verhältnis der Peakintensität von Thymolglucuronid zu -sulfat blieb zwischen den

verschiedenen Sammelintervallen konstant.

Freies Thymol wurde auch im Urin nicht detektiert. Nach oraler Applikation einer

wesentlich höheren Dosis des strukturell ähnlichen Menthols (500 mg), konnte

ebenfalls kein freies Menthol nachgewiesen werden (BELL et al., 1981). Weitere, mit

Menthol durchgeführte Studien konzentrierten sich auf die gesamte, mit

unverändertem Mentholgrundgerüst renal eliminierte Menge nach enzymatischer

Spaltung, so daß in diesem Punkt keine Vergleiche angestellt werden konnten

(SOMERVILLE et al., 1984; KAFFENBERGER und DOYLE, 1990). Unkonjugiertes Phenol,

Guaiacol, p-Cresol und Creosol wurden im Urin nur in geringen Mengen gefunden,

obwohl die verabreichten Dosen z.T. das 30fache der verabreichten Thymoldosis

betrugen (OGATA et al., 1995).

Die vorliegenden Daten zeigen, daß Thymolglucuronid trotz seiner Abwesenheit im

Plasma renal eliminiert wurde. Auch für andere Verbindungen (z.B. Probenecid)

konnte die Präsenz eines Metaboliten im Urin belegt werden, obwohl dieser im

Plasma nicht nachgewiesen werden konnte (VREE et al., 1992; VREE et al., 1993).

Im Falle des Thymols könnte Thymolsulfat im Nierengewebe durch die Aktivität von

Arylsulfatasen, die u.a. für menschliches Nierengewebe beschrieben wurde (MUNROE

und CHANG, 1987), gespalten werden. Darüber hinaus könnte Thymolsulfat

glomerulär filtriert, durch im Urin aktive Arylsulfatasen (CAVALLINI et al., 1980)

4 Diskussion 111

gespalten und im proximalen Tubulus rückresorbiert werden. Somit könnte durch

UDP-Glucuronyltransferasen die Glucuronidierung im Nierengewebe bzw. -epithel

erfolgen und Thymolglucuronid könnte durch die vielfältigen zur Verfügung

stehenden Transportmechanismen erneut in den proximalen Tubulus sezerniert

werden (DEKANT, 2001).

Obwohl die Leber als wichtigstes Organ bei der Biotransformation angesehen wird,

konnte an Hand von Modellsubstanzen gezeigt werden, daß Nierenmikrosomen

Glucuronyltransferaseaktivität besitzen (BRUNELLE und VERBEECK, 1996), bzw. sogar

einen wesentlich effizienteren Beitrag zur Glucuronidierung leisten als beispielsweise

Lebermikrosomen oder Mikrosomen der Darmschleimhaut (BRUNELLE und VERBEECK,

1996; SHIPKOVA et al., 2001). Die Glucuronidierung in der Niere wurde auch für

Morphin (MAZOIT et al., 1990) und für das dem Thymol strukturell sehr ähnliche

Propofol beobachtet (RAOOF et al., 1996). Außerdem konnte die Glucuronidierung

von Paracetamol (HART et al., 1980), 1-Naphtol (REDEGELD et al., 1988) und 4-

Dimethylaminophenol (ELBERS et al., 1980) mit Hilfe der perfundierten Rattenniere

nachgewiesen werden. Darüber hinaus konnte auch eine unterschiedliche Aktivität

von UDP-Glucuronyltransferasen verschiedener Gewebe gezeigt werden (SHIPKOVA

et al., 2001). Für den o.g. Mechanismus würde auch das in der vorliegenden Arbeit

beobachtete, über die Zeit hinweg konstant bleibende Verhältnis von renal

eliminiertem Glucuronid und Sulfat sprechen.

4 Diskussion 112

4.2.2 Pharmakokinetik

Da im Plasma nur Thymolsulfat nachweisbar war, war die Berechnung der

pharmakokinetischen Parameter an Hand der sich nach enzymatischer Hydrolyse

der Plasmaproben ergebenden Plasmakonzentrations-Zeitverläufe gerechtfertigt.

Pilotstudien

Die Pilotstudien dienten in erster Linie der Bestimmung des Meßzeitraumes und der

Meßabstände für die Hauptstudie sowie der Entwicklung der Plasmaanalytik. Die

entwickelte Probenaufarbeitung erlaubte die Bestimmung von Thymol nach oraler

Applikation einer Tablette Bronchipret®TP nach enzymatischer Spaltung von

Thymolsulfat. Im Rahmen der Validierung dieser Methode stellte sich jedoch auf

Grund der Unzulänglichkeit der Parameter für Präzision und Richtigkeit heraus, daß

die Hauptstudie nur durch die Übertragung der Methode auf einen Autosampler

durchführbar war.

Bereits in den ersten beiden Pilotstudien zeichnete sich ab, daß Thymol (nach

enzymatischer Spaltung) wesentlich länger im Plasma detektierbar war als andere

Ätherisch-Öl-Verbindungen nach oraler Applikation (ZIMMERMANN et al., 1995;

LANGENECKERT, 1998). Im Zuge der dritten Pilotstudie wurden schließlich solange

Plasmaproben genommen, bis nach 48 h kaum noch Thymol detektierbar war.

Die exakte Erfassung der Eliminationsphase war für die Berechnung

pharmakokinetischer Parameter von großer Bedeutung. Um die Eliminationsphase

aller Probanden vollständig erfassen zu können, wurde auf Grund der Datenlage der

Pilotstudien für die Hauptstudie ein Meßzeitraum von 72 h festgelegt.

Hauptstudie

Die Plasmakonzentrations-Zeitverläufe waren sehr konsistent. Thymol wurde

offensichtlich frühzeitig resorbiert, was auch in der MAT von 0,5 h zum Ausdruck

kam. Dies deutete darauf hin, daß die Verbindungen hauptsächlich in den oberen

Darmabschnitten aufgenommen wurden. Dies wurde auch durch Versuche mit

Ileostomiepatienten bestätigt. Im Vergleich zu gesunden Probanden war die mit dem

Urin ausgeschiedene Mentholmenge bei den Ileostomiepatienten nur um 11 %

4 Diskussion 113

geringer (SOMERVILLE et al., 1984). Nach oraler Gabe von 1,8-Cineol und α-Pinen

waren die Verbindungen ebenfalls nach 10-30 min im Plasma detektierbar

(ZIMMERMANN et al., 1995; LANGENECKERT, 1998). Die geringe Molekülgröße, sowie

die lipophilen Eigenschaften der Ätherisch-Öl-Komponenten, dürften die Resorption

begünstigt haben.

Maximale mittlere Plasmakonzentrationen von 93,1 ng⋅mL-1 wurden nach 1,97 h

erreicht. Diese Werte waren vergleichbar mit denen anderer Ätherisch-Öl-

Komponenten nach oraler Applikation. 1,8-Cineol erreichte Cmax nach 1,25

(LANGENECKERT, 1998) bzw. 0,7 h und α-Pinen nach 1,75 h (ZIMMERMANN et al., 1995;

LANGENECKERT, 1998). Thymol konnte im Plasma über einen Zeitraum von 24 bis

38 h nach Applikation nachgewiesen werden. Andere Ätherisch-Öl-Komponenten,

oral appliziert, waren nach wesentlich kürzerer Zeit im Plasma nicht mehr

detektierbar (ZIMMERMANN et al., 1995; LANGENECKERT, 1998). Die lange

Verweildauer des Thymolsulfates drückte sich auch in der Eliminationshalbwertszeit

von 10,2 h aus. Hierfür fanden sich in der Literatur keine vergleichbaren Werte.

Andere Ätherisch-Öl-Komponenten wie α-Pinen und 1,8-Cineol sowie die von Ogata

et al. untersuchten Phase-II-Metabolite der verabreichten Phenole zeigten wesentlich

kürzere Eliminationhalbwertszeiten von 0,8 bis 5,8 h (OGATA et al., 1995;

ZIMMERMANN et al., 1995; LANGENECKERT, 1998).

Die langsame Ausscheidung des Thymols spiegelte sich ebenfalls in der geringen

Gesamtkörperclearance unter Berücksichtigung des bioverfügbaren Anteils (Cltot/f)

von nur 1,21 l⋅h-1 wider. Sie konnte je nach Bioverfügbarkeit zwischen 0,19

(mindestens 16 % des applizierten Thymols wurden resorbiert) und 1,21 l⋅h-1 (100 %

Bioverfügbarkeit) betragen. Das Verteilungsvolumen unter Berücksichtigung des

bioverfügbaren Anteils im Steady State (Vdss/f) bzw. im Pseudo Steady State

(Vdarea/f) war mit 14,7 bzw. 17,7 L ebenfalls klein und deutete darauf hin, daß die

Verbindungen bevorzugt im Extrazellulärraum vorlagen. Je nach bioverfügbarem

Anteil (16 % bzw. 100 %) resultierten Werte zwischen 2,2 und 14,7 bzw. 2,65 und

17,7 L. Ein Verteilungsvolumen von 2 L war jedoch extrem unwahrscheinlich, da das

bedeuten würde, daß die Substanz ausschließlich im Plasma vorlag, was aber durch

das biphasische Eliminationsprofil nicht bestätigt werden konnte. Deshalb war eine

Resorption von weit mehr als 16 % anzunehmen.

4 Diskussion 114

Für α-Pinen wurde nach dermaler Applikation eine Clearance von 14186 l⋅h-1

berechnet. Das Verteilungsvolumen/bioverfügbarer Anteil betrug 8425 L (SCHUSTER

et al., 1986). Damit schien sich α-Pinen - im Gegensatz zu Thymolsulfat - bevorzugt

im Gewebe aufzuhalten. Für die strukturell sehr ähnlichen Phase-II-Metabolite

(Glucuronid/Sulfat) von Phenol, Guaiacol und p-Cresol wurden Verteilungs-

volumina/bioverfügbarem Anteil (Vdarea/f) von 185/130, 100/396 und 58/74 L

bestimmt. Die Gesamtkörperclearance betrug 47/45, 33/108 und 33/61 L⋅h-1. Diese

Parameter deuteten darauf hin, daß sich diese Verbindungen ebenfalls bevorzugt im

Extrazellulärraum aufhielten und rasch eliminiert wurden. Die Verbindungen konnten

bis maximal 8 h nach Applikation im Plasma nachgewiesen werden.

Die individuellen Plasmakonzentrations-Zeitkurven wurden an ein Zweikom-

partiment-Modell angepaßt. Nur die Plasmakonzentrations-Zeitkurve eines

Probanden ließ sich besser mit einem Einkompartiment-Modell beschreiben. Ein

biphasischer Verlauf, unterteilt in eine Verteilungs- und Eliminationsphase, ließ sich

auch für die meisten anderen Ätherisch-Öl-Komponenten beobachten (KLEINSCHMIDT

et al., 1985; SCHUSTER et al., 1986; FALK und HAGBERG, 1990; JAGER et al., 1996).

Die Bestimmung des Anteils an renal eliminiertem Thymol erfolgte nach

enzymatischer Spaltung der Phase-II-Konjugate. Bereits nach 24 h konnten keine

Phase-II-Metabolite mehr im Urin nachgewiesen werden. Ein Großteil der renal

eliminierten Menge wurde bereits innerhalb der ersten 6 Stunden nach Applikation

ausgeschieden. Da die renale Elimination der Thymolkonjugate bei allen Probanden

innerhalb der Urinsammelperiode von 31 h abgeschlossen war, konnte somit der

renal eliminierte prozentuale Anteil der verabreichten Dosis bestimmt werden. Der

mittlere, renal eliminierte prozentuale Anteil der Dosis mit intaktem

Thymolgrundgerüst betrug 16,2 ± 4,5 % (MW±SD). Für die strukturell ähnlichen

Verbindungen Phenol, Guaiacol, p-Cresol und Creosol lag der mit unverändertem

Grundgerüst renal ausgeschiedene Anteil bei 45 bis 100 % der verabreichten Dosis,

wovon der Hauptanteil bereits 2 h nach Applikation eliminiert wurde (OGATA et al.,

1995). Für Menthol lag der renal eliminierte Anteil mit 35 bis 80 % ebenfalls

wesentlich höher, jedoch wurde der Großteil der renal eliminierten Menge ebenfalls

bereits nach 6 h ausgeschieden (BELL et al., 1981; SOMERVILLE et al., 1984;

KAFFENBERGER und DOYLE, 1990; LANGENECKERT, 1998).

4 Diskussion 115

Untersuchungen von Austgulen et al. zum Phase-I-Metabolismus von Thymol in

Rattenurin zeigten die Bildung von 6 verschiedenen Phase-I-Metaboliten (AUSTGULEN

et al., 1987). Sollten ähnliche Verbindungen im Menschen gebildet werden, könnte

dadurch die vergleichsweise geringe Ausscheidungsrate an Thymol mit intaktem

Grundgerüst von 16 % erklärt werden. Ein anderer Grund für die wesentlich größeren

Ausscheidungsraten der strukturell ähnlichen Verbindungen könnte in der Dosis

begründet sein. Da Menthol und die anderen Phenole in erheblich höheren Dosen

verabreicht wurden, waren evtl. die Phase-I-Enzyme gesättigt, so daß die

Metabolisierung bei höherer Dosierung durch Konjugation übernommen wurde.

Die aus den Urindaten mit Hilfe des Sigma-Minus-Plots berechnete mittlere

Halbwertszeit von 4,38 h stimmte nicht mit der aus den Plasmakonzentrationen

ermittelten terminalen Halbwertszeit von 10,2 h überein. Dies könnte eventuell darauf

zurückzuführen sein, daß geringe, nach 24 h noch ausgeschiedene Mengen

Thymolsulfat bzw. Thymolglucuronid durch die Analytik nicht mehr erfaßt wurden und

somit aus den Sigma-Minus-Plots zu große Eliminationskonstanten ermittelt wurden.

Diese Annahme wurde durch den flachen Plasmakonzentrationsverlauf im hinteren

Bereich unterstützt.

Die mittlere renale Clearance betrug 0,271 L⋅h-1. Diese geringe renale

Ausscheidungsrate könnte auf eine hohe Proteinbindung oder durch die

Rückresorption der Verbindung in der Niere zurückzuführen sein. Aufgrund der

Verweildauer und einem schwach sauren pH-Wert könnten vor allem in der Blase

Konjugate gespalten werden und resorbierbare Verbindungen freigesetzt werden

(FORTH et al., 1993). Durch einen Konzentrationsgradienten würde die Verbindung im

proximalen Tubulus wieder rückresorbiert. Die biliäre Exkretion und ein damit

verbundener enterohepatischer Kreislauf schien für die Phase-II-Metabolite des

Thymols unwahrscheinlich, da erst Moleküle > 500-700 g/mol über die Galle

ausgeschieden werden (FORTH et al., 1993).

4 Diskussion 116

4.2.3 Beurteilung der potentiellen Wirksamkeit

Da Thymol in humanem Plasma nur in Form seines Phase-II-Metaboliten

Thymolsulfat nachzuweisen war, würde also nach dem bisherigen Kenntnisstand

eine pharmakologische Wirkung in vivo nach Einnahme von Thymianextrakt u.a.

durch die o.g. Verbindung hervorgerufen werden. Die Eliminationshalbwertszeit des

Thymolsulfates von 10 h würde bei therapeutischer Dosierung von BronchipretTP

(3x1/d) zunächst zu einer Akkumulation und dann zu Steady-State-Konzentrationen

führen, die eine Wirksamkeit erklären könnten. Unter Berücksichtigung der langen

Eliminationsphase sollte das Dosierungsschema überdacht werden, um die Dosis

bzw. die Dosierintervalle den Plasmaspiegeln entsprechend anzupassen.

Die pharmakodynamische Wirkung des Thymolsulfates ist bislang noch nicht

untersucht worden. Anhand des vorliegenden Datenmaterials können also die in vitro

mit Thymianöl bzw. Thymianextrakt beobachteten Wirkungen nicht ohne weiteres auf

die in den klinischen Studien beobachtete Wirksamkeit übertragen werden (KNOLS et

al., 1994, ERNST et al., 1997). Möglicherweise wirken einzelne Komponenten des

„Vielstoffgemisches Phytopharmakon“ synergistisch, wie es vielfach in der

Phytotherapie beobachtet wird. Besonderes Augenmerk gilt dabei den ebenfalls im

Thymianextrakt enthaltenen Flavonoiden.

Um die klinische Wirksamkeit auf Basis der antiphlogistischen, sekretolytsischen,

antibakteriellen und antiviralen Wirkung von Thymianextrakt bzw. Thymol, das ja mit

bis zu 70 % den Hauptbestandteil des Ätherischen Thymianöls darstellt (CZYGAN und

HÄNSEL, 1993), zu erklären, wäre auch die enzymatische Freisetzung des Thymols

aus Thymolsulfat durch Sulfatasen denkbar. Die Aktivität von Sulfatasen im

menschlichen Lungengewebe wurde an Hand von Modellsubstanzen gezeigt

(TOUSSAINT et al., 1993) und könnte damit erklären, daß Thymol trotz der

Abwesenheit unkonjugierten Thymols im Plasma zu einem gewissen Teil auch

pulmonal eliminiert wurde (BISCHOFF, 2000). Darüber hinaus wäre auch die Spaltung

des Thymolsulfates durch Sulfatasen in anderen Geweben denkbar, so daß das frei

werdende Thymol in die Zellen aufgenommen würde. Somit wäre unkonjugiertes

Thymol zwar im Plasma nicht nachweisbar, jedoch könnte es auf diesem Wege

trotzdem am jeweiligen Zielorgan pharmakodynamische Wirkungen zeigen.

4 Diskussion 117

Die Elimination von Thymol erfolgte einerseits renal in Form seiner Phase-II-

Konjugate, andererseits konnte auch die pulmonale Elimination geringer Mengen

Thymols nachgewiesen werden (BISCHOFF, 2000). Die dermale Elimination erschien

auf Grund der Lipophilie und der Molekülgröße des Thymols ebenfalls wahrscheinlich

und ein gewisser Anteil könnte auch mit der Faeces ausgeschieden worden sein. Da

der mit unverändertem Thymolgrundgerüst renal eliminierte Anteil nur 16 % betrug,

könnte - neben den erwähnten anderen Eliminationswegen - ein erheblicher Teil der

verabreichten Dosis bereits in Phase-I-Reaktionen zu eventuell wirksamen

Verbindungen metabolisiert worden sein. Somit dürfte die Bioverfügbarkeit nach

oraler Applikation erheblich mehr als 16 % betragen. Um jedoch die absolute

Bioverfügbarkeit nach oraler Applikation exakt bestimmen zu können, müßte

zunächst die Bioverfügbarkeit nach intravenöser Applikation bestimmt werden.

Da im Rahmen der Untersuchungen von Austgulen et al. verschiedene Phase-I-

Metabolite des Thymols im Rattenurin detektiert wurden, wären weiterführende

Untersuchungen diesbezüglich im Menschen interessant (AUSTGULEN et al., 1987).

Die Identifizierung der potentiellen humanen Phase-I-Metabolite sowie deren

Quantifizierung würden zur umfassenden Klärung des Metabolismus von Thymol

beitragen. Weiterhin würden pharmakodynamische Untersuchungen mit diesen

Phase-I-Metaboliten einen weiteren Beitrag zum Verständnis des Wirkmechanismus

leisten.

Außerdem wäre der Vergleich der Pharmakokinetik von kranken und gesunden

Probanden, vor allem im Hinblick auf die pulmonale Elimination von Interesse. Durch

eine Verschiebung des pH-Wertes im Zuge einer Entzündung, wie sie bei einer

Bronchitis vorliegt, könnten Sulfatasen im Lungengewebe eine höhere Aktivität

aufweisen und somit eine größere Menge Thymol im Lungengewebe von kranken

Probanden freigesetzt werden. Der Nachweis der Spaltung von Thymolsulfat zu

Thymol durch Sulfatasen würde einen wichtigen Beitrag zur Übertragbarkeit von In-

vitro-Ergebnissen auf In-vivo-Resultate leisten.

5 Zusammenfassung 118

5 Zusammenfassung

Um abzuklären, ob Thymol, der Hauptbestandteil des Ätherischen Thymianöls nach

oraler Applikation einer thymianhaltigen Zubereitung zur Wirksamkeit beitragen kann,

wurde eine pharmakokinetische Studie nach Applikation einer Einzeldosis von

Bronchipret®TP Tabletten durchgeführt.

Die Voraussetzung hierfür war die Entwicklung einer Extraktionsmethode, mit der

Thymol nach enzymatischer Spaltung seiner Phase-II-Konjugate Thymolsulfat aus

Plasma sowie nach Spaltung von Thymolsulfat und Thymolglucuronid aus Urin

extrahiert werden konnte. Das hierzu verwendete neuartige automatisierte Verfahren

der Headspace-Festphasenmikroextraktion ermöglichte Extraktion, Anreicherung und

Probenaufgabe in einem einzigen Arbeitsschritt. Nur durch die Automatisierung der

Methode konnte eine internationalen Anforderungen genügende Validierung der

Methode vorgenommen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal

das Verfahren der Festphasenmikroextraktion für die Auswertung einer

Bioverfügbarkeits- bzw. pharmakokinetischen Studie angewendet.

Zur Analytik des Thymols wurde eine GC-Methode mit Flammenionisatiosdetektion

entwickelt. Dieses sensitive Detektionsverfahren ermöglichte die Quantifizierung des

Thymols nach enzymatischer Spaltung im unteren ng⋅mL-1 Bereich. Bei dem

systemisch verfügbaren Phase-II-Konjugat des Thymols handelte es sich um

Thymolsulfat. Per HPLC-MS/MS konnte der Phase-II-Metabolit Thymolsulfat in

Plasma und Urin sowie zusätzlich Thymolglucuronid im Urin identifiziert werden.

Thymol selbst war systemisch nicht verfügbar. Im Plasma konnte freies Thymol

oberhalb der Bestimmungsgrenze von 1,4 ng⋅mL-1 nicht nachgewiesen werden. Im

Urin war freies Thymol oberhalb einer Bestimmungsgrenze von 2,1 ng⋅mL-1 ebenfalls

nicht detektierbar. Somit war alleine Thymolsulfat im Plasma detektierbar und die

pharmakokinetische Auswertung wurde an Hand der sich nach enzymatischer

Hydrolyse ergebenden Thymolkonzentrationen vorgenommen.

Die systemische Verfügbarkeit und Pharmakokinetik von Thymol wurde im

Rahmen von 4 klinischen Studien an gesunden Probanden untersucht. In 2

Pilotstudien wurde eine Einmaldosierung (1 Tablette Bronchipret®TP) verabreicht, um


den Meßzeitraum für die Hauptstudie festlegen zu können. In einer dritten Pilotstudie

erhielten die Probanden die therapeutische Dosierung von 3x1 Tablette pro Tag. Aus

den Pilotstudien ging eindeutig hervor, daß Thymolsulfat über einen Zeitraum von ca.

40 Stunden nach Applikation im Plasma detektierbar war. Die Hauptstudie wurde mit

12 gesunden Probanden nach Einmaldosierung durchgeführt. (Dosis: 1 Tablette

BronchipretTP entsprechend 1,08 mg Thymol).

Nach Applikation einer Einzeldosis Bronchipret®TP erfolgte die Resorption frühzeitig.

So war Thymol bereits bei einigen Probanden schon nach 20 min im enzymatisch

behandelten Plasma detektierbar. Maximale Plasmaspiegel (cmax ) von

93,1±24,5 ng⋅mL-1 (MW±SD) wurden nach 1,97±0,77 h (tmax) (MW±SD) erreicht.

Die Plasmakonzentrationen, über die Zeit hinweg beobachtet, zeigten einen

biphasischen Verlauf, wobei die terminale Eliminationsphase erst nach ca. 10

Stunden einsetzte und bis zu 38 h andauerte. Die terminale Halbwertszeit betrug somit 10,2 h. Hieraus wurde ersichtlich, daß entsprechend lange Meßzeiträume in

Kombination mit einer hochempfindlichen Analytik zur vollständigen Erfassung der

Daten benötigt werden.

Bezogen auf die verabreichte Thymoldosis (1,08 mg) betrug die renal eliminierte

Thymolmenge mit unverändertem Thymolgrundgerüst 16,2±4,5 % (MW±SD). Die

renale Clearance betrug 271±156 mL⋅h-1 (MW±SD), was auf eine hohe

Plasmaeiweißbindung bzw. eine tubuläre Rückresorption hindeutete.

Nach dem bisherigen Kenntnisstand würde also eine pharmakologische Wirkung in

vivo nach Einnahme von Thymianextrakt u.a. durch Thymolsulfat bzw. potentielle

Phase-I-Metabolite hervorgerufen. Die pharmakodynamischen Wirkungen dieser

Verbindungen sind jedoch bislang noch nicht untersucht. Anhand des vorliegenden

Datenmaterials kann die in den klinischen Studien beobachtete Wirksamkeit einer

thymianextrakthaltigen Formulierung nicht auf eine einzelne Substanz zurückgeführt

werden. Möglicherweise wirken die einzelnen Komponenten synergistisch, wie es

vielfach in der Phytotherapie beobachtet wird.

Denkbar wäre auch die enzymatische Freisetzung des Thymols aus Thymolsulfat

durch Sulfataseaktivität im Zielgewebe. Die Aktivität dieses Enzyms wurde u.a. im

menschlichen Lungengewebe an Hand von Modellsubstanzen gezeigt und könnte


damit erklären, daß Thymol trotz der Abwesenheit freien Thymols im Plasma zu

einem gewissen Teil auch pulmonal eliminiert wird. Somit wäre unkonjugiertes

Thymol zwar im Plasma nicht nachweisbar, jedoch könnte es auf diesem Wege

trotzdem am Zielorgan Respirationstrakt wirken.

Der Nachweis der Spaltung von Sulfat zum Aglykon würde einen wichtigen Beitrag

zur Übertragbarkeit von den in-vitro mit Thymianextrakt und Thymianöl beobachteten

Wirkungen auf die klinische Wirksamkeit bei akuter Bronchitis leisten. Ebenso wäre

die pharmakodynamische Aktivität möglicher Phase-I-Metabolite von großem

Interesse für das Verständnis des Wirkmechanismus.

6 Summary 121

6 Summary

A pharmacokinetic study following a single dose of BronchipretTP tablets was

performed to determine whether thymol, which is the main compound in the essential

oil of thyme, contributes to the efficacy of this formulation containing thyme extract.

The major prerequisite for this study was the development of an extraction method

for the analysis of thymol after enzymatic cleavage of the phase-II-conjugates thymol

sulfate in human plasma as well as thymol sulfate and thymol glucuronide in urine. A

novel automated headspace solid-phase microextraction method was developed,

which provided extraction, concentration and sampling in a single step.

Automation of the method was necessary to test the method according to

international guidelines for validation of bioanalytical procedures. This is the first time

that solid-phase microextraction has been used for a bioavailability or

pharmacokinetic study.

A sensitive method for quantification of thymol was developed by using gas

chromatography combined with flame ionization detection. Quantification of thymol at

the lower ng⋅mL-1 level was consequently achieved.

Thymol itself was not systemically available because no free thymol could be

detected in plasma above 1.4 ng⋅mL-1. The systemically available phase-II-

metabolite was identified as thymol sulfate by HPLC-MS/MS. Thymol sulfate was

identified in plasma whereas both thymol sulfate and thymol glucuronide were

detected in urine. No free thymol was detected in urine above a limit of quantification

of 2.1 ng⋅mL-1. As thymol sulfate was the only compound systemically available in

plasma, pharmacokinetic analysis of the data was carried out based on the data

obtained after enzymatic cleavage of thymol sulfate.

The systemic availability and pharmacokinetics of thymol was investigated in 4

clinical studies of healthy male volunteers. A single dose (1 tablet Bronchipret®TP)

was administered in 2 pilot studies to determine blood sampling periods. The

therapeutic dosage of 3 tablets per day was administered in the third pilot study.

These pilot studies indicated that thymol sulfate was detectable in plasma up to 40 h

6 Summary 122

after application. The main study comprised a single-dose study with 12 healthy

volunteers (dose: 1 tablet BronchipretTP equivalent to 1.08 mg thymol).

Absorption of thymol was rapid after administration of a single dose of

Bronchipret®TP tablets. Thymol could be detected in hydrolyzed plasma 20 min after

application. Maximum plasma levels (cmax) of 93.1±24.5 ng⋅mL-1 (mean±SD) were

reached after 1.97±0.77 h (tmax) (mean±SD). Plasma concentrations showed a

biphasic profile and the terminal elimination phase set in after about 10 h and

continued up to 38 h. The terminal elimination half life was calculated to be 10.2 h.

This stresses the importance of long sampling periods in combination with highly

sensitive analytical tools to adequately follow the elimination profile.

With regard to the applied thymol dose (1.08 mg) the renally eliminated amount of

thymol with unchanged thymol base structure was 16.2±4.5 % (mean±SD). The renal

clearance of 271±156 mL⋅h-1 (mean±SD) indicates high protein binding and/or tubular

reabsorption.

The data indicate that the pharmacological effect observed in-vivo after application of

preparations containing thyme extract could be due to thymol sulfate or putative

phase-I-metabolites.

However, the pharmacodynamic effects of these compounds have not been

investigated yet. The clinical efficacy of a formulation containing thyme extract can

therefore not be reduced to one single compound. A synergism of several

compounds is frequently observed in phytomedicine.

Another concept for explanation of the data obtained bases on cleavage of the

phase-II-metabolite by sulfatases. The activities of these enzymes have been

demonstrated with model compounds in human lung tissue. This activity is consistent

with the observed pulmonary elimination of thymol. Free thymol could therefore be

effective at the respiratory system, although it was not detected in plasma.

Evidence of cleavage of thymol sulfate to thymol also has implications for the transfer

of the results obtained in-vitro with thyme extract and thyme oil and the clinical

efficacy against acute bronchitis. Finally this study has highlighted the need to study

the pharmacodynamic activity of putative phase-I-metabolites of thymol in order to

understand the mechanisms of actions.

7 Literaturverzeichnis 123

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8 Anhang 132

8 Anhang

Tab. 8.1 Demographische Daten der Probanden. Probanden-

kürzel

Alter

[Jahre]

Körpergröße

[cm]

Gewicht

[kg]

Körperfett-

anteil [%]

A 25 181 72 15

B 27 192 92 16

C 26 185 77 13

D 26 189 92 21

E 28 185 83 20

F 25 178 88 26

G 25 175 86 27

H 48 180 74 18

I 36 192 83 15

J 27 180 84 21

K 28 179 79 19

L 33 178 78 19

MW 29,50 182,83 82,33 19,17

SD 6,74 5,70 6,54 4,26

Min 25 175 72 13

Median 27 180,5 83 19

Max 48 192 92 27

8 Anhang 133

Tab. 8.2 Stabilität der Plasmaproben nach 24 h im Autosampler.

Zeit [h] gemessene Konzentration MW CV RE [ng.mL-1] [ng.mL-1] [%] [%]

0 37,2736,92 37,36 1,32 -8,8838,0637,20

24 42,6938,21 39,59 5,77 -3,4337,5739,91

Tab. 8.3 Kalibrierfunktionen während der Vermessung der Plasmaproben.

Proband

Steigung Achsenabschnitt R2 Steigung Achsenabschnitt R2

A 0,0273 0,12616 0,97799 0,03194 -0,13181 0,9924

B 0,0252 0,36312 0,98178 0,0241 0,2994 0,993360,0218 0,1672 0,9784

C 0,01715 0,43911 0,98544 0,02354 0,33222 0,99462

D 0,02193 0,59287 0,95873 0,01841 0,54031 0,9775

E 0,02561 -0,02167 0,97513 0,02305 0,01963 0,99907

F 0,02125 0,37117 0,99405 0,02467 0,19811 0,99104

G 0,02669 -0,03389 0,97935 0,01877 0,20114 0,99752

H 0,0231 0,05612 0,99417 0,01943 0,18039 0,99669

I 0,02785 0,0257 0,99715 0,02653 0,04407 0,99951

J 0,02437 0,07396 0,95649 0,02576 0,01164 0,99099

K 0,02703 -0,03621 0,98236 0,02404 -0,01168 0,99088

L 0,03033 0,00999 0,96345 0,0281 0,11108 0,99309

8,14 bis 40,07 ng.mL-1 30,54 bis 203,5 ng.mL-1

8 Anhang 134

Tab. 8.4 Ergebnisse der Qualitätskontrollproben (Plasma).

Konzentration MW CV RE n[ng.mL-1] [ng.mL-1] [%] [%]

21,5 20,85 13,28 -2,28 24

101,8 99,73 8,89 -2,04 24

169,2 163,26 7,57 -3,51 24

Tab. 8.5 Stabilität der Urinproben im Autosampler nach 24 h.

Zeit [h] gemessene Konzentration MW CV RE [ng.mL-1] [ng.mL-1] [%] [%]

0 104,21135,12 119,96 10,84 9,55116,45124,04

24 115,31121,61 122,54 4,40 11,91127,21126,02

8 Anhang 135

Tab. 8.6 Kalibrierfunktionen während der Vermessung der Urinproben.

Proband10,95 bis 328,5 ng.mL-1

Steigung Achsenabschnitt R2 Steigung Achsenabschnitt R2

A/B 978,16 13074,17 0,99850 942,91 31458,91 0,98155

C/D/E 993,5 4572,55 0,99476 948,77 24083,88 0,97537

F/G 704,84 26874,67 0,98724

H/I 805,03 25948,97 0,99301

J/K/L 847,98 30885,29 0,99156

10,95 bis 219,0 ng.mL-1 bzw. 164,25 bis 755,0 ng.mL-1

Tab. 8.7 Ergebnisse der Qualitätskontrollproben (Urin).

Konzentration MW CV RE n[ng.mL-1] [ng.mL-1] [%] [%]

30,54 30,95 17,12 1,64 9

164,25 164,56 9,81 0,19 4

273,75 280,33 8,88 2,40 3

328,5 313,22 6,70 -4,65 4

657,0 640,51 8,29 -2,51 4

8 Anhang 136

Tab. 8.8 Berechnungsgrundlagen der in Kinetica 2000 verwendeten pharmakokinetischen Parameter für extravaskuläre Applikation. parameter 1 Komp. Modell 2 Komp. Modell

Vc Vc

Dose

A= Vc

Dose

A +B=

AUC

−

−=

ka1

alpha1

alphakakaAAUC

−

−+

−

−=

ka1

beta1

betakakaB

ka1

alpha1

alphakakaAAUC

AUMC

−

−= 22 ka

1alpha

1alphaka

kaAAUC

−

−+

−

−= 2222 ka

1beta

1betaka

kaBka1

alpha1

alphakakaAAUC

T1/2 Tln2

alpha12alpha = T

ln2

beta12 beta=

MRT

+−=

ka1lag

AUCAUMCMRT

Cl, Vss, Vz Cl

Dose

AUC=

Vss Cl M RT= ⋅ VzCl

Lz=

kel kel Lz alpha= = kel

alpha beta

k21= ⋅

C0 C0=A C0=A+B

K21 k

A beta B alpha

C21

0= ⋅ + ⋅

K12 ( )kelkbetaalphak 2112 +−+=

8 Anhang 137

Tab. 8.9 Plasmakonzentrationen [ng.mL-1] von Thymolsulfat, Probanden A-D.

Zeit soll [h]

t [h] Cp t [h] Cp t [h] Cp t [h] Cp

0 0 0 0 0 0 0 0 00,25 0,37 38,7 0,27 0 0,32 0 0,23 0

0,5 0,62 42,3 0,52 11,6 0,55 51,0 0,48 00,75 0,83 42,6 0,77 17,7 0,80 67,4 0,73 0

1,00 1,12 51,8 1,03 13,8 1,07 55,1 0,98 01,5 1,62 62,4 1,55 36,8 1,58 54,6 1,50 6,0

2 2,10 76,5 2,03 73,9 2,07 58,6 2,00 110,92,5 2,63 79,2 2,57 61,3 2,60 66,5 2,53 88,5

3 3,13 80,4 3,03 51,8 3,08 59,1 3,00 99,43,5 3,58 72,8 3,53 50,2 3,67 61,9 3,50 91,6

4 4,12 62,1 4,00 50,2 4,17 59,7 3,97 88,25 5,10 55,2 5,03 42,8 5,07 44,3 5,00 74,0

6 6,13 45,9 6,07 24,2 6,10 36,7 6,03 54,27 7,10 41,7 7,50 25,7 7,07 27,9 7,03 32,1

8 8,10 36,7 8,03 22,4 8,07 23,7 8,00 30,39 8,97 28,0 9,08 17,2 9,03 21,2 9,00 24,5

10 10,03 21,9 10,07 17,3 10,08 18,9 10,00 18,812 11,97 15,2 12,00 16,6 12,07 22,0 12,03 19,2

14 14,08 18,6 14,00 16,3 14,07 16,8 13,92 15,824 24,20 8,5 24,08 6,8 24,25 7,8 24,17 7,8

31 30,93 3,7 31,00 0 31,03 0 30,92 038 37,92 - 38,17 0 38,08 0 38,00 0

48 48,50 - 48,42 - 2,38 - 48,12 055 55,33 - 55,67 - 55,08 - 55,00 -

62 61,92 - 62,33 - 62,00 - 62,00 -72 72,25 - 72,42 - 72,00 - 72,00 -

ProbandA B C D

8 Anhang 138

Tab. 8.10 Plasmakonzentrationen [ng.mL-1] von Thymolsulfat, Probanden E-H.

Zeit soll [h]


0 0 181,2 0 0 0 0 0 00,25 0,25 221,5 0,33 17,0 0,37 20,9 0,30 36,6

0,5 0,50 173,1 0,57 32,3 0,62 36,8 0,60 76,10,75 0,75 192,8 0,83 39,0 0,87 40,8 0,85 122,4

1,00 1,00 207,9 1,10 55,9 1,17 43,4 1,13 125,81,5 1,52 315,7 1,50 50,9 1,53 56,7 2,52 125,4

2 2,00 275,0 2,02 52,7 2,08 59,5 2,05 90,02,5 2,50 226,9 2,72 53,3 2,62 70,0 2,60 90,8

3 3,00 284,7 3,05 52,8 3,08 69,1 3,07 86,53,5 3,50 229,1 3,55 45,3 3,62 59,6 3,50 76,6

4 4,00 172,7 4,05 43,6 4,07 47,0 4,00 78,45 5,00 170,2 5,05 43,4 5,08 28,8 5,08 53,2

6 6,03 169,8 6,00 35,8 6,03 25,0 6,02 66,67 7,05 163,6 7,03 24,5 7,08 24,7 7,07 67,3

8 8,03 147,5 8,08 25,2 8,10 20,0 8,05 52,59 9,00 153,9 9,08 29,4 9,03 17,7 9,02 43,9

10 10,02 126,5 10,05 23,3 10,08 16,3 10,02 37,012 12,00 114,0 12,08 22,5 12,12 15,1 12,05 27,8

14 14,00 99,7 13,98 18,2 14,03 13,4 14,08 26,524 23,83 38,0 24,42 7,4 23,87 10,5 24,00 19,1

31 30,83 28,5 31,30 0 31,03 5,0 30,93 10,238 37,75 15,1 37,42 0 37,95 0 37,88 6,9

48 47,83 9,2 48,22 - 48,20 0 48,05 055 55,42 0 54,92 - 55,00 - 54,80 0

62 62,33 - 61,92 - 62,00 - 61,83 072 72,25 - 72,08 - 72,00 - 71,88 0

ProbandF G HE

8 Anhang 139

Tab. 8.11 Plasmakonzentrationen [ng.mL-1] von Thymolsulfat, Probanden I-L.

Zeit soll [h]


0 0 0 0 0 0 0 0 00,25 0,25 0 0,25 0 0,25 17,1 0,25 0

0,5 0,50 24,9 0,50 12,6 0,50 65,7 0,50 26,30,75 0,75 52,3 0,83 59,8 0,75 101,3 0,75 44,0

1,00 1,00 60,5 1,05 73,9 1,00 123,4 1,00 68,91,5 1,52 80,7 1,50 99,0 1,52 86,6 1,52 104,4

2 2,00 91,9 2,00 96,2 2,00 95,2 2,00 105,62,5 2,50 103,7 2,50 75,7 2,50 99,8 2,50 113,9

3 3,00 92,2 3,02 81,4 3,00 80,3 3,00 104,33,5 3,50 90,6 3,53 59,1 3,50 67,9 3,50 107,7

4 4,00 81,8 4,00 64,1 4,00 61,2 4,00 94,45 5,00 56,9 5,00 58,1 5,00 57,6 5,00 98,2

6 3,03 49,6 6,03 41,1 6,03 54,6 6,03 62,47 7,02 43,3 7,03 38,6 7,00 37,0 7,05 51,5

8 8,02 42,7 8,05 37,1 8,00 29,6 8,03 54,59 9,05 35,8 9,03 34,6 9,02 28,5 9,00 48,3

10 10,08 38,8 10,03 31,9 10,03 34,2 10,02 39,712 12,03 21,3 12,00 24,3 12,00 28,4 12,00 30,7

14 14,00 25,6 14,02 18,3 14,03 20,8 14,00 34,524 24,00 16,8 23,88 11,6 24,00 11,4 23,83 14,0

31 30,75 8,7 31,05 6,7 31,00 7,0 30,83 7,738 38,00 5,8 38,22 0 37,92 0 37,75 0

48 48,00 0 48,08 0 47,75 0 47,83 -55 54,67 0 55,33 0 54,92 - 55,42 -

62 61,83 0 62,17 0 62,00 - 62,33 -72 71,83 - 72,42 0 72,00 - 72,25 -

J K LProband

I

8 Anhang 140

Tab. 8.12 Kumulative Urinausscheidung Ut [µg] von Thymol nach enzymatischer Spaltung der Thymol-Konjugate.

Zeit [h] A B C D E F G H I J K LUt [µg] Ut [µg] Ut [µg] Ut [µg] Ut [µg] Ut [µg] Ut [µg] Ut [µg] Ut [µg] Ut [µg] Ut [µg] Ut [µg]

0 0 0 0 0 63,6 0 0 0 0 0 0 03 85,7 104,9 76,4 39,7 181,6 58,8 102,8 69,1 62,6 50,5 29,6 63,1

6 123,1 160,2 102,2 68,9 231,9 72,3 158,1 88,3 103,3 96,5 80,4 95,79 151,2 203,3 124,0 93,2 243,7 98,6 191,2 102,2 138,8 123,5 113,4 134,9

14 182,5 232,5 149,5 122,1 277,4 106,9 220,7 122,5 169,1 140,6 129,4 138,524 218,5 257,4 161,7 143,9 314,4 132,6 250,1 133,7 186,2 140,6 145,2 145,3

31 218,5 257,4 161,7 143,9 325,5 132,6 259,9 133,7 186,2 140,6 145,2 145,338 218,5 257,4 161,7 143,9 330,9 132,6 259,9 133,7 186,2 140,6 145,2 145,3

48 - - - - 330,9 - 259,9 133,7 186,2 - - 145,355 - - - - 330,9 - - - - - - -

Proband

8 Anhang 141

Tab. 8.13 Individuelle Pharmakokinetische Parameter der Nichtkompartiment-Analyse.

Proband A B C D E F G H I J K L

cmax [ng/mL] 80,39 73,87 67,39 110,87 315,68 55,90 70,04 125,82 103,68 99,01 123,36 113,87tmax [h] 3,13 2,03 0,80 2,00 1,52 1,10 2,62 2,52 2,50 1,50 1,00 2,50

ke [1/h] 0,0791 0,0704 0,0708 0,0702 0,0655 0,0837 0,0536 0,0585 0,0640 0,0625 0,0698 0,0789t1/2 [h] 8,8 9,9 9,8 9,9 10,6 8,3 12,9 11,8 10,8 11,1 9,9 8,8

AUCcum [ng*h/mL] 708,4 511,7 980,3 733,6 3604,1 456,7 534,4 1281,6 1040,4 835,8 915,3 1212,2AUClast [ng*h/mL] 46,18 96,95 110,07 111,77 81,30 88,29 92,41 118,11 91,07 107,95 100,07 98,05AUCtot [ng*h/mL] 795,5 608,6 1341,3 794,4 3685,4 678,5 682,3 1340,7 1131,5 943,8 1015,4 1266,8

%AUClast 5,8 15,9 8,2 14,1 2,2 13,0 13,5 8,8 8,2 11,4 9,9 7,7AUMCcum [h2*ng/mL] 5438,6 4253,0 2968,0 6626,9 44356,9 2694,4 4336,0 15797,8 11717,7 7855,0 8185,7 12384,4AUMClast [h2*ng/mL] 2012,4 3712,7 4223,1 4294,6 5746,9 3210,5 4590,8 6491,9 4883,7 5078,8 4535,4 4266,3AUMCtot [h2*ng/mL] 8524,7 7965,7 10850,1 9524,3 50103,8 8174,5 10379,8 19808,9 16601,4 12933,8 12721,0 15197,5MRTabs [h] 10,7 13,1 8,1 12,0 13,6 12,0 15,2 14,8 14,7 13,7 12,5 12,0

solver tmax [h] 1,71 1,88 1,91 1,84 1,78 1,86 1,85 1,71 1,91 1,79 1,79 1,82ka [1/h] 2,0 1,8 1,8 1,8 2,0 1,7 2,0 2,2 1,8 2,0 1,9 1,8

MAT [h] 0,51 0,56 0,57 0,54 0,50 0,59 0,50 0,46 0,55 0,50 0,52 0,56MRTiv [h] 10,2 12,5 7,5 11,4 13,1 11,5 14,7 14,3 14,1 13,2 12,0 11,4

Dose [mg] 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08CLtot/f [L/h] 1,36 1,77 0,81 1,36 1,59 0,29 1,58 0,81 0,95 1,14 1,06 0,85

Vdss/f [L] 13,85 22,23 6,05 15,56 18,24 3,84 23,29 11,53 13,47 15,11 12,77 9,75Vd area/f [L] 17,16 25,22 11,37 19,38 19,01 4,48 29,51 13,76 14,91 18,31 15,23 10,81

8 Anhang 142

Tab. 8.14 Tabellarische Darstellung des Fittings der Thymol-Plasmakonzentrationen für ein Zweikompartiment-Modell (Proband A-K) bzw. Einkompartiment-Modell (Proband L).

A B C D E F G H I J K L

dose mg 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08ka [1/h] 0,48 0,63 0,62 0,40 0,52 0,65 0,57 1,31 0,49 2,05 0,69 0,10

Tlag [h] 0,67 0,32 1,48 0,54Vc [L] 6,10 7,72 5,57 1,26 0,78 9,66 7,62 6,90 5,63 7,93 4,55 1,28ke [1/h] 0,23 0,19 0,28 1,05 0,39 0,17 0,20 0,12 0,16 0,15 0,23 0,68

k12 [1/h] 0,16 0,33 0,32 1,05 1,79 0,27 0,28 0,12 0,19 0,22 0,35k21 [1/h] 0,14 0,11 0,17 0,11 0,48 0,29 0,11 0,17 0,10 0,32 0,20AUC [ng*h/mL] 758,79 747,39 698,73 822,08 3579,11 672,92 716,84 1326,14 1197,64 893,54 1016,22 1238,25

AUMC [h2*ng/mL] 8467,51 16571,30 8236,68 10506,70 50593,10 8894,38 13735,80 20015,70 23714,00 10299,40 13397,70 14509,30MRT [h] 9,09 19,92 9,84 8,78 12,21 11,68 17,41 14,33 17,75 10,50 11,74 1,46Lz [1/h] 0,09 0,08 0,07 0,07 0,07 0,08 0,05 0,06 0,06 0,06 0,06 0,09

Cmax calc [ng/mL] 74,00 58,35 74,94 112,81 243,02 52,56 58,37 108,74 84,62 95,12 98,77 87,33tmax calc [h] 2,44 2,53 2,10 2,51 1,32 2,15 2,04 1,66 2,56 1,62 1,72 3,32

A [ng/mL] 145,60 120,18 161,39 837,09 1152,89 70,17 121,28 95,45 159,15 74,65 188,14 846,15Alpha [1/h] 0,46 0,59 0,70 2,15 2,58 0,66 0,55 0,35 0,41 0,61 0,71 0,68

B [ng/mL] 31,39 19,71 32,39 22,61 225,38 41,64 20,37 61,02 32,53 61,51 48,99Beta [1/h] 0,07 0,04 0,07 0,05 0,07 0,07 0,04 0,06 0,04 0,08 0,07t ½ ka [h] 1,44 1,10 1,13 1,74 1,33 1,06 1,22 0,53 1,42 0,34 1,00 7,11tabs [h] 7,18 5,48 5,63 8,72 6,66 5,32 6,08 2,64 7,10 1,69 5,01 35,54

t ½ alpha [h] 1,51 1,17 0,99 0,32 0,27 1,05 1,26 1,97 1,67 1,14 0,97 1,01t ½ beta [h] 9,74 19,15 10,02 13,24 9,63 9,42 16,88 11,98 17,33 8,69 10,65t ½ Lz [h] 9,74 19,15 10,02 13,24 9,63 9,42 16,88 11,98 17,33 8,69 10,65 1,01t ½ ke [h] 2,97 3,70 2,50 0,66 1,80 4,17 3,51 5,87 4,33 4,55 2,97 1,01

Vz [L] 20,01 39,92 22,35 25,10 4,19 21,82 36,68 14,08 22,55 15,15 16,32 1,28Cl [L/h] 1,42 1,45 1,55 1,31 0,30 1,60 1,51 0,81 0,90 1,21 1,06 0,87

Conc. Unit [ng/mL]

8 Anhang 143

Abb. 8.1 GC-EI-Spektrum des Thymolpeaks einer mit Thymol versetzten Plasmaprobe (SIM Modus).

Abb. 8.2 GC-EI-Spektrum des Thymolpeaks aus Plasma nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP (SIM Modus).

Tab. 8.15 Prozentuale Verhältnisse der Fragmente von Thymol (Plasma).

m/z 91 115 135 150

Referenz 15,7 14,3 100 30,6 1 Tablette 15,31 13,98 100 31,03

8 Anhang 144

Abb. 8.3 GC-EI-Spektrum des Thymolpeaks einer mit Thymol versetzten Urinprobe (SIM Modus).

Abb. 8.4 GC-EI-Spektrum des Thymolpeaks aus Urin nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP (SIM Modus).

Tab. 8.16 Prozentuale Verhältnisse der Fragmente von Thymol (Urin).

m/z 91 115 135 150

Referenz 16,79 14,38 100 32,08 1 Tablette 14,6 14,34 100 32,99

8 Anhang 145

Abb. 8.5 1. Ableitung der UV-Absorptionsspektren von Thymol (—) λmax = 274 nm (0-Durchgang) und dem neu entstandenen Peak, Thymolglucuronid (- -) λmax = 270 nm (0-Durchgang).

240

250

270

260

280

290

300

Wavelenght [nm]

Der

ivat

ive

of A

bsor

banc

e x

10-3

-2.0

00-1

.000

0.00

01.

000

-2.0

00-1

.000

0.00

01.

000

Line Type Time Range______ 30.16 - 30.29

- - - - - - 25.58 - 25.61

8 Anhang 146

Abb. 8.6 LC-ESI-MS-Spektrum von Thymolglucuronid-Standard, enzymatisch synthetisiert ([M – H]¯ = 325 amu) (oben). Das Molion wurde per SRM fragmentiert, die Tochterionen [M – H]¯ 307 (Wasserverlust), 175 (Glucuronsäure), 149 (Thymol; nur schwach erkennbar) und 113 sind im MS/MS-Spektrum zu erkennen (unten). T h y m o l g l u k u r o n i d # 1 0 5 5 - 1 0 8 0 R T : 1 3 . 0 1 - 1 3 . 4 4 A V : 1 4 S B : 3 5 1 8 . 9 1 - 1 2 . 8 7 , 1 3 . 8 4 - 1 5 . 5 2 N L : 1 . 6 3 E 5T : - c E S I F u l l m s [ 1 1 5 . 0 0 - 6 0 0 . 0 0 ]

1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0m / z

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

3 5

4 0

4 5

5 0

5 5

6 0

6 5

7 0

7 5

8 0

8 5

9 0

9 5

1 0 0

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lati

ve

Ab

un

da

nc

e

1 4 3 . 1 3

2 8 5 . 1 9

3 2 5 . 0 1

3 8 2 . 8 9

2 0 0 . 0 7

3 0 1 . 0 82 3 8 . 9 2

2 8 1 . 9 23 4 2 . 1 9 3 8 4 . 9 5

3 6 6 . 9 12 2 4 . 8 9 3 0 6 . 9 53 5 7 . 9 62 0 2 . 9 4 3 8 9 . 9 32 4 0 . 7 7

1 3 6 . 0 4 2 8 0 . 9 31 5 6 . 9 4 1 8 1 . 9 0 2 2 1 . 1 1 2 4 4 . 0 71 2 4 . 0 5

T h y m o l g l u k u r o n i d # 1 0 6 9 R T : 1 3 . 2 3 A V : 1 N L : 7 . 7 9 E 4T : - c d F u l l m s 2 3 2 4 . 9 8 @ 4 0 . 0 0 [ 7 5 . 0 0 - 6 6 0 . 0 0 ]

1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0m / z

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

3 5

4 0

4 5

5 0

5 5

6 0

6 5

7 0

7 5

8 0

8 5

9 0

9 5

1 0 0

Re

lati

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Ab

un

da

nc

e

1 1 2 . 9 0

1 7 4 . 8 2

3 0 7 . 1 51 7 3 . 9 19 8 . 7 5 1 2 9 . 1 2 2 5 0 . 0 8 2 6 2 . 0 5 2 8 9 . 3 8

8 Anhang 147

Abb. 8.7 LC-ESI-MS-Spektrum von Thymolsulfat ([M – H]¯ = 229 amu) im Plasma nach Einnahme einer Tablette Bronchipret® TP (oben). Das Molion wurde per SRM fragmentiert, die Tochterionen [M – H]¯ 211 (Wasserverlust), 201, 165 (SO2 Verlust), 149 (Thymol) und 80 (SO3¯) sind im MS/MS-Spektrum zu erkennen (unten). P l a s m a G 1 B s p i k e # 1 1 0 0 - 1 1 3 0 R T : 1 4 . 8 7 - 1 5 . 3 9 A V : 1 6 S B : 7 8 1 3 . 5 8 - 1 4 . 8 3 , 1 5 . 8 3 - 1 7 . 3 0 N L : 5 . 9 4 E 5T : - c E S I F u l l m s [ 1 1 5 . 0 0 - 6 0 0 . 0 0 ]

1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0m / z

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

3 5

4 0

4 5

5 0

5 5

6 0

6 5

7 0

7 5

8 0

8 5

9 0

9 5

1 0 0

Re

lati

ve

Ab

un

da

nc

e

2 2 9 . 0 6

3 5 2 . 0 1

3 6 9 . 2 9

3 0 4 . 1 42 4 9 . 0 2

1 6 6 . 2 0 3 0 5 . 1 2 3 2 3 . 0 61 8 7 . 1 3 3 8 0 . 8 82 9 7 . 0 01 4 0 . 9 6 2 7 0 . 5 92 1 3 . 9 9

P l a s m a G 1 B s p i k e # 1 1 1 3 - 1 1 2 7 R T : 1 5 . 1 1 - 1 5 . 3 3 A V : 8 S B : 7 8 1 3 . 5 8 - 1 4 . 8 3 , 1 5 . 8 3 - 1 7 . 3 0 N L : 4 . 2 2 E 5T : - c d F u l l m s 2 2 2 9 . 0 3 @ 4 0 . 0 0 [ 5 0 . 0 0 - 4 7 0 . 0 0 ]

5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0m / z

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

3 5

4 0

4 5

5 0

5 5

6 0

6 5

7 0

7 5

8 0

8 5

9 0

9 5

1 0 0

Re

lati

ve

Ab

un

da

nc

e

1 4 9 . 1 1

8 0 . 0 0

1 6 5 . 1 3

8 0 . 9 1 2 0 0 . 8 9 2 2 9 . 1 61 2 3 . 2 27 9 . 4 0 2 4 2 . 5 1 3 7 5 . 9 61 8 6 . 1 3

8 Anhang 148

Abb. 8.8 LC-ESI-MS-Spektrum von Thymolglucuronid ([M – H]¯ = 325 amu) in Urin (10 Tabletten) (oben). Das Molion wurde per SRM fragmentiert, die Tochterionen [M – H]¯ 307 (Wasserverlust), 175 (Glucuronsäure), 149 (Thymol) und 113 sind im MS/MS-Spektrum zu erkennen (unten). U r i n E R I I I 1 . 2 # 8 4 4 - 8 7 7 R T : 1 2 . 5 5 - 1 3 . 0 9 A V : 1 7 S B : 7 9 1 0 . 9 7 - 1 2 . 5 0 , 1 3 . 4 0 - 1 4 . 6 3 N L : 8 . 8 0 E 5T : - c E S I F u l l m s [ 1 1 5 . 0 0 - 6 0 0 . 0 0 ]

1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0m / z

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

3 5

4 0

4 5

5 0

5 5

6 0

6 5

7 0

7 5

8 0

8 5

9 0

9 5

1 0 0

Re

lati

ve

Ab

un

da

nc

e

3 2 5 . 0 2

3 8 5 . 1 8

3 8 7 . 2 12 2 9 . 0 6

3 2 5 . 9 4

3 9 3 . 1 13 5 6 . 4 53 6 7 . 2 5

3 0 5 . 1 1 3 3 8 . 9 12 8 8 . 9 32 0 7 . 8 81 7 8 . 0 21 2 4 . 0 9 2 3 6 . 5 5 2 7 2 . 9 6

1 6 3 . 8 0

U r i n E R I I I 1 . 2 # 8 5 9 R T : 1 2 . 8 1 A V : 1 N L : 2 . 8 8 E 5T : - c d F u l l m s 2 3 2 5 . 0 2 @ 4 0 . 0 0 [ 7 5 . 0 0 - 6 6 5 . 0 0 ]

1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0m / z

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

3 5

4 0

4 5

5 0

5 5

6 0

6 5

7 0

7 5

8 0

8 5

9 0

9 5

1 0 0

Re

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ve

Ab

un

da

nc

e

1 1 2 . 9 4

1 7 4 . 8 4

3 0 7 . 0 02 4 4 . 0 21 7 4 . 2 01 4 9 . 0 9

1 5 6 . 8 11 1 0 . 9 8 2 1 4 . 1 6 2 6 8 . 0 5 3 0 6 . 2 31 3 9 . 1 5 3 2 2 . 2 11 9 7 . 9 3

8 Anhang 149

Abb. 8.9 LC-ESI-MS-Spektrum (oben) von Thymolsulfat ([M – H]¯ = 229 amu) in Urin (10 Tabletten). Das Molion wurde per SRM fragmentiert, die Tochterionen [M – H]¯ 211 (Wasserverlust), 201, 165 (SO2 Verlust), 149 (Thymol) und 80 (SO3¯) sind im MS/MS-Spektrum zu erkennen (unten). U r i n E R I I I 1 . 2 # 9 9 1 - 1 0 1 8 R T : 1 5 . 1 5 - 1 5 . 5 3 A V : 1 4 S B : 1 1 6 1 2 . 5 5 - 1 4 . 9 7 , 1 5 . 9 2 - 1 7 . 5 7 N L : 2 . 5 7 E 6T : - c E S I F u l l m s [ 1 1 5 . 0 0 - 6 0 0 . 0 0 ]

1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0m / z

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

3 5

4 0

4 5

5 0

5 5

6 0

6 5

7 0

7 5

8 0

8 5

9 0

9 5

1 0 0

Re

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ve

Ab

un

da

nc

e

2 2 9 . 0 4

3 5 2 . 0 6

3 5 3 . 0 82 3 0 . 1 43 5 6 . 1 8

3 0 4 . 0 0 3 3 8 . 4 5 3 6 9 . 9 21 4 9 . 2 0 2 7 6 . 0 31 4 0 . 8 8 2 1 6 . 0 6 2 6 2 . 8 81 6 8 . 9 1 1 9 4 . 5 6

U r i n E R I I I 1 . 2 # 9 9 7 - 1 0 2 1 R T : 1 5 . 2 3 - 1 5 . 5 8 A V : 1 2 S B : 1 1 6 1 2 . 5 5 - 1 4 . 9 7 , 1 5 . 9 2 - 1 7 . 5 7 N L : 1 . 1 4 E 6T : - c d F u l l m s 2 2 2 9 . 0 5 @ 4 0 . 0 0 [ 5 0 . 0 0 - 4 7 0 . 0 0 ]

5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0m / z

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

3 5

4 0

4 5

5 0

5 5

6 0

6 5

7 0

7 5

8 0

8 5

9 0

9 5

1 0 0

Re

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Ab

un

da

nc

e

1 4 9 . 1 2

8 0 . 0 1

1 6 5 . 1 7

1 4 8 . 2 68 1 . 0 3 1 1 3 . 3 0 2 0 1 . 9 87 8 . 1 5 1 8 6 . 9 2 2 4 0 . 4 6 3 7 7 . 9 32 7 0 . 9 0

8 Anhang 150

Abb. 8.10 Graphische Darstellung der individuellen Thymolsulfat-Plasmakonzentrations-Zeitverläufe. Zur Bestimmung von ke wurden jeweils die letzten 4 Wertepaare herangezogen.

Proband A

1

10

100

0 5 10 15 20 25 30 35

Zeit [h]

cp [n

g*m

L-1]

Proband D

1

10

100

1000

0 5 10 15 20 25 30

Ze it [h]

cp [n

g*m

L-1]

Proband B

1

10

100

0 5 10 15 20 25 30

Zeit [h]

cp [n

g*m

L-1]

Proband E

1

10

100

1000

0 10 20 30 40 50 60

Zeit [h]

cp [n

g*m

L-1]

Proband C

1

10

100

0 5 10 15 20 25 30

Zeit [h]

cp [n

g*m

L-1]

Proband F

1

10

100

0 5 10 15 20 25 30

Zeit [h]

cp [n

g*m

L-1]

8 Anhang 151

Proband G

1

10

100

0 5 10 15 20 25 30 35

Zeit [h]

cp [n

g*m

L-1]

Proband J

1

10

100

1000

0 10 20 30 40

Zeit [h]

cp [n

g*m

L-1]

Proband H

1

10

100

1000

0 10 20 30 40

Zeit [h]

cp [n

g*m

L-1]

Proband K

1

10

100

1000

0 5 10 15 20 25 30 35

Ze it [h]

cp [n

g*m

L-1

]

Proband I

1

10

100

1000

0 10 20 30 40

Zeit [h]

cp [n

g*m

L-1]

Proband L

1

10

100

1000

0 5 10 15 20 25 30 35

Ze it [h]

cp [n

g*m

L-1]

8 Anhang 152

Abb. 8.11 Graphische Darstellung des Fittings der Thymol-Plasmakonzentrationen für ein Zweikompartiment- (Proband A-K) bzw. Einkompartiment-Modell (Proband L).

8 Anhang 153

8 Anhang 154

Abb. 8.12 Sigma-Minus-Plots zur Ermittlung der Eliminationskonstante ke.

Proband A

y = 192,68e-0,1188x

1

10

100

1000

0 5 10 15

Zeit [h]

Uin

f-Ut [

µg]

Proband D

y = 170,37e-0,143x

1

10

100

1000

0 5 10 15

Zeit [h]

Uin

f-Ut [

µg]

Proband B

y = 253,9e-0,1668x

1

10

100

1000

0 5 10 15

Zeit [h]

Uin

f-Ut [

µg]

Proband E

y = 291,93e-0,1251x

1

10

100

1000

0 10 20 30 40

Zeit [h]

Uin

f-Ut [

µg]

Proband C

y = 162,68e-0,1783x

1

10

100

1000

0 5 10 15

Zeit [h]

Uin

f-Ut [

µg]

Proband F

y = 99,91e-0,1014x

1

10

100

1000

0 5 10 15

Zeit [h]

Uin

f-Ut [

µg]

8 Anhang 155

Proband G

y = 225,87e-0,1299x

1

10

100

1000

0 5 10 15 20 25 30

Zeit [h]

Uin

f-Ut [

µg]

Proband J

y = 215,15e-0,2772x

1

10

100

1000

0 2 4 6 8 10

Zeit [h]

Uin

f-Ut [

µg]

Proband H

y = 113,97e-0,1589x

1

10

100

1000

0 5 10 15

Zeit [h]

Uin

f-Ut [

µg]

Proband K

y = 190,39e-0,1831x

1

10

100

1000

0 5 10 15

Zeit [h]

Uin

f-Ut [

µg]

Proband I

y = 230,79e-0,1824x

1

10

100

1000

0 5 10 15

Zeit [h]

Uin

f-Ut [

µg]

Proband L

y = 161,78e-0,2434x

1

10

100

1000

0 5 10 15

Zeit [h]

Uin

f-Ut [

µg]

8 Anhang 156

Abb. 8.13 Renale Clearance-Plots (Ut gegen AUCt).

Proband A

y = 321,05x

0

50

100

150

200

250

0 0,2 0,4 0,6 0,8

AUCt cum [h*µg/mL]

Ut c

um [µ

g]

Proband D

y = 209,03x0

50

100

150

200

0 0,2 0,4 0,6 0,8

AUCt cum [h*µg/mL]

Ut c

um [µ

g]

Proband B

y = 633,35x

0

50100

150

200

250300

350

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

AUCt cum [h*µg/mL]

Ut c

um [µ

g]

Proband E

y = 114,53x

050

100150200250300350400

0 1 2 3 4

AUCt cum [h*µg/mL]

Ut c

um [µ

g]

Proband C

y = 148,44x

0

50

100

150

200

0 0,5 1 1,5

AUCt cum [h*µg/mL]

Ut c

um [µ

g]

Proband F

y = 246,34x0

50

100

150

200

0 0,2 0,4 0,6 0,8

AUCt cum [h*µg/mL]

Ut c

um [µ

g]

8 Anhang 157

Proband G

y = 492,77x

0

50

100

150

200

250

300

350

0 0,2 0,4 0,6 0,8

AUCt cum [h*µg/mL]

Ut c

um [µ

g]

Proband J

y = 240,32x0

50

100

150

200

0 0,2 0,4 0,6 0,8

AUCt cum [h*µg/mL]

Ut c

um [µ

g]

Proband H

y = 144,41x0

50

100

150

200

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

AUCt cum [h*µg/mL]

Ut c

um [µ

g]

Proband K

y = 180,83x

0

50

100

150

200

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

AUCt cum [h*µg/mL]

Ut c

um [µ

g]

Proband I

y = 199,83x0

50

100

150

200

250

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

AUCt cum [h*µg/mL]

Ut c

um [µ

g]

Proband L

y = 160,16x

0

50

100

150

200

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

AUCt cum [h*µg/mL]

Ut c

um [µ

g]

9 Abbildungsverzeichnis 158

9 Abbildungsverzeichnis

Abb. 1.1 Thymus vulgaris, L....................................................................................... 4

Abb. 1.2 Strukturformeln von Ätherisch-ÖL-Komponenten (SCHNEIDER, 1998)........ 11

Abb. 1.3 Phase-I-Metaboliten von Thymol im Rattenurin (AUSTGULEN et al., 1987). 14

Abb. 2.1 Schematische Darstellung der Headspace-Festphasenmikroextraktions-

methode. ........................................................................................................... 39

Abb. 2.2 Peakflächen-Zeitprofil für Thymol bei 68°C, MW aus Doppelbestimmung. 43

Abb. 2.3 0-Wert Plasma mit Thymol versetzt (1,4 ng⋅mL-1) (blau), Plasma nach

Einnahme einer Tablette BronchipretTP (grün). .............................................. 56

Abb. 2.4 Ionenspurchromatogramm von 0-Wert Urin mit Thymol (2,1 ng⋅mL-1)

versetzt................................................................................................................57

Abb. 2.5 Ionenspurchromatogramm von Urin nach Einnahme einer Tablette

BronchipretTP.................................................................................................. 57

Abb. 2.6 Combi-Pal Autosampler............................................................................. 58

Abb. 2.7 Chromatogramm nach Einnahme einer Tablette Bronchipret®TP (oben) und

einer mit Thymol versetzten Probe (unten)........................................................ 64

Abb. 2.8 Chromatogramm nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP (oben) und

einer 0-Wert Probe (unten)................................................................................ 64

Abb. 2.9 Peakflächen-Zeitprofil für Thymol bei 80°C, MW aus 2 Messungen.......... 65

Abb. 2.10 Kalibriergerade für den unteren Konzentrationsbereich des

Arbeitsbereiches................................................................................................ 66

Abb. 2.11 Kalibriergerade für den oberen Bereich des Arbeitsbereiches................. 66

Abb. 2.12 Chromatogramm nach Einnahme einer Tablette Bronchipret®TP (oben)

und einer mit Thymol versetzten Urinprobe (unten). ......................................... 74

Abb. 2.13 Chromatogramm nach Einnahme einer Tablette Bronchipret®TP (oben)

und einer 0-Wert Urinprobe (unten)................................................................... 74

Abb. 2.14 Peakflächen-Zeitprofil für Thymol bei 80°C, MW aus 2 Messungen........ 75

Abb. 2.15 Kalibriergerade für den unteren Konzentrationsbereich des


Abb. 2.16 Kalibriergerade für den oberen Konzentrationsbereich des



Abb. 2.17 Thymolglucuronid. ................................................................................... 81

Abb. 2.18 Chromatogramme des Reaktionsgemisches ohne (schwarz) und mit

Uridin-5`-Diphosphoglucuronyl-Transferase (rot) nach 60minütigem Inkubieren

bei 37°C............................................................................................................. 83

Abb. 3.1 Ionenspurchromatogramme (neg. LC-ESI) von 0-Wert Plasma (oben), nach

Einnahme einer Tablette Bronchipret®TP (mitte) und Plasma nach Einnahme

einer Tablette Bronchipret®TP mit Thymolglucuronid versetzt (unten). ............. 88

Abb. 3.2 Konzentrations-Zeit-Verlauf des Gesamtthymolgehaltes nach

enzymatischer Spaltung mittels HS-SPME ( ) und des per LC-MS ermittelten

Thymolsulfates (�). Beschriftung der Y-Achse: : cp [ng⋅mL-1]; �: Thymolsulfat

[Peakfläche/250000], 1 Proband. ...................................................................... 89

Abb. 3.3 Ionenspurenchromatogramme (neg. LC-ESI) von 0-Wert Urin (oben) und

nach Einnahme von 10 Tabletten BronchipretTP (unten)................................ 90

Abb. 3.4 Kumulative renale Ausscheidung von Thymolsulfat und Thymolglucuronid,

1 Proband.......................................................................................................... 91

Abb. 3.5 Individuelle Plasmakonzentrations-Zeitprofile für Thymolsulfat nach

Einnahme einer Tablette BronchipretTP.......................................................... 92

Abb. 3.6 Plasmakonzentrations-Zeitprofil (Median, n=4) für Thymolsulfat nach

Einnahme einer Tablette BronchipretTP.......................................................... 93

Abb. 3.7 Individuelle Plasmakonzentrations-Zeitprofile für Thymolsulfat im Steady

State nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP. ↑ : erneute

Tabletteneinnahme............................................................................................ 94

Abb. 3.8 Plasmakonzentrations-Zeitprofil für Thymolsulfat nach Einnahme einer

Tablette BronchipretTP, 1 Proband. ................................................................ 95

Abb. 3.9 Graphische Darstellung der individuellen Plasmakonzentrationen für

Thymolsulfat nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP............................ 97

Abb. 3.10 Graphische Darstellung der mittleren und medianen Plasma-

konzentrationen für Thymolsulfat nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP.

Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert dar, n=11. .. 97

Abb. 3.11 Kumulative Urinausscheidung in % der verabreichten Dosis (MW+SD) von

Thymol nach enzymatischer Spaltung der Konjugate (n=11). ........................... 99


Abb. 3.12 Graphische Darstellung des Fittings des Mittelwertes der Thymolsulfat-

Plasmakonzentrationen. .................................................................................. 102

Abb. 3.13 Graphische Darstellung des Fittings des Medians der Thymolsulfat-

Plasmakonzentrationen . ................................................................................. 102

Abb. 8.1 GC-EI-Spektrum des Thymolpeaks einer mit Thymol versetzten

Plasmaprobe (SIM Modus).............................................................................. 143

Abb. 8.2 GC-EI-Spektrum des Thymolpeaks aus Plasma nach Einnahme einer

Tablette BronchipretTP (SIM Modus). ........................................................... 143

Abb. 8.3 GC-EI-Spektrum des Thymolpeaks einer mit Thymol versetzten Urinprobe

(SIM Modus).................................................................................................... 144

Abb. 8.4 GC-EI-Spektrum des Thymolpeaks aus Urin nach Einnahme einer Tablette

BronchipretTP (SIM Modus). ......................................................................... 144

Abb. 8.5 1. Ableitung der UV-Absorptionsspektren von Thymol (—) λmax = 274 nm (0-

Durchgang) und dem neu entstandenen Peak, Thymolglucuronid (- -) λmax = 270

nm (0-Durchgang). .......................................................................................... 145

Abb. 8.6 LC-ESI-MS-Spektrum von Thymolglucuronid-Standard, enzymatisch

synthetisiert ([M – H]¯ = 325 amu) (oben). Das Molion wurde per SRM

fragmentiert, die Tochterionen [M – H]¯ 307 (Wasserverlust), 175

(Glucuronsäure), 149 (Thymol; nur schwach erkennbar) und 113 sind im

MS/MS-Spektrum zu erkennen (unten). .......................................................... 146

Abb. 8.7 LC-ESI-MS-Spektrum von Thymolsulfat ([M – H]¯ = 229 amu) im Plasma

nach Einnahme einer Tablette Bronchipret® TP (oben). Das Molion wurde per

SRM fragmentiert, die Tochterionen [M – H]¯ 211 (Wasserverlust), 201, 165

(SO2 Verlust), 149 (Thymol) und 80 (SO3¯) sind im MS/MS-Spektrum zu

erkennen (unten). ............................................................................................ 147

Abb. 8.8 LC-ESI-MS-Spektrum von Thymolglucuronid ([M – H]¯ = 325 amu) in Urin

(10 Tabletten) (oben). Das Molion wurde per SRM fragmentiert, die Tochterionen

[M – H]¯ 307 (Wasserverlust), 175 (Glucuronsäure), 149 (Thymol) und 113 sind

im MS/MS-Spektrum zu erkennen (unten). ..................................................... 148

Abb. 8.9 LC-ESI-MS-Spektrum (oben) von Thymolsulfat ([M – H]¯ = 229 amu) in Urin

(10 Tabletten). Das Molion wurde per SRM fragmentiert, die Tochterionen [M –

H]¯ 211 (Wasserverlust), 201, 165 (SO2 Verlust), 149 (Thymol) und 80 (SO3¯)

sind im MS/MS-Spektrum zu erkennen (unten)............................................... 149


Abb. 8.10 Graphische Darstellung der individuellen Thymolsulfat-

Plasmakonzentrations-Zeitverläufe. Zur Bestimmung von ke wurden jeweils die

letzten 4 Wertepaare herangezogen. .............................................................. 150

Abb. 8.11 Graphische Darstellung des Fittings der Thymol-Plasmakonzentrationen

für ein Zweikompartiment- (Proband A-K) bzw. Einkompartiment-Modell

(Proband L). .................................................................................................... 152

Abb. 8.12 Sigma-Minus-Plots zur Ermittlung der Eliminationskonstante ke. .......... 154

Abb. 8.13 Renale Clearance-Plots (Ut gegen AUCt). ............................................. 156

10 Tabellenverzeichnis 162

10 Tabellenverzeichnis

Tab. 1.1 Pharmakokinetik Ätherischer-Öl-Verbindungen (Fortsetzung s. Seite 21). 20

Tab. 1.2 Resorption in Tier und Mensch .................................................................. 22

Tab. 1.3 Metabolismus in Tier und Mensch.............................................................. 23

Tab. 1.4 Elimination bei Nagern ............................................................................... 24

Tab. 1.5 Elimination beim Menschen ....................................................................... 25

Tab. 2.1 Kalibrierfunktion für Thymol im Plasma. ......................................................44

Tab. 2.2 Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Thymol in humanem

Plasma. Variationskoeffizient und Relativer Fehler wurden jeweils aus den

Meßpunkten einer Konzentration bestimmt. ...................................................... 44

Tab. 2.3 Kalibrierfunktion für Thymol, als Interner Standard wurde t-Anethol

verwendet.......................................................................................................... 52

Tab. 2.4 Kalibrierfunktion (Konzentrationen: 1,4; 14,0; 28,0; 140,0 ng⋅mL-1) für die

Bestimmung von Thymol im Plasma. ................................................................ 56

Tab. 2.5 Kalibrierfunktion (Konzentrationen: 2,12; 5,3; 10,6; 21,2; 53,0; 106,0;

212,0 ng⋅mL-1) zur Bestimmung von Thymol im Urin......................................... 57

Tab. 2.6 Interkalibrierung des Arbeitstandards mit dem Primärstandard.................. 62

Tab. 2.7 Parameter der Kalibrierfunktionen für Thymol............................................ 67

Tab. 2.8 Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Thymol während der

Validierung („intra-day precision“). .................................................................... 68


Validierung („between-day precision“), berechnet aus den Mittelwerten der „intra-

day precision“. ................................................................................................... 68

Tab. 2.10 Stabilität von Thymolsulfat im Plasma bei Lagerung bei -20°C. Die Werte

entsprechen jeweils den Mittelwerten aus 2 Messungen, Gehalt in [%]. ........... 69

Tab. 2.11 Stabilität der Plasmaproben im Autosampler (n=4). ................................. 70

Tab. 2.12 Wiederfindung für verschiedene Konzentrationen von Thymol aus

humanem Plasma für Headspace-Festphasenmikroextraktion. ........................ 71

Tab. 2.13 Parameter der Kalibrierfunktionen für die Bestimmung von Thymol im

Urin.................................................................................................................... 76


Validierung („intra-day precision“). .................................................................... 77



Validierung („between-day precision“), ermittelt aus den Mittelwerten der „intra-

day precision“. ................................................................................................... 77

Tab. 2.16 Stabilität der Thymol-Konjugate im Urin bei Lagerung bei -20°C. Die Werte

entsprechen jeweils den Mittelwerten aus 2 Messungen, Gehalt in [%]. ........... 78

Tab. 2.17 Stabilität der Urinproben im Autosampler (n=4). ...................................... 78

Tab. 2.18 Wiederfindung für verschiedene Konzentrationen von Thymol aus

humanem Urin für Headspace-Festphasenmikroextraktion............................... 80

Tab. 2.19 Gradient zur Trennung von Thymol und Thymolglucuronid...................... 83

Tab. 3.1 Thymolsulfat-Plasmakonzentrationen der Probanden A-D, F-L,

MW=arithmetischer Mittelwert (n=11), SD=Standardabweichung,

Min=Minimalwert, Max=Maximalwert, GEO=Geometrisches Mittel. .........98

Tab. 3.2 Renale Elimination von Thymol (in Form seiner Phase-II-Konjugate) in

Prozent der applizierten Dosis (1,08 mg Thymol). MW=arithmetischer Mittelwert

(n=11), SD=Standardabweichung, Min=Minimalwert, Max=Maximalwert,

GEO=Geo-metrisches Mittel.............................................................................. 99

Tab. 3.3 Pharmakokinetische Parameter der Nichtkompartiment-Analyse (Definition

der Parameter in Absatz 2.11.1); MW=Mittelwert (n=11),

SD=Standardabweichung, Min=Minimalwert, Max=Maximalwert, GEO=Geome-

trisches Mittel. ................................................................................................. 101

Tab. 3.4 Pharmakokinetische Parameter der Kompartiment-Analyse (Definition der

Parameter siehe Absatz 2.11.2) nach Anpassung des Mittelwertes und des

Medianes an ein Zweikompartiment-Modell. ................................................... 103

Tab. 3.5 Bestimmung der Eliminationshalbwertszeit aus den jeweiligen Sigma-Minus-

Plots. MW=Mittelwert (n=11), SD=Standardabweichung, Min=Minimalwert,

Max=Maximalwert, GEO=Geometrisches Mittel.............................................. 105

Tab. 3.6 Bestimmung der renalen Clearance aus den jeweiligen Clearance- Plots.

MW=Mittelwert (n=11), SD=Standardabweichung, Min=Minimalwert, Max=Maxi-

malwert, GEO=Geometrisches Mittel. ............................................................. 105

Tab. 8.1 Demographische Daten der Probanden. ...................................................132

Tab. 8.2 Stabilität der Plasmaproben nach 24 h im Autosampler........................... 133

Tab. 8.3 Kalibrierfunktionen während der Vermessung der Plasmaproben. .......... 133

Tab. 8.4 Ergebnisse der Qualitätskontrollproben (Plasma). ................................... 134


Tab. 8.5 Stabilität der Urinproben im Autosampler nach 24 h. ............................... 134

Tab. 8.6 Kalibrierfunktionen während der Vermessung der Urinproben................. 135

Tab. 8.7 Ergebnisse der Qualitätskontrollproben (Urin). ........................................ 135

Tab. 8.8 Berechnungsgrundlagen der in Kinetica 2000 verwendeten

pharmakokinetischen Parameter für extravaskuläre Applikation. .................... 136

Tab. 8.9 Plasmakonzentrationen [ng.mL-1] von Thymolsulfat, Probanden A-D. ..... 137

Tab. 8.10 Plasmakonzentrationen [ng.mL-1] von Thymolsulfat, Probanden E-H. ... 138

Tab. 8.11 Plasmakonzentrationen [ng.mL-1] von Thymolsulfat, Probanden I-L. ..... 139

Tab. 8.12 Kumulative Urinausscheidung Ut [µg] von Thymol nach enzymatischer

Spaltung der Thymol-Konjugate. ..................................................................... 140

Tab. 8.13 Individuelle Pharmakokinetische Parameter der Nichtkompartiment-

Analyse............................................................................................................ 141

Tab. 8.14 Tabellarische Darstellung des Fittings der Thymol-Plasmakonzentrationen

für ein Zweikompartiment-Modell (Proband A-K) bzw. Einkompartiment-Modell

(Proband L). .................................................................................................... 142

Tab. 8.15 Prozentuale Verhältnisse der Fragmente von Thymol (Plasma). ........... 143

Tab. 8.16 Prozentuale Verhältnisse der Fragmente von Thymol (Urin).................. 144

11 Abkürzungsverzeichnis 165

11 Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

AP alkalische Phosphatase

bzw. beziehungsweise

ca. circa

CK Creatinkinase

Cp Plasmakonzentration

CRP c-reaktives Protein

CV Variationskoeffizient (coefficient of variation)

EI Elektronenstoßionisation

ESI Electrospray Ionisation

FDA Food and Drug Administration

FID Flammenionisiationsdetektor, -detektion

GC Gaschromatographie

GEO geometrisches Mittel

GOT Glutamat-Oxalacetat-Transaminase

GPT Glutamat-Pyruvat –Transaminase

h Stunde(n)

HPLC high performance liquid chromatography

I.D. Innendurchmesser

IC50 Halbmaximale Hemmkonzentration

Istd Interner Standard

i.v. intravenös

LC Liquid Chromatography

LD50 mittlere tötliche Dosis, bei der 50 % der Versuchstiere sterben

LDH Lactat-Dehydrogenase

LOQ Limit of Quantification, Bestimmungsgrenze

M mol⋅L-1

MCV mittleres zelluläres Erythrozytenvolumen

min Minute(n)

MS Massenspektrometrie

11 Abkürzungsverzeichnis 166

MW Mittelwert

n Anzahl

NMR Nuclear Magnetic Resonance

PA Polyacrylat

PDMS-DVB Polydimethylsiloxan-Divenylbenzen

PGE2 Prostaglandin E2

PTT Thromboplastin-Zeit

QCs Qualitätskontrollproben

R.t. Retentionszeit

RE Relativer Fehler

Rel.Resp. relative Response

R2 Korrelationskoeffizient

LC Liquid Chromatography

rpm rounds per minute

s. siehe

SD Standardabweichung

SIM Selected Ion Monitoring

SPME Festphasenmikroextraktion, Solid-Phase-Microextraction

SRM Selected Reaction Monitoring

Tab. Tabelle

TIC Total Ion Current (Totalionenstrom)

TSH Thyreotropin

UDPGA Uridin-5`-Diphosphoglucuronsäure

UV Ultraviolett

z.B. zum Beispiel

Hiermit versichere ich an Eides statt, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und

nur mit den angegebenen Hilfsmitteln angefertigt habe. Diese Dissertation hat in

gleicher oder ähnlicher Form zuvor keinem anderen Prüfungsverfahren vorgelegen.

Ich habe noch keine anderen akademischen Grade erworben oder zu erwerben

versucht.

CURRICULUM VITAE

Persönliche Angaben Geburtsdatum:

30. Januar 1973

Geburtsort: Bad Kissingen, Deutschland Staatsangehörigkeit: deutsch

Ausbildung 09.98 - heute

Promotion

Bei Privatdozent Dr. Markus Veit „Systemische Verfügbarkeit und Pharmakokinetik von Thymol nach oraler Applikation einer thymianhaltigen Zubereitung im Menschen“

06.00 – 06.01 Bionorica AG

04.00 - 05.00 DAAD Stipendium, University of Florida, Gainesville, USA, bei Prof. Dr. H. Derendorf, Department of Pharmaceutics

09.98 - 03.00 Universität Würzburg,

Lehrstuhl für Pharmazeutsiche Biologie

01.98 - 08.98 Apothekenpraxis

Elisabeth Apotheke, Schweinfurt

11.96 - 11.97 3. Abschnitt der Pharmazeutischen Prüfung

05.97 - 11.97 2. Hälfte des Praktischen Jahres: Henneberg-Apotheke, Nüdlingen

11.96 - 05.97 1. Hälfte des Praktischen Jahres: Apotheke des Klinikums St. Marien, Amberg

11.92 - 10.96 Pharmaziestudium

Bayerische Julius-Maximilians-Universität Würzburg, 1. Staatsexamen September 1994 2. Staatsexamen Oktober 1996

1983 - 1992 Mai 1992

Gymnasium Bad Kissingen Abitur

1979 - 1983 Anton-Kliegl Schule Bad Kissingen

Documents

Claudia Kohlert Systemische Verfügbarkeit und ...Pharmazeutische Biologie, die durch ihre Hilfe einen wertvollen Beitrag zu einem sehr angenehmen Arbeitsklima leisteten. Meinen Kollegen