Entwicklung von Bioreaktoren zur Kultivierung von Mikroalgen

ZfP-Sonderpreis der DGZfP beim Regionalwettbewerb Jugend forscht

INGOLSTADT

Jugend forscht 2015

Moritz Hamberger

Schule:

Katharinen-GymnasiumIngolstadt

Entwicklung von Bioreaktoren zur Kultivierung

von Mikroalgen

Moritz Hamberger

Katharinen-Gymnasium Ingolstadt

Klasse 8a

Inhaltsverzeichnis:

I Tabellenverzeichnis 3

II Abbildungsverzeichnis 3

III Zusammenfassung 4

IV Quellenverzeichnis 4

V Danksagung

1 Einleitung und Zielsetzung der Arbeit 5

2 Versuchsdurchführungen 6

2.1 KMK 6 2.1.1 Reaktoraufbau 6 2.1.2 Anlagentechnik 6 2.1.3 Ernährung 6 2.1.4 Ergebnis 6

2.2 Open Pond 7 2.1.1 Reaktoraufbau 7 2.1.2 Anlagentechnik 7 2.1.3 Ernährung 7 2.1.4 Ergebnis 8

2.3 BAR 8 2.1.2 Anlagentechnik 8 2.1.3 Ernährung 9 2.1.4 Ergebnis 10

2.4 FPR 10 2.1.1 Reaktoraufbau 10 2.1.2 Anlagentechnik 11 2.1.3 Ernährung 12 2.1.4 Ergebnis 14

2.5 FPR 2.0 15 2.1.1 Reaktoraufbau 15 2.1.2 Anlagentechnik 16 2.1.3 Ernährung 17 2.1.4 Ergebnis 18

3 Ausblick 18

Seite - 2 -

I Tabellenverzeichnis:

Tabelle 1: Zusammensetzung der DSN-Teillösung A 9 Tabelle 2: Zusammensetzung der DSN-Teillösung B 9 Tabelle 3: Zusammensetzung der met-DS-A-Spurenelementlösung 9 Tabelle 4: Zusammensetzung der met-DS-B-Lösung 9 Tabelle 5: Ergebnisse der BTM-Proben 13

II Abbildungsverzeichnis:

Abbildung 1: KMK mit Fischertechnik Luftkompressor 6 Abbildung 2: Goldfischglas als "Open Pond" mit Belüftung und Beleuchtung 7 Abbildung 3: BAR-Anlage mit vorbereiteten Nährlösungen 9 Abbildung 4: BAR-Anlage nach dem Urlaub 10 Abbildung 5: Fertiger FPR mit Pumpe und Schläuchen ohne Beleuchtung 10 Abbildung 6: FPR mit Beleuchtungseinheit auf der Vorderseite 11 Abbildung 7: Schematischer Aufbau der vollständigen FPR-Anlage 12 Abbildung 8: BTM-Proben im Trockenschrank 13 Abbildung 9: Mikoskopaufnahme von Algen mit Lipidtröpfchen 14 Abbildung 10: Beide FPRs, links mit „gekippter“, rechts mit gesunder Algenkultur 14 Abbildung 11: Sägen der Stegplatte an der Tischkreissäge 15 Abbildung 12: Strömungsversuch am realen Reaktor 16 Abbildung 13: Schematische Seitenansicht des Reaktoraufbaus 16 Abbildung 14: Leerer Reaktor mit Stützkonstruktion und Beleuchtung 16 Abbildung 15: Farbpalette 17 Abbildung 16: Schematische Darstellung der Anlagentechnik der FPR 2.0 18 Abbildung 17: FPR 2.0 im Testbetrieb mit Fluorescein gefärbtem Wasser 18

Seite - 3 -

III Zusammenfassung:

Seit etwa zwei Jahren forsche ich an der Kultivierung von Mikroalgen, einem potenziellen Energieträger der Zukunft. Dafür werden Mikroalgen gezüchtet und deren Lipide genutzt und z.B. zu Biodiesel weiterverarbeitet. Im Rahmen der Versuchsdurchführung wurden verschiedene Bioreaktoren aufgebaut und in ihren Eigenschaften von Versuch zu Versuch verbessert. Die Kultivierung von Teichalgen erfolgte anfangs in der KMK (eine Zuchtanlage mit Fischertechnik Luft-Kompressor). Dann verwendete ich den Open Pond, um höhere Biomasseerträge in kürzerer Zeit zu bekommen. Da beide Kultivierungsverfahren nicht effektiv genug waren, suchte ich mir Rat beim Fraunhofer Institut IGB in Stuttgart. Mir wurde zur Verwendung einer Algen-Reinkultur geraten. Als ich nun Algen (Chlorella vulgaris) bekommen hatte, kultivierte ich diese in einem Bottle-Airlift-Reaktor (kurz BAR). Nachdem die Ergebnisse wiederum nicht sehr zufriedenstellend waren, baute ich meinen eigenen Flat-Panel-Reaktor, mit dem Ziel durch einen flacheren Reaktor eine höhere Photosyntheserate zu erhalten. Chlorella vulgaris wird in einem speziellen DNS-Medium kultiviert. Außerdem wird sie wöchentlich mit einer Ammonium-, Phosphat- und Eisenlösung "gefüttert" sowie täglich mit CO2 angereichert, was zu einem verbesserten Wachstum führt. Die gewünschte Lipidbildung wird durch die Limitierung der N- und P-Nährsalzlösungen hervorgerufen. In der aktuell laufenden Experimentierstufe wurde erneut ein neuer Reaktor mit deutlich vergrößertem Volumen gebaut und mit moderner Mess- und Regeltechnik ausgestattet. Diese Zusatztechnik erlaubt einen vollautonomen Betrieb der Anlage, da neben der automatisierten Nährsalz- und CO2-Zufuhr auch der pH-Wert geregelt wird. Die vorhandene Temperaturmessung würde in einem weiteren Aufbauschritt auch eine Temperaturregelung der Algenkultur ermöglichen. IV Quellenverzeichnis:

Bachelorarbeit im Studiengang Verfahrenstechnik an der Universität Stuttgart von Achim Werner

http://de.wikipedia.org/wiki/Lux_(Einheit) http://up.picr.de/7753380fui.jpg

V Danksagung:

In erster Linie möchte ich mich bei Frau Dipl.-Ing. Ronja Münkel des IGB bedanken, ohne deren Hilfe ich meine Forschung nicht hätte weiterführen könnte.

Des Weiteren danke ich dem Katharinen-Gymnasium und Herrn Dr. Kammermayer für die Bereitstellung der Mittel, insbesondere aber meinem Betreuungslehrer Herrn Starck, der mich bei meinem Projekt sehr unterstützt und immer ein offenes Ohr für Fragen und neue Ideen hat.

Auch meiner Familie danke ich herzlich für die Unterstützung meines Projekts, vor allem meinem Vater, der die kniffligen Arbeiten an der Tischkreissäge für mich erledigte.

Seite - 4 -

1 Einleitung und Zielsetzung der Arbeit Motivation meiner Forschung ist der zukünftig notwendige, verstärkte Einsatz nachwachsender Rohstoffe. Fossile Rohstoffe wie z.B. Erdöl, Erdgas sind endlich und erzeugen bei ihrem Einsatz große Mengen an Treibhausgasen. Besonders positiv an nachwachsenden Energieträgern ist, dass sie CO2-neutral sind, d.h. bei der Nutzung wird nicht mehr CO2 freigesetzt als in der Wachstumsphase gebunden wurde.

Heute bereits gebräuchliche Alternativen sind Biodiesel, Biogas oder z.B. auch Palmöl. Alle diese Verfahren verwenden Kulturpflanzen (z.B. Zuckerrüben, Mais) auf intensiv bewirtschafteten Ackerflächen. Diese stehen so nicht mehr der Nahrungserzeugung zur Verfügung. Zur Gewinnung von Palmöl wird oft sogar Urwald gerodet, nur um noch mehr Fläche dafür zu haben, wobei hohe Mengen an Treibhausgasen freigesetzt werden.

Auf der Suche nach umweltverträglicheren Alternativen hat bei mir die Züchtung von Algen besonderes Interesse geweckt. Neben der Erzeugung von Inhaltsstoffen (Lipide), die sich zur Weiterverarbeitung zu Treibstoff eignen, hat mich besonders fasziniert, dass zur Kultivierung keine Ackerflächen benutzt werden müssen. Algen können in dafür gebauten Zuchtanlagen überall wachsen, auf Dächern von Industriegebäuden, an deren Fassaden, in der Wüste oder auch im Meer.

Ziel meiner Arbeit ist es, die Kultivierung von Algen zu erforschen, um mehr über die nachhaltige Erzeugung nachwachsender Rohstoffe zu erfahren und um mir ein Bild über die zukünftigen Chancen und Risiken der Algenzucht zu verschaffen.

Vorteile der Algenkultivierung:

Die Kultivierung von Algen bietet zahlreiche Vorteile. Diese lassen sich in folgende zwei Gesichtspunkte einteilen (Bachelorarbeit im Studiengang Verfahrenstechnik an der Universität Stuttgart von Achim Werner):

Vorteile der Algenkultivierung im Vergleich zu Land- und Kulturpflanzen

Die flächenbezogene Lipidproduktivität ist deutlich höher als bei pflanzlichen Ölquellen (z.B. Raps...).

Algen besitzen eine 5-10 mal höhere Biomasseproduktivität. Sie benötigen deutlich weniger Wasser als Kulturpflanzen. Pestizide oder Herbizide sind nicht notwendig. Landwirtschaftlich nutzbare Flächen werden nicht benötigt. Biochemische Zusammensetzungen können durch Veränderung der Kultivierungs-

bedingungen gezielt beeinflusst werden. Algenbiomasse ist homogen und frei von Lignocellulose.

Aspekte für eine nachhaltige Kultivierung

Algen können in Abwässern wachsen und diese reinigen, sie können aber auch CO2 aus Abgasen nutzen und diese reinigen.

Restbiomasse kann zu Biogas vergoren oder als Dünger verwendet werden. Marine Mikroalgen sind in Meerwasser kultivierbar. Eine Nettoenergieproduktion ist möglich.

Seite - 5 -

2 Versuchsdurchführungen

2.1 KMK

2.1.1 Reaktoraufbau

Der erste Reaktor trug den Namen "KMK" (Kompakt Mikroalgen Kultivierungsanlage) und bestand aus einer 1.25L PET-Flasche, die mit algenreichem Teichwasser gefüllt war. An diese war ein selbst gebauter Kompressor des Fischertechnik Pneumatikbaukastens angeschlossen (siehe Abbildung 1).

2.1.2 Anlagentechnik

Dieser Kompressor bestand aus einem 9V-Netzteil, einem Schalter, einem Motor, einer Übertragungswelle, einem Zylinder, einem Rückstauventil und einem Schlauch, der in die Flasche ragte. Dieser Schlauch war durch ein Loch im Schraubdeckel der Flasche befestigt. Ein weiteres Loch im Deckel sorgte dafür, dass der Druck aus der Flasche entweichen konnte. Außerdem diente ein PC-Lüfter als Kühler für den Motor. Die beiden Teile des Netzteil-gehäuses eines PCs fungierten einerseits als Halterung der PET-Flasche, andererseits als Gehäuse des Kompressors.

2.1.3 Ernährung

Als „Futter“ dienten die im Teichwasser natürlich gelösten Nährsalze. Wie bekannt benötigt jede Pflanze CO2 für ihren Stoffwechsel. Darum wurde Außenluft, die in geringen Mengen CO2 enthält, in die PET-Flasche gepumpt.

2.1.4 Ergebnis

Eine nur geringe Biomassezunahme in der KMK ließ darauf schließen, dass zu wenige Nährstoffe im Teichwasser enthalten waren oder zu wenig Licht verfügbar war. Des Weiteren setzte sich ein Großteil der Algen am Flaschenboden ab. Zuletzt überlasteten einige Netzteile in kurzer Zeit, sodass ich in Zukunft auf eine stabilere Belüftungstechnik zurückgreifen musste.

Diese Ergebnisse führten dazu, dass ich den Versuch beendete und erneut unter besseren Rahmenbedingungen startete.

Abbildung 1: KMK mit Fischertechnik Luftkompressor

Seite - 6 -

2.2 Open Pond

Im neuen Versuch wurden verschiedene Verbesserungen eingeführt: Es wurde ein Goldfischglas verwendet, da dieses mehr Fassungsvermögen besaß als die KMK und somit mehr Biomasse erzeugt werden konnte. Außerdem bin ich auf eine Aquarienluftpumpe (Europet Bernina Hi-Tech air 1400cc) umgestiegen, die für den Dauerbetrieb ausgelegt war. Am Ende des Schlauches ist ein Ausströmer (Eheim) angeschlossen worden, der mit einem Saugnapf am Boden des Glases befestigt wurde. Des Weiteren wurde eine Beleuchtungseinheit, die Tag und Nacht leuchtete, installiert.

2.2.1 Reaktoraufbau

Der Reaktor wurde „Open Pond“ genannt, weil diese Form von Bioreaktoren „offen“ ist. Diese Open Ponds werden derzeit vor allem zur Kultivierung von Mikroalgen genutzt, da diese „Becken“ im Vergleich zur Kultivierung im geschlossenen Reaktor deutlich billiger sind. Wie oben beschrieben diente ein Goldfischglas mit etwa 13L Fassungsvermögen als Kultivierungsort der Teichalgen (siehe Abbildung 2).

2.2.2 Anlagentechnik

Die Aquarienpumpe sorgte erstens für mehr gelöstes CO2, da mehr Luft in die Kultur gelangte als bei der KMK und zweitens für mehr Zirkulation, da die Luft unten im Glas durch einen Ausströmer entwich. Diese Zirkulation in der Kultur verhinderte das Absetzen der Algen und größere Mengen von CO2 konnten in der Kultur gelöst werden. Des Weiteren war die Lichtversorgung der Algen und somit die Energie-versorgung für die Photo-synthese gewährleistet (Tag und Nacht). Der Spiegel, an

dem die Leuchtstoffröhre angebracht war, sorgte für die Reflexion der Lichtstrahlen aus anderen Richtungen und steigerte die Lichtausbeute. Betrieben wurde die Anlage auf meinem Balkon. Damit Regen in der Elektrik keine Schäden anrichten konnte, wurde für die Steckerleiste mit den Netzteilen und der Aquarienpumpe eine wasserdichte Box aus einem Zinkrohr und zwei mit Silikon angeklebten und abgedichteten Platten gebaut.

2.2.3 Ernährung

Wie bei der KMK wird die Alge „nur“ mit dem in der Luft vorhandenen CO2 versorgt und den im Teichwasser gelösten Nährsalzen.

Abbildung 2: Goldfischglas als "Open Pond" mit Belüftung, Beleuchtung und einer wasserdichten Elektrik-Box

Seite - 7 -

2.2.4 Ergebnis

Nach einiger Zeit der Kultivierung mit gutem Wachstum, musste ich feststellen, dass die Biomassekonzentration nicht mehr weiter zunahm. Bei der Untersuchung der Kultur unter dem Mikroskop fand ich neben den Algen noch sehr viele weitere Einzeller im Becken wie Pantoffel- (Paramecien), Glockentierchen usw., die wahrscheinlich das weitere Wachstum der Algen verhinderten.

2.3 BAR

Ich erkundigte mich im Internet über Institute, die an lipidreichen (fettreichen) Mikroalgen forschen. Dabei bin ich auf das Stuttgarter Fraunhofer-Institut für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechniken gestoßen. Dieses zeigte sich als sehr kooperativ. Wenige Wochen nach dem Erstkontakt begleitete mich mein Betreuungslehrer Herr Starck nach Stuttgart, um eine Reinkutur von Chlorella vulgaris (500ml, 2g/L Biomasse) abzuholen. Frau Dipl.- Ing. Ronja Münkel (vom Fraunhofer-Institut) gab uns den Tipp diese in PET-Flaschen zu züchten, da diese Kultivierung günstig und einfach aufzubauen ist. Außerdem bekam ich Sterilfilter, damit die Kontamination durch Bakterien aus der Umgebungsluft vermieden wird. Frau Münkel erklärte mir, dass sich das geringe Algenwachstum im Open Pond auch auf eine zu geringe Nährsalzkonzentration des Teichwassers zurückführen lässt. Vom Institut bekam ich zwei Bachelorarbeiten mit Informationen über Nährsalzlösungen und ein erforschtes Nährmedium.

Chlorella vulgaris: Die Mikroalgen der Gattung Chlorella gehören zur Gruppe der Grünalgen (Chlorophyta). Aufgrund ihres schnellen Wachstums und der vergleichsweise "einfachen" Kultivierung bergen sie ein großes Potential im Hinblick auf die Biodieselproduktion. Eine Kultur besteht aus einzelnen, nicht beweglichen Zellen. Sie sind 5-10 µm groß und besitzen eine kugelförmige Gestalt. Die Fortpflanzung erfolgt über Autosporen. (Bachelorarbeit im Studiengang Verfahrenstechnik an der Universität Stuttgart von Achim Werner)

2.3.1 Anlagentechnik

Erneut wurden PET Flaschen (BAR/Bottle Airlift Reaktor genannt) verwendet, weil ich damit die Kultur am einfachsten von unerwünschten Umwelteinflüssen fernhalten konnte. Die Flaschen wurden anfangs desinfiziert, um Kontamination der Algen mit Bakterien zu verhindern. Danach bohrte ich jeweils zwei Löcher (etwa 6 mm) in den Flaschendeckel. In einem der beiden Löcher wurde der Zuluft-, im anderen Loch der Abluftschlauch befestigt. Beide Löcher wurden mit Silikon abgedichtet. Am Zuluftschlauch war am Ende ein Ausströmer befestigt, der die Luft gleichmäßig verteilte. Der Schlauch mit dem Ausströmer kam in die Flasche und am anderen Ende war ein Filter angeschlossen. Dem Filter folgte ein Adapter, an welchem ein weiteres Stück Schlauch befestigt war. Dieses war wiederum an eine Aquarienpumpe angesteckt. An den Abluftschlauch wurde ein Sterilfilter (0,2µm Porengröße) angeschlossen, der dafür sorgte, dass keine Bakterien oder Viren über die Abluft in die Kultur gelangen konnten. Die kleine Flasche (0,5 L) wurde an eine Aquarienpumpe mit 80 L/h Födermenge (europet bernina Hi-Tech Membranpumpe) angeschlossen. Die beiden großen Flaschen wurden mit einer 240 L/h fördernden Pumpe (Oase AquaOxy 240) versorgt. Beleuchtet wurden die BAR mit dem bereits im letzten Experiment verwendeten Beleuchtungseinheit.

Seite - 8 -

2.3.2 Ernährung

Im Gegensatz zum bisherigen Teichwasser setzte ich nun zur Züchtung der Algen die Lösungen nach den Vorgaben aus Tabelle 1-4 (siehe Seite 8) für das Medium an und gab es in die "Bottle-Airlift-Reaktoren" (BAR). Die großen Reaktoren wurden mit 200 ml Algen angeimpft, der kleinere nur mit 100 ml. Anschließend wurde die Ammonium- und die Phosphatlösung angesetzt. Diese Lösungen dienen als Nährsalze für Chlorella vulgaris. Zusätzlich wurden die BAR's wöchentlich mit einer Eisen(III)-Chlorid- (siehe met DS-B), Ammonium- (8,6 ml/L) und Phosphatlösung (2,9 ml/L) "gefüttert" (Angaben des Fraunhofer IGBs in Stuttgart). Dies geschah mit einem desinfizierten Messzylinder. Der pH Wert lag nahezu konstant bei 8.

Tabelle 1: Zusammensetzung der DSN-Teillösung A Komponente Konzentration Tropic Marin (Meersalz) met-DS-A (Spurenelementlösung) MgSO4*7H2O CaCl2

H2O

3,5 g/L 40 ml/L 2,46 g/L 0,56 g/L ad 1L

Tabelle 2: Zusammensetzung der DSN-Teillösung B Komponente Konzentration met-DS-B-Lösung 40 ml/L

Tabelle 3: Zusammensetzung der met-DS-A-Spurenelementlösung Komponente Konzentration MnCl2*4H2O ZnSO4*7H2O CoSO4*7H2O Na2MoO4*2H2O CuSO4*5H2O H2O

20 mg/L 5 mg/L 5mg/L 5mg/L 0,5 mg/L ad 1L

Tabelle 4: Zusammensetzung der met-DS-B-Lösung Komponente Konzentration FeCl3*6H2O H2O

0,4 g/L ad 1L

Abbildung 3: BAR-Anlage mit vorbereiteten Nährlösungen Seite - 9 -

2.3.3 Ergebnis

Nachdem ich mich einige Wochen durch die gute Versorgung mit den richtigen Nährsalzen über ein sehr ordentliches Wachstum meiner Algen freuen konnte, war die Enttäuschung nach einem 10-tägigen Familienurlaub umso größer. Die linke Kultur schimmelte aus unbekannten Gründen und nahm eine bräunliche Farbe an (siehe Abb. 4). Im BAR daneben sanken die Algen ab und verklumpten. Die Farbe des Mediums veränderte sich von einem satten Grün zu einem trüben Grün. Die trübe Färbung der beiden anderen Bottle-Airlift-Reaktoren ließ sich auf eine Zelllyse der Algen zurückführen, der eine drastische Ver-mehrung assoziierter Bakterien folgte. Somit waren alle meine drei Reaktoren „gekippt“ bzw. mit Bakterien befallen.

2.4 FPR

Nach der Zusage, dass ich vom IGB erneut Algen erhalten würde, machte ich mich ans Bauen eines eigenen Flat-Panel-Reaktors (FPR) aus Plexiglas. Mein Ziel war es durch eine flachere Reaktorform und durch eine verbesserte Beleuchtungstechnik eine höhere Lichtintensität innerhalb der Kultur zu erreichen und dadurch das Algenwachstum zu beschleunigen und somit die Algen widerstandsfähiger gegen Bakterienbefall zu machen. Die verwendeten Sterilfilter werden nicht mehr eingesetzt, da diese zu leicht verstopfen und trotzdem Befall mit Pilzen oder Bakterien auftrat. 2.4.1 Reaktoraufbau

Der Reaktor besteht aus 5mm starken Plexiglasteilen mit folgenden Maßen: 2 Frontscheiben a 32cm x 30cm, 2 Seiten-scheiben a 32cm x 3,5cm, einem Deckel mit 32cm x 4,5cm und einer Bodenplatte mit 37cm x 12cm. Die Einzelteile wurden mit einem speziellen lichtaushärtenden Plexiglaskleber (Acrifix 1R 0192) wasserdicht verklebt. Als Hilfsmittel, um einen möglichst geraden Aufbau zu erhalten, diente ein Anschlagwinkel, der an die erste zu klebende Wand gelehnt wurde. Damit Winkel und Plexiglasplatte in einer stabilen Position blieben, wurde der Eisenwinkel durch Magnete auf der Gegenseite der Platte fixiert. Nach einiger Zeit

der Aushärtung wurden nach und nach die anderen Platten angefügt. In die Deckplatte wurden mit einem Forstnerbohrer (25mm) die

Abbildung 4: BAR-Anlage nach dem Urlaub

Abbildung 5: Fertiger FPR mit Pumpe und Schläuchen ohne Beleuchtung

Seite - 10 -

Löcher für die Silikonstopfen gebohrt. Wichtig hierbei war die Positionierung der Löcher ganz an der Reaktorwand, um ein restloses Entleeeren des Reaktor zu ermöglichen. Daraufhin wurde der Deckel mittig auf die Reaktoroberseite geklebt.

2.4.2 Anlagentechnik

Bau der LED-Beleuchtungseinheit: Zur Intensivierung der Beleuchtung wurde die bisherige Leuchtstoffröhre durch eine neue Beleuchtungseinheit ersetzt Diese wurde wie der Reaktor aus Plexiglas gebaut und bestand aus 3cm breiten Streifen. Es war ein 25cm weites, nach unten offenes U-förmiges Gestell. An dessen Enden wurde jeweils ein diagonales Plexiglasstück angebracht. Diese Plexiglasteile wurden jeweils spiegelverkehrt an das Gestell geklebt. In diesen Streifen befanden sich zwei rechteckige Aussparungen in denen die LED-Leuchten befestigt wurden. Als Stromversorgung diente ein elektronischer 12V Trafo und die Verkabelung erfolgte mit Kupferdraht und Lüsterklemmen (siehe Abb. 6). Die vier verbauten LED-Leuchten hatten einen Lichtstrom von je 260 Lumen. Addiert man die Werte der vier Lampen und teilt das Ergebnis durch die beleuchtete Algenfläche (0,32m x 0,27m), erhält man eine Beleuchtungsstärke von ca. 12.000 Lux. 10.000 Lux entsprechen der Helligkeit in einem OP-Saal bzw. im Schatten bei Sonnenschein.

Formel 1: 𝐄𝐄 = 𝚽𝚽𝐀𝐀

E: Beleuchtungsstärke [lx] Φ: Lichtstrom [lm] A: Fläche [m²]

Weitere Teile des Kultivierungsreaktors: Luftpumpe (Eheim air pump 400, Oase AquaOxy 240) 2 Ausströmer (Aquarienartikel) Silikonschläuche Silikonstopfen (mit 2 Bohrungen) T-Stück (Luer Lock System) männliche/ weibliche Adapter (Luer Lock System) Waschflasche (später ergänzt) Erlenmeyerkolben

Instandsetzung und genauer Aufbau des Reaktors: Zuerst wurden die beiden Ausströmer an den Silikonschläuchen angeschlossen und später so auf dem Reaktorboden angeordnet, dass eine gleichmäßige Zirkulation des Mediums erzeugt und damit ein Absetzen der Algen verhindert wurde. Mit einer Pinzette wurden die

Abbildung 6: FPR mit Beleuchtungseinheit auf der Vorderseite

Seite - 11 -

Schläuche durch die Löcher in den Silikonstopfen gezogen. Zwei Bohrungen wurden für die Zuluftschläuche benötigt, eine weitere diente als Durchführung für den Abluftschlauch, der in einen mit Desinfektionsmittel (Helipur) gefüllten Erlenmayerkolben führte. Dies war nötig, um eine Infektion der Kultur über den Abluftschlauch zu vermeiden. Die übrige Bohrung wurde mit einem kleinen Silikonstopfen abgedichtet. Später wurde der Erlenmayerkolben durch eine vorgeschaltete Waschflasche mit Desinfektionsmittel ergänzt. So konnte übergelaufenes Material ohne Öffnung des sterilen Kreislaufes entsorgt werden. Um von Anfang an einen Bakterienbefall weitestgehend auszuschließen, wurden alle Teile der Apparatur in einem Schnellkochtopf sterilisiert. Als Nächstes wurde der Reaktor mit einem Gemisch von 98% Wasser und 2% Desinfektionsmittel (Helipur, Krankenhausbedarf) desinfiziert. Als letztes wurde der FPR dreimal mit bidestilliertem Wasser durchgespült, um das restliche Helipur zu entfernen. Anschließend wurden das DSN Medium (für 1,5L) und die Nährsalzlösungen angesetzt (siehe Tabelle 1-4, Seite 8) und im Reaktor vereinigt. Die dafür benötigten Kolben wurden mit dem gleichen Verfahren sterilisiert. Zum Schluss wurden 500ml Algen in den Reaktor gefüllt.

2.4.3 Ernährung

Um optimale Wachstumsbedingungen durch eine richtige Ernährung der Algen zu gewährleisten, wurden folgende Nährsalzlösungen angesetzt: Eisen(III)-Chlorid- (siehe met DS-B, 0,5 ml/L), Ammonium- (8,6 ml/L) und Phosphatlösung (2,9 ml/L). Mit sterilen Spritzen wurden diese wöchentlich an die Algenkultur „verfüttert". Um den stets etwas zu hohen pH-Wert zu minimieren, wurde die Eisen(III)-Chlorid- durch eine Eisen(III)-Citrat-Lösung ersetzt. Außerdem wurde die Kultur täglich (Montag-Freitag) in der Schulpause um 11:15 Uhr mit CO2 angereichert. Dieser Vorgang erhielt den Namen „Duschen". Dies geschah, indem der Schlauch zwischen T-Stück und Pumpe abgestöpselt und mit einer „Olive" an die „CO2-Kartusche" angeschlossen wurde. Dann wurde der Haupthahn der Kartusche auf und gleich wieder zugeschraubt, nachdem das Nadelventil auf etwa 1 Bar eingestellt wurde. Daraufhin musste nur noch das Drehventil geöffnet werden und nur die im Druckminderer enthaltene Menge Gas strömte durch die Algenkultur.

Abbildung 7: Schematischer Aufbau der vollständigen FPR-Anlage

Seite - 12 -

Wöchentlich wurde dann die Kultur auf Kontaminationen und auf den Zustand der Algen unter dem Mikroskop (bei 1000-facher Vergrößerung ) untersucht. Der pH-Wert wurde mittels einer Sonde bestimmt. Dafür wurde eine Probe von etwa 10 ml aus der Kultur genommen. Dieser Wert lag bei etwa 7,5 und blieb fast konstant. Vor den Ferien wurde noch der zweite FPR 1.0 mit Medium angeimpft und wie der andere Reaktor „gefüttert". In den Ferien konnten ich die Algen nur wöchentlich „duschen“, was man beim pH-Wert feststellen konnte, denn dieser stieg dann auf Werte von 8,0-8,13. Nach den Ferien, als die Kultur wieder täglich mit CO2 angereichert wurde, stabilisierte sich dieser Wert bei etwa 7,6. Beide FPRs hatten in etwa die gleiche Dichte und nahmen nicht mehr an BTM (Biotrockenmassekonzentration) zu. Als Nächstes wurde nun eine N- und P-Limitierung vorgenommen, d.h.: die Eisen(III)-Citratlösung wurde weiter der Kultur hinzugegeben, die Ammonium- und die Phosphatlösung aber bewusst weggelassen. Dieser Zustand der Nährsalzunterversorgung startete nun den beabsichtigten Vorgang der vermehrten Produktion von Lipiden - dem Ausgangsstoff für die Biodieselerzeugung.

Bestimmung der Biotrockenmassekonzentration: Zur Bestimmung der Biotrockenmasse-konzentration (BTM) benötigt man Proben a' 10 ml. Diese wurden in exakt gewogene Well Plates gegeben. Diese Proben wurden zuvor mit bidestilliertem Wasser gewaschen, um Mediumsrückstände zu entfernen, die das Ergebnis verfälschen würden. Anschließend wurden diese bei etwa 105°C im Trockenschrank getrocknet und erneut gewogen. Daraufhin wurde die BTM mit Formel 2 berechnet.

Formel 2: 𝐁𝐁𝐁𝐁𝐁𝐁 = (𝐦𝐦𝐖𝐖𝐖𝐖,𝟏𝟏 −𝐦𝐦𝐖𝐖𝐖𝐖,𝟐𝟐)𝐱𝐱 𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝐕𝐕𝐖𝐖

BTM: Biotrockenmassekonzentation [g/L] mWp, 1: Masse der Well Plates nach dem Trocknen [g] mWp, 2: Masse des Well Plates leer [g] Vp: Probevolumen [ml] Tabelle 5: Ergebnisse der BTM-Proben Reaktor 1 Reaktor 2

1. Probe 7,43g/L 6,97 g/L

2. Probe 8,44 g/L 8,38 g/L

3. Probe 3,07 g/L In Tabelle 5 sind die Ergebnisse der BTM aufgelistet. Da die BTM-Werte der ersten und zweiten Probe im Gegensatz zu Vergleichswerten des IGB als zu hoch erschienen, wurde als

Abbildung 8: BTM-Proben im Trockenschrank

Seite - 13 -

dritte Probe eine Vierfachbestimmung durchgeführt. Wie schon vermutet, waren die Werte der ersten und zweiten Probe zu hoch. Mein Reaktor erzielte mittlerweile einen BTM-Wert von 3,069 g/L und konnte sich mit den Ergebnissen des Fraunhofer Instituts in Stuttgart messen, das selbst auch etwa 3 g/L BTM erreicht.

2.4.4 Ergebnis

Leider erlebte ich auch in diesem Experiment eine böse Überraschung. Nachdem anfangs alles sehr gut funktionierte und die Algen prächtig gediehen, war der Reaktor eines Tages fast leer. Da ringsherum alles trocken und sauber war, lag der Verdacht nahe, dass eine Reinigungskraft den Reaktor aus Versehen umgestoßen hatte. Mit der verbliebenen Flüssigkeit im Reaktor, einem Restbestand aus der Algenlieferung vom IGB und neuem Medium füllte ich den Reaktor wieder auf und hoffte das Beste. Wider Erwarten stellte sich bald ein zufriedenstellendes Algenwachstum ein. Trotz der sterilen Bedingungen ist mir einer meiner Reaktoren aus unbekannten Gründen wieder „gekippt“, und musste auch wieder neu angesetzt werden. Ergebnis des Versuches war, dass nach jedem Ansetzen einer Algenkultur im FPR gutes Algenwachstum erzielt werden konnte. Vergleichbare BTM Werte wie am Fraunhofer Institut ließen darauf schließen, dass bei Beleuchtung, Ernährung und CO2-Versorgung ein recht guter Stand erreicht wurde. Auch die Lipidproduktion in der Alge konnte aktiviert werden, wie man in Abbildung 9 an den hellen Punkten innerhalb der Algenzelle gut sehen kann.

Abbildung 9: Mikroskopaufnahme von Algen mit Lipidtröpfchen (weiße Bereiche innerhalb der Alge)

Abbildung 10: Beide FPRs, links mit „gekippter", rechts mit gesunder Algenkultur

Seite - 14 -

Verbesserungspotenziale gibt es allerdings immer noch bei den Themen Bakterienbefall und Standfestigkeit gegen Umfallen und Auslaufen. Damit ein kontinuierlicher Betrieb der Anlage auch in den Ferienzeiten ohne tägliche Betreuung funktionieren kann, wäre eine weitest gehende Automatisierung der Versorgung mit Mineralsalzen, der CO2-Versorgung sowie der pH-Wert Regelung nötig. Für weitere Versuche zur Lipidextraktion aus den eigenen Algen ist die bisher erzielbare Erntemenge an Algentrockenmasse (ca. 12 g) nicht ausreichend. Der Bau eines größeren Reaktors ist damit unabdingbar.

2.5 FPR 2.0

Da die Bakterienkontamination auf das Öffnen des Reaktors zurückzuführen ist, sollten pH-Messungen, die Zugabe von Nährsalzen und das Nachfüllen des verdunsteten Wassers steril ablaufen. Daraus folgt dies muss im geschlossenen System erfolgen. Auch sollte sich der Reaktor nun unten mit einem Hahn entleeren lassen. Neue Ausströmer wurden benötigt, da die des FPR nicht für ausreichende Zirkulation sorgten. Der Reaktor wurde des Weiteren dünner, da aus Platzmangel nur noch eine Lichtquelle verwendet wurde. Acrylglas verwendete ich weiterhin, da sich dieses Material bei meinen Forschungsarbeiten bewährt hatte und gut bearbeiten lässt. Weil bei der Lipidextraktion viel Masse benötigt wird, musste das Volumen des neuen Reaktors deutlich größer werden als das des FPR. Dieser Reaktor wird FPR 2.0 (Flatpannelreaktor 2nd Generation) genannt. 2.5.1 Reaktoraufbau Ausgangsmaterial für den neuen Reaktor war diesmal eine industriell gefertigte Stegplatte. Maße: 250cm x 100cm x 1,6cm. Zusammengesetzt aus ca. 10 cm breiten Hohlkammern erreicht die Platte eine erstaunliche Stabilität. Der erste Schritt bestand darin, die Stegplatte quer zu den Hohl-kammern auf ein Format von etwa 75cm x 100cm zuzusägen (Festool Basic). Anschließend wurden aus der übrigen Fläche zwei Kammern mit einer Länge von 100cm heraus-gesägt, wobei eine Kante der Kammer weggeschnitten wurde und damit ein u-förmiges Profil entstand. Danach wurden die beiden Kammern leicht aufgebogen und mit ca. drei Zentimeter Überlappung auf die offenen Enden der Stegplatte geschoben und mit einem Acrylkleber (Acrifix 1R 0192) verklebt. Die offenen Enden der unteren angeklebten Kammer wurden mit der Säge nochmal bündig geschnitten und mit je einer Acrylplatte (3cm x 5cm) verschlossen. Die oberen Ecken wurden im 45°-Winkel abgesägt, um die Zirkulation im Reaktor zu beschleunigen (siehe Abbildung 12), und erneut durch Acrylplatten (3cm x 15cm) verklebt.

Abbildung 11: Sägen der Stegplatte an der Tischkreissäge

Seite - 15 -

Die Standsicherheit der Anlage wurde durch eine dreieckige Ständerkonstruktion an beiden Seiten des Reaktors aus Aluminiumprofilen gewährleistet. Daran wurde auch die neue Beleuchtungseinheit befestigt. Hierzu wurde ein 30W LED-Strahler mit einem Lichtstrom von 2550 lm verwendet. Umgerechnet mit Formel 1 auf die aktive Reaktorfläche von 94cm x 80cm ergibt sich eine Beleuchtungsstärke von ca. 3400 lx. Das ist zwar in etwa nur ein Drittel der bisher erzielten Beleuchtungsstärke,

aber da der Reaktor auch nur halb so dick wie das Vorgängermodel FPR ist und nun noch ein Reflektor angebracht wurde , sollte es genügen. Sollte dies dennoch nicht ausreichen, kann ein zweiter bzw. leistungsstärkerer Strahler verwendet werden. Eine besondere Herausforderung war die Herstellung aller benötigten Schlauch- und Sensordurchführungen in wasserdichter Ausführung. Verschraubbare Kabel-durchführungen der Größe M12 in der Schutzart IP68 (staub- und wasserdicht bis 5 bar) waren die beste Lösung. Befestigt wurden diese Verschraubungen in den Eckverklebungen. Diese hatten eine Dicke von 5mm, im Gegensatz zur Wandstärke der Stegplatte mit 1,5 mm. Zuerst wurde ein Loch von 10mm Durchmesser in die Acrylplatten gebohrt (Bosch PSR 18LI) und mit einem Gewindebohrer (M12) das geeignete Gewinde geschnitten. Anschließend wurden die Verschraubungen mit einer Gummidichtung in das Gewinde gedreht. Die Schläuche brauchten jetzt nur noch durchgeführt und dicht verschraubt werden.

2.5.2 Anlagentechnik Für die Belüftung des neuen Reaktors dient eine stärkere Aquarienpumpe (Oase AQUAOXY 2000 CWS), dass sich die Zirkulation durch diese deutlich verbessert. wird. Nachdem es bei den bisher verwendeten Ausströmern immer wieder Probleme mit Verstopfungen gab oder sich trotzdem Algen absetzen konnten, versuchte ich hier eine einfachere Lösung. Als Ausströmer/ Perlator dient jetzt ein einfacher Kunststoff-schlauch, der am Ende verschweißt und über eine Länge von ca. 20cm mit einer heißen Nadel (am Lötkolben befestigt) in zwei Reihen mit kleinen Löchern perforiert wurde. Zwei dieser Perlatorenschläuche wurden durch die seitlichen Verschraubungen in den Reaktor geführt und sorgen für die nötige Zirkulation des

Abbildung 13: Schematische Seitenansicht des Reaktoraufbaus

Abbildung 12: Strömungsversuch am realen Reaktor

Abbildung 14: Leerer Reaktor mit Stützkonstruktion und Beleuchtung

Seite - 16 -

Kulturmediums. Damit die Schläuche am Boden bleiben und nicht aufsteigen können, wurden beim Bau des Reaktors bereits entsprechende Niederhalter eingeklebt. Da der Verdacht bestand, dass Kontaminationen durch Öffnen, CO2 Zugabe und Fütterung erfolgten, wird der Reaktor über ein System selbstständig geregelt. Ein wichtiges Gerät ist der Perfusor (B. Braun Perfusor secura FT), dessen Perfusorspritze wöchentlich aufgefüllt wird und die Algen nach Belieben mit unterschiedlicher Menge an Nährsalzen versorgt. Um den pH-Wert dauerhaft und genau zu erfassen ist eine spezielle pH-Sonde am Reaktor angebracht, die eine Doppelmembran besitzt und somit ständig in der Kultur verbleiben kann. Ein pH-Computer (Consort R3620) sorgt für die „non stop“-Überwachung des pH-Wertes und übermittelt die gemessenen Werte zur Aufzeichnung und Kontrolle an den PC via RS 232 Schnittstelle. Da CO2 ein den pH-Wert minimierendes Gas ist und von Lebewesen mit photosynthetischem Stoffwechsel benötigt wird, verwende ich es wie folgt zur pH-Regelung: Bei einem pH-Wert über 7,0 öffnet eine Ventilbox das Magnetventil und aus der angeschlossenen Gasflasche strömt das CO2 durch die Ventilbox. Dadurch wird zusätzliches CO2 der Zuluft beigemischt. Wenn die Kultur einen pH-Wert von 6,9 erreicht, schließt sich das Magnetventil erneut bis ein Wert von 7,0 erreicht wird. Außerdem ist eine Temperatursonde an den Computer angeschlossen, um im Sommer die Kulturtemperatur zu erfassen und evtl. dementsprechend zu temperieren. Da sich trotz der Zirkulation Algen in der Mitte der Unterkammer absetzen, wurde ein Rührfisch angebracht, der mit einem Elekromotor, an dessen Ende ein Magnet montiert ist, angetrieben wird. Algen können sich nun nicht mehr absetzen, da sie dauerhaft aufgewirbelt werden. Außerdem kann der Rührfisch zur Reinigung der Acryl-Innenwände des Reaktor verwendet werden. Um die Zunahme der Algendichte zu bestimmen, wird einerseits die BTM bestimmt, andererseits mit einem Luxmeter die Transmission gemessen. Da der Farbverlauf der Kultur auch bestimmt werden muss, verwende ich eine vorgefertigte Farbtafel (siehe Abbildung 15) im grün-gelben Bereich.

2.5.3 Ernährung

Bei der Ernährung der Algen wurde auf das bewährte Verfahren der Vorversuche zurückgegriffen. Die Algen werden kontinuierlich mit Nährsalzlösungen durch den Perfusor versorgt. Außerdem befinden sich im Kulturmedium notwendige Spurenelemente (siehe BAR). Die CO2-Versorgung erfolgt über die durch einen pH-Computer gesteuerte Ventilbox. Eine pH-Regelung auf den Sollwert von 7 ist somit gewährleistet.

Abbildung 15: Farbpalette

Seite - 17 -

2.5.4 Ergebnis

Nachdem der Reaktor erst kürzlich in Betrieb genommen wurde, kann ich noch keine Ergebnisse zum Algen-wachstum vorweisen. Die Ausgangs-situation ist aber ganz vielver-sprechend. Der Reaktor ist dicht, die Technik läuft stabil und die Durch-strömung des Reaktors verläuft wunschgemäß. Zusammen mit der nun geschlossenen Anordnung zur kontinuierlichen Versorgung mit Nähr-salzen und CO2 erwarte ich ein schnelleres Algenwachstum und vor allem weniger Probleme durch Bakterienbefall.

Abbildung 17: FPR 2.0 im Testbetrieb mit Fluorescein gefärbtem Wasser

Abbildung 16: Schematische Darstellung der Anlagentechnik des FPR 2.0

Seite - 18 -

3 Ausblick

Nach technischen Gesichtspunkten ist die Anlage in einem maximalen Ausbauzustand. Weitere grundlegende technische Verbesserungen sind mit den zur Verfügung stehenden schulischen Mitteln nicht mehr zu erwarten. Zwei kleinere Verbesserungen wären noch umsetzbar. Zur Erhöhung der Lichtinitensität in der Kultur könnte noch ein weiterer LED-Strahler angebracht werden. Da nach Angaben des Fraunhofer Instituts eine Erwärmung der Kultur auf über 30°C vermieden werden sollte, wäre eine Erweiterung der Anlage um eine Kühlmöglichkeit im Sommer hilfreich. Durch die vorhandene kontinuierliche Durchströmung scheint die einfachste Lösung hierfür zu sein, den Reaktor in eine Wanne mit gekühltem Wasser zu stellen. Dazu muss die aktuelle Ständerkonstruktion nur etwas umgebaut werden. Die Querstreben, die unter dem Reaktor durchführen, müssten auf eine seitliche Führung mit einer höheren Befestigung umgebaut werden. Ob diese Umbauten noch durchgeführt werden, mache ich von den Ergebnissen der Algenkultivierung abhängig. Jetzt heißt es einmal abwarten und das Algenwachstum und die anschließende Lipidbildung zu überwachen. Wenn ich dann genügend Biomasse ernten kann, beginnt der nächste wichtige Teil des Experiments – die Extraktion der Lipide aus den Algen. Erste Vorversuche die Lipide mechanisch (Mörser) oder mit Lösungsmitteln aus der Alge zu gewinnen, waren bisher nicht sehr erfolgversprechend. Hier gilt es neue Ansätze zu finden. Im nächsten Schritt werde ich versuchen mit unserem schuleigenem Soxhlet oder mit Hilfe eines Homogenisators bessere Ergebnisse zu erzielen.

Seite - 19 -