Interferenzgerir't zur Urnwandlung eines Mikroskops in ein Interferenzrnikroskop

Von H a n s W o l f e r

(Mit 1 Abbildung)

Inhaltsiibersicht Es wird ein einfach zu fertigendes und lichtstarkes Interferenzgerat beschrieben,

das in ein Mikroskop oder eine makroskopische Abbildungsvorrichtung eingesetzt werden kann und u. a. Phasenobjekte deutlicli erkennen und vermessen lafit. Ohne Justierschwierigkeiten liefert das Gerat automatisch niedere Interferenz- ordnungen, so daI3 spektral beliebig zusammengesetzte Beleuchtung, z. B. auch Gliihlicht oder Elektronenblitzlicht verwendbar ist. Zugleich mit den Phasen- objekten werden ohne weiteres auch Amplitudenobjekte deutlich; Polarisations- objekte konnen durch Einfiigen von Polarisatoren ebenfalls sichtbar gemacht werden. Ein mit diesem Interferenzgerat ausgeriistetes Mikroskop gibt objekt- treue farbige Bilder und ist frei von den ,,Hofen" und ,,Aufhellungserscheinungen" des Phasenkontrastverfahrens.

1. Das hier zu beschreibende Interferenzgerat dient zur Verdeutlichung und zur Vermessung von Bildern makroskopischer oder vormgsweise mikroskopischer Phasenobjekte, d. h. solcher Gegenstande, die sich von ihrer Umgebung vorwiegend im Brechungsindex unterscheiden.

Dem dienen auch das bekannte Phasenkontrastverfahren nach Ze r n ike , das Reflexionsinterferometer nach F i z e a u - To l a n s k y - Mer t o n l), das Mic he1 - sonsche und das Dysonsche2) Interferometer. Das erste gibt keine eineindeutige Zuordnung zwischen Phasen und Bildkontrast Das zweite erfordert geringen Abstand zwischen dem versilberten Objekttrager und dem versilberten Deckglas, sofern spektral beliebig zusammengesetztes Licht zur Beleuchtung benutzt wird, und l a t daher nur die Unterbringung extrem dunner Objekte zu. Das Michel - sonsche Interferometer bedingt bei seinem Ausbau zum Interferenzmikroskop koniplizierte Anordnung und Justierung, insbesondere dann, wenn die besonders vorteilhaften niederen Interferenzordnungen eingestellt werden sollen. Dem- gegeniiber ergibt das neue Interferenzgerat :tutomatisch niedere Interferenz- ordnungen, es ist leicht justierbar, frei von den prinzipiellen Mangeln des Phasenkontrastverfahrens und kann leicht niit jedem Mikroskop kombiniert werden. Gegeniiber dem D ysonschen Interferometer hat es den Vorteil groI3erer Lichtstarke und Einfachheit.

Andererseits hat das neue Interferenzgerat auch wesentliche Nachteile im Vergleich zu einigen der anderen genannten Gerate. Es erreicht hinsichtlich

1) T o l a n s k y , Proc. Roy. SOC. London 186, 2iO (1946); Merton, Proc. Roy. SOC. London 189, 310 (1947).

2) Dyson, Nature 164, 229 (1949). 3) H. W o l t e r , Ann. Physik (6) 7, 34 u. 147 (1950); Naturwiss. 37, 272 (1950).

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Einfachheit und muheloser Justierung nicht das Phasenkontrastmikroskop. Dem To lansky-Mer tonschen Gerat mit stark verspiegelten Objekttragern und Deckglasern ist es bei Bakterienuntersuchungen an Empfindlichkeit und auch an Einfachheit unterlegen. Sein Anwendungsbereich deckt sich daher nicht mit dem der anderen Gerate, und man wird es hauptsachlich dort verwenden, wo es auf Lichtstarke, Objekttreue oder gar quantitative Untersuchungen an Phasen- objekten (auch solchen von insgesamt mehreren Wellenlangen mechanischer Dicke) ankommt.

Die vorliegende Veroffentlichung beschrankt sich auf eine knappe Mitteilung des Prinzips und einiger Eigenschaften des Interferometers. Die entscheidende Frage nach der objekttreuen Abbildung wird an Hand farbiger Aufnahmen im Rahmen allgemeinerer Untersuchungen zur Interferenzmikroskopie spater dis- kutiert werden; denn diese Frage liiljt sich fur eine grol3e Klasse von Interferenz- geraten einheitlich behandeln und beantworten.

2. Im Prinzip kann man das Interferenzgerat auf das Jaminsche Interfero- meter zuruckfuhren, das bekanntlich niedrige Ordnungen nur dann gibt, wenn beide Planparallelplatten sehr genau gleiche Dicke haben. Diese sonst unbequeme Forderung erfullt man rnit dem neuen Interferometer miihelos, indem man es als J ami nsches Interferometer aufbaut, dessen zweite Planparallelplatte nicht real ausgefuhrt, sondern lediglich ein Spiegelbild der ersten ist ; denn keine zwei Plan- parallelplatten konnten einander so gleichen wie eine Platte ihrem Spiegelbilde.

Dieses Prinzip kann man auf mehrfache Weise auswerten. Hier sei als Aus- fiihrungsbeispiel die Form beschrieben, in der das Gerat zum Ausbau eines Mi- kroskops zum Interferenzmikroskop dient. Die makroskopische Ausfuhrungs- form kann hieraus durch Vereinfachung leicht erschlossen werden.

Als Zusatz zum Mikroskop wird das Interferenzgerat zwischen Kondensor und Objektiv gesetzt ; es besteht aus zwei einander parallelen, undurchllssigen, ebenen und gemaIj der Abb. 1 unterbrochenen Spiegeln a und b und einer zu beiden Spiegeln parallelen teildurchlassigen und entsprechend der Abb. 1 unterbrochenen Spiegelflache c.

Beleuchtet wird mit einem Lichtkegel, der z. B. dadurch hergestellt werden kann, daB in die untere Brennebene des Mikroskopkondensors eine Ringblende gelegt wird. e sei ein einfallender Strahl des Liclitkegels. Der Teil f dieses Strahles wird a n der halbdurchlassig verspiegelten Plache c reflektiert, dann an a reflek- tiert, ferner an b und schlieljlich an c reflektiert; er verlaljt bei k das Gerat und tri t t dort in das Mikroskopobjektiv ein, sofern nicht eine weitere Reflexion an dem in der Umgebung der optischen Achse u ausgesparten Kugelspiegel x und nochmals an dem Spiegel b vorgezogen wird. Der andere Teil 1 des einfallenden Strahles e wird an b, dann an a reflektiert und durchsetzt die zur Aufnahme des Objekts bestimmte Objektkammer t , dann den Spiegel c und vereinigt sich mit dem Strahle k Beide Strahlenwege haben gleiche optische Lange, wenn die Objektkamnier ein Medium enthalt, dessen Brechungsindex vollig dem der Kompensationskammer t' pleicht. Liegen jedoch in dem Medium der Ob jektkammer t mikroskopische Phasen- objekte, so tri t t ein Gangunterschied auf, der sich bei Verwendung weil3er Be- leuchtung in Farbunterschieden oder bei Verwendung monochromatischen Lichtes in Helligkeitsunterschieden auBert. Was hier fur einen Strahl ausgesagt wurde, gilt entsprechend fur jeden Strahl des Beleuchtungskegels. Man denke sich zum Verstandnis des gesamten Vorgangs eine raumliche Anordnung, die durch Rotation der Abb. 1 um die optische Achse u beschrieben werden kann.

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Die a m dem Interferenzgerat austretenden Strahlen k kann man unmittelbar in ein Mikroskopobjektiv eintreten lassen. Dann fallt der in Abb. 1 noch zu- satzlich gezeichnete KugeIspiegel x fort und das Objektiv wird scharf eingestellt auf die Objektkammer t. Da manche der gebrauchlichen Mikroskop- abjektive aber sehr kleine Frontlinsen haben, miiDte das Interferometer in diesem Falle unbequem klein ausgefiihrt werden. Deshalb ist es zweckmaDig, den Kugel- spiegel z, der in der Umgebung der optischen Ache u ausgespart sei, zu verwenden und durch ihn die Objektkammer bei y abzubilden. Dann wird erst dieses Bild mit dem Mikroskopobjektiv betrachtet. Hierdurch wird die Gro13e des Geriits unabhangig von der GroDe der Frontlinsez).

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Abb. 1. Schnitt durch das Interferenzgerat. a und b sind Spiegelflachen, c halbdurch- 1assige Spiegelfliichen. c und b bilden Belegungen auf einer Planparallelplatte; der Spiegel a laBt die Planparallelplatte ein zweites Ma1 wirksam werden. In der Kammer t liegt das Objekt; oberhalb y ist das Mikroskopobjektiv mit u als optischer Achse

zu denken

Die Lage der Objektkammer kann noch weitgehend variiert werden. So kann diese z. B. unmittelbar an der Flache a oder b liegen, so da13 dasselbe Objekt von dem auf den Spiegel a bzw. b auftreffenden und von dem reflektierten. Strahl durch- aetzt wird. Dadurch erreicht man die doppelte Empfindlichkeit.

Man kann auch darauf verzichten, die Objektkammer und die Kompensations- kammer voneinander zu trennen. Am einfachsten werden beide als ein gemeinsamer Raum wie der iiblicherweise zwischen Objekttrager und Deckglas gebildete ver- wendet. Das gesamte Interferenzgerat kann am zwei Teilen bestehen, die dort zusammengesetzt werden, wo sich entsprechend der Abb. 1 die Objektkammer t und die Kompensationskammer t’ befinden. Beide Teile werden dann unter EinschluB des Objekts so aufeinandergelegt wie ein Objekttrager und ein Deck- glas. Eine leichte seitliche Verschiebung des oberen Teiles gegen den unteren Teil

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ist ohne Belang. Die Parallelitat der Flachen a, b, c kann durch eine Justiervor- richtung stets optimal eingestellt aerden. Doch ist das Interferenzgerat gegen ein leichtes Abweichen von der Parallelitat der Flachen nicht besonders empfindlich.

3. Das Interferenzgerat erlaubt die Herstellung niederer Interferenzordnungen auch bei Verwendung einer dicken Objektkammer. Darin liegt der entscheidende Vorteil gegenuber der Tolanskyschen Anordnung, in der dicke Objekte nur mit hohen Interferenzordnungen beobachtet werden konnten.

Die Verwendung niederer Interferenzordnungen biet et mehrere Vorteile : a) Die Verwendbarkeit beliebig spektral zusammengesetzten Lichtes sorgt

fur kurze Belichtungszeiten bei der Mikrophotographie ; auch Elektronenblitz- lampen konnen benutzt werden.

b) Bei Verwendung weiden Lichtes kann man z. B. den Gangunterscliied so wahlen, dad das Gesichtsfeld die Farbe Purpur annimmt. Die Objekte erscheinen dann farbig differenziert, weiBe Blutkorperchen z. B. grun mit blauem Kern. Bakterien sind deutlich farbig abgesetzt von der Umgebung. Urn feine Bakterien nachzuweisen, stellt man zweckmadig den. Gangunterschied auf fast dunkles Gesichtsfeld ein, auf dem Bakterien sich dann hell abheben.

Auch die Vermessung der optischen Dicke von Phasenobjekten ist bei Ver- wendung kontinuierlicher Beleuchtung erheblich erleichtert ; man stellt hierbei den Gangunterschied fur das gesamte Gesichtsfeld ungleichmal3ig ein, so dad der von Objekten freie Gesichtsfeldteil bereits von Interferenzstreifen durchzogen wird. Die Verschiebung, die diese Streifen innerhalb der Objekte erfahren, kann bei Verwendung von Gluhlicht und niedrigen Interferenzordnungen in eindeutiger Weise gemessen werden, wahrend bei der Verwendung hoher Ordnungen und monochromatischen Lichtes bekanntlich eine Unbestimmtheit bleibt.

c) Die Benutzung weiden Lichtes la& eine Kombination mit der Polarisations- mikroskopie zu; die Vorrichtung ist dann zwischen Kondensor und Objektiv eines Polarisationsmikroskops zu setzen, das die Polarisationsunterschiede zweck- madig durch eine in den Strahlengang gebrachte Quarzplatte oder Glimmerplatte in bekannter Weise zu Farbunterschieden umwandelt. Die Depolarisation an den Spiegelflachen erschwert zwar quantitative Auswertung ; doch erlaubt ein so auf- gebautes Mikroskop, Polarisationsobjekte und Phasenobjekte gleichzeitig sichtbar zu machen. Amplitudenobjekte sind mit dem Mikroskop ebenfalls ohne Schwierig- keiten erkennbar.

4. Das Tnterferenzgerat kann noch in verschiedener Hinsicht abgewandelt werden. Wenn es auf die Lichtintensitat nicht ankommt, wie z. B. bei der Beob- achtung und Mikrophotographie unbeweglicher Objekte, so kann man die Spiegel- flache b in der gesamten Ausdehnung halbdurchlassig spiegelnd ausfuhren. Man gewinnt dadurch eine volle Ausnutzung der Objektivapertur und eine groSere Freiheit in der Wahl der Beleuchtungsapertur, besonders dann, wenn man auch die Flache a und u. U. auch die Flache c ganz oder doch grodtenteils halbdurch- lassig verspiegelt.

Bei Verwendung eines Kugelspiegels x wird mit Vorteil unmittelbar uber den Spiegel b noch ein nach oben erhabener Spiegel gesetzt; dieser reflektiert das von dem Kugelspiegel x kommende Licht statt des ebenen Spiegels b und entwirft unmittelbar ein Bild in dem Okular des Mikroskops, so dad ein Mikroskopobjektiv damit entbehrlich wird.

Alle mit dem Einbau von Kugelspiegeln verbundenen Abbildungsfehler ver- meidet man, wenn man den Kugelspiegel x nur fur radiale, in sich reflektierte

H . IVolter: Interferenzgerat z. Umumdlung eines Mikroskops in ein Inlerferenzmikroskop 69

Strahlen verwendet. Die Flaclie b ist dann aufierlialb des vollspiegelnden Gebietes oder als Ganzes durchlassig verspiegelt auszufiihren ".

Das Interferenzgerat kann auch so abgewandelt werden, daB reflektierende Objekte im Auflicht betrachtet werden konnen. Das reflektierendc Objekt tr i t t dann an die Stelle eines Teiles des Spiegels a oder b. Die Abmessungen des Inter- ferenzgerates sind dann so zu andern, daR diesw Objekt annahernd in der opti- schen Achse liegt.

5 . Ein besonders empfindliches und zu quantitativen Messungen geeignetes Gerat zur Sichtbarmachung der Phasenunterschiede erhalt man, wenn man bei w einen z. 13. radial polarisierenden Ring und bei w' einen z. B. tangential polari- sierenden Ring anbringt. Man kann dabei die Worte ,,tangential" und ,,radial" miteinander vertauschen. Die Ringe konnen ferner auch an andere Stellen des geteilten Strahlenganges gebracht werden. Man kann den Ring w auch durch ein polarisierendes Kreisscheibchen w" unterhalb der Objektkammer t und den Ring w' durch ein jeweils senkrecht zu w polarisierentles Kreisscheibchen w"' ersetzen. Hierdurch werden die Gangunterschiede, die da5 Objekt bei t verursacht, umge- wandelt in Gangunterschiede zwischen zwei polari4erten Komponenten im Strahle k Dadurch werden auf dieses Interferenzmikroskop alle vom Polarisationsmikroskop her bekannten Verfahren zum Nachweis von Gangunrerschieden zweier senk- recht zueinander polarisierter Schwingungskomponenten iibertragbar. Man setzt hierzu insbesondere in den Weg des Strahles e untl des Strahles k je einen vorzugs- weise unter 45' gegen den Radius polarisierenden Ring. Werden zwischen diese Ringe noch doppelbrechende oder Rotationsdispersion zeigende Platten oder entsprechende Ringe eingelegt, so konnen die Polarisationsunterschiede in Farbunterschiede um- gewandelt werden, wie das an sich vom Polarisittionsmikroskop her gelaufig ist.

6. Man kann bei der mikroskopischen, vor a1lc.m aber hei dor makrmkopischen Verwendung des Interferenzgerates auf die rot ationssymmetrische Ausfiihrung der Anordnung und der Beleuchtung verzichten. indem man nur einen Teil der zum Beleuchtungskegel gehorenden Strahlen verwendet. Insbesondere wird man bei der makroskopischen Ausfiihrung oft mit einrm einzigen Strahle e - d. h. mit einem Wellenbiindel - auskommen. Auf den Kugelspiegel x wird man dann in den nieisten Fallen verzichten.

Bei einem solchen Verzicht auf rotationssymmetrische Ausfiihrung verein- fachen sich auch die Polarisatoren w und w' bzw. w" und w'" wesentlich. Ins- besondere wird man bei Verwendung nur eines Strahles e - d. h. eines Wellen- biindels - diese Polarisatoren als einfache linearpolarisierende Platten ausbilden. Statt ,,radialpolarisierend" denke man sich oben dann ,,linearpolarisierend mit Schwingungsrichtung in der Einfallsebene" gesetzt und entsprechend ,,linear- polarisierend mit Schwingungsrichtung senkrecht zur Einfallsebene" statt ,,tan- gentialpolarisieren". Die in die Strahlen e und k zu bringenden Polarisatoren sind dann Linearpolarisatoren mit Schwingungsrichtungen, die um 45" gegen die Einfallsebene geneigt sind.

Dem Direktor des Instituts, Herrn Prof. Dr. L o c h t e - H o l t g r e v e n , dankt Verfasser fur die freundliche Uberlassung von Raumen und Geraten und Herrn stud. rer. nat. C a r s t e n s e n fur seine Hilfe bei experimentellen Arbeiten. Ins- besondere dankt Verfasser der Firma Ernst Leit,z und Herrn Dr. R o s e n t h a l - Wetzlar fur die Bereitstellung ausgezeichneter l'lanparallelplatten.

K ie l , Institut fur Experimentalphysik der Universitat. (Bei der Redaktion eingegangen am 24. Februar 1951.)