Een studie van de antioxidatieve enzymatische respons bij …lib.ugent.be/fulltxt/RUG01/002/216/834/RUG01-002216834... · 2015-11-08 · enzymen zoals SOD, CAT, APX en POX werd nagegaan

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen

Academiejaar 2014 – 2015

Een studie van de antioxidatieve enzymatische respons

bij diploïde en tetraploïde rozen onder droogtestress

Deborah Ongenaert

Promotor: Prof. Dr. Ir. Marie-Christine Van Labeke

Tutor: Ir. Katrien De Dauw

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van

Master of Science in de industriële wetenschappen: biochemie

AUTEURSRECHT

“De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te

stellen en delen van de scriptie te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt

onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de

verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze

scriptie.”

“The author and the promoter give the permission to use this thesis for consultation and to

copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more

specifically the source must be extensively specified when using the results from this thesis”.

Gent, januari 2015 Promotor Auteur Prof. Dr. Ir. Marie-Christine Van Labeke Deborah Ongenaert

WOORD VOORAF

Een thesis maak je nooit alleen, daarom dan ook kort dit dankwoord.

Eerst en vooral wil ik graag mijn promotor Prof. Dr. Ir. Marie-Christine Van Labeke bedanken

voor de kans die ik gekregen heb om mijn masterproef uit te voeren in haar vakgroep. Eveneens

ben ik zeer dankbaar voor haar suggesties en feedback zonder dewelke deze thesis niet tot stand

had kunnen komen.

Ik wil ook mijn begeleidster Ir. Katrien De Dauw bedanken om mij wegwijs te maken in het

laboratorium, haar tijd en input in mijn experimenten, voor de sfeer en ontspannende babbels

tussen de metingen door en de laboradio.

Speciale dank gaat uit naar Ann De Wulf, om altijd klaar te staan om mijn vragen te

beantwoorden, haar bijdrage aan de optimalisaties en om praktische suggesties te geven om

mijn labowerk te verbeteren. Gil, voor zijn goedlachsheid en positivisme, alsook alle

doctoraatsstudenten en het personeel van het labo voor de aangename sfeer.

SAMENVATTING

Droogte heeft een sterke negatieve impact op de plantaardige productie. Vanwege de

klimaatwijziging zal de landbouw geconfronteerd worden met langere periodes van droogte

tijdens de actieve groeifase van de teelten. Hierdoor wordt in de plantenveredeling sterk

gezocht naar het inbrengen van droogtetolerantie.

Rozen hebben veel toepassingen en worden gewaardeerd als sierplanten, hagen en

bodembedekkers. Een langere droogteperiode tijdens de zomermaanden kan echter de

bloeikwaliteit negatief beïnvloeden. In deze studie werd het enzymatische antioxidatieve

verdedigingsmechanisme bij diploïde en tetraploïde rozen onder droogtestress onderzocht.

Er werd gebruik gemaakt van drie roos genotypes (genotype 16, genotype 96 en Rosa

laevigata). Droogte werd toegepast gedurende 21 dagen door het stoppen van irrigatie. Er

werden analyses uitgevoerd op 7, 14 en 21 dagen na inductie van droogte. Het

proteïnegehalte in bladextracten werd bepaald en de activiteit van ROS-opruimende

enzymen zoals SOD, CAT, APX en POX werd nagegaan.

Volgens de resultaten van deze studie werd gevonden dat de planten van genotype 16 en

96 zich in matige tot ernstige droogtestress verdedigen tegen de beschadigende effecten

van ROS door het verhogen van de activiteit van SOD. De verdedigingsantwoorden aan

droogtestress waren minder merkbaar in POX, CAT en APX activiteit. De activiteit van deze

enzymen nam wel toe in het begin van het experiment bij matige stress, maar nam

vervolgens af indien de droogtestress ernstig werd. Dit is ook in overeenstemming met de

waargenomen afname van het totale proteïnegehalte in de bladeren onder droogtestress. Bij

R. laevigata kwam APX bij milde tot matige droogtestress tussen in detoxificatie van ROS,

maar werd eveneens geen bijdrage in POX-activiteit waargenomen. Verder werd

waargenomen dat er geen toegevoegde waarden worden gecreëerd in de enzymatische

respons door polyploïdie te induceren in roos.

Trefwoorden: Antioxidatieve enzymen, Droogtestress, Polyploïdie, Rozen

ABSTRACT

Drought has a negative impact on crop production. Due to climate change, agriculture will be

confronted with long periods of drought during the active growth phase of crops. As a result,

there is a need for the development and identification of more drought tolerant plants.

Rose plants are valued as ornamental plants, hedges and ground covers. A prolonged dry

period in summer will have a negative impact on flowering quality. This study focuses on the

enzymatic antioxidant defense mechanism in diploid en tetraploid roses under drought

stress. Three rose genotypes (genotype 16, genotype 96 and Rosa laevigata) were used.

Drought was applied for 21 days by stopping the irrigation. Analyses were performed on 7,

14 and 21 days after induction of drought. The protein content in leaves was determined.

The concentration of ROS-scavenging enzymes such as SOD, CAT, APX and POX were

also examined.

According to the results of this study the plants of genotype 16 and 96 defend themselves

against the damaging effects of ROS in moderate to severe drought stress by enhancing the

activity of SOD. The defense responses to drought stress were less noticeable in POX, CAT

and APX activity. The activity of these enzymes does increase at the beginning of the

experiment for moderate stress, but decreases rapidly when the drought stress becomes

severe. This is also in agreement with the observed decrease of the total protein content in

the leaves. In R. laevigata an increase of APX activity in mild to moderate drought stress was

observed, but no contribution was seen in POX activity. Finally it was seen that no added

values are created in the enzymatic response by inducing polyploidy in rose plants.

Keywords: Antioxidative enzymes, Drought stress, Polyploidy, Rose

INHOUDSOPGAVE

1. INLEIDING .................................................................................................................... 1

2. LITERATUURSTUDIE ................................................................................................... 3

2.1 DE ROSACEAE FAMILIE .................................................................................................... 3

2.2 POLYPLOÏDIE................................................................................................................. 4

2.3 MORFOLOGISCHE EN FYSIOLOGISCHE AANPASSINGEN AAN DROOGTESTRESS .............................. 5

2.4 BIOCHEMISCHE AANPASSINGEN AAN DROOGTESTRESS .......................................................... 8

2.4.1 OXIDATIEVE STRESS ...................................................................................................... 8

2.4.2 PRO-OXIDANTEN .......................................................................................................... 9

2.4.3 PLAATSEN VAN ROS PRODUCTIE .................................................................................... 11

2.4.4 NEGATIEVE EFFECTEN VAN REACTIEVE ZUURSTOFVORMEN .................................................. 12

2.4.5 ANTIOXIDATIEVE ENZYMEN .......................................................................................... 14

2.4.6 ANTIOXIDATIEVE METABOLIETEN .................................................................................. 17

3. MATERIAAL EN METHODEN ...................................................................................... 19

3.1 PROEFOPZET SERRE ...................................................................................................... 19

3.2 EIWITEXTRACTIE ......................................................................................................... 20

3.3 PROTEÏNEBEPALING VOLGENS BRADFORD ........................................................................ 20

3.4 BEPALING VAN DE CATALASE-ACTIVITEIT ......................................................................... 21

3.5 BEPALING VAN DE SUPEROXIDE DISMUTASE-ACTIVITEIT ..................................................... 22

3.6 BEPALING VAN DE GUAIACOLPEROXIDASE-ACTIVITEIT ........................................................ 23

3.7 BEPALING VAN DE ASCORBAAT PEROXIDASE-ACTIVITEIT ..................................................... 23

3.8 STATISTISCHE ANALYSE ................................................................................................. 24

4. RESULTATEN ............................................................................................................. 25

4.1 METHODOLOGISCH ONDERZOEK ..................................................................................... 25

4.1.1 SOD-ANALYSE ............................................................................................................ 25

4.1.2 EIWITEXTRACTIE ....................................................................................................... 30

4.1.3 POX-ANALYSE ............................................................................................................ 32

4.1.4 APX-ANALYSE ............................................................................................................ 33

4.2 DROOGTESTRESS-EXPERIMENT ....................................................................................... 36

4.2.1 EFFECTEN VAN POLYPLOÏDIE OP DE ACTIVITEIT VAN STRESS-ENZYMEN .................................. 36

4.2.2 EFFECTEN VAN DROOGTESTRESS OP HET TOTALE EIWITGEHALTE .......................................... 37

4.2.3 EFFECTEN VAN DROOGTESTRESS OP DE ACTIVITEIT VAN STRESS-ENZYMEN .............................. 39

5. DISCUSSIE .................................................................................................................. 50

6. ALGEMEEN BESLUIT .................................................................................................. 57

7. LITERATUURLIJST ..................................................................................................... 59

LIJST MET AFKORTINGEN

O2- Superoxide radicaal

OH Hydroxylradicaal

1O2 Singlet zuurstof

2x Diploïd

4x Tetraploïd

APX Ascorbaatperoxidase

Arg Arginine

AsA Ascorbaat

Ca Calcium

CAT Catalase

Cys Cysteïne

DHA Dehydroascorbaat

DHAR Dehydroascorbaatreductase

dinucleotide

DNA Desoxyribonucleïnezuur

EDTA Ethyleendiaminetetra-azijnzuur

ETC Elektronentransportketen

Fe IJzer

GR Glutathionreductase

Grx Glutaredoxine

GSH Glutathion

GSSG Glutathiondisulfide

H2O2 Waterstofperoxide

HO2 Hydroperoxylradicaal

LPO Lipidenperoxidatie

Lys Lysine

MDHA Monodehydroascorbaat

MDHR Monodehydroascorbaatreductase

Met Methionine

MQ Milli-Q (dubbel gedestilleerd water)

Na Natrium

NADPH Gereduceerd nicotinamide adenine

NO Stikstofmonoxide

O2 Zuurstof

ONOO- Peroxynitriet

POX Guaiacolperoxidase

Pro Proline

Prx Peroxiredoxines

PUFA Polyonverzadigde vetzuren

PVP Polyvinylpyrrolidone

PVPP Polyvinylpolypyrrolidone

PX Peroxidasen

R. laevigata Rosa laevigata

RL Rosa laevigata

ROS Reactive Oxygen Species

SOD Superoxidedismutase

Thr Threonine

Trp Tryptofaan

Trx Thioredoxine

LIJST MET FIGUREN EN TABELLEN

Figuur 1: Effecten van polyploïdie op blaadjes en bloemen van het Rosa species Thérèse Bugnet. ................... 5

Figuur 2: Wortelgroei en proliferatie onder goede bewatering en droogtestress. ................................................. 6

Figuur 3: Regulatie van de stomata. ..................................................................................................................... 7

Figuur 4: ROS chemie. ......................................................................................................................................... 9

Figuur 5: De Haber Weiss reactie. ...................................................................................................................... 10

Figuur 6: De mitochondriale elektronentransportketen. ...................................................................................... 11

Figuur 7: Kettingreactie van lipidenperoxidatie.. ................................................................................................. 13

Figuur 8: Structuur van α-tocoferol.. ................................................................................................................... 17

Figuur 9: Structuur van glutathion. ...................................................................................................................... 17

Figuur 10: Ascorbaat-glutathioncyclus. ............................................................................................................... 18

Figuur 11: Visuele weergave van de indeling van de serre. ............................................................................... 19

Figuur 12: Principe van de SOD assay kit. ......................................................................................................... 22

Figuur 13: Grafische voorstelling van de gemiddelde eiwitconcentratie bij gebruik van 2 extractiebuffers met

verschillende PVPP concentratie. ....................................................................................................................... 27

Figuur 14: Het interfererende effect van ascorbinezuur op de SOD meting. ...................................................... 28

Figuur 15: Grafische voorstelling van het effect van ascorbinezuur op de eiwitconcentratie in het extract. ....... 28

Figuur 16: Voorstelling van de multiwellplaat na meting ter illustratie van de interfererende componenten. ...... 29

Figuur 17: SOD inhibitiecurve bij verschillende incubatietijden. ......................................................................... 29

Figuur 18: Grafische weergave van de invloed van vortexen op de eiwitconcentratie in het extract. ................. 31

Figuur 19: De invloed van protease-inhibitoren op het behoud van de eiwitconcentratie. Het activiteitsverlies

van de eiwitextracten in verloop van de tijd wordt weergegeven.. ...................................................................... 32

Figuur 20: Kleurontwikkeling door reactie van guaiacol met peroxidase.. .......................................................... 33

Figuur 21: Grafische voorstelling van de APX bepaling via oxidatie van pyrogallol tot purpurogallin ................. 35

Figuur 22: Het verloop van het volumetrisch vochtgehalte van het substraat bij genotype 16 in functie van de

duur van de opgelegde droogtestress.. .............................................................................................................. 40

Figuur 23: De invloed van droogtestress in de tijd op de APX-activiteit van genotype 16. ................................. 41

Figuur 24: De invloed van droogtestress in de tijd op de POX-activiteit van genotype 16.. ................................ 41

Figuur 25: De invloed van droogtestress in de tijd op de CAT-activiteit van genotype 16.. ................................ 42

Figuur 26: De invloed van droogtestress in de tijd op de SOD-activiteit van genotype 16. ................................. 43

Figuur 27: De invloed van droogtestress op de morfologie van genotype 16. .................................................... 43

Figuur 28: Het verloop van het volumetrisch vochtgehalte van het substraat bij genotype 96 in functie van de

duur van de opgelegde droogtestress.. .............................................................................................................. 44

Figuur 29: De invloed van droogtestress in de tijd op de APX-activiteit van genotype 96.. ................................ 44

Figuur 30: De invloed van droogtestress in de tijd op de POX-activiteit van genotype 96.. ................................ 45

Figuur 31: De invloed van droogtestress in de tijd op de CAT-activiteit van genotype 96.. ................................ 46

Figuur 32: De invloed van droogtestress in de tijd op de SOD-activiteit van genotype 96. ................................. 46

Figuur 33: De invloed van droogtestress op de morfologie van genotype 96. .................................................... 47

Figuur 34: Het verloop van het volumetrisch vochtgehalte van het substraat bij genotype Rosa laevigata in

functie van de duur van de opgelegde droogtestress. ........................................................................................ 47

Figuur 35: De invloed van droogtestress in de tijd op de APX-activiteit van genotype Rosa laevigata............... 48

Figuur 36: De invloed van droogtestress in de tijd op de POX-activiteit van genotype Rosa laevigata. ............. 49

Figuur 37: De invloed van droogtestress op de morfologie van genotype Rosa laevigata. ................................ 49

Tabel 1: Samenstelling van de oorspronkelijke extractiebuffer voor SOD-analyse............................................. 25

Tabel 2: Samenstelling van de verschillende blanco-oplossingen en stalen die gebruikt worden in SOD analyse.

........................................................................................................................................................................... 26

Tabel 3: Activiteiten van antioxidatieve enzymen in controleplanten van genotype 16 op 3 tijdstippen tijdens het

experiment. ......................................................................................................................................................... 36

Tabel 4: Activiteiten van antioxidatieve enzymen in controleplanten van genotype 96 op 3 tijdstippen tijdens het

experiment. ......................................................................................................................................................... 37

Tabel 5: Activiteiten van antioxidatieve enzymen in controleplanten van genotype Rosa laevigata op 3

tijdstippen tijdens het experiment. ...................................................................................................................... 37

Tabel 6: De hoeveelheid geëxtraheerde eiwitten in genotype 16 voor de analyse van de stress-enzymen. De

eiwitten werden geëxtraheerd uit bladmateriaal. ................................................................................................ 38

Tabel 7: De hoeveelheid geëxtraheerde eiwitten in genotype 96 voor de analyse van de stress-enzymen. De

eiwitten werden geëxtraheerd uit bladmateriaal. ................................................................................................ 38

Tabel 8: De hoeveelheid geëxtraheerde eiwitten in genotype Rosa laevigata voor de analyse van de stress-

enzymen. ............................................................................................................................................................ 39

Tabel 9: Trend van de antioxidatieve enzymen in de verschillende genotypes bij onderwerping aan

droogtestress. ..................................................................................................................................................... 52

Tabel 10: Een vergelijking van de hoogst gemeten activiteit van elk bepaald antioxidant enzym in de

droogteplanten. ................................................................................................................................................... 55

Hoofdstuk 1: Inleiding 1

1. INLEIDING

In de natuur worden planten voortdurend blootgesteld aan verschillende soorten biotische

en abiotische stress. Onder deze soorten stress is droogtestress één van de meest

ongunstige factor die de groei en productiviteit van de plant negatief beïnvloedt. Droogte

wordt aanzien als een ernstige bedreiging voor de plantaardige productie. Droogte leidt tot

een heleboel veranderingen in planten, gaande van wijzigingen in het cellulair metabolisme

tot veranderingen in groeisnelheid en gewasopbrengst. Klimaatwijziging en de verhoogde

risico’s van langere droogteperiodes leiden tot de noodzakelijke ontwikkeling van nieuwe

cultivars met verbeterde tolerantie voor droogtestress. Droogtetolerante planten hebben

daarnaast ook een economisch voordeel aangezien deze minder water vereisen tijdens het

telen. Inzicht in de biochemische respons op droogte is belangrijk voor het verstaan van de

plantaardige resistentiemechanismen onder beperkte watervoorraad en de kennis kan

gebruikt worden ter ontwikkeling of selectie van meer stressbestendige planten.

Abiotische stress zoals te veel zonlicht of droogte leidt in de plant tot oxidatieve stress.

Oxidatieve stress wordt gedefinieerd als een bovenmatige blootstelling aan reactieve

zuurstofverbindingen of Reactive Oxygen Species (ROS). Het is het gevolg van een

verstoorde balans tussen pro- en antioxidanten. ROS zoals waterstofperoxide (H2O2),

superoxide ionen (O2-) en hydroxylradicalen (OH) worden gegenereerd in metabolisch

actieve cellen. Accumulatie van ROS heeft een invloed op veel cellulaire functies door het

beschadigen van nucleïnezuren, oxideren van eiwitten en veroorzaken van

lipidenperoxidatie (LPO). Planten zijn uitgerust met efficiënte detoxificatiemechanismen voor

ROS, zodat schade aan cellen wordt voorkomen of beperkt. Superoxide ionen worden

omgezet in waterstofperoxide door superoxide dismutasen (SOD), waarna het gevormde

waterstofperoxide wordt omgezet in water en zuurstof door catalase (CAT) en/of peroxidase

(PX).

Polyploïde planten, met drie of meer sets chromosomen, kunnen verschillende

morfologische, anatomische en biochemische voordelen hebben vergeleken met diploïde

planten. Van Laere et al. 2011 vermeldt verbeterde stresstolerantie als één van de voordelen

van polyploïde Spathiphyllum wallisii. Sierplanten hebben een grote commerciële waarde,

maar worden vaak vegetatief voortgeplant waardoor er dus geen herschikking van het

moedergenoom plaatsvindt. Vooral in deze planten kan de inductie van polyploïdie en de

vermoedelijk daarmee gepaard gaande verbeterde droogtetolerantie een waardevolle

eigenschap geven.

Hoofdstuk 1: Inleiding 2

Rozen (Rosa) behoren tot de Rosaceae familie, waartoe ook appel (Malus), peer (Pyrus),

pruim (Prunus) en aardbei (Fragaria) behoren. Rozen zijn veel voorkomend en worden

gewaardeerd als sierplanten, hagen en bodembedekkers. In het uitgevoerde onderzoek

worden tuinrozen gekozen als vertegenwoordiger van de Rosaceae familie. Er zal

onderzocht worden of de activiteit van antioxidant enzymen zoals catalase, superoxide

dismutase, ascorbaat peroxidase en guaiacolperoxidase toenemen in planten onder

stressomstandigheden en correleren met verbeterde stresstolerantie, waardoor zo de

stressgevoelige en tolerante genotypes kunnen geselecteerd worden. Ook zullen de effecten

van mitotische verdubbeling op de activiteit van de stress-enzymen onderzocht worden.

Hoofdstuk 2: Literatuurstudie 3

2. LITERATUURSTUDIE

2.1 De Rosaceae familie

Traditioneel wordt de Rosaceae familie onderverdeeld in vier onderfamilies: Rosoideae,

Spiraeoideae, Maloideae en Amygdaloideae (Ross 1991). Tot de onderfamilie Rosoideae

behoort het geslacht roos (Rosa) alsook andere sierplanten zoals Potentilla en kleinfruit

waaronder aardbei (Fragaria), bramen, framboos en diverse hybridebessen (Rubus). Tot de

onderfamilie Maloideae behoren belangrijke eetbare fruitsoorten en een groot aantal van de

landschapsplanten. De meest economisch belangrijke zijn appel (Malus), peer (Pyrus) en

ook een aantal minder verspreide vruchten zoals mispel, Japanse mispel en kweepeer. De

steenvruchten, met het belangrijk geslacht Prunus (kers, pruim, abrikoos, perzik), behoren

tot de onderfamilie Amygdaloideae (Folta en Gardiner 2009).

Het onderzoeken van de taxonomie van het geslacht Rosa kan een ontmoedigende en

verwarrende taak zijn. De species zijn erg variabel en hybridiseren vrij, wat afbakening van

de soorten moeilijk maakt (Ross 1991). Het aantal chromosomen bij roos varieert van

2n=2x=14 (diploïd) tot 2n=8x=56 (octaploïd). De meeste species zijn diploïd of tetraploïd

(Rout et al. 1999). Classificatie is ook problematisch door de voortdurende verandering van

de gebruikte kenmerken. Bijvoorbeeld Rosa canina (hondsroos) wordt enkel geclassificeerd

op basis van het unieke meiotische systeem en dus niet door zichtbare kenmerken (Debener

en Gudin 2003). De taxonomische moeilijkheden hebben geleid tot meldingen tussen 100

en 250 Rosa species (Ross 1991).

Rozen zijn enkele van de meest voorkomende tuinplanten in de wereld en tuinrozen zijn één

van de meest populaire en op grote schaal geteelde planten (Debener en Gudin 2003). Ze

kunnen gebruikt worden als hagen en bodembedekkers en worden gewaardeerd als sierfruit.

De teelt stelt echter een aantal uitdagingen voor de teler wegens de geringe weerstand tegen

ziekten, extreme temperaturen, droogte en zout (Cai et al. 2012). Tuinrozen zijn goed

aangepast aan gematigde klimaten maar er is weinig wetenschappelijk onderbouwde kennis

over hun tolerantiemechanismen tegen verschillende klimaten en bodemsamenstellingen

wereldwijd. De weinige kennis over de plantreactie op milieu-invloeden zoals droogtestress,

zorgt voor een toenemende bezorgdheid in droge en semi-droge gebieden. Daarom is naast

het verbeteren van de bloemkleur, grootte en geur ook het verbeteren van bestendigheid

tegen omgevingsstress één van de toekomstdoelen (Niu en Rodriguez 2009).


2.2 Polyploïdie

Polyploïde organismen bevatten meer dan twee complete sets chromosomen in de kern.

Ploïdie wordt meestal weergegeven door de notatie nx, waarbij een kern met twee complete

sets van chromosomen wordt aangeduid als diploïd (2x), drie complete sets van

chromosomen is triploïd (3x) en vier complete sets is tetraploïd (4x). Polyploïdie kent

meerdere oorsprongen, die verband houden met de aard van de chromosomale duplicatie

(Grant 1974, Stebbins 1971). Zo wordt een autopolyploïd gevormd door de replicatie van de

chromosomen binnen een species (genoomnotatie bvb. AA -> AAAA). In tegenstelling tot

een autopolyploïd komt een allopolyploïd voort uit de verdubbeling van chromosomen tussen

verschillende species (genoomnotatie bvb. AABB). Autoallopolyploïden bevatten

gedupliceerde chromosomen van een species en minstens één set van een ander species

(genoomnotatie bvb. AAAABB).

Polyploïden kunnen spontaan ontstaan in planten tijdens de somatische celdeling (mitose)

wat kan resulteren in het ontstaan van een autopolyploïd (Stebbins 1971). Deze kunnen ook

ontstaan tijdens de meiose door niet-gereduceerde gameten. Allopolyploïden komen veel

meer voor dan autopolyploïden door de hybridisatie van verschillende species (Stebbins

1971). Polyploïden kunnen ook experimenteel geïnduceerd worden in planten door het

gebruik van mitotische inhiberende chemicaliën zoals colchicine (Dermen 1940), oryzalin

(Vella 1994), trifluralin (Eeckhaut et al. 2004) en N2O (Kitamura et al. 2009). Colchicine is

een alkaloïde dat gewonnen wordt uit zaden of knollen van Colchicum autumnale. Het

toevoegen van colchicine blokkeert de microtubuli waardoor de celdeling stopt in de

metafase (Nussbaum et al. 2007). In deze fase liggen de gecondenseerde chromosomen in

één vlak in het centrum (evenaarsvlak), maar heeft het centromeer zich nog niet in tweeën

gedeeld waardoor tetraploïdie ontstaat.

Hoewel somatische chromosoomverdubbeling geen nieuw genetisch materiaal induceert en

het enkel een bijkomende kopie van de bestaande genen en chromosomen met zich

meebrengt kan mitotische verdubbeling toch leiden tot fenotypische variatie (Adams en

Wendel 2005). Polyploïde planten hebben een breed scala aan toepassingen waardoor

veredelaars soms voorstander zijn van het gebruik ervan. In de sierteelt omvatten de

voordelen o.a. dikkere bloemblaadjes die langer bloeien dan hun diploïde tegenhangers

(Kehr 1996). De morfologische voordelen van polyploïdie werden ook aangetoond door

Kermani et al. 2003, waar het effect van oryzalin-geïnduceerde chromosoomverdubbeling in

Rosa werd onderzocht. Hierbij zag men dat chromosoomverdubbeling gepaard gaat met

toename in dikte en donkere kleur van get blad alsook in meer bloemblaadjes (zie Figuur 1).

Ook kan de anatomische en morfologische variatie leiden tot fysiologische veranderingen.

Als gevolg hiervan kunnen polyploïden een verbeterde stresstolerantie en betere resistentie

tegen plagen hebben (Levin 1983). Een studie van Li et al. 2009 toonde een hogere

resistentie tegen droogte in tetraploïde Lonicera japonica. Bovendien herstelden de

tetraploïden ook sneller na de droogtestress.


Figuur 1: Effecten van polyploïdie op blaadjes en bloemen van het Rosa species Thérèse Bugnet. Bovenaan: blaadjes van A: diploïde, B: tetraploïde vorm van Thérèse Bugnet. Hierbij vallen de grotere breedte-lengte ratio en de donkere kleur op van de tetraploïde vorm. Onderaan: bloemen van A: diploïde, B: tetraploïde vorm van Thérèse Bugnet. Merk het groter aantal bloemblaadjes op bij de tetraploïde vorm. Overgenomen uit Kermani et al. 2003.

Polyploïdie is een vaak geziene eigenschap in de familie van de Rosaceae. Hieronder volgen

slechts enkele voorbeelden. In het geslacht Fragaria zijn veel polyploïden terug te vinden,

met soorten die variëren tussen diploïd en octoploïd, waaronder gecultiveerde aardbei,

Fragaria x ananassa (Byrne 1976). Binnen het geslacht Malus is de gecultiveerde appel

‘Jonagold’ een triploïd als resultaat van de fertilisatie met een niet-gereduceerde ‘Golden

Delicious’ vrouwelijke gameet en ‘Jonathan’ pollen (Gianfranceschi et al. 1998). Binnen het

geslacht Prunus is het species P. serotina (zwarte kers) een tetraploïd (Downey en Iezzoni

2000).

2.3 Morfologische en fysiologische aanpassingen aan droogtestress

Wanneer planten worden geconfronteerd met droogtestress ondergaan deze morfologische

wijzigingen wat leidt tot functionele schade en afstoting van bepaalde delen van de plant als

de droogte aanhoudt. Het ontwikkelingsstadium van de plant bepaalt sterk hoe droogte een

plant zal beïnvloeden.


De initiële reacties op droogte omvatten een verschuiving van scheut naar wortelgroei en

reductie in fotosynthese en groei (Praba et al. 2009). Wortelontwikkeling wordt sterk

beïnvloed door ongunstige groeiomstandigheden zoals droogtestress. Dit werd ook gezien

in het onderzoek van Jaleel et al. 2008, waar de invloed van droogte op wortelgroei in rijst

werd onderzocht (zie Figuur 2). Echter, de wortelgroei heeft minder last van droogtestress

dan de scheutgroei. In oleander (Nerium oleander) ontwikkelden droogtetolerante klonen

meer nieuwe scheuten en toonden een grotere scheutgroei tijdens een droogtestress

periode, terwijl de minder droogte-tolerante planten minder nieuwe scheuten hadden en

minder scheutgroei (Niu et al. 2008). Niu en Rodriguez (2009) rapporteren dat Rosa x

fortuniana een grotere scheutgroei en bladoppervlakte had onder droogtestress en werd

geacht meer tolerant te zijn aan droogte dan de drie andere onderzochte cultivars (R x

hybride 'Dr Huey', Rosa multiflora, en Rosa odorata). Fotosynthese is het voornaamste

proces voor de productie van plant biomassa en is één van de meest gevoelige fysiologische

processen voor omgevingsstress (Hsiao en Acevedo 1974). Bijgevolg is het vermogen om

een redelijk niveau van fotosynthese te handhaven onder stress omstandigheden een goede

indicator van de tolerantie van de plant. In tegenstelling tot andere soorten stress ontstaat

droogtestress niet plotseling maar wordt het ernstiger in verloop van tijd (Munné-Bosch en

Alegre 2004). Planten acclimatiseren langzaam aan de afnemende beschikbaarheid van

water alvorens de weefsels dehydrateren. De veranderingen die plaatsvinden tijdens deze

periode verbeteren de waterhuishouding van de plant. Groei vertraagt tijdens acclimatisatie

vanwege de verminderde celexpansie en koolstofassimilatie (Costa E Silva et al. 2004).

Figuur 2: Wortelgroei en proliferatie onder goede bewatering en droogtestress. Rijstgenotypes Nip, sI 13, sI 34, sI 45 en sI50 werden opgevolgd onder goede bewatering (bovenaan) en droogtestress (onderaan). Uit Jaleel et al. 2008.


Droogte veroorzaakt ook veranderingen in de hormoonspiegels van een plant, het

reduceert namelijk groeipromotoren (Vaadia 1976). De cytokinine inhoud wordt positief

gecorreleerd met de fotosynthese en neemt af onder droogtestress (Munné-Bosch en Alegre

2004). Anderzijds wordt meer abscisinezuur (ABA) geproduceerd als de wortels beginnen te

dehydrateren en accumuleert het zuur in planten onderhevig aan droogtestress. ABA initieert

stomatale sluiting en de expressie van stress-gerelateerde genen (Aroca 2012).

De stomatale regulatie is één van de meest waardevolle mechanismen om uitdroging te

voorkomen. Het treedt snel in als antwoord op lage waterbeschikbaarheid, waarbij het soms

optreedt bij bodemwater uitputting voordat er sprake is van een meetbare verandering van

de watertoestand in het blad (Loewenstein en Pallardy 1998). Stomatale opening en sluiting

(zie Figuur 3) zorgen voor een evenwicht tussen het maximaliseren van de CO2 opname om

aan fotosynthese te doen en het reduceren van waterverlies door transpiratie (Roger en

Sánchez-Moreiras 2001). Wanneer de bodem begint te drogen wordt ABA getransporteerd

van de plantenwortels naar de scheuten en signaleert zo stomatale sluiting (Loewenstein en

Pallardy 1998). In situaties van ernstige waterdeficiëntie hangt het overleven van de plant af

van de mogelijkheid tot minimaliseren van de hoeveelheid water die verloren gaat via de

epidermis nadat de stomata gesloten zijn (Praba et al. 2009). Hoewel sluiting van de stomata

zorgt dat de plant kan omgaan met waterdeficiëntie minimaliseert dit ook de opname van

CO2 en leidt het tot verminderde opbrengst omdat de plant niet aan fotosynthese kan doen

aan de maximale capaciteit (Praba et al. 2009).

Figuur 3: Regulatie van de stomata. Bij droogte stijgt de concentratie aan ABA in de wortels. Vervolgens wordt het zuur via het xyleem getransporteerd naar de bladeren en komt het in de stomata terecht, waar het de instroomkanalen van Ca2+ en de protonenpompen inhibeert, wat leidt tot een stijging van de pH in het cytosol. Hierdoor wordt instroom van K+-ionen verhindert en wordt de uitstroom ervan geïnduceerd. Als gevolg is er een wateruitstroom en zal er geen turgordruk opgebouwd worden in de stomata waardoor deze gesloten blijven. Aangepast uit Araújo et al. 2011.


Veroudering en abscissie (afvallen van plantendelen) ontstaan langzaam en zijn essentiële

onderdelen van een plantenreactie op watertekort. Deze processen verlagen water- en

voedingsstoffentekort voor de voortplantingsorganen door herschikking van voedingsstoffen

en het verminderen van het watertransport naar oudere, minder productieve bladeren (Jaleel

et al. 2009). De meest zichtbare verandering die bladeren ondergaan als zij verouderen is

vergeling, welke begint wanneer chlorofyl wordt afgebroken (Aroca 2012). Zelfs wanneer

ouder wordende bladeren niet langer bijdragen door fotosynthese bezitten deze nog

voedingsstoffen zoals lipiden en proteïnen waarvan andere delen van de plant baat bij

hebben (Munné-Bosch en Alegre 2004).

Minder duidelijk zijn veranderingen in de ultrastructuur van de cel (chromatine condensatie,

thylakoïd zwelling), in metabolisme (proteïne degradatie, lipidenperoxidatie) en

veranderingen in genexpressie (Munné-Bosch en Alegre 2004).

2.4 Biochemische aanpassingen aan droogtestress

2.4.1 Oxidatieve stress

Reactive Oxidative Species (ROS) zijn reactieve chemische entiteiten die kunnen gesplitst

worden in twee categorieën: de vrije radicalen (O2- en OH) en de non-radicalaire derivaten

(H2O2 en HOCl). Het O2 molecule is een vrij radicaal omdat het in de grondtoestand, de

meest stabiele vorm, twee ongepaarde elektronen heeft die eenzelfde spin hebben. Deze

spin-beperking maakt dat O2 liever één elektron tegelijk accepteert, wat leidt tot de generatie

van ROS (Mittler et al. 2004). De vrije radicalen worden geproduceerd als bijproduct van

verschillende metabolische pathways die gelokaliseerd zijn in verscheidene cellulaire

compartimenten zoals in chloroplast, mitochondriën en peroxisomen (Navrot et al. 2007)

terwijl de niet-radicalaire derivaten kunnen leiden tot vorming van vrije radicalen.

Een radicaal is een chemische verbinding die een ongepaard elektron bevat. Aangezien

deze configuratie energetisch ongunstig is, zal een vrij radicaal snel reageren met andere

aanwezige moleculen om naar een energetisch gunstiger gepaarde elektronenconfiguratie

over te gaan. Vaak wordt het radicaal overgedragen naar een andere molecule en

veroorzaakt dit een kettingreactie, waarbij het vrije radicaal reageert met een molecule dat

op zijn beurt een radicaal vormt. De kettingreactie die een vrij radicaal veroorzaakt, kan

schade berokkenen aan macromoleculen (Bhattacharjee 2005).

Onder steady state condities worden de ROS moleculen opgeruimd door verschillende

antioxidatieve afweermechanismen (Foyer en Noctor 2005). Antioxidanten zijn in het lichaam

voorkomende moleculen die de kettingreactie van de vrije radicalen kunnen voorkomen of

kunnen onderbreken. De antioxidanten bezitten meestal een structuur die toelaat om het vrij

elektron te delokaliseren (Zarban et al. 2009). Door deze delokalisatie zal het radicaal

gestabiliseerd worden, waardoor de antioxidant minder reactief zal zijn dan een ander vrij


radicaal. Behalve delokalisatie, kan de reactiviteit ook dalen door sterische hinder

(Gutteridge en Halliwell 2010). Het evenwicht tussen de productie en het opruimen van ROS

kan verstoord zijn door verschillende biotische en abiotische stressfactoren zoals

zoutgehalte, UV-straling, droogte, zware metalen, extreme temperaturen, tekort aan

voedingsstoffen, luchtvervuiling, herbiciden en pathogeen-aanvallen (Sarvajeet Singh 2008).

Accumulatie van ROS als het gevolg van verschillende omgevingsinvloeden is een

belangrijke oorzaak van verlies van gewas-productiviteit. ROS heeft een invloed op veel

cellulaire functies door het beschadigen van nucleïnezuren, oxideren van eiwitten en

veroorzaken van lipidenperoxidatie (LPO) (Foyer en Noctor 2005). Het is belangrijk op te

merken dat of ROS zal fungeren als schadelijk, beschermend of signaalfactor afhankelijk is

van het evenwicht tussen de productie van ROS en de opruiming op de juiste plaats en tijd

(Gratão et al. 2005a). ROS kunnen cellen beschadigen maar heeft ook een invloed op de

expressie van een aantal genen en signaal transductie pathways, wat doet veronderstellen

dat cellen strategieën ontwikkeld hebben om ROS te gebruiken als biologische prikkers en

signalen die genetische stress-antwoord programma’s activeren en controleren (Dalton et al.

1999). De celrespons blijkt sterk afhankelijk te zijn van verschillende factoren. De

subcellulaire locatie van vorming van ROS is belangrijk voor een hoog reactieve ROS omdat

deze slechts diffundeert over zeer korte afstand voor deze reageert met een cellulaire

molecule (Gratão et al. 2005a).

2.4.2 Pro-oxidanten

Het voorkomen van O2 in de respiratie en de energiesystemen welke O2 gebruiken als finale

elektronacceptor leidt tot vorming van ROS in cellen. Hoewel atmosferische zuurstof vaak

niet-reactief is, kan het aanleiding geven tot ROS waaronder O2-, H2O2, OH en 1O2 (Temple

et al. 2005).

De meest reactieve O2 vorm, singlet zuurstof (1O2) (Figuur 4), ontstaat door toevoeging van

energie uit bijvoorbeeld zonlicht waardoor de spinrestrictie wordt opgeheven. De

herschikking van de elektronen zal tot gevolg hebben dat het oxiderend vermogen sterk

toeneemt (Gutteridge en Halliwell 2010). Deze spin-inversie is een aanzienlijk probleem voor

chloroplasten, aangezien een

verkeerde energieverdeling

tijdens de fotosynthese kan

leiden tot de energietransfer

van geëxciteerd chlorofyl

naar O2 waardoor 1O2

ontstaat (Mittler et al. 2004).

In deze vorm kan O2 wel snel

reageren met verbindingen.

Indien een elektron in plaats

van energie wordt aangeboden aan O2, zal het superoxide ion (O2-) gevormd worden.

Figuur 4: ROS chemie. De vorming van verschillende ROS door energietransfer. Aangepast uit Sarvajeet Singh 2008.


Bijkomende toevoeging van een elektron levert het peroxide ion (O22-) op wat in de cel

voorkomt als waterstofperoxide (H2O2) door de toevoeging van twee protonen (H+). Dit kan

volledig gereduceerd worden tot H2O en O2 of gedeeltelijk tot het hydroxylradicaal (OH)

(Gutteridge en Halliwell 2010).

Hydroxylradicalen behoren tot de sterkste natuurlijke radicalen (Noctor et al. 2007) en zijn

verantwoordelijk voor de meeste biologische schade aangezien ze reageren met suikers,

aminozuren, fosfolipiden, nucleotiden en organische zuren (Gutteridge en Halliwell 2010).

Ze worden gevormd doordat vrije redox-actieve metalen, zoals Fe2+ en Cu2+, de productie

van OH radicalen stimuleren (Haber Weiss reactie, Figuur 5). Als gevolg van de hoge

reactiviteit zullen OH radicalen onmiddellijk na vorming reageren met naburige moleculen

via onder andere waterstofadditie en elektronentransfer. Deze reacties zullen opnieuw

radicalen vormen, maar deze zijn gewoonlijk wel minder reactief dan het hydroxylradicaal

zelf (Gutteridge en Halliwell 2010).

Figuur 5: De Haber Weiss reactie. Dit is een anorganische reactie waarbij hydroxylradicalen worden

gevormd uit waterstofperoxide en een superoxide ion. Deze reactie wordt gekatalyseerd door ijzer.

De eerste stap is een reductie van driewaardig naar tweewaardig ijzer door het superoxide ion. In de

tweede stap (Fenton-reactie) wordt het tweewaardige ijzer door waterstofperoxide geoxideerd. De

nettoreactie (Haber Weiss) kan onderaan gezien worden. Gebaseerd op Halliwell 2006.

Het superoxide ion is matig reactief en kan over beduidende afstand diffunderen alvorens

het reageert (Halliwell en Gutteridge 2007). De reacties omvatten reductie, oxidatie en

dismutatie. In waterige oplossing kan het superoxide ion geprotoneerd worden waardoor het

reactievere hydroperoxylradicaal (HO2) ontstaat (zie Figuur 4). Het superoxide ion kan ook

reageren met stikstofmonoxide (NO) waardoor het reactieve peroxynitriet (ONOO-) ontstaat

(Apel en Hirt 2004).

Waterstofperoxide is net als het superoxide ion weinig reactief en kan weg diffunderen van

de plaats van vorming. Doordat het een zwak oxiderend en reducerend agens is kan het een

aantal enzymen meteen inactiveren door oxidatie van thiolgroepen in het actief centrum

(Bhattacharjee 2005).


2.4.3 Plaatsen van ROS productie

De productie van O2- gebeurt zowel enzymatisch als niet-enzymatisch. NADPH-oxidasen

gelegen op de plasmamembraan zijn de belangrijkste enzymatische bron van O2- in planten.

Ze gebruiken elektronen afkomstig van intracellulair NADPH om O2- te vormen uit O2 (Kim

et al. 2008). Daarnaast katalyseren lipoxygenasen de reductie van linol- en α-linoleenzuur,

beide belangrijke bouwstenen van membranen. In contact met O2 kunnen deze gereduceerd

worden waardoor O2- als bijproduct ontstaat (Mittler et al. 2004).

De niet-enzymatische productie van O2- gebeurt in de chloroplasten, mitochondriën en

peroxisomen als een bijproduct van metabole processen zoals fotosynthese en respiratie

(Turrens 2003). De meeste elektronentransportketen-stappen in mitochondriën en

chloroplasten bestaan uit enkelvoudige elektrontransfer, waaruit regelmatig elektronen

lekken die zorgen voor de reductie van O2. De mitochondriale elektronentransportketen

wordt weergegeven in Figuur 6. Deze bestaat uit vier membraangebonden

elektronentransportcomplexen (I – IV) en één ATP synthesecomplex. Elektronen afkomstig

van complex I of II worden overgebracht naar complex III en IV, waar zuurstof gereduceerd

wordt tot water. Complex I en complex III kunnen, door directe transfer van elektronen naar

O2, leiden tot de vorming van het superoxide ion (Balaban et al. 2005).

In de peroxisomen wordt H2O2 gevormd als bijproduct van de vetzuuroxidatie. Hoewel

peroxisomen H2O2 kunnen neutraliseren, kunnen veroudering of stresscondities ervoor

zorgen dat de ROS productie toeneemt omdat de catalase-activiteit vermindert (Schrader en

Fahimi 2004).

Figuur 6: De mitochondriale elektronentransportketen. Energierijke elektronen uit de Krebscyclus geven hun energie af in een serie van redoxreacties, waarbij uiteindelijk zuurstof wordt gereduceerd tot water. De energie wordt gebruikt om een protonengradiënt te creëren. De protonengradiënt zorgt voor synthese van ATP, welke energie levert voor enzymatische en cellulaire processen. Superoxide ionen worden gevormd ter hoogte van complex I en III. Overgenomen uit Balaban et al. 2005.


2.4.4 Negatieve effecten van reactieve zuurstofvormen

Aangezien de verschillende antioxidatieve systemen niet altijd 100% efficiënt zijn is

oxidatieve schade aan macromoleculen onvermijdelijk. Tevens heeft dit ook geleid tot de

ontwikkeling van verschillende mechanismen die de schade kunnen herstellen.

De peroxidatie van lipiden (LPO) wordt beschouwd als het meest schadelijke proces dat

optreedt in eender welk levend organisme. Zowel in cellulaire- als organelmembranen vindt

LPO plaats wanneer een bovendrempel van het ROS gehalte wordt bereikt (Navrot et al.

2007). Het betreft een oxidatieve degradatie van lipiden. Hierdoor wordt niet alleen het

normale cellulaire functioneren beïnvloedt maar verergert de oxidatieve stress ook via de

productie van lipideradicalen (Montillet et al. 2005).

De destructie van de membraanlipiden en de eindproducten van de

lipidenperoxidatiereacties zijn gevaarlijk voor de structurele integriteit van cellen en weefsels.

De algemene effecten van LPO zijn het verlagen van de membraan vloeibaarheid,

verhoogde lekkage van de membranen naar substanties die normaal niet kunnen passeren,

behalve door specifieke kanalen alsook het beschadigen van membraanproteïnen waardoor

receptoren, enzymen en ionkanalen worden geïnactiveerd (Gill en Tuteja 2010).

De kettingreactie en het verloop van lipidenperoxidatie worden weergegeven in Figuur 7. In

de eerste stap trekken vrije radicalen elektronen aan van lipiden zoals membraangebonden

polyonverzadigde vetzuren (PUFA’s) waardoor een lipideradicaal geproduceerd wordt. De

initiators zijn meestal ROS zoals OH. Het gevormde lipideradicaal is onstabiel en reageert

snel met O2 waardoor een peroxyradicaal wordt gevormd. Deze radicalen reageren snel met

andere lipiden om een nieuw lipideradicaal en een lipideperoxide te produceren. Deze

kettingreactie kan versneld worden door middel van redoxactieve metalen zoals Cu waarbij

een alkoxyradicaal en een nieuw hydroxylradicaal ontstaan en de lipidenperoxidatie

exponentieel gaat toenemen. Het volledige proces kan enkel gestopt worden wanneer twee

lipideradicalen met elkaar reageren en een neutrale molecule produceren (Marnett 1999).


Figuur 7: Kettingreactie van lipidenperoxidatie. Deze bestaat uit drie stappen: initiatie, propagatie en terminatie. Tijdens de initiatie wordt een lipideradicaal gevormd. Dit wordt geïnitieerd door OH en H2O. Aangezien het lipideradicaal niet stabiel is zal het snel reageren met een zuurstofmolecule (O2) en wordt zo een peroxyradicaal gevormd. Ook dit radicaal is onstabiel en reageert met een andere lipiden waarbij opnieuw een lipideradicaal en lipidenperoxide worden gevormd. Aangepast uit Larson en Marley 2007.

Eiwitoxidatie wordt gedefinieerd als modificatie van een eiwit geïnduceerd door ROS of

bijproducten van oxidatieve stress. De carbonylering van een eiwit wordt veel gebruikt als

merker voor eiwitoxidatie (Job et al. 2005). Het onderzoek van Bartoli et al. 2004 toonde aan

dat eiwitcarbonylatie hoger was in mitochondriën dan in chloroplasten en peroxisomen in

tarwebladeren, wat doet veronderstellen dat de mitochondriën meer vatbaar zijn voor

oxidatieve schade. Ongeacht de locatie van ROS synthese en actie, zal ROS zich meestal

richten tot proteïnen die zwavel- en thiol groepen bevatten. Cysteïne (Cys) en Methionine

(Met) zijn vrij reactief, voornamelijk met 1O2 en OH. Geactiveerde zuurstof kan een

waterstofatoom wegtrekken van cysteïne residu’s waardoor een thiylradicaal wordt gevormd,

welke cross-links vormt naar een tweede thiylradicaal en zo zwavelbruggen vormt (Hancock

et al. 2006). Ook kan zuurstof gebonden worden aan een methionineresidu en methionine

sulfoxide derivaten vormen (Sadanandom et al. 2000).

De meeste soort eiwitoxidaties zijn onomkeerbaar, maar enkele oxidatiereacties met

zwavelhoudende aminozuren zijn omkeerbaar (Ghezzi en Bonetto 2003). Het herstel van

Cys en Met omvat reductie van de disulfidebruggen door glutathion en thioredoxide. De

andere geoxideerde eiwitten worden afgebroken door het proteasoom (Davies 2001).

Hoewel het plantengenoom zeer stabiel is kan het DNA beschadigd worden door

blootstelling aan biotische en abiotische stressfactoren. Hierbij wordt genotoxische stress

uitgeoefend (Tuteja et al. 2009). Endogeen gegenereerde schade aan het DNA staat bekend

als “spontane DNA schade” en wordt geproduceerd door reactieve metabolieten. Zoals al

eerder vermeld is OH het meest reactief en veroorzaakt deze schade aan alle componenten

van de DNA molecule, zowel de purine- en pyrimidinebasen als de deoxyribose bouwstenen


worden beschadigd (Halliwell en Gutteridge 2007). 1O2 valt voornamelijk guanine aan, terwijl

H2O2 en O2- helemaal niet reageren (Wiseman en Halliwell 1996).

De effecten van ROS op DNA omvatten base deletie, pyrimidine dimeren, breuken in

strengen en base modificatie zoals alkylatie en oxidatie (Tuteja et al. 2001). Schade in DNA

resulteert in verschillende fysiologische effecten zoals verminderde eiwitsynthese,

celmembraanvernietiging en beschadiging van fotosynthetische proteïnen welke een invloed

heeft op de groei en ontwikkeling van het hele organisme (Britt 1999). DNA-schade kan

resulteren in afremmen of inductie van transcriptie, inductie van signaaltransductie

pathways, replicatiefouten, celmembraandestructie en genomische instabiliteit (Britt 1999).

Voor het herstellen van beschadigd DNA is er het Nucleotide Excision Repair (NER)

mechanisme, waarbij de dubbele DNA helix wordt geopend en de beschadigde nucleotide

wordt verwijderd en vervangen, waarna er terug ligatie van de strengen volgt (Tuteja et al.

2001). Het Base Excision Repair (BER) mechanisme wordt gebruikt om oxidatieve schade

aan basen en suikers te herstellen. De eerst stap omvat het verbreken van de glycosidische

binding tussen de beschadigde base en suiker door glycosylase-activiteit. Door het

verwijderen van de base ontstaat een abasische plaats die herkend wordt door een

endonuclease die de fosfodiësterbinding verbreekt. Tot slot wordt de opening van één

nucleotide opnieuw gevuld en geligeerd (Bohr 2002).

2.4.5 Antioxidatieve enzymen

Om zichzelf te beschermen tegen toxische zuurstofradicalen hebben de plantencellen en de

organellen zoals chloroplast, mitochondriën en peroxisomen een antioxidant

verdedigingssysteem. Veel onderzoek heeft aangetoond dat de inductie van het cellulaire

antioxidant systeem belangrijk is voor de bescherming tegen verscheidene stress (Tuteja

2007, Sarvajeet Singh 2008). Dit systeem bestaat enerzijds uit ROS-scavenging enzymen

zoals superoxide dismutasen (SOD), catalase (CAT) en peroxidase (PX) en anderzijds uit

metabolieten. Samen voorzien zij de cellen van een efficiënt systeem om ROS te

neutraliseren en de hoeveelheid ROS in cellen onder controle te houden (Sarvajeet Singh

2008). Stresstolerantie van planten kan daarom verbeterd zijn door versterkte werking van

antioxiderende enzymen (Singh Gill en Tuteja 2011).

Het metalloenzym superoxidedismutase (SOD) (EC 1.15.1.1) is de meest effectieve

intracellulaire enzymatische antioxidant dat alomtegenwoordig is in aërobe organismen en

in subcellulaire compartimenten die gevoelig zijn aan ROS gemedieerde oxidatieve stress.

Het wordt verondersteld van belang te zijn voor stresstolerantie van planten en is een

eerstelijns verdediging tegen de toxische effecten die afkomstig zijn van verhoogde ROS

gehaltes. SOD katalyseert de dismutatie van het zeer reactieve O2- tot H2O2 (Vergelijking 1).

Vergelijking 1: 2O2- + 2H+ H2O2 + O2


De SOD’s worden ingedeeld in verschillende iso-enzymen naargelang het metaal dat dienst

doet als cofactor, zo zijn er ijzer (FeSOD), koper/zink (Cu/ZnSOD) en mangaan SOD

(MnSOD) aanwezig, elk gelokaliseerd in verschillende cellulaire compartimenten. Ongeacht

het metaal werken alle SOD’s via dezelfde reactie (Mittler et al. 2004).

Cu/ZnSOD wordt voornamelijk teruggevonden in het cytosol. Aangezien O2- in belangrijke

mate in de chloroplast wordt gevormd ten gevolge van het aëroob metabolisme, is het nodig

dat hier veel actieve SOD’s aanwezig zijn (Alscher et al. 2002). Verder wordt Cu/ZnSOD ook

in lagere hoeveelheden in lysosomen, de kern en de ruimte tussen de binnenste en buitenste

mitochondriale membranen aangetroffen (del Río et al. 2002). Het koperion is betrokken in

de oxidatie en reductie tijdens dismutatie (zie Vergelijking 2). Eerst wordt het koperion (Cu2+)

gereduceerd tot Cu+ en hierbij wordt het superoxide ion geoxideerd tot O2. Vervolgens wordt

Cu+ terug geoxideerd tot Cu2+ door verbruik van een tweede molecule O2-, dat hierbij zelf

gereduceerd wordt tot H2O2. Het zinkion heeft geen functie in het katalytisch mechanisme

maar stabiliseert wel het enzym. MnSOD bevindt zich voornamelijk in de mitochondriën

(Fridovich 1995), terwijl FeSOD voornamelijk in de chloroplasten van planten gevonden

worden.

Vergelijking 2: SOD-Cu2+ + O2- SOD-Cu+ + O2

SOD-Cu+ + O2- + 2H+ SOD-Cu2+ + H2O2

Catalasen (CAT) (EC 1.11.1.6) zijn tetramere homoproteïnen die gelokaliseerd zijn in

peroxisomen en glyoxysomen. De zeer stijve, stabiele structuur van catalase is resistent

tegen ontvouwen, waardoor de enzymen goed bestand zijn tegen pH, thermische

denaturatie en proteolyse (Loprasert et al. 1996). Het heem-bevattende CAT zal fungeren

als katalysator bij het afbreken van H2O2 tot H2O en O2 zonder het verbruik van cellulaire

reducerende equivalenten (Vergelijking 3) (Garg en Manchanda 2009). Hierdoor voorziet

catalase de cel een heel energie-efficiënt mechanisme om H2O2 te verwijderen. Dit gebeurt

in een tweestaps mechanisme waarin waterstofperoxide afwisselend het heem-ion in de

actieve plaats oxideert en reduceert. In de eerste stap oxideert een waterstofperoxide het

heem-ion tot oxyferryl. In de tweede stap wordt een tweede waterstofperoxide molecule

gebruikt als reductans om het enzym te regenereren, waardoor water en zuurstof

geproduceerd worden (Willekens et al. 1997).

Vergelijking 3: 2 H2O2 H2O + O2

Catalase heeft een lage substraataffiniteit maar een hoge reactiesnelheid indien twee H2O2

moleculen binden op het actieve gedeelte van CAT. Terwijl CAT actief zijn bij ernstige stress

situaties zullen peroxidasen (PX) de cel beschermen bij een lager niveau van oxidatieve

stress. In tegenstelling tot dieren kunnen planten verschillende enzymatische vormen

(isozymen) hebben van catalase. De aanwezigheid van deze verschillende catalase


isozymen doen vermoeden dat catalase meerdere functies heeft in verschillende

plantenweefsels in verschillende ontwikkelingsstadia (Garg en Manchanda 2009).

De catalase expressie en activiteit kunnen veranderen tijdens plant-pathogeen interacties.

Verminderde plant catalase-activiteit wordt waargenomen in resistente planten als antwoord

op een poging tot virusinfectie (So-Young Yi 2003). Men vermoedt dat dit toelaat H2O2 te

accumuleren, wat leidt tot antimicrobiële activiteit door versterking van de plantencelwand,

activatie van verdedigingsgenen en vermindering van de pathogene infectie (Lamb en Dixon

1997).

Peroxidasen (EC 1.11.1.7) zorgen voor de detoxificatie van H2O2 en organische peroxiden.

H2O2 wordt verwijderd via oxidatie van andere organische substraten (zie Vergelijking 4).

Vergelijking 4: SH2 + H2O2 S + 2 H2O

Glutathionperoxidase (GPX) is opgebouwd uit vier subunits, die elk een seleniumatoom

bevatten in hun actief centrum. Het wordt aangetroffen in de cytosol en verschillende

celcompartimenten waarvan de mitochondriën de belangrijkste zijn. GPX elimineert H2O2

door gebruik te maken van gereduceerd glutathion (GSH) als cofactor (Chance et al. 1979).

Naast de omzetting van waterstofperoxide kunnen ze ook betrokken zijn bij de reductie van

andere peroxiden (zie Vergelijking 5). Hierbij worden de peroxiden omgezet tot hun

overeenkomstige alcohol.

Vergelijking 5: 2GSH + ROOH GSSG + ROH + H2O

Ascorbaatperoxidase (APX) wordt aangetroffen in chloroplast en cytosol. APX speelt een rol

in de detoxificatie van H2O2 en organische peroxiden, met een hoge specificiteit via de AsA-

GSH cyclus met AsA als elektronendonor (zie 2.4.6) (Caverzan et al. 2012). Peroxidasen die

guaiacol (o-methoxyfenol) oxideren, een veel gebruikt reducerend substraat in vitro, worden

guaiacol peroxidasen (POX) genoemd. Ze worden gelokaliseerd in cytosol, vacuole,

celwand, apoplast maar niet in organellen. Ze worden verondersteld betrokken te zijn in

diverse processen die betrekking hebben tot groei en ontwikkeling van de plant (Ghamsari

et al., 2007)


2.4.6 Antioxidatieve metabolieten

Antioxidatieve metabolieten hebben antioxidatieve eigenschappen en zijn daarnaast ook

essentieel in verschillende metabole processen. De belangrijkste metabolieten in planten zijn

ascorbaat (AsA), glutathion (GSH), vitamine E, carotenoïden en polyfenolen.

Vitamine E (α-tocoferol) is een

membraangebonden, laag moleculaire

massa antioxidant die de cel beschermt

tegen ROS door de lipidenperoxidatie tegen

te gaan. Vitamine E moleculen kunnen de

vrije radicalen kettingreactie onderbreken

door het vrij radicaal te vangen. De vrije hydroxylgroep op de aromatische ring verleent hen

hun antioxiderende eigenschappen. De waterstof van deze groep wordt gedoneerd aan een

vrij radicaal (Engin 2009).

Glutathion (GSH) is een tripeptide. Het komt wijd verspreid voor in plantencellen en wordt

gesynthetiseerd in chloroplast en cytosol. GSH heeft een vrije thiolgroep en kan zo via

reductie elektronen op ROS overdragen,

waardoor deze onschadelijk worden. Glutathion

wordt hierbij geoxideerd en gaat van de

monomere vorm GSH over in het dimeer

glutathiondisulfide (GSSG). Door het enzym

glutathionreductase kunnen, met verbruik van

NADPH, opnieuw twee gereduceerde GSH

moleculen gevormd worden. Het speelt ook een rol in de regeneratie van ascorbaat, reageert

met 1O2 en OH en reguleert de genexpressie bij omgevingsstress en pathogene aanval

(Hess en Alscher 1993).

Ascorbaat (vitamine C) wordt aangetroffen in de chloroplasten, het cytosol, de vacuole, de

mitochondriën en de apoplastische ruimte van bladcellen. Het is één van de belangrijkste

antioxidanten in de plant en zorgt net als catalase voor de reductie van H2O2 waarbij

ascorbaat geoxideerd wordt (Ajay Arora 2002). Hierdoor vermindert het de schade ten

gevolge van oxidatieve processen. Ascorbaat heeft ook nog een tweede antioxidatieve

functie. Het kan gebruikt worden om membraangebonden antioxidanten zoals α-tocoferol te

regenereren (Hess en Alscher 1993). Het gevormde tocoferoxyl-radicaal wordt op zijn beurt

gereduceerd door AsA. Zo ontstaat er een antioxidant interactie tussen drie redoxcycli:

vitamine E, vitamine C en thiol. Behalve de antioxidantfunctie is ascorbaat ook nog cofactor

voor een aantal enzymen en heeft het een regulerende rol in groei, celwandbiosynthese,

fotosynthese, en differentiatie (Smirnoff 1996).

Figuur 8: Structuur van α-tocoferol. Uit Engin 2009.

Figuur 9: Structuur van glutathion. Uit Kaplowitz 1981.


De ascorbaat-gluthathioncyclus werkt efficiënt in zowel de

chloroplast als in het cytosol waarbij achtereenvolgens AsA, GSH

en NADPH geoxideerd en opnieuw gereduceerd worden (zie

Figuur 10). De reductie van H2O2 door AsA verloopt in twee

stappen. In de eerste stap wordt H2O2 gereduceerd tot H2O met

behulp van het ascorbaatperoxidase (APX) met ascorbaat als

elektrondonor, waarbij monodehydroascorbaat (MDA) wordt

gevormd. MDA is een radicaal en indien dit niet gereduceerd wordt

disproportioneert het spontaan tot dehydroascorbaat (DHA). Voor

de regeneratie van AsA zijn twee enzymen verantwoordelijk. Het

monodehydroascorbaatreductase (MDAR) dat gebruik maakt van

NADH als reductans en het dehydroascorbaatreductase (DHAR)

dat gekoppeld is aan GSH. DHAR linkt de reductie van AsA aan de

oxidatie van GSH waarbij GSSG gevormd wordt. Het GSSG wordt

terug gereduceerd door het glutathionreductase (GR) met behulp

van NADPH (Hess en Alscher 1993).

Polyfenolen komen voor in alle planten en worden ingedeeld in flavonoïden en non-

flavonoïden (Cheynier 2005). Het zijn belangrijke antioxidanten aangezien ze ROS kunnen

stabiliseren. Ze kunnen de lipidenperoxidatie kettingreacties beëindigen door te reageren

met het peroxylradicaal (zie 2.4.4) en zorgen voor de recyclage van vitamine E en C. Verder

kunnen ze reageren met metaalionen zoals Fe2+, waardoor deze niet meer kunnen gebruikt

worden ter vorming van vrije hydroxylradicalen (zie Figuur 5) (Middleton et al. 2000).

Verder worden in planten twee soorten carotenoïden aangetroffen: de carotenen, die enkel

uit koolwaterstoffen zijn opgebouwd, en de xanthofyllen, die één of meerdere

zuurstofgroepen bevatten (Sarvajeet Singh 2008). In de chloroplast hebben de carotenoïden

belangrijke functies als lichtabsorberende pigmenten en als fotobeschermende reagentia. Ze

beschermen de chloroplast tegen de absorptie van overmatige excitatie-energie van

chlorofyl. Verder zijn het ook efficiënte antioxidanten (Hess en Alscher 1993).

Figuur 10: Ascorbaat-glutathioncyclus. Uit Rouhier 2014.

Hoofdstuk 3: Materiaal en methoden 19

3. MATERIAAL EN METHODEN

3.1 Proefopzet serre

De plantenproef werd opgesteld in de serreafdeling van de Universiteit Gent, Caritasstraat,

Melle. Het plantmateriaal bestond uit 3 verschillende genotypes, telkens zowel diploïd (2x)

als tetraploïd (4x): (i) genotype 16, (ii) genotype 96 en (iii) Rosa laevigata. Genotypes 16 en

96 maken deel uit van een diploïde F1 populatie afkomstig van de kruising Rosa ‘Yesterday’

x Rosa wichurana. De tetraploïden werden bekomen via behandeling met antimitotica en

worden zodus autotetraploïden genoemd. Door vermeerdering via stekken werden van elk

genotype 20 klonen bekomen. De planten werden onderverdeeld in twee groepen die

gebruikt werden voor elk één behandeling: droogtestress of controle. Een visuele voorstelling

van de opstelling in de serre wordt weergegeven in Figuur 11. De schematische indeling kan

gevonden worden in Bijlage 2.

Figuur 11: Visuele weergave van de indeling van de serre.

De aangewende potgrond was een turf gebaseerd substraat. De goten werden op 1m hoogte

geplaatst om irrigatie toe te laten. De dagen nachttemperatuur in de serre bedroeg

respectievelijk 18 en 15°C. Er werd met behulp van assimilatiebelichting een daglengte van

16 uren (6u tot 22u) gecreëerd. Wanneer voldoende bladmassa per plant aanwezig was

werd de droogtebehandeling gestart. De droogte werd geïnduceerd door het stoppen van de

irrigatie op 17/09/2014. Bij de controleplanten werd de irrigatie behouden. Het verloop van

het volumetrisch vochtgehalte in het substraat werd bepaald met een WET-sensor (Delta-T,

UK). De eerste stalen werden één week na inductie van droogte genomen. Vervolgens werd

gedurende drie weken tot staalname overgegaan, waarbij volgende goten werden geoogst:

op 24/09/2014 goot 5 en 8, op 1/10/2014 goot 3 en 10 en op 8/10/2014 goot 2 en 11. Alle

blaadjes van de individuele plant werden afgeplukt en koel gehouden. Nadien werden de

blaadjes gegrind in vloeibare stikstof met behulp van een maalmolen (Ika A11 basic). Het

gegrind bladmateriaal kan gedurende 6 maanden bewaard worden bij -80°C.


Ook werden ongeveer 3 blaadjes afgewogen en nadien gedroogd in de oven bij 80°C

gedurende 24 uur. Hierna werden de blaadjes opnieuw afgewogen waardoor zo de

verhouding tussen vers en droog gewicht van de bladstalen gekend is. Bij genotype 16 en

96 werd er gewerkt met 4 herhalingen (n=4) per staalname, bij R. laevigata met 2 herhalingen

(n=2).

3.2 Eiwitextractie

Voor de bepaling van de stress-enzymen wordt eerst een eiwitextractie uitgevoerd. De

extractiebuffer en de hoeveelheid bladmateriaal varieert naarmate de doelstelling van het

eiwitstaal:

De extractiebuffer voor CAT en SOD bepaling bestaat uit: 50mM kaliumfosfaatbuffer

pH 7.8, 1mM Na-EDTA pH 7.8, 0.02M natriumwaterstofsulfiet, 20% sorbitol en 4%

PVPP.

De extractiebuffer voor POX en APX bepaling bestaat uit: 50mM kaliumfosfaatbuffer

pH 6.1, 0.1mM EDTA, 1mM ascorbinezuur en 10% PVP.

Er wordt 300mg bladmateriaal (gegrind in vloeibare stikstof) afgewogen en overgebracht in

een Eppendorf buisje. Vervolgens wordt 1600µl extractiebuffer toegevoegd. De stalen

worden 15 minuten gevortext (Vortex Genie 2, Scientific Industries) en 15 minuten op ijs

geplaatst. Hierna worden de stalen 17 minuten gecentrifugeerd bij 13000g (Eppendorf

Centrifuge 5804R) en wordt het supernatans overgebracht. Het supernatans wordt nogmaals

gecentrifugeerd gedurende 10 minuten eveneens bij 13000g. Het supernatans wordt

overgebracht en kan gebruikt worden voor enzymanalyse. Om activiteitsverlies te

voorkomen worden alle voorgaande stappen uitgevoerd bij 4°C.

3.3 Proteïnebepaling volgens Bradford

Om de activiteiten van de stress-enzymen te kunnen relateren aan het eiwitgehalte dienen

eiwitbepalingen uitgevoerd te worden. Vandaar zal eerst de totale hoeveelheid aanwezig

eiwit gemeten worden via de methode van Bradford (1976).

De proteïnebepaling volgens Bradford is een colorimetrische methode, gebaseerd op een

absorptieverschuiving van de kleurstof Coomassie Briljant Blue G-250 bij proteïnebinding.

Onder zure omstandigheden wordt de rode vorm van de kleurstof omgezet in blauw wanneer

er binding is aan de proteïnen uit het staal. De vorming van het blauwe complex gebeurt in

twee stappen: (i) de Coomassie kleurstof doneert vrije elektronen aan de ioniseerbare

groepen van het proteïne, waardoor de hydrofobe delen van het proteïne worden vrijgesteld,

(ii) vervolgens binden de hydrofobe delen niet-covalent aan de apolaire regio van de kleurstof

via Van Der Waals krachten. Het complex wordt verder versterkt door ionische interactie

tussen de twee. Na ongeveer acht minuten wordt een stabiel complex gevormd met het eiwit


in het te onderzoeken staal (protein-dye complex). Aangezien de gebonden vorm van de

kleurstof een absorptiemaximum heeft van 595nm, is de toename van absorptie bij 595nm

evenredig met de hoeveelheid gebonden kleurstof en aldus met de hoeveelheid

(concentratie) eiwit in het monster. Het eiwitgehalte van het staal wordt berekend op basis

van de absorbantie van een standaard eiwit (Runderserumalbumine of Bovine Serum

Albumine, BSA).

Er wordt 10µl supernatans eiwitextract (zie 3.2) of standaard gepipetteerd in een 96 wellplaat

(Brand). De BSA standaard verdunningsreeks wordt gemaakt in MilliQ water in volgende

concentraties: 2, 1.5, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625 en 0 mg/ml. Vervolgens wordt 300µl

Bradfordreagens (Sigma Aldrich) toegevoegd. Met behulp van een spectrofotometer

(NanoQuant Infinite M200 Tecan) wordt het volgende programma gevolgd: (i) de plaat wordt

geschud, (ii) incubatie gedurende 8 minuten, (iii) de absorbantie wordt gemeten bij 595nm.

Elk staal of standaard wordt in drievoud gemeten (technische replicatie).

3.4 Bepaling van de catalase-activiteit

De totale catalase-activiteit wordt bepaald overeenkomstig met Aebi (1984), welke een

directe methode is om catalase-activiteit aan te tonen. De afname van waterstofperoxide,

het substraat voor catalase (zie Vergelijking 3), wordt spectrofotometrisch gevolgd waarna

de aanwezigheid van catalase kwantitatief kan worden bepaald. Aangezien dit een reactie

van de eerste orde is, is de hoeveelheid waterstofperoxide die wordt omgezet recht

evenredig met de concentratie van het substraat en de snelheid van de reactie recht

evenredig met de hoeveelheid aanwezig enzym. De absorptie-afname bij 240nm is direct het

gevolg van de vermindering van H2O2 door de aanwezigheid van catalase. Hieruit volgt dat

een grotere absorptie-afname duidt op meer aanwezige catalase-activiteit.

De CAT-activiteit (units mg-1 eiwit min-1) wordt, uitgaande van de snelheidsconstante van

een eerste orde reactie als volgt berekend:

k= 2,3 ∗ log (

A1A2

)* 60

∆t * D * prot (mg/ml)

Met: A1= absorbantie bij 240nm op tijdstip t1

A2 = absorbantie bij 240nm op tijdstip t2

∆t= t2-t1

D= dilutiefactor

In een kwarts cuvet wordt 100µl eiwitextract (zie 3.2) en 1900µl 50mM kaliumfosfaatbuffer

pH 7.0 gepipetteerd. De cuvet wordt in de spectrofotometer (Uvikon XL, Biotek Instruments)

geplaatst. De reactie wordt gestart door toevoegen van 1000µl 30mM H2O2. Hierbij worden


volgende instellingen gevolgd: (i) de meting gebeurt bij 240nm, (ii) er gebeuren 30 metingen

per minuut, (iii) er wordt gedurende 1 minuut gemeten. De meting wordt in drievoud

uitgevoerd (technische replicatie).

3.5 Bepaling van de superoxide dismutase-activiteit

Ter bepaling van de SOD-activiteit wordt de Sigma Aldrich 19160 SOD determination kit

gebruikt. Deze kit gebruikt het tetrazolium zout WST-1 voor de detectie van superoxide

radicalen die gegenereerd worden door xanthine oxidase (zie Figuur 12). Eén unit SOD wordt

gedefinieerd als de hoeveelheid enzym dat nodig is om 50% dismutatie te veroorzaken van

het superoxide radicaal.

SOD (% inhibitie)= [(A blank 1-A blank 3)- (A staal-A blank 2)]

A blank 1-A blank 3

x 100

Units=% inhibitie

50%

Het protocol van de kit kan gevonden worden in Bijlage 1. Elk staal of blanco wordt in

drievoud gemeten (technische replicatie). De stalen worden voor de meting 1/20 verdund.

Figuur 12: Principe van de SOD assay kit. De omzetting van xanthine en O2 naar urinezuur en H2O2 door xanthine oxidase (XO) genereert superoxide radicalen. Het superoxide ion reduceert WST-1 naar het gekleurde WST-1 formazan. SOD dismuteert superoxide ionen en reduceert hierbij de vorming van de formazankleur. De reductie in het verschijnen van WST-1 is een maat voor de SOD-activiteit. Uit Sigma Aldrich kit datasheet.


3.6 Bepaling van de guaiacolperoxidase-activiteit

De guaiacolperoxidase-activiteit (POX) wordt spectrofotometrisch bepaald overeenkomstig

met Chance en Maehly (1954). Hierin wordt aangegeven dat tetraguaiacol het product is van

guaiacol oxidatie door peroxidasen, met een molaire extinctiecoëfficient van

25,5 mM-1 cm-1. De enzymcapaciteit, de activiteit wanneer een overmaat substraat wordt

toegevoegd, wordt spectrofotometrisch gemeten in het supernatans. Het principe van deze

meting is gebaseerd op de wet van Lambert-Beer. Deze wet houdt in dat in het lineaire

gebied de concentratieverandering in de tijd recht evenredig is met de absorptieverandering

in de tijd, op voorwaarde dat er rekening gehouden wordt met de extinctiecoëfficiënt (ε) en

de weglengte van de cuvet.

De POX activiteit (nmol min-1 mg proteïne -1) wordt als volgt berekend:

POX-activiteit =rico * Vt

Ԑ ∗ Vs * proteïne (mg/µl)

Met: Vs= volume staal

Vt= totaal volume in cuvet

ԑ= extinctiecoëfficiënt van tetraguaiacol (25.5 mM-1cm-1)

rico= richtingscoëfficiënt

In een kwarts cuvet wordt 100µl eiwitextract (zie 3.2), 200µl 25mM guaiacol en 700µl 50mM

kaliumfosfaatbuffer pH 7.0 gepipetteerd. De cuvet wordt in de spectrofotometer (Uvikon XL,

Biotek Instruments) geplaatst. Er wordt 100µl 200mM H2O2 toegevoegd en na mengen wordt

de meting onmiddellijk gestart. Hierbij worden volgende instellingen gevolgd: (i) de meting

gebeurt bij 436nm, (ii) er gebeuren 6 metingen per minuut, (iii) er wordt gedurende 1.5

minuten gemeten. Elk staal wordt in drievoud gemeten (technische replicatie).

3.7 Bepaling van de ascorbaat peroxidase-activiteit

De ascorbaat peroxidase-activiteit (APX) wordt bepaald als de snelheid van de

waterstofperoxide afhankelijke oxidatie van pyrogallol als elektrondonor tot purpurogallin.

Aangezien purpurogallin een oranje kleur vertoont kan de oxidatie van pyrogallol gevolgd

worden als de toename van absorbantie bij 430nm met een extinctiecoëfficiënt van

2,47 mM-1cm-1.


De APX-activiteit (nmol min-1 mg proteïne -1) wordt overeenkomstig als bij POX bepaald op

basis van de wet van Lambert-Beer.

APX-activiteit =rico * Vt

Ԑ ∗ Vs * proteïne (mg/µl)

Met Vs= volume staal

Vt= totaal volume in cuvet

ԑ= extinctie coëfficiënt van purpurogallin (2,47 mM-1cm-1)

rico= richtingscoëfficiënt

In een kwarts cuvet wordt 50µl eiwitextract (zie 3.2) en 950µl reactiemix gepipetteerd. De

reactiemix bestaat uit 50mM kaliumfosfaatbuffer pH 7.8, 20mM pyrogallol, 0.1mM EDTA en

0.1mM H2O2. Na toevoegen van de reactiemix wordt de cuvet in de spectrofotometer (Uvikon

XL, Biotek Instruments) geplaatst en start men de meting onmiddellijk. Hierbij worden

volgende instellingen gevolgd: (i) de meting gebeurt bij 430nm (ii) er gebeuren 6 metingen

per minuut, (iii) er wordt gedurende 2.5 minuten gemeten. Elk staal wordt in drievoud

gemeten (technische replicatie).

3.8 Statistische analyse

De normaliteit van de data werd nagegaan met behulp van een Shapiro-Wilk test omdat deze

test als eerste een afwijking van normaliteit zal bemerken bij kleine datasets (n<2000). De

gegevens werden verder statistisch geanalyseerd op basis van een t-test. De nulhypothese

werd nagegaan op significantieniveau 0,05. Het gebruikte programma is SPSS Statistics 22.

Hoofdstuk 4: Resultaten 25

4. RESULTATEN

4.1 Methodologisch onderzoek

4.1.1 SOD-analyse

In het uitgangsprotocol voor SOD analyse werd aan 200 à 250mg bladmateriaal 1500µl

extractiebuffer toegevoegd, welke bestond uit 50mM kaliumfosfaatbuffer pH 7.8, 0.075%

PVPP, 0.1M TRISbase, 6.8% sucrose, 0.01M Na-EDTA, 0.003% Tween 20 en 0.8%

natriumthioglycolaat. De functionaliteit van de componenten wordt gegeven in Tabel 1.

Tabel 1: Samenstelling van de oorspronkelijke extractiebuffer voor SOD-analyse

Component Functie

Fosfaatbuffer Bufferende component

PVPP Verwijdert fenolische componenten

TRISbase Behouden van de pH

Sucrose Voorkomen osmotische shock

Na-EDTA Heeft een hoge affiniteit voor divalente ionen

zoals Ca2+ en Mg2+, die cofactoren zijn voor veel

enzymen

Tween 20 Oplossen celmembraan

Natriumthioglycolaat Beschermt enzymen tegen inactivatie

Als teststalen werd gebruik gemaakt van roosstalen, onderworpen aan droogtestress, die

dateren van februari-maart 2014. Metingen met het bestaande protocol leverden echter niet

de gewenste resultaten op. In meerdere stalen werd een SOD-activiteit bekomen die 100%

overschrijdt. Aangezien de teststalen nog steeds representatief geacht werden en de SOD-

kit nieuw werd aangekocht, werd in eerste instantie gedacht dat de oorzaak lag bij het

gehanteerde eiwitextractieprotocol. De samenstelling van het bestaande protocol werd

geanalyseerd op functionaliteit van de stoffen (zie Tabel 1) en werd, overeenkomstig met

Grossi et al. 1997, op volgende punten aangepast:

- Aan de extractiebuffer werd 0,3% β-mercapto-ethanol toegevoegd, een reagens

welke -SH groepen in gereduceerde staat houdt. De -SH groepen van veel enzymen

zijn van groot belang voor de activiteit van deze enzymen. Tevens zorgt het ook voor

het verwijderen van tannines.


- Er werd 0,4% ascorbinezuur toegevoegd, wat zorgt voor het capteren van

polyfenolen, welke gekend zijn in hoge concentraties voor te komen in roos.

Bovendien werd ook de werking van de SOD-kit uitgespit. Er zijn drie verschillende blanco

metingen voorzien in het protocol, waarbij blanco 1 (B1) de maximale absorbantie geeft die

kan ontstaan, namelijk geen toevoeging van SOD bevattend staal waardoor alle aanwezige

zuurstofradicalen kunnen omgezet worden in WST-1 formazan. Blanco 3 (B3) is een

correctie voor de achtergrondkleur en blanco 2 (B2) is correctie voor de kleur van het staal.

De samenstelling van deze blanco-oplossingen wordt weergegeven in Tabel 2. Aangezien

de eiwitextracten uit rozenblaadjes een sterke gele kleur hadden, vermoedelijk door de

aanwezige polyfenolen, werd voor elk staal apart een B2 gemaakt.

Vermits het betreffende materiaal om een inhibitiecurve van SOD te meten niet voorhanden

was, werd de werking van de methode getest aan de hand van verdunningen. De SOD-

bepaling volgt uit een inhibitiereactie, vandaar wordt verwacht dat wanneer er minder SOD

aanwezig is in het staal (door bvb. verdunnen), er minder zuurstofradicalen worden

gedismuteerd en er meer WST-1 naar WST-1 formazan wordt omgezet, wat resulteert in een

hogere absorbantiewaarde. Er werd gekozen om een aantal verdunningen (3/4, 1/2, 1/4) van

de stalen te testen.

Tabel 2: Samenstelling van de verschillende blanco-oplossingen en stalen die gebruikt worden in SOD analyse.

Staal Blanco 1 (B1) Blanco 2 (B2) Blanco 3 (B3)

Eiwitextract v v

ddH2O v v

WST oplossing v v v v

Enzym oplossing v v

Verdunningsbuffer v v

Ondanks de aanpassingen bleef de SOD-activiteit nog steeds tegen 100% aan te leunen.

Indien de bekomen resultaten grondig werden geanalyseerd bleek het volgende:

- De absorbantiewaarde van de stalen valt boven de B3 absorbantiewaarde. Dit duidt

vermoedelijk op interferenties, waarbij wordt gedacht dat de reeds gele kleur van de

eiwitextracten overheersend is over de gele kleur die ontstaat door het WST-1

formazan.

http://melkveehouders.nieuwsgrazer.nl/topic/50316/


Dit werd ook bevestigd doordat het verschil tussen de absorbantie van het staal en

B2 blijkt niet significant bleek te zijn (bvb. een verschil in absorbantie van 0,01). In de

stalen gaat de kleurreactie die nodig is om SOD te bepalen nauwelijks meetbaar door.

- De absorbantie van de verdunningsreeks neemt af, wat nogmaals duidt op het niet

werken van de methode.

De gemaakte veranderingen hadden nog steeds tot gevolg dat de SOD activiteit te hoog was

door interfererende componenten. De gebruikte extractiebuffer bevat slechts 0.075% PVPP,

waardoor het kan dat, zelfs met toevoeging van ascorbinezuur, niet voldoende polyfenolen

worden verwijderd. De extractiebuffer die gebruikt wordt voor CAT-activiteit bevat 50mM

kaliumfosfaatbuffer pH 7.8, 0.1mM Na-EDTA pH 7.8, 1mM ascorbinezuur, 0.02M

natriumbisulfiet, 20% sorbitol en 2% PVPP. Er zal getest worden of gebruik van deze buffer,

en dezelfde buffer met 4% PVPP een lichter gekleurd extract geeft en zo aanleiding tot betere

SOD meting. Hierbij worden stalen getest van controleplanten, aangezien verwacht wordt

dat deze een lagere SOD-activiteit zouden hebben.

Er werd visueel vastgesteld dat de extracten een lichtere kleur hadden, en dat het verschil

tussen het staal en B2 groter werd bij gebruik van meer PVPP. Aangezien uit deze resultaten

bleek dat het gewenst was de PVPP concentratie in de eiwitextractiebuffer aan te passen

naar 4% werd een vergelijking gemaakt tussen de eiwitconcentratie bij gebruik van beide

buffers. Het resultaat kan gezien worden in Figuur 13. Hieruit kan men concluderen dat het

gebruik van meer PVPP in de extractiebuffer een lichte verhoging veroorzaakt van de

eiwitconcentratie in het extract, maar dat het geëxtraheerde eiwitmateriaal in het algemeen

vrij laag is.

Figuur 13: Grafische voorstelling van de gemiddelde eiwitconcentratie bij gebruik van 2 extractiebuffers met verschillende PVPP concentratie. Bij gebruik van de extractiebuffer met 2% PVPP (zwart) wordt een gemiddelde eiwitconcentratie van 0.051 mg/ml bekomen. Bij de extractiebuffer met 4% PVPP (grijs) wordt een gemiddelde eiwitconcentratie van 0.054 mg/ml verkregen.

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

Co

nc

(mg

pro

teïn

e/

ml)

Buffer met 2% PVPP Buffer met 4% PVPP


Volgens het protocol van de kit zorgt ascorbinezuur in een concentratie van 0.1mM voor een

10% toename van de absorbantiewaarde. Aangezien werd opgemerkt tijdens de praktische

uitvoering dat na toevoegen van WST-1 oplossing, zonder toevoegen van enzym, al reeds

een sterkere gele kleur ontstaat dan afkomstig van het staal werd getest of de 1mM

ascorbinezuur in de extractiebuffer op zich zorgt voor kleurontwikkeling. Hiervoor werden

drie verschillende buffers gemaakt, maar er werd niet overgegaan op eiwitextractie. Deze

buffers bevatten 1, 0.5 en 0mM ascorbinezuur en hebben overigens dezelfde samenstelling

als eerder vermeld. Vervolgens werd aan deze bufferoplossing WST-oplossing toegevoegd

en werd een foto genomen (zie Figuur 14). Hierbij ziet men dat zelfs zonder toevoegen van

het enzym (dat de zuurstofradicalen levert voor omzetting van WST) een gele kleur ontstaat

en dat deze vermoedelijk interfereert met de meting. Uit de absorbantiewaarden blijkt dat de

aanwezigheid van ascorbinezuur in de buffer op zich al zorgt voor een absorbantie van

0,4522.

Figuur 14: Het interfererende effect van ascorbinezuur op de SOD meting. Van links naar rechts: buffer met 1, 0.5 en 0mM ascorbinezuur. De absorbantiewaarden van links naar rechts bedragen: 0.4522, 0.1978 en 0.0609.

Vervolgens werd nagegaan of het niet toevoegen van ascorbinezuur een invloed heeft op de

eiwitextractie en de catalase-activiteit. Het resultaat van de eiwitextractie kan gezien worden

in Figuur 15. Hieruit kan besloten worden dat er gemiddeld minder eiwitten worden

geëxtraheerd bij gebruik van een buffer zonder ascorbinezuur, echter de eiwitextractie zal

nog verder geoptimaliseerd worden in poging tot het bekomen van een hogere

eiwitconcentratie (zie 4.1.2). Er werd geen invloed op de catalase-activiteit gevonden door

weglaten van ascorbinezuur in de buffer.

Figuur 15: Grafische voorstelling van het effect van ascorbinezuur op de eiwitconcentratie in het extract. Bij gebruik van de buffer met ascorbinezuur (zwart) wordt een gemiddelde eiwitconcentratie van 0.12mg/ml verkregen. Bij gebruik van de buffer zonder ascorbinezuur (grijs) bedraagt de gemiddelde eiwitconcentratie 0.08mg/ml.

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

Co

nc

(mg

pro

teïn

e/

ml)

Buffer met ascorbinezuur Buffer zonder ascorbinezuur


Anderzijds werd tijdens een andere SOD-analyse proefopzet,

waarbij geen ascorbinezuur werd gebruikt tijdens extractie, ook

waargenomen dat er vermoedelijk nog andere interfererende

componenten in de eiwitextracten zit. Maar indien de stalen

verdund worden (vb. 1/20) is deze echter in zodanig lage

concentratie aanwezig dat deze niet meer interfereert met de

meting (zie Figuur 16).

Bovendien werden opnieuw een aantal verdunningen van de stalen getest. De relatie tussen

SOD-activiteit en remming van de WST-1 reductie is niet recht evenredig maar logaritmisch

(zie Figuur 17), vandaar moest sterker verdund worden (1/20, 1/100 en 1/200) dan eerder

getest. Om in het goede gebied van de curve te meten moet verdund worden tot de activiteit

tussen 20 en 80% ligt. Er werd gezien dat bij toenemende verdunning de absorbantie ook

toenam, wat in overeenkomst is met het meetprincipe van de kit. Bovendien kon besloten

worden dat de SOD-activiteit van verdunning 1/20 en 1/100 een acceptabel niveau hebben

en binnen het goede gedeelte van de curve vallen, waarbij besloten werd om voor de stalen

steeds een 1/20 verdunning te hanteren.

Figuur 17: SOD inhibitiecurve bij verschillende incubatietijden. Uit Sigma Aldrich kit datasheet.

Figuur 16: Voorstelling van de multiwellplaat na meting ter illustratie van de interfererende componenten. Gebruikte nummers: 1= onverdund staal, 2= 1/20 verdunning van het staal, 3= B2 van het onverdund staal, 4=B2 van het verdunde staal. Hierbij wordt gezien dat er bij nr. 3 nog steeds een interfererende reactie optreedt, terwijl bij verdunning (nr. 4) deze reactie niet optreedt.


4.1.2 Eiwitextractie

De meeste plantenweefsels vergen extra aandacht en maatregelen voor eiwitextractie.

Bovendien hebben plantencellen een relatief laag eiwitgehalte in vergelijking met zoogdier-

en bacteriecellen.

Het bestaande protocol bestond uit een extractiebuffer met 50mM kaliumfosfaatbuffer pH

7.8, 1mM Na-EDTA pH 7.8, 1mM ascorbinezuur, 0.02M natriumwaterstofsulfiet, 20% sorbitol

en 2% PVPP. Er werd 1600µl extractiebuffer toegevoegd aan 150mg bladmateriaal en na 10

seconden vortexen werd er 30 minuten geïncubeerd op ijs. Vervolgens volgden 2

centrifugeerstappen, waarbij telkens supernatans werd afgepipetteerd. Deze

centrifugeerstappen gebeuren respectievelijk 17 en 10 min bij 13000g.

Na enkele metingen werd het duidelijk dat het protocol moest aangepast worden door de

kleine hoeveelheid eiwitten die geëxtraheerd werden, met een gemiddelde eiwitconcentratie

van 0,03mg/ml eiwit. Er wordt vermoed dat dit niet ligt aan onvoorzichtige behandeling van

de monsters aangezien steeds op ijs werd gewerkt. Mogelijks zou het lage eiwitgehalte ook

een verklaring kunnen zijn waarom de APX en POX meting op dat moment niet lukte omdat

de betreffende enzymen niet mee geëxtraheerd werden. Het protocol werd op volgende

punten aangepast en getest:

- Er werd een extra punt in de ijklijn aangebracht van 0,0625mg/ml BSA tussen 0 en

0,125mg/ml BSA om zo met grotere nauwkeurigheid de eiwitconcentratie van de

stalen te kunnen bepalen

- De hoeveelheid uitgangsmateriaal werd verdubbeld naar 300mg met dezelfde

hoeveelheid extractiebuffer, waarbij de eiwitconcentraties van het extract variëren

tussen 0,04 en 0,06mg/ml. Aangezien gewenst is dat deze nog hoger liggen werd er

verder getest.

- Hoewel het gewild was een meer geconcentreerd eiwitextract te bekomen, kon het

volume van het eiwitextract, met oog op de nodige hoeveelheid voor enzymanalyse,

niet aangepast worden. Vandaar werd de extractieprocedure enigszins aangepast,

maar met behoud van de hoeveelheid extractiebuffer. Aan 300mg bladmateriaal werd

800µl extractiebuffer toegevoegd om vervolgens te centrifugeren en supernatans af

te nemen. Daarna werd aan de pellet opnieuw 800µl extractiebuffer toegevoegd en

werden de stappen herhaald. Het supernatans kon nadien samengebracht worden.

Echter, de concentratie van het eiwitextract toonde geen beduidende verhoging.

- Vervolgens werd geprobeerd om een goede scheiding te krijgen tussen pellet en

supernatans waarbij werd nagedacht over een methode om de pellet door een spuit

en filter te halen om zo een drogere pellet te verkrijgen. Praktisch bleek dit echter niet

haalbaar.

- Polysorbaat 20 (Tween 20) zorgt voor het oplossen van het celmembraan en

onderzoek binnen de onderzoeksgroep had al aangetoond dat dit een hogere

eiwitconcentratie teweegbrengt. Het toevoegen van 0,003% Tween 20 aan de

extractiebuffer (wat overeenkomt met een druppel op een tipje) leidt tot hogere


concentratie in het eiwitextract met ongeveer 40% meer eiwitopbrengst in vergelijking

met de oorspronkelijke extractiebuffer, maar tegelijk wordt gedacht dat toevoegen

van Tween 20 interfereert met de tertiaire structuur van het eiwit en wordt dit bij

voorkeur niet toegevoegd.

- In het bestaande protocol werden de stalen slechts 10 seconden gevortext en

vervolgens gedurende 30 minuten op ijs geplaatst. Deze stap werd aangepast naar

15 minuten vortexen en 15 minuten op ijs plaatsen. Het vortexen gebeurt in de koude

kamer om activiteitsverlies te voorkomen.

Deze verandering had tot gevolg dat er tot 30% hogere eiwitconcentratie in het extract

gemeten wordt (zie Figuur 18) en de concentratie op acceptabel niveau is. Met deze

resultaten werd besloten dat de eiwitextractie voortaan zal uitgevoerd worden door

15 minuten te vortexen bij 4°C.

Figuur 18: Grafische weergave van de invloed van vortexen op de eiwitconcentratie in het extract. Bij de oorspronkelijke methode (zwart) wordt gemiddelde eiwitconcentratie van 0.05 mg/ml bekomen. Bij de aangepaste vortexmethode (grijs) wordt een veel hogere waarde bekomen namelijk 0.17 mg/ml.

Vervolgens werd de aandacht gevestigd op de houdbaarheid van de eiwitextracten. Er werd

vermoed dat de eiwitextracten langer houdbaar zullen zijn door de verhoogde

eiwitconcentratie in de stalen. Hierbij dient opgemerkt te worden dat de eiwitextracten niet

bij -20°C bewaard kunnen worden, aangezien invriezen zou leiden tot activiteitsverlies. Drie

dagen na het extraheren van de eiwitten toonde de eiwitconcentratie echter ±70% verlies.

Hieruit rijzen de volgende vragen: wat veroorzaakt het activiteitsverlies en wat kan er gedaan

worden tegen dit activiteitsverlies? Als antwoord op de eerste vraag kan met redelijke

waarschijnlijkheid worden aangenomen dat de afname het gevolg is van afbraak van de

enzymen door proteasen. In dit geval kan de afbraak eenvoudig voorkomen worden door

gebruik van protease remmers, waarbij de invloed van 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride

(PMSF) (serine protease inhibitor), 1mg/ml L-leucine en 1mg/ml capronzuur werden

onderzocht. Indien opnieuw drie dagen na het maken van het eiwitextract de

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

Oorspronkelijke methode Vortexmethode

Co

nc

(mg

pro

teïn

e/

ml)


eiwitconcentratie gemeten werd, zag men hier slechts een verlies van ±40%. De grafische

vergelijking van het eiwitgehalte is weergegeven in Figuur 19. Hieruit kan besloten worden

dat het toevoegen van protease-inhibitoren een gunstig effect heeft op het behoud van het

eiwitextract. Aangezien zal getracht worden de stalen per dag te verwerken, wordt vermoed

dat de activiteit van de enzymen vrij constant zal blijven gedurende de dag waardoor

toevoeging van protease inhibitoren in de extractiebuffer niet nodig is.

Figuur 19: De invloed van protease-inhibitoren op het behoud van de eiwitconcentratie. Het activiteitsverlies van de eiwitextracten in verloop van de tijd wordt weergegeven. Zwart= verloop van de eiwitconcentratie in de tijd zonder toevoegen van een protease inhibitorcocktail Hierbij daalt het eiwitgehalte in het extract van 0.185 naar 0.057 mg/ml. Grijs= verloop van de eiwitconcentratie in de tijd met toevoegen van een protease inhibitorcocktail. Het eiwitgehalte in het extract daalt van 0.197 naar 0.122mg/ml.

4.1.3 POX-analyse

Het bestaande protocol voor POX analyse bestond uit een eiwitextractie, waarbij de buffer

en methode werd gebruikt zoals oorspronkelijk aangehaald in 4.1.2. De enzymactiviteit wordt

bestudeerd door de vorming van een eindproduct, geoxideerd guaiacol (tetraguaiacol) bij

436nm te meten. Bovendien heeft tetraguaiacol een bruine kleur, waardoor er ook een

visuele controle is op het doorgaan van de reactie.

De eerste oriënterende meting toonde niet het gewenste lineaire resultaat, waarbij werd

gedacht dat de activiteit of aanwezigheid van POX in de stalen beduidend laag moet geweest

zijn, waardoor de absorptie-verandering niet meetbaar was. Na optimalisatie van de

eiwitextractie werd de aanwezigheid van POX bevestigd door een lineair verband, echter de

bruine kleur die zou ontstaan ten gevolge van tetraguaiacol werd niet gezien. Dit laatste

zorgde voor twijfel over het correct werken van de methode en dus werd er verder getest.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

Co

nc

(mg

pro

teïn

e/

ml)

Tijd (dagen)

Zonder protease inhibitorcocktail Met protease inhibitorcocktail


Er werd een extractiebuffer getest met als samenstelling 50mM kaliumfosfaatbuffer pH 6.1,

0.1mM EDTA en 10% PVP. Vervolgens werd hetzelfde extractieprotocol gevolgd. Er werd

opgemerkt dat deze buffer gepaard gaat met een hoge eiwitconcentratie in het extract, tot

1.5mg/ml. Bovendien zorgde de POX meting nu voor een lineair verband en zag men ook

de bruine kleur ten gevolge van tetraguaiacol (zie Figuur 20). Mogelijks zorgt de lagere pH

van 6,1 van de extractiebuffer voor het ontstaan van de kleurontwikkeling, terwijl deze niet

zichtbaar was bij gebruik van een extractiebuffer met pH 7,8.

Figuur 20: Kleurontwikkeling door reactie van guaiacol met peroxidase. Links = kleur voor starten van de reactie met H2O2. Rechts = kleur ten gevolge van tetraguaiacol vorming.

Bij voorkeur worden alle enzymbepalingen van een gemaakt eiwitextract op dezelfde dag

bepaald, waardoor getest werd of de CAT en SOD bepalingen ook konden gebeuren met

dezelfde extractiebuffer welke succesvolle POX metingen oplevert. Tevens zou het maken

van één extract tijdswinst opleveren, waardoor meerdere stalen per dag kunnen

geanalyseerd worden. De CAT-activiteiten vertoonden echter niet de gewenste resultaten,

waardoor in eerste instantie niet werd overgegaan op SOD-meting. Wel zal nog getracht

worden de APX bepaling te meten in hetzelfde extract, omdat deze op dat ogenblik nog niet

geoptimaliseerd was.

4.1.4 APX-analyse

Het APX protocol dat voorhanden was bestond uit het volgen van de H2O2 afhankelijke

oxidatie van ascorbinezuur en werd bepaald door de afname van absorbantie bij 290nm te

volgen. Analoog als bij de POX analyse toonden de eerste metingen niet het gewenste

lineaire resultaat. Ook na het verkrijgen van een hogere eiwitconcentratie door optimalisatie

van de eiwitextractie werden geen correcte metingen verkregen. Vandaar werden volgende

extractiemethoden uitgetest:

- Aangezien de aanwezigheid van ascorbinezuur belangrijk is voor stabilisatie van APX

werd aan de geoptimaliseerde POX buffer ascorbinezuur toegevoegd, waardoor de

buffer bestaat uit: 50mM kaliumfosfaat pH 6.1, 0.1mM EDTA, 10% PVP en 5mM

ascorbinezuur. Indien de APX meting zou lukken, zal de toevoeging van

ascorbinezuur op POX meting nagegaan worden.


- Analoog met Srivalli et al. (2003) werd een extractiebuffer getest met volgende

samenstelling: 50mM kaliumfosfaat pH 7.0, 2mM EDTA, 4% PVP en 5mM

ascorbinezuur.

- Een extractiebuffer bestaande uit 50mM natriumfosfaat pH 7.0, 0.25mM EDTA, 2%

PVP-25, 10% glycerol en 1mM ascorbinezuur werd getest, zoals beschreven in

Panchuk et al. (2002).

- De extractiebuffer waarmee Jin et al. (2006) in Rosa hybrida L. met succes APX

bepaald hadden, bestaande uit 50mM natriumfosfaat pH 7.0, 1mM EDTA, 1mM

ascorbinezuur en 5 g/l PVP-10.

De bepaling van APX gebeurde met ascorbinezuur als substraat, zoals beschreven in

Nakano en Asada (1981). Er werden drie verschillende reactiemengsels gemaakt, die een

gelijkaardige samenstelling hadden maar in verschillende concentraties.

- Het protocol dat voorhanden was voor het maken van de reactiemix bestond uit:

kaliumfosfaatbuffer pH 7.8, 0.1mM H2O2, 0.1mM EDTA en 0.5mM ascorbinezuur.

- De tweede reactiemix bestond uit 25mM natriumfosfaat pH 7.0, 0.1mM EDTA, 1mM

H2O2 en 0.25mM ascorbinezuur (Panchuk et al. 2002).

- De derde reactiemix bestond uit: 50mM natriumfosfaat pH 7.0, 0.1mM H2O2 en

0.5mM ascorbinezuur (Amako et al. 1994).

Elke reactiemix werd getest met elk verschillend extract. Geen enkele combinatie leverde

resultaat op. Hierbij werd vermoed dat APX mogelijks niet aanwezig is in het eiwitextract.

Er werd verder onderzoek gedaan in literatuur en dat leverde volgende optimalisatiestappen

op:

- Er werd gepland meer bladmateriaal af te wegen (500mg), in de veronderstelling dat

APX mogelijks dan wel geëxtraheerd wordt.

- Aangezien gekend is dat fenolen inhibitoren zijn van peroxidase (Hart et al. 1971)

werd gekozen om twee anti-fenolen toe te voegen, namelijk 10mM β-mercapto-

ethanol en 1mM dithiothreitol (DTT). Beide stabiliseren de vrije -SH groepen, die van

groot belang zijn voor de activiteit van enzymen. Deze anti-fenolen werden

toegevoegd aan de buffersamenstelling gebruikt door Jin et al. (2006), aangezien

hierin wordt uitgegaan van gelijkaardig startmateriaal. Indien veel aanpassingen

tegelijk gedaan worden is het niet duidelijk welke veranderingen precies de gewenste

resultaten geven. Vandaar werd behalve een extract met anti-fenolen ook een extract

gemaakt zonder anti-fenolen in dezelfde extractiebuffer ter vergelijking.

- Zoals beschreven in Amako et al. (1994) kan de APX-activiteit in het supernatans op

twee manieren getest worden: met ascorbinezuur als substraat of met pyrogallol als

substraat. Bij gebruik van pyrogallol zijn de gebruikte instellingen en formules van het

bestaande protocol ongeschikt geworden. De omzetting van pyrogallol naar

purpurogallin wordt gemeten bij 430nm en de extinctiecoëfficient van purpurogallin

moet gebruikt worden bij berekeningen. De activiteit van het enzym kan gezien


worden als toename in absorbantie. De reactiemix bestaat uit: 50mM fosfaatbuffer

pH 7.8, 20mM pyrogallol, 0.1mM H2O2 en 0.1mM EDTA.

De combinatie van meer bladmateriaal afwegen, eiwitextractie volgens Jin et al. (2006) en

het volgen van de oxidatie van pyrogallol zorgden voor een stijgend lineair verband bij 430nm

ten gevolge van pyrogallol oxidatie door APX (zie Figuur 21).

Figuur 21: Grafische voorstelling van de APX bepaling via oxidatie van pyrogallol tot purpurogallin.

Zoals eerder aangehaald is het wenselijk meerdere enzymen te bepalen in één extract met

oog op tijdswinst. In een volgende proefopzet werd getest of de APX bepaling met pyrogallol

als substraat correcte resultaten geeft in de geoptimaliseerde POX extractiebuffer, maar met

toevoeging van 1mM ascorbinezuur. Deze buffer heeft een gelijkaardige samenstelling,

enkel een lagere pH van 6,1. In Tauber (1953) wordt aangeraden niet onder een pH van 5,3

te werken voor APX bepaling via pyrogallol, dus mogelijks stelt de pH geen problemen. Er

kan opgemerkt worden dat niet geprobeerd werd te testen of de APX bepaling lukt met de

extractiebuffer die gebruikt wordt voor SOD en CAT-activiteit, aangezien deze geen

ascorbinezuur bevat door de interferenties die anders optreden tijdens SOD analyse, terwijl

voor APX analyse net ascorbinezuur nodig is voor stabilisatie. Ook werd de nodige

hoeveelheid bladmateriaal bepaald. Hieruit komen volgende bevindingen:

- De APX bepaling is succesvol in de geoptimaliseerde POX buffer en de toevoeging

van ascorbinezuur heeft geen invloed op de POX meting. Aangezien deze extractie

verschillend is van de extractiebuffer voor SOD en CAT bepaling, zal de

eiwitconcentratie voor elk extract apart moeten bepaald worden via de methode van

Bradford.

- Indien 300mg bladmateriaal wordt afgewogen, wordt een extract met gemiddelde

eiwitconcentratie van 0,8mg/ml bekomen, terwijl bij gebruik van 500mg bladmateriaal

1,25mg/ml eiwitconcentratie wordt bekomen. Tevens zorgt deze hogere

eiwitconcentratie voor een beter lineair verband tijdens enzymmetingen, met een r²

y = 0,0129x + 0,9141R² = 0,9984

0,91

0,915

0,92

0,925

0,93

0,935

0,94

0,945

0,95

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

Ab

sorb

an

tie

Tijd


tussen 0,98 en 0,99 in vergelijking met 0,90 bij het extract met lagere

eiwitconcentratie. Om de eiwitconcentratie met grotere nauwkeurigheid te kunnen

bepalen zal de BSA ijklijn ook uitgebreid worden tot 2 mg/ml.

4.2 Droogtestress-experiment

4.2.1 Effecten van polyploïdie op de activiteit van stress-enzymen

Als eerste onderdeel werd onderzocht of polyploïdie een invloed had op de activiteit van

stress-enzymen in de controleplanten. Het doel is achterhalen of een eventuele constitutieve

expressie door verhoogd ploïdie niveau leidt tot hogere translatie, waardoor polyploïdisatie

kan leiden tot het verhogen van de stressresistentie.

De gegevens van het experiment worden weergegeven in Tabellen 3, 4 en 5. Met behulp

van een t-toets kan op basis van het 5% significantieniveau besloten worden dat er op het

globaal gemiddelde bij geen enkel genotype significant verschillende waarden gevonden zijn

tussen de diploïde en tetraploïde vorm. Indien ook een t-toets per tijdstip wordt uitgevoerd

worden wel effecten gezien van polyploïdie maar deze zijn niet gelijklopend voor de

verschillende genotypes. In genotype 16 wordt een systematisch lagere activiteit van POX

gezien in de tetraploïde vorm. Bij genotype 96 wordt een hogere SOD-activiteit

waargenomen in de tetraploïde vorm. Een besluit trekken over de activiteit van de andere

enzymen blijkt moeilijk bij deze genotypes, er worden namelijk geen consistenties gezien.

Bij R. laevigata wordt een trend van verhoogde activiteit in de tetraploïde vorm gezien, maar

er blijken meer herhalingen nodig voor de statische verwerking opdat deze trend significant

zouden worden.

Tabel 3: Activiteiten van antioxidatieve enzymen in controleplanten van genotype 16 op 3 tijdstippen tijdens het experiment. De enzymactiviteit werd gemeten in bladextract op verschillende tijdstippen na inductie van droogte. SOD: Superoxidedismutase; CAT: Catalase; APX: Ascorbaatperoxidase; POX: Guaiacolperoxidase; 2x: Diploïde vorm; 4x: Tetraploïde vorm. De weergegeven waarden zijn het gemiddelde van 4 onafhankelijke replica’s (n=4). Significantieniveau: *:p<0,05.

Genotype Tijdstip SOD (Unit)

CAT (units

mg proteïne -1 min -1)

APX (mmol

min -1 mg

proteïne -1)

POX (mmol

min -1 mg

proteïne -1)

16 2x 24/09/2014

36,26 2,18 791,15 34,65

16 4x 37,33 2,07 852,62 24,19

16 2x 1/10/2014

71,06 4,57 626,56 25,57

16 4x 87,70 6,66 643,30 22,19

16 2x 8/10/2014

45,06 9,74 1895,89 43,56

16 4x 30,73 7,33 1326,12 30,71

Globaal

gemiddelde

16 2x 50,79 5,50 1104,53 34,59

16 4x 51,92 5,35 1039,81 25,70


Tabel 4: Activiteiten van antioxidatieve enzymen in controleplanten van genotype 96 op 3 tijdstippen tijdens het experiment. De enzymactiviteit werd gemeten in bladextract op verschillende tijdstippen na inductie van droogte. SOD: Superoxidedismutase; CAT: Catalase; APX: Ascorbaatperoxidase; POX: Guaiacolperoxidase; 2x: Diploïde vorm; 4x: Tetraploïde vorm. De weergegeven waarden zijn het gemiddelde van 4 onafhankelijke replica’s (n=4). Significantieniveau: *:p<0,05.

Genotype Tijdstip SOD (Unit)

CAT (units

mg proteïne -1 min -1)

APX (mmol

min -1 mg

proteïne -1)

POX (mmol

min -1 mg

proteïne -1)

96 2x 24/09/2014

35,95 1,86 863,63 26,85

96 4x 43,05 4,84 809,23 22,83

96 2x 1/10/2014

57,49 1,59 1693,19 37,65

96 4x 92,44 4,69 1426,37 47,74

96 2x 8/10/2014

33,94 1,28 936,93 41,17

96 4x 35,36 1,13 978,60 32,35

Globaal

gemiddelde

96 2x 42,46 1,58 1164,58 34,01

96 4x 56,95 3,55 1071,4 34,31

Tabel 5: Activiteiten van antioxidatieve enzymen in controleplanten van genotype Rosa laevigata op 3 tijdstippen tijdens het experiment. De enzymactiviteit werd gemeten in bladextract op verschillende tijdstippen na inductie van droogte. SOD: Superoxidedismutase; CAT: Catalase; APX: Ascorbaatperoxidase; POX: Guaiacolperoxidase; 2x: Diploïde vorm; 4x: Tetraploïde vorm; RL: Rosa laevigata. De weergegeven waarden zijn het gemiddelde van 2 onafhankelijke replica’s (n=2). Significantieniveau: *:p<0,05.

Genotype Tijdstip

APX (mmol

min -1 mg

proteïne -1)

POX (mmol

min -1 mg

proteïne -1)

RL 2x 24/09/2014

736,05 13,09

RL 4x 796,59 39,44

RL 2x 1/10/2014

228,38 27,92

RL 4x 632,93 65,87

RL 2x 8/10/2014

581,39 61,74

RL 4x 686,40 70,79

Globaal

gemiddelde

RL 2x 515,27 34,25

RL 4x 705,31 58,70

4.2.2 Effecten van droogtestress op het totale eiwitgehalte

Droogtestress brengt kwantitatieve en kwalitatieve veranderingen met zich mee in het

proteïnegehalte van de plant. Aangezien waterdeficiëntie mogelijks leidt tot down-regulatie

van eiwitbiosynthese wordt nagegaan of de eiwitconcentraties beïnvloed worden gedurende

de geïnduceerde droogtestress. In Tabellen 6, 7 en 8 wordt een vergelijking gemaakt van de

totale hoeveelheid geëxtraheerde eiwitten. Vermits er twee verschillende extracties werden

uitgevoerd, met elk een verschillende buffersamenstelling, worden beide extractiewaarden

afzonderlijk weergegeven. Aangezien 80-95% van het vers gewicht van planten kan bestaan

uit water worden de eiwitextracties uitgedrukt op basis van het drooggewicht, omgerekend


via de achterhaalde verhouding tussen vers en droog gewicht van de bladstalen (zie 3.1).

Op deze manier kan een vergelijking gemaakt worden tussen controle en droogteplanten.

Reeds bij de eerste staalname, 7 dagen na het stoppen van de irrigatie, worden significant

minder eiwitten geëxtraheerd uit het bladmateriaal dat afkomstig is van planten die

onderworpen zijn aan droogtestress. Deze dalende trend houdt aan naarmate de

droogtestress verder vordert.

Tabel 6: De hoeveelheid geëxtraheerde eiwitten in genotype 16 voor de analyse van de stress-enzymen. De eiwitten werden geëxtraheerd uit bladmateriaal. Er werd een verschillende buffer gebruikt voor de bepaling van SOD en CAT en voor POX en APX. De weergegeven waarden zijn het gemiddelde van 4 onafhankelijke replica’s (n=4). Significantieniveau: *:P<0,05. SOD: Superoxidedismutase; CAT: Catalase; APX: Ascorbaatperoxidase; POX: Guaiacolperoxidase; 2x: Diploïde vorm; 4x: Tetraploïde vorm.

Genotype

Tijdstip

(dagen na

inductie

droogte)

Extractie voor SOD en CAT

(mg proteïne * g DW -1)

Extractie voor POX en APX


Controle Droogte Controle Droogte

16 2x 7 6,45 * 2,92 37,89 * 26,29

16 2x 14 4,62 1,39 26,97 31,11

16 2x 21 2,59 2,86 28,45 32,61

16 4x 7 6,83 * 3,14 40,08 * 23,45

16 4x 14 3,06 2,51 33,43 27,80

16 4x 21 5,51 4,60 38,38 32,80

Tabel 7: De hoeveelheid geëxtraheerde eiwitten in genotype 96 voor de analyse van de stress-enzymen. De eiwitten werden geëxtraheerd uit bladmateriaal. Er werd een verschillende buffer gebruikt voor de bepaling van SOD en CAT en voor POX en APX. De weergegeven waarden zijn het gemiddelde van 4 onafhankelijke replica’s (n=4). Significantieniveau: *:P<0,05. SOD: Superoxidedismutase; CAT: Catalase; APX: Ascorbaatperoxidase; POX: Guaiacolperoxidase; 2x: Diploïde vorm; 4x: Tetraploïde vorm.

Genotype

Tijdstip

(dagen na

inductie van

droogte)

Extractie voor SOD en CAT




Controle Droogte Controle Droogte

96 2x 7 5,82 * 2,60 33,53 * 23,52

96 2x 14 5,93 * 2,12 36,78 * 26,19

96 2x 21 4,83 * 2,34 36,65 * 23,88

96 4x 7 4,55 * 2,51 43,46 * 16,55

96 4x 14 4,45 2,11 23,65 26,48

96 4x 21 5,37 * 2,04 27,11 19,23


Tabel 8: De hoeveelheid geëxtraheerde eiwitten in genotype Rosa laevigata voor de analyse van de stress-enzymen. De eiwitten werden geëxtraheerd uit bladmateriaal. Enkel de enzymactiviteiten van POX en APX werden bepaald in dit genotype. De weergegeven waarden zijn het gemiddelde van 2 onafhankelijke replica’s (n=2). Significantieniveau: *:P<0,05. SOD: Superoxidedismutase; CAT: Catalase; APX: Ascorbaatperoxidase; POX: Guaiacolperoxidase; 2x: Diploïde vorm; 4x: Tetraploïde vorm, RL: Rosa laevigata.

Genotype

Tijdstip

(dagen na

inductie van

droogte)


(mg proteïne g DW -1)

Controle Droogte

RL 2x 7 26,26 * 16,04

RL 2x 14 26,09 18,53

RL 2x 21 31,50 * 19,06

RL 4x 7 29,39 24,01

RL 4x 14 28,57 * 14,17

RL 4x 21 25,77 16,28

4.2.3 Effecten van droogtestress op de activiteit van stress-enzymen

Om na te gaan hoe een genotype reageert op door droogte geïnduceerde oxidatieve stress

werd onderzocht hoe de stressgevoelige enzymen CAT, SOD, APX en POX reageren

wanneer de planten gedurende 21 dagen onderworpen worden aan droogte. Hieruit kunnen

tevens de droogtetolerante en droogtegevoelige cultivars geselecteerd worden. Verder

zullen deze resultaten ook gekoppeld worden aan de morfologische waarnemingen.

4.2.3.1 Genotype 16

Het verloop van het volumetrisch vochtgehalte van het substraat tijdens de droogtestress

wordt weergegeven in Figuur 22. Hieruit kan gezien worden met welke snelheid het genotype

droogte voelt. Inductie van droogte begint bij 30-35 vol% en vanaf 20 vol% kan men spreken

van ernstige droogtestress.

Aangezien op de dag van staalname het vochtgehalte in het substraat niet werd gemeten,

worden de resultaten van de metingen gebruikt op de dagen die het dichtst bij de staalname

lagen, namelijk op 8, 16 en 22 dagen na inductie van droogte. Aangezien deze waarden

kunnen verschillen van het werkelijke vochtgehalte op de dagen van staalname (7, 14 en 21)

wordt dit in de resultaten aangeduid als een schatting door voorafgaand ± te gebruiken.

Bij de diploïde vorm is het verloop in de droogteplanten op 8, 16 en 22 dagen na inductie

van droogte respectievelijk 24.4, 15.4 en 11.9 vol%. De tetraploïde vorm voelt de droogte

ongeveer even snel, namelijk op 8, 16 en 22 dagen na inductie van droogte respectievelijk

27.3, 16.6 en 12.8 vol% (zie Figuur 22). Bij beide ploïdieniveaus kan gezien worden dat de

droogte ernstig wordt wanneer deze 10 dagen aanhield. In de controleplanten daalt het

vochtgehalte niet onder 50 vol%.


Figuur 22: Het verloop van het volumetrisch vochtgehalte van het substraat bij genotype 16 in functie van de duur van de opgelegde droogtestress. Een referentielijn bij 20 vol% wordt weergegeven.

De APX-activiteit wordt weergegeven in Figuur 23. De APX-activiteit bij de controleplanten

varieert voor de diploïde planten tussen 626,56 en 1895,89 mmol min-1 mg proteïne-1 en voor

de tetraploïde tussen 643,31 en 1326,13 mmol min-1 mg proteïne-1. Bij de droogteplanten

varieert de APX-activiteit van de diploïde planten tussen 982,72 en 1230,42 mmol min-1

mg proteïne-1 en voor de tetraploïde planten tussen 935,58 en 1058,85 mmol min-1 mg

proteïne-1.

De APX-activiteit vertoont bij de diploïde vorm een significante stijging na 14 dagen droogte

(vochtgehalte substraat ±15,4 vol%), maar deze daalt terug op het einde van het experiment.

Bij de tetraploïde vorm neemt de activiteit aan het begin van de droogteperiode significant

toe maar verschilt verder in de tijd niet significant van de controleplanten.

Er kan opgemerkt worden dat de controleplanten bij beide ploïdieniveaus 21 dagen na

inductie van droogte een plotse stijging maken in APX-activiteit. Er kan in eerste instantie

gedacht worden dat dit te wijten is aan meer zonlicht in de serre, waardoor een reactie van

de controleplanten op verhoogde ROS productie wordt gemeten. De lichtintensiteitsdata

tonen echter geen sterkere lichtintensiteit de dagen voor staalname. Aangezien tijdens het

serre experiment een aantal druppelaars van de controleplanten niet goed werkten wordt

ook gekeken naar het vochtgehalte van het substraat één dag na staalname (na 22 dagen).

Hierin wordt eveneens geen afwijking gevonden, het vol% substraat bedraagt namelijk

51,8% in genotype 16 2x en 60,15% in genotype 16 4x. Er kan geen omgevingsparameter

worden aangetoond die de hogere APX-activiteit in controleplanten op dag 21 t.o.v. dag 14

en 7 verklaard.

Genotype 16

Dagen na inductie van droogte

0 5 10 15 20 25

Vo

ch

tge

ha

lte

su

bstr

aa

t (v

ol%

)

0

20

40

60

80

10016 2x Controle

16 2x Droogte

16 4x Controle

16 4x Droogte

Genotype 96


0 5 10 15 20 25

Vo

ch

tge

ha

lte

su

bstr

aa

t (V

ol%

)

0

20

40

60

80

10096 2x Controle

96 2x Droogte

96 4x Controle

96 4x Droogte

Rosa laevigata


0 5 10 15 20 25

Vo

ch

tge

ha

lte

su

bstr

aa

t (V

ol%

)

0

20

40

60

80

100RL 2x Controle

RL 2x Droogte

RL 4x Controle

RL 4x Droogte


Figuur 23: De invloed van droogtestress in de tijd op de APX-activiteit van genotype 16. De activiteit wordt weergegeven in mmol min-1 mg proteïne-1. De weergegeven waarden zijn het gemiddelde van 4 replica’s (n=4). De foutenbalken zijn een weergave van de standaard error (SE). *= Significantie voor p<0,05.

De POX-activiteit wordt weergegeven in Figuur 24. De POX-activiteit bij de controleplanten

varieert voor de diploïde planten tussen 25,58 en 43,56 mmol min-1 mg proteïne-1 en voor de

tetraploïde planten tussen 22,19 en 30,71 mmol min-1 mg proteïne-1. Bij de droogteplanten

varieert de POX-activiteit van de diploïde planten tussen 24,70 en 43,26 mmol min-1 mg

proteïne-1 en voor de tetraploïde planten tussen 23,95 en 51,06 mmol min-1 mg proteïne-1.

De POX-activiteit toont in de diploïde en tetraploïde vorm een significante stijging bij milde

droogtestress (7 dagen, vochtgehalte respectievelijk ±24,4 en ±27,3 Vol%), terwijl de

activiteit niet significant verandert (16 4x) of afneemt (16 2x) in vergelijking met de

controleplanten bij ernstige droogtestress (21 dagen, vochtgehalte respectievelijk ±12,8 en

±11,9 Vol%).

Figuur 24: De invloed van droogtestress in de tijd op de POX-activiteit van genotype 16. De activiteit wordt weergegeven in mmol min-1 mg proteïne-1. De weergegeven waarden zijn het gemiddelde van 4 replica’s (n=4). De foutenbalken zijn een weergave van de standaard error (SE). *= Significantie voor p<0,05.

APX genotype 16 2x


7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

500

1000

1500

2000

250016 2x controle

16 2x droogte

APX genotype 96 2x


7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

500

1000

1500

2000

96 2x controle

96 2x droogte

APX genotype 16 4x


7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

500

1000

1500

2000

250016 4x controle

16 4x droogte

APX genotype 96 4x


7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

500

1000

1500

2000

96 4x controle

96 4x droogte

APX genotype Rosa laevigata 2x


7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

500

1000

1500

2000

2500

RL 2x controle

RL 2x droogte



7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

500

1000

1500

2000

2500

RL 4x controle

RL 4x droogte

*

*

*

*

*

*

*POX genotype 16 2x


7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

10

20

30

40

50

60

16 2x controle

16 2x droogte

POX genotype 96 2x


7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

20

40

60

8096 2x controle

96 2x droogte

POX genotype 16 4x


7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

10

20

30

40

50

60

16 4x controle

16 4x droogte

POX genotype 96 4x


7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

20

40

60

8096 4x controle

96 4x droogte

POX genotype Rosa laevigata 2x


7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

20

40

60

80

100RL 2x controle

RL 2x droogte



7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

20

40

60

80

100RL 4x controle

RL 4x droogte

*

*

*

* *

*

*

*


De CAT-activiteit wordt weergegeven in Figuur 25. De CAT-activiteit bij de controleplanten

varieert voor de diploïde planten tussen 2,19 en 9,74 units min-1 mg proteïne-1 en tussen 2,07

en 7,34 units min-1 mg proteïne -1 voor de tetraploïde planten. Bij de droogteplanten varieert

de CAT-activiteit van de diploïde planten tussen 2,09 en 6,15 units min-1 mg proteïne-1 en

tussen 1,94 en 3,21 units min-1 mg proteïne-1 voor de tetraploïde planten.

De CAT-activiteit toont in de diploïde vorm geen significante verandering in het begin van

het droogte experiment tegenover de controleplanten, en na 21 dagen droogte (vochtgehalte

substraat ±11,9 vol%) zelfs een significante daling van de activiteit tegenover de

controleplanten. Bij de tetraploïde vorm wordt bij milde droogtestress (na 7 dagen,

vochtgehalte substraat ±27,3 Vol%) een initiële toename gezien, terwijl de activiteit geen

significante verandering toont ten opzichte van de controleplanten bij ernstig wordende

droogtestress, na 14 en 21 dagen droogte (vochtgehalte substraat respectievelijk ±16,6 en

±12,8 Vol%). Er wordt opnieuw een stijging gezien van de activiteit in de controleplanten van

beide ploïdieniveaus 21 dagen na inductie van droogte.

Figuur 25: De invloed van droogtestress in de tijd op de CAT-activiteit van genotype 16. De activiteit wordt weergegeven in units min-1 mg proteïne-1. De weergegeven waarden zijn het gemiddelde van 4 replica’s (n=4). De foutenbalken zijn een weergave van de standaard error (SE). *= Significantie voor p<0,05.

De SOD-activiteit wordt weergegeven in Figuur 26. De SOD-activiteit bij de controleplanten

varieert voor de diploïde planten tussen 36,27 en 71,07 units en tussen 30,73 en 87,70 units

voor de tetraploïde planten. Bij de droogteplanten varieert het SOD-activiteit van de diploïde

planten 151,96 en 185,89 units en tussen 147,21 en 185,43 units voor de tetraploïde planten.

De enzymactiviteit van SOD neemt in beide ploïdieniveaus significant toe aan het begin van

de inductie van droogte en blijft vrij stabiel gedurende het experiment. Bij de controleplanten

blijft de SOD waarde significant lager.

Catalase genotype 16 2x


7 14 21

Units /

min

* m

g p

rote

in

0

2

4

6

8

10

12

16 2x controle

16 2x droogte



7 14 21

Units / m

in *

mg p

rote

in

0

2

4

6

8

96 2x controle

96 2x droogte



7 14 21

Units / m

in *

mg p

rote

in

0

2

4

6

8

10

12

16 4x controle

16 4x droogte



7 14 21

Units / m

in *

mg p

rote

in

0

2

4

6

8

96 4x controle

96 4xdroogte

*

*

*


Figuur 26: De invloed van droogtestress in de tijd op de SOD-activiteit van genotype 16. De activiteit wordt weergegeven in units. De weergegeven waarden zijn het gemiddelde van 4 replica’s (n=4). De foutenbalken zijn een weergave van de standaard error (SE). *= Significantie voor p<0,05.

Ten slot kunnen deze resultaten ook nog gekoppeld worden aan de waargenomen

morfologische kenmerken van de planten (Figuur 27). Er wordt minder groei gezien in de

droogteplanten. Verder vallen ook de mindere hoeveelheid blaadjes op en de vergeling die

ontstaat bij de droogteplanten. Morfologische voordelen van de tetraploïde planten ten

opzichte van de diploïde worden niet waargenomen.

Figuur 27: De invloed van droogtestress op de morfologie van genotype 16. De foto’s zijn genomen op het einde van het experiment of na een droogte die 23 dagen aanhield. Gebruikte afkortingen: a: 16 2x droogte, b: 16 2x controle, c: 16 4x droogte, d: 16 4x controle, 2x : diploïd vorm, 4x: tetraploïde vorm.

4.2.3.2 Genotype 96

Het volumetrisch vochtgehalte van het substraat wordt weergegeven in Figuur 28. Bij de

diploïde vorm is het verloop in de droogteplanten op 8, 16 en 22 dagen na inductie van

droogte respectievelijk 22.9, 13.5 en 12.0 vol%. De tetraploïde vorm voelt de droogte iets

sneller, namelijk op 8, 16 en 22 dagen na inductie van droogte respectievelijk 17.0, 11.3 en

9.7 vol%. In de controleplanten daalt het vochtgehalte niet onder 45 vol%.

SOD genotype 16 2x


7 14 21

Unit

0

50

100

150

200

16 2x controle

16 2x droogte

SOD genotype 96 2x


7 14 21

Unit

0

50

100

150

200

96 2x controle

96 2x droogte

SOD genotype 16 4x


7 14 21

Unit

0

50

100

150

200

16 4x controle

16 4x droogte

SOD genotype 96 4x


7 14 21

Unit

0

50

100

150

200

96 4x controle

96 4x droogte

*

* *

*

**

** *

*

**


Figuur 28: Het verloop van het volumetrisch vochtgehalte van het substraat bij genotype 96 in functie van de duur van de opgelegde droogtestress. Een referentielijn bij 20 vol% wordt weergegeven.


varieert voor de diploïde planten tussen 863,64 en 1693,19 mmol min-1 mg proteïne-1 en

tussen 809,24 en 1426,38 mmol min-1 mg proteïne-1 voor de tetraploïde planten. Bij de

droogteplanten varieert de APX-activiteit van de diploïde planten tussen 855,21 en 1021,35

mmol min-1 mg proteïne-1 en tussen 923,78 en 1383,27 mmol min-1 mg proteïne-1 voor de

tetraploïde planten.

Bij de tetraploïde vorm neemt de APX-activiteit aan het begin van de droogteperiode toe

maar verandert verder in de tijd niet significant van de controleplanten. Bij de diploïde vorm

wordt geen stijging waargenomen in de activiteit van de droogteplanten.

Figuur 29: De invloed van droogtestress in de tijd op de APX-activiteit van genotype 96. De activiteit wordt weergegeven in mmol min-1 mg proteïne-1. De weergegeven waarden zijn het gemiddelde van 4 replica’s (n=4). De foutenbalken zijn een weergave van de standaard error (SE). *= Significantie voor p<0,05.

Genotype 16


0 5 10 15 20 25

Vochtg

ehalte s

ubstr

aat (v

ol%

)

0

20

40

60

80

10016 2x Controle

16 2x Droogte

16 4x Controle

16 4x Droogte

Genotype 96


0 5 10 15 20 25

Vochtg

ehalte s

ubstr

aat (V

ol%

)

0

20

40

60

80

10096 2x Controle

96 2x Droogte

96 4x Controle

96 4x Droogte

Rosa laevigata


0 5 10 15 20 25

Vochtg

ehalte s

ubstr

aat (V

ol%

)

0

20

40

60

80

100RL 2x Controle

RL 2x Droogte

RL 4x Controle

RL 4x Droogte

APX genotype 16 2x


7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

500

1000

1500

2000

250016 2x controle

16 2x droogte

APX genotype 96 2x


7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

500

1000

1500

2000

96 2x controle

96 2x droogte

APX genotype 16 4x


7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

500

1000

1500

2000

250016 4x controle

16 4x droogte

APX genotype 96 4x


7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

500

1000

1500

2000

96 4x controle

96 4x droogte



7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

500

1000

1500

2000

2500

RL 2x controle

RL 2x droogte



7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

500

1000

1500

2000

2500

RL 4x controle

RL 4x droogte

*

*

*

*

*

*

*



varieert voor de diploïde planten tussen 26,85 en 41,17 mmol min-1 mg proteïne-1 en tussen

22,83 en 73,60 mmol min-1 mg proteïne-1 voor de tetraploïde planten. Bij de droogteplanten


proteïne-1 en tussen 44,98 en 74,84 mmol min-1 mg proteïne-1 voor de tetraploïde planten.

De POX-activiteit van de diploïde vorm vermindert in de tijd na de initiële geziene significante

stijging bij milde droogtestress. Bij de tetraploïde vorm wordt initieel een significante stijging

gezien in activiteit, waarna deze daalt na 14 dagen droogte en terug stijgt op het einde van

het experiment.

Figuur 30: De invloed van droogtestress in de tijd op de POX-activiteit van genotype 96. De activiteit wordt weergegeven in mmol min-1 mg proteïne-1. De weergegeven waarden zijn het gemiddelde van 4 replica’s (n=4). De foutenbalken zijn een weergave van de standaard error (SE). *= Significantie voor p<0,05.

De CAT-activiteit wordt weergegeven in Figuur 31. De CAT-activiteit bij de controleplanten

varieert voor de diploïde planten tussen 1,28 en 1,86 units min-1 mg proteïne-1 en tussen 1,13

en 4,84 units min-1 mg proteïne-1 voor de tetraploïde planten. Bij de droogteplanten varieert

de CAT-activiteit van de diploïde planten tussen 1,48 en 5,63 units min-1 mg proteïne-1 en

tussen 2,75 en 4,82 units min-1 mg proteïne-1 voor de tetraploïde planten.

In de CAT-activiteit van de diploïde vorm wordt eerst een initiële toename (na 7 dagen,

vochtgehalte substraat ±22.9 vol%) gezien, waarna de activiteit in het verdere verloop van

het experiment niet significant verschilt van de activiteit in de controleplanten. Bij de

tetraploïde vorm wordt gedurende het volledige experiment geen significante verandering

gezien tussen de activiteit in droogte- en controleplanten. De verschillen in activiteit tussen

controle- en droogteplanten zijn vaak niet significant door de relatief grote standaardfout.

POX genotype 16 2x


7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

10

20

30

40

50

60

16 2x controle

16 2x droogte

POX genotype 96 2x


7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

20

40

60

8096 2x controle

96 2x droogte

POX genotype 16 4x


7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

10

20

30

40

50

60

16 4x controle

16 4x droogte

POX genotype 96 4x


7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

20

40

60

8096 4x controle

96 4x droogte



7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

20

40

60

80

100RL 2x controle

RL 2x droogte



7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

20

40

60

80

100RL 4x controle

RL 4x droogte

*

*

*

* *

*

*

*


Figuur 31: De invloed van droogtestress in de tijd op de CAT-activiteit van genotype 96. De activiteit wordt weergegeven in units min-1 mg proteïne-1. De weergegeven waarden zijn het gemiddelde van 4 replica’s (n=4). De foutenbalken zijn een weergave van de standaard error (SE). *= Significantie voor p<0,05.

De SOD-activiteit wordt weergegeven in Figuur 32. De SOD-activiteit bij de controleplanten

varieert voor de diploïde planten tussen 33,94 en 57,49 units en tussen 35,36 en 92,44 units

voor de tetraploïde planten. Bij de droogteplanten varieert de SOD-activiteit van de diploïde

planten 160,07 en 178,19 units en tussen 137,76 en 181,53 units voor de tetraploïde planten.

Opvallend is dat de capaciteit van SOD ook in genotype 96 constant blijft. De SOD-activiteit

is in de droogteplanten significant hoger dan in de controleplanten. Dit blijft zo gedurende

het volledige droogte-experiment.

Figuur 32: De invloed van droogtestress in de tijd op de SOD-activiteit van genotype 96. De activiteit wordt weergegeven in units. De weergegeven waarden zijn het gemiddelde van 4 replica’s (n=4). De foutenbalken zijn een weergave van de standaard error (SE). *= Significantie voor p<0,05.



7 14 21

Units /

min

* m

g p

rote

in

0

2

4

6

8

10

12

16 2x controle

16 2x droogte



7 14 21

Units /

min

* m

g p

rote

in

0

2

4

6

8

96 2x controle

96 2x droogte



7 14 21

Units /

min

* m

g p

rote

in

0

2

4

6

8

10

12

16 4x controle

16 4x droogte



7 14 21

Units /

min

* m

g p

rote

in

0

2

4

6

8

96 4x controle

96 4xdroogte

*

*

*

SOD genotype 16 2x


7 14 21

Unit

0

50

100

150

200

16 2x controle

16 2x droogte

SOD genotype 96 2x


7 14 21

Unit

0

50

100

150

200

96 2x controle

96 2x droogte

SOD genotype 16 4x


7 14 21

Unit

0

50

100

150

200

16 4x controle

16 4x droogte

SOD genotype 96 4x


7 14 21

Unit

0

50

100

150

200

96 4x controle

96 4x droogte

*

* *

*

**

** *

*

**


Morfologisch kan een sterke geel verkleuring van de blaadjes gezien worden en zichtbaar

gereduceerde plantengroei indien de droogte- en controleplanten vergeleken worden (Figuur

33).

Figuur 33: De invloed van droogtestress op de morfologie van genotype 96. De foto’s zijn genomen op het einde van het experiment of na een droogte die 23 dagen aanhield. Gebruikte afkortingen: a: 96 2x droogte, b: 96 2x controle, c: 96 4x droogte, d: 96 4x controle, 2x : diploïd vorm, 4x: tetraploïde vorm.

4.2.3.3 Rosa laevigata

Het volumetrisch vochtgehalte van het substraat wordt weergegeven in Figuur 34. Bij de

diploïde vorm is het verloop in de droogteplanten op 8, 16 en 22 dagen na inductie

respectievelijk 36.3, 16.8 en 19.4 vol%. Bij de tetraploïde vorm is het verloop van het

vochtgehalte van het substraat op 8, 16 en 22 dagen na inductie van droogte respectievelijk

35.1, 22.2 en 19.7 vol%. In de controleplanten daalt het vochtgehalte niet onder 50 vol%.

Figuur 34: Het verloop van het volumetrisch vochtgehalte van het substraat bij genotype Rosa laevigata in functie van de duur van de opgelegde droogtestress. Een referentielijn bij 20 vol% wordt weergegeven.

Genotype 16


0 5 10 15 20 25

Vochtg

ehalte s

ubstr

aat (v

ol%

)

0

20

40

60

80

10016 2x Controle

16 2x Droogte

16 4x Controle

16 4x Droogte

Genotype 96


0 5 10 15 20 25

Vochtg

ehalte s

ubstr

aat (V

ol%

)

0

20

40

60

80

10096 2x Controle

96 2x Droogte

96 4x Controle

96 4x Droogte

Rosa laevigata


0 5 10 15 20 25

Vochtg

ehalte s

ubstr

aat (V

ol%

)

0

20

40

60

80

100RL 2x Controle

RL 2x Droogte

RL 4x Controle

RL 4x Droogte



varieert voor de diploïde planten tussen 228,38 en 736,05 mmol min-1 mg proteïne -1 en

tussen 632,93 en 796,59 mmol min-1 mg proteïne -1 voor de tetraploïde planten. Bij de

droogteplanten varieert de APX-activiteit van de diploïde planten tussen 1202,36 en 1852,51

mmol min-1 mg proteïne -1 en tussen 1013,84 en 2100,23 mmol min-1 mg proteïne -1 voor de

tetraploïde planten.

De hoge APX-activiteit in beide ploïdieniveaus van Rosa laevigata valt meteen op. Er wordt

een stijgend verband gezien, maar aangezien slechts met twee herhalingen werd gewerkt is

dit verband door de relatief grote standaardfout niet significant. Ook opvallend is dat deze

stijging al optreedt na een droogte van 7 dagen, terwijl het vochtgehalte in het substraat na

8 dagen droogte ±35-36 vol% bedraagt.

Figuur 35: De invloed van droogtestress in de tijd op de APX-activiteit van genotype Rosa laevigata. De activiteit wordt weergegeven in mmol min-1 mg proteïne-1. De weergegeven waarden zijn het gemiddelde van 2 replica’s (n=2). De foutenbalken zijn een weergave van de standaard error (SE). *= Significantie voor p<0,05.


varieert voor de diploïde planten tussen 13,10 en 61,74 mmol min-1 mg proteïne -1 en tussen

39,44 en 70,80 mmol min-1 mg proteïne -1 voor de tetraploïde planten. Bij de droogteplanten


proteïne -1 en tussen 57,86 en 74,24 mmol min-1 mg proteïne -1 voor de tetraploïde planten.

De POX-activiteit verandert bij de tetraploïde vorm van R. laevigata niet significant tegenover

de controleplanten gedurende de volledige droogtestressperiode. Bij de diploïde vorm wordt

bij aanvang van de stress een stijgende maar niet significante toename gezien en na 21

dagen droogte (vochtgehalte substraat ±19,4 vol%) een significante daling in de activiteit van

de droogteplanten tegenover de controleplanten.

APX genotype 16 2x


7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

500

1000

1500

2000

250016 2x controle

16 2x droogte

APX genotype 96 2x


7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

500

1000

1500

2000

96 2x controle

96 2x droogte

APX genotype 16 4x


7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

500

1000

1500

2000

250016 4x controle

16 4x droogte

APX genotype 96 4x


7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

500

1000

1500

2000

96 4x controle

96 4x droogte



7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

500

1000

1500

2000

2500

RL 2x controle

RL 2x droogte



7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

500

1000

1500

2000

2500

RL 4x controle

RL 4x droogte

*

*

*

*

*

*

*


Figuur 36: De invloed van droogtestress in de tijd op de POX-activiteit van genotype Rosa laevigata. De activiteit wordt weergegeven in mmol min-1 mg proteïne-1. De weergegeven waarden zijn het gemiddelde van 2 replica’s (n=2). De foutenbalken zijn een weergave van de standaard error (SE). *= Significantie voor p<0,05.

Aangezien de geoptimaliseerde methode voor CAT en SOD bepaling niet bleek te werken in

het genotype R. laevigata kunnen omtrent deze enzymactiviteiten geen resultaten

weergegeven worden.

Morfologisch wordt er weinig verschil gezien tussen de droogte- en controleplanten en

tussen de diploïde en tetraploïde vorm. Dit is in overeenstemming met de resultaten van het

vochtgehalte in het substraat, aangezien de droogte pas ernstig begon te worden op het

einde van het experiment.

Figuur 37: De invloed van droogtestress op de morfologie van genotype Rosa laevigata. De foto’s zijn genomen op het einde van het experiment of na een droogte die 23 dagen aanhield. Gebruikte afkortingen: a: RL 2x droogte, b: RL 2x controle, c: RL 4x droogte, d: RL 4x controle, 2x : diploïd vorm, 4x: tetraploïde vorm, RL= Rosa laevigata.

POX genotype 16 2x


7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

10

20

30

40

50

60

16 2x controle

16 2x droogte

POX genotype 96 2x


7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

20

40

60

8096 2x controle

96 2x droogte

POX genotype 16 4x


7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

10

20

30

40

50

60

16 4x controle

16 4x droogte

POX genotype 96 4x


7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

20

40

60

8096 4x controle

96 4x droogte



7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

20

40

60

80

100RL 2x controle

RL 2x droogte



7 14 21

mm

ol /

min

* m

g p

rote

in

0

20

40

60

80

100RL 4x controle

RL 4x droogte

*

*

*

* *

*

*

*

Hoofdstuk 5: Discussie 50

5. DISCUSSIE

Droogte heeft een sterke negatieve impact op de plantaardige productie (Vinocur en Altman

2005). Droogtestress kan namelijk de kwaliteit en opbrengst van het gewas met 50%

verminderen (Wood 2005). Vanwege de klimaatwijziging zal de landbouw geconfronteerd

worden met langere periodes van droogte tijdens de actieve groeifase van de teelten.

Hierdoor wordt in de plantenveredeling sterk gezocht naar het inbrengen van

droogtetolerantie.

Dit onderzoek richt zich naar roos, behorende tot de Rosaceae familie. Er werden drie

diploïde genotypes mitotisch verdubbeld via antimitotica en geëvalueerd op

droogtetolerantie, namelijk genotype 16, genotype 96 en Rosa laevigata. Genotypes 16 en

96 maken deel uit van een diploïde F1 populatie afkomstig van de kruising Rosa ‘Yesterday’

x Rosa wichurana. De droogtestress werd geïnduceerd door het stoppen van de irrigatie en

hield 21 dagen aan. In deze thesis werd onderzocht of verhoging van ploïdieniveau

resulteerde in een betere droogtetolerantie door een beter afweermechanisme tegen ROS.

Onder normale condities zal de productie van ROS in planten laag zijn. Daarentegen zal

ROS accumulatie toenemen onder stressomstandigheden zoals droogte en de balans

tussen O2-, OH en H2O2 in de cel verstoren. Stress zorgt voor modificaties in de

genexpressie van planten (Vierling 1991). Deze modificaties kunnen resulteren in andere

genproducten en kunnen leiden tot accumulatie of net vermindering van bepaalde

metabolieten, synthese van nieuwe proteïnen, verminderde eiwitsynthese en veranderingen

in het gedrag van enzymen (Jacobsen et al. 1986). Verhoogde activiteit van verschillende

antioxidant enzymen werd al vermeld onder droogtestress in verscheidene plantspecies

(Sharma et al. 2012). Dit leidt tot twee onderzoeksthema’s die werden nagegaan:

1. Inzicht verwerven over de invloed van droogtestress op het totaal proteïnegehalte in

de bladeren.

2. De invloed van droogtestress op de activiteit van verschillende antioxidant enzymen

(SOD, CAT, APX en POX) nagaan. Dit omvat ook de enzymen uitzoeken die het

meest bijdragen aan ROS opruiming en nagaan of gebaseerd op deze

enzymactiviteiten de droogtegevoelige en tolerante roos genotypes kunnen

geselecteerd worden.

Natuurlijk voorkomende polyploïden kunnen een adaptief voordeel hebben in

stressomstandigheden (Hegarty en Hiscock 2008). Recent werd gezien dat ook kunstmatig

geïnduceerde polyploïden een verhoogde stressresistentie kunnen hebben (Talukdar 2014,

Van Laere et al. 2011, Li et al. 2009). Hieruit volgt het laatste onderzoeksthema:

3. Nagaan of chromosoomverdubbelde roos planten een verbeterde resistentie hebben

tegen droogtestress door verhoogde activiteit van antioxidatieve enzymen.


Effecten van droogtestress op het totale eiwitgehalte

Onder droogtestress werd bij roos een afname in het proteïnegehalte waargenomen in de

bladeren vergeleken met de controleplanten (normale irrigatie). Bovendien werd dit al vrij

vroeg in het experiment waargenomen, namelijk na een droogte die 7 dagen aanhield. De

afname van de hoeveelheid eiwitten onder droogtestress is een trend die al veelvoudig

beschreven werd in de literatuur bij verscheidene planten, onder andere in Vitex (Britto et al.

2011), maïs (Bewley en Larsen 1982, Heikkila et al. 1984) en gerst (Dasgupta en Bewley

1984). Omgevingsstress is in het algemeen nadelig voor de groei van de plant en beïnvloedt

het metabolisme van de planten negatief, waardoor het gehalte proteïnen kan afnemen door

de onderdrukkende effecten van de stress op proteïnesynthese en toegenomen snelheid

van proteolyse (Prisco en Vieira 1976, Dubey en Rani 1990). De reductie in eiwitsynthese

onder stresscondities is niet ten koste van één specifiek proteïne maar alle proteïnen worden

getroffen, doch wel in verschillende mate (Dasgupta en Bewley 1984). Droogte kan wel

leiden tot synthese van verscheidene nieuwe proteïnen, zoals vastgesteld in Vitex door Britto

et al. (2011). Deze nieuwe proteïnen zijn specifiek voor het type stress dat de plant

ondergaat.

Effecten van droogtestress op de activiteit van stress-enzymen

Hoewel de totale hoeveelheid eiwitten afneemt kan er wel een versterkte synthese van

eiwitten met een beschermende functie plaats vinden (Jacobsen et al. 1986). Dit is tevens

één van de strategieën die planten gebruiken om te kunnen weerstaan aan uitdroging. Er

werd dus nagegaan of droogtestress leidt tot hogere productie van antioxidatieve enzymen.

Het al of niet verhogen van een enzymactiviteit onder droogte hangt af van de

eigenschappen van de enzymen, de duur en ernst van de stress, het plantmateriaal dat

bestudeerd wordt en het ontwikkelingsstadium van de plant (Smirnoff 1993), wat vergelijking

van de bekomen resultaten bij roos met de literatuur bemoeilijkt.

De snelheid waarmee droogte optrad in de genotypes kon gevolgd worden aan de hand van

het vochtgehalte in het substraat. Hierbij werd een grens van 20 vol% gesteld, waar onder

men kan spreken van ernstige droogtestress. Bij genotype 16 daalde het vochtgehalte van

substraat onder deze grens 10 dagen na inductie van droogte, bij genotype 96 na 8 dagen

en bij R. laevigata na 20 dagen. In vergelijking met de andere onderzochte genotypes duurt

het langer bij R. laevigata tot het vochtgehalte in het substraat 20 vol% nadert. Opname van

water uit een beperkt substraatvolume wordt sterk beïnvloed door de aanwezige bladmassa.

R. laevigata heeft de kleinste biomassa en zal dus eerder een lichte tot matige droogtestress

ondergaan terwijl bij de 2 andere genotypes reeds na 10 dagen een vrij sterke droogtestress

aanwezig is.


De resultaten van de enzymatische respons bij toenemende droogtestress worden

samengevat in Tabel 9 voor de 3 genotypes. Deze worden in onderstaande paragrafen

besproken en gediscussieerd.

Tabel 9: Trend van de antioxidatieve enzymen in de verschillende genotypes bij onderwerping aan droogtestress. SOD: Superoxide dismutase, CAT: Catalase, APX: Ascorbaatperoxidase, POX: Guaiacolperoxidase, 2x: Diploïde vorm, 4x: Tetraploïde vorm. In vergelijking met de controleplanten: + significante toename, - significante afname, = geen significante verandering.

Dagen na droogte

7 14 21

Ge

no

typ

e 1

6

2x SOD (+) CAT(=)

APX(=) POX(+)

SOD (+) CAT(=)

APX(+) POX(=)

SOD (+) CAT(-)

APX(-) POX(-)

4x SOD (+) CAT(+)

APX(+) POX(+)

SOD (+) CAT(=)

APX(=) POX(=)

SOD (+) CAT(=)

APX(=) POX(=)

Ge

no

typ

e 9

6

2x SOD (+)CAT (+)

APX(=) POX(+)

SOD (+) CAT(=)

APX(-) POX(=)

SOD (+) CAT(=)

APX(=)POX(=)

4x SOD (+) CAT(=)

APX(+) POX(+)

SOD (+) CAT(=)

APX(=) POX(-)

SOD (+) CAT(=)

APX(=) POX(+)

Ro

sa

laevig

ata

2x APX(=) POX(=) APX(+) POX(=) APX(=) POX(-)

4x APX(=) POX(=) APX(+) POX(=) APX(=) POX(=)

Het enzym SOD zet superoxide radicalen om tot waterstofperoxide en vormt zo een

eerstelijns verdediging tegen ROS in de cel (Halliwell 2006). De resultaten tonen een

significant verhoogde SOD-activiteit in genotype 16 en 96 bij blootstelling aan droogte,

welke niet gezien werd in de controleplanten. Bovendien bleef de activiteit vrij constant

gedurende het experiment. Dit resultaat is in overeenstemming met andere studies, die

verhoogde SOD-activiteit vermelden in graan (Bakalova 2004), zonnebloem (Gunes et al.

2008) en erwten (Malecka et al. 2001) als antwoord op droogtestress. SOD is gekend

substraat-induceerbaar te zijn waardoor de verhoging in SOD-activiteit vermoedelijk wordt

veroorzaakt door de hogere accumulatie van ROS deeltjes als substraat, wat leidt tot hogere

expressie van genen die coderen voor SOD (Tsang et al. 1991).

Het ontstane waterstofperoxide, als resultaat van de actie van SOD, is toxisch voor de cellen.

Daarom moet het snel omgezet worden door het antioxidatieve systeem tot water en zuurstof

(Guo et al. 2006). Vandaar kan de overexpressie van SOD samengaan met verbeterde H2O2

opruimingsmechanismen zoals CAT en peroxidase enzymactiviteiten (McKersie et al.1999),

aangezien deze de omzetting van H2O2 naar water en O2 katalyseren (Gratão et al. 2005).


De CAT-activiteit bij genotype 16 werd in de diploïde vorm niet significant gewijzigd in het

begin van het droogte experiment tegenover de controleplanten en op het einde van het

experiment werd zelfs een significante vermindering van de CAT-activiteit tegenover de

controleplanten gevonden. Bij de tetraploïde vorm werd bij milde droogtestress een initiële

toename gezien, terwijl de activiteit geen significante verandering toonde ten opzichte van

de controleplanten bij ernstig wordende droogtestress, Dit werd ook gezien in de diploïde

vorm van genotype 96, waar na een initiële toename de activiteit in het verdere verloop van

het experiment niet significant verschilde van de activiteit in de controleplanten. Bij de

tetraploïde vorm werd gedurende het volledige experiment geen significante verandering

gezien tussen de activiteit in droogte- en controleplanten. Algemeen kan besloten worden

dat er een dalende trend werd gezien in de enzymactiviteit van catalase tijdens blootstelling

aan droogte. Er wordt minder catalase aangemaakt in de tijd of het wordt sterk afgebroken.

Dit wordt aanzien als een algemene respons van dit enzym onder abiotische stress (Guo et

al. 2006, Gunes et al. 2008, Liu et al. 2008). De reductie in CAT-activiteit wordt

toegeschreven aan inhibitie van enzymsynthese of veranderingen in de assemblage van de

subunits van het enzym onder droogtestress. Het kan ook geassocieerd worden met

degradatie, veroorzaakt door peroxisomale proteasen.

Lagere CAT-activiteit werd al gezien in correlatie met een hogere peroxidase-activiteit

(Buonaurio et al. 1993). Deze hogere activiteit is belangrijk voor de decompositie van H2O2,

voornamelijk bij CAT-inactivatie.

In genotype 16 nam de POX-activiteit van de droogteplanten in beide ploïdieniveaus 7

dagen na inductie van droogte significant toe onder stresscondities, maar bij verder

vorderende droogtestress nam de activiteit af. Dit verband werd ook waargenomen bij de

diploïde vorm van genotype 96, waar de activiteit eveneens vermindert in de tijd na de

initiële geziene stijging bij milde droogtestress. Bij de tetraploïde vorm werd op het einde van

het experiment nog een stijging van de activiteit waargenomen. De activiteit veranderde in

tetraploïde vorm van Rosa laevigata niet significant tegenover de controleplanten

gedurende de volledige droogtestressperiode, en bij R. laevigata 2x werd na 21 dagen een

daling gezien in de activiteit van de droogteplanten tegenover de controleplanten. De

resultaten tonen aan dat bij roos POX niet zal bijdragen tot detoxificatie van ROS species bij

langdurige droogtestress en de activiteit al snel daalt bij ernstig wordende droogtestress.

Bij genotype 16 toont de enzymactiviteit van APX na inductie van droogte in zowel de

diploïde als tetraploïde planten een stijgende trend. Bij verder gevorderde droogte neemt de

activiteit af. Dit verband werd ook gezien in genotype 96 bij de tetraploïde planten. Bij

genotype 96 2x werd geen stijging in activiteit waargenomen tijdens het experiment. Dit

verloop voor APX werd ook gezien door Sharma en Dubey (2005), waar gevonden werd dat

milde droogtestress leidde tot een hogere chloroplastische APX-activiteit dan in de

controleplanten, maar de activiteit nam af bij een hoger niveau van droogtestress. Bij Rosa

laevigiata werd bij beide ploïdieniveaus wel een niet significante stijgende trend gezien. Dit


doet vermoeden dat bij milde tot matige droogtestress bij Rosa laevigata APX inderdaad

tussenkomt bij detoxificatie van ROS onder droogtestress.

Voor genotypes 16 en 96 kan besloten worden dat SOD het enige enzym is met een

constante hogere activiteit gedurende het volledige droogtestress experiment. De

verdedigingsantwoorden aan droogtestress waren minder merkbaar in POX, CAT en APX.

Het gehalte van deze enzymen neemt vermoedelijk wel toe bij milde stress, maar neemt

vervolgens snel af indien de stress ernstig wordt. Voor het antioxidatieve afweersysteem

blijkt de balans tussen antioxidatieve enzymactiviteiten belangrijk te zijn om te kunnen

omgaan met de beschadigende effecten van ROS. Op-regulatie van de activiteit van één

enzym kan leiden tot reductie van andere antioxidatieve enzymen (Apel en Hirt, 2004), wat

een verklaring kan zijn voor het feit dat enkel de SOD capaciteit constant bleef gedurende

het stressexperiment. De daling van de andere antioxidatieve enzymen kan ook zijn doordat

de plant zich in eerste instantie probeert te verdedigen door hogere expressie van stress-

enzymen, terwijl het bij ver gevorderde droogtestress steeds moelijker is voor de plant om

de enzymen aan te maken en zich te verdedigen tegen de ROS species. Overexpressie van

één component is mogelijks niet voldoende om reactieve zuurstofdeeltjes te verwijderen en

oxidatieve schade te elimineren, terwijl verhoogde expressie van een combinatie van

enzymen getoond heeft de tolerantie te doen toenemen (Aono et al. 1995, Kwon et al. 2002).

Droogtolerantie is de mogelijkheid van de plant om bestand te zijn tegen water tekort door

aanpassingen waardoor het mogelijk is om het normale metabolisme te behouden, zelfs bij

lage water-potentialen (Wood 2005). Droogtetolerantie omvat cel- en weefselspecifieke

fysiologische, biochemische en moleculaire mechanismen. Accumulatie van specifieke

proteïnen en stressmetabolieten, stress gereguleerde genexpressie, afname van snelheid

van fotosynthese en opregeling van antioxidatieve enzymen zijn enkele mechanismen die

droogtetolerante planten gebruiken (Reddy et al. 2004).

De enzymatische respons van genotype 16 en 96 doet geen verschillen in tolerantie voor dit

onderdeel van de stressrespons vermoeden. Aangezien er hoge SOD-activiteit was zal

hierdoor veel H2O2 ontstaan zijn in de planten, welke vervolgens niet werd weggehaald door

peroxidasen of catalase. Het is mogelijk dat andere celcomponenten (ascorbinezuur, proline)

nog bijdragen tot ROS detoxificatie na 21 dagen droogtestress en dat de genotypes hiervoor

verschillen. Er kan geopteerd worden om in de toekomst de hoeveelheid H2O2

spectrofotometrisch te bepalen om zo het resultaat van de hoge waargenomen SOD activiteit

te relateren. Ook kan de analyse van de individuele SOD isozymen belangrijk zijn, omdat dit

helpt om te verstaan hoe stress de verschillende subcellulaire compartimenten treft (Bowler

et al. 1992).


In R. laevigata, waar de droogtestress minder sterk was, werd wel een reactie op

droogtestress gezien in de APX-activiteit, maar eveneens niet in POX-activiteit. Het zou

interessant zijn de bepalingsmethode voor SOD en CAT te optimaliseren voor R. laevigata,

waarna de bepaling van deze enzymen kan zorgen voor meer inzicht in de antioxidatieve

respons en eventuele tolerantiemechanismen.

Een vergelijking van de antioxidatieve capaciteit werd gemaakt in Tabel 10. Een eerste

belangrijke opmerking hierbij is dat niet elk genotype in dezelfde mate droogtestress voelde

tijdens het experiment. Terwijl genotype 16 en 96 sterke droogtestress hadden, vertoonde

R. laevigata matige droogtestress. Uit de tabel wordt duidelijk dat in de tijd verschillende

afweermechanismen tegen ROS deeltjes gebruikt worden door de plant. De hogere activiteit

van APX in R. laevigata tegenover genotype 16 en 96 bevestigt nogmaals dat APX enkel

tussenkomt bij detoxificatie van ROS onder milde tot matige droogtestress.

Om een betekenis te geven aan de waarden van de gemeten activiteit werd het

omzettingsgetal (turnover number) van de enzymen opgezocht. Het omzettingsgetal wordt

gedefinieerd als het maximum aantal substraatmoleculen dat het enzym kan omzetten per

tijdseenheid (Cook en Cleland 2007). Er werden geen waarden gevonden voor het

omzettingsgetal van de enzymen in roos, daarom zal het organisme van herkomst telkens

vermeld worden. Voor SOD werd een minimum waarde van 6000000 min-1 gevonden in Bos

taurus, met als substraat O2-. Voor APX werd een omzettingsgetal van 9600 min-1 gevonden

in Pisum sativum, met als substraat pyrogallol en voor CAT 606000 min-1 in Mycobacterium

tuberculosis met als substraat H2O2 (Schomburg et al. 2007). Er werden geen waarden van

het omzettingsgetal gevonden voor POX.

In roos werden de hoogste activiteitswaarden gemeten in APX, maar dit enzym heeft het

laagste omzettingsgetal. Dit terwijl CAT een schijnbaar lage activiteitswaarde heeft, maar

een hoog omzettingsgetal. Dit doet vermoeden dat Cat, ondanks de afname in activiteit bij

langdurige droogte, nog steeds bijdraagt tot detoxificatie van ROS.

Tabel 10: Een vergelijking van de hoogst gemeten activiteit van elk bepaald antioxidant enzym in de droogteplanten.

Genotype 16 Genotype 96 Rosa laevigata

APX-activiteit

(mmol min-1 mg proteïne-1) 1230,42 1383,27 2100,23

POX-activiteit

(mmol min-1 mg proteïne-1) 51,06 74,84 74,24

CAT-activiteit

(units mg proteïne-1 min-1) 6,15 5,63

SOD-activiteit

(units) 185,89 181,53


Effecten van polyploïdie op de activiteit van stress-enzymen

Het effect van polyploïdie op de activiteit van de antioxidatieve enzymen werd nagegaan in

de controleplanten. Er werd een globaal gemiddelde berekend van de activiteit van elk

enzym in de tijd en zo werd een vergelijking gemaakt tussen diploïd en tetraploïd. Hieruit

werden geen significant verschillende waarden gevonden. Er werd geen algemeen effect

van polyploïdie op de activiteit van de antioxidant enzymen waargenomen bij de

controleplanten. Onder droogtestress werd wel een effect gezien maar dit was afhankelijk

van het genotype en de sterkte van de stress.

Het effect van polyploïdie op verhoging van stresstolerantie is dus soort-afhankelijk,

aangezien wel literatuur werd gevonden waarin polyploïdie een rol speelt in meer

stresstolerantie. In tabak (Nicotiana benthinana) werd een hogere activiteit gezien van de

enzymen SOD, CAT, APX en glutathione reductase (GR) in de octaploïde vorm tegenover

de tetraploïde vorm wanneer droogtestress werd toegepast (Deng et al. 2012). In verband

met stressresistentie wordt gedacht dat polyploïden een gen dosage voordeel hebben over

corresponderende diploïden en dat er een positieve correlatie is tussen verbeteren van de

stressresistentie en verhoging van de antioxidatieve capaciteit van polyploïden tegenover

hun diploïde vorm (Chandra en Dubey 2010, Niwa en Sasaki 2003). Wel kunnen de

gedupliceerde genen eventueel verloren gaan of muteren (Chen 2010, Allario et al. 2011).

Dit gendosage effect werd niet waargenomen in het verrichte onderzoek, alhoewel we een

constitutieve expressie vermoeden omdat deze enzymen ook in niet-gestresseerde planten

actief zijn, leidde dit niet tot hogere translatie. Naast species-afhankelijkheid kan ook het

soort stress een rol spelen in het stressantwoord. Uit het onderzoek van Deng et al. (2012)

bleek namelijk dat de octaploïde tabaksplanten een sterke toename in tolerantie hadden

tegenover tetraploïde planten tegen droogte en nutriëntstress, maar niet tegen stress

veroorzaakt door te veel water.

In de literatuur werden ook nog verschillende species gevonden waarin tetraploïden een

betere stresstolerantie vertoonden, maar waar de enzymatische respons niet werd bepaald.

In Japanse kamperfoelie (Lonicera japonica) toonden de tetraploïde cultivars hogere

resistentie tegen waterstress dan diploïde cultivars en dit werd gezien in gasuitwisseling,

chlorofyl fluorescentie en doordat de metabolieten minder getroffen werden. Ook herstelden

de tetraploïden sneller wanneer er terug werd overgegaan op irrigatie (Li et al. 2009).

Tetraploïde Spathiphyllum wallisii planten toonden meer tolerant te zijn na 15 dagen droogte

dan diploïde planten op basis van de stomatale weerstand, waterpotentiaal van het blad,

relatieve waterinhoud (RWC) en proline-inhoud van de bladeren. Binnen de rozenfamilie

werd in de tetraploïde vorm van pruim (Prunus salicina Lindl.) meer tolerantie aan

droogtestress gezien dan in de diploïde vorm (Pustovoitova et al. 1996).

Hoofdstuk 6: Algemeen Besluit 57

6. ALGEMEEN BESLUIT

Abiotische stress zoals droogte heeft een sterke negatieve impact op de plantaardige

productie. Vanwege de klimaatwijziging zal de landbouw geconfronteerd worden met langere

periodes van droogte tijdens de actieve groeifase van de teelten. Hierdoor wordt in de

plantenveredeling sterk gezocht naar het inbrengen van droogtetolerantie. Er zijn

verschillende manieren waarop een plant zich kan aanpassen aan droogtestress. De focus

van het onderzoek ligt bij de activiteit van antioxidatieve enzymen. Natuurlijk voorkomende

polyploïden kunnen een adaptief voordeel hebben in stressomstandigheden door verhoogde

heterozygotie. Het effect van kunstmatig geïnduceerde polyploïdie in roos op de

antioxidatieve enzymactiviteit werd nagegaan. Hiervoor werden drie verschillende genotypes

onderzocht, namelijk genotype 16, genotype 96 en Rosa laevigata.

Een optimalisatie van de eiwitextractie uit bladmateriaal stelde zich. Om een hogere

eiwitconcentratie te verkrijgen in het extract werd het extractieprotocol aangepast en de

aanwezigheid van proteasen en polyfenolen werd verminderd. Deze hogere

eiwitconcentratie was nodig voor de enzymanalyses. De enzymanalyses bleken verder ook

sterk species afhankelijk te zijn, aangezien de optimalisaties werden uitgevoerd op teststalen

van de kruisingspopulaties (genotype 16 en 96) en sommige methodes niet bleken te werken

in R. laevigata.

Er werd geen algemeen effect van polyploïdie op de activiteit van de antioxidant enzymen

waargenomen. Per genotype werd wel een effect gezien, in genotype 16 werd een significant

lagere POX-activiteit waargenomen in de tetraploïden, en in genotype 96 een significant

hogere SOD-activiteit in de tetraploïden. Bij Rosa laevigiata werd een trend van hogere

enzymatische activiteit in de tetraploïden opgemerkt.

Eveneens werd informatie verkregen over de antioxidatieve enzymatische activiteit onder

droogtestress. Op basis van het vochtgehalte in het substraat kunnen twee situaties

onderscheiden worden. Bij genotype 16 en 96 kan gesproken worden van matige tot ernstige

droogtestress, terwijl de gebruikte condities bij R. laevigata resulteerden in milde tot matige

stress. Er kan besloten worden dat SOD actief is bij sterke droogtestress om O2- te

dismuteren. De verdedigingsantwoorden waren minder merkbaar in POX, CAT en APX. Bij

milde tot matige droogtestress in R. laevigata werd een verhoogde APX activiteit

waargenomen. Dit wijst erop dat in eerste instantie H2O2 enzymatisch geneutraliseerd wordt

door APX maar bij ernstig wordende stress werd minder activiteit waargenomen en

bovendien daalt ook het totaal proteïnegehalte in de bladeren van de plant. De plant zal dan

waarschijnlijk de niet-enzymatische scavenging van H2O2 gebruiken om de negatieve

effecten van ROS te neutraliseren.

Hoofdstuk 6: Algemeen Besluit 58

Er kan besloten worden dat verder onderzoek van droogtetolerantie in roos zich moet

toespitsen op het selecteren van interessante genotypes die kunnen gebruikt worden als

kruisingsouders en niet op het induceren van polyploïdie. Er is ook nood aan verdere kennis

over de verdedigingsmechanismen onder milde, matige en ernstige droogtestress.

Onderzoek van de niet-enzymatisch scavenging zal in de toekomst belangrijk zijn.

Voorgaande metingen hebben al een verhoogde proline concentratie onder droogtestress

aangetoond, waardoor ook de bepaling van polyfenolen en ascorbinezuur nuttig kunnen zijn.

Hoofdstuk 7: Literatuurlijst 59

7. LITERATUURLIJST

Adams, Keith L., and Jonathan F. Wendel 2005 Polyploidy and Genome Evolution in Plants. Current Opinion in Plant Biology 8(2): 135–141. Aebi, H. 1984 Catalase in Vitro. Methods in Enzymology 105: 121–126. Ajay Arora, R. K. Sairam 2002 Oxidative Stress and Antioxidative System in Plants Vol 82(10): 1227–1238. Allario, Thierry, Javier Brumos, Jose Manuel Colmenero-Flores, et al. 2011 Large Changes in Anatomy and Physiology between Diploid Rangpur Lime (Citrus Limonia) and Its Autotetraploid Are Not Associated with Large Changes in Leaf Gene Expression. Journal of Experimental Botany 62(8): 2507–2519. Alscher, Ruth Grene, Neval Erturk, and Lenwood S. Heath 2002 Role of Superoxide Dismutases (SODs) in Controlling Oxidative Stress in Plants. Journal of Experimental Botany 53(372): 1331–1341. Amako, Katsumi, Gong-Xiang Chen, and Kozi Asada 1994 Separate Assays Specific for Ascorbate Peroxidase and Guaiacol Peroxidase and for the Chloroplastic and Cytosolic Isozymes of Ascorbate Peroxidase in Plants. Plant and Cell Physiology 35(3): 497–504. Aono, M., H. Saji, A. Sakamoto, et al. 1995 Paraquat Tolerance of Transgenic Nicotiana Tabacum with Enhanced Activities of Glutathione Reductase and Superoxide Dismutase. Plant & Cell Physiology 36(8): 1687–1691. Apel, Klaus, and Heribert Hirt 2004 Reactive Oxygen Species: Metabolism, Oxidative Stress, and Signal Transduction. Annual Review of Plant Biology 55: 373–399. Araújo, Wagner L., Adriano Nunes-Nesi, Sonia Osorio, et al. N.d. Antisense Inhibition of the Iron-Sulphur Subunit of Succinate Dehydrogenase Enhances Photosynthesis and Growth in Tomato via an Organic Acid–Mediated Effect on Stomatal Aperture. http://www.plantcell.org, accessed December 21, 2014. Aroca, Ricardo 2012 Plant Responses to Drought Stress: From Morphological to Molecular Features. Springer Science & Business Media. Bakalova, S. 1113 Isoenzyme Profiles of Peroxidase Catalase and Superoxide Dismutase as Affected by Dehydration Stress and ABA during Germination of Wheat Seeds. Bulgarian Academy of Sciences Acad. G. Bonchev Street Bulgaria. BULG. J. PLANT PHYSIOL 21(30): 1–2. Balaban, Robert S., Shino Nemoto, and Toren Finkel 2005 Mitochondria, Oxidants, and Aging. Cell 120(4): 483–495.


Bartoli, Carlos Guillermo, Facundo Gómez, Dana Ethel Martínez, and Juan José Guiamet 2004 Mitochondria Are the Main Target for Oxidative Damage in Leaves of Wheat (Triticum Aestivum L.). Journal of Experimental Botany 55(403): 1663–1669. Bewley, Jd, and Km Larsen 1982 Differences in the Responses to Water-Stress of Growing and Non-Growing Regions of Maize Mesocotyls - Protein-Synthesis on Total, Free and Membrane-Bound Polyribosome Fractions. Journal of Experimental Botany 33(134): 406–415. Bhattacharjee, Soumen 2005 Reactive Oxygen Species and Oxidative Burst : Roles in Stress, Senescence and Signal Transduction in Plants. Current Science 89(7): 1113–1121. Bohr, Vilhelm A. 2002 Repair of Oxidative DNA Damage in Nuclear and Mitochondrial DNA, and Some Changes with Aging in Mammalian Cells. Free Radical Biology & Medicine 32(9): 804–812. Bowler, C, M V Montagu, and D Inze 1992 Superoxide Dismutase and Stress Tolerance. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 43(1): 83–116. Bradford, Marion M. 1976 A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Analytical Biochemistry 72(1–2): 248–254. Britt, Anne B 1999 Molecular Genetics of DNA Repair in Higher Plants. Trends in Plant Science 4(1): 20–25. Britto, John A. De, P. Benjamin Jeya Rathna Kumar, D. Herin Sheeba Gracelin, and S. Santhana Jency 2011 Drought Stress and Its Impact on Protein in Three Species of Vitex. http://core.kmi.open.ac.uk/display/17842811, accessed December 20, 2014. Byrne, G. Jelenkovic 1976 Cytological Diploidization in the Cultivated Octoploid Strawberry Fragaria X Ananassa. Canadian Journal of Genetics and Cytology 18(4): 653–659. Cai, Xiaoya, Terri Starman, Genhua Niu, Charles Hall, and Leonardo Lombardini 2012 Response of Selected Garden Roses to Drought Stress. HortScience 47(8): 1050–1055. Caverzan, Andréia, Gisele Passaia, Silvia Barcellos Rosa, et al. 2012 Plant Responses to Stresses: Role of Ascorbate Peroxidase in the Antioxidant Protection. Genetics and Molecular Biology 35(4 (suppl)): 1011–1019. Chance, B., H. Sies, and A. Boveris 1979 Hydroperoxide Metabolism in Mammalian Organs. Physiological Reviews 59(3): 527–605. Chandra, Amaresh, and Archana Dubey 2010 Effect of Ploidy Levels on the Activities of Δ1-Pyrroline-5-Carboxylate Synthetase, Superoxide Dismutase and Peroxidase in Cenchrus Species Grown under Water Stress. Plant Physiology and Biochemistry 48(1): 27–34.


Chen, Z. Jeffrey 2010 Molecular Mechanisms of Polyploidy and Hybrid Vigor. Trends in Plant Science 15(2): 57–71. Cheynier, Véronique 2005 Polyphenols in Foods Are More Complex than Often Thought. The American Journal of Clinical Nutrition 81(1 Suppl): 223S–229S. Cook, Paul F., and W. W. Cleland 2007 Enzyme Kinetics and Mechanism. 1 edition. London ; New York: Garland Science. Costa E Silva, F., A. Shvaleva, J. P. Maroco, et al. 2004 Responses to Water Stress in Two Eucalyptus Globulus Clones Differing in Drought Tolerance. Tree Physiology 24(10): 1165–1172. Dalton, T. P., H. G. Shertzer, and A. Puga 1999 Regulation of Gene Expression by Reactive Oxygen. Annual Review of Pharmacology and Toxicology 39: 67–101. Dasgupta, Juthika, and J. Derek Bewley 1984 Variations in Protein Synthesis in Different Regions of Greening Leaves of Barley Seedlings and Effects of Imposed Water Stress. Journal of Experimental Botany 35(10): 1450–1459. Davies, K. J. 2001 Degradation of Oxidized Proteins by the 20S Proteasome. Biochimie 83(3-4): 301–310. Debener, Thomas, and Serge Gudin 2003 Encyclopedia of Rose Science, Three-Volume Set. Academic Press. Deng, Benliang, Wenchao Du, Changlai Liu, et al. 2012 Antioxidant Response to Drought, Cold and Nutrient Stress in Two Ploidy Levels of Tobacco Plants: Low Resource Requirement Confers Polytolerance in Polyploids? Plant Growth Regulation 66(1): 37–47. Dermen, Haig 1940 Colchicine Polyploidy and Technique. The Botanical Review 6(11): 599–635. Downey, Suzanne L., and Amy F. Iezzoni 2000 Polymorphic DNA Markers in Black Cherry (Prunus Serotina) Are Identified Using Sequences from Sweet Cherry, Peach, and Sour Cherry. Journal of the American Society for Horticultural Science 125(1): 76–80. Dubey, RS, and M Rani 1990 Influence of NaCl Salinity on the Behaviour of Protease, Aminopeptidase and Carboxypeptidase in Rice Seedlings in Relation to Salt Tolerance. Functional Plant Biology 17(2): 215–221. Eeckhaut, Tom G. R., Stefaan P. O. Werbrouck, Leen W. H. Leus, Erik J. Van Bockstaele, and Pierre C. Debergh 2004 Chemically Induced Polyploidization in Spathiphyllum Wallisii Regel through Somatic Embryogenesis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 78(3): 241–246.


Engin, Kaya Nusret 2009 Alpha-Tocopherol: Looking beyond an Antioxidant. Molecular Vision 15: 855–860. Folta, Kevin M., and Susan E. Gardiner 2009 Genetics and Genomics of Rosaceae. Springer Science & Business Media. Foyer, Christine H., and Graham Noctor 2005 Redox Homeostasis and Antioxidant Signaling: A Metabolic Interface between Stress Perception and Physiological Responses. The Plant Cell Online 17(7): 1866–1875. Fridovich, I. 1995 Superoxide Radical and Superoxide Dismutases. Annual Review of Biochemistry 64: 97–112. Garg, N., and G. Manchanda 2009 ROS Generation in Plants: Boon or Bane? Plant Biosystems - An International Journal Dealing with All Aspects of Plant Biology 143(1): 81–96. Ghamsari, Lila, Ezzatollah Keyhani, and Shokoofeh Golkhoo 2007 Kinetics Properties of Guaiacol Peroxidase Activity in Crocus Sativus L. Corm during Rooting. Iranian Biomedical Journal 11(3): 137–146. Ghezzi, Pietro, and Valentina Bonetto 2003 Redox Proteomics: Identification of Oxidatively Modified Proteins. Proteomics 3(7): 1145–1153. Gianfranceschi, L., N. Seglias, R. Tarchini, M. Komjanc, and C. Gessler 1998 Simple Sequence Repeats for the Genetic Analysis of Apple. Theoretical and Applied Genetics 96(8): 1069–1076. Gill, Sarvajeet Singh, and Narendra Tuteja 2010 Reactive Oxygen Species and Antioxidant Machinery in Abiotic Stress Tolerance in Crop Plants. Plant Physiology and Biochemistry: PPB / Société Française de Physiologie Végétale 48(12): 909–930. Grant, Verne 1974 Plant Speciation. New York: Columbia University Press. Gratão, P.L., A. Polle, P.J. Lea, and R.A. Azevedo 2005a Making the Life of Heavy Metal-Stressed Plants a Little Easier. Functional Plant Biology 32(6): 481–494. 2005b Making the Life of Heavy Metal-Stressed Plants a Little Easier. Functional Plant Biology 32(6): 481–494. Grossi, Cédric, Olivier Raymond, and Maurice Jay 1997 Isozyme Polymorphism of Rosa Spp. and Cultivar Identification. Euphytica 98(1-2): 11–19. Gunes, Aydin, David J. Pilbeam, Ali Inal, and Sencan Coban 2008 Influence of Silicon on Sunflower Cultivars under Drought Stress, I: Growth, Antioxidant Mechanisms, and Lipid Peroxidation. Communications in Soil Science and Plant Analysis 39(13-14): 1885–1903.


Guo, Z., W. Ou, S. Lu, and Q. Zhong 2006 Differential Responses of Antioxidative System to Chilling and Drought in Four Rice Cultivars Differing in Sensitivity. Plant Physiology and Biochemistry: PPB / Société Française de Physiologie Végétale 44(11-12): 828–836. Gutteridge, John M. C., and Barry Halliwell 2010 Antioxidants: Molecules, Medicines, and Myths. Biochemical and Biophysical Research Communications 393(4): 561–564. Halliwell, Barry 2006 Reactive Species and Antioxidants. Redox Biology Is a Fundamental Theme of Aerobic Life. Plant Physiology 141(2): 312–322. Halliwell, Barry, and John Gutteridge 2007 Free Radicals in Biology and Medicine. Fourth Edition. Oxford University Press. Hancock, John, Radhika Desikan, Judith Harrison, et al. 2006 Doing the Unexpected: Proteins Involved in Hydrogen Peroxide Perception. Journal of Experimental Botany 57(8): 1711–1718. Hart, M. A., H. Tyson, and R. Bloomberg 1971 Measurement of Activity of Peroxidase Isoenzymes in Flax (Linum Usitatissimum). Canadian Journal of Botany 49(12): 2129–2137. Hegarty, Matthew J., and Simon J. Hiscock 2008 Genomic Clues to the Evolutionary Success of Polyploid Plants. Current Biology: CB 18(10): R435–444. Heikkila, Jj, Jet Papp, Ga Schultz, and Jd Bewley 1984 Induction of Heat-Shock Protein Messenger-Rna in Maize Mesocotyls by Water-Stress, Abscisic-Acid, and Wounding. Plant Physiology 76(1): 270–274. Hess, John L., and Ruth G. Alscher 1993 Antioxidants in Higher Plants /. WE09, CRC press. Hsiao, Theodore C., and Edmundo Acevedo 1974 Plant Responses to Water Deficits, Water-Use Efficiency, and Drought Resistance. Agricultural Meteorology 14(1–2). Plant Modification for More Efficient Water Use: 59–84. Jacobsen, J. V., A. D. Hanson, and P. C. Chandler 1986 Water Stress Enhances Expression of an Alpha-Amylase Gene in Barley Leaves. Plant Physiology 80(2): 350–359. Jaleel, C. A., P. Manivannan, A. Wahid, et al. 2009 Drought stress in plants: A review on morphological characteristics and pigments composition. International Journal of Agriculture and Biology (Pakistan). http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=PK2009000855, accessed October 14, 2014. Jaleel, Cheruth Abdul, Paramasivam Manivannan, Abdul Wahid, et al. 2008 Drought Stress in Plants: A Review on Morphological Characteristics and Pigments Composition.


Jin, Jishi, Ningwei Shan, Nan Ma, Jinhe Bai, and Junping Gao 2006 Regulation of Ascorbate Peroxidase at the Transcript Level Is Involved in Tolerance to Postharvest Water Deficit Stress in the Cut Rose (Rosa Hybrida L.) Cv. Samantha. Postharvest Biology and Technology 40(3): 236–243. Job, Claudette, Loïc Rajjou, Yoann Lovigny, Maya Belghazi, and Dominique Job 2005 Patterns of Protein Oxidation in Arabidopsis Seeds and during Germination. Plant Physiology 138(2): 790–802. Kehr, August E 1996 Woody Plant Polyploidy. http://connection.ebscohost.com/c/articles/9603200129/woody-plant-polyploidy, accessed September 7, 2014. Kermani, M. J., V. Sarasan, A. V. Roberts, et al. 2003 Oryzalin-Induced Chromosome Doubling in Rosa and Its Effect on Plant Morphology and Pollen Viability. Theoretical and Applied Genetics 107(7): 1195–1200. Kim, Cheolmin, Joo-Young Kim, and Jae-Hong Kim 2008 Cytosolic Phospholipase A(2), Lipoxygenase Metabolites, and Reactive Oxygen Species. BMB Reports 41(8): 555–559. Kitamura, Satomi, Masako Akutsu, and Keiichi Okazaki 2009 Mechanism of Action of Nitrous Oxide Gas Applied as a Polyploidizing Agent during Meiosis in Lilies. Sexual Plant Reproduction 22(1): 9–14. Kwon, S. Y., Y. J. Jeong, H. S. Lee, et al. 2002 Enhanced Tolerances of Transgenic Tobacco Plants Expressing Both Superoxide Dismutase and Ascorbate Peroxidase in Chloroplasts against Methyl Viologen-Mediated Oxidative Stress. Plant, Cell & Environment 25(7): 873–882. Van Laere, Katrijn, Soraya C. França, Hein Vansteenkiste, et al. 2011 Influence of Ploidy Level on Morphology, Growth and Drought Susceptibility in Spathiphyllum Wallisii. Acta Physiologiae Plantarum 33(4): 1149–1156. Lamb, Chris, and Richard A. Dixon 1997 THE OXIDATIVE BURST IN PLANT DISEASE RESISTANCE. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 48: 251–275. Larson, Richard A., and Karen A. Marley 2007 Optimized Antioxidants for Biodiesel. Levin, Donald A. 1983 Polyploidy and Novelty in Flowering Plants. American Naturalist - Amer Naturalist 122(1). Liu, Jinrong, Xiaorong Xie, Jianxiong Du, Jixiong Sun, and Xiaomin Bai 2008 Effects of Simultaneous Drought and Heat Stress on Kentucky Bluegrass. Scientia Horticulturae 115(2): 190–195. Li, Wei-Dong, Dilip K. Biswas, Hong Xu, et al. 2009 Photosynthetic Responses to Chromosome Doubling in Relation to Leaf Anatomy in Lonicera Japonica Subjected to Water Stress(36 (9)): 783–792.


Loewenstein, Nancy J., and Stephen G. Pallardy 1998 Drought Tolerance, Xylem Sap Abscisic Acid and Stomatal Conductance during Soil Drying: A Comparison of Young Plants of Four Temperate Deciduous Angiosperms. Tree Physiology 18(7): 421–430. Loprasert, S., P. Vattanaviboon, W. Praituan, S. Chamnongpol, and S. Mongkolsuk 1996 Regulation of the Oxidative Stress Protective Enzymes, Catalase and Superoxide Dismutase in Xanthomonas--a Review. Gene 179(1): 33–37. Maehly, A. C., and B. Chance 1954 The Assay of Catalases and Peroxidases. Methods of Biochemical Analysis 1: 357–424. Malecka, A., W. Jarmuszkiewicz, and B. Tomaszewska 2001 Antioxidative Defense to Lead Stress in Subcellular Compartments of Pea Root Cells. Acta Biochimica Polonica 48(3): 687–698. Marnett, L. J. 1999 Lipid Peroxidation-DNA Damage by Malondialdehyde. Mutation Research 424(1-2): 83–95. McKersie, Bryan D., Stephen R. Bowley, and Kim S. Jones 1999 Winter Survival of Transgenic Alfalfa Overexpressing Superoxide Dismutase. Plant Physiology 119(3): 839–848. Middleton, E., C. Kandaswami, and T. C. Theoharides 2000 The Effects of Plant Flavonoids on Mammalian Cells: Implications for Inflammation, Heart Disease, and Cancer. Pharmacological Reviews 52(4): 673–751. Mittler, Ron, Sandy Vanderauwera, Martin Gollery, and Frank Van Breusegem 2004 Reactive Oxygen Gene Network of Plants. Trends in Plant Science 9(10): 490–498. Montillet, Jean-Luc, Sangpen Chamnongpol, Christine Rusterucci, et al. 2005 Fatty Acid Hydroperoxides and H2O2 in the Execution of Hypersensitive Cell Death in Tobacco Leaves. Plant Physiology 138(3): 1516–1526. Munné-Bosch, Sergi, and Leonor Alegre 2004 Die and Let Live: Leaf Senescence Contributes to Plant Survival under Drought Stress. Functional Plant Biology 31(3): 203–216. Nakano, Yoshiyuki, and Kozi Asada 1981 Hydrogen Peroxide Is Scavenged by Ascorbate-Specific Peroxidase in Spinach Chloroplasts. Plant and Cell Physiology 22(5): 867–880. Navrot, Nicolas, Nicolas Rouhier, Eric Gelhaye, and Jean-Pierre Jacquot 2007 Reactive Oxygen Species Generation and Antioxidant Systems in Plant Mitochondria. Physiologia Plantarum 129(1): 185–195. Niu, Genhua, and Denise S. Rodriguez 2009 Growth and Physiological Responses of Four Rose Rootstocks to Drought Stress. Journal of the American Society for Horticultural Science 134(2): 202–209. Niu, Genhua, Denise S. Rodriguez, and Wayne Mackay 2008 Growth and Physiological Responses to Drought Stress in Four Oleander Clones. Journal of the American Society for Horticultural Science 133(2): 188–196.


Niwa, Yukie, and Yoshinori Sasaki 2003 Plant Self-Defense Mechanisms against Oxidative Injury and Protection of the Forest by Planting Trees of Triploids and Tetraploids. Ecotoxicology and Environmental Safety 55(1): 70–81. Noctor, Graham, Rosine De Paepe, and Christine H. Foyer 2007 Mitochondrial Redox Biology and Homeostasis in Plants. Trends in Plant Science 12(3): 125–134. Nussbaum, Robert, Roderick R. McInnes, and Huntington F. Willard 2007 Thompson & Thompson Genetics in Medicine. Elsevier Health Sciences. Panchuk, Irina I., Roman A. Volkov, and Friedrich Schöffl 2002 Heat Stress- and Heat Shock Transcription Factor-Dependent Expression and Activity of Ascorbate Peroxidase in Arabidopsis. Plant Physiology 129(2): 838–853. Praba, M. L., J. E. Cairns, R. C. Babu, and H. R. Lafitte 2009 Identification of Physiological Traits Underlying Cultivar Differences in Drought Tolerance in Rice and Wheat. Journal of Agronomy and Crop Science 195(1): 30–46. Prisco, José Tarquinio, and Gustavo Hitzschky Fernandes Vieira 1976 Effects of NaCl Salinity on Nitrogenous Compounds and Proteases during Germination of Vigna Sinensis Seeds. Physiologia Plantarum 36(4): 317–320. Pustovoitova, T. N., G. V. Eremin, E. G. Rassvetaeva, N. E. Zhdanova, and V. N. Zholkevich 1996 Drought Resistance, Recovery Capacity, and Phytohormone Content in Polyploid Plum Leaves. Russian Journal of Plant Physiology 43(2): 232–235. Reddy, Attipalli Ramachandra, Kolluru Viswanatha Chaitanya, and Munusamy Vivekanandan 2004 Drought-Induced Responses of Photosynthesis and Antioxidant Metabolism in Higher Plants. Journal of Plant Physiology 161(11): 1189–1202. Del Río, Luis A., F. Javier Corpas, Luisa M. Sandalio, et al. 2002 Reactive Oxygen Species, Antioxidant Systems and Nitric Oxide in Peroxisomes. Journal of Experimental Botany 53(372): 1255–1272. Roger, Manuel J. Reigosa, and Adela M. Sánchez-Moreiras 2001 Determination of Transpiration Using A Steady-State Porometer. In Handbook of Plant Ecophysiology Techniques. Manuel J. Reigosa Roger, ed. Pp. 223–233. Springer Netherlands. http://link.springer.com/chapter/10.1007/0-306-48057-3_16, accessed August 28, 2014. Ross, Deane 1991 The Ross Guide to Rose Growing. Port Melbourne, Vic: Lothian Pub Co. Rout, G. R, S Samantaray, J Mottley, and P Das 1999 Biotechnology of the Rose: A Review of Recent Progress. Scientia Horticulturae 81(3): 201–228. Sadanandom, Arivananthan, Zaruhi Poghosyan, David J. Fairbairn, and Denis J. Murphy 2000 Differential Regulation of Plastidial and Cytosolic Isoforms of Peptide Methionine Sulfoxide Reductase in Arabidopsis. Plant Physiology 123(1): 255–264.


Sarvajeet Singh, NA Anjum 2008 Metal-Binding Peptides and Antioxidant Defense in Plants: Significance in Cadmium Tolerance: 159–189. Schomburg, Dietmar, Antje Chang, and Ida Schomburg 2007 Class 1 Oxidoreductases X: EC 1.9 - 1.13. Springer Science & Business Media. Schrader, Michael, and H. Dariush Fahimi 2004 Mammalian Peroxisomes and Reactive Oxygen Species. Histochemistry and Cell Biology 122(4): 383–393. Sharma, Pallavi, and Rama Shanker Dubey 2005 Modulation of Nitrate Reductase Activity in Rice Seedlings under Aluminium Toxicity and Water Stress: Role of Osmolytes as Enzyme Protectant. Journal of Plant Physiology 162(8): 854–864. Sharma, Pallavi, Ambuj Bhushan Jha, Rama Shanker Dubey, and Mohammad Pessarakli 2012 Reactive Oxygen Species, Oxidative Damage, and Antioxidative Defense Mechanism in Plants under Stressful Conditions. Journal of Botany 2012: e217037. Singh Gill, Sarvajeet, and Narendra Tuteja 2011 Cadmium Stress Tolerance in Crop Plants. Plant Signaling & Behavior 6(2): 215–222. Skórzyńska-Polit, E., and Z. Krupa 2006 Lipid Peroxidation in Cadmium-Treated Phaseolus Coccineus Plants. Archives of Environmental Contamination and Toxicology 50(4): 482–487. Smirnoff, Nicholas 1993 The Role of Active Oxygen in the Response of Plants to Water Deficit and Desiccation. New Phytologist 125(1): 27–58. 1996 BOTANICAL BRIEFING: The Function and Metabolism of Ascorbic Acid in Plants. Annals of Botany 78(6): 661–669. So-Young Yi, Seung-Hun Yu 2003 Involvement of Hydrogen Peroxide in Repression of Catalase in TMV-Infected Resistant Tobacco. Molecules and Cells 15(3): 364–9. Srivalli, B., Geetanjali Sharma, and Renu Khanna-Chopra 2003 Antioxidative Defense System in an Upland Rice Cultivar Subjected to Increasing Intensity of Water Stress Followed by Recovery. Physiologia Plantarum 119(4): 503–512. Stebbins, George Ledyard 1971 Chromosomal Evolution in Higher Plants. Edward Arnold. Talukdar, Dibyendu 2014 Increasing Nuclear Ploidy Enhances the Capability of Antioxidant Defense and Reduces Chromotoxicity in Lathyrus Sativus Roots under Cadmium Stress. TURKISH JOURNAL OF BOTANY 38: 696–712. Tauber, Henry 1953 Oxidation of Pyrogallol to Purpurogallin by Crystalline Catalase. Journal of Biological Chemistry 205(1): 395–400.


Temple, Mark D., Gabriel G. Perrone, and Ian W. Dawes 2005 Complex Cellular Responses to Reactive Oxygen Species. Trends in Cell Biology 15(6): 319–326. Tsang, E. W., C. Bowler, D. Hérouart, et al. 1991 Differential Regulation of Superoxide Dismutases in Plants Exposed to Environmental Stress. The Plant Cell Online 3(8): 783–792. Turrens, Julio F. 2003 Mitochondrial Formation of Reactive Oxygen Species. The Journal of Physiology 552(2): 335–344. Tuteja, Narendra 2007 Mechanisms of High Salinity Tolerance in Plants. Methods in Enzymology 428: 419–438. Tuteja, Narendra, Parvaiz Ahmad, Brahma B. Panda, and Renu Tuteja 2009 Genotoxic Stress in Plants: Shedding Light on DNA Damage, Repair and DNA Repair Helicases. Mutation Research 681(2-3): 134–149. Tuteja, N., M. B. Singh, M. K. Misra, P. L. Bhalla, and R. Tuteja 2001 Molecular Mechanisms of DNA Damage and Repair: Progress in Plants. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 36(4): 337–397. Vaadia, Y. 1976 Plant Hormones and Water Stress. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences 273(927): 513–522. Vella, F 1994 Molecular Biology of the Cell (third Edition): By B Alberts, D Bray, J Lewis, M Raff, K Roberts and J D Watson. Pp 1361. Garland Publishing, New York and London. 1994. Biochemical Education 22(3): 164–164. Vierling, E 1991 The Roles of Heat Shock Proteins in Plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 42(1): 579–620. Vinocur, Basia, and Arie Altman 2005 Recent Advances in Engineering Plant Tolerance to Abiotic Stress: Achievements and Limitations. Current Opinion in Biotechnology 16(2). Plant biotechnology/Food Biotechnology: 123–132. Willekens, H, S Chamnongpol, M Davey, et al. 1997 Catalase Is a Sink for H2O2 and Is Indispensable for Stress Defence in C3 Plants. The EMBO Journal 16(16): 4806–4816. Wiseman, H., and B. Halliwell 1996 Damage to DNA by Reactive Oxygen and Nitrogen Species: Role in Inflammatory Disease and Progression to Cancer. The Biochemical Journal 313 ( Pt 1): 17–29. Wood, Andrew J. 2005 Eco-Physiological Adaptations to Limited Water Enviornments. In Plant Abiotic Stress. tthew A. Jenks and Paul M. Hasegawa, eds. Pp. 1–13. Blackwell Publishing Ltd. http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/9780470988503.ch1/summary, accessed December 21, 2014.


Wood, Zachary A., Ewald Schröder, J. Robin Harris, and Leslie B. Poole 2003 Structure, Mechanism and Regulation of Peroxiredoxins. Trends in Biochemical Sciences 28(1): 32–40. Zarban, Asghar, Fatemeh Taheri, Taiebeh Chahkandi, Gholamreza Sharifzadeh, and Mohsen Khorashadizadeh 2009 Antioxidant and Radical Scavenging Activity of Human Colostrum, Transitional and Mature Milk. Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition 45(2): 150–154.

BIJLAGEN

Bijlage 1: Het protocol van de SOD-activiteit bepaling (Sigma

Aldrich kit).

Bijlage 2: De indeling van de serre

RL 4x

16 2x

16 4x

96 2x

96 4x 96 4x

96 2x 16 4x

16 2x

RL 4x

RL 4x

16 2x

16 4x

96 2x

96 4x 16 2x

16 2x

96 4x

96 2x 16 4x

16 2x

RL 4x

RL 2x

16 2x

16 4x

96 2x

96 4x 16 4x

16 4x

96 4x

96 2x 16 4x

16 2x

RL 2x

RL 2x

16 2x

16 4x

96 2x

96 4x 96 2x

96 2x

96 4x

96 2x 16 4x

16 2x

RL 2x

96 4x

RL 4x

16 2x

16 4x

96 2x 96 4x

96 4x

96 2x

16 4x 16 2x

RL 4x

96 4x

96 4x

RL 4x

16 2x

16 4x

96 2x 96 2x

16 4x 16 2x

RL 4x

96 4x

96 4x

RL 2x

16 2x

16 4x

96 2x 96 2x

16 4x 16 2x

RL 2x

96 4x

96 4x

RL 2x

16 2x

16 4x

96 2x 96 2x

16 4x 16 2x

RL 2x

96 4x

96 2x

96 4x

RL 4x

16 2x

16 4x 16 4x

16 2x RL 4x

96 4x

96 2x

96 2x

96 4x

RL 4x

16 2x

16 4x 16 4x

16 2x RL 4x

96 4x

96 2x

96 2x

96 4x

RL 2x

16 2x

16 4x 16 4x

16 2x RL 2x

96 4x

96 2x

96 2x

96 4x

RL 2x

16 2x

16 4x 16 4x

16 2x RL 2x

96 4x

96 2x

16 4x

96 2x

96 4x

RL 4x

16 2x 16 2x

RL 4x 96 4x

96 2x

16 4x

16 4x

96 2x

96 4x

RL 4x

16 2x 16 2x

RL 4x 96 4x

96 2x

16 4x

16 4x

96 2x

96 4x

RL 2x

16 2x 16 2x

RL 2x 96 4x

96 2x

16 4x

16 4x

96 2x

96 4x

RL 2x

16 2x 16 2x

RL 2x 96 4x

96 2x

16 4x

16 2x

16 4x

96 2x

96 4x

RL 4x

RL 4x

96 4x 96 2x

16 4x

16 2x

16 2x

16 4x

96 2x

96 4x

RL 4x

RL 4x

96 4x 96 2x

16 4x

16 2x

16 2x

16 4x

96 2x

96 X

RL 2x

RL 2x

96 X

96 2x

16 4x

16 2x

16 2x

16 4x

96 2x

96 4x

RL 2x

RL 2x

96 4x 96 2x

16 4x

16 2x

G12 G11

G10 G9 G8 G5 G4 G3 G2 G1

Controle Droogte

Documents

Een studie van de antioxidatieve enzymatische respons bij …lib.ugent.be/fulltxt/RUG01/002/216/834/RUG01-002216834... · 2015-11-08 · enzymen zoals SOD, CAT, APX en POX werd nagegaan