Aus der Klinik für kleine Haustiere

der Tierärztlichen Hochschule Hannover ________________________________________________________________

Methodische und klinische Untersuchungen mit dem

Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 beim Hund

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

vorgelegt von

Anke Helene Keidel

aus Nordhorn

Hannover 2001

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. R. Mischke 1. Gutachter: Prof. Dr. R. Mischke 2. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. H.-J. Schuberth Tag der mündlichen Prüfung: 19.11.2001

Meinen Eltern

Inhaltsverzeichnis A. Einleitung 13 B. Literaturübersicht 15 1. Physiologie der primären Hämostase 15 1.1. Rolle im Blutstillungssystem 15 1.2. Entwicklung der Thrombozyten 15 1.3. Struktur der Thrombozyten 15 1.4. Membranständige Rezeptoren der Thrombozyten 16 1.5. Ablauf der primären Hämostase 17 1.5.1. Adhäsion 17 1.5.2. Formwandel und Sekretion 18 1.5.3. Aggregation, Stabilisation des primären

Plättchenpfropfs

19 1.5.4. Thrombusretraktion, Auflösung des Plättchenpfropfs 19 2. Störungen der primären Hämostase 21 2.1. Thrombozytopenie 21 2.2. Thrombozytopathien bei ausgewählten Erkrankungen 22 2.2.1. Willebrand-Erkrankung 22 2.2.2. Azetylsalizylsäure-induzierte Thrombozytopathie 24 2.2.3. Urämie 24 2.2.4. Hepatopathien, portosystemischer Shunt 25 2.2.5. Canine Leishmaniose 27 2.2.6. Leukämie 28 2.2.7. Malignes Lymphom 29 2.2.8. Multiples Myelom 30 3. Labormethoden zur Überprüfung der

Thrombozytenfunktion

31 3.1. Kapilläre In-vivo-Blutungszeit 31 3.2. Thrombozytenaggregation 32 3.3. Messung der Plättchenadhäsion 33 3.4. Resonanzthrombographie 33 3.5. Durchflußzytometrie 34 3.6. Plättchenfunktionsanalysengeräte 35 3.6.1. Geräteaufbau 35

3.6.2. Präanalytische Untersuchungen 39 3.6.2.1. Geräteparameter 39 3.6.2.2. Einfluß der verwendeten Probengefäße und -zusätze 40 3.6.2.3. Präzisionsstudien, Reproduzierbarkeit der Ergebnisse 41 3.6.2.4. Einfluß der Meßzellcharge 41 3.6.2.5. Einfluß der Lagerdauer der Probe vor der Messung

und der Temperatur von Probe und Filter

42 3.6.3. Referenzbereiche, Einfluß von Geschlecht und Alter 43 3.6.4. Einfluß der Thrombozytenzahl 48 3.6.4.1. Thrombozytopenie-adaptiertes Vorläufergerät 49 3.6.4.2. Überprüfung der Wirkung von Thrombozytentrans-

fusionen bzw. des therapeutischen Einsatzes von Phospholipiden

49 3.6.5. Nachweis angeborener und erworbener

Thrombozytenfunktionsstörungen

50 3.6.5.1. Willebrand-Erkrankung 50 3.6.5.2. Andere hereditäre Thrombozytopathien 52 3.6.5.3. Erworbene Thrombozytopathien 53 3.6.5.4. Erfassung einer Plättchenaktivierung 54 3.6.6. Einfluß von Thrombozytenfunktionshemmern und

Antikoagulanzien

55 3.6.6.1. Azetylsalizylsäure 55 3.6.6.1.1. Einfluß von 1-Deamino-(8-D-Arginin)-Vasopressin

auf die durch Azetylsalizylsäure verlängerte Verschlußzeit

57 3.6.6.2. Sonstige 57 3.6.7. Einfluß des Hämatokrits bzw. einer Hämodilution

durch Infusionslösungen

59 3.6.8. Einfluß der Leukozytenzahl 60 3.6.9. Plasmatische Gerinnungsstörungen 60 3.6.10. Biokompatibilität 61 C. Untersuchungsgut, Material und Methodik 62 1. Material 62 1.1. Geräte und Bezugsquellen 62 1.2. Reagenzien, Arzneimittel, Abkürzungen und Bezugs-

quellen

63 1.3. Verbrauchsmaterial und Bezugsquellen 64

2. Untersuchungsgut 66 2.1. Klinisch gesunde Hunde 66 2.2. Patienten 66 2.2.1. Thrombozytopenien 67 2.2.2. Willebrand-Erkrankung 67 2.2.3. Urämie 68 2.2.4. Hepatopathien, Ikterus 68 2.2.5. Portosystemischer Shunt 68 2.2.6. Leishmaniose 69 2.2.7. Akute lymphatische Leukämie 69 2.2.8. Chronische lymphatische Leukämie 70 2.2.9. Malignes Lymphom 70 2.2.10. Multiples Myelom 71 2.2.11. Hyperfibrinolyse 71 2.2.12. Cumarinvergiftung 71 2.2.13. Hämophilie A 72 3. Probengewinnung und -behandlung 72 3.1. Blutentnahme 72 3.2. Probenverarbeitung und Gewinnung von plättchen-

reichem und plättchenfreiem Plasma

72 4. Methoden 73 4.1. Thrombozytenzahl und andere Meßgrößen des

Blutbildes

73 4.2. Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 73 4.3. Kapilläre In-vivo-Blutungszeit 74 4.4. Thrombozytenaggregation nach der BORN-Methode 74 4.5. Klinisch-chemische Messungen 76 4.6. Bestimmung der aktivierten partiellen Thrombo-

plastinzeit und der Prothrombinzeit, der FaktorVIII:C-Aktivität und der Willebrandfaktor-Konzentration

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5. Versuchsaufbau von In-vivo- und In-vitro-Experimenten

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5.1. Präzisionsanalyse (Kollagen/ADP-Meßzelle) 77 5.2. Chargenprüfung (Kollagen/ADP-Meßzelle) 77 5.3. Einfluß der Lagerung (Kollagen/ADP- und

Kollagen/Epinephrin-Meßzelle)

77 5.4. Einfluß des Hämatokrits (Kollagen/ADP-Meßzelle) 78 5.5. Einfluß von Desmopressin (DDAVP) bei einem Hund

mit Willebrand-Faktor-Mangel (Kollagen/ADP-Meßzelle)

78 5.6. Einfluß der intravenösen Injektion von Azetylsalizyl-

säure beim gesunden Hund (Kollagen/ADP-Meßzelle und Kollagen/Epinephrin-Meßzelle)

78 5.7. Einfluß des In-vitro-Zusatzes von Azetylsalizylsäure

beim gesunden Hund (Kollagen/ADP-Meßzelle und Kollagen/Epinephrin-Meßzelle)

79 6. Statistische Auswertung 79 D. Ergebnisse 80 1. Referenzwerte für Verschlußzeit und Gesamtvolumen 80 2. Referenzwerte der In-vivo-Blutungszeit 82 3. Referenzwerte der Thrombozytenzahl und des

Hämatokrits

83 4. Präzisionsanalyse 83 5. Einfluß der Meßzellcharge 84 6. Einfluß der Lagerung 85 7. Einfluß des Hämatokrits 88 8. Einfluß der Thrombozytenzahl 89 9. Willebrand-Erkrankung 96 10. Einfluß der intravenösen Injektion von

Azetylsalizylsäure beim gesunden Hund

99 11. Einfluß des In-vitro-Zusatzes von Azetylsalizylsäure

bei Blutproben von gesunden Hunden

102 12. Urämie 107 13. Hepatopathien 111 13.1. Ikterus 113 14. Portosystemischer Shunt 113 15. Leishmaniose 118

16. Akute lymphatische Leukämie 122 17. Chronische lymphatische Leukämie 126 18. Malignes Lymphom 127 19. Multiples Myelom 132 20. Hyperfibrinolyse 134 21. Cumarinvergiftung und Hämophilie A 137 E. Diskussion 140 F. Zusammenfassung 150 G. Summary 153 H. Literaturverzeichnis 156 I. Tabellarischer Anhang 192

Abkürzungsverzeichnis °C = Grad Celsius ADP = Adenosindiphosphat ASS = Azetylsalizylsäure ATP = Adenosintriphosphat BZ 1 = Blutungszeit 1 BZ 2 = Blutungszeit 2 Ca = Kalzium CaCl2 = Kalziumchlorid cAMP = zyklisches Adenosinmonophosphat cGMP = zyklisches Guanosinmonophosphat cm = Zentimeter DDAVP = 1-Deamino-(8-D-Arginin)-Vasopressin dl = Deziliter Epi = Epinephrin F-VIII:C = Faktor-VIII:C-Aktivität g = gravitas, Erdbeschleunigung GP = Glykoprotein GV = Gesamtvolumen HE = Hämatoxilin-Eosin HTK = Hämatokrit I.E. = Internationale Einheiten kD = kiloDalton kg = Kilogramm l = Liter M = Mol mbar = Millibar mg = Milligramm mm = Millimeter mmol = Millimol n = Anzahl NO = Stickstoffmonoxid NaCl = Natriumchlorid PFP = plättchenfreies Plasma PGG2 = Prostaglandinendoperoxid G2

PGH2 = Prostaglandinendoperoxid H2

PRP = plättchenreiches Plasma r = Korrelationskoeffizient

r2 = Bestimmtheitsmaß SD = standard deviation, Standardabweichung sec = Sekunden Tab. = Tabelle Thrz. = Thrombozytenzahl TXA2 = Thromboxan A2

VK = Variationskoeffizient VLA = very late lymphocyte-activation antigen-Gruppe VZ = Verschlußzeit WF:Ag = Willebrandfaktor-Konzentration WF:RCo = Ristocetin-Kofaktoraktivität µg = Mikrogramm µl = Mikroliter µm = Mikrometer µM = Mikromol

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A. Einleitung Die kapilläre Blutungszeit ist ein wesentlicher Screeningtest der Hämostase und überprüft die Bildung des primären Plättchenpfropfs. Ihre Messung ist insbesondere bei Verdacht auf Plättchenfunktionsstörungen indiziert, wobei die kapilläre Blutungszeit - bei physiologischer Thrombozytenzahl - verlängert ist (NOLTE et al. 1994). Neben der In-vivo-Messung, wofür auch für den Hund ein praktikables Verfahren zur Verfügung steht (NOLTE et al. 1997), hat mittlerweile die In-vitro-Blutungszeitmessung in speziellen Geräten einen wesentlichen Stellenwert bei der Erkennung und Verlaufskontrolle von Thrombozytenfunktionsstörungen beim Menschen erlangt (u.a.: KRETSCHMER et al. 1989; ESCOLAR et al. 1999; CATTANEO et al. 1999). Diese Methode zeichnet sich gegenüber der Messung der kapillären Blutungszeit am Patienten insbesondere durch eine bessere Standardisierbarkeit und einen geringeren personellen Aufwand aus (MÜLLER et al. 1997). Für den Hund sind der zugänglichen Literatur allerdings bislang nur wenige Daten im Zusammenhang mit dieser Methode zu entnehmen (SCHWARZ et al. 1997). Daher waren die Ziele der vorliegenden Arbeit: 1. Basierend auf einer größeren Tierzahl sollten Referenzbereiche für die Analysen mit dem Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 beim Hund erstellt werden. 2. Es sollte der Einfluß von Meßzellcharge, der Lagerung des Probenmaterials, des Hämatokrits und der Thrombozytenzahl sowie von Azetylsalizylsäure auf die In-vitro-Blutungszeit beim Hund untersucht werden. 3. Bei Erkrankungen, die beim Menschen und/oder Hund mit Thrombo-zytenfunktionsstörungen assoziiert sind (z.B. Urämie, Hepatopathien, akute Leukämie), sollten Messungen der In-vitro-Blutungszeit beim Hund erfolgen. 4. Schließlich sollte anhand von Hunden mit plasmatischen Gerinnungs-störungen die Spezifität der Methode zur Aufdeckung von Störungen der primären Hämostase getestet werden.

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B. Literaturübersicht 1. Physiologie der primären Hämostase 1.1. Rolle im Blutstillungssystem Das Hämostasesystem kann als ein Dreikomponentensystem aufgefaßt werden. Diese drei Komponenten sind die zellulären und humoralen Bestandteile des zirkulierenden Blutes, die Komponenten der Gefäßwand und die Vasomotorik (MÜLLER-BERGHAUS 1997). Als wesentlicher Bestandteil des komplexen Hämostaseapparats erfüllen Blutplättchen dabei eine Reihe wichtiger Funktionen. So tragen sie unter anderem zur Aufrechterhaltung der Gefäß-wandintegrität bei, sorgen bei einer Verletzung durch Bildung eines hämostatisch wirksamen Pfropfs für die primäre Blutstillung und fördern die Aktivierung des Gerinnungssystems (SCHARF 1997). Veränderungen in Thrombozytenzahl oder -funktion sind eine wesentliche Ursache für Blutungen bei domestizierten Tieren und ergeben eine große Bandbreite erworbener oder kongenitaler Erkrankungen (DAVENPORT et al. 1982). 1.2. Entwicklung der Thrombozyten Die Zellreihe der Thrombozytopoese geht aus pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen des Knochenmarks hervor. Unter dem Einfluß des Wachstumsfaktors Thrombopoetin entwickeln sich aus den Stammzellen die Megakaryoblasten und aus diesen über einige Zwischenstufen die Megakaryozyten (WEISS 1975; SCHNEIDER u. GATTERMANN 1996). Durch Invagination der Megakaryozytenmembran und anschließende Fragmentierung entstehen aus einem kernhaltigen Megakaryozyten 1000-2000 kernlose Thrombozyten (WEISS 1975). Die Lebensdauer der Thrombozyten beträgt beim Menschen im Mittel 10 Tage (SCHALM et al. 1975), beim Hund liegt sie zwischen 5 und 7 Tagen (JAIN 1993). Die normale Thrombozytenzahl des peripheren Blutes beträgt beim Hund 150.000-500.000/µl (MISCHKE 1997), überalterte Thrombozyten werden durch das Monozyten-Makrophagen-System in der Leber eliminiert. 1.3. Struktur der Thrombozyten Thrombozyten zirkulieren in der Blutbahn im Ruhezustand in einer diskoiden Form (SCHARF 1997). Beim Hund beträgt ihr Durchmesser 1,3-4,7 µm, ihre Dicke 0,5 µm (JAIN 1975). Bei Aktivierung machen sie einen

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charakteristischen Formwandel durch. Sie verlieren ihre Scheibenform, werden nahezu kugelförmig und stülpen Pseudopodien aus (BLOCKMANS et al. 1995; WHITE 1996). Elektronenmikroskopisch können vier Regionen der Thrombozyten unter-schieden werden:

• Die periphere Zone besteht aus der Plasmamembran und ihr assoziierten Strukturen. Die als Glykokalix bezeichnete Schicht stellt die äußere Hülle des Plättchens dar. Sie ist reich an Glykoproteinen, die als Rezeptoren für Plättchenagonisten und adhäsive Proteine dienen. Die mittlere Schicht der peripheren Zone wird repräsentiert durch die phospholipidreiche Plasmamembran mit dem Aufbau einer typischen Einheitsmembran (WHITE 1979). Der unter der Plasmamembran liegende Bereich bildet die dritte Schicht dieser Zone. Dieser vermittelt eine Signaltransduktion zwischen Rezeptoren und Plättcheninnerem beziehungsweise zwischen zytoplasmatischen Strukturen und der Plättchenoberfläche. Über Invaginationen der Plasmamembran, das sogenannte offene kanalikuläre System, steht die Oberfläche mit dem Plättcheninneren in Verbindung (SCHARF 1997).

• Die Sol-Gel-Zone stellt die Matrix des Plättchenzytoplasmas dar. Sie enthält drei Fasersysteme: die submembranösen Filamente, die Mikrotubuli und die Mikrofilamente (FOX 1993; WHITE 1994). Die Komponenten der strukturellen Zone halten die diskoide Form des ruhenden Thrombozyten aufrecht und sind aktiv an der Formveränderung des aktivierten Plättchens beteiligt (GAWAZ 1999).

• Die Organellenzone umfaßt die a-Granula, einige dichte Granula („dense bodies“), wenige Mitochondrien, Peroxisomen und Lysosomen.

• Die Membranzone besteht aus dem dichten tubulären System und dem offenen kanalikulären System (WHITE 1996).

1.4. Membranständige Rezeptoren der Thrombozyten Adhäsion und Aggregation der Thrombozyten werden über membranständige Rezeptoren der Thrombozyten vermittelt (DE GROOT u. SIXMA 1990; SCHRÖR 1991; BLOCKMANS et al. 1995; WHITE 1996). Diese lassen sich unterscheiden in zur Familie der Integrine und zur Familie der Nonintegrine gehörende Rezeptoren:

• Zur Familie der Integrine zählen die very late lymphocyte-activation antigen-Gruppe (VLA) und die Zytoadhäsine. Die Gruppe der VLA umfaßt den Glykoprotein(GP)Ia-IIa-Rezeptor, einen Rezeptor für Kollagen, den GPIc-IIa-Rezeptor, einen Rezeptor für Fibronektin, und

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den GPIc`-IIa-Rezeptor, einen Rezeptor für Laminin. Zu den Zytoadhäsinen gehören der GPIIb-IIIa-Rezeptor, ein Rezeptor für Fibrinogen, Willebrandfaktor, Fibronektin und Vitronektin, und der avGPIIIa-Rezeptor, ein Rezeptor für Vitronektin. Während die übrigen Rezeptoren auch auf anderen Zellen vorkommen, ist die Expression des GPIIb-IIIa-Rezeptors auf das Megakaryozyten-Plättchen-System be-schränkt (DE GROOT u. SIXMA 1990; SCHARF 1996).

• Zur Familie der Nonintegrine zählen der GPIb-Rezeptor, der auf den Plättchen als Komplex mit GPIX und GPV vorliegt und ein Rezeptor ist für den Willebrandfaktor und Thrombin, und der GPIV-Rezeptor, ein Rezeptor für Kollagen und Thrombospondin (DE GROOT u. SIXMA 1990; BLOCKMANS et al. 1995; SCHARF 1996).

Neben aktivierenden Rezeptoren finden sich auch inhibierende Rezeptoren auf der Membran der Thrombozyten, zum Beispiel für Prostaglandine und Adenosin. Diese sind über stimulatorische G-Proteine an eine Adenylatzyklase gekoppelt, deren Stimulation zur Bildung des Botenstoffs cAMP und dadurch zur Aktivierung einer Proteinkinase A führt. Daraufhin erfolgt durch Phosphorylierungsreaktionen eine Hemmung der Plättchenaktivierung durch Antagonisierung der Agonisten-induzierten Erhöhung der zytosolischen Kalzium-Konzentration. Zudem wird die Plättchenaktivierung durch Dephosphorylierung des sogenannten „47kD-Proteins“ und der leichten Ketten des Myosins gehemmt. Ein weiterer inhibitorischer Botenstoff ist cGMP, welches durch Stimulation der löslichen Guanylatzyklase gebildet wird. Diese Stimulation kann durch Stickstoffmonoxid aus dem Endothel sowie NO-Donatoren erfolgen (SCHRÖR 1991). 1.5. Ablauf der primären Hämostase 1.5.1. Adhäsion Der erste Schritt der primären Hämostase ist die Adhäsion von noch ruhenden Blutplättchen an die verletzte Gefäßwand. Bei hohen Scherraten wird dieser initiale Kontakt vermittelt durch den GPIb-V-IX-Rezeptor der Plättchenoberfläche und den an die exponierte Gefäßwandmatrix gebundenen Willebrandfaktor (DE GROOT u. SIXMA 1990; RUGGERI 1994; SIXMA et al. 1995; SCHARF 1996; WHITE 1996; ROSENFELD u. GRALNICK 1997), welcher erst bei hohen Scherraten in multimerischer Form vorliegt (RUGGERI 1994; MÜLLER-BERGHAUS 1997). Bei niedrigen Scherkräften sollen die Plättchen über den GPIa-IIa-Rezeptor auch direkt an exponiertes Kollagen des

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Gefäßsubendothels anhaften können (SCHARF 1996; ROSENFELD u. GRALNICK 1997). Nach DE GROOT und SIXMA (1990) ist bei niedrigen Scherraten Fibronektin das Haupadhäsivprotein. Über weitere Ligand-Rezeptor-Interaktionen erfolgt eine Stabilisierung der Plättchenadhäsion (SIXMA 1995; GAWAZ 1999). 1.5.2. Formwandel und Sekretion Durch Kopplung der membranständigen Rezeptoren mit intrazellulären Messengersystemen kommt es durch Bindung eines Agonisten am jeweiligen Rezeptor zu einer Erhöhung intrazellulärer Botenstoffe und dadurch zu einer Stimulation der Thrombozyten, die sich in Formwandel, Sekretion oder Aggregation äußert (PACKHAM 1983; SCHARF 1996; ROSENFELD u. GRALNICK 1997). Eine Stimulation der Rezeptoren führt zur Aktivierung von Phospholipase A2 sowie Phospholipase C mit Bildung und Freisetzung von folgenden intrazellulären Botenstoffen aus Membranphospholipiden: Arachidonsäure, Inositol-1,4,5-Triphosphat und Diazylglyzerol. Aus der Arachidonsäure entstehen über den Zyklooxygenaseweg Prostaglandin-endoperoxide (PGG2/PGH2) und Thromboxan A2 (TXA2). Sie binden am PGH2/TXA2-Rezeptor und stimulieren darüber die Plättchensekretion. Diazylglyzerol aktiviert die Proteinkinase C, welche zur Phosphorylierung eines „47kD-Proteins“ und damit zur Induzierung der Plättchensekretion und -aggre-gation führt. Außerdem kommt es durch transmembranösen Einstrom durch rezeptorabhängige Kalziumkanäle und durch Inositol-Triphosphat - induzierte Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Speichern zu einer Erhöhung der zytosolischen Kalzium-Konzentration. Dies führt unter anderem zu einer Aktivierung der Myosin-light-chain-Kinase, welche durch Phosphorylierung der leichten Ketten des Myosins neben einer Verstärkung der Plättchensekretion vor allem den Formwandel („shape change“) der Thrombozyten katalysiert (SCHRÖR 1991). Die bei der Sekretion freigesetzten Granulainhaltsstoffe können sowohl „autokrin“ den Aktivierungsvorgang verstärken als auch durch Stimulation noch ruhender Thrombozyten diese aus der Zirkulation rekrutieren und zur Aggregation mit schon adhärenten Plättchen anregen. Das Endstadium der Adhäsion ist erreicht, wenn der Thrombozyt vollkommen über dem Subendothel ausgespreizt ist (GAWAZ 1999).

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1.5.3. Aggregation, Stabilisation des primären Plättchenpfropfs Durch Signaltransduktion des aktivierten Thrombozyten wird auch der Rezeptor GPIIb-IIIa stimuliert. Dieser liegt auf ruhenden Plättchen in einer inaktiven Form vor. Bei Plättchenaktivierung erfolgt eine Konformationsänderung dieses Rezeptors, womit die Freilegung von Bindungsstellen für Fibrinogen und andere adhäsive Plasmaproteine einhergeht (DE GROOT u. SIXMA 1990; RUGGERI 1994; SIXMA et al. 1995; SCHARF 1996; ROSENFELD u. GRALNICK 1997). Dem GPIIb-IIIa-Rezeptor kommt bei der Aggregation zentrale Bedeutung zu. Daneben ist er auch am Spreizungsprozeß wesentlich beteiligt. Bei der Aggregation, der Koadhäsion zwischen zwei Thrombozyten, unterscheidet man zwei Phasen: die primäre und die sekundäre Aggregation. Während der primären reversiblen Phase werden die Thrombozyten über Fibrinogenbrücken locker miteinander verbunden. Die Bindung von Fibrinogen an das GPIIb-IIIa ist dabei streng abhängig von Ca2+-Ionen. Im weiteren Verlauf kommt es zu einer Degranulation der Plättchen und einer Verfestigung der Fibrinogenbindung an der Thrombozytenoberfläche (sekundäre, irreversible Aggregation) (GAWAZ 1999). Bei Aktivierung der Thrombozyten kommt es neben den genannten Veränderungen zudem zu Änderungen der Phospholipidorientierung im Bereich der Plasmamembran, welche die Anlagerung von Gerinnungsfaktoren und die Bildung eines katalytischen Prothrombinasekomplexes an der aktivierten Oberfläche (Plättchenfaktor 3) erlauben. Dieses führt zur gesteigerten Thrombinbildung in der Umgebung eines Plättchenaggregates und damit zur Konsolidierung des hämostastischen Pfropfs durch Fibrinvernetzung (GAWAZ 1999). 1.5.4. Thrombusretraktion, Auflösung des Plättchenpfropfs Während der Stabilisation des Plättchenpfropfs erfolgt durch das gebildete Thrombin neben der Polymerisierung von Fibrinogen zu Fibrin an der Außenseite der Aggregate bereits eine Retraktion des Pfropfs. Zusätzlich führt die Aktivierung von Aktomyosin in den Plättchen zu einer zentripetalen Kontraktion. So ziehen Fibrinfäden und die Aktomyosinkontraktion den Plättchenthrombus bzw. die Plättchenaggregate zusammen, und das in den Zwischenräumen befindliche Serum wird ausgepreßt. In dieser Phase wird auch der Inhalt der Lysosomen der Plättchen freigesetzt, wodurch wahrscheinlich eine limitierte Proteinverdauung einsetzt. Dies ist der erste Schritt in Richtung Transformation vom aktiven Blutstillungspfropf in den passiven Überrest, der

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im Rahmen der Gefäßwandreparatur, u.a. mit Hilfe der Fibrinolyse, beseitigt wird (HEMKER u. POLIWODA 1997). Im Rahmen der Fibrinolyse erfolgt eine weitere Auflösung des Gerinnsels durch das proteolytische Enzym Plasmin, welches aus einem inaktiven zirkulierenden Proenzym, dem Plasminogen hervorgeht (ASTRUP u. THORSEN 1972; COLLEN u. LIJNEN 1995). Die Umwandlung von Plasminogen zu Plasmin kann durch eine Vielzahl von Aktivatoren initiiert werden (ASTRUP u. THORSEN 1972). Die Aktivierung des Plasminogensystems unterliegt hierbei einer feinregulierten Steuerung, in die sowohl Endothelzellen als auch Blutplättchen eingeschaltet sind (MÜLLER-BERGHAUS 1997; OSTENDORF et al. 1997). Die Blutplättchen enthalten Plasminogenaktivatoren, können Plasminogen auf ihrer Oberfläche binden und andererseits Plasminogen-aktivator-Inhibitor und a2-Antiplasmin sezernieren, so daß an den Thrombo-zyten sowohl fibrinolysefördernde als auch -hemmende Effekte beobachtet werden können (COLLER 1990).

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2. Störungen der primären Hämostase 2.1. Thrombozytopenie Die Thrombozytopenien lassen sich entsprechend ihrer Pathogenese nach Bildungsstörungen, Verlust bzw. Umsatz- oder Verteilungsstörungen unterscheiden, wobei jeder dieser Störungen noch einmal verschiedene Ursachen zugrunde liegen können (FELDMAN et al. 1988). Eine epidemiologische Studie über 987 thrombozytopenische Hunde ergab folgende Verteilung: Bei 5 % der Hunde lag eine immunbedingte Thrombozytopenie vor (zu dieser Gruppe wurden auch Hunde mit systemischem Lupus erythematosus, Pemphigus und rheumatoider Arthritis gezählt), bei 13% eine Neoplasie-assoziierte, bei 23 % eine inflammatorisch oder infektiös bedingte Thrombo-zytopenie, 59 % zeigten Mischformen (GRINDEM et al. 1991). Zu den möglichen einer Thrombozytopenie zugrundeliegenden Infektionen zählen beim Hund neben der Ehrlichiose unter anderem auch die Leishmaniose und die Staupe (RUSSEL u. GRINDEM 2000). Zu den mit der Thrombozytopenie assoziierten Neoplasien zählen unter anderem die Leukämie, das maligne Lymphom und das multiple Myelom (MADEWELL et al. 1980; GRINDEM et al. 1994). Die immunvermittelte Thrombozytopenie muß nach SCOTT (2000) unterteilt werden in die primäre (idiopathische oder autoimmune) Form und in die sekundäre Form. Letztere kann auftreten bei systemischen autoimmunen Erkrankungen, bei Neoplasien, Infektionen oder auch nach Einnahme bestimmter Arzneimittel. Zusätzlich zur Thrombozytopenie liegt bei der sekundären Form nicht selten auch eine immunvermittelte hämolytische Anämie vor (SCOTT 2000). Zudem wurde bei der immunbedingten Thrombozytopenie (bzw. idiopathischen thrombozytopenischen Purpura) sowohl beim Hund (KRISTENSEN et al. 1994) als auch beim Menschen (HEYNS et al. 1978; STUART et al. 1981; CLANCY et al. 1992) auch ein qualitativer Defekt der Plättchen beschrieben. In der experimentellen Untersuchung von KRISTENSEN et al. (1994) wurde hierzu normales plättchenreiches Hundeplasma mit Serum bzw. Immunglobulin G von Hunden mit immunbedingter Thrombozytopenie inkubiert und die Plättchenaggregation bestimmt. Hierbei ergab sich bei der Mehrzahl der untersuchten Proben ein reduziertes Aggregationsmaximum im Vergleich mit einer Kontrollgruppe. Die Ursache der angedeuteten Plättchenfunktionsstörung sehen KRISTENSEN et al. (1994) hierbei in den zirkulierenden Antikörpern. Demgegenüber steht eine Untersuchung von HARKER und SLICHTER (1972) beim Menschen, in der bei Patienten mit chronischer immunvermittelter Thrombozytopenie, die laut LEWIS und

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MEYERS (1996) mit der des Hundes vergleichbar ist, eine Blutungszeit gemessen wurde, die für den jeweils vorliegenden Grad der Thrombozytopenie unverhältnismäßig kurz war. Dieses wurde mit dem Vorliegen einer jungen Plättchenpopulation mit verstärkter hämostastischer Kompetenz begründet (HARKER u. SLICHTER 1972). 2.2. Thrombozytopathien bei ausgewählten Erkrankungen

2.2.1. Willebrand-Erkrankung Die Willebrand-Erkrankung ist die am weitesten verbreitete erbliche Blut-stillungsstörung beim Menschen (RICK 1994). Sie besitzt unterschiedliche Ausprägungen, die mit einer qualitativen oder quantitativen Abnormalität des Willebrandfaktors einhergehen (SADLER 1994; FRESSINAUD u. MEYER 1996). Auch beim Hund ist diese Krankheit bereits in über 50 Rassen diagnostiziert worden (BROOKS 1992). Neben den erblichen Formen der Krankheit existieren sowohl beim Menschen als auch beim Hund erworbene Formen (THOMAS 1996). Da dieser Faktor unter anderem durch seine plättchenagglutinierende Eigenschaft eine entscheidende Rolle in der Hämostase spielt, wirkt sich ein Defekt des Willebrandfaktors vor allem auf die thrombozytenabhängige Blutstillung aus (MEYER u. GIRMA 1993; THOMAS 1996; RUGGERI 1997). Dieses wurde neben anderen Funktionstests in zahlreichen Untersuchungen durch Bestimmung der kapillären In-vivo-Blutungszeit sowohl beim Hund (JERGENS et al. 1987) als auch beim Menschen belegt (u.a.: HARKER u. SLICHTER 1972; WEIPPERT-KRETSCHMER et al. 1995; FRESSINAUD et al. 1996, 1997, 1998). Die Differenzierung der verschiedenen Typen des Willebrand-Syndroms erfordert die Durchführung mehrerer diagnostischer Tests. Eine Übersicht über eine Differenzierung verschiedener Typen des Willebrand-Syndroms beim Menschen anhand verschiedener Tests ist Tabelle 1 zu entnehmen.

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Tab. 1: Klassifikation des Willebrand-Syndroms (nach ZIMMERMAN u. RUGGERI 1982). diagnostische Test-

systeme Typ I Typ II A Typ II B Typ III

In-vivo-Blutungszeit verlängert verlängert verlängert verlängert

Plättchenzahl normal normal normal o. vermindert normal

F-VIII:C vermindert vermindert o. normal vermindert stark

vermindert

WF:Ag vermindert vermindert o. normal

vermindert o. normal

stark vermindert

WF:RCo vermindert stark vermindert

vermindert o. normal fehlt

Ristocetin-induz. Plättchenaggregation

vermindert o. normal

fehlt o. vermindert erhöht fehlt

Multimerstruktur normal aber

generell vermindert

Fehlen der großen und

mittleren Multimeren

Fehlen der großen

Multimeren variabel

Zweidimensionale Elektrophorese normal pathologisch pathologisch variabel

Erbgang autosomal dominant

autosomal dominant

autosomal dominant

autosomal rezessiv

F-VIII:C = Faktor-VIII:C-Aktivität; WF:Ag = Willebrandfaktor-Konzentration; WF:RCo = Ristocetin-Kofaktoraktivität; induz. = induziert

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2.2.2. Azetylsalizylsäure-induzierte Thrombozytopathie Der Effekt der beim Menschen häufig und beim Hund seltener als Thrombo-zytenaggregationshemmer eingesetzten Azetylsalizylsäure auf die Thrombo-zytenfunktion ist weitestgehend geklärt: Die Azetylsalizylsäure führt zu einer irreversiblen Azetylierung und hiermit Inaktivierung des Enzyms Zyklooxygenase (COX-I) und bewirkt so eine Hemmung des Prostaglandinstoffwechsels und damit der Thromboxanbildung (u.a.: SMITH u. WILLIS 1971; ROTH u. SIOK 1978; MAJERUS 1983; SCHRÖR 1991; GAWAZ 1999). Die dadurch entstehende Beeinträchtigung der primären Hämostase ist in zahlreichen Untersuchungen unter anderem anhand der kapillären In-vivo-Blutungszeit sowohl beim Menschen (MIELKE et al. 1969; RAJAH et al. 1978; MIELKE 1982, 1983) als auch beim Hund (THOMAS et al. 1979; JERGENS et al. 1987; NOLTE 1988a, 1994a, b, 1997) bestätigt worden. So wurde zum Beispiel in der Studie von NOLTE et al. (1994b) durch Azetylsalizylsäure experimentell bei gesunden Hunden eine thrombozyten-spezifische Blutungsneigung erzeugt und anhand der Messung der kapillären In-vivo-Blutungszeit der therapeutische Effekt verschiedener Behandlungs-möglichkeiten von thrombozytenabhängigen Hämostasestörungen überprüft. Die Untersuchungen zum Einfluß der Azetylsalizylsäure auf die In-vitro-Blutungszeit sind im Kapitel 3 angeführt.

2.2.3. Urämie Bei der Urämie wird beim Menschen (DAVIS et al. 1972; MANNUCCI et al. 1983; REMUZZI et al. 1983, 1990; DI MINNO et al. 1985; CASTILLO et al. 1986; WARE et al. 1989) wie auch beim Hund (JERGENS et al. 1987; HARRIS u. KRAWIEC 1990) regelmäßig eine Blutungsneigung (bzw. eine Verlängerung der In-vivo-Blutungszeit) beobachtet. Der Literatur sind vor allem für den Menschen eine Reihe von Faktoren zu entnehmen, die an dieser Blutungs-neigung beteiligt sein sollen wie die eventuell bestehende Thrombozytopenie, Gerinnungsfaktormängel und Plättchenfunktionsstörungen (EBERST u. BERKOWITZ 1994). Eine Plättchenfunktionsstörung wurde in mehreren Untersuchungen durch die Bestimmung der kapillären In-vivo-Blutungszeit sowohl bei urämischen Menschen (HARKER u. SLICHTER 1972; REMUZZI et al. 1977, 1978; MANNUCCI et al. 1983; DI MINNO et al. 1985; CASTILLO et al. 1986; GORDGE et al. 1988; WARE et al. 1989) als auch bei urämischen bzw. azotämischen Hunden (JERGENS et al. 1987; BRASSARD et al. 1994; BRASSARD u. MEYERS 1994) belegt. So zeigte sich zum Beispiel in einer

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Studie von JERGENS et al. (1987) bei 5 von 6 Hunden mit Urämie eine deutlich verlängerte kapilläre In-vivo-Blutungszeit. Die der Urämie-induzierten Plättchendysfunktion zugrundeliegenden Mecha-nismen sind noch nicht vollständig geklärt. In mehreren Studien ergab sich eine beeinträchtigte Plättchenadhäsion sowohl beim Menschen (TURNEY et al. 1981; CASTILLO et al. 1986; ESCOLAR et al. 1990) als auch beim Hund (BRASSARD et al. 1994). Deren Ursache ist zumindest beim Menschen nach ESCOLAR et al. (1990) in einer gestörten Interaktion zwischen dem Willebrandfaktor und dem GPIIb-IIIa-Rezeptor zu suchen. In einer experimentellen Untersuchung mit azotämischen Hunden fand sich jedoch kein Hinweis auf eine strukturelle oder funktionelle Abnormalität dieses Faktors (BRASSARD u. MEYERS 1994). Weiterhin wurde in einigen Fällen beim Menschen ein abnormaler Prostaglandinmetabolismus der Thrombozyten (REMUZZI et al. 1978, 1983; SMITH u. DUNN 1981; DI MINNO et al. 1985; JACOBSSON et al. 1985) oder auch der Endothelzellen (resultierend in einer erhöhten Prostazyklinaktivität) (REMUZZI et al. 1977) nachgewiesen. Erklärungsversuche hierfür bezogen sich bei den Thrombozyten auf einen funktionellen Defekt der Zyklooxygenase (REMUZZI et al. 1983; JACOBSSON et al. 1985) beziehungsweise auf eine Hemmung des Arachidonsäuremetabolismus durch Substanzen des urämischen Plasmas (SMITH u. DUNN 1981). Ebenfalls belegt in Untersuchungen beim Menschen wurden eine verminderte Verfügbarkeit des Plättchenfaktors 3 durch urämische Toxine wie Guanidinbernsteinsäure (HOROWITZ et al. 1967) sowie eine abweichende Kalzium-Homöostase der Plättchen (WARE et al. 1989). Auch die Retention von Harnstoff und Harnstoffmetaboliten soll zu einer Beeinträchtigung der Thrombozytenfunktion beim Menschen führen (DAVIS et al. 1972). Als weitere Mediatoren der urämischen Blutung entdeckten REMUZZI et al. (1990) das Stickstoffmonoxid und WALKOWIAK et al. (1994) Protein-Degradationsprodukte, welche die Fibrinogenbindung der Thrombozyten hemmen. REMUZZI et al. (1990) führten hierzu eine experimentelle Studie an Ratten durch, WALKOWIAK et al. (1994) fanden diese Protein-Degradationsprodukte im Plasma urämischer Menschen. Weiterhin stellten WINKELMANN et al. (1986) eine Inhibition der DNA-Replikation der Thrombozyten des Menschen unter dem Einfluß der Urämie fest. 2.2.4. Hepatopathien, portosystemischer Shunt Bei Lebererkrankungen findet sich neben einer regelmäßig verminderten Thrombozytenzahl (Mensch u.a.: TOGHILL et al. 1977; VIOLI et al. 1994;

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PEREIRA et al. 1995; Hund: MISCHKE et al. 1998b) auch eine funktionelle Beeinträchtigung der primären Hämostase. Letzteres ist aus Untersuchungen sowohl beim Menschen (MAURER u. CAUL 1972; BALLARD u. MARCUS 1976; RUBIN et al. 1979; OWEN et al. 1981; VIOLI et al. 1994) als auch beim Hund (BOWEN et al. 1988; SCHULZE 1989; WILLIS et al. 1989) zu entnehmen. Die Thrombozytenfunktionsstörung wurde in den Untersuchungen beim Menschen unter anderem anhand einer veränderten Plättchenaggregation (MAURER u. CAUL 1972; BALLARD u. MARCUS 1976; RUBIN et al. 1979; OWEN et al. 1981) sowie in den Studien von BALLARD und MARCUS (1976) und VIOLI et al. (1994) anhand einer verlängerten kapillären In-vivo-Blutungszeit belegt. In den Studien beim Hund fand ebenfalls die Plättchenaggregation Anwendung (BOWEN et al. 1988; SCHULZE 1989; WILLIS et al. 1989). In diesen Studien ergaben sich reduzierte Aggregationsmaxima mit den Agonisten Kollagen und ADP (BOWEN et al. 1988; SCHULZE 1989) bzw. mit Kollagen und Arachidonsäure (WILLIS et al. 1989). Die für die Thrombozytopathie bei Lebererkrankungen verantwortlichen Mechanismen sind noch nicht vollständig geklärt. Der Literatur sind vorwiegend für den Menschen Erklärungsversuche zu entnehmen, unter anderem ein Coating der Thrombozytenoberfläche durch Fibrin(ogen)spaltprodukte, die durch die primäre Aktivierung des fibrinolytischen Systems in einer erhöhten Konzentration vorliegen (Mensch: THOMAS et al. 1967; BALLARD u. MARCUS 1976; Hund: REAGAN u. REBAR 1995). Weiterhin wird eine veränderte Lipidzusammensetzung der Thrombozytenmembran, resultierend in einer reduzierten Arachidonsäureverfügbarkeit, als Ursache für eine Plättchen-funktionsstörung angegeben (OWEN et al. 1981). Auch die Plasma-konzentration von Bilirubin (SUVANSRI et al. 1969; MAURER u. CAUL 1972) und eine erhöhte Konzentration an Gallensäuren (BOWEN et al. 1988) werden als inhibitorische Elemente angeführt, wobei Bilirubin durch Hemmung ATP-ADP-abhängiger Systeme der Thrombozyten zu Abnormalitäten von Plättchenfunktion und -morphologie führen soll (SUVANSRI et al. 1969). Daneben sehen VIOLI et al. (1994) eine weitere mögliche Ursache für eine beeinträchtigte primäre Hämostase in der bei ihren Patienten festgestellten Hypofibrinogenämie. Auch beim portosystemischen Shunt konnte eine Beeinträchtigung der primären Hämostase festgestellt werden. So beobachteten WILLIS et al. (1989) in ihrer Studie bei Hunden mit portosystemischem Shunt eine im Vergleich mit einer Kontrollgruppe reduzierte Aggregationsneigung in vitro nach Stimulation mit Kollagen (Endkonzentration im Testansatz: 5 µg/ml) und Arachidonsäure (Endkonzentration im Testansatz: 50 µg/ml). Ebenso wies der in der Arbeit von

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SCHULZE (1998) untersuchte Hund mit portosystemischem Shunt deutlich reduzierte Aggregationsmaxima nach Stimulation mit Kollagen bzw. ADP in verschiedenen Endkonzentrationen auf. Als eine mögliche Ursache dieser Plättchenfunktionsstörung beim portosystemischen Shunt führen SHINYA et al. (1996) die bei diesem Krankheitsbild häufig vorliegende Hyperammonämie an. In ihrer Studie an Ratten ergab sich bei Blutproben von Tieren, bei denen experimentell eine Hyperammonämie erzeugt worden war, eine reduzierte Thrombin-induzierte Plättchenaggregation im Vergleich mit Blutproben von gesunden Kontrolltieren. 2.2.5. Canine Leishmaniose Das Krankheitsbild der Leishmaniose ist bei Hunden häufig verbunden mit klinischen Anzeichen einer gestörten Hämostase wie Epistaxis (FERRER 1994) und Hämaturie (BINHAZIM et al. 1992; FERRER 1994). Verantwortlich für diese Hämostasestörung könnten eine Vaskulitis (PUMAROLA et al. 1991), eine disseminierte intravasale Gerinnung (FONT et al. 1994), eine Thrombo-zytopenie (FERRER 1994) oder auch Plättchenfunktionsstörungen (MORENO et al. 1998; VALLADARES et al. 1998) sein. So belegten MORENO et al. (1998) in ihrer Studie an 26 Hunden mit Leishmaniose eine Beeinträchtigung der primären Hämostase anhand der Messung der kapillären In-vivo-Blutungszeit. Diese war bei den infizierten Hunden gegenüber der Kontrollgruppe signifikant verlängert, zudem innerhalb der Leishmaniose-Gruppe signifikant länger bei Hunden mit einer Kreatininkonzentration >1,5mg/dl gegenüber Hunden mit im Referenzbereich liegender Kreatininkonzentration. Hingegen wiesen die kapillären In-vivo-Blutungszeiten von Hunden mit hohen und Hunden mit normalen Plasma-Konzentrationen der Alanin-Amino-Transferase keine deutlichen Unterschiede auf. Keine signifikanten Unterschiede ergaben sich in der Thrombozytenzahl zwischen gesunden und erkrankten Hunden. Auch VALLADARES et al. (1998) untersuchten die Plättchenfunktion bei experimentell mit Leishmania infantum infizierten Hunden anhand der Plättchenaggregation mit Kollagen als Aggregationsinduktor, wobei sich ein deutlich reduziertes Aggregationsmaximum ergab. Als kausale Faktoren der Plättchenfunktionsstörung bei der Leishmaniose des Hundes werden die gegebenenfalls vorliegende Urämie (MORENO et al. 1998) sowie die in mehreren Studien belegte erhöhte Plasmakonzentration zirkulierender Immunkomplexe (u.a.: SLAPPENDEL 1988; LOPEZ et al. 1996) diskutiert.

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2.2.6. Leukämie Beim Menschen wie beim Hund mit Leukämie wurde neben Veränderungen der plasmatischen Gerinnung (Mensch: GRALNICK et al. 1972; FRENCH u. LILLEYMAN 1979; GUARINI et al. 1980; SPEISER et al. 1990; TÖRNEBOHM et al. 1992; TALLMAN et al. 1993; Hund: MISCHKE et al. 1998a) sehr häufig auch eine Thrombozytopenie (Mensch: GRALNICK et al. 1972; FRENCH u. LILLEYMAN 1979; Hund: MATUS et al. 1983; COUTO 1985; HENRY et al. 1996) beobachtet. Letztere wird unter anderem durch die Verdrängung der Megakaryozyten im Knochenmark und die Splenomegalie verursacht (gilt nicht bei chronischen Leukämien) (SPEISER et al. 1990; MISCHKE et al. 1998a). Darüber hinaus wurde - jedoch bislang nur beim Menschen - auch eine Beeinträchtigung der Plättchenfunktion festgestellt (PUI et al. 1982; WOODCOCK et al. 1984; MOHRI 1986; NARESH et al. 1993). So fand sich in diesen Studien bei Patienten mit akuter bzw. chronischer myeloischer Leukämie (u.a. auch akuter megakaryoblastischer Leukämie) sowie akuter lymphoblastischer Leukämie eine abnormale Plättchenaggregation und Plättchenfreisetzungsreaktion bzw. eine veränderte In-vivo-Blutungszeit. Der kausale Hintergrund dieser somit in Verbindung mit verschiedenen Leukämieformen auftretenden Plättchenfunktionsstörung ist jedoch noch nicht hinreichend geklärt. Vermutlich liegen auch hier verschiedene Ursachen zugrunde. COWAN et al. (1975) belegten in einer Untersuchung bei Patienten mit akuter bzw. chronischer myeloischer Leukämie neben verschiedenen ultrastrukturellen Veränderungen der Thrombozyten eine verminderte intrazelluläre Adeninnukleotid-Konzentration sowie eine beeinträchtigte Kollagen-induzierte Freisetzungsreaktion von Adeninnukleotiden. Ein Storage-Pool-Defekt wurde auch in anderen Studien bei Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie festgestellt (GERRARD et al. 1978; PARETI et al. 1982; MOHRI 1986). JUBELIRER et al. (1980) und PARETI et al. (1982) wiesen eine Beeinträchtigung des Arachidonsäuremetabolismus bei chronischer myeloischer Leukämie nach. Zudem wurde über das Vorkommen der erworbenen Form der Willebrand-Erkrankung bei chronischer lymphatischer bzw. myeloischer Leukämie berichtet (MANNUCCI et al. 1984; MOHRI 1986; RINDER et al. 1997). Auch beim Hund wurden in einer Studie bei experimentell durch Bestrahlung erzeugter myeloischer Leukämie morphologische Veränderungen der Thrombo-zyten beobachtet (SEED et al. 1977). So waren im peripheren Blut Riesenplättchen und Megakaryozytenfragmente nachzuweisen, von denen einige große Einschlußkörperchen und eine zentrale Vereinigung von Granula, Kanälen und Anteilen des tubulären Systems enthielten. Es sind der

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zugänglichen Literatur bislang jedoch keine Untersuchungen zu Plättchenfunktionsstörungen bei der Leukämie des Hundes zu entnehmen. 2.2.7. Malignes Lymphom Wie bei der Leukämie sind auch beim malignen Lymphom neben Veränderungen der Thrombozytenzahl (Mensch: UESUGI et al. 1997; Hund: HELFAND 1988; GRINDEM et al. 1994) Störungen der Plättchenfunktion beschrieben worden (Mensch: BERTOLINO et al. 1991; MALIK et al. 1998; Hund: MCNIEL et al. 1997; THOMAS u. ROGERS 1999). So wurde in einer Fallstudie bei einem Menschen mit Blutungssymptomatik, milder Thrombozyto-penie sowie stark beeinträchtigter Plättchenaggregation und -freisetzungs-reaktion ein Non-Hodgkin-Lymphom diagnostiziert (BERTOLINO et al. 1991). In einer anderen Fallbeschreibung eines Menschen mit Hodgkin-Lymphom wies der Patient zunächst keine Blutungssymptomatik auf. Einige Monate nach Therapieende traten jedoch spontan Ekchymosen und rektale Blutungen auf. Die erst zu diesem Zeitpunkt durchgeführten Plättchenfunktionstests ergaben eine beeinträchtigte Plättchenaggregation sowie eine verlängerte In-vivo-Blutungs-zeit (MALIK et al. 1998). Bei letztgenanntem Patienten war die lympho-proliferative Erkrankung assoziiert mit einer erworbenen Thrombasthenie. Eine weitere mögliche Ursache einer Plättchenfunktionsstörung beim Non-Hodgkin-Lymphom stellt zumindest beim Menschen das Vorliegen einer erworbenen Willebrand-Erkrankung dar, welche bei 10% der Patienten mit Non-Hodgkin-Lymphom auftreten soll (RINDER et al. 1997). Andererseits wurde bei Menschen mit verschiedenen nicht näher differenzierten hämatologischen Tumorerkrankungen auch eine erhöhte Plättchenreaktivität beobachtet (DAVIS et al. 1969). Auch beim Hund ist eine Steigerung der Plättchenaggregation und/oder Plättchensekretion bei lymphoproliferativen Erkrankungen beschrieben worden (MCNIEL et al. 1997; THOMAS u. ROGERS 1999). So ergaben sich in der Studie von THOMAS und ROGERS (1999) bei Hunden mit einem multizentrischen Lymphom mit allen verwendeten Agonisten (Plättchenaktivierender Faktor, ADP, Kollagen) deutlich höhere Aggregationsmaxima im Vergleich zur Kontrollgruppe (gesunde Hunde). In diese Untersuchung gingen 15 Hunde mit unbehandeltem multizentrischen Lymphom ein, die weder Veränderungen der Thrombozytenzahl noch klinische Anzeichen einer Blutgerinnungsstörung aufwiesen. Neben der Vollblut-aggregometrie wurde die Freisetzung von ADP aus den dichten Granula überprüft, wobei sich jedoch zwischen den Patienten und der Kontrollgruppe kein signifikanter Unterschied ergab. Ähnliche Ergebnisse (unter anderem höhere Aggregationsmaxima der Kollagen-induzierten Aggregation im

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Vergleich mit einer Kontrollgruppe gesunder Hunde) wurden für die Plättchenaggregation bei Hunden mit verschiedenen Tumorerkrankungen - darunter auch hämatologische wie das Lymphom - von MCNIEL et al. (1997) erzielt. Sie führen als mögliche Ursache dieser Hyperaggregabilität eine veränderte Lipidzusammensetzung der Plasmamembran, das Vorliegen vorwiegend junger Plättchen oder ein Ansteigen aggregationsinduzierender Faktoren im Serum an. 2.2.8. Multiples Myelom Bei dem multiplen Myelom, einer beim Menschen wie beim Hund selten auftretenden Neoplasie der Plasmazellen, wurde in Untersuchungen beim Menschen neben anderen Störungen des Gerinnungssystems auch eine beeinträchtigte Thrombozytenfunktion nachgewiesen (KASTURI u. SARAYA 1978; DI MINNO et al. 1986; ROBERT et al. 1993). Daß auch beim Hund eine Störung der primären Hämostase an der häufig beobachteten Blutungsneigung bei Myelompatienten beteiligt ist, deckten einige Studien übereinstimmend unter anderem anhand der Messung der kapillären In-vivo-Blutungszeit auf, welche gegenüber den Referenzwerten deutlich verlängert war (SHEPARD et al. 1972; HAMMER u. COUTO 1994; RUIZ DE GOPEGUI et al. 1994; MISCHKE et al. 2000). Darüber hinaus ergaben sich in diesen Untersuchungen Beein-trächtigungen der Plättchenadhäsivität (SHEPARD et al. 1972) sowie der Plättchenaggregation (reduzierte Aggregationsmaxima mit den Aggregations-induktoren ADP, Kollagen und Thrombin) (MISCHKE et al. 2000). Der kausale Hintergrund dieser Plättchenfunktionsstörungen ist noch nicht hinreichend geklärt. Eine unspezifische Anlagerung von Paraproteinen an die Thrombozytenoberfläche wird als eine mögliche Ursache angeführt (SHULL et al. 1978; MANNUCCI et al. 1984; DI MINNO et al. 1986; BICK 1992; RUIZ DE GOPEGUI et al. 1994). Aber auch Thrombozytenmembrandefekte (GEORGE u. NURDEN 1994; SCHARF 1996), eine erworbene Willebrand-Erkrankung (GLASPY 1992; RINDER et al. 1997), erworbene Speicherdefekte sowie Störungen im Arachidonsäure- (EY u. GOODNIGHT 1990) oder Glykogenmetabolismus (AGAM et al. 1977) werden diskutiert.

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3. Labormethoden zur Überprüfung der Thrombozytenfunktion Zur Analyse der Thrombozytenfunktion existieren für den Menschen eine Vielzahl von Testsystemen bzw. -verfahren, von denen viele auch beim Hund bereits in verschiedenen Untersuchungen Anwendung fanden. Die einzelnen Methoden unterscheiden sich unter anderem im Aufwand für die Probenvorbereitung oder auch in der Aussagekraft. Während einige spezifisch die Plättchenfunktion überprüfen wie zum Beispiel die Plättchenaggregation, geben andere einen Überblick über den Ablauf der gesamten Hämostase wie zum Beispiel die Thrombelastographie und die Resonanzthrombographie. Im folgenden werden einige der auch beim Hund häufiger angewendeten und der aktuellen Methoden erläutert. 3.1. Kapilläre In-vivo-Blutungszeit Mit der kapillären In-vivo-Blutungszeit ist es sowohl möglich, einen Thrombozytenmangel als auch eine Thrombozytenfunktionsstörung (bei normaler Thrombozytenzahl) zu diagnostizieren (NOLTE et al. 1994b). Seit der ersten Beschreibung (DUKE 1910) wurden zahlreiche weitere Methoden zur Bestimmung der kapillären In-vivo-Blutungszeit entwickelt, von denen heute beim Menschen das Verfahren nach Ivy modifiziert nach MIELKE et al. (1969) bevorzugt wird (WITT u. PATSCHEKE 1997; GAWAZ 1999). Die Blutungszeit umfaßt bei all diesen Methoden die Zeitspanne, in der es nach einer Hautinzision zum Blutungsstillstand kommt (GAWAZ 1999). Bei der Methode nach MIELKE et al. (1969) wird nach Anlegen einer Stauung von 40mm Hg am Oberarm mit einem entsprechenden Gerät („Template“) am Unterarm ein Schnitt von 1 mm Tiefe und 9 mm Länge gesetzt und das aus dieser Wunde austretende Blut im Abstand von 30 sec mit einem Filterpapier so lange abgesaugt, bis ein Stillstand der Blutung eingetreten ist. Modifikationen dieser Methode unterscheiden sich durch Verwendung anderer Geräte zur Durchführung der Hautinzision („Simplate I“, „Simplate II“) von der erstbeschriebenen Methode nach MIELKE et al. (1969) in erster Linie in Länge und Art des Schnittes (MIELKE 1984; WITT u. PATSCHEKE 1997). Bei einer entsprechenden subaqualen Methode wird eine Inzision am Ohrläppchen gesetzt, das Ohrläppchen in ein Wasserbad von 37°C getaucht und die Zeit bis zum Abreißen des niedersinkenden Blutfadens gemessen (WITT u. PATSCHEKE 1997). Auch für den Hund wurden verschiedene Techniken zur Bestimmung der kapillären In-vivo-Blutungszeit beschrieben, die sich unter anderem in Tiefe und Lokalisation der Inzision unterscheiden (BROOKS u. CATALFAMO 1993). Zu

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diesen Techniken zählen zum Beispiel die Bestimmung der Blutungszeit an der Mundhöhlenschleimhaut (u.a.: JERGENS et al. 1987; BROOKS u. CATALFAMO 1993; SCHERMERHORN et al. 1994) und die von NOLTE et al. (1997) beschriebene Methode. Bei letztgenanntem Verfahren wird der unsedierte Hund in Seitenlage verbracht. Nach Rasur des Punktionsgebietes, des Übergangs von behaarter Haut und Ballenhorn der seitlichen Zehe der Vordergliedmaße, wird eine Blutdruckmanschette über Radius und Ulna dieser Gliedmaße angelegt, auf das geschorene Hautareal eine hyperämisierende Salbe aufgetragen und eine Stoppuhr gestartet. Nach Ablauf von einer Minute wird die Salbe mit einem Mulltupfer entfernt und die Blutdruckmanschette mit einem Druck von 70 mmHg aufgeblasen. Nach Ablauf einer weiteren Minute erfolgt 1-3 mm oberhalb der Ballengrenze zweimalig im Abstand von ½ cm eine Punktion mit einer automatischen Blutlanzette. Bei Aufrechterhaltung der Druckverhältnisse werden die frei fließenden Blutperlen alle 15 sec vorsichtig mit einem Mulltupfer abgesaugt. Die Zeit von der Punktion bis zum vollständigen Versiegen der Blutungen wird als kapilläre In-vivo-Blutungszeit gemessen und aus den beiden sich ergebenden Werten der Mittelwert gebildet (Referenzbereich nach ADAMIK u. MISCHKE 1998: 0,75 – 2,25 min). Zur Anwendung kam diese Methode zum Beispiel in einem Blutungsmodell, an dem unterschiedliche Therapieverfahren zur Behandlung thrombozyten-abhängiger hämorrhagischer Diathesen untersucht wurden (AMMELOUNX u. NOLTE 1987; NOLTE et al. 1988a; NOLTE et al. 1994a, b). Hierbei wurde durch intravenöse Applikation von Azetylsalizylsäure bei klinisch gesunden Hunden eine Thrombozytopathie mit verlängerter kapillärer Blutungszeit und irreversibler Aggregationshemmung hervorgerufen. 3.2. Thrombozytenaggregation Zu den aggregometrischen Verfahren zur Bestimmung der Thrombozyten-funktion zählen unter anderem das turbimetrische Verfahren nach BORN (1962) und die Vollblutaggregometrie (GAWAZ 1999). Erstgenannte Methode beruht auf der photometrischen Erfassung der Trübungsabnahme im plättchenreichen Plasma nach Zusatz von aggregationsauslösenden Substanzen wie ADP, Kollagen oder Thrombin. Die Transmissionsänderung wird als Kurve aufgezeichnet (BORN 1962). Die Born-Methode fand beim Hund neben den im vorhergehenden Abschnitt bereits erwähnten Studien (NOLTE et al. 1988a, 1994a) auch in verschiedenen anderen klinischen (SCHULZE 1998) wie experimentellen (NOLTE u. MISCHKE 1995; KLEIN et al. 1999; MISCHKE u. NIMMERFALL 2000) Studien Anwendung. Letztere betrafen unter anderem die Überprüfung des

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Einflusses von Lagerungsdauer und/oder Lagerungsbedingungen auf die Qualität von Vollblut bzw. Thrombozytenkonzentraten (NOLTE u. MISCHKE 1995; KLEIN et al. 1999). Die Vollblutaggregometrie oder Impedanzmethode basiert auf der Messung von Änderungen des elektrischen Widerstandes zwischen zwei Platinelektroden infolge der Anlagerung von Thrombozyten bei Stromfluß (CARDINAL u. FLOWER 1980; GAWAZ 1999). Die Ergebnisse sind denen der optischen Messung vergleichbar (GAWAZ 1999). Auch diese Methode kam bereits in verschiedenen Untersuchungen beim Hund zum Einsatz (FORSYTHE et al. 1989; BARR et al. 1992; GRAUER et al. 1992; SCHERMERHORN et al. 1994; SOLOVIEV et al. 1999). So wurden zum Beispiel in der Studie von FORSYTHE et al. (1989) Untersuchungen zur Vollblutaggregometrie bei Hunden mit Urämie durchgeführt, in der Studie von BARR et al. (1992) wurde der Einfluß einer Sedation mit Azepromazin und darauffolgender Anästhesie auf die Thrombozytenaggregation und die Adenosintriphsophat-Freisetzung der Plättchen überprüft. 3.3. Messung der Plättchenadhäsion Zur Messung der Plättchenadhäsion sind verschiedene Techniken beschrieben worden, von denen nur wenige spezifisch die Plättchenadhäsion erfassen, die Mehrheit dagegen die Plättchenadhäsion und -aggregation bestimmt (WILLIAMS et al 1985). Bei diesen Tests wird Blut oder plättchenreiches Plasma verschiedenen Oberflächen ausgesetzt (MOOLTEN u. VROMAN 1949; ZBINDEN u. TOMLIN 1969; MASON u. GILKEY 1971; GEORGE 1972; CAZENAVE et al. 1973). Das am häufigsten verwendete Testverfahren ist der Glasperlen-Säulen-Test oder Thrombozytenretentionstest (HELLEM 1960). Der Nachteil dieser Methode gegenüber anderen Plättchenfunktionstests liegt in der schwierigen Standardisierbarkeit und der geringen Spezifität in der Erfassung einer Plättchenadhäsionsstörung (WILLIAMS et al. 1985; YARDUMIAN et al. 1986). Auch beim Hund fand dieser Plättchenfunktionstest Anwendung. So wurde in der Studie von SHEPARD et al. (1972) bei einem Hund mit Myelom neben einer verlängerten In-vivo-Blutungszeit auch eine reduzierte Plättchenadhäsion gemessen. 3.4. Resonanzthrombographie Die Resonanzthrombographie, die im erweiterten Sinn zu den Globaltests der Hämostase zählt, zeichnet ebenso wie die Thrombelastographie den gesamten

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Gerinnungsablauf in Form einer Kurve auf. Sie registriert durch einen in Orbitalbewegung schwingenden Stempel die dreidimensionale Scherbean-spruchung des Thrombus. Als Meßgröße wird der Radius der Orbitalbewegung verwandt, der vom variablen Resonanzeffekt der entstehenden elastischen Fibrinstruktur abhängt (MISCHKE 1997). Die Resonanzthrombographie stellt eine Weiterentwicklung der Thrombelastographie dar, ermöglicht eine Unter-scheidung des Effektes der Fibrinbildung und der Thrombozytenaktivität (HARTERT 1981, 1983; MISCHKE 1997) und läßt so eine gewisse Aussage über die Thrombozytenfunktion zu. In verschiedenen Arbeiten beim Menschen erwies sich die Resonanz-thrombographie grundsätzlich zur Aufdeckung von Thrombozytopenien und Thrombozytopathien sowie zur Effektivitätskontrolle einer Thrombozyten-substitution als geeignet (HILLER u. SCHAAL 1981; HILLER et al. 1982; ANDERS et al. 1985). Jedoch wurde über das Auftreten falsch negativer Ergebnisse bei einer Thrombozytenzahl = 25.000/µl berichtet (HARTERT 1983). In einer systematischen Untersuchung beim Hund (MISCHKE u. ADAMIK 1998) wurde die geringe Sensitivität der Resonanzthrombographie zum Nachweis einer Thrombozytopenie aufgedeckt. Beim Menschen führten weiterhin die Thrombasthenie und Thrombozytosen zu einem von der Norm abweichenden Kurvenbild des Resonanzthrombogramms. Keine Veränderung der Meßparameter ergab sich bei Menschen mit Thrombopathien mit defekter Aggregation oder Adhäsion (HILLER et al. 1982). Über die Aussage der Methode bei Thrombozytenfunktionsstörungen des Hundes lassen sich der zugänglichen Literatur keine Angaben entnehmen. 3.5. Durchflußzytometrie Bei der Durchflußzytometrie werden die in einer Suspension befindlichen Zellen unter Messung des Absorptionsspektrums nach Kontakt mit einem Laserstrahl einzeln analysiert. Das Streulicht und die Intensität der Fluoreszenz werden durch spezifische Photodioden registriert (GIVAN 1992; GRINDEM 1996; GAWAZ 1999). So kann die Größe und die Granularität der Plättchen sowie die Oberflächenexpression von Antigenen nach Bindung eines fluorochrom-konjugierten Antikörpers bestimmt werden (GAWAZ 1999). Diese Methode ermöglicht zum Beispiel in Verbindung mit fluorochrom-markierten, monoklonalen Antikörpern oder Substanzen die Analyse spezifischer Veränderungen der aktivierten Plättchenoberfläche. Zudem kann der aus den Plättchengranula sezernierte Inhalt, die Bindung von Liganden und der intrazelluläre Kalziumstrom nach Stimulation der Thrombozyten durch einen Agonisten quantifiziert werden (RINDER 1998; GAWAZ 1999).

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Die Durchflußzytometrie fand bereits in verschiedenen Untersuchungen zur Plättchenfunktion beim Hund Anwendung (BOUDRAUX et al. 1994, 1996a, b; PENG et al. 1994). So wurde zum Beispiel in der Studie von PENG et al. (1994) anhand der Durchflußzytometrie der Einfluß von Interleukin-6 auf die Plättchenfunktion beim Hund untersucht. Hierzu wurde durch Thrombin bzw. Plättchenaktivierenden Faktor eine Plättchenaktivierung induziert und diese anhand der Expression von P-Selektin auf der Plättchenoberfläche durch Bindung eines monoklonalen Antikörpers bestimmt. In der Untersuchung von BOUDREAUX et al. (1996a) wurde neben anderen Methoden anhand der Durchflußzytometrie die Thrombasthenie Typ I bei einem Hund diagnostiziert. Hierbei kamen verschiedene canine bzw. kreuzreagierende humane monoklonale Antikörper gegen die Plättchenglykoproteine a IIb und ß3 zur Anwendung. 3.6. Plättchenfunktionsanalysengeräte 3.6.1. Geräteaufbau Die Konstruktion des für den Routinegebrauch zur Verfügung stehenden Plättchenfunktionsanalysengerätes PFA-100 baut auf der Technik des Vorläufergerätes Thrombostat 4000 (VDG, von der Goltz, Seeon, Deutschland) auf. Das Konzept des Vorläufergerätes Thrombostat 4000 wurde von Kratzer und Born im Jahre 1985 entworfen und 1991 von von der Goltz zu einem Meßgerät weiterentwickelt (KRATZER u. BORN 1985; KRATZER et al. 1985; KUNDU et al. 1994, 1995; MAMMEN et al. 1995). Die meisten der hervorstechenden Nachteile des Thrombostat 4000 konnten bei der Konstruktion des neuen Systems behoben werden, wie z.B.:

• Das Gerät Thrombostat 4000 arbeitete mit Einweg-„Filtern“, die Kapillaren wurden jedoch mehrmals verwendet, was eine aufwendige Reinigung und Trocknung bedeutete, die bei mangelhafter Ausführung zu fehlerhaften Testergebnissen führte. Während der Bedienung und nach Beendigung des Tests kam der Benutzer in Kontakt mit der Blutprobe, was vor allem bei humanem Probenmaterial ein potentielles Gesundheitsrisiko darstellte. Das Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 arbeitet hingegen mit die Kapillare enthaltenden Einweg-Meßzellen, die nach der Messung ohne Kontakt zur Blutprobe entsorgt werden (KUNDU et al. 1995; MAMMEN et al. 1995).

• Die Patronen des Gerätes Thrombostat 4000 enthielten nur Kollagen. Eine Lösung aus Adenosin-Diphosphat (ADP), Epinephrin, Natriumchlorid

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oder Kalciumchlorid wurde vor dem Test von außen zugegeben im Gegensatz zu den Meßzellen des Plättchenfunktionsanalysengerätes PFA-100, die alle bioaktiven Bestandteile in der Membran enthalten (ALSHAMEERI u. MAMMEN 1995; KUNDU et al. 1995; MAMMEN et al. 1995).

• Insgesamt war die Benutzung des Vorläufergerätes Thrombostat 4000 sehr arbeitsintensiv und daher kostspielig, weswegen es nie als Instrument für den Routinegebrauch im Labor betrachtet wurde (KUNDU et al. 1995; MAMMEN et al. 1995).

Das Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 wurde zur In-vitro-Bestimmung der primären Hämostase in Zitratblutproben entwickelt (KUNDU et al. 1994, 1995; MAMMEN et al. 1995) und enthält folgende wichtige Bestandteile: 1. System zum Probentransport und zur Inkubation, 2. System zur Vakuumkontrolle, 3. System zur Datenverwaltung, 4. Instrumentenkontrolle und 5. System zur Zugabe der Starterlösung. Das Gerät kann im selbständigen Modus ohne Anschluß an einen externen Computer oder computergesteuert mit Hilfe der Datenmanager-Software eines externen Computers betrieben werden. Optional erhältlich ist ein Strichkodelesegerät (KUNDU et al. 1995). Abb. 1: Vereinfachte Darstellung der Funktionselemente des Plättchenfunktions-analysengerätes PFA-100 (aus: Bedienungsanleitung für PFA-100).

37

Die Meßzelle des Plättchenfunktionsanalysengerätes PFA-100 simuliert das verletzte Blutgefäß und besteht aus einem Probenreservoir und einer Kapillare, an deren Ende sich eine biologisch aktive Membran mit einer zentralen Öffnung befindet (KUNDU et al. 1994, 1995; COMP et al. 1997; CATTANEO et al. 1999b) (Abb. 1). Durch die Kapillare wird das Vollblut unter konstantem Vakuum aus dem Probenreservoir zur Membran angesaugt. Die Kapillare ahmt dabei die Durchflußbedingungen in einem Blutgefäß nach. Die Membran ist mit Kollagen und ADP bzw. bei einem zweiten Meßzellentyp mit Kollagen und Epinephrin beschichtet (KUNDU et al. 1994, 1995; CARCAO et al. 1997; FRESSINAUD et al. 1997; HEILMANN et al. 1997; RAND et al. 1998; CATTANEO et al. 1999b). Aufgrund der Stimulation mit diesen biologischen Wirkstoffen und der hohen Scherkräfte lagern sich die Thrombozyten am Rand der Membranöffnung an und aggregieren auf der Kollagenoberfläche (KUNDU et al. 1994, 1995, 1996; RAND et al. 1998). An der Bildung der Plättchenaggregate ist hierbei der Willebrandfaktor maßgeblich beteiligt, was durch elektronenmikroskopische und immunologische Untersuchungen der Aggregate belegt wurde (POUJOL et al. 1998). Der entstehende Plättchenthrombus verengt die Öffnung immer mehr, bis sie vollständig verschlossen ist (HEILMANN et al. 1997; WILMER et al. 1997; RAND et al. 1998; CATTANEO et al. 1999b). Das Analysengerät überwacht den Durchfluß des Blutes kontinuierlich. Sobald er zum Stillstand kommt, ist der Test beendet. Das Testergebnis gibt in Form der Verschlußzeit die Zeit vom ersten Membrankontakt der Probe bis zum vollständigen Membranverschluß an (KUNDU et al. 1994, 1995; CARCAO et al. 1997; FRESSINAUD et al. 1997; WILMER et al. 1997; HEILMANN et al. 1997). Neben dieser Meßgröße, welche die In-vitro-Blutungszeit darstellt, kann das Gesamtvolumen des Blutes, das während der Messung durch die Kapillare fließt, optional ausgedruckt werden (DE HAAN u. KOLDE 1996).

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Abb. 2: Schematische Darstellung der Bestandteile der Meßzellen des Plättchen-funktionsanalysengerätes PFA-100 (A-Außenansicht, B-Querschnitt) (aus: KUNDU et al. 1995). Die Meßzellen des Plättchenfunktionsanalysengerätes sind Einwegartikel. Die einteiligen Patronen bestehen aus einer Behälter/Kapillaren-Konstruktion und einem Gehäuse bzw. Probenreservoir (Abb. 2A, 2B). Die Behälter/Kapillaren-Konstruktion enthält einen Polypropylenbehälter, in den eine biologisch aktive Membranscheibe eingefügt ist. Im Zentrum der Membranscheibe befindet sich eine durch eine mechanische Präzisions-Stanzvorrichtung erzeugte Öffnung von 147 µm Durchmesser. Eine Polypropylen-Nabe, welche eine Kapillare aus rostfreiem Stahl enthält (innerer Durchmesser: 200 µm), ist durch Ultraschall am Boden des Behälters befestigt. Eine dünne Trennmembran aus Plastik, die sich am oberen Teil des Probenreservoirs befindet, verhindert den Kontakt des Blutes mit der Kapillare während der Inkubationszeit. Zu Beginn einer Bestimmung wird die Kapillare mit Hilfe des Vakuumanschlusses durch die Trennmembran in das Probenreservoir hinabgezogen. Nach der Passage durch die Öffnung sammelt sich das Abfallblut in dem Behälter; die gesamte Meßzelle wird am Ende der Bestimmung verworfen (KUNDU et al. 1995). Die biologisch aktive Membran ist eine Standard-Nitrozellulosefiltrations-membran mit einer mittleren Porengröße von 0,45 µm. Die Bluteintrittsseite der Membran ist mit 2 µg fibrillärem Kollagen Typ I aus der Pferdesehne und 10 µg Adrenalinbitartrat (Epinephrin) oder 50 µg Adenosin 5`-Diphosphat (ADP) beschichtet (KUNDU et al. 1994, 1995; RAND et al. 1998).

Behälter/Kapillaren- Konstruktion

Meßzellen-Typenbezeichnung

Proben- Einfüllöffnung

Gehäuse/Proben- Reservoir

Vakuumanschluß

Behälter/Kapillaren-Konstruktion beschichtete Membran

Kapillare

Blutprobe Gehäuse/Proben-Reservoir

A B

39

Die PFA-100-Meßzellen werden in eine Kassette eingesetzt, welche das Inkubationssystem zur Erwärmung der Probe auf 37°C vor der Analyse enthält. Die Kassette wiederum wird in ein Karussell gestellt, welches sich zu Beginn der Messung dreht und die Meßzellen so unter den Vakuumanschluß im Inneren des Geräts plaziert. Eine isotonische Standardlösung mit 0,9 % Kochsalz dient als Starterlösung, von der eine festgelegte Menge vor Beginn der Inkubationszeit an die Membran der Meßzellen abgegeben wird, um ADP oder Epinephrin in Lösung zu bringen. Am Ende des Testablaufs kehrt das Karussell in seine Ausgangsposition zurück, so daß die gebrauchten Patronen entfernt und entsorgt werden können. Die Proben können einzeln oder doppelt gemessen werden. Bei der Erhebung von Doppelwerten werden die Proben nacheinander gemessen (KUNDU et al. 1995). 3.6.2. Präanalytische Untersuchungen Der zugänglichen Literatur sind zu präanalytischen Untersuchungen mit dem Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 ausschließlich Ergebnisse für den Menschen zu entnehmen. Für den Hund liegen hierzu bislang keine Ergebnisse vor. 3.6.2.1. Geräteparameter KRETSCHMER et al. (1990) und DIETRICH et al. (1995a) untersuchten am Vorläufergerät verschiedene Variablen, welche die Meßergebnisse beim Menschen beeinflussen, und empfahlen bestimmte Standardisierungen für die Routineanwendung und Modifikationen für den speziellen Gebrauch. Geräteparameter mit statistisch signifikantem Einfluß waren der Durchmesser der Filteröffnung und der Kapillare, die Aggregationsreagenzien und ihre Konzentration, die Methode der Kapillartrocknung und der Aspirationsdruck (DIETRICH et al. 1995a). Bezüglich dieser getesteten Parameter gaben DIETRICH et al. (1995a) folgende Standardisierungsempfehlungen für den Routinegebrauch: Die Öffnung der Kollagen-beschichteten Filter sollte 150 µm, der Aspirationsdruck 40 mbar betragen. Ebenso erforderlich sei eine sorgfältige Fixation einer sauberen und trockenen Kapillare, die eine Länge von 32 mm und einen Innendurchmesser von 200 µm aufweisen sollte, und der Zusatz von 40 µl CaCl2 (2 mmol/l) oder 40 µl ADP (4 mmol/l) auf die Mitte des Filters. Zudem sollte vor der Messung eine Erwärmung der im Kühlschrank aufzubewahrenden Filter und der Blutprobe für 4 Minuten bei 37°C erfolgen (DIETRICH et al. 1995a).

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Weitere Untersuchungen am Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 wie am Vorläufergerät betrafen die Möglichkeit der aufeinanderfolgenden Bestimmung von zwei Proben im Verlauf einer Messung bei gleichzeitigem Verbringen der befüllten Meßzellen in die Meßkammern (Postion A und Position B). Im Hinblick auf eine eventuell stattfindende Sedimentation der zuletzt bestimmten Probe (Position B) führten mit Humanblut durchgeführte Studien zu unterschiedlichen Ergebnissen. Während in einer Arbeit zum Plättchen-funktionsanalysengerät PFA-100 mit der Kollagen/ADP-Meßzelle signifikante Unterschiede der Verschlußzeiten zwischen den beiden Positionen festgestellt wurden - ohne Angabe genauer Werte - (KARGER et al. 1997), zeigten sich in anderen Untersuchungen bei beiden Meßzellen keine klinisch relevanten Unterschiede (MAMMEN et al. 1995; WILMER et al. 1997; MAMMEN et al. 1998). Ein Vergleich der Meßergebnisse der beiden Kanäle des Vorläufergeräts ergab in einer anderen Untersuchung mit ADP als Primer ebenfalls keine signifikanten Unterschiede (ALSHAMEERI u. MAMMEN 1995). 3.6.2.2. Einfluß der verwendeten Probengefäße und -zusätze Vergleichende Untersuchungen beim Menschen am Plättchenfunktions-analysengerät PFA-100 zu verschiedenen Blutsammelsystemen und Antikoagulanzien ergaben im wesentlichen übereinstimmende Ergebnisse. In verschiedenen Untersuchungen führte die Verwendung des Vacutainers mit 0,129 M gepuffertem Natriumzitrat zu höheren Verschlußzeiten im Vergleich mit Vacutainern, die mit 0,105 M gepuffertem Natriumzitrat beschickt waren (MAMMEN et al. 1995; HEILMANN et al. 1997; SIO et al. 1997). So wurde in einer Studie für die Kollagen/Epinephrin-Meßzelle mit 0,105 M Natriumzitrat ein Referenzbereich von 84-153 sec (Mittelwert: 113 sec) ermittelt, mit 0,129 M Natriumzitrat hingegen ein Referenzbereich von 89-165 sec (Mittelwert: 124 sec). In der gleichen Studie wurde für die Kollagen/ADP-Meßzelle mit 0,105 M Natriumzitrat ein Referenzbereich von 61-105 sec (Mittelwert: 80 sec) erarbeitet, während dieser bei Verwendung von 0,129 M Natriumzitrat bei 66-115 sec (Mittelwert: 87 sec) lag (HEILMANN et al. 1997). Ein ganz entscheidender Unterschied zeigte sich für die Thrombozyten-funktionsanalyse bei Patienten unter Azetylsalizylsäure-Therapie. Hierbei wurde die durch Azetylsalizylsäure induzierte Hemmwirkung erheblich sensitiver erfaßt mit Blutproben, die mit 129 mmol/l gepuffertem Natriumzitrat antikoaguliert waren, im Vergleich zu Proben, denen 106 mmol/l gepufferte Natriumzitratlösung zugesetzt wurde (VON PAPE et al. 1999). Zudem ergab sich in dieser Studie in einem gemessenen Zeitintervall von < 1 Minute bis 60 Minuten nach Blutentnahme bei 3,2%igem (106 mmol Natriumzitrat/l Blut)

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Zitratblut eine zeitabhängige Verkürzung der Verschlußzeiten im Gegensatz zu weitestgehend stabilen Meßwerten bei 3,8%igem (129 mmol/l) Zitratblut. Die Verwendung der Spritzenmonovette mit 0,105 M ungepuffertem Natrium-zitrat führte im Vergleich mit anderen Blutsammelsystemen zu häufigeren Testabbrüchen (HEILMANN et al. 1997; SIO et al. 1997). 3.6.2.3. Präzisionsstudien, Reproduzierbarkeit der Ergebnisse Sowohl am Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 als auch am Vorläufer-gerät wurde in verschiedenen Untersuchungen beim Menschen eine gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse festgestellt (ALSHAMEERI u. MAMMEN 1995; MAMMEN et al. 1995; RAND et al. 1998; HARRISON et al. 1999; SESTITO et al. 1999). Hierbei ergab sich für konsekutive Messungen einer Probe am Vorläufergerät sowohl mit ADP als auch mit Epinephrin als Primer ein Variationskoeffizient von 9 % (ALSHAMEERI u. MAMMEN 1995). Am Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 lag der Variationskoeffizient bei Messungen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle < 10 % (MAMMEN et al. 1995; HARRISON et al. 1999), bei der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle < 15 % (MAMMEN et al. 1995) bzw. < 9 % (HARRISON et al. 1999). Für Messungen einer an aufeinanderfolgenden Tagen entnommenen Blutprobe jeweils eines Probanden lagen die Variationskoeffizienten für die Verschlußzeit beim Menschen bei beiden Geräten unter 13 % (ALSHAMEERI u. MAMMEN 1995; MAMMEN et al. 1995). Im Rahmen von Wiederholungsmessungen am Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 ergab sich bei der jeweils zweiten Bestimmung einer Probe keine klinisch relevante Abweichung gegenüber der ersten Bestimmung (MAMMEN et al. 1998; SESTITO et al. 1999). 3.6.2.4. Einfluß der Meßzellcharge Hinsichtlich des Einflusses der Meßzellcharge sind der Literatur wider-sprüchliche Ergebnisse zu entnehmen. Am Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 traten bei KARGER et al. (1997) im Vergleich verschiedener Meßzellchargen basierend auf Probenmaterial vom Menschen signifikante Unterschiede der Meßergebnisse auf (ohne genaue Angabe des Meßzelltyps), in anderen Untersuchungen erbrachte der Vergleich verschiedener Produktions-chargen beider Meßzellen für dieses Gerät hingegen keine nennenswerten Unterschiede (WILMER et al. 1997; MAMMEN et al. 1998; HARRISON et al. 1999). Am Vorläufergerät zeigten sich in zwei Untersuchungen am Menschen ebenfalls Unterschiede der Testergebnisse (Verwendung von ADP bzw. CaCl2

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als Startreagenz) bei Verwendung verschiedener Filterchargen (KRETSCHMER et al. 1990; ALSHAMEERI u. MAMMEN 1995). Keine deutlichen Unterschiede an diesem Gerät mit ADP bzw. CaCl2 als Primer ergaben sich jedoch in einer anderen Studie bei Verwendung von Chargen, die ab September 1990 hergestellt worden waren (DIETRICH et al. 1995b). 3.6.2.5. Einfluß der Lagerdauer der Probe vor der Messung und der Temperatur von Probe und Filter Für das Vorläufergerät wurde aus verschiedenen Untersuchungen für den Menschen die Empfehlung abgeleitet, die Messung innerhalb eines Zeitintervalls von ≥ 30 Minuten und < 3 Stunden nach Entnahme der Probe vorzunehmen. Innerhalb dieses Zeitintervalls ergaben sich keine statistisch signifikanten Unterschiede der Meßergebnisse (CaCl2 bzw. ADP-CaCl2 als Startreagenz), eine Messung außerhalb dieses Intervalls führte zu längeren Verschlußzeiten und höheren Gesamtvolumina sowie zu einer stärkeren Streuung der Ergebnisse (KRETSCHMER et al. 1990; DIETRICH et al. 1995a). In einer anderen Studie zeigte eine Lagerung der Probe über einen Zeitraum von bis zu 5 Stunden bei Raumtemperatur keinen Einfluß auf die Verschlußzeit (ohne Angabe zu verwendetem Startreagenz), eine Lagerung bei 4°C führte hingegen zu verlängerten Verschlußzeiten innerhalb dieses Zeitraumes (ALSHAMEERI u. MAMMEN 1995). Untersuchungen am Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 mit beiden Meßzelltypen belegten ebenfalls, daß Blutproben bis zu 5 Stunden gelagert werden könnten, bevor es zu bedeutenden Veränderungen der Meßwerte kommt (MAMMEN et al. 1995; SIO et al. 1997; HARRISON et al. 1999). Während MAMMEN et al. (1995) und SIO et al. (1997) hierzu keine konkreten Ergebnisse mitteilen, findet sich in der Arbeit von HARRISON et al. (1999) ausschließlich eine grafische Darstellung ohne statistischen Vergleich. Der grafischen Darstellung läßt sich entnehmen, daß die mediane Verschlußzeit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle über einen Zeitraum von 8 Stunden in einem Bereich von etwa 110-125 Sekunden lag und danach auf 130 bis über 150 Sekunden anstieg. Die medianen Verschlußzeiten der Kollagen/ADP-Meßzelle lagen während des gesamten Zeitraumes von 24 Stunden in einem Bereich von 75-100 Sekunden.

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3.6.3. Referenzbereiche, Einfluß von Geschlecht und Alter Weder für das Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 noch für das Vorläufergerät Thrombostat 4000 sind der zugänglichen Literatur Referenzbereiche für den Hund zu entnehmen. Für das Vorläufergerät wurden in verschiedenen Untersuchungen Referenzbereiche für den Menschen festgelegt (ALESKOG et al. 1995; ALSHAMEERI u. MAMMEN 1995; DIETRICH et al. 1995a; WEIPPERT-KRETSCHMER et al. 1995). Dabei lag der Referenzbereich der Verschlußzeit für ADP - abhängig von der Studie - in einem Bereich von 60-102 Sekunden (ALSHAMEERI u. MAMMEN 1995) bis 76-120 Sekunden (WEIPPERT-KRETSCHMER et al. 1995), für Epinephrin wurde ein Referenzbereich von 73-157 Sekunden ermittelt (ALSHAMEERI u. MAMMEN 1995). Die Tabellen 2 und 3 geben einen Überblick über die in verschiedenen Studien für das Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 festgelegten Referenzbereiche für die Verschlußzeit beim erwachsenen Menschen bzw. bei Kindern und Neugeborenen. Auch hier zeigte sich eine erhebliche Schwankungsbreite der jeweiligen für eine Meßzelle bestimmten Refererenzbereiche zwischen den Studien. Neugeborene wiesen im Vergleich mit Erwachsenen oder Kindern kürzere Verschlußzeiten auf. Hinsichtlich des Gesamtvolumens wurde nur in zwei Studien eine Angabe zum Referenzbereich gemacht: Bei WEIPPERT-KRETSCHMER et al. (1997) ergab sich ein Referenzbereich von 227-323 µl (Kollagen/ADP-Meßzelle) bzw. 244-412 µl (Kollagen/Epinephrin-Meßzelle), in einer anderen Studie ergab sich mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle für das Gesamtvolumen ein Referenzbereich von 326-378 µl (WIEDING et al. 1997). Bei Kindern zeigten sich zudem geringgradig unterschiedliche Referenz-bereiche bei Verwendung von Injektionsnadeln verschiedener Stärke zur Blutentnahme (Tab. 3).

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Tab. 2: Referenzbereiche für die Verschlußzeit (VZ) ermittelt mit zwei verschiedenen Meßzellen (Kollagen/ADP-Meßzelle; Kollagen/Epinephrin-Meßzelle) des Plättchenfunktionsanalysengerätes PFA-100 beim erwachsenen Menschen.

Quelle n Zitrat-konz.

(mmol/l)

Kollagen/ADP-Meßzelle VZ (sec)

Kollagen/Epin.-Meßzelle VZ (sec)

KUNDU et al. 1994

35a

28b k.A. 63-123 (Mittelwert ± 2SD)

97-188 (Mittelwert ± 2SD)

MAMMEN et al. 1995 99 129 77-133

(*) 98-185

(*)

KUNDU et al. 1996a

84a

96b k.A. 71-114 (5-95%-Intervall)

96-170 (5-95%-Intervall)

KUNDU et al. 1996b 28 129 n.u. 98-188 (*)

FRESSINAUD et al. 1996 25 k.A. 72-100

(Mittelwert ± 2SD) 96-138

(Mittelwert ± 2SD)

MÜLLER et al. 1997 k.A. k.A. 60-135

(*) 85-185

(*)

KARGER et al. 1997 115 106 61-102

(5-95%-Intervall) 82-144

(5-95%-Intervall)

WILMER et al. 1997 42 106 69-115

(5-95%-Intervall) 81-150

(5-95%-Intervall)

WEIPPERT-KRETSCHMER

et al. 1997 108 k.A. 62-118

(Mittelwert ± 2SD) 73-141

(Mittelwert ± 2SD)

SIO et al. 1997 36 129 66-115

(5-95%-Intervall) 98-165

(5-95%-Intervall)

MÜLLER et al. 1997 k.A. k.A. 60-135

(*) 85-185

(*)

45

Fortsetzung Tab. 2:

Quelle n Zitrat-konz.

(mmol/l)

Kollagen/ADP-Meßzelle VZ (sec)

Kollagen/Epin.-Meßzelle VZ (sec)

CARCAO et al. 1997 31 105 69-101

(Mittelwert ± SD) 85-127

(Mittelwert ± SD)

BORRIES et al. 1997 17 k.A. n.u. 102-150

(*)

WIEDING et al. 1997 k.A. k.A. n.u. 101-139

(*)

COMP et al. 1997 118 k.A. n.u. 93-191

(5-95%-Intervall)

HEILMANN et al. 1997 36 129 66-115

(5-95%-Intervall) 89-165

(5-95%-Intervall)

MARSHALL et al. 1997 12 k.A. n.u. 83-161

(*)

CARCAO et al. 1998 31 105 67-111

(5-95%-Intervall) 82-142

(5-95%-Intervall)

RAND et al. 1998 31 105 67-111

(5-95%-Intervall) 82-142

(5-95%-Intervall)

MAMMEN et al. 1998 206 129 72-120

(5-95%-Intervall) 94-191

(5-95%-Intervall)

POUJOL et al. 1998 31 129 71-101

(Mittelwert ± SD) 96-144

(Mittelwert ± SD)

SESTITO et al. 1999 62 106 52-148

(Min.-Max.) n.u.

ESCOLAR et al. 1999 20 129 83-91

(Mittelwert±SD) 108-118

(Mittelwert±SD)

46

Fortsetzung Tab. 2:

Quelle n Zitrat-konz.

(mmol/l)

Kollagen/ADP-Meßzelle VZ (sec)

Kollagen/Epin.-Meßzelle VZ (sec)

FAVALORO et al. 1999 18 105 66-124

(Mittelwert ± SD) 98-158

(Mittelwert ± SD)

BÖCK et al. 1999

309

105 62-100

(90%-Mittelinterv.) 82-150

(90%-Mittelinterv.)

FEURING et al. 1999 10 106 43-150

(*) 47-137

(*)

CATTANEO et al. 1999b 40 129 54-187

(*) 69-203

(*)

HOMONCIK et al. 2000 10 129 69-166

(*) 69-121

(*)

ORTEL et al. 2000 k.A. 129 71-118

(*) 94-193

(*) n = Anzahl der Probanden, Zitratkonz. = Zitratkonzentration im Probengefäß, Epin. = Epinephrin, a = Kollagen/ADP-Meßzelle, b = Kollagen/Epinephrin-Meßzelle, k.A. = keine Angabe, n.u. = nicht untersucht, * = ohne Angabe zum statistischen Verfahren, Min. = Minimum, Max. = Maximum, SD = Standardabweichung, Mittelinterv. = Mittelintervall

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Tab. 3: Referenzbereiche für die Verschlußzeit (VZ) ermittelt mit zwei verschiedenen Meßzellen (Kollagen/ADP-Meßzelle; Kollagen/Epinephrin-Meßzelle) des Plättchenfunktionsanalysengerätes PFA-100 bei Kindern und Neugeborenen.

Quelle Alters-stufe n

Kollagen/ADP-Meßzelle VZ (sec)

Kollagen/Epin.-Meßzelle VZ (sec)

7+ 77 - 101 96 - 125 CARCAO et al. 1997 (x ± SD)

Kinder

27* 76 - 103 92 - 144

27+ 77 - 112 91 - 142 Kinder

30* 70 - 110 82 - 165 RAND

et al. 1998 (5-95%-Intervall)

Neug. 17 48 - 65 61 - 108 n = Anzahl der Probanden, Epin. = Epinephrin, Neug. = Neugeborene, + = Nadelstärke 21 G, * = Nadelstärke 23 G Hinsichtlich des Einflusses von Geschlecht und Alter der Probanden auf die Verschlußzeit ergaben verschiedene Studien beim Menschen übereinstimmende Ergebnisse: Untersuchungen beim Menschen von SESTITO et al. (1999) an gesunden Probanden unterschiedlichen Geschlechts in einem Alter von 35 bis 73 Jahren ergaben weder hinsichtlich des Geschlechts noch des Alters signifikante Unterschiede in der Verschlußzeit (Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100, Kollagen/ADP-Meßzelle). Ältere Männer zeigten lediglich eine Tendenz in Richtung kürzerer Verschlußzeiten im Vergleich mit jungen Männern. Auch in anderen Studien am Menschen hatte das Geschlecht der Probanden keinen Einfluß auf die Verschlußzeiten (KARGER et al. 1997; BÖCK et al. 1999). In einer Untersuchung am Vorläufergerät (ohne Angabe zum verwendeten Primer) zu Unterschieden der primären Hämostase bei Frauen in verschiedenen Zyklusstadien ergaben sich folgende Ergebnisse: Bei älteren Frauen zeigten sich im Vergleich mit jüngeren, nichtschwangeren Frauen längere Verschlußzeiten; schwangere Frauen zeigten extrem kurze Verschlußzeiten (93,8 ± 20,5 Sekunden). Die Ergebnisse der Frauen während der proliferativen bzw. der lutealen Phase des Zyklus unterschieden sich nicht signifikant (123,2 ± 22,8 Sekunden bzw. 127,2 ± 16,0 Sekunden). Zudem wurden die Verschlußzeiten männlicher Probanden vor und nach einer Injektion von 40 mg Östrogen

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überprüft. Nach der Injektion von Östrogen trat bei diesen eine Verkürzung der Verschlußzeiten auf (vor Injektion: 88-102 Sekunden; nach Injektion: 73-89 Sekunden) (SUZUKI et al. 1995). 3.6.4. Einfluß der Thrombozytenzahl Als weitere wesentliche Einflußgröße auf die Meßergebnisse des Plättchen-funktionsanalysengerätes PFA-100 bzw. des Vorläufergerätes erwies sich die Thrombozytenzahl der Probe. Auch hier ergab sich in mehreren Untersuchungen beim Menschen mit ADP und/oder CaCl2 beziehungsweise Epinephrin als Aggregationsstimulatoren eine negative Korrelation zwischen Thrombozyten-zahl und Verschlußzeit (KRETSCHMER et al. 1993, 1994, 1995; ALESKOG et al. 1995; SÖHNGEN et al. 1995; KUNDU et al. 1996b; HARRISON et al. 1999). So wurde in einer Studie am Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 (Kollagen/Epinephrin-Meßzelle) beim Menschen der Einfluß der Thrombo-zytenzahl der Blutprobe auf die Verschlußzeit bei normaler Thrombo-zytenfunktion durch In-vitro-Variation der Thrombozytenzahl in Blutproben gesunder Probanden untersucht. Hierbei ergaben sich zunehmend längere Verschlußzeiten bei abnehmender Thrombozytenzahl. So lag der Mittelwert der Verschlußzeiten bei einer Thrombozytenzahl von 200.000/µl < 140 Sekunden und verlängerte sich auf > 150 Sekunden bei 100.000 Thrombozyten/µl und auf > 210 Sekunden bei 50.000 Plättchen/µl (KUNDU et al. 1996b). In einer ähnlichen Studie beim Menschen am Vorläufergerät mit ADP als Primer ergab sich eine deutliche Verlängerung der Verschlußzeiten bei einer Thrombo-zytenzahl < 50.000/µl (SÖHNGEN et al. 1995). Keine beziehungsweise keine statistisch signifikante Korrelation zwischen der Verschlußzeit und der Thrombozytenzahl der Probe wurde andererseits in den Studien von KARGER et al. (1997) und von SESTITO et al. (1999) gefunden. Diese Ergebnisse basierten jedoch auf Probenmaterial von gesunden Menschen. ALESKOG et al. (1995) verwendeten in ihrer Studie das Vorläufergerät (Thrombostat 4000) am Menschen zur Abschätzung des Blutungsrisikos thrombozytopenischer Patienten (Thrombozytenzahl ≤ 150.000/µl) vor chirurgischen Eingriffen. Nach Erstellung eines präoperativen Behandlungs-protokolls und Kontrolle des Therapieerfolges anhand der Verschlußzeit erfolgte die Beurteilung, welche Patienten zur Operation freigegeben werden können. Bei all diesen Patienten verliefen die Eingriffe ohne Blutungskomplikationen. Für den Hund liegen hierzu bislang keine entsprechenden Untersuchungen vor.

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3.6.4.1. Thrombozytopenie-adaptiertes Vorläufergerät Zur Abschätzung des funktionellen Potentials der primären Hämostase von Patienten mit einer Thrombozytenzahl < 50.000/µl entwickelten KRETSCHMER et al. (1993) zwei Modifikationen des Vorläufergerätes, welche in verschiedenen Studien beim Menschen Anwendung fanden (KRETSCHMER et al. 1994, 1995; HOFFMANN et al. 1996). Die Modifikation bestand hierbei neben einer Erhöhung der ADP-Konzentration in einer Reduktion des Blutflusses durch die Kapillare durch eine Verringerung des Aspirationsdruckes und eine Erhöhung des inneren Durchmessers der Kapillare bzw. durch Verwendung von Filtern mit einer schmaleren Öffnung (KRETSCHMER et al. 1995). In diesen Untersuchungen zeigte sich eine enge Korrelation zwischen der Thrombozytenzahl und der gemessenen Verschlußzeit der Blutprobe. So ergaben Berechnungen des Bestimmtheitsmaßes (r2) in der Studie von KRETSCHMER et al. (1995) bei Blutproben gesunder Probanden mit experimentell verminderter Thrombozytenzahl Werte von r2 = 0,86, bei Blutproben thrombozytopenischer Patienten von r2 = 0,65. Übereinstimmend kamen die Autoren bei diesen Untersuchungen zu dem Schluß, daß das Vorläufergerät in seiner Modifikation eine Hilfe bei der Bestimmung des thrombozytenabhängigen Blutungsrisikos thrombozytopenischer Patienten darstellt (KRETSCHMER et al. 1993, 1994, 1995; HOFFMANN et al. 1996). Darüber hinaus konnten mit dem Thrombozytopenie-adaptierten Vorläufergerät signifikante Unterschiede der Plättchenfunktion bei verschiedenen der Thrombozytopenie zugrundeliegenden Erkrankungen gezeigt werden (KRETSCHMER et al. 1994, 1995). So wiesen zum Beispiel Blutproben von Patienten mit autoimmuner Thrombozytopenie bei gleicher Thrombozytenzahl kürzere Verschlußeiten auf als Blutproben von Patienten mit Non-Hodgkin-Lymphom (KRETSCHMER et al. 1994). Bezüglich dieser funktionellen Unterschiede fanden HOFFMANN et al. (1996) in ihrer Untersuchung einen Zusammenhang mit der Glykoproteinexpression auf den Thrombozyten. Es zeigte sich eine enge negative Korrelation zwischen der Expression von GPIIIb und GPIb auf den Thrombozyten, gemessen mit der Durchflußzytometrie, und der Verschlußzeit bzw. der In-vivo-Blutungszeit. 3.6.4.2. Überprüfung der Wirkung von Thrombozytentransfusionen bzw. des therapeutischen Einsatzes von Phospholipiden In verschiedenen Untersuchungen am Vorläufergerät wurde die Möglichkeit aufgezeigt, den Transfusionserfolg von Thrombozytenkonzentraten beim Menschen anhand der Verschlußzeit vorauszusagen (HÖGMAN et al. 1993;

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KRETSCHMER et al. 1994, 1995; BÖCK et al. 1995; KRATZER et al. 1997). Nach Ansicht der Autoren dieser Studien ermöglicht die Verschlußzeit eine Einschätzung beziehungsweise Voraussage der funktionellen Kapazität transfundierter Plättchen. So ergab sich zum Beispiel in der Studie von KRATZER et al. (1997) eine enge Korrelation zwischen den Verschlußzeiten bzw. den Gesamtvolumina von Blutproben von Patienten, die eine Transfusion von Thrombozytenkonzentraten erhalten hatten, und Blutproben der thrombozytopenischen Patienten, denen ex vivo Thrombozytenkonzentrat zugesetzt worden war. Darüber hinaus wurden die Ergebnisse konventioneller Thrombozyten-funktionstests mit denen des Vorläufergerätes Thrombostat 4000 (ADP als Primer) bei der Qualitätskontrolle flüssig-gelagerter und kältekonservierter Thrombozytenkonzentrate verglichen. Es zeigte sich eine enge Korrelation zwischen den Ergebnissen der Aggregometrie, der Bestimmung der Serotoninfreisetzung bzw. der GMP-140-Expression nach Stimulation und andererseits der Verschlußzeit des Vorläufergerätes, wobei in allen Testsystemen eine Beeinträchtigung der Thrombozytenfunktion durch die Lagerung abzulesen war (BÖCK et al. 1995). In einer anderen Studie erwies sich auch das Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 als geeignet, eine Erhaltung oder Beeinträchtigung gelagerter Thrombozytenkonzentrate zu bestimmen (BORZINI et al. 1999). DIETRICH et al. (1995b) prüften anhand des Vorläufergerätes, der Thrombelastographie und der Resonanzthrombographie den therapeutischen Einsatz von Phospholipiden bei acht Patienten mit Thrombozytopenie bzw. mit verschiedenen Thrombozytopathien. Bei vier Patienten blieb die Verschlußzeit auch nach der Infusion über den Meßbereich hinaus erhöht, bei einem ergab sich nach der Infusion eine nur geringfügige Verringerung der Verschlußzeit, bei einem anderen sogar eine Verlängerung. Da bei zwei der Probanden (Schwester und Bruder) zudem nach Phospholipidgabe ein schwerer anaphylaktischer Schock aufgetreten war, führte die Studie insgesamt zu der Schlußfolgerung, daß Phospholipide keine Alternative zu Thrombozytentransfusionen darstellen. 3.6.5. Nachweis angeborener und erworbener Thrombozytenfunktions-störungen 3.6.5.1. Willebrand-Erkrankung Als Screeningverfahren im Hinblick auf die Willebrand-Erkrankung wiesen sowohl das Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 (KUNDU et al. 1994; FRESSINAUD et al. 1996, 1997, 1998; KUNDU et al. 1996a; COMP et al.

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1997; WEIPPERT-KRETSCHMER et al. 1997; CARCAO et al. 1998; MAMMEN et al. 1998; RAND et al. 1998; CATTANEO et al. 1999a; DI PAOLA et al. 1999; FAVALORO et al. 1999; HARRISON et al. 1999; DEAN et al. 2000; ORTEL et al. 2000) als auch das Vorläufergerät Thrombostat 4000 (DIETRICH et al. 1990c; ALSHAMEERI u. MAMMEN 1995; ULSHÖFER et al. 1995; WEIPPERT-KRETSCHMER et al. 1995) in verschiedenen Untersuchungen beim Menschen eine hohe Sensitivität auf. In diese Studien gingen Erwachsene und Kinder mit Willebrand-Erkrankung verschiedener Typen und Schweregrade ein. Den oben angeführten Untersuchungen sind hierbei ausschließlich Angaben zur Verschlußzeit, nicht zum Gesamtvolumen zu entnehmen. Insgesamt gesehen ergab sich dabei am Plättchenfunktions-analysengerät PFA-100 für die beiden unterschiedlichen Meßzellen dieses Systems (Kollagen/ADP-Meßzelle, Kollagen/Epinephrin-Meßzelle) eine ähnlich hohe Sensitivität. Am Vorläufergerät hingegen ergab sich in einer Studie für ADP (WEIPPERT-KRETSCHMER et al. 1995), in einer anderen für NaCl eine deutlich geringere Sensitivität als für die übrigen Primer (ALSHAMEERI u. MAMMEN 1995). Im Vergleich mit der In-vivo-Blutungszeit erwies sich die In-vitro-Blutungszeit als die sensitivere Methode in der Erfassung der Willebrand-Erkrankung (WEIPPERT-KRETSCHMER et al. 1995; FRESSINAUD et al. 1996, 1997, 1998; CATTANEO et al. 1999a; DEAN et al. 2000). Auffälligerweise wurden in einigen Untersuchungen die Patienten mit Willebrand-Erkrankung vom Typ 2N (verringerte Affinität des Willebrand-faktors zum Faktor VIII) anhand der In-vitro-Blutungszeit nicht erkannt (FRESSINAUD et al. 1996, 1997, 1998). In anderen Studien zeigten einige Patienten der Willebrand-Erkrankung Typ 1 (leichte Verringerung an funktionstüchtigem Willebrandfaktor) normale Verschlußzeiten (CATTANEO et al. 1999a; DEAN et al. 2000). Auch in der Kontrolle der Therapie mit 1-Deamino-(8-D-Arginin)-Vasopressin (DDAVP) ist das Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 geeignet. So führte in einigen Studien die DDAVP-Gabe bei den Patienten mit verschiedenen Typen der Willebrand-Erkrankung bei beiden Meßzellen zu einer Verkürzung der verlängerten Verschlußzeiten (RAND et al. 1998; CATTANEO et al. 1999a; FRESSINAUD et al. 1999). So verkürzten sich die Verschlußzeiten bei einem 4 Jahre alten Kind mit Willebrand-Erkrankung Typ 1 eine Stunde nach intravenöser DDAVP-Applikation von 156 Sekunden auf 107 Sekunden (Kollagen/ADP-Meßzelle) bzw. von 223 Sekunden auf 133 Sekunden (Kollagen/Epinephrin-Meßzelle), wobei diese verkürzten Zeiten im Referenz-bereich lagen (RAND et al. 1998). Bei Infusion verschiedener Willebrandfaktor-Konzentrate bei Patienten mit Willebrand-Erkrankung Typ 3 blieben die

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Verschlußzeiten dagegen bei beiden Meßzellen unverändert bzw. wurden nur geringfügig verkürzt (CATTANEO et al. 1999a; FRESSINAUD et al. 1999; MESKAL et al. 1999). In diesem Zusammenhang ist eine weitere Studie anzuführen, in der die Auswirkung der Willebrandfaktor-Aktivität von Faktor-VIII-Konzentraten auf die Verschlußzeit des Plättchenfunktionsanalysengerätes PFA-100 bei Willebrand-Patienten untersucht wurde. Dazu wurden Blutproben von Patienten mit Willebrand-Erkrankung Typ III mit verschiedenen Faktor-VIII-Konzentraten inkubiert und die jeweiligen Verschlußzeiten bestimmt. Hierbei konnte nur ein Einfluß von Willebrandfaktor-Multimeren mit hohem Molekulargewicht auf die Verschlußzeit festgestellt werden; Faktor-VIII-Konzentrate, die ausschließlich Willebrandfaktor mit niedrigem Molekulargewicht enthielten, hatten keinen Einfluß (CHANG et al. 1998). In einer Studie von SCHWARZ et al. (1997) über einen humanen rekombinanten Willebrandfaktor kam das Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 neben dem Menschen auch beim Hund zur Anwendung. Hierbei wurden einem Willebrand-Typ III-Patienten und einem Hund mit Willebrandfaktor-Mangel Blutproben entnommen und vor und nach Zusatz des humanen rekombinanten Willebrandfaktors die Verschlußzeiten bestimmt (keine Angabe der verwendeten Meßzelle). In beiden Fällen ergab sich eine Verkürzung der Verschlußzeiten, beim Hund von 265 Sekunden auf 177 Sekunden (Verschlußzeit eines in dieser Studie gemessenen gesunden Hundes: 140 Sekunden), beim Menschen von über 300 Sekunden auf 127 Sekunden, was im Referenzbereich lag. 3.6.5.2. Andere hereditäre Thrombozytopathien Zum Nachweis von hereditären Thrombozytenfunktionsstörungen mittels der Verschlußzeit liegen verschiedene Studien beim Menschen vor. Übereinstimmend ließen die Ergebnisse dieser Studien die Eignung des Plättchenfunktionsanalysengerätes PFA-100 bzw. des Vorläufergerätes erkennen, Plättchenfunktionsstörungen anhand einer Überschreitung des Referenzbereiches der untersuchten Meßgröße aufzudecken. Untersucht wurden hierbei unter anderem Blutproben von erwachsenen Patienten mit Thrombasthenie (MÜLLER et al. 1997; FRESSINAUD et al. 1998; MAMMEN et al. 1998; HARRISON et al. 1999), Bernard-Soulier-Syndrom (KUNDU et al. 1994; MÜLLER et al. 1997; HARRISON et al. 1999), Storage-Pool-Defekten (KUNDU et al. 1994; MÜLLER et al. 1997; FRESSINAUD et al. 1998; CATTANEO et al. 1999b; HARRISON et al. 1999), Giant-Platelet-Thombozytopathie (MÜLLER et al. 1997) und anderen Defekten der primären, Thrombozyten-bedingten Hämostase (ALSHAMEERI u. MAMMEN 1995;

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COMP et al. 1997; CATTANEO et al. 1999b; ESCOLAR et al. 1999; HARRISON et al. 1999; ORTEL et al. 2000). Hierbei war in zwei Studien bei Patienten mit Storage-Pool-Defekten bzw. Giant-Platelet-Thombozytopathie oder primären Sekretionsdefekten die Verschlußzeit nur bei der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle, nicht aber bei der Kollagen/ADP-Meßzelle deutlich verlängert (MÜLLER et al. 1997; CATTANEO et al. 1999b). Zu berücksichtigen ist, daß die in den Studien von ALSHAMEERI und MAMMEN (1995) und HARRISON et al. (1999) untersuchten Patienten mit Bernard-Soulier-Syndrom eine Anämie und/oder eine Thrombozytopenie aufwiesen. Bei den übrigen in die Untersuchung von HARRISON et al. (1999) eingegangenen Patienten sowie bei den Patienten der Studie von FRESSINAUD et al. (1998) lag der Hämatokrit über 35% und die Thrombozytenzahl über 150.000/µl. Den anderen Studien sind keine Angaben zur Thrombozytenzahl bzw. zum Hämatokrit der untersuchten Proben zu entnehmen. In eine andere Studie gingen auch Kinder mit verschiedenen erblichen Plättchenfunktionsstörungen ein. Von zwei Schwestern mit dem grauen-Plättchen-Syndrom wies nur die Blutprobe der einen verlängerte Verschluß-zeiten auf. Stark verlängerte Verschlußzeiten mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle zeigten zwei Kinder mit dichte-Granula-Mangel bei einer Thrombozytenzahl von 110.000/µl, die Verschlußzeiten der Kollagen/ADP-Meßzelle lagen dagegen im Referenzbereich (CARCAO et al. 1997). 3.6.5.3. Erworbene Thrombozytopathien In zwei weiteren Untersuchungen beim Menschen traten verlängerte Verschlußzeiten auch bei erworbenen Störungen der primären Hämostase - bei Urämie bzw. Zirrhose - auf (ALSHAMEERI u. MAMMEN 1995; ESCOLAR et al. 1999). In der Untersuchung von ESCOLAR et al. (1999) am Plättchen-funktionsanalysengerät PFA-100 lag der durchschnittliche Hämatokrit der Blutproben der urämischen bzw. zirrhotischen Patienten jedoch bei nur 0,26 l/l beziehungsweise 0,27 l/l, so daß eine Zuordnung der Ergebnisse zu einer Thrombozytenfunktionsstörung wesentlich eingeschränkt wird. So ergab eine experimentelle 5%ige Erhöhung des Hämatokrits der Blutproben bei beiden Meßzellen und beiden Patientengruppen eine deutliche Verkürzung der Verschlußzeiten, bei den zirrhotischen Patienten sogar bis in den Referenzbereich hinein. Bei den von ALSHAMEERI und MAMMEN (1995) mit dem Vorläufergerät untersuchten urämischen Blutproben erfolgte keine Angabe zum Hämatokrit bzw. zur Thrombozytenzahl der Proben. Weiterhin anzuführen ist in diesem Zusammenhang die Studie von TABUCHI et al. (1995). In dieser wurden am Vorläufergerät (Meßgröße: Gesamtvolumen)

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Blutproben von Patienten, die zu einer Koronararterienbypass-Operation anstanden, im Hinblick auf eine mögliche Beteiligung einer Thrombozyten-funktionsstörung an der nach kardiologischen Operationen auftretenden Hämostasebeeinträchtigung untersucht. Es ergab sich ein im Vergleich zur Kontrolle (Blutproben gesunder Probanden) mit simulierter Hämodilution signifikant erhöhter Anstieg des Gesamtvolumens nach Start des Bypasses. Nach einem weiteren Ansteigen während des Bypasses reduzierte sich das Gesamtvolumen nach Beendigung des Bypasses wieder. Zudem ergab sich eine signifikante positive Korrelation zwischen dem Gesamtvolumen und dem nach der Operation auftretenden Blutverlust. Zu berücksichtigen bleibt jedoch, daß keine Angaben zum Hämatokrit der Proben gemacht werden. 3.6.5.4. Erfassung einer Plättchenaktivierung In verschiedenen klinischen (WIEDING et al. 1997) bzw. experimentellen (LORETH et al. 1997) Untersuchungen beim Menschen erfolgte mit dem Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 eine Überprüfung der primären Hämostase vor dem Hintergrund einer möglichen Aktivierung. So wurde in der Studie von LORETH et al. (1997) die Veränderung der Kapazität der primären Hämostase beim Venenverschlußtest als In-vivo-Modell der Hämostaseaktivierung untersucht. Dazu wurden vor und nach einem 20minütigen Venenverschluß die Verschlußzeiten gemessen. Bei beiden Meßzelltypen ergab sich eine signifikante Verkürzung der Verschlußzeiten, bei der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle eine Verkürzung von 110 Sekunden vor dem Venenverschluß auf 82 Sekunden nach dem Venenverschluß, bei der Kollagen/ADP-Meßzelle von 81 Sekunden auf 61 Sekunden. WIEDING et al. (1997) analysierten unter anderem mit dem Plättchen-funktionsanalysengerät PFA-100 (Kollagen/Epinephrin-Meßzelle) die Plättchen-funktion von Menschen mit wiederkehrender zerebraler Ischämie (Gruppe A) im Hinblick auf eine mögliche Abschätzung des Risikos des Wiederauftretens. Dabei verglichen sie die Ergebnisse mit denen von Patienten mit einmaliger zerebraler Ischämie oder vaskulären Risikofaktoren (Gruppe B) und denen von gesunden Probanden. Die Verschlußzeiten der Patienten der Gruppe A waren hierbei deutlich kürzer und die Gesamtvolumina geringer als die der Patienten der Gruppe B bzw. die der gesunden Probanden. Parallel hierzu wies die Thrombozytenmembran dieser Patienten mehr Glycoprotein Ib auf, zudem zeigten die Plättchen ein größeres Volumen. In einer anderen Studie erfolgte eine Bewertung der Thrombozytenfunktion bei einem orthopädischen Eingriff (Hüft- bzw. Knieersatz) vor dem Hintergrund der bei solchen Operationen häufig auftretenden Thromboembolien und auch

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Blutungskomplikationen. Den Patienten wurden Blutproben vor der Operation und im Anschluß an die Operation sowie eine Woche danach abgenommen. Die Thrombozytenfunktion zeigte hierbei deutliche Veränderungen, die sich postoperativ in einer verminderten Hämostasekapazität (verlängerte Verschluß-zeiten), am 8. Tag nach der Operation in einer erhöhten Hämostasekapazität (verkürzte Verschlußzeiten) widerspiegelten. Die mit dem Plättchenfunktions-analysengerät gemessenen Verschlußzeiten korrelierten hierbei mit anderen bestimmten Parametern der Hämostasediagnostik (VON PAPE et al. 1997). 3.6.6. Einfluß von Thrombozytenfunktionshemmern und Antikoagulanzien 3.6.6.1. Azetylsalizylsäure Hinsichtlich des Einflusses von Azetylsalizylsäure auf die Verschlußzeit erbrachten die für den Menschen vorliegenden Untersuchungen überein-stimmende Ergebnisse. In allen Studien ergab sich sowohl am Plättchen-funktionsanalysengerät PFA-100 als auch am Vorläufergerät bei Verwendung von Epinephrin als Aggregationsstimulator eine Verlängerung der Verschlußzeit bzw. eine Erhöhung des Gesamtvolumens durch Azetylsalizylsäure, wobei nicht jeder Untersuchung eine Aussage über die statistische Signifikanz zu entnehmen ist (statistisch signifikant: ALSHAMEERI u. MAMMEN 1995; BÖHNER et al. 1997; BORRIES et al. 1997; MARSHALL et al. 1997; HARRISON et al. 1999; keine Aussage über statistische Signifikanz: KUNDU et al. 1994; MAMMEN et al. 1995; COMP et al. 1997; MAMMEN et al. 1998; FRANCIS et al. 1999; VON PAPE et al. 1999; HOMONCIK et al. 2000; ORTEL et al. 2000). In einer Studie wurde die Verlängerung der Verschlußzeiten als nicht signifikant gegenüber der Kontrollgruppe beschrieben (FEURING et al. 1999). Am Vorläufergerät wurde die Einnahme von Azetylsalizylsäure zudem sensitiv angezeigt bei Verwendung der Startreagenzien CaCl2 bzw. NaCl (KRETSCHMER et al. 1989; DIETRICH et al. 1990; ALSHAMEERI u. MAMMEN 1995; ULSHÖFER et al. 1995). In diesen Studien erhielten zumeist gesunde Probanden Azetylsalizylsäure (bzw. Aspirin) in einer Dosierung von 20 mg bis 1000 mg einmalig oral (KRETSCHMER et al. 1989; KUNDU et al. 1994; ALSHAMEERI u. MAMMEN 1995; MAMMEN et al. 1995; BÖHNER et al. 1997; MAMMEN et al. 1998; HARRISON et al. 1999) bzw. in einer bestimmten Dosierung über mehrere Tage (KRETSCHMER et al. 1989; MARSHALL et al. 1997). In der Studie von HOMONCIK et al. (2000) am Plättchenfunktions-analysengerät PFA-100 erhielten Menschen Azetylsalizylsäure unter anderem als intravenöse Infusion in einem Zeitintervall von 20 Minuten und einer

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Dosierung von 10 mg bis 500 mg Azetylsalizylsäure pro Intervall. Bei einem von acht Probanden verlängerte sich die mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle bestimmte Verschlußzeit auf über 300 Sekunden schon nach einer Infusion von 30 mg Azetylsalizylsäure, bei sieben von acht Probanden nach 100 mg und bei allen bei einer Injektionsdosis von 1000 mg Azetylsalizylsäure (Basalwerte: 69-166 Sekunden). In der Untersuchung von HOMONCIK et al. (2000) wurde zudem die Beeinflussung der Verschlußzeit durch In-vitro-Zusatz von Azetylsalizylsäure überprüft. Damit stellt diese Studie die bislang einzige Azetylsalizylsäure-In-vitro-Untersuchung dar. Hierbei zeigte sich nach In-vitro-Zusatz von 100 mg Azetylsalizylsäure / l Zitratblut schon nach 3 Minuten eine Verlängerung des Mittelwertes der Verschlußzeit von 117 Sekunden auf über 300 Sekunden (Kollagen/Epinephrin-Meßzelle). Bei Verwendung der Stimulatoren ADP (Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100) (BÖHNER et al. 1997; BORRIES et al. 1997; HARRISON et al. 1999; FAVALORO et al. 1999; HÉZARD et al. 2000; HOMONCIK et al. 2000) bzw. ADP und CaCl2-ADP (Vorläufergerät) (KRETSCHMER et al. 1989; ALSHAMEERI u. MAMMEN 1995) hatte Azetylsalizylsäure keinen signifikanten Einfluß auf die Verschlußzeit bzw. das Gesamtvolumen. So ergab sich zum Beispiel in der Studie von HARRISON et al. (1999) am Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 vor Verabreichung von 300 mg Aspirin an 6 gesunde Probanden ein Mittelwert der Verschlußzeiten von 80,2 Sekunden, 2 Stunden nach Verabreichung ein Mittelwert von 79,7 Sekunden. In anderen Studien zur Wirkung von Azetylsalizylsäure auf die mit der Kollagen/ADP-Meßzelle an diesem Gerät gemessenen Verschlußzeit erhielten die Probanden Azetylsalizylsäure in einer Dosierung von 100 mg bis 500 mg einmalig oral (BÖHNER et al. 1997; BORRIES et al. 1997; MAMMEN et al. 1998) bzw. 50 mg bis 200 mg täglich über mehrere Tage (HÉZARD et al. 2000; HOMONCIK et al. 2000). In der klinischen Studie von FAVALORO et al. (1999) wird keine Angabe zur eingenommenen Azetylsalizylsäuredosis gemacht. In den Studien am Vorläufergerät wurde eine Dosierung von 325 mg Azetylsalizylsäure (ALSHAMEERI u. MAMMEN 1995) bzw. 1000 mg Aspirin (KRETSCHMER et al. 1989) einmalig oral verabreicht. In der Studie von MAMMEN et al. (1998) ergaben sich bei einem geringen Anteil der Blutproben von Probanden, die Azetylsalizylsäure eingenommen hatten, mit der Kollagen/ADP-Meßzelle zwar auch über den Referenzbereich hinausgehende Verschlußzeiten, es werden jedoch keine Werte genannt. So bleibt unklar, in welchem Ausmaß diese Veränderungen vorlagen. Für den Hund sind der zugänglichen Literatur hierzu bislang keine Ergebnisse zu entnehmen.

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3.6.6.1.1. Einfluß von 1-Deamino-(8-D-Arginin)-Vasopressin auf die durch Azetylsalizylsäure verlängerte Verschlußzeit Zur Abklärung des Pathomechanismus des 1-Deamino-(8-D-Arginin)-Vasopressin (DDAVP oder Desmopressin) - abhängigen Effektes auf die durch Azetylsalizylsäure verlängerte In-vitro- bzw. In-vivo-Blutungszeit wurden beim Menschen zwei Studien mit dem Vorläufergerät Thrombostat 4000 durchgeführt (BECK et al. 1995a, b). In diesen erhielten 16 gesunde Probanden zweimalig im Abstand von 12 Stunden eine Dosis von 100 mg Azetylsalizylsäure. 24 und 32 Stunden nach der ersten ASS-Gabe wurden 0,4 µg/kg Körpergewicht DDAVP intravenös appliziert. Zu festgelegten Zeitpunkten wurden Blutproben entnommen (BECK et al. 1995a, b). Nach Verabreichung von DDAVP zeigte sich eine dreifache (1. Applikation) bzw. eineinhalbfache (2. Applikation) Erhöhung der Ristocetin-Kofaktor-Aktivität (BECK et al. 1995b). Mit CaCl2 als Primer verlängerte sich die Verschlußzeit nach Azetylsalizylsäure-Gabe bei allen Probanden über den Meßbereich hinaus (>486 Sekunden) für die gesamte Meßzeit (einschließlich der Zeit nach DDAVP-Gabe). Mit ADP als Primer verlängerte sich die Verschlußzeit nach Azetylsalizylsäure-Gabe nur geringfügig (nicht statistisch signifikant). Die DDAVP-Applikation nach 24 Stunden be-wirkte bei diesem Primer eine deutliche Verkürzung der Verschlußzeit bis weit unter den Ausgangswert. Hiernach verlängerte sich die Verschlußzeit erneut (statistisch signifikant) bis zur zweiten DDAVP-Gabe nach 32 Stunden. Diese zweite Applikation erzielte - entsprechend der geringer ausgeprägten Ristocetin-Kofaktor-Aktivität - eine weniger deutliche Verschlußzeitverkürzung verglichen mit der ersten. Einen analogen Effekt hatten die DDAVP-Applikationen auf die ebenfalls bestimmte In-vivo-Blutungszeit. Die In-vivo- und die In-vitro-Blutungszeit (Induktion mit ADP) zeigten negative Korrelationen mit der Ristocetin-Kofaktor-Aktivität mit einem Bestimmtheitsmaß (r2) von 0,97 für die In-vivo-Blutungszeit bzw. r2 = 0,99 für die In-vitro-Blutungszeit. 3.6.6.2. Sonstige Zum Einsatz von weiteren Thrombozytenfunktionshemmern und deren Einfluß auf die Verschlußzeit liegen verschiedene Untersuchungen beim Menschen sowohl mit dem Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 als auch mit dem Vorläufergerät vor. In diesen Studien fanden unter anderem verschiedene plättchenspezifische Antikörper Anwendung, wie Antikörper bzw. Antikörperfragmente gegen die Glykoproteine IIb/IIIa oder Ib (KUNDU et al. 1994, 1995, 1996b; KOTTKE-MARCHANT et al. 1997; FAVALORO et al. 1999; KOTTKE-MARCHANT et al. 1999; HÉZARD et al. 2000), zudem gegen

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den Willebrandfaktor gerichtete Antikörper (KUNDU et al. 1994, 1995, 1996b; FAVALORO et al. 1999) und Arginin-Glycin-Asparaginsäure- bzw. Arginin-Glycin-Asparaginsäure-Serin- Sequenzen beinhaltende Verbindungen (KUNDU et al. 1996b, 1995, 1997). Diese Substanzen führten zu einer Verlängerung der durch ADP oder Epinephrin induzierten Verschlußzeiten (KOTTKE-MARCHANT et al. 1997; HÉZARD et al. 2000), die teilweise konzentrations-abhängig war (KUNDU et al. 1994, 1995, 1996b, 1997). In der Studie von FAVALORO et al. (1999) führten Antikörper zur Verlängerung der Verschlußzeit, die gegen die GPIb/IX-Bindungstelle des Willebrandfaktors bzw. gegen die Willebrandfaktor-Bindungsstelle des GPIb/IX-Rezeptors gerichtet waren. Die Verwendung eines Antikörpers gegen Fibrinogen bzw. Fibronektin zeigte dagegen keine relevante Veränderung der Verschlußzeit (KUNDU et al. 1995, 1996b; FAVALORO et al. 1999). In anderen Untersuchungen wurde der Thrombozytenaggregationshemmer Ticlopidin eingesetzt. Während die Einnahme von Aspirin keinen Einfluß auf die mit der Kollagen/ADP-Meßzelle bestimmte Verschlußzeit hatte (BORRIES et al. 1997), verlängerte sie sich bei zusätzlicher Einnahme von Ticlopidin signifikant (BORRIES et al. 1997) bzw. in einer anderen Studie nur geringfügig (KOTTKE-MARCHANT et al. 1997). Weiterhin anzuführen ist in diesem Zusammenhang die Untersuchung von KRATZER et al. (1995), in der anhand der Verschlußzeit die synergistische Wirkung einiger Thrombozytenfunktion-inhibierender Arzneimittel bzw. die plättchenfunktionsbeeinträchtigende Wirkung einer fischreichen Ernährung dargestellt werden konnte. Zudem liegen sowohl beim Menschen als auch beim Hund einige Studien bezüglich des Einflusses von Heparin auf die mit dem Plättchenfunktions-analysengerät PFA-100 bzw. dem Vorläufergerät gemessene In-vitro-Blutungs-zeit vor. Hierbei wurde beim Menschen nur in einer Studie am Plättchen-funktionsanalysengerät PFA-100 eine signifikante Verlängerung der Verschluß-zeit festgestellt (ZIMMERMANN et al. 1998). In anderen Untersuchungen am Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 (KOTTKE-MARCHANT et al. 1997, 1999) bzw. am Vorläufergerät (DIETRICH et al. 1990d) wurde kein Einfluß von Heparin auf Verschlußzeit bzw. Gesamtvolumen festgestellt. Auch in den Studien beim Hund mit dem Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 konnte kein deutlicher Einfluß des Heparins auf Verschlußzeit bzw. Gesamtvolumen festgestellt werden bzw. führte Heparin erst in hoher Plasmaaktivität (= 10 Internationale Einheiten/ml unfraktioniertes bzw. = 50 Anti-Faktor-Xa-Aktivität/ml niedermolekulares Heparin) zu auffälligen Veränderungen der Verschlußzeiten (NIMMERFALL u. MISCHKE 1999; MISCHKE u. NIMMERFALL 2000).

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3.6.7. Einfluß des Hämatokrits bzw. einer Hämodilution durch Infusionslösungen Mehrere beim Menschen durchgeführte Untersuchungen zum Einfluß des Hämatokrits auf die Meßergebnisse zeigten sowohl am Plättchen-funktionsanalysengerät PFA-100 als auch am Vorläufergerät mit ADP- und/oder Epinephrin-abhängigen Testverfahren bzw. anderen Aggregationsstimulatoren eine klare negative Korrelation zwischen dem Hämatokrit der Probe und der Verschlußzeit bzw. dem Gesamtvolumen (DIETRICH et al. 1990b, d, 1995a; SÖHNGEN et al. 1995; KUNDU et al. 1996b; HARRISON et al. 1999). So führte zum Beispiel in einer Untersuchung ein Hämatokrit von 55% zu einem unmittelbaren Verschluß des Filters, während bei einem Hämatokrit < 15% bei konstanter Thrombozytenzahl (200.000/µl) keine Verschlußzeiten mehr meßbar waren (SÖHNGEN et al. 1995). Vor diesem Hintergrund wurde in einer Untersuchung am Vorläufergerät eine Modifizierung des Aspirationsdruckes beschrieben, wodurch eine vom Hämatokrit unabhängige Messung ermöglicht werden sollte (KRATZER et al. 1997). Keine beziehungsweise keine signifikante Korrelation zwischen Hämatokrit und Verschlußzeit ergab sich in anderen Untersuchungen am Plättchenfunktions-analysengerät PFA-100 beim Menschen, in welchen jedoch ausschließlich Blutproben gesunder Probanden gemessen wurden (KARGER et al. 1997; SESTITO et al. 1999). In einer anderen Studie wurde in definiert zusammengesetzten Blutproben mit unterschiedlichem Hämatokrit, aber konstanter Thrombozytenkonzentration der Einfluß von Kochsalzlösung (0,9 %), Albumin (5 %), Dextran (6 %), Gelatine (3,5 %) und Hydroxyäthylstärke (6 %) auf die primäre Hämostase des Menschen mittels des Vorläufergerätes untersucht. Alle Infusionslösungen verursachten eine Verlängerung der Verschlußzeiten in Abhängigkeit vom verwendeten Volumen, wobei Kochsalzlösung und Albumin den stärksten Effekt hatten (DIETRICH et al. 1990a, d). Für den Hund liegen bislang keine entsprechenden Ergebnisse vor.

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3.6.8. Einfluß der Leukozytenzahl Bei konstanter Thrombozytenzahl (200.000/µl) und konstantem Hämatokrit (40 %) resultierte in einer Untersuchung am Vorläufergerät beim Menschen mit ADP als Primer eine steigende Zahl mononukleärer oder polymorphnukleärer Leukozyten in einer Verkürzung der Verschlußzeiten. Leukozyten eines Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie hatten den gleichen Effekt (SÖHNGEN et al. 1995). In einer anderen Studie, die mit dem Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 mit der Kollagen/ADP-Meßzelle bei gesunden Menschen durchgeführt wurde, ergab sich keine statistisch signifikante Korrelation zwischen der Verschlußzeit und der Leukozytenzahl der Blutprobe (SESTITO et al. 1999). 3.6.9. Plasmatische Gerinnungsstörungen In einer Studie mit 62 Menschen, die an verschiedenen plasmatischen Gerinnungsstörungen ohne thrombozytären Defekt litten (Hämophilie A, Hämophilie B, Faktor XII-Mangel, Hypofibrinogenämie, Anwendung von Heparin und von Cumarinderivaten), ergab sich am Vorläufergerät keine relevante Abweichung der Verschlußzeit oder des Gesamtvolumens von den jeweiligen Referenzbereichen (DIETRICH et al. 1990c). Die überwiegende Nichtbeeinflussung der Meßergebnisse durch plasmatische Gerinnungsstörungen wird in der zugänglichen Literatur auch für das Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 beschrieben (CARCAO et al. 1998; FRESSINAUD et al. 1998; RAND et al. 1998; FAVALORO et al. 1999). So ergaben sich in einer Untersuchung für Blutproben von Personen mit Hämophilie A mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle Verschlußzeiten von 87 bis 138 Sekunden (Kontrollgruppe: 77-186 Sekunden), mit der Kollagen/ADP-Meßzelle Verschlußzeiten zwischen 63 und 119 Sekunden (Kontrollgruppe: 66-126 Sekunden). Für Blutproben von zwei Personen mit Hämophilie B ergaben sich für die Kollagen/Epinephrin-Meßzelle Verschlußzeiten von 77 und 128 Sekunden (Kontrollgruppe: 77-186 Sekunden), für die Kollagen/ADP-Meßzelle 60 und 109 Sekunden (Kontrollgruppe: 66-126 Sekunden) (FRESSINAUD et al. 1998). Auch Blutproben von Kindern mit Hämophilie wiesen normale Verschlußzeiten auf (CARCAO et al. 1998; RAND et al. 1998). Lediglich in der Studie von (HARRISON et al. 1999) am Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 ergab sich bei einem Patienten mit kongenitaler Afibrinogenämie eine geringgradig über den Referenzbereich hinausgehende Verlängerung der Verschlußzeit.

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3.6.10. Biokompatibilität TIGCHELAAR et al. (1995) führten mit dem Vorläufergerät anhand von Blutproben gesunder Probanden Biokompatibilitätstests mit verschiedenen, die Hämostase beeinflussenden Komponenten sowie mit Plasmaersatzstoffen durch. Hierbei war die Verschlußzeit des den nicht kompatiblen Materialien (wie zum Beispiel Glas) ausgesetzten Blutes nach einstündiger Inkubation deutlich erhöht. Zusätzlich wurden verschiedene Polymere sowie einige lösliche Hämostase-stimulatoren wie zum Beispiel Thrombin oder ADP direkt auf den Kollagenfilter der Meßzelle appliziert. Die verschiedenen Reagenzien führten zu einer unterschiedlich stark ausgeprägten Verkürzung der Verschlußzeiten.

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C. Untersuchungsgut, Material und Methodik 1. Material 1.1. Geräte und Bezugsquellen Heinrich Amelung GmbH, Lemgo § Koagulometer nach Schnitger und Gross Beckman Instruments GmbH, München § GPKR Zentrifuge, Kühlzentrifuge DADE-Behring Vertriebs-GmbH, Schwalbach § PFA-100™, Analysengerät für Thrombozytenfunktionstests Erka GmbH, Bad Tölz § Erkameter, Blutdruckmeßgerät (Nr. 218087) mit Kindermanschette Andreas Hettich GmbH, Tuttlingen § HETTICH Zentrifuge EBA 12, Zentrifuge LAbor, Laborgeräte+Analysensysteme Vertriebsgesellschaft mbH, Ahrensburg § Automated Platelet Aggregation and Coagulation Tracer APACT mit Printer

Plotter, Plättchenaggregationsmeßgerät Laboratory Centrifuges GmbH, Osterode § Sigma 113, Laborzentrifuge Roche Diagnostics GmbH, Mannheim § SoftclixII, Stechhilfe § Hitachi 704, Analysenautomat für die klinische Chemie Sysmex Medical Electronics GmbH, Norderstedt § Sysmex Microcellcounter F-800 mit Sysmex Auto-Diluter AD-260,

automatisches Zellzählgerät mit Verdünnungseinheit

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1.2. Reagenzien, Arzneimittel, Abkürzungen und Bezugsquellen

Bayer Vital GmbH, Leverkusen § Aspisol, Lösung zur intravenösen oder intramuskulären Injektion,

5 Flaschen mit je 1 g Trockensubstanz und 5 Ampullen mit je 5 ml Wasser für Injektionszwecke

DADE Behring Vertriebs-GmbH, Schwalbach § Pathromtin®, Aktivatorreagenz für die aktivierte partielle Thrombo-

plastinzeit § Diethylbarbiturat-Acetat-Pufferlösung § Thromborel®S, Aktivatorreagenz für die Prothrombinzeit Zubehör für das Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100®: § DADE®PFA Meßzelle Kollagen/ADP, B-4170-21 § DADE®PFA Meßzelle Kollagen/Epinephrin, B4170-20 § DADEPFA Startlösung, B-4170-50 Ferring Arzneimittel GmbH, Kiel § Minirin®, 1-Deamino-(8-D-Arginin)-Vasopressin (DDAVP oder Desmo-

pressin), Analogon des antidiuretischen Hormons (ADH), 5 Ampullen à 1ml (4µg)

Fresenius AG, Bad Homburg § Isotone Kochsalzlösung (NaCl) 0,9 % (Glasampullen zu 2 ml) § Ampuwa®, destilliertes Wasser Haemochrom Diagnostika GmbH, Essen § Fibrinogen, Plasminogen frei, 1,0 g NYCOMED Arzneimittel GmbH, Ismaning b. München § Kollagenreagenz Horm® mit SKF Horm® Puffer, Plättchenaggre-

gationsstimulator

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Roche Diagnostics GmbH, Mannheim § Natriumzitratlösung 0,11 mol/l § Kalciumchlorid (CaCl2)-Lösung 0,025 mol/l § “Calibrator for automated systems”, humanes Universalkalibrationsserum § Precinorm® U, humanes Universalkontrollserum § STA LIA vWF, Test zur automatisierten Bestimmung des Willebrandfaktors § STA®Faktor VIII, Mangelplasma für Einzelfaktorbestimmung Systempackungen für den Analysenautomaten Hitachi 704: § Albumin; Bromcresolgrün-Methode § Alkalische Phosphatase; Optimierte Standard-Methode der Deutschen

Gesellschaft für Klinische Chemie § ALT; UV-Test zur Messung der Aktivität der Alanin-Amino-Transferase § Bilirubin; DPD-Methode für die Bestimmung des Gesamt-Bilirubin § CREA; Kinetischer UV-Test zur Messung des Kreatiningehalts § GLDH aktiviert; Optimierte Standard-Methode der Deutschen Gesellschaft

für Klinische Chemie, UV-Test zur Messung der Aktivität der Glutamat-Dehydrogenase

§ Gesamt-Eiweiß (TP); Biuret-Methode § Harnstoff; Kinetischer UV-Test Sigma Diagnostics GmbH, Deisenhofen § ADP-Reagenz (Katalog Nr. 885-3), Plättchenaggregationsstimulator 1.3. Verbrauchsmaterial und Bezugsquellen BRAND PLASTIBRAND® GmbH & Co, Wertheim § Transferpipette® 5-50 µl, Kolbenhubpipette § Transferpipette® 100-1000µl, Kolbenhubpipette § Pipettenspitzen, variabel Braun Melsungen AG, Melsungen § Einmal-Injektions-Kanülen, 1,1 x 30 mm, (19 G x 1 ¼ ‘‘)

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DADE-Behring Vertriebs-GmbH, Schwalbach Zubehör für das Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100: § DADEPFA Druckpapier, B-4170-71 § DADEPFA Farbband, B-4170-72 § DADEPFA O-Ring-Reinigungspads, B-4170-73 § DADEPFA Initialisierungszellen, B-4170-74 § DADEPFA Vakuum-Meßzelleinsatz, B-4170-75 Eppendorf-Netheler-Hinz-GmbH, Hamburg § Eppendorf-Reaktionsgefäße 3810 § Pipette 4700, 10 µl LAbor, Laborgeräte+Analysensysteme Vetriebsgesellschaft mbH, Ahrensburg § Mikroküvetten und Mikromixer für APACT-Aggregometer § Thermopapier für APACT-Printer Plotter

Roche Diagnostics GmbH, Mannheim § Softclix®II Lancet 21 G, 0,8mm, 200 sterile Lanzetten Art. Nr. 1623460,

Lanzetten zur Kapillarblutgewinnung als Zubehör zum automatischen Blut-lanzettenschnapper

Sarstedt AG + Co., Nümbrecht § 1,3 ml Mikroprobengefäße mit Kalium-EDTA § 1,3 ml Mikroprobengefäße mit Lithium-Heparinat (15 I.E./ml) § S-Monovette, 2,9 ml, Probengefäß mit Zitronensäure-Natriumzitrat-Puffer

(pH 5,5, 0,129 mol/l Zitrat) § Graduierte Polyethylenzentrifugenröhrchen 10 ml § Plastikstopfen, farblos Sysmex Medical Electronics GmbH, Norderstedt § Quicklyser-II®, Hämolyselösung zur Leukozytenzählung Thomae GmbH, Biberach an der Riss § Finalgon®, extra stark, Reg. Nr. F 772, hyperämisierende Salbe

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2. Untersuchungsgut 2.1. Klinisch gesunde Hunde Für die verschiedenen Untersuchungen (Ermittlung der Referenzbereiche, Chargen- bzw. Präzisionsprüfung, Überprüfung des Einflusses eines verminderten Hämatokrits, Kontrolle der Azetylsalizylsäurewirkung auf die Thrombozytenfunktion in vitro) wurde Blut von klinisch gesunden Hunden verschiedener Rassen und Geschlechter entnommen (Tab. 20, tab. Anhang), die ein ungestörtes Allgemeinbefinden zeigten und denen mindestens 12 Stunden zuvor das Futter entzogen worden war. Hierbei fanden nur Tiere Berücksichtigung, die ein unauffälliges Blutbild und im Referenzbereich liegende Ergebnisse folgender Meßgrößen aufwiesen: Albumin-, Gesamteiweiß-, Harnstoff-, Kreatinin- und Gesamtbilirubinkonzentration sowie Aktivität der Leberenzyme Alkalische Phosphatase, Alanin-Amino-Transferase und Glutamat-Dehydro-genase. Um eine ungestörte Plättchenfunktion zu gewährleisten, wurde zudem die Plättchenaggregation gemessen. Hierbei wurden nur Proben berücksichtigt, deren Meßergebnis sich ebenfalls im laborinternen Referenzbereich befand. Für die In-vivo-Untersuchung der Azetylsalizylsäurewirkung auf die Thrombozytenfunktion standen klinisch gesunde Beagles der Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Verfügung (3 Rüden, 7 Hündinnen). 2.2. Patienten Weiterhin wurden Hunde mit unterschiedlichen Erkrankungen in die Untersuchungen mit einbezogen, die zum Teil stationär in die Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover aufgenommen wurden. Zu diesen Erkrankungen zählten:

• Willebrand-Erkrankung (n=2) • Urämie (n=10) • Hepatopathien (n=9): Leberzirrhose mit Kupferspeicherung (n=2),

Hepatose (n=2), degenerative Hepatopathie (n=3), Tumormetastasen in der Leber (n=1), Hepatitis (n=1)

• portosystemischer Shunt (n=10) • Leishmaniose (n=12)

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• akute lymphatische Leukämie (n=7) • chronische lymphatische Leukämie (n=4) • malignes Lymphom (n=9) • multiples Myelom (n=4) • Cumarinvergiftung (n=8) • Hämophilie A (n=3)

Zudem gingen Hunde in diese Untersuchung ein, die eine Hyperfibrinolyse infolge metastasierenden Karzinoms aufwiesen (n=8). Weiterhin wurden 65 Proben von 54 Hunden mit Thrombozytopenien (Thrombozytenzahl < 150.000/µl) unterschiedlicher Ursache untersucht. Aufgrund des deutlichen Einflusses des Hämatokrits flossen hiervon nur 39 Proben von 32 Hunden mit einem Hämatokrit > 30 % in die Auswertung ein. 2.2.1. Thrombozytopenien Die Patienten dieser Gruppe wiesen eine Thrombozytopenie unterschiedlichen Schweregrades auf (Median: 29 x103/µl; Minimum: 3 x103/µl; Maximum: 134 x103/µl) (Tab. 33, tab. Anhang). Zugrundeliegende Erkrankungen dieser Thrombozytopenien waren unter anderem die immunvermittelte Thrombo-zytopenie (13 Proben von 7 Hunden) und/oder die Ehrlichiose (7 Proben von 3 Hunden). Alle Patienten wiesen keine wesentlich veränderte aktivierte partielle Thromboplastinzeit bzw. Prothrombinzeit auf (Tab. 33). Der Verlauf eines Hundes mit immunvermittelter Thrombozytopenie, der mit Prednisolon (5 mg/kg Körpergewicht) behandelt wurde, wird beispielhaft beschrieben. Rasse, Geschlecht und Alter der Hunde dieser Gruppe sind im tabellarischen Anhang aufgeführt (Tab. 32, tab. Anhang). 2.2.2. Willebrand-Erkrankung Die Diagnosestellung der Willebrand-Erkrankung erfolgte anhand der Bestimmung der Willebrandfaktor-Konzentration am Hitachi 704 mit einem turbimetrischen Verfahren mit Hundepool als Standard. Die Konzentration des Willebrandfaktors lag bei dem ersten Patienten (Dobermann, weiblich, 1 Jahr) bei beiden Messungen < 25 %, bei dem zweiten (Labrador, weiblich, 6 Monate) unter 6 %.

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2.2.3. Urämie Die Gruppe der urämischen bzw. azotämischen Hunde bestand aus drei weiblichen Berner Sennenhunden, vier Golden Retrievern (2 männlich, 2 weiblich), zwei deutschen Schäferhunden (1 männlich, 1 weiblich) und einem weiblichen Hovawart. Das mittlere (Median) Alter betrug 5 Jahre (3-10, Minimum-Maximum), das mittlere Gewicht 28 kg (22-37 kg). Von zwei Fällen, in denen eine pathologisch-histologische Untersuchung der Nieren erfolgte (Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover), lag in dem einen Fall (Tab. 11: Nr. 5) eine hochgradige Glomerulopathie vor, in dem anderen (Tab. 11: Nr. 4) eine Nephropathie, die lichtmikroskopisch in der HE- und PAS-Färbung dem Bild einer mesangiokapillären Glomerulonephritis entsprach. Die mittlere (Median) Kreatininkonzentration betrug 5,61 mg/dl (2,6-12,07 mg/dl, Minimum-Maximum), die mittlere Harnstoffkonzentration 211,5 mg/dl (106-553 mg/dl). Die Albuminkonzentration lag im Mittel bei 1,94 mg/dl (0,94-3,17 mg/dl) (Tab. 43, tab. Anhang). 2.2.4. Hepatopathien, Ikterus Die Gruppe der Hunde mit Hepatopathien umfaßte zwei Hunde mit Leberzirrhose mit Kupferspeicherung, zwei Hunde mit Hepatose, drei mit degenerativer Hepatopathie, einen Hund mit Tumormetastasen in der Leber sowie einen Hund mit Hepatitis. Die pathologisch-histologischen Untersuchungen der Patienten erfolgten im Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover und/oder im Institut für Veterinärpathologie der Universität Leipzig. Die Aktivität der Leberenzyme war bei jeweils acht Hunden mehr oder weniger deutlich erhöht (Tab. 45, tab. Anhang). Vier dieser Patienten zeigten einen ausgeprägten Ikterus (Gesamtbilirubin > 10 mg/dl) (Tab. 12: Patient Nr. 2a, 3b, 3c, 5). In die Gruppe der Hunde mit Ikterus ging zusätzlich ein weiterer Hund mit einem Gesamtbilirubinwert von 35 mg/dl (Dobermann, weiblich, 3 Jahre) ein, zu dem keine Pathologie vorlag. 2.2.5. Portosystemischer Shunt Die untersuchten Patienten mit portosystemischem Shunt waren Hunde beiderlei Geschlechts (3 männlich, 7 weiblich) folgender Rassen: Berner Sennenhund (n=2), Mischling (n=2), Irischer Wolfshund (n=2), Nova Scotia Duck Tolling Retriever, Elchhund, Hovawart und Labrador. Das mittlere (Median) Alter

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betrug 5 Monate (3-22 Monate, Minimum-Maximum), das mittlere Gewicht 12 kg (3-31 kg). Das Vorliegen eines Shuntgefäßes wurde bei den untersuchten zehn Hunden mittels positivem Ammoniak-Belastungstest, Angiographie, Dopplersono-graphie, Szintigraphie und/oder pathologischer Untersuchung (Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover) diagnostiziert. Die Einzelmeßwerte der eingeleiteten Laboruntersuchungen dieser Hunde sind im tabellarischen Anhang aufgeführt (Tab. 47). Die Aktivität der Leberenzyme Alanin-Amino-Transferase und Glutamat-Dehydrogenase lag bei den Hunden überwiegend im Referenzbereich, die Aktivität der Alkalischen Phosphatase war bei den meisten erhöht (Tab. 47). Die Blutentnahmen für die eigenen Untersuchungen erfolgten jeweils vor einer gegebenenfalls erfolgten chirurgischen Therapie. 2.2.6. Leishmaniose Die Gruppe der Hunde mit Leishmaniose (n=12) setzte sich aus Mischlingen (n=7) sowie je einem Hund folgender Rassen zusammen: Akita Inu, Labrador, Dobermann, Rottweiler, Deutsche Dogge. Diese Patientengruppe umfaßte 8 Rüden und 4 Hündinnen mit einem mittleren (Median) Alter von 4 Jahren (2-8 Jahre, Minimum-Maximum) und einem mittleren (Median) Gewicht von 26 kg (6-62 kg, Minimum-Maximum). Die Diagnosestellung erfolgte durch direkten Erregernachweis im zytologischen Lymphknoten- und Knochenmarkpräparat. Zur Bestimmung des Leishmaniose-Antikörpertiters wurde bei allen Patienten eine serologische Untersuchung eingeleitet. Mittels indirektem Fluoreszenz-Antikörpertest wurde hierbei ein positiver Antikörpertiter gegen Leishmania infantum (donovani) ermittelt (Institut für vergleichende Tropenmedizin und Parasitologie, Ludwig-Maximilian-Universität, München, Prof. Dr. R. Gothe). Unter den Laborwerten war die in 10 von 11 Fällen vorliegende Hyperproteinämie besonders auffällig. Der mittlere (Median) Gesamt-eiweißgehalt der Blutproben betrug 9,02 g/dl (Minimum: 4,85 g/dl; Maximum: 12,18 g/dl) (Tab. 49, tab. Anhang). Die Messungen erfolgten vor einer Therapie. 2.2.7. Akute lymphatische Leukämie Es wurden sieben nicht vorbehandelte Hunde mit akuter lymphatischer Leukämie untersucht. Diese Patientengruppe umfaßte Hunde beiderlei Geschlechts (5 männlich, 2 weiblich), verschiedener Rassen (Mischlinge (n=3), je ein Labrador, Weimaraner, Beagle, Deutscher Schäferhund); das mittlere

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(Median) Alter lag bei 4 Jahren (2-10 Jahre, Minimum-Maximum), das mittlere Gewicht bei 31 kg (14-37 kg). Die Diagnosestellung erfolgte anhand von zytologischen Knochenmark-aspirationspräparaten beziehungsweise Blutausstrichen nach zytomorpho-logischen, zytochemischen und immunzytologischen Kriterien (JAIN et al. 1991). Der Blastenanteil im Knochenmark lag bei den sieben Patienten > 60 % unter weitestgehender Verdrängung der physiologischen Hämatopoese. Die Leukozytenzahl im Blut lag bei diesen Patienten zwischen 11.000/µl und 750.000/µl (Minimum-Maximum) mit einem Median von 15.000/µl (Tab. 50). 2.2.8. Chronische lymphatische Leukämie Die vier in diese Arbeit eingegangenen Hunde mit chronischer lymphatischer Leukämie waren ein Berner Sennenhund (weiblich, 8 Jahre, 41 kg), ein Staffordshire Bull Terrier (weiblich, 2 Jahre, 20 kg) und zwei männliche Mischlinge (4 Jahre, 29 kg bzw. 12 Jahre, 30 kg). Die Diagnosestellung bei den in dieser Arbeit untersuchten vier Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie erfolgte anhand der charakteristischen hochgradigen Vermehrung der Lymphozyten im Blutbild. Bei allen Patienten lag eine deutliche Leukozytose vor (68.600/µl, 117.000/µl, 122.700/µl und 131.000/µl), die nahezu ausschließlich auf Lymphozyten beruhte. Bei drei von drei untersuchten Hunden zeigte sich eine deutliche Tumorzellinfiltration im Knochenmark, eine zusätzliche Leberinfiltration bestand bei zwei von zwei untersuchten Tieren. Die Blutenentahme erfolgte jeweils vor einer Therapie. 2.2.9. Malignes Lymphom Die untersuchten Hunde mit hochmalignem Lymphom setzten sich aus einem weiblichen Groenendael, einem weiblichen Briard, einem männlichen Collie, einer weiblichen Deutschen Wachtel, drei Neufundländern (2 männlich, 1 weiblich) und zwei männlichen Dobermännern zusammen. Das mittlere (Median) Alter betrug 6 Jahre (4-12 Jahre, Minimum-Maximum), das mittlere Gewicht 35 kg (7-52 kg). Bei allen neun in diese Arbeit eingegangenen Patienten war palpatorisch bzw. röntgenologisch und/oder sonographisch eine Vergrößerung verschiedener Lymphknoten und/oder Leber und Milz festzustellen. Die zytologische Untersuchung der vergrößerten Lymphknoten bzw. veränderter Organbezirke ergab einen hohen Anteil blastärer, lymphoider Zellen. Die Messungen erfolgten vor einer Therapie.

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2.2.10. Multiples Myelom Die vier in diese Studie eingegangenen Hunde mit multiplem Myelom waren ein männlicher Mischling (14 Jahre), ein männlicher Großpudel (10 Jahre) sowie zwei weibliche Berner Sennenhunde (9 Jahre und 11 Jahre). Die Patienten zeigten eine hochgradige Plasmazellinfiltration im Knochenmark (> 20 % der kernhaltigen Zellen). Zudem war bei allen vier Patienten der Gesamteiweißgehalt im Blut erhöht (> 12 g/dl), was in allen Fällen mittels Serumelektrophorese auf eine monoklonale Gammopathie zurückgeführt werden konnte. 2.2.11. Hyperfibrinolyse Die Patienten dieser Gruppe setzten sich zusammen aus zwei Mischlingshündinnen, zwei Dobermann-Hündinnen, einem männlichen West Highland White Terrier sowie jeweils einer Hündin folgender Rassen: Irish Setter, Deutsch Drahthaar, Deutscher Schäferhund. Das mittlere (Median) Alter betrug 9 Jahre (6-15 Jahre, Minimum-Maximum), das mittlere Gewicht 25 kg (9-38 kg). Alle untersuchten Hunde zeigten anhand der Meßergebnisse von Fibrinogenkonzentration (deutlich vermindert), Thrombinzeit (deutlich verlängert) und Fibrinogenspaltproduktkonzentration (deutlich erhöht) (Ergebnisse nicht dargestellt) eine ausgeprägte Hyperfibrinolyse infolge eines metastasierenden Karzinoms. 2.2.12. Cumarinvergiftung Die Patienten mit Cumarinvergiftung umfaßten drei Mischlingshündinnen, zwei Teckel-Hündinnen, einen weiblichen Boxer, einen männlichen Deutschen Schäferhund und eine weibliche Bordeaux-Dogge. Das mittlere (Median) Alter betrug 3 Jahre (5 Monate - 11 Jahre, Minimum-Maximum), das mittlere Gewicht 21 kg (6-38 kg). Die Diagnose der Cumarinvergiftung wurde gestellt anhand der typischen Befundkombination der Gruppentests des Gerinnungssystems (deutlich verlängerte Prothrombinzeit und aktivierte partielle Thromboplastinzeit bei normaler Thrombinzeit) (Tab. 54, tab. Anhang). Eine rasche Besserung des Gerinnungsstatus nach Vitamin-K1-Therapie bestätigte in allen Fällen die Diagnose. Die Messungen der In-vitro-Blutungszeit erfolgten vor Therapie.

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2.2.13. Hämophilie A Die Patienten dieser Gruppe waren drei männliche Deutsche Schäferhunde (3, 4 und 10 Jahre). Die Messungen erfolgten vor einer Therapie. Die Diagnosestellung der Hämophilie A erfolgte anhand der isoliert verminderten Faktor VIII:C-Aktivität, welche bei diesen drei Patienten bei 8 %, 10 % und 25 % lag (Tab. 55, tab. Anhang). 3. Probengewinnung und -behandlung 3.1. Blutentnahme Die Blutentnahme erfolgte aus der Vena cephalica oder der Vena saphena mit sterilen Einmal-Injektions-Kanülen (1,1 × 30 mm) am stehenden Hund. Dabei wurden die betreffenden Gefäße nicht oder nur kurzzeitig leicht gestaut. Nach Verwerfung der ersten Blutstropfen wurde das frei nachfließende Blut in mit Antikoagulanz beschickten Probengefäßen aufgefangen. Dies betraf für die Untersuchung der kapillären In-vitro-Blutungszeit eine mit Zitronensäure-Natriumzitrat-Puffer (0,129 mol/l Zitrat) beschickte 2,9-ml-Monovette und gegebenenfalls zusätzlich für die Untersuchung der Plättchenaggregation (und der Willebrandfaktor-Konzentration) ein mit 1 ml 0,11 molarer Natriumzitrat-Lösung (1 Teil) befülltes Polyethylen-Zentrifugenröhrchen, welches bis zur 10 ml-Markierung mit Blut (9 Teile) gefüllt wurde. Nach Verschluß der Röhrchen wurde vorsichtig geschwenkt, um eine vollständige Durchmischung des Blutes mit dem Antikoagulanz zu gewährleisten. Für die Bestimmung weiterer hämatologischer und klinisch-chemischer Meßgrößen wurden außerdem 1 ml Kalium-EDTA-Blut und zweimal 1 ml Lithium-Heparinat-Blut (15 I.E. Heparin/ml) entnommen. 3.2. Probenverarbeitung und Gewinnung von plättchenreichem und plättchenfreiem Plasma Die Gewinnung von plättchenreichem Plasma (PRP) zur Messung der Thrombozytenaggregation erfolgte aus dem in dem 10 ml Polyethylen-Zentrifugenröhrchen aufgefangenen Zitratblut durch 30-minütige Zentrifugation in der Kühlzentrifuge bei 20°C und 150 × g. Der plättchenreiche Überstand wurde in ein Polyethylen-Zentrifugenröhrchen abpipettiert und für die Thrombozytenzählung bereitgehalten. Um plättchenfreies Plasma (PFP) zu erhalten, wurde ein Teil des PRP nochmals 10 min bei 10.000 × g zentrifugiert,

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der Überstand ebenfalls abpipettiert und in Eppendorf-Reaktionsgefäßen aufbewahrt. Zum Erhalt einer einheitlichen Thrombozytenzahl von 300.000/µl im PRP wurde zunächst die Thrombozytenzahl im PRP mit dem automatischen Blutzellzählgerät bestimmt. Bei Werten < 300.000/µl wurde ein Auf-konzentrieren durch nochmaliges hochtouriges Zentrifugieren (2000 x g, 10 Minuten), Abpipettieren eines Teiles des Plasmaüberstandes und Resuspension der absedimentierten Thrombozyten erzielt. Bei PRP mit einer Thrombo-zytenzahl > 300.000/µl erfolgte durch Zugabe von PFP zum PRP die Einstellung der Thrombozytenzahl auf 300.000/µl. Beispiel: Thrombozytenzahl: 320.000/µl: → 300 µl PRP + 20 µl PFP. Das zur Aggregationsmessung verwendete PRP wurde nach der Thrombozytenzahlkontrolle innerhalb von 4 Stunden verwendet und währenddessen bei Raumtemperatur gelagert. Aus dem Lithiumheparinatblut wurde durch Zentrifugation für 2 Minuten bei 10.000 × g entsprechendes Plasma zur Messung klinisch-chemischer Meßgrößen hergestellt. 4. Methoden 4.1. Thrombozytenzahl und andere Meßgrößen des Blutbildes Die Thrombozytenzahl sowie der Hämatokrit und die Leukozytenzahl wurden mit dem halbautomatischen Hämatologiesystem Sysmex F-800 nach zweistufiger Verdünnung mit dem Auto-Dilutor AD-260 gemessen. Als Hämolysemittel wurde Quicklyser-II eingesetzt. 4.2. Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 Die Untersuchung mit dem Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 erfolgte in der Regel in einem Zeitraum von 30 - 60 Minuten nach Blutentnahme. Die Meßzellen, welche bei 4°C gelagert wurden, wurden vor Beginn der Messung für 15 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahrt. Danach wurde eine Meßzelle (Kollagen/ADP-Meßzelle) in die Position A der Kassette des Plättchen-funktionsanalysengerätes eingesetzt, nach vorherigem vier- bis fünfmaligen vorsichtigen Schwenken der Blutprobe 1000 µl Blut aus der Probe in das Probenreservoir der in der Kassette befindlichen Meßzelle pipettiert und über die integrierte Tastatur des Gerätes der Testlauf gestartet. Nach Ausgabe der Ergebnisse erfolgte die Entsorgung dieser Meßzelle und der Test wurde mit der

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zweiten Meßzelle (Kollagen/Epinephrin-Meßzelle) in analoger Weise durchgeführt. 4.3. Kapilläre In-vivo-Blutungszeit Die kapilläre In-vivo-Blutungszeit wurde mit zwei unterschiedlichen Methoden bestimmt: Zur Messung der kapillären In-vivo-Blutungszeit entsprechend der von NOLTE et al. (1997) beschriebenen Methode wurde der Hund in Seitenlage verbracht. Nach Rasur des Punktionsgebietes, des Übergangs von behaarter Haut und Ballenhorn der seitlichen Zehe der Vordergliedmaße, wurde eine Blutdruckmanschette über Radius und Ulna dieser Gliedmaße angelegt, auf das geschorene Hautareal eine hyperämisierende Salbe aufgetragen und eine Stoppuhr gestartet. Nach Ablauf von einer Minute wurde die Salbe mit einem Mulltupfer entfernt und die Blutdruckmanschette mit einem Druck von 70 mm Hg aufgeblasen. Nach Ablauf einer weiteren Minute erfolgte 1-3 mm oberhalb der Ballengrenze zweimalig im Abstand von ½ cm eine Punktion mit einer automatischen Blutlanzette. Bei Aufrechterhaltung der Druckverhältnisse wurden die frei fließenden Blutperlen alle 15 sec vorsichtig mit einem Mulltupfer abgesaugt. Die Zeit von der Punktion bis zum vollständigen Versiegen der Blutungen wurde als kapilläre In-vivo-Blutungszeit gemessen und aus den beiden sich ergebenden Werten der Mittelwert gebildet. Diese Methode wird zur Vereinfachung im weiteren als „kapilläre Blutungszeit“ bezeichnet. Zudem wurde die kapilläre In-vivo-Blutungszeit mit einer Modifikation der zuvor beschriebenen Technik in Anlehnung an die beim Menschen teilweise verwendete subaquale Methode gemessen. Die Bestimmung erfolgte in analoger Weise (einminütige Hyperämisierung und Ablauf einer weiteren Minute unter den entsprechenden Druckverhältnissen) am sitzenden Hund. Hierbei wurde die Vorderpfote nach Punktion in ein Gefäß mit 37°C warmem Wasser gehalten. Die kapilläre In-vivo-Blutungszeit entsprach bei dieser Methode der Zeit von der Punktion bis zum Abreißen der Blutsäule im Wasserbad. Diese Methode wird im weiteren als „subaquale Blutungszeit“ bezeichnet. 4.4. Thrombozytenaggregation nach der BORN-Methode Die Messung der Thrombozytenaggregation basierte auf der Methode von BORN (1962) an einem 2-Kanal-Aggregometer mit rechnergestützter Kurven-analyse.

75

Für die vorliegende Studie wurden folgende Endkonzentrationen der Aggregationsstimulanzien im Testansatz verwendet: • ADP: 0,025 mol/l • Kollagen: 10 µg/ml Das in Trockensubstanz vorliegende ADP wurde zur Herstellung einer Lösung mit einer Konzentration von 0,525 mol/l ADP (Endkonzentration im Testansatz: 0,025 mol/l) mit 381 µl Aqua bidest in Lösung gebracht. Für die Herstellung des Kollagenreagenzes mit einer Konzentration von 210 µg/ml (Endkonzentration im Testansatz: 10 µg/ml) wurden 21 µl einer Kollagenreagenzstammlösung (1 mg/ml) zu 79 µl des im Testkit enthaltenen Puffers gegeben. Die ADP-Lösung war bei Kühlschranktemperatur 5 Tage lagerbar, vor der Verwendung wurde sie zur Erwärmung 10 Minuten bei Zimmertemperatur aufbewahrt. Die Kollagen-Lösung wurde für jeden Arbeitstag frisch angesetzt. Zu Beginn jeder Messung erfolgte die Eichung des Aggregometers mit zwei Standards auf 100 % Aggregation (PFP) und 0 % Aggregation (PRP). Der Ansatz für die Eichung auf 100 % Aggregation enthielt 200 µl PFP + 10 µl einer isotonen NaCl-Lösung für die ADP-induzierte Aggregation bzw. 200 µl PFP + 10 µl des Kollagenreagenz-Puffers für die Kollagen-induzierte Aggregation. Der Ansatz für die Eichung auf 0 % Aggregation setzte sich aus 200 µl PRP + 10 µl isotoner NaCl-Lösung (Kollageninduzierte Aggregation: 200 µl PRP + 10 µl Kollagenreagenz-Puffer) zusammen. Für die Messung der Thrombozytenaggregation wurden jeweils 200 µl PRP in die Küvetten der beiden Meßkanäle pipettiert und die Registrierung gestartet. Nach zweiminütiger Inkubationszeit bei 37°C wurde die Aggregation mit jeweils 10 µl der aggregationsauslösenden Substanzen (Kollagen, ADP) induziert. Während der Messung über 12 Minuten erfolgte ein ständiges Rühren der Testansätze mit einem Magnetrührer bei 1000 U/min. Aggregationseintritt und -ablauf wurden bei einer Papiergeschwindigkeit von 7,5 mm/min aufgezeichnet. Die Ausmessung der Aggregationskurve nach den Meßgrößen Aggregationsmaximum (%) und maximaler Gradient (%/min) erfolgte automatisch durch das Gerät. Der anschließenden Auswertung der so erhaltenen Daten wurde der laborinterne Referenzbereich (SCHULZE 1998) zugrunde-gelegt: • ADP: 0,025 mol/l: Referenzbereich des Aggregationsmaximums: 80-98 % • Kollagen: 10 µg/ml: Referenzbereich des Aggregationsmaximums: 80- 96 %

76

4.5. Klinisch-chemische Messungen Die Messung der Blutplasmakonzentration von Harnstoff, Kreatinin, Gesamteiweiß und Gesamtbilirubin sowie der Enzymaktivität der Alanin-Amino-Transferase, der Glutamat-Dehydrogenase und der Alkalischen Phospha-tase erfolgten aus Lithiumheparinatplasma mit kommerziellen Testkits nach Standardmethoden im Analysenautomaten Hitachi 704. Die Kalibration wurde mit einem universellen humanen Kalibrationsserum durchgeführt. Die bei jeder Messung mitgeführten Qualitätskontrollen mit Precinorm U lagen stets im angegebenen Kontrollbereich. 4.6. Bestimmung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit und der Prothrombinzeit, der Faktor-VIII:C-Aktivität und der Willebrandfaktor-Konzentration Die Messung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit und der Prothrombinzeit sowie der Faktor-VIII:C-Aktivität erfolgte am Koagulometer nach SCHNITGER und GROSS. Zur Messung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit wurde zunächst das Reagenz Pathromtin® durch Lösen der Kaolin-Suspension in der lyophilisierten Lipidkomponente hergestellt. Als Testansatz wurden - gemäß Testanleitung - 100 µl Aktivatorreagenz mit 100 µl plättchenarmen Plasmas für genau zwei Minuten bei 37°C inkubiert. Durch Zugabe von 100 µl auf 37°C vorgewärmter Kalziumchloridlösung (0,025 mol/l) erfolgte die weitere Aktivierung der Gerinnungskaskade, gleichzeitig wurde die Stoppuhr am Gerät gestartet und die Zeit bis zur Fibrinbildung bestimmt (Ergebnis in Sekunden). Zur Bestimmung der Prothrombinzeit wurde die Probe zunächst vorverdünnt (1 Teil plättchenarmes Plasma + 19 Teile Verdünnungsmedium). Daraufhin wurden 100 µl dieser vorverdünnten Probe zusammen mit 100 µl Fibrinogenlösung zwei Minuten bei 37°C inkubiert. Nach Ablauf dieser zwei Minuten wurden 100 µl Reagenzlösung hinzupipettiert. Durch gleichzeitiges Starten der Stoppuhr am Gerät erfolgte die Messung der Zeit bis zur Fibrinbildung, das Meßergebnis in Sekunden wurde über eine Referenzkurve in Prozent Aktivität der Norm umgerechnet. Zur Messung der Faktor-VIII:C-Aktivität wurden 100 µl Aktivatorreagenz der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit zu einer Mischung von 50 µl plättchenarmen Probenplasmas und 50 µl eines humanen Plasmas mit Faktor-

77

VIII-Mangel zugefügt. Nach einer Inkubation von genau 3 Minuten bei 37°C wurden 100 µl einer auf 37°C vorgewärmten Kalziumchloridlösung (0,025 mol/l) hinzupipettiert und die Gerinnungszeit gemessen. Das Meßergebnis in Sekunden wurde über eine Referenzkurve in Prozent Aktivität der Norm umgerechnet (MISCHKE 2001). Die Bestimmung der Willebrandfaktor-Konzentration erfolgte am Hitachi 704 unter Anwendung eines Tests mit polyklonalen Antikörpern gegen humanen Willebrandfaktor (STA LIA vWF, Roche Diagnostics GmbH Mannheim). Dieser Test basiert auf einer Messung der Zunahme der optischen Dichte bei Agglutination von Willebrandfaktor-Antigen und den spezifischen Antikörpern. Die Adaptation des Gerätes (Probenvolumen: 20 µl, Reagenz 1: 185 µl, Reagenz 2: 150 µl, Zweipunktmessung der Trübungsänderung bei 546 nm zwischen den Meßpunkten 19 und 32) erfolgte entsprechend der Testvorschrift für humanes Probenmaterial. Als Standard (100 % Aktivität) diente Hundepoolplasma. 5. Versuchsaufbau von In-vivo- und In-vitro-Experimenten 5.1. Präzisionsanalyse (Kollagen/ADP-Meßzelle) Zur Überprüfung der Präzision wurde von fünf klinisch gesunden Hunden Blut entnommen und nach Ablauf von 30 Minuten jeweils fünf Messungen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle durchgeführt. Bestimmt wurden Verschlußzeit und Gesamtvolumen. Hierzu wurde das Blut eines Probanden auf fünf Portionen aufgeteilt und jede Portion vor der Messung vorsichtig geschwenkt. 5.2. Chargenprüfung (Kollagen/ADP-Meßzelle) Zur Prüfung des Einflusses der Meßzellencharge auf das Testergebnis der Kollagen/ADP-Meßzelle wurde von 8 klinisch gesunden Hunden ein größeres Volumen an Zitrat-gepuffertem Blut entnommen und jeweils unter Verwendung folgender Chargen der Kollagen/ADP-Meßzelle in wechselnder Reihenfolge die Verschlußzeit und das Gesamtvolumen bestimmt: PCA-125, PCA-130, PCA-132, PCA-134, PCA-141, PCA-146. 5.3. Einfluß der Lagerung (Kollagen/ADP- und Kollagen/Epinephrin-Meßzelle) Zur Prüfung des Einflusses der Lagerung der Blutprobe auf die Meßergebnisse wurde von fünf klinisch gesunden Hunden ein größereres Volumen an Zitrat-

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gepuffertem Blut entnommen und sofort nach Entnahme sowie nach 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6, 8 und 24 Stunden mit beiden Meßzellen die Verschlußzeit und das Gesamtvolumen bestimmt. Hierzu wurde das Blut eines Probanden auf 11 Portionen aufgeteilt und jede Portion vor der Messung vorsichtig geschwenkt. 5.4. Einfluß des Hämatokrits (Kollagen/ADP-Meßzelle) Für die Beurteilung des Einflusses des Hämatokrits auf die Verschlußzeit wurde von fünf klinisch gesunden Hunden Blut entnommen und aus einem Anteil jeder Blutprobe jeweils PRP (und PFP) hergestellt. Basierend auf den Ergebnissen des Mikrohämatokrits des EDTA-Blutes erfolgte dann durch Zugabe von PRP eine Einstellung auf verschiedene Hämatokritwerte (40, 30, 25, 20, 15, 10 %). Zuvor wurde die Thrombozytenzahl im PRP durch Zugabe von PFP auf die Thrombozytenzahl der jeweiligen Blutprobe eingestellt. Die Messung der Verschlußzeit und des Gesamtvolumens erfolgte mit der Kollagen-ADP-Meßzelle. 5.5. Einfluß von Desmopressin (DDAVP) bei einem Hund mit Willebrandfaktor-Mangel (Kollagen/ADP-Meßzelle) Bei dem ersten Patienten (Dobermann) der oben angegebenen Hunde mit Willebrand-Krankheit wurde nach subkutaner Gabe von 0,4 µg/kg KGW DDAVP der Verlauf der Verschlußzeit und des Gesamtvolumens (Kollagen/ADP-Meßzelle) im Vergleich zur Willebrandfaktor-Konzentration verfolgt (Messungen nach 5 Minuten, 30 Minuten, 60 Minuten, 2 Stunden, 4 Stunden, 6 Stunden und 22 Stunden). 5.6. Einfluß der intravenösen Injektion von Azetylsalizylsäure beim gesunden Hund (Kollagen/ADP-Meßzelle und Kollagen/Epinephrin-Meßzelle) Um die Veränderung der Verschlußzeit und des Gesamtvolumens bei Azetylsalizylsäure-induzierter Thrombozytopathie zu untersuchen, wurde von zehn klinisch gesunden Hunden vor und zwei Stunden nach einer intravenösen Injektion von 20 mg/kg Körpergewicht Azetylsalizylsäure (Aspisol) Blut entnommen. Die Messung der Verschlußzeit und des Gesamtvolumens erfolgte bei diesem Versuch sowohl mit der Kollagen/ADP- als auch mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle.

79

5.7. Einfluß des In-vitro-Zusatzes von Azetylsalizylsäure beim gesunden Hund (Kollagen/ADP-Meßzelle und Kollagen/Epinephrin-Meßzelle) Zur Beurteilung des Einflusses von Azetylsalizylsäure wurden ferner die Verschlußzeit und das Gesamtvolumen bei beiden Meßzelltypen nach In-vitro-Zusatz von Azetylsalizylsäure in verschiedenen Konzentrationen zu jeweils 5 bis 11 Proben gesunder Hunde gemessen. Nach Messung der jeweiligen Ausgangswerte der Verschlußzeit und des Gesamtvolumens (Kollagen/ADP-Meßzelle und Kollagen/Epinpehrin-Meßzelle) erfolgte eine Zugabe von 20 µl bzw. 3 µl des unverdünnten Handelspräparates (Aspisol) / ml Blut (Endkonzentration: 2 mg bzw. 0,3 mg Azetylsalizylsäure / ml Blut) je Probe und eine Bestimmung der Verschlußzeiten und Gesamtvolumina nach 15 Minuten, 60 Minuten und 120 Minuten bzw. bei der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle entsprechend den Ergebnissen nur nach 15 Minuten. Als Kontrolle wurde eine Probe mit dem Zusatz von 20 µl bzw. 3 µl NaCl / ml Blut mitgeführt und nach 120 Minuten (Kollagen/ADP-Meßzelle) bzw. 15 Minuten (Kollagen/Epi-nephrin-Meßzelle) gemessen. 6. Statistische Auswertung Als deskriptive statistische Meßgrößen fanden der arithmetische Mittelwert und die Standardabweichung und bei nicht annähernd Standard-normalverteilten Daten Median, Minimum und Maximum Anwendung. Die Ermittlung der Referenzbereiche basierte auf dem 2,5 %- und 97,5 %-Quantil. Bei lokalen statistischen Vergleichen abhängiger Stichproben mit Kontroll-werten wurde bei normalverteilten Daten der paarige t-Test bzw. bei nicht normalverteilten Daten der Wilcoxon-Test zugrundegelegt. Beim globalen statistischen Vergleich wurden die einfaktorielle Varianzanalyse bzw. der Friedman-Test angewendet. Ein Vergleich der unabhängigen Stichproben (z.B. ein Vergleich der Gruppe der Hunde mit Leishmaniose mit der Gruppe der gesunden Hunde) erfolgte aufgrund der überwiegend nicht normalverteilten Daten mit dem Mann-Whitney-Test. Als Maß für den Abhängigkeitsgrad von zwei Meßgrößen wurde der Rangkorrelationskoeffizient nach Spearman herangezogen.

80

D. Ergebnisse 1. Referenzwerte für Verschlußzeit und Gesamtvolumen Die Abbildungen 3 und 4 zeigen die Ergebnisse der Verschlußzeit und des Gesamtvolumens für die Kollagen/ADP-Meßzelle und für die Kollagen/Epinephrin-Meßzelle bei klinisch gesunden Hunden. Die auf der Grundlage des 2,5 %- und 97,5 %-Quantils ermittelten Referenzbereiche der Verschlußzeit und des Gesamtvolumens für die zwei Meßzellen des Plättchen-funktionsanalysengerätes PFA-100 sind in der Tabelle 4 zusammengefaßt. Die Einzelmeßwerte sind zudem in der Tabelle 21 im tabellarischen Anhang aufgeführt. Mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle waren die Referenzwerte für die Verschlußzeit deutlich länger sowie für das Gesamtvolumen deutlich höher und wiesen eine größere Streuung auf. Die obere Referenzbereichsgrenze der Verschlußzeit erreichte bei diesem Meßzelltyp die Meßbereichsgrenze von 300 Sekunden. Tab. 4: Referenzbereiche der Verschlußzeit und des Gesamtvolumens für die beiden Meßzelltypen des Plättchenfunktionsanalysengerätes PFA-100, ermittelt anhand von klinisch gesunden Hunden (n=136, Kollagen/ADP-Meßzelle; n=128, Kollagen/Epinephrin-Meßzelle) auf der Grundlage des 2,5 %- und 97,5 %- Quantils.

Meßzelltyp Verschlußzeit (sec)

Gesamtvolumen (µl)

Kollagen/ADP- Meßzelle (n=136)

53 – 98 (Median: 73)

227 – 318 (Median: 264)

Kollagen/Epinephrin- Meßzelle (n=128)

92 – >300 (Median: 163)

296 – 720 (Median: 414)

81

Abb. 3: Meßergebnisse der Verschlußzeit beim gesunden Hund für die Kollagen/ADP-Meßzelle (n=136) und für die Kollagen/Epinephrin-Meßzelle (n=128) mit Markierung der Mediane.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

Verschlußzeit (sec)

Kollagen/ADP - Meßzelle

Kollagen/ Epinephrin - Meßzelle

>300

82

Abb. 4: Meßergebnisse des Gesamtvolumens beim gesunden Hund für die Kollagen/ADP-Meßzelle (n=136) und für die Kollagen/Epinephrin-Meßzelle (n=128) mit Markierung der Mediane. 2. Referenzwerte der In-vivo-Blutungzeit Der auf der Grundlage des 2,5 %- und 97,5 %-Quantils bei klinisch gesunden Hunden (n=136) ermittelte Referenzbereich für die anhand von zwei

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

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650

700

750

800

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900

950

1000

Gesamtvolumen (µl)

Kollagen/ADP-Meßzelle

Kollagen/Epinephrin-Meßzelle

83

unterschiedlichen Methoden bestimmte In-vivo-Blutungszeit betrug 60 - 150 Sekunden (kapilläre Blutungszeit) bzw. 45 - 90 Sekunden (suabaquale Blutungszeit). Die Einzelmeßwerte sind in der Tabelle 20 im tabellarischen Anhang aufgeführt. 3. Referenzwerte der Thrombozytenzahl und des Hämatokrits Der auf der Grundlage des 2,5 %- und 97,5 %-Quantils bei klinisch gesunden Hunden (n=136) ermittelte Referenzbereich für die Thrombozytenzahl betrug 153.000/µl - 439.000/µl, für den Hämatokrit wurde ein Referenzbereich von 38 - 56 % bestimmt. Die Einzelmeßwerte sind in der Tabelle 21 im tabellarischen Anhang aufgeführt. 4. Präzisionsanalyse Die Präzisionsanalyse ergab für die mit der Kollagen/ADP-Meßzelle gemessene Verschlußzeit sowie für das mit dieser Meßzelle gemessene Gesamtvolumen Variationskoeffizienten von im Mittel (Median) 7,3 % bzw. 2,7 % (Tab. 5). Tab. 5: Präzision in der Serie (5 Wiederholungsmessungen) der mit der Kollagen/ADP-Meßzelle gemessenen Verschlußzeit bzw. des Gesamtvolumens bei fünf klinisch gesunden Hunden: arithmetischer Mittelwert (x), Standardabweichung (SD) und Variationskoeffizient (VK).

Verschlußzeit Gesamtvolumen

Hund Nr. x

(sec)

SD (sec)

VK (%)

x

(µl) SD (µl)

VK (%)

1 73 4,0 5,6 271 10,4 3,8

2 58 3,0 5,1 247 3,5 1,4

3 63 5,4 8,6 259 7,0 2,7

4 76 5,6 7,3 272 7,3 2,7

5 66 5,0 7,6 253 12,0 4,7

84

5. Einfluß der Meßzellcharge Beim Vergleich sechs verschiedener Kollagen/ADP-Meßzellchargen (PCA-125, PCA-130, PCA-132, PCA-134, PCA-141, PCA-146) bei klinisch gesunden Hunden ergab sich weder für die Verschlußzeit (p = 0,1548) (Abb. 5a) noch für das Gesamtvolumen (p = 0,0921) (Abb. 5b) mit der Varianzanalyse ein statistisch signifikanter Unterschied. Die Einzelwerte sowie der jeweilige arithmetische Mittelwert und die Standardabweichung sind in den Tabellen 22 und 23 im tabellarischen Anhang aufgeführt.

Abb. 5a, b: Vergleich der Verschlußzeiten (Abb. 5a) bzw. Gesamtvolumina (Abb. 5b) klinisch gesunder Hunde (n=8), die mit sechs verschiedenen Chargen der Kollagen/ADP-Meßzelle (PCA-125, PCA-130, PCA-132, PCA-134, PCA-141, PCA-146) gemessen wurden. Darstellung des arithmetischen Mittelwertes und der Standardabweichung.

Gesamtvolumen (µl)

0

50

100

150

200

250

300

350

PCA-130

PCA-132

PCA-134

PCA-141

PCA-146

MeßzellchargePCA-125

0

20

40

60

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100

120

PCA-125

PCA-130

PCA-132

PCA-134

PCA-141

PCA-146

Meßzellcharge

Verschlußzeit (sec)

a

b

85

6. Einfluß der Lagerung Die Abbildungen 6 und 7 geben eine Übersicht über den Einfluß des Meßzeitpunktes nach Blutentnahme (0-24 Stunden) auf die Verschlußzeit bzw. das Gesamtvolumen gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle. Für die Kollagen/ADP-Meßzelle ergab sich hierbei beim globalen statistischen Vergleich mit der Varianzanalyse weder für die Verschlußzeit (p=0,0842) noch für das Gesamtvolumen (p=0,0655) ein Unterschied. Beim lokalen Vergleich der Werte mit den 0-h-Werten bzw. den 1-h-Werten mittels des t-Tests fiel eine Verkürzung der Verschlußzeit beim Zeitpunkt 0,5 und 1,5 Stunden gegenüber dem 0-h-Wert sowie beim Zeitpunkt 1,5 Stunden gegenüber dem 1-h-Wert auf. Gleichzeitig zeigte sich eine Verringerung des Gesamtvolumens bei 1,5 Stunden im Vergleich mit dem 0-h-Wert (Tab. 28, tabellarischer Anhang). Die geringste Streuung der Einzelwerte der Verschlußzeit ergab sich in einem Bereich von 0,5 h bis 4 h (Abb. 6a). Für die Kollagen/Epinephrin-Meßzelle ergab sich beim globalen statistischen Vergleich mit dem Friedman-Test ein deutlicher Unterschied (Verschlußzeit: p=0,0120; Gesamtvolumen: p=0,0061). Beim lokalen statistischen Vergleich aller Zeitpunkte mit dem 0-h- und 1-h-Wert mittels Wilcoxon-Test zeigte sich ein Unterschied beim 24-h-Wert der Verschlußzeit verglichen mit dem 1-h-Wert (Tab. 29, tabellarischer Anhang), so daß eine Messung der Probe nach einem Zeitraum von über 8 Stunden nach Blutentnahme nicht zu empfehlen ist. Die Einzelwerte der Verschlußzeit und des Gesamtvolumens sowie des statistischen Vergleichs sind in den Tabellen 24 bis 29 im tabellarischen Anhang aufgeführt.

86

Abb. 6a, b: Verschlußzeit (Abb. 6a) und Gesamtvolumen (Abb. 6b) klinisch gesunder Hunde (n=5) zu verschiedenen Zeitpunkten nach Blutentnahme gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle mit Markierung der arithmetischen Mittelwerte.

0

20

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Verschlußzeit (sec)

Zeit nachBlutentnahme (h)

0 0,5 1 21,5 43 86 24

0

50

100

150

200

250

300

350

Zeit nachBlutentnahme (h)

0,5 1 21,5 43 86 24

Gesamtvolumen (µl)

0

a

b

87

Abb. 7a, b: Verschlußzeit (Abb. 7a) und Gesamtvolumen (Abb. 7b) klinisch gesunder Hunde (n=5) zu verschiedenen Zeitpunkten nach Blutentnahme gemessen mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle mit Markierung der Mediane.

0

20

40

60

80

100

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140

160

180

200

220

240

260

280

300

Zeit nachBlutentnahme (h)

0 0,5 1 21,5 43 86 24

>300

Verschlußzeit (sec)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

0 0,5 1 21,5 43 86 24

Gesamtvolumen (µl)

Zeit nachBlutentnahme (h)

b

a

88

7. Einfluß des Hämatokrits Die Abbildungen 8 und 9 zeigen die Veränderung der Verschlußzeit bzw. des Gesamtvolumens gesunder Hunde bei stufenweiser Verminderung des Hämatokrits von 40 % bis auf 10 % durch Zusatz eines entsprechenden Volumens plättchenreichen Plasmas gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle. Hierbei zeigte sich schon bei einer Verminderung des Hämatokrits von 40 % auf 30 % eine deutliche Verlängerung der Verschlußzeit (p=0,0049; t-Test) bzw. Erhöhung des Gesamtvolumens (p=0,0030; t-Test), die sich bei weiterer Abnahme des Erythrozytenanteils verstärkte. Auch beim globalen statistischen Vergleich mit der Varianzanalyse zeigten sich bei beiden Meßgrößen auffällige Unterschiede zwischen verschiedenen Hämatokritniveaus (Verschlußzeit: p< 0,0001; Gesamtvolumen: p=0,0002). Die Einzelwerte sowie die jeweiligen arithmetischen Mittelwerte und Standardabweichungen sind in den Tabellen 30 und 31 im tabellarischen Anhang aufgeführt.

Abb. 8: Verschlußzeit klinisch gesunder Hunde (n=5) gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle bei stufenweiser Verminderung des Hämatokrits durch Zusatz eines entsprechenden Volumens plättchenreichen Plasmas mit Markierung der arithmetischen Mittelwerte. Der angegebene p-Wert resultiert aus dem statistischen Vergleich der einzelnen Verdünnungsstufen mit den Ergebnissen bei einem Hämatokrit von 40 % mittels t-Test für abhängige Stichproben.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

Hämatokrit (%)40 30 25 20 15 10

Verschlußzeit (sec)

p=0,0049p=0,007

p=0,0009p=0,001

p<0,0001

89

Abb. 9: Gesamtvolumen klinisch gesunder Hunde (n=5) gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle bei stufenweiser Verminderung des Hämatokrits durch Zusatz eines entsprechenden Volumens plättchenreichen Plasmas mit Markierung der arithmetischen Mittelwerte. Der angegebene p-Wert resultiert aus dem statistischen Vergleich der einzelnen Verdünnungsstufen mit den Ergebnissen bei einem Hämatokrit von 40 % mittels t-Test für abhängige Stichproben. 8. Einfluß der Thrombozytenzahl Bei 31 von den in dieser Studie untersuchten 39 Proben von 32 Hunden mit Thrombozytopenie und einem Hämatokrit > 30 % lagen die mit der Kollagen/ADP-Meßzelle gemessenen Verschlußzeiten und Gesamtvolumina oberhalb des Referenzbereiches (Abb. 10a, b). Bei den falsch negativen Proben der Verschlußzeit lag die Thrombozytenzahl in einem Bereich von 36.000-134.000/µl, bei den falsch negativen Proben des Gesamtvolumens in einem Bereich von 13.000-134.000/µl (Tab. 33, tabellarischer Anhang). Dagegen

p=0,003p=0,0031

p=0,0006p=0,001

p<0,0001

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

Gesamtvolumen (µl)

Hämatokrit (%)40 30 25 20 15 10

90

wurde mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle nur bei 19 Proben eine über den Meßbereich hinausgehende Verschlußzeit gemessen. Bei elf weiteren Proben wurde nur ein weniger als 300 Sekunden betragender Mindestwert bestimmt (Abb. 11a). Bei den übrigen innerhalb des Referenzbereiches liegenden neun Proben lag die Thrombozytenzahl in einem Bereich von 25.000-128.000/µl. Die mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle bestimmten Gesamtvolumina lagen bei 26 Proben oberhalb des Referenzbereiches (Abb. 11b). Die Thrombozytenzahl der falsch negativen Proben lag in einem Bereich von 3.000-128.000/µl (Tab. 33). Die Einzelmeßwerte sind in der Tabelle 33 im tabellarischen Anhang angeführt. In den Gruppen der Hunde mit Thrombozytopenie bzw. der Gesamtzahl der Hunde ergab sich für die mit der Kollagen/ADP-Meßzelle gemessene Verschlußzeit und das Gesamtvolumen wie auch für die In-vivo-Blutungszeit eine signifikante negative Korrelation mit der Thrombozytenzahl. Für die Kollagen/Epinephrin-Meßzelle traf dies nur für die Gesamtzahl der Hunde zu. In jedem Fall wiesen die mit der Kollagen/ADP-Meßzelle gemessenen Verschlußzeiten und Gesamtvolumina eine engere Korrelation zur Thrombozytenzahl auf als die mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle gemessenen Werte (Tab. 6). Für die Beziehung zwischen der kapillären bzw. der subaqualen Blutungszeit und den Meßgrößen des Plättchenfunktions-analysengerätes PFA-100 ergab sich sowohl bei der Gruppe der Hunde mit Thrombozytopenie als auch bei der Gesamtzahl der Hunde eine engere Korrelation zwischen den mit der Kollagen/ADP-Meßzelle gemessenen Werten im Vergleich zur Kollagen/Epinephrin-Meßzelle (Tab. 7 und 8).

91

Tab. 6: Rangkorrelationskoeffizienten (rs) für die Beziehung zwischen der Thrombozytenzahl und der Verschlußzeit (VZ) bzw. dem Gesamtvolumen (GV) der Kollagen/ADP-Meßzelle (Kollagen/ADP) und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle (Kollagen/Epinephrin) sowie der kapillären Blutungszeiten (Blutungszeit 1) und der subaqualen Blutungszeiten (Blutungszeit 2). Berechnung für drei verschiedene Gruppen: Hunde mit Thrombozytopenie, gesunde Hunde sowie Gesamtzahl der Hunde. Sternchen kennzeichnen eine signifikante Abhängigkeit (* = p < 0,05).

Hunde mit

Thrombozytopenie gesunde Hunde

Gesamtzahl der Hunde

Kollagen/ADP VZ (sec)

- 0,5793* (39 Proben/32 Hunde)

0,0756 (136 Hunde)

- 0,3991* (175 Proben/168 Hunde)

Kollagen/ADP GV (µl)

- 0,5493* (39 Proben/32 Hunde)

0,1686 (136 Hunde)

- 0,4340* (175 Proben/168 Hunde)

Kollagen/Epinephrin VZ (sec)

- 0,2919 (39 Proben/32 Hunde)

0,2906* (128 Hunde)

- 0,3891* (164 Proben/160 Hunde)

Kollagen/Epinephrin GV (µl)

- 0,1609 (39 Proben/32 Hunde)

0,2627* (128 Hunde)

- 0,3990* (164 Proben/160 Hunde)

Blutungszeit 1 (sec)

- 0,4882* (39 Messungen/32

Hunde) 0,1084

(136 Hunde) - 0,3171*

(175 Messungen/168 Hunde)

Blutungszeit 2 (sec)

- 0,4185* (39 Messungen/32

Hunde)

0,2295* (136 Hunde)

- 0,4006* (175 Messungen/168

Hunde)

92

Tab. 7: Rangkorrelationskoeffizienten (rs) für die Beziehung zwischen der kapillären Blutungszeit und der Verschlußzeit (VZ) bzw. dem Gesamtvolumen (GV) bei Messung mit der Kollagen/ADP-Meßzelle (Kollagen/ADP) und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle (Kollagen/Epinephrin). Berechnung für drei verschiedene Gruppen: Hunde mit Thrombozytopenie, gesunde Hunde sowie Gesamtzahl der Hunde. Sternchen kennzeichnen eine signifikante Abhängigkeit (* = p < 0,05).

Hunde mit Thrombozytopenie

gesunde Hunde

Gesamtzahl der Hunde

Kollagen/ADP VZ (sec)

0,5633* (39 Proben/32 Hunde)

- 0,0285 (136 Hunde)

0,4067* (175 Proben/168 Hunde)

Kollagen/ADP GV (µl)

0,6366* (39 Proben/32 Hunde)

0,0356 (136 Hunde)

0,4282* (175 Proben/168 Hunde)

Kollagen/Epinephrin VZ (sec)

0,4478* (39 Proben/32 Hunde)

0,2105* (128 Hunde)

0,3046* (164 Proben/160 Hunde)

Kollagen/Epinephrin GV (µl)

0,3976* (39 Proben/32 Hunde)

0,1718 (128 Hunde)

0,3371* (164 Proben/160 Hunde)

Tab. 8: Rangkorrelationskoeffizienten (rs) für die Beziehung zwischen der subaqualen Blutungszeit und der Verschlußzeiten (VZ) bzw. dem Gesamt-volumen (GV) bei Messung mit der Kollagen/ADP-Meßzelle (Kollagen/ADP) und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle (Kollagen/Epinephrin). Berechnung für drei verschiedene Gruppen: Hunde mit Thrombozytopenie, gesunde Hunde sowie Gesamtzahl der Hunde. Sternchen kennzeichnen eine signifikante Abhängigkeit (* = p < 0,05).

Hunde mit Thrombozytopenie

gesunde Hunde

Gesamtzahl der Hunde

Kollagen/ADP VZ (sec)

0,6359* (39 Proben/32 Hunde)

0,1677 (136 Hunde)

0,4822* (175 Proben/168 Hunde)

Kollagen/ADP GV (µl)

0,6706* (39 Proben/32 Hunde)

0,2310* (136 Hunde)

0,4959* (175 Proben/168 Hunde)

Kollagen/Epinephrin VZ (sec)

0,4650* (39 Proben/32 Hunde)

0,2845* (128 Hunde)

0,4018* (164 Proben/160 Hunde)

Kollagen/Epinephrin GV (µl)

0,3162* (39 Proben/32 Hunde)

0,2878* (128 Hunde)

0,4115* (164 Proben/160 Hunde)

93

Abb. 10a, b: Beziehung zwischen Thrombozytenzahl und Verschlußzeit (Abb. 10a) bzw. Gesamtvolumen (Abb. 10b) der Kollagen/ADP-Meßzelle basierend auf 39 Proben von 32 Hunden mit Thrombozytopenie und 136 gesunden Hunden mit physiologischer Thrombozytenzahl. Markierung der auf der Grundlage des 2,5 % - und 97,5 % - Quantils ermittelten Referenzbereichs-grenzen für die Verschlußzeit und die Thrombozytenzahl. Dreiecke kennzeichnen als Mindestwert angegebene Ergebnisse.

a

b

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

Verschlußzeit (sec)

Thrombozytenzahl (103/µl)

100

300

>300

50

150

200

250

100

200

300

400

500

600

700

800

900

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

Gesamtvolumen (µl)

Thrombozytenzahl (103/µl)

94

Abb. 11a, b: Beziehung zwischen Thrombozytenzahl und Verschlußzeit (Abb. 11a) bzw. Gesamtvolumen (Abb. 11b) der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle basierend auf 39 Proben von 32 Hunden mit Thrombozytopenie und 128 gesunden Hunden mit physiologischer Thrombozytenzahl. Markierung der auf der Grundlage des 2,5 % - und 97,5 % - Quantils ermittelten Referenzbereichs-grenzen für die Verschlußzeit und die Thrombozytenzahl. Dreiecke kennzeichnen als Mindestwert angegebene Ergebnisse.

a

b

300

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

Verschlußzeit (sec)>300

Thrombozytenzahl (103/µl)

100

50

150

200

250

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

Gesamtvolumen (µl)

Thrombozytenzahl (103/µl)

100

200

300

400

500

600

700

800

900

95

Die Tabelle 9 stellt den Verlauf der Verschlußzeit und des Gesamtvolumens sowie der kapillären Blutungszeit eines Hundes mit immunbedingter Thrombozytopenie nach Therapiebeginn dar. Hierbei zeigte sich mit steigender Thrombozytenzahl eine Verkürzung der Verschlußzeit und eine Verminderung des Gesamtvolumens sowie eine Verkürzung der kapillären Blutungszeit bis zu in den jeweiligen Referenzbereichen liegenden Werten bei physiologischen (Probe Nr. 5) oder annähernd normalen (Probe Nr. 4) Thrombozytenwerten. Tab. 9: Thrombozytenzahl, Hämatokrit, Verschlußzeit (VZ) und Gesamt-volumen (GV) gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle (Kollagen/ADP) und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle (Kollagen/Epi) sowie kapilläre Blutungszeit bei einem Hund mit immunbedingter Thrombozytopenie vor (Probe Nr. 1) und 3 Tage (Probe Nr. 2), 4 Tage (Probe Nr. 3), 7 Tage (Probe Nr. 4), 10 Tage (Probe Nr. 5) nach der Behandlung mit Prednisolon (5 mg/kg Körpergewicht/Tag).

Meßparameter Einheit Referenz-bereich

Proben- Nr. 1

2 3 4 5

Thrombozyten-zahl x103/µl 153-439 7 25 56 128 235

Hämatokrit % 38-56 48,1 46,4 38,1 33,8 36,5

Kollagen/ADP VZ sec 53-98 sec >300 110 120 80 57

Kollagen/ADP GV µl 227-318 738 369 417 328 273

Kollagen/Epi VZ sec 92-300 >300 208 >300 141 81

Kollagen/Epi GV µl 296-720 722 525 684 490 315

kapilläre Blutungszeit sec 60-150 330 240 200 80 80

96

9. Willebrand-Erkrankung Bei allen vier untersuchten Proben der zwei in diese Studie eingegangenen Hunde mit Willebrand-Erkrankung waren die mit der Kollagen/ADP-Meßzelle gemessenen Verschlußzeiten verlängert sowie die Gesamtvolumina erhöht. Zwei der drei mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle untersuchten Proben wiesen ein erhöhtes Gesamtvolumen auf; bei einer dieser Proben lag die Verschlußzeit oberhalb des Meßbereichs, bei der anderen konnte nur ein Mindestwert ermittelt werden. Thrombozytenzahl und Hämatokrit des ersten Patienten lagen im Referenzbereich (Nr. 1a, 1b). Die erste Probe des zweiten Patienten (Nr. 2a) wies eine Thrombozytopenie und eine Anämie auf, Probe 2b nur eine Anämie. Die In-vivo-Blutungszeiten waren bei allen Messungen deutlich über den Referenzbereich hinaus verlängert. Die Einzelwerte der Willebrandfaktor-Konzentration sind im tabellarischen Anhang aufgeführt (Tab. 34). Tab. 10: Thrombozytenzahl (Thrz.), Hämatokrit (HTK), kapilläre Blutungszeit (BZ 1), subaquale Blutungszeit (BZ 2), Verschlußzeit (VZ) und Gesamtvolumen (GV) der Kollagen/ADP- und der Kollagen/Epinephrin (Kollagen/Epi.)-Meßzelle von zwei Hunden mit Willebrand-Erkrankung (Hund 1: Probe Nr. 1a und 1b; Hund 2: Probe Nr. 2a und 2b). Sternchen (*) kennzeichnen außerhalb des Referenzbereiches liegende Werte.

Kollagen/ADP-Meßzelle

Kollagen/Epi.-Meßzelle Probe

Nr.

Thrz. (x 103 /µl)

HTK (%)

BZ 1 (sec)

BZ 2 (sec) VZ

(sec) GV (µl)

VZ (sec)

GV (µl)

Ref.- bereich

153-439 38-56 60 - 150 45 - 90 53-98 227-

318 92-300 296-720

1a 178 40,1 > 600* > 600* 259* 541* > 300 839*

1b 281 50,9 390* 300* 138* 335* 267 495 2a 71* 21,6* > 900* n.u. > 219* 871* n.u. n.u. 2b 159 23,7* > 900* n.u. > 270* 869* > 247 871*

n.u. = nicht untersucht; a,b = wiederholte Probenentnahme bei einem Patienten an verschiedenen Tagen

97

Bereits fünf Minuten nach subkutaner Injektion von 0,4 µg Desmopressin/kg Körpergewicht bei einem Hund mit Willebrand-Erkrankung (Patient 1) wurde mit der Kollagen/ADP-Meßzelle parallel zur Erhöhung der Willebrandfaktor-Konzentration eine gegenüber dem Ausgangswert deutlich verkürzte Verschluß-zeit bestimmt, welche jedoch noch außerhalb des Referenzbereiches lag. Anschließend verlängerte sich die Verschlußzeit wieder bei abnehmender Willebrandfaktor-Konzentration (Abb. 12). Das Gesamtvolumen verhielt sich ähnlich, wobei es mit einer Reduzierung von 512 µl auf 322 µl 60 Minuten nach Injektion nur geringgradig außerhalb des Referenzbereiches lag (Abb. 13). Die Einzelwerte der Verschlußzeit und des Gesamtvolumens sind im tabellarischen Anhang (Tab. 35) aufgeführt.

Abb. 12: Verlauf der Verschlußzeit (Kollagen/ADP-Meßzelle) und der Willebrandfaktor-Konzentration bei einem Hund mit hereditärem Willebrandfaktor-Mangel vor und zu verschiedenen Zeitpunkten nach subkutaner Injektion von 0,4 µg Desmopressin/kg Körpergewicht. Die gestrichelten Linien markieren den Referenzbereich der Verschlußzeit (2,5 %- und 97,5 %-Quantil der Werte von 136 gesunden Hunden).

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80Verschlußzeit (sec) Willebrandfaktor-Konzentration (%)

5 Min. 30 Min. 60 Min . 2 h 4 h 6 h 22 hvorher Zeit nach Injektion (Minuten bzw. Stunden)

98

Abb. 13: Verlauf des Gesamtvolumens (Kollagen/ADP-Meßzelle) und der Willebrandfaktor-Konzentration bei einem Hund mit hereditärem Willebrandfaktor-Mangel vor und zu verschiedenen Zeitpunkten nach subkutaner Injektion von 0,4 µg Desmopressin/kg Körpergewicht. Die gestrichelten Linien markieren den Referenzbereich des Gesamtvolumens (2,5 %- und 97,5 %-Quantil der Werte von 136 gesunden Hunden).

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

Gesamtvolumen (µl) Willebrandfaktor-Konzentration (%)

5 Min. 30 Min. 60 Min. 2 h 4 h 6 h 22 hvorher Zeit nach Injektion (Minuten bzw. Stunden)

99

10. Einfluß der intravenösen Injektion von Azetylsalizylsäure beim gesunden Hund Bei Verwendung der Kollagen/ADP-Meßzelle verlängerte sich die Verschlußzeit durch die intravenöse Injektion von Azetylsalizylsäure von im Mittel 85 ± 10,5 Sekunden auf 105 ± 14,8 Sekunden (arithmetischer Mittelwert ± Standardabweichung) zwei Stunden nach der Injektion (p=0,0008, t-Test) (Abb. 14a, b). Das mit dieser Meßzelle gemessene Gesamtvolumen erhöhte sich von im Mittel 279 ± 22,4 µl auf 323 ± 38,9 µl (p=0,0097, t-Test). Mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle zeigte sich der Einfluß der Azetylsalizylsäure in noch ausgeprägteren Verlängerungen der Verschlußzeiten von 135 Sekunden auf über 300 Sekunden (Median) (p=0,0051, Wilcoxon-Test) bzw. Erhöhungen der Gesamtvolumina von 368 µl auf 768 µl (p=0,0051, Wilcoxon-Test) (Abb. 15a, b). Parallel verminderte sich das Kollagen-induzierte Aggregationsmaximum von im Mittel (Median) 84,5 % vor der Gabe von Azetylsalizylsäure auf 9,1 % zwei Stunden nach Azetylsalizylsäuregabe (p=0,0051, Wilcoxon-Test). Die ADP-induzierte Plättchenaggregation war dagegen nur geringgradig beeinträchtigt. Hier ergab sich eine Reduzierung des Aggregationsmaximums von im Mittel (arithmetischer Mittelwert) 86,6 % auf 72,5 % (p=0,0030, t-Test). Die kapilläre Blutungszeit verlängerte sich deutlich von 138 ± 27,5 Sekunden auf 270 ± 63,0 Sekunden (p<0,0001, t-Test). Die Einzelmeßwerte sowie die jeweiligen arithmetischen Mittelwerte und Standardabweichungen bzw. Mediane sind in den Tabellen 36 und 37 im tabellarischen Anhang aufgeführt.

100

Abb. 14a, b: Verschlußzeit und Gesamtvolumen klinisch gesunder Hunde (n=10) vor und 120 Minuten nach intravenöser Injektion von 20 mg/kg Körpergewicht Azetylsalizylsäure (ASS) gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300Verschlußzeit (sec)

vor Injektionvon ASS

120 min nach Injektion von ASS

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

Gesamtvolumen (µl)

vor Injektionvon ASS

120 min nach Injektion von ASS

a

b

101

Abb. 15a, b: Verschlußzeit und Gesamtvolumen klinisch gesunder Hunde (n=10) vor und 120 Minuten nach intravenöser Injektion von 20 mg/kg Körpergewicht Azetylsalizylsäure (ASS) gemessen mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle. Dreiecke markieren als Mindestwert angegebene Ergebnisse.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

Verschlußzeit (sec)>300

vor Injektionvon ASS

120 min nach Injektion von ASS

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900Gesamtvolumen (µl)

vor Injektionvon ASS

120 min nach Injektion von ASS

a

b

102

11. Einfluß des In-vitro-Zusatzes von Azetylsalizylsäure bei Blutproben von gesunden Hunden Nach Zusatz von Azetylsalizylsäure in der Endkonzentration von 0,3 g / l Blut ergab sich mit der Kollagen/ADP-Meßzelle eine Verlängerung der Verschlußzeit von im Mittel (Median) 86 Sekunden vor Zusatz auf über 300 Sekunden 120 Minuten nach Zusatz von Azetylsalizylsäure. Das mediane Gesamtvolumen erhöhte sich von 272 µl auf 573 µl. Jedoch ließ sich nur bei drei von fünf Proben eine deutliche Beeinflussung von Verschlußzeit bzw. Gesamtvolumen erkennen (Abb. 16a, b). Statistisch gesehen ergab sich bis zum Versuchsende nur für das Gesamtvolumen (p=0,0431, Wilcoxon-Test) ein deutlicher Unterschied gegenüber dem Ausgangswert (Verschlußzeit: p=0,0796, Wilcoxon-Test). Bei einer Endkonzentration von 2 g Azetylsalizylsäure / l Blut zeigte sich unter Verwendung der Kollagen/ADP-Meßzelle eine Verlängerung der Verschlußzeit von im Mittel (Median) 75 Sekunden auf über 300 Sekunden bzw. eine Erhöhung des Gesamtvolumens von 274 µl auf 754 µl (p=0,0277, Wilcoxon-Test) 120 Minuten nach Azetylsalizylsäurezusatz. Nach 120 Minuten waren hier die Verschlußzeiten aller Proben über den Meßbereich bzw. bis zur Meßbereichsgrenze (>299 Sekunden) verlängert (Abb. 17a), was sich auch in einem durchschnittlich höheren Medianwert gegenüber dem Ausgangswert widerspiegelte (Verschlußzeit p=0,0277, Wilcoxon-Test). Unter Verwendung der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle zeigte sich sowohl bei der niedrigeren (p=0,0431, Wilcoxon-Test) als auch bei der höheren (p=0,0034, Wilcoxon-Test) Azetylsalizylsäurekonzentration bereits nach 15 Minuten bei allen Proben eine Verlängerung der Verschlußzeit über den Meßbereich hinaus (> 300 Sekunden) (Abb. 18a, 19a). Ebenso fand sich in beiden Versuchsreihen eine auffällige Erhöhung des Gesamtvolumens (p<0,05) (Abb. 18b, 19b). Die Einzelmeßwerte sind in den Tabellen 38-41 im tabellarischen Anhang aufgeführt.

103

Abb. 16a, b: Verschlußzeit bzw. Gesamtvolumen klinisch gesunder Hunde (n=5) vor und zu verschiedenen Zeitpunkten (15, 60 und 120 min) nach In-vitro-Zusatz von 0,3 g Azetylsalizylsäure (ASS)/ l Blut gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle mit Markierung der Mediane. Die angegebenen p-Werte resultieren aus dem statistischen Vergleich der Werte mit den Ausgangswerten (vor Zusatz von ASS) unter Anwendung des Wilcoxon-Tests. Sternchen kennzeichnen einen signifikanten Unterschied (* = p < 0,05). Dreiecke markieren als Mindestwert angegebene Ergebnisse.

Gesamtvolumen (µl)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

vor Zusatzvon ASS

15 min nach Zusatz

von ASS

60 min nach Zusatz

v o n A S S

120 min nach Zusatz

von ASS

p = 0 ,5002 p = 0,0796 p = 0,0431*

Verschlußzeit (sec)

0

20

40

60

80

1 0 0

1 2 0

1 4 0

1 6 0

1 8 0

2 0 0

2 2 0

2 4 0

2 6 0

2 8 0

3 0 0

>300

vor Zusatzvon ASS

15 min nach Zusatz

von ASS

60 min nach Zusatz

von ASS

120 min nach Zusatz

von ASS

p = 0,6858 p = 0,0431* p = 0 ,0796

a

b

104

Abb. 17a, b: Verschlußzeit bzw. Gesamtvolumen klinisch gesunder Hunde (n=6) vor und zu verschiedenen Zeitpunkten (15, 60 und 120 min) nach In-vitro-Zusatz von 2 g Azetylsalizylsäure (ASS)/ l Blut gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle mit Markierung der Mediane. Die angegebenen p-Werte resultieren aus dem statistischen Vergleich der Werte mit den Ausgangswerten (vor Zusatz von ASS) unter Anwendung des Wilcoxon-Tests. Sternchen kennzeichnen einen signifikanten Unterschied (* = p < 0,05). Dreiecke markieren als Mindestwert angegebene Ergebnisse.

G e s a m t v o l u m e n ( µ l )

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

v o r Z u s a t zv o n A S S

1 5 m i n nach Zusa tz

v o n A S S

6 0 m i n n a c h Z u s a t z

v o n A S S

1 2 0 m i n n a c h Z u s a t z

v o n A S S

p = 0 , 0 2 7 7 * p = 0 , 0 2 7 7 * p = 0 , 0 2 7 7 *

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

15 min nach Zusatz

von ASS

60 min nach Zusatz

von ASS

120 min nach Zusatz

von ASSvor Zusatz

von ASS

Verschlußzeit (sec )>300

p = 0 ,0277* p = 0 ,0277* p = 0,0277*

a

b

105

Abb. 18a, b: Verschlußzeit bzw. Gesamtvolumen klinisch gesunder Hunde (n=5) vor und 15 Minuten nach In-vitro-Zusatz von 0,3 g Azetylsalizylsäure (ASS)/ l Blut gemessen mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle mit Markierung der Mediane. Die angegebenen p-Werte resultieren aus dem statistischen Vergleich der Werte mit den Ausgangswerten (vor Zusatz von ASS) unter Anwendung des Wilcoxon-Tests. Sternchen kennzeichnen einen signifikanten Unterschied (* = p < 0,05). Dreiecke markieren als Mindestwert angegebene Ergebnisse.

0

20

40

60

80

1 0 0

1 2 0

1 4 0

1 6 0

1 8 0

2 0 0

2 2 0

2 4 0

2 6 0

2 8 0

3 0 0

Verschlußzeit (sec)> 3 0 0

vor Zusatzv o n A S S

15 min nach Zusatz

von ASSp = 0,0431*

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900Gesamtvolumen (µl)

vor Zusatzvon ASS

15 min nach Zusatz

von ASSp = 0,0431*

a

b

106

Abb. 19a, b: Verschlußzeit bzw. Gesamtvolumen klinisch gesunder Hunde (n=11) vor und 15 Minuten nach In-vitro-Zusatz von 2 g Azetylsalizylsäure (ASS)/ l Blut gemessen mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle mit Markierung der Mediane. Die angegebenen p-Werte resultieren aus dem statistischen Vergleich der Werte mit den Ausgangswerten (vor Zusatz von ASS) unter Anwendung des Wilcoxon-Tests. Sternchen kennzeichnen einen signifikanten Unterschied (* = p < 0,05). Dreiecke markieren als Mindestwert angegebene Ergebnisse.

0

2 0

4 0

6 0

8 0

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

Verschlußze i t ( sec)

vor Zusatzv o n A S S

1 5 m i n nach Zusatz

v o n A S S

>300

p = 0 ,0034*

0

50

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0

3 0 0

3 5 0

4 0 0

4 5 0

5 0 0

5 5 0

6 0 0

6 5 0

7 0 0

7 5 0

8 0 0

8 5 0

9 0 0G e s a m t v o l u m e n ( µ l )

vor Zusatzvon ASS

1 5 m i n nach Zusatz

v o n A S Sp = 0 ,0034*

a

107

12. Urämie Bei den zehn untersuchten Hunden mit Urämie bzw. Azotämie ergab sich mit der Kollagen/ADP-Meßzelle eine durchschnittlich höherere mediane Verschluß-zeit (125 sec) im Vergleich mit der Kontrollgruppe (73 sec) (p=0,0009). Ebenso lag in dieser Gruppe das mediane Gesamtvolumen (334 µl) über dem der Kontrollgruppe (264 µl) (p<0,0001). Von den zehn Patienten wiesen sieben mit der Kollagen/ADP-Meßzelle verlängerte Verschlußzeiten auf (Nr. 1, 2, 3, 5, 7, 8, 9), fünf von diesen zudem erhöhte Gesamtvolumina (Abb. 20 und 21). Bei vier von diesen sieben Patienten (Nr. 1, 2, 3, 8) lag allerdings parallel eine Thrombozytopenie und eine Anämie vor. Die drei übrigen Hunde (Nr. 5, 7, 9) wiesen eine nur geringgradige Anämie (Hämatokrit: 35 % > x ≤ 38 %) und/oder geringgradige Thrombozytopenie (Thrombozytenzahl: 110.000/µl > x ≤ 153.000/µl) auf (Tab. 11). Auch für die Kollagen/Epinephrin-Meßzelle ergab sich insgesamt ein höherer Median sowohl für die Verschlußzeit als auch für das Gesamtvolumen. Für die Verschlußzeit lag der Median bei 300 Sekunden (Kontrolle: 163 sec; p=0,0002), für das Gesamtvolumen bei 729 µl (Kontrolle: 414 µl; p<0,0001). Mit dieser Meßzelle wurde bei sechs Hunden eine über den Meßbereich hinausgehende Verschlußzeit gemessen (Nr. 1, 3, 4, 5, 7, 9). Bei drei (Nr. 1, 3, 4) dieser Patienten lag gleichzeitig eine Thrombozytopenie und/oder eine Anämie vor, bei den übrigen (Nr. 5, 7, 9) eine nur geringgradige Thrombozytopenie und/oder Anämie. Das Gesamtvolumen lag bei fünf Patienten oberhalb des Referenzbereiches (Nr. 1, 2, 4, 5, 8). Die In-vivo-Blutungszeiten waren bei jeweils sechs Hunden verlängert (Nr. 1, 2, 3, 5, 8, 9) (jeweils p<0,0001) (Tab. 11). Die Einzelwerte der Verschlußzeit und des Gesamtvolumens sind im tabellarischen Anhang (Tab. 42) aufgeführt.

108

Tab. 11: Thrombozytenzahl, Hämatokrit, kapilläre Blutungszeit und subaquale Blutungszeit von Hunden mit Urämie (n=10): Einzelwerte, Median, Minimum, Maximum und aus dem statistischen Vergleich mit der Gruppe der gesunden Hunde (n=136) resultierender p-Wert (Mann-Whitney-Test). Sternchen (*) kennzeichnen außerhalb des Referenzbereiches liegende Werte.

Hund Nr. Thrombozyten-

zahl (x 103/µl)

Hämatokrit (%)

kapilläre Blutungszeit

(sec)

subaquale Blutungszeit

(sec) Referenz-bereich 153 - 439 38 - 56 60 - 150 45 - 90

1 161 17,2* 270* 285*

2 116* 22,2* 420* 300*

3 77* 29,9* 300* 300*

4 268 27,9* 105 90

5 150* 39,0 300* 270*

6 162 41,0 90 60

7 110* 35,6* 150 90

8 83* 20,9* 300* 300*

9 203 39,7 210* 150*

10 319 19,2* 90 60

Median 156 28,8 240 210

Minimum 77 17,2 90 60

Maximum 319 41,0 420 300

p-Wert 0,0003 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001

109

Abb. 20: Verschlußzeit gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle bei Hunden mit Urämie (n=10) mit Markierung des 2,5 %- und 97,5 %-Quantils der Werte von 136 bzw. 128 gesunden Hunden als Referenzbereichsgrenzen mit gestrichelten Linien. Dreiecke kennzeichnen als Mindestwert angegebene Ergebnisse. Nicht ausgefüllte Kästchen bzw. Dreiecke repräsentieren Ergebnisse von Blutproben mit im Referenzbereich liegender Erythrozyten- und Thrombozytenzahl. Die Werte der Hunde mit einer Thrombozytopenie (Thrombozytenzahl < 153.000/µl) und/oder einem Hämatokrit < 37,5 % sind durch einen ausgefüllten Marker dargestellt. Die neben den Kästchen befindlichen Zahlen entsprechen den Patientennummern aus Tabelle 11.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

Verschlußzeit (sec)

Kollagen/ADP-Meßzelle

Kollagen/Epinephrin-Meßzelle

>300

6

10

4

5

97 2

8

1

3

10

26

8

5 7 9431

110

Abb. 21: Gesamtvolumen gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle bei Hunden mit Urämie (n=10) mit Markierung des 2,5 %- und 97,5 %-Quantils der Werte von 136 bzw. 128 gesunden Hunden als Referenzbereichsgrenzen mit gestrichelten Linien. Die neben den Kästchen befindlichen Zahlen entsprechen den Patientennummern aus Tabelle 11. Bezüglich der Marker siehe auch Legende zu Abb. 20.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

Gesamtvolumen (µl)

Kollagen/ADP -Meßzelle

Kollagen/Epinephrin-Meßzelle

4

3

128

7

95106

10

3

9

6

71

45

82

111

13. Hepatopathien Von insgesamt neun Hunden mit histologisch nachgewiesener Hepatopathie wiesen vier mit der Kollagen/ADP-Meßzelle eine verlängerte Verschlußzeit, drei ein erhöhtes Gesamtvolumen auf. Nur bei einem Hund war die mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle gemessene Verschlußzeit über den Meßbereich hinaus verlängert, bei einem weitereren war mit dieser Meßzelle das Gesamtvolumen erhöht (Tab. 12). Von den zwei Hunden mit Leberzirrhose wurde bei einem mit der Kollagen/ADP-Meßzelle eine verlängerte Verschlußzeit sowie mit beiden Meßzellen erhöhte Gesamtvolumina gemessen. Zudem war bei beiden Tieren die subaquale In-vivo-Blutungszeit verlängert. Bei beiden Hunden lagen sowohl Thrombozytenzahl als auch Hämatokrit im Referenzbereich. Von den beiden Patienten mit Hepatose wies einer mit der Kollagen/ADP-Meßzelle eine verlängerte Verschlußzeit und ein erhöhtes Gesamtvolumen auf sowie eine über den Meßbereich hinaus verlängerte Verschlußzeit mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle. Bei diesem Patienten lagen jedoch gleichzeitig eine deutliche Thrombozytopenie und Anämie vor. Bei dem Patienten ohne Veränderung der Meßparameter des Plättchenfunktionsanalysengerätes war die subaquale Blutungszeit geringgradig verlängert, die kapilläre lag innerhalb des Referenzbereiches, bei dem zweiten Patienten lagen sowohl die kapilläre als auch die subaquale In-vivo-Blutungszeit innerhalb der jeweiligen Referenz-bereiche. Bei zwei von drei Patienten mit Leberzelldegeneration wurde mit der Kollagen/ADP-Meßzelle eine geringgradig verlängerte Verschlußzeit, bei dem dritten ein erhöhtes Gesamtvolumen gemessen. Gleichzeitig bestand bei einem dieser Hunde eine geringgradige Thrombozytopenie (Thrombozytenzahl: 120.000/µl > x ≤ 153.000/µl), bei einem zweiten eine geringgradige Anämie (Hämatokrit: 34 % > x ≤ 38 %). Mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle lagen Verschlußzeit und Gesamtvolumen bei diesen Tieren im Referenzbereich. Die In-vivo-Blutungszeiten waren nur bei einem der Hunde mit Leberzelldegeneration verlängert. Bei dem Hund mit Tumormetastasen in der Leber lagen die Verschlußzeiten und Gesamtvolumina beider Meßzellen sowie die In-vivo-Blutungszeiten im Referenzbereich, ebenso bei dem Hund mit chronisch-aktiver Hepatitis.

112

Tab. 12: Thrombozytenzahl (Thrz.), Hämatokrit (HTK), kapilläre Blutungszeit (BZ 1), subaquale Blutungszeit (BZ 2), Verschlußzeit (VZ) und Gesamtvolumen (GV) der Kollagen/ADP-Meßzelle (Koll/ADP) und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle (Koll/Epi) von Hunden mit verschiedenen Lebererkrankungen (n=11). Sternchen (*) kennzeichnen außerhalb des Referenzbereiches (Ref.) liegende Werte.

Koll/ADP Koll/Epi Patient

Nr.

Thrz. (x 103/

µl)

HTK (%)

BZ 1 (sec)

BZ 2 (sec) VZ

(sec) GV (µl)

VZ (sec)

GV (µl)

Ref. 153-439 38-56 60-150 45-90 53-98 227 -318 92-300 296 -

720

1a 372 42,3 105 90 67 284 164 415

1b 268 42,8 150 120* 131* 344* 264 750*

2a 129* 49,9 120 105* 85 287 249 649

2b 9* 24,3* 120 75 185* 408* >300 559

3a 527* 34,3* 150 75 96 344* 265 640

3b 128* 59,9* 105 75 101* 275 211 447

3c 379 47,0 210* 150* 105* 309 185 530

4 377 48,5 75 60 72 267 146 348

5 298 41,0 90 75 54 256 105 360 Patient 1a, 1b = Leberzirrhose mit Kupferspeicherung Patient 2a = Hepatose mit massiver Destruktion der organspezifischen Strukturen Patient 2b = Hepatose mit diffuser Vakuolisierung der Leberzellen Patient 3a = vakuoläre Leberzelldegeneration, degenerative Leberver- fettung Patient 3b = hydropische Leberzelldegeneration, degenerative Leberver- fettung, reaktive Hepatitis, mittelgradige Cholestasis Patient 3c = akute degenerative Hepatopathie, ausgeprägte Cholestase Patient 4 = Tumormetastasen in der Leber, Verdacht auf Fibrosarkom Patient 5 = hochgradige chronisch-aktive Hepatitis, Verdacht auf Leptospirose

113

13.1. Ikterus Bei Messungen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle lag die mediane Verschlußzeit bei den Hunden mit Ikterus (101 sec) höher als bei der Kontrollgruppe (73 sec) (p=0,0459). Gleiches ergab sich für das mit dieser Meßzelle bestimmte Gesamtvolumen (Ikterus: 287 µl, Kontrollgruppe: 264 µl) (p=0,0436). Drei Patienten hatten mit der Kollagen/ADP-Meßzelle verlängerte Verschlußzeiten (Tab. 12: Nr. 3b, 3c und Tab. 44a), nur einer ein gegenüber dem Referenzbereich erhöhtes Gesamtvolumen (Tab. 44a). Bei diesen drei Hunden lag jedoch auch eine geringgradige Thrombozytopenie vor, bei einem zudem eine Anämie. Zwei dieser Hunde hatten auch verlängerte In-vivo-Blutungszeiten (Tab.12: 3c, Tab. 44a). Die subaquale Blutungszeit war zusätzlich bei einem dritten Hund mit im Referenzbereich liegenden Ergebnissen der Kollagen/ADP-Meßzelle verlängert (Tab. 12: Nr. 2a). Für die Kollagen/Epinephrin-Meßzelle ergab sich weder für die Verschlußzeit (p=0,2636) noch für das Gesamtvolumen (p=0,0694) ein wesentlicher Unterschied im Vergleich der Mediane dieser Gruppe und der Kontrollgruppe. Mit dieser Meßzelle konnte bei einem Hund nur ein Mindestwert ermittelt werden, das Gesamtvolumen war bei diesem erhöht (Tab. 12: Patient Nr. 6). Gleichzeitig bestand bei diesem Hund jedoch eine geringgradige Thrombozytopenie und eine Anämie. Die übrigen Ergebnisse dieser Meßzelle lagen im Referenz- bzw. Meßbereich. 14. Portosystemischer Shunt Bei allen zehn in diese Studie eingegangenen Hunden mit portosystemischem Shunt lagen die Verschlußzeiten innerhalb der Referenzbereiche. Zwei Hunde (Nr. 6, 10) hatten mit der Kollagen/ADP-Meßzelle ein erhöhtes Gesamtvolumen. Im Vergleich zum Referenzbereich des adulten Hundes bestand bei einem von diesen (Nr. 6) gleichzeitig eine Thrombozytopenie und eine Anämie (Tab. 13). Der statistische Vergleich der Mediane dieser Gruppe (72 sec) mit der Kontrollgruppe (73 sec) ergab für die Verschlußzeit keinen Unterschied (p=0,3789), beim Gesamtvolumen lag der Median dieser Gruppe (284 µl) höher als in der Kontrollgruppe (264 µl) (p=0,0071). Mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle wurde bei einem Hund eine über 300 Sekunden liegende Verschlußzeit gemessen, bei zwei weiteren Hunden konnte nur ein Mindestwert ermittelt werden. Bei diesen drei Hunden war zudem das Gesamtvolumen erhöht (Abb. 22 und 23). Bei zwei von diesen Hunden lag jedoch gleichzeitig eine Thrombozytopenie und ein (im Vergleich zum Referenzbereich des adulten Hundes) verminderter Hämatokrit vor. Die mediane

114

Verschlußzeit (212 sec) der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle war für diese Gruppe höher als in der Kontrollgruppe (163 sec) (p=0,0212), ebenso wie das mediane Gesamtvolumen in dieser Gruppe (639 µl) über dem der Kontrollgruppe (414 µl) lag (p<0,0001). Die In-vivo-Blutungszeiten lagen bei allen zehn Hunden im Referenzbereich (Tab. 13). Die Einzelwerte der Verschlußzeiten und der Gesamtvolumina sind im tabellarischen Anhang (Tab. 46) aufgeführt.

115

Tab. 13: Thrombozytenzahl, Hämatokrit, kapilläre Blutungszeit und subaquale Blutungszeit von Hunden mit portosystemischem Shunt (n=10): Einzelwerte, Median, Minimum, Maximum und aus dem statistischen Vergleich mit der Gruppe der gesunden Hunde (n=136) resultierender p-Wert (Mann-Whitney-Test). Sternchen (*) kennzeichnen außerhalb des Referenzbereiches liegende Werte.

Hund Nr. Thrombozyten-

zahl (x 103/µl)

Hämatokrit (%)

kapilläre Blutungszeit

(sec)

subaquale Blutungszeit

(sec) Referenz-bereich + 153 - 439 38 - 56 60 - 150 45 - 90

1 322 38,1 105 90

2 231 38,2 90 60

3 371 38,8 75 60

4 355 41 90 75

5 119* 35,9* 105 75

6 95* 29,9* 90 75

7 168 34,8* 90 60

8 181 31* 75 75

9 119* 42 90 60

10 194 40 90 60

Median 188 38,2 90 75

Minimum 95 29,9 75 60

Maximum 371 42,0 105 90

p-Wert 0,0444 < 0,0001 0,3383 0,2912

+ = adulte Hunde

116

Abb. 22: Verschlußzeit gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle bei Hunden mit portosystemischem Shunt (n=10) mit Markierung des 2,5 %- und 97,5 %-Quantils der Werte von 136 bzw. 128 gesunden Hunden als Referenzbereichsgrenzen mit gestrichelten Linien. Die neben den Kästchen befindlichen Zahlen entsprechen den Patientennummern aus Tabelle 13. Bezüglich der Marker siehe auch Legende zu Abb. 20.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

Kollagen/ADP -Meßzelle

Kollagen/Epinephrin-Meßzelle

Verschlußzeit (sec)

>300

387 456 21 910

47

98 10

2613

5

117

Abb. 23: Gesamtvolumen gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle bei Hunden mit portosystemischem Shunt (n=10) mit Markierung des 2,5 %- und 97,5 %-Quantils der Werte von 136 bzw. 128 gesunden Hunden als Referenzbereichsgrenzen mit gestrichelten Linien. Die neben den Kästchen befindlichen Zahlen entsprechen den Patientennummern aus Tabelle 13. Bezüglich der Marker siehe auch Legende zu Abb. 20.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

Kollagen/ADP -Meßzelle

Kollagen/Epinephrin-Meßzelle

Gesamtvolumen (µl)

749

310

82

561

106 1

8372 49 5

118

15. Leishmaniose In der Gruppe der Hunde mit Leishmaniose ergab sich mit der Kollagen/ADP-Meßzelle im Vergleich mit der Kontrollgruppe sowohl für die Verschlußzeit (125 sec, Kontrollgruppe: 73 sec) als auch für das Gesamtvolumen (323 µl; Kontrollgruppe: 264 µl) ein höherer Medianwert (jeweils p<0,0001).Von den zwölf in diese Untersuchung eingegangenen Hunden mit Leishmaniose wiesen sechs (Nr. 1, 2, 5, 6, 8, 11) mit der Kollagen/ADP-Meßzelle eine im Vergleich zum Referenzbereich verlängerte Verschlußzeit sowie ein erhöhtes Gesamtvolumen auf. Bei zwei weiteren Tieren war entweder die Verschlußzeit verlängert (Nr. 10) oder das Gesamtvolumen erhöht (Nr. 12). Bei sechs (Nr. 1, 2, 5, 10, 11, 12) von diesen acht Patienten lag jedoch eine deutliche Thrombozytopenie und/oder Anämie vor, einer wies eine nur geringgradige Anämie (Hämatokrit > 30,5 %) (Nr. 8) auf, bei einem (Nr. 6) lagen Thrombozytenzahl und Hämatokrit im Referenzbereich (Tab. 14). Mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle ergaben sich in dieser Gruppe ebenfalls höhere mediane Verschlußzeiten (238 sec) im Vergleich mit der Kontrollgruppe (163 sec) wie auch höhere mediane Gesamtvolumina (506 µl, Kontrollgruppe: 414 µl) (Verschlußzeit: p= 0,0014; Gesamtvolumen: p=0,0433). Bei Messung mit dieser Meßzelle überschritt die Verschlußzeit in vier Fällen (Nr. 1, 6, 8, 9) die Meßbereichsgrenze von 300 Sekunden (Abb. 24). Das Gesamtvolumen lag bei einem Hund (Nr. 12) außerhalb des Referenzbereiches (Abb. 25). Auch die medianen In-vivo-Blutungszeiten lagen in dieser Gruppe höher als in der Kontrollgruppe (p<0,0001). Bei fünf von den sieben Hunden, die mit der Kollagen/ADP-Meßzelle verlängerte Verschlußzeiten aufwiesen, wurde parallel eine verlängerte kapilläre Blutungszeit gemesssen (Nr. 1, 6, 8, 10, 11), die subaquale Blutungszeit war nur bei drei von diesen sieben Hunden (Nr. 1, 6, 8) verlängert. Darüber hinaus war die kapilläre und/oder subaquale Blutungszeit bei zwei Hunden (Nr. 3, 9) verlängert, welche keine Veränderungen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle aufwiesen (Tab. 14). Ein Vergleich der In-vivo-Blutungszeiten und der Ergebnisse des Thrombo-zytenfunktionsanalysengerätes mit der Globulinkonzentration der Proben ließ keinen wesentlichen Zusammenhang erkennen. Die Einzelwerte der Verschlußzeiten und der Gesamtvolumina sind im tabellarischen Anhang (Tab. 48) aufgeführt.

119

Tab. 14: Thrombozytenzahl, Hämatokrit, Globulinkonzentration (Globulinkonz.), kapilläre Blutungszeit und subaquale Blutungszeit von Hunden mit Leishmaniose (n=12): Einzelwerte, Median, Minimum, Maximum und aus dem statistischen Vergleich mit der Gruppe der gesunden Hunde (n=136) resultierender p-Wert (Mann-Whitney-Test). Sternchen (*) kennzeichnen außerhalb des Referenzbereiches liegende Werte.

Hund Nr. Thrombo-zytenzahl (x 103/µl)

Hämatokrit (%)

Globulin-konz. (g/dl)

kapilläre Blutungszeit

(sec)

subaquale Blutungszeit

(sec) Referenz-bereich 153 - 439 37,5 - 55,5 ?/. 60 - 150 45 - 90

1 43* 27,1* 5,94 345* 210*

2 31* 30,4* 8,63 90 75

3 147* 29,0* 3,09 150 135*

4 185 17,6* 7,16 120 90

5 69* 34,3* 8,93 90 75

6 202 38,6 4,83 270* 180*

7 220 47,0 7,08 120 75

8 170 30,7* 7,15 195* 120*

9 204 30,2* 10,87 210* 180*

10 162 25,4* 5,37 180* 90

11 61* 33,6* 6,83 180* 75

12 150* 14,6* 1,91 90 75

Median 156 30,3 6,96 165 90

Minimum 31 14,6 1,91 90 75

Maximum 220 47,0 10,87 345 210

p-Wert <0,0001 <0,0001 ?/. <0,0001 <0,0001

120

Abb. 24: Verschlußzeit gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle bei Hunden mit Leishmaniose (n=12) mit Markierung des 2,5 %- und 97,5 %-Quantils der Werte von 136 bzw. 128 gesunden Hunden als Referenzbereichsgrenzen mit gestrichelten Linien. Die neben den Kästchen befindlichen Zahlen entsprechen den Patientennummern aus Tabelle 13. Bezüglich der Marker siehe auch Legende zu Abb. 20.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

>300

Verschlußzeit (sec)

Kollagen/ADP -Meßzelle

Kollagen/Epinephrin-Meßzelle

74

3 9

10211

8 15

6

12

7

104

23

511

6198

12

121

Abb. 25: Gesamtvolumen gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle bei Hunden mit Leishmaniose (n=12) mit Markierung des 2,5 %- und 97,5 %-Quantils der Werte von 136 bzw. 128 gesunden Hunden als Referenzbereichsgrenzen mit gestrichelten Linien. Die neben den Kästchen befindlichen Zahlen entsprechen den Patientennummern aus Tabelle 14. Bezüglich der Marker siehe auch Legende zu Abb. 20.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

Kollagen/ADP-Meßzelle

Kollagen/Epinephrin-Meßzelle

Gesamtvolumen (µl)

79

412 32

11 12 58

1

6

7

10

52 4

3

119

86

1

12

122

16. Akute lymphatische Leukämie Auch in der Gruppe der Hunde mit akuter lymphatischer Leukämie lag der Median der mit der Kollagen/ADP-Meßzelle gemessenen Verschlußzeit (149 sec) deutlich höher als in der Kontrollgruppe (Verschlußzeit: 73 sec) (p=0,0001). Gleiches galt für das Gesamtvolumen (387 µl, Kontrollgruppe: 264 µl) (p<0,0001). Von den sieben untersuchten Hunden wiesen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle jeweils sechs eine verlängerte Verschlußzeit sowie ein erhöhtes Gesamtvolumen auf (Abb. 26 und 27). Ebenso ergab sich mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle eine höhere mediane Verschlußzeit (>286 sec) im Vergleich mit der Kontrollgruppe (Verschlußzeit: 163 sec) (p=0,0059) wie auch ein höheres medianes Gesamtvolumen (819 µl, Kontrollgruppe: 414 µl) (p=0,0026). Mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle wurde bei zwei Patienten (Nr. 3, 6) eine über 300 Sekunden liegende Verschlußzeit gemessen, bei drei weiteren Patienten (Nr. 4, 5, 6) konnte nur ein Mindestwert ermittelt werden (Abb. 26). Das Gesamtvolumen war bei fünf Hunden erhöht (Abb. 27). Bei allen Hunden lag jedoch zugleich eine Thrombozytopenie und/oder Anämie vor (Tab. 15). Die kapilläre Blutungszeit war bei vier Hunden (p=0,0003), die subaquale bei fünf Hunden verlängert (p=0,0002) (Tab. 15). Die Einzelwerte der Verschlußzeiten und der Gesamtvolumina sind im tabellarischen Anhang (Tab. 50) aufgeführt.

123

Tab. 15: Thrombozytenzahl, Hämatokrit, kapilläre Blutungszeit und subaquale Blutungszeit von Hunden mit akuter lymphatischer Leukämie (n=7): Einzel-werte, Median, Minimum, Maximum und aus dem statistischen Vergleich mit der Gruppe der gesunden Hunde (n=136) resultierender p-Wert (Mann-Whitney-Test). Sternchen (*) kennzeichnen außerhalb des Referenzbereiches liegende Werte.

Hund Nr. Thrombo-zytenzahl (x 103/µl)

Hämatokrit (%)

kapilläre Blutungszeit

(sec)

subaquale Blutungszeit

(sec) Referenz-bereich 153 - 439 38 - 56 60 - 150 45 - 90

1 28* 34,9* 150 75 2 47* 34,3* 75 60 3 81* 44,7 135 120* 4 91* 35,4* 240* 180* 5 17* 27,3* 480* 330* 6 68* 29,0* 330* 240* 7 52* 40,2 240* 210*

Median 52 34,9 240 180 Minimum 17 27,3 75 60 Maximum 91 44,7 480 330

p-Wert <0,0001 <0,0001 0,0003 0,0002

124

Abb. 26: Verschlußzeit gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle bei Hunden mit akuter lymphatischer Leukämie (n=7) mit Markierung des 2,5 %- und 97,5 %-Quantils der Werte von 136 bzw. 128 gesunden Hunden als Referenzbereichsgrenzen mit gestrichelten Linien. Die neben den Kästchen befindlichen Zahlen entsprechen den Patientennummern aus Tabelle 15. Bezüglich der Marker siehe auch Legende zu Abb. 20.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

Kollagen/ADP-Meßzelle

Kollagen/Epinephrin-Meßzelle

Verschlußzeit (sec)

>300

2

13

7

64

5

2

1

4

75

36

125

Abb. 27: Gesamtvolumen gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle bei Hunden mit akuter lymphatischer Leukämie (n=7) mit Markierung des 2,5 %- und 97,5 %-Quantils der Werte von 136 bzw. 128 gesunden Hunden als Referenzbereichsgrenzen mit gestrichelten Linien. Die neben den Kästchen befindlichen Zahlen entsprechen den Patientennummern aus Tabelle 15. Bezüglich der Marker siehe auch Legende zu Abb. 20.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

Kollagen/ADP-Meßzelle

Kollagen/Epinephrin-Meßzelle

Gesamtvolumen (µl)

2

1376

4

5

2

1

6

3

5 47

126

17. Chronische lymphatische Leukämie Die vier in dieser Arbeit untersuchten Hunde mit chronischer lymphatischer Leukämie wiesen ohne Ausnahme mit der Kollagen/ADP-Meßzelle verlängerte Verschlußzeiten sowie erhöhte Gesamtvolumina auf. Mit der Kollagen/Epi-nephrin-Meßzelle lag die Verschlußzeit bei zwei Hunden (Nr. 3, 4) über 300 Sekunden, bei den beiden anderen konnte nur ein Mindestwert bestimmt werden. Bei zwei Hunden (Nr. 1, 2) wurden mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle erhöhte Gesamtvolumina gemessen (Tab. 16). Die kapilläre Blutungszeit war bei vier, die subaquale Blutungszeit bei drei Hunden (Nr. 2, 3, 4) verlängert (Tab. 16). Zwar bestand bei drei Hunden (Nr. 1, 2, 4) parallel eine auffällige Anämie und/oder Thrombozytopenie, allerdings lag auch bei dem vierten Hund (Nr. 3, Gesamtleukozytenzahl: 117.000/µl) mit nur leichter Thrombozytopenie und Anämie eine auffällige Verlängerung der In-vivo-Blutungszeit vor. Alle Hunde wiesen eine deutliche Leukozytose auf.

127

Tab. 16: Thrombozytenzahl (Thrz.), Hämatokrit (HTK), Verschlußzeit (VZ), Gesamtvolumen (GV) (Kollagen/ADP-Meßzelle und Kollagen/Epinephrin-Meßzelle), kapilläre Blutungszeit (BZ 1) und subaquale Blutungszeit (BZ 2) von Hunden mit chronischer lymphatischer Leukämie (n=4). Sternchen (*) kennzeichnen außerhalb des Referenzbereiches liegende Werte.

Kollagen/ADP-Meßzelle

Kollagen/Epi-nephrin-Meßzelle Hund

Nr.

Thrz. (x 103/

µl)

HTK (%)

BZ 1 (sec)

BZ 2 (sec)

VZ (sec)

GV (µl)

VZ (sec)

GV (µl)

Ref.- bereich 153-439 38 -

56 60-150 45-90 53-98 227-318 92-300 296-720

1 26* 29* 180* 90 128* 356* >287 873*

2 56* 14,8* 210* 180* 129* 473* >202 869*

3 133* 37* 300* 240* >300* 848* >300 671

4 29* 25* 300* 210* >300* 640* >300 701

Ref.bereich = Referenzbereich 18. Malignes Lymphom Insgesamt ergab sich für die Kollagen/ADP-Meßzelle in der Gruppe der Hunde mit malignem Lymphom für die Verschlußzeit (96 sec) ein durchschnittlich höherer Median gegenüber der Kontrollgruppe (Verschlußzeit: 73 sec) (p=0,0477). Ebenso lag das mediane Gesamtvolumen dieser Hunde (305 µl) über dem der Kontrollgruppe (264 µl) (p=0,0327). Bei vier Hunden (Nr. 1, 4, 6, 7) der neun untersuchten Tiere lagen die Verschlußzeiten, bei drei Hunden (Nr. 1, 6, 7) die Gesamtvolumina der Kollagen/ADP-Meßzelle außerhalb des Referenzbereiches (Abb. 28 und 29, Tab. 17). Bei allen vier Hunden bestand eine Thrombozytopenie und/oder Anämie. Neben diesen vier Hunden bestand

128

bei vier weiteren Patienten (Nr. 2, 3, 5, 8) eine geringgradige Thrombozytopenie (Thrombozytenzahl > 80.000/µl) oder Anämie (Hämatokrit > 34%), bei einem (Nr. 9) lagen Thrombozytenzahl und Hämatokrit im Referenzbereich. Bei letztgenannten fünf Hunden lagen Verschlußzeit und Gesamtvolumen der Kollagen/ADP-Meßzelle im Referenzbereich. Auch für die Kollagen/Epinephrin-Meßzelle ergab sich für die Gesamtzahl der Hunde ein durchschnittlich höherer Median (Verschlußzeit: >287 sec) ver-glichen mit der Kontrollgruppe (163 sec) (p=0,0019). Gleiches galt für das mediane Gesamtvolumen (747 µl, Kontrollgruppe: 414 µl) (p=0,0008). Mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle wurde bei zwei Hunden (Nr. 1, 9) eine über 300 Sekunden liegende Verschlußzeit bestimmt, bei drei Patienten (Nr. 4, 6, 7) konnte nur ein Mindestwert ermittelt werden. Das Gesamtvolumen war bei fünf Hunden (Nr. 1, 4, 6, 7, 9) erhöht (Abb. 28 und 29). Auch die kapilläre und subaquale Blutungszeit war bei zwei Hunden (Nr. 1, 6) verlängert (p=0,0411 bzw. p=0,0179). Bei diesen beiden Hunden lag parallel eine deutliche Thrombozytopenie bzw. eine deutliche Anämie vor. Die Einzelwerte der Verschlußzeiten und Gesamtvolumina sind im tabellarischen Anhang aufgeführt (Tab. 51).

129

Tab. 17: Thrombozytenzahl, Hämatokrit, kapilläre Blutungszeit und subaquale Blutungszeit von Hunden mit malignem Lymphom (n=9): Einzelwerte, Median, Minimum, Maximum und aus dem statistischen Vergleich mit der Gruppe der gesunden Hunde (n=136) resultierender p-Wert (Mann-Whitney-Test). Sternchen (*) kennzeichnen außerhalb des Referenzbereiches liegende Werte.

Hund Nr. Thrombozyten-

zahl (x 103/µl)

Hämatokrit (%)

kapilläre Blutunsgzeit

(sec)

subaquale Blutungszeit

(sec) Referenz-bereich 153 - 439 38 - 56 60 - 150 45 - 90

1 11* 44,7 195* 165*

2 85* 49,2 90 90

3 231 36,5* 75 60

4 14* 40,0 90 60

5 197 34,5* 90 75

6 440 20,0* 240* 180*

7 9* 21,7* 120 75

8 83* 45,0 90 60

9 337 45,0 90 75

Median 85 40,0 90 75

Minimum 9 20,0 75 60

Maximum 440 49,2 240 180

p-Wert 0,0108 0,0012 0,0411 0,0179

130

Abb. 28: Verschlußzeit gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle bei Hunden mit malignem Lymphom (n=9) mit Markierung des 2,5 %- und 97,5 %-Quantils der Werte von 136 bzw. 128 gesunden Hunden als Referenzbereichsgrenzen mit gestrichelten Linien. Die neben den Kästchen befindlichen Zahlen entsprechen den Patientennummern aus Tabelle 17. Bezüglich der Marker siehe auch Legende zu Abb. 20.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

Kollagen/ADP-Meßzelle

Kollagen/Epinephrin-Meßzelle

Verschlußzeit (sec)

>300 1

7

6

4 28

3 9 5

3

5

27

6 48

9 1

131

Abb. 29: Gesamtvolumen gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle bei Hunden mit malignem Lymphom (n=9) mit Markierung des 2,5 %- und 97,5 %-Quantils der Werte von 136 bzw. 128 gesunden Hunden als Referenzbereichsgrenzen mit gestrichelten Linien. Die neben den Kästchen befindlichen Zahlen entsprechen den Patientennummern aus Tabelle 17. Bezüglich der Marker siehe auch Legende zu Abb. 20.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

Kollagen/ADP-Meßzelle

Kollagen/Epinephrin-Meßzelle

Gesamtvolumen (µl)

3

5

2

8

9

1

47 6

5 93

248

6

1

7

132

19. Multiples Myelom Bei den untersuchten sieben Proben der vier Hunde mit multiplem Myelom konnte bei vier Proben von drei Hunden kein Ergebnis bestimmt werden; bei diesen wurde der Meßfehler „Durchflußfehler“ - auch bei wiederholter Mes-sung - angegeben (Tab. 18). Alle übrigen Proben von zwei Patienten (Nr. 1b [nach Therapie], 3, 3a) zeigten mit der Kollagen/ADP-Meßzelle verlängerte Verschlußzeiten (ein Wert wurde nur als Mindestwert ermittelt). Bei Hund Nr. 3a wurde ein Mindestwert bestimmt und gleichzeitig der Meßfehler „Durchflußfehler“ angegeben. Ein erhöhtes Gesamtvolumen lag bei Messung mit der Kollagen/ADP-Meßzelle bei beiden Proben von Patient Nr. 3 vor, während es bei der Probe 1b normal war. Diese drei Proben wiesen eine im Referenzbereich liegende Thrombozytenzahl auf, bei zwei Proben (Nr. 3, 3a) war der Hämatokrit jedoch deutlich vermindert. Mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle lagen die Verschlußzeiten bei allen drei Proben von zwei Hunden, bei denen ein Wert ermittelt werden konnte, über 300 Sekunden. Die dazugehörenden Gesamtvolumina befanden sich im Referenz-bereich. Die In-vivo-Blutungszeiten waren - abgesehen von Untersuchung 1b - bei allen untersuchten Hunden über den Referenzbereich hinaus verlängert (Tab. 18).

133

Tab. 18: Thrombozytenzahl (Thrz.), Hämatokrit (HTK), kapilläre Blutungszeit (BZ 1), subaquale Blutungszeit (BZ 2), Verschlußzeit (VZ) und Gesamt-volumen (GV) der Kollagen/ADP- (ADP) und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle (Epi) von Hunden mit multiplem Myelom (Proben: n=7; Hunde: n=4). Sternchen (*) kennzeichnen außerhalb des Referenzbereiches liegende Werte. Lfd. Nr.

Thrz. (x103/

µl)

HTK (%)

VZ ADP (sec)

GV ADP (µl)

VZ Epi

(sec)

GV Epi (µl)

BZ 1 (sec)

BZ 2 (sec)

Ref. 153-439

37,5-55,5 53-98 227-318 92-300 296-720 60-150 45-90

1 75* 22,7* Durchflußfehler 300* n.u.

1a 273 34,8* Durchflußfehler 360* n.u.

1b 223 39,4 123* 309 >300 598 150 90

2 174 42,3 Durchflußfehler 510* 420*

3 213 26,1* 180* 379* >300 589 240* 210*

3a 202 26,2* >116* und D. 352* >300 625 210* n.u.

4 115* 46,3 Durchflußfehler n.u. n.u.

Ref. = Referenzbereich; n.u. = nicht untersucht; a, b = Wiederholungs-messungen an verschiedenen Tagen; 1a = Messung unter Melphalan-Therapie; D. = Durchflußfehler

134

20. Hyperfibrinolyse Alle untersuchten Hunde mit Hyperfibrinolyse (n=8) wiesen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle verlängerte Verschlußzeiten sowie erhöhte Gesamtvolumina auf (Abb. 30a, b). Die Verschlußzeiten wurden hierbei bei sieben Hunden nicht als exakter Wert bestimmt, sondern nur als Mindestwert angegeben. Auch mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle waren die Gesamtvolumina bei allen Hunden erhöht, bei den Verschlußzeiten konnte bei allen Hunden kein exakter Wert, sondern nur ein Mindestwert bestimmt werden (Abb. 30a, b). Statistisch gesehen lag somit der durchschnittliche Median dieser Gruppe für die Kollagen/ADP-Meßzelle sowohl für die Verschlußzeit (257 sec) als auch für das Gesamtvolumen (871 µl) höher als in der Kontrollgruppe (Verschlußzeit: 73 sec; Gesamtvolumen: 264 µl) (p<0,0001 bzw. p=0,0011). Gleiches galt für Verschlußzeit (234 sec) und Gesamtvolumen (871 µl) der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle (Kontrollgruppe: Verschlußzeit: 163 sec; Gesamtvolumen: 414 µl) (jeweils p<0,0001). Bei allen Hunden lag eine Thrombozytopenie, bei sieben Hunden zudem eine Anämie vor (Tab. 19). Die hochgradigen Veränderungen schlossen auch die drei Hunde (Nr. 1, 3, 8) mit allenfalls geringgradiger Anämie (Hämatokrit = 36 %) und einer Thrombozyten-zahl von 49.000-63.000/µl ein. Die In-vivo-Blutungszeiten waren bei fünf von sechs untersuchten Hunden verlängert (jeweils p<0,0001) (Tab. 19). Die Einzelwerte der Verschlußzeiten und der Gesamtvolumina sind im tabellarischen Anhang (Tab. 52) aufgeführt.

135

Tab. 19: Thrombozytenzahl, Hämatokrit, kapilläre Blutungszeit und subaquale Blutungszeit von Hunden mit Hyperfibrinolyse (n=8): Einzelwerte, Median, Minimum, Maximum und aus dem statistischen Vergleich mit der Gruppe der gesunden Hunde (n=136 bzw. 128) resultierender p-Wert (Mann-Whitney-Test). Sternchen (*) kennzeichnen außerhalb des Referenzbereiches liegende Werte.

Hund Nr. Thrombozyten-

zahl (x 103/µl)

Hämatokrit (%)

kapilläre Blutungszeit

(sec)

subaquale Blutungszeit

(sec) Referenz-bereich 153 - 439 38 - 56 60 - 150 45 - 90

1 60* 45,6 480* 225* 2 30* 23,3* 120 90 3 63* 35,9* n.u. n.u. 4 47* 24,4* n.u. n.u. 5 76* 24,0* 300* 270* 6 68* 18,3* > 900* > 900* 7 22* 11,7* 330* 315* 8 49* 36,4* 360* 300*

Median 55 24,2 345 285 Minimum 22 11,7 120 90 Maximum 76 45,6 900 900

p-Wert <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 n.u. = nicht untersucht

136

Abb. 30 a,b: Verschlußzeit und Gesamtvolumen gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle bei Hunden mit Hyperfibrinolyse (n=8) mit Markierung des 2,5 %- und 97,5 %-Quantils der Werte von 136 bzw. 128 gesunden Hunden als Referenzbereichsgrenzen mit gestrichelten Linien. Die neben den Kästchen befindlichen Zahlen entsprechen den Patientennummern aus Tabelle 19. Bezüglich der Marker siehe auch Legende zu Abb. 20.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

Kol lagen/ADP-Meßzelle

Kol lagen /Epinephrin -Meßzelle

Verschlußzeit (sec)

> 3 0 0

71

2

46

53

8

7

24

51

6

8

3

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

Kol lagen/ADP-Meßzelle

Kol lagen /Epinephrin -Meßzelle

Gesamtvolumen (µl)

5 27436

8

1

3 7 5 6 4 2 1

8

a

b

137

21. Cumarinvergiftung und Hämophilie A Bei den acht in diese Arbeit eingegangenen Hunden mit Cumarinvergiftung lag die mediane Verschlußzeit der Kollagen/ADP-Meßzelle (62 sec) sogar unter der der Kontrollgruppe (73 sec; p=0,0083). Die medianen Gesamtvolumina entsprachen einander (Patienten: 264 µl; Kontrollgruppe: 264 µl) (p=0,7238). Von den acht Hunden mit Cumarinvergiftung wies ein Hund mit der Kollagen/ADP-Meßzelle ein erhöhtes Gesamtvolumen auf, bei diesem Hund lag gleichzeitig eine Anämie vor; die Verschlußzeiten lagen bei allen acht Hunden im Referenzbereich (Abb. 31a, b). Mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle ergab sich kein signifikanter Unterschied zwischen den medianen Verschlußzeiten dieser Gruppe (162 sec) im Vergleich mit der Kontrollgruppe (163 sec) (p=0,7885) wie auch kein deutlicher Unterschied zwischen den medianen Gesamtvolumina (456 µl, Kontrollgruppe: 414 µl) (p=0,2611). Mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle wurde bei zwei Hunden ein erhöhtes Gesamtvolumen gemessen, bei diesen wurden zudem die Verschlußzeiten nur als Mindestwert ausgegeben (Abb. 31a, b). Diese zwei Hunde wiesen einen Hämatokrit < 30 % auf. Von den drei untersuchten Hunden mit Hämophilie A wiesen alle mit beiden Meßzellen im Referenzbereich liegende Verschlußzeiten und Gesamtvolumina auf (Abb. 32a, b). Die Einzelmeßwerte sind in der Tab. 53-55 im tabellarischen Anhang aufgeführt.

138

Abb. 31a, b: Verschlußzeit und Gesamtvolumen gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle bei Hunden mit Cumarinvergiftung (n=8) mit Markierung des 2,5 %- und 97,5 %-Quantils der Werte von 136 bzw. 128 gesunden Hunden als Referenzbereichsgrenzen mit gestrichelten Linien. Die neben den Kästchen befindlichen Zahlen entsprechen den Patientennummern aus Tabelle 54. Bezüglich der Marker siehe auch Legende zu Abb. 20.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

Verschlußzeit (sec)

Kollagen/ADP -Meßzelle

Kollagen/Epinephrin -Meßzelle

25643

871

58

6

2

3

7

1

4

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

Kollagen/ADP-Meßzelle

Kollagen/Epinephrin -Meßzelle

Gesamtvolumen (µl)

1

3

6

285

47

25

46 37

1

8

a

b

139

Abb. 32a, b: Verschlußzeit und Gesamtvolumen gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle bei Hunden mit Hämophilie A (n=3) mit Markierung des 2,5 %- und 97,5 %-Quantils der Werte von 136 bzw. 128 gesunden Hunden als Referenzbereichsgrenzen mit gestrichelten Linien. Bezüglich der Marker siehe auch Legende zu Abb. 20.

a

b

0

2 0

4 0

6 0

8 0

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

Kollagen/ADP -Meßzelle

Kollagen/Epinephrin-Meßzelle

Verschlußzeit (sec)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

Kollagen/ADP-Meßzelle

Kollagen/Epinephrin -Meßzelle

Gesamtvolumen (µl)

140

E. Diskussion Der mit der Kollagen/ADP-Meßzelle für den Hund ermittelte Referenzbereich für die Verschlußzeit (53 - 98 sec) lag im Bereich der Mehrzahl der für den Menschen bestimmten Referenzwerte (z.B.: SIO et al. 1997; RAND et al. 1998; POUJOL et al. 1998). So ergab sich beim Menschen zum Beispiel in der Studie von KARGER et al. (1997) für diese Meßzelle ein Referenzbereich von 62 - 100 sec. Demgegenüber befand sich der für die Kollagen/Epinephrin-Meßzelle erstellte Referenzbereich der Verschlußzeit (92 - >300 sec) deutlich über den von KARGER et al. (1997) für den Menschen erarbeiteten Werten (82 - 150 sec), obgleich auch diese erheblich höher als bei der Kollagen/ADP-Meßzelle lagen. Der Grund für die langen Verschlußzeiten sowie die starke Streuung der mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle ermittelten Werte beim Hund ist, daß Epinephrin beim Hund keine signifikante Thrombozytenaggregation auszulösen vermag (SCHULZE 1998). Mit Ausnahme der endogenen Agonisten Thrombin und Kollagen, welche bei allen Säuger-Thrombozyten eine rasche irreversible Aggregation induzieren, besteht zwischen den einzelnen Spezies eine große Variationsbreite bezüglich der Antwort der Blutplättchen auf andere Agonisten. Sie ist abhängig von verschiedenen Faktoren, zum Beispiel der Art und Anzahl der Agonist-Rezeptoren auf der Thrombozytenoberfläche (GENTRY 2000). Die für das Gesamtvolumen ermittelten Referenzbereiche spiegelten die Verhältnisse der Verschlußzeiten wider. Eine Übereinstimmung mit den Angaben für den Menschen und somit eine gute Präzision für Messungen in der Serie fand sich bei der Präzisionsanalyse mit der Kollagen/ADP-Meßzelle. Hier ergab sich in der eigenen Untersuchung für die Verschlußzeit ein Variationskoeffizient von im Mittel (Median) 7,3%. In der Literatur werden für Verschlußzeitmessungen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle am Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 Variationskoeffizienten von im Mittel 9,5 % (MAMMEN et al. 1995) bzw. 9,6 % (HARRISON et al. 1999) angegeben. Die Differenz zwischen den eigenen erarbeiteten Variationskoeffizienten und denen der Literaturangaben liegt vermutlich in der geringeren Anzahl der Wiederholungsmessungen in der vorliegenden Arbeit (n=5) im Vergleich mit den angegebenen Studien (n=10 [MAMMEN et al. 1995]; n=20 [HARRISON et al. 1999]). Übereinstimmend mit den Untersuchungen von WILMER et al. (1997) und MAMMEN et al. (1998) erbrachte der in dieser Arbeit vorgenommene Vergleich verschiedener Produktionschargen der Kollagen/ADP-Meßzelle

141

sowohl für die Verschlußzeit als auch für das Gesamtvolumen keine statistisch signifikanten Unterschiede. In den angegebenen Arbeiten fand sich ebenfalls kein Unterschied beim Vergleich verschiedener Produktionschargen der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle (WILMER et al. 1997; MAMMEN et al. 1998). Auf eine entsprechende Untersuchung der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle in wurde in der eigenen Arbeit jedoch aufgrund der begrenzten klinischen Anwendbarkeit dieser Meßzelle beim Hund verzichtet. Die für die Kollagen/ADP-Meßzelle erzielten Ergebnisse deuten an, daß für Messungen mit diesem Meßzellentyp beim Hund auf die Ermittlung chargenspezifischer Referenzbereiche verzichtet werden kann. Die von verschiedenen Autoren erstellte Empfehlung, die Messung der In-vitro-Blutungszeit innerhalb eines Zeitintervalls von ≥ 30 Minuten (Vorläufergerät; KRETSCHMER et al. 1990) und < 3 Stunden (Vorläufergerät; KRETSCHMER et al. 1990) beziehungsweise 5 Stunden (Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100) (ALSHAMEERI u. MAMMEN 1995; MAMMEN et al. 1995; SIO et al. 1997; HARRISON et al. 1999) nach Entnahme der Blutprobe vorzunehmen, konnte beim Hund zumindest für Messungen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle nicht nachvollzogen werden. Für diese Meßzelle ergab sich beim globalen statistischen Vergleich der Meßergebnisse eines Zeitintervalls von 0-24 Stunden nach Probenentnahme weder für die Verschlußzeit noch für das Gesamtvolumen ein Unterschied. So wäre für diese Meßzelle beim Hund sogar ein Probenversand zur Bestimmung der In-vitro-Blutungszeit in einem Fremdlabor denkbar. Mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle fand sich insbesondere eine deutliche Zunahme der Streuung der Meßwerte ab einer Probenlagerungszeit von einer Stunde. Somit stehen die eigenen Ergebnisse für diese Meßzelle im Widerspruch zu den Angaben aus der Literatur (SIO et al. 1997; HARRISON et al. 1999) und legen die Empfehlung nahe, Messungen mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle innerhalb von dreißig Minuten nach Probenentnahme vorzunehmen. Ein Einfluß der Lagerung auf die Plättchenfunktion wurde in verschiedenen Studien zur Lagerungsfähigkeit der Thrombozyten festgestellt (NOLTE et al. 1988b, NOLTE u. MISCHKE 1995; KLEIN et al. 1999). Funktionsverluste der Plättchen werden auf metabolische und strukturelle Veränderungen der Blutplättchen während der Lagerung zurückgeführt. So kommt es in Abhängigkeit von den Lagerungsbedingungen zu einer unterschiedlich schnell auftretenden Permeabilitätsstörung oder Zerstörung der Zellmembran der Plättchen (KLEIN et al. 1999). Bei den metabolischen Veränderungen ist vor allem der durch den fortdauernden Energiestoffwechsel der Thrombozyten

142

bedingte Abfall des pH-Wertes hervorzuheben (NOLTE et al. 1988b; KLEIN et al. 1999). Der in der vorliegenden Arbeit in Blutproben vom Hund aufgezeigte auffällige Einfluß des Hämatokrits der Blutprobe auf die mit der Kollagen/ADP-Meßzelle gemessene Verschlußzeit zeigte sich auch bei Studien in der Humanmedizin. Mehrere In-vitro-Untersuchungen zum Hämatokrit sowohl am Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 als auch am Vorläufermodell, dem Thrombostat, zeigten eine klare negative Korrelation zwischen Hämatokrit und Verschlußzeit der Probe (DIETRICH et al. 1990b; DIETRICH et al. 1995a; SÖHNGEN et al. 1995; KUNDU et al. 1996b). So führte in der Untersuchung von SÖHNGEN et al. (1995) ein Hämatokrit von 55 % zu einem unmittelbaren Verschluß des Filters, während bei einem Hämatokrit < 15 % bei gleicher Thrombozytenzahl (200.000/µl) keine Verschlußzeiten mehr meßbar waren. Dieses Phänomen läßt sich dadurch erklären, daß ein niedriger Hämatokrit zu einer niedrigen Viskosität führt und damit zu einem Anstieg des Blutflusses. Außerdem resultiert ein niedriger Hämatokrit in einer geänderten Verteilung der verschiedenen Blutzellen im Gefäß, bei einem niedrigen Hämatokrit fließen die Plättchen in der In-vitro-Kapillare wie im Blutgefäß weiter von der Wand entfernt (DIETRICH et al. 1995a). Basierend auf Blutproben von thrombozytopenischen Patienten und gesunden Hunden wurde in dieser Arbeit eine negative, statistisch signifikante Korrelation zwischen Verschlußzeit bzw. Gesamtvolumen und Thrombozytenzahl der untersuchten Probe nachgewiesen. Diese Beziehung wurde auch beim Menschen in mehreren klinischen (KRETSCHMER et al. 1993, 1994, 1995) und experimentellen Studien beschrieben (KRETSCHMER et al. 1995; SÖHNGEN et al. 1995; KUNDU et al. 1996b). In den klinischen Studien (KRETSCHMER et al. 1993, 1994, 1995) wurden Blutproben unterschiedlicher Thrombozyten-zahl von Patienten mit verschiedenen Grunderkrankungen wie zum Beispiel der immunbedingten Thrombozytopenie oder der Leukämie untersucht, in den experimentellen (KRETSCHMER et al. 1995; SÖHNGEN et al. 1995; KUNDU et al. 1996b) wurde durch In-vitro-Variation der Thrombozytenzahl in Blutproben gesunder Probanden der Einfluß der Plättchenzahl auf die Verschlußzeit überprüft, wobei sich zunehmend längere Verschlußzeiten bei abnehmender Thrombozytenzahl ergaben. In der eigenen Arbeit fand sich für Hunde mit Thrombozytopenie eine niedrigere Korrelation zwischen der mit der Kollagen/ADP-Meßzelle gemessenen Verschlußzeit und der Thrombozytenzahl (r = - 0,58) als es in der Literatur für die klinischen Studien beim Menschen beschrieben wird (r = - 0,74

143

bzw. - 0,81; nach Umrechnung des in der Literatur angegebenen Bestimmt-heitsmaßes [r2]) (KRETSCHMER et al. 1993 bzw. 1995). Zu den Differenzen zwischen den beiden Studien kann auch eine unterschiedliche Zusammen-setzung des Patientengutes beitragen. So kann zum Beispiel auch bei Patienten mit Thrombozytopenie parallel eine Thrombozytenfunktionsstörung vorliegen, wie es KRISTENSEN et al. (1994) und HEYNS et al. (1978) bei Patienten mit immunbedingter Thrombozytopenie nachgewiesen haben. Dieser Zusammen-hang zeigte sich auch anhand der Daten der Studie von KRETSCHMER et al. (1995), in der bei Blutproben gesunder Probanden mit experimentell verminderter Thrombozytenzahl aber intakter Thrombozytenfunktion und konstantem Hämatokrit eine engere Korrelation (r = - 0,93; nach Umrechnung des in der Literatur angegebenen Bestimmtheitsmaßes [r2]) zwischen Verschlußzeit und Thrombozytenzahl nachgewiesen wurde als bei Blutproben thrombozytopenischer Patienten mit verschiedenen Grunderkrankungen (r = - 0,81). Des weiteren zeigte sich ein Einfluß der Datenverteilung auf die Ergebnisse der statistischen Auswertung in der eigenen Arbeit. Wie auch in der Literatur für den Menschen beschrieben (KARGER et al. 1997; SESTITO et al. 1999), fand sich in der eigenen Untersuchung keine wesentliche Korrelation zwischen der Verschlußzeit und der Thrombozytenzahl bei Proben gesunder Probanden. Auch ergab sich für die Gesamtzahl der Hunde eine geringere Korrelation zwischen der mit der Kollagen/ADP-Meßzelle gemessenen Verschlußzeit und der Thrombozytenzahl (r = - 0,40) als für die Gruppe der Hunde mit Thrombo-zytopenie (r = - 0,58). Auf der Grundlage der Proben von thrombozytopenischen Hunden ließ sich in der eigenen Arbeit hinsichtlich der Sensitivität kein Vorteil für die optional abrufbare Meßgröße Gesamtvolumen im Vergleich zur Verschlußzeit nachweisen. Die höhere Sensitivität der Kollagen/ADP-Meßzelle bei der Aufdeckung von Thrombozytopenien kann vor allem durch die große Streuung der Referenzwerte für die Kollagen/Epinephrin-Meßzelle beim Hund erklärt werden. Wie bereits durch mehrere Studien beim Menschen belegt, weist das Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 eine hohe Sensitivität im Screening nach der Willebrand-Erkrankung auf (u.a.: FRESSINAUD et al. 1996, 1997, 1998; CARCAO et al. 1998; RAND et al. 1998; CATTANEO et al. 1999; DI PAOLA et al. 1999; FAVALORO et al. 1999). In einer anderen Studie über einen humanen rekombinanten Willebrandfaktor kam das Plättchenfunktions-analysengerät auch bei einem Hund mit Willebrand-Erkrankung zur Anwendung, wobei sich bei diesem eine verlängerte Verschlußzeit im Vergleich

144

mit der Verschlußzeit eines gesunden Hundes ergab (SCHWARZ et al. 1997). In Übereinstimmung mit diesen Untersuchungen wurden in der vorliegenden Arbeit mit der Kollagen/ADP-Meßzelle bei vier von vier Proben der zwei in diese Studie eingegangenen Hunde verlängerte Verschlußzeiten sowie erhöhte Gesamtvolumina gemessen. Mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle ergab sich bei zwei von drei Proben ein erhöhtes Gesamtvolumen. Dies deutet insgesamt die Verwendbarkeit der In-vitro-Blutungszeit als sensitiven Screeningtest der Willebrand-Erkrankung bei Hunden an. Allerdings ist zu berücksichtigen, daß nur bei einem Patienten Thrombozytenzahl und Hämatokrit im Referenzbereich lagen. Der kausale Hintergrund der Thrombozytenfunktionsstörung bei einem Mangel des Willebrandfaktors besteht darin, daß dieser Faktor durch seine plättchenagglutinierende Eigenschaft eine entscheidende Rolle in der Hämostase spielt (MEYER u. GIRMA 1993; THOMAS 1996; RUGGERI 1997). Bei hohen Scherraten, wie sie auch im Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 vor-liegen, wird der initiale Kontakt noch ruhender Blutplättchen an die verletzte Gefäßwand vermittelt durch den GPIb-V-IX-Rezeptor der Plättchenoberfläche und den an die exponierte Gefäßwandmatrix gebundenen Willebrandfaktor (u.a.: DE GROOT u. SIXMA 1990; RUGGERI 1994; SIXMA et al. 1995; WHITE 1996). Auch in der Kontrolle der Anwendung von 1-Deamino-(8-D-Arginin)-Vasopressin (DDAVP) bei Willebrandpatienten mit dem Plättchenfunktions-analysengerät ergaben sich Übereinstimmungen zwischen der Untersuchung der vorliegenden Arbeit und den der Literatur für den Menschen entnehmbaren Ergebnissen. So führte in der eigenen Untersuchung die subkutane Verabreichung von Vasopressin in einer Dosierung von 0,4µg/kg KGW bei einem Hund mit Willebrand-Erkrankung zu einer Verkürzung der mit der Kollagen/ADP-Meßzelle gemessenen Verschlußzeiten bei gleichzeitiger Erhöhung der Willebrandfaktor-Aktivität. In Analogie zu diesen eigenen Ergebnissen steht die Studie von RAND et al. (1998), in der die intravenöse DDAVP-Applikation bei einem Kind mit Willebrand-Erkrankung zu einer Normalisierung der Verschlußzeiten bei beiden Meßzellen führte. Diese therapeutische Wirkung des Vasopressin-Analogons bei der Willebrand-Erkrankung basiert auf einer Vasopressin-induzierten Freisetzung des Willebrandfaktors aus den Endothelzellen (MANNUCCI et al. 1977; KAUFMANN et al. 2000). Die in der vorliegenden Arbeit hinsichtlich des Einflusses von Azetylsalizylsäure erzielten Ergebnisse auf die In-vitro-Blutungszeit decken sich nur teilweise mit den der Literatur entnehmbaren Ergebnissen beim Menschen. So ergab sich

145

sowohl in den eigenen Untersuchungen als auch in den vergleichbaren Studien beim Menschen (u.a.: BÖHNER et al. 1997; BORRIES et al. 1997; MAMMEN et al. 1998; HARRISON et al. 1999; VON PAPE et al. 1999; HOMONCIK et al. 2000; ORTEL et al. 2000) bei Messungen mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle eine deutliche Verlängerung der Verschlußzeit bzw. Erhöhung des Gesamtvolumens nach Applikation von Azetylsalizylsäure. Auch führte in einer Studie beim Menschen übereinstimmend mit den eigenen Ergebnissen der In-vitro-Zusatz von 0,1g Azetylsalizylsäure/l Zitratblut zu einer Verlängerung des Mittelwertes der Verschlußzeit von 117 Sekunden auf über 300 Sekunden (HOMONCIK et al. 2000). Dieser Effekt läßt sich dadurch erklären, daß die Azetylsalizylsäure das Enzym Zyklooxygenase der Thrombozyten irreversibel azetyliert und somit inaktiviert (u.a.: SMITH u. WILLIS 1971; ROTH u. SIOK 1978; MAJERUS 1983; SCHRÖR 1991). Keine Übereinstimmung zwischen den Literaturangaben für den Menschen und den selbst beim Hund vorgenommenen Messungen ergab sich dagegen bei Verwendung der Kollagen/ADP-Meßzelle. Hier zeigte Azetylsalizylsäure in den Studien beim Menschen keinen signifikanten Einfluß auf die Verschlußzeit bzw. das Gesamtvolumen (u.a.: BORRIES et al. 1997; MAMMEN et al. 1998; HARRISON et al. 1999; HÉZARD et al. 2000; HOMONCIK et al. 2000). In den eigenen Untersuchungen wurde jedoch ebenfalls eine Verlängerung der Verschlußzeit sowie eine Erhöhung des Gesamtvolumens gemessen. Diese Veränderungen waren vor allem bei den In-vitro-Studien deutlich ausgeprägt, wobei hier auch eine Dosisabhängigkeit zu erkennen war. Die Diskrepanz zwischen eigenen Ergebnissen und den Angaben der Literatur läßt sich möglicherweise mit der in der eigenen Arbeit verwendeten höheren Dosierung von Azetylsalizyläure (20 mg/kg Körpergewicht; Literatur: 5 mg/kg Körpergewicht bis höchstens 15 mg/kg Körpergewicht) wie auch mit speziesspezifischen Unterschieden in der Beeinträchtigung der Plättchen durch Azetylsalizylsäure erklären. Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Patienten mit Urämie bzw. Azotämie zeigten überwiegend eine Verlängerung der Verschlußzeiten bzw. eine Erhöhung des Gesamtvolumina. Diese konnte bei einem Teil der Fälle - bei physiologischer Thrombozytenzahl und physiologischem Hämatokrit - einer Plättchenfunktionsstörung zugeordnet werden. Damit fügen sich diese Ergebnisse in eine Reihe von Untersuchungsergebnissen bei Mensch und Hund ein, in denen bei Patienten mit Urämie bzw. Azotämie - ebenfalls unter anderem anhand der Bestimmung der In-vivo-Blutungszeit - eine durch einen Plättchen-defekt verursachte Blutungsneigung belegt wurde (Mensch: u.a.: MANNUCCI et al. 1983; DI MINNO et al. 1985; CASTILLO et al. 1986; WARE et al. 1989;

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Hund: JERGENS et al. 1987; BRASSARD et al. 1994; BRASSARD u. MEYERS 1994). Als Ursache für die Thrombozytenfunktionsstörung bei der Urämie werden verschiedene Faktoren diskutiert. Erwähnung fanden hier beim Menschen unter anderem neben einer Beeinträchtigung der Plättchenadhäsion durch einen funktionellen Defekt in der Interaktion zwischen dem Willebrandfaktor und dem GPIIb-IIIa-Rezeptor (ESCOLAR et al. 1990) auch ein abnormaler Prostaglandinmechanismus der Thrombozyten verursacht durch Substanzen des urämischen Plasmas (SMITH u. DUNN 1981; REMUZZI et al. 1983, JACOBSSON et al. 1985). Weiterhin belegt wurde eine verminderte Verfügbarkeit des Plättchenfaktors 3 beim Menschen durch urämische Toxine (HOROWITZ et al. 1967). Für die bereits in einigen Untersuchungen sowohl beim Menschen (u.a.: RUBIN et al. 1979; OWEN et al. 1981; VIOLI et al. 1994) wie beim Hund (BOWEN et al. 1988; WILLIS et al. 1989) aufgezeigte Beeinträchtigung der primären Hämostase bei Patienten mit Hepatopathien ergaben sich auch in der vorliegenden Arbeit Hinweise, die der Bestätigung auf der Grundlage einer größeren Patientenzahl bedürfen. So konnte nur bei einem Hund mit Leberzirrhose eine deutlich verlängerte Verschlußzeit sowie ein erhöhtes Gesamtvolumen bei gleichzeitig im Referenzbereich liegender Thrombozyten- und Erythrozytenzahl gemessen werden. Bei den übrigen Patienten mit deutlich abweichenden Meßergebnissen war die Aussagekraft hinsichtlich einer Thrombozytenfunktionsstörung aufgrund der gleichzeitig bestehenden Thrombozytopenie und/oder Anämie entsprechend eingeschränkt. Verantwortlich gemacht für eine Störung der primären Hämostase bei Hepatopathien wird unter anderem ein Coating der Thrombozytenoberfläche durch Fibrin(ogen)spaltprodukte (THOMAS et al. 1967; BALLARD u. MARCUS 1976; REAGAN u. REBAR 1995), eine veränderte Lipidzusammensetzung der Thrombozytenmembran, resultierend in einer reduzierten Arachidonsäureverfügbarkeit (OWEN et al. 1981), oder die eventuell vorliegende erhöhte Konzentration an Gallensäuren (BOWEN et al. 1988) und die Plasmakonzentration von Bilirubin (SUVANSRI et al. 1969; MAURER u. CAUL 1972). In der eigenen Arbeit war jedoch kein eindeutiger Zusammenhang zum Bilirubingehalt der Blutprobe herzustellen. Bei allen zehn im Rahmen der vorliegenden Arbeit untersuchten Patienten mit portosystemischem Shunt lagen die gemessenen Verschlußzeiten sowie die In-vivo-Blutungszeiten innerhalb der Referenzbereiche. Damit stehen diese eigenen Untersuchungen im Widerspruch zu den bisher der Literatur entnehmbaren

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Studienergebnissen, die auch bei diesem Krankheitsbild auf eine Beeinträchtigung der primären Hämostase deuten. So belegten Studien von WILLIS et al. (1989) und SCHULZE (1998) bei Hunden mit diesem Krankheitsbild vor allem bei der Kollagen-induzierten Plättchenaggregation ein deutlich reduziertes Aggregationsmaximum, was die Autoren mit der in solchen Fällen vorliegenden hochgradigen Funktionsstörung der Leber erklärten. Die bei den Hunden mit Leishmaniose vorliegende Verlängerung der Verschlußzeit bzw. Erhöhung des Gesamtvolumens reflektiert nicht zwangsläufig einen Funktionsdefekt der Blutplättchen, da bei der Mehrzahl dieser Patienten gleichzeitig eine Thrombozytopenie und/oder Anämie vorlag. Allerdings deuten die bei einzelnen Patienten trotz unveränderter oder nahezu normaler Thrombozyten- und Erythrozytenzahl veränderte Verschlußzeit auf eine Thrombozytenfunktionsstörung, die auch an anderer Stelle beobachtet wird. So belegten unter anderem MORENO et al. (1998) in ihrer Studie an 26 Hunden mit Leishmaniose anhand einer im Vergleich zur Kontrollgruppe verlängerten kapillären Blutungszeit bei normaler Thrombozytenzahl eine Beeinträchtigung der primären Hämostase. Eine Verlängerung der kapillären Blutungszeit bei Hunden mit Leishmaniose wurde auch in der eigenen Arbeit beobachtet. Als kausale Faktoren dieser Plättchenfunktionsstörung bei der caninen Leishmaniose werden die eventuell vorliegende Urämie (MORENO et al. 1998), eine erhöhte Plasmakonzentration zirkulierender Immunkomplexe (LOPEZ et al. 1996) oder auch eine chronische Hepatitis (BINHAZIM et al. 1992; FERRER 1994) diskutiert. Aufgrund der bei der akuten lymphatischen Leukämie erheblichen Verdrängung der Megakaryozyten im Knochenmark durch die hochgradige Infiltration mit Blasten (SPEISER et al. 1990; MISCHKE et al. 1998a) geht diese Erkrankung in den meisten Fällen mit einer Thrombozytopenie einher. So wiesen auch die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Hunde mit akuter lymphatischer Leukämie bis auf eine Ausnahme eine Thrombozytopenie, einige darüberhinaus auch eine Anämie auf, wodurch wiederum die eindeutige Zuordnung einer verlängerten Verschlußzeit bzw. eines erhöhten Gesamtvolumens zu einer Plättchen-funktionsstörung nicht möglich war. Gleiches galt für die Hunde mit chronischer lymphatischer Leukämie, die ebenfalls überwiegend eine deutliche Thrombozytopenie und Anämie aufwiesen. Die Ausnahme bildete ein Hund mit chronischer lymphatischer Leukämie bei normaler Thrombozytenzahl und nur geringgradiger Anämie, bei dem eine Verlängerung der Verschlußzeit beider Meßzellen über den Meßbereich hinaus gemessen wurde. Der kausale Hintergrund einer hier angedeuteten Plättchenfunktionsstörung bei der

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Leukämie ist jedoch auch beim Menschen noch nicht hinreichend geklärt. So wird beim Menschen in diesem Zusammenhang über eine erworbene Willebrand-Erkrankung oder ultrastrukturelle Veränderungen der Thrombozyten berichtet (COWAN et al. 1975; MANNUCCI et al. 1984). Für die in der Literatur beschriebenen qualitativen Veränderungen der Plättchen-funktion bei Patienten mit malignem Lymphom (Mensch: BERTOLINO et al. 1991; MALIK et al. 1998; Hund: THOMAS u. ROGERS 1999) konnte in der eigenen Untersuchung anhand des eingegangenen Patientengutes kein Nachweis erbracht werden, da in dieser Gruppe alle Hunde mit verlängerter Verschlußzeit bzw. erhöhtem Gesamtvolumen eine Thrombozytopenie und/oder Anämie aufwiesen. Hunde hingegen mit einer nur geringgradigen Thrombozytopenie (Thrombozytenzahl > 80.000/µl) und/oder geringgradigen Anämie (> 34 %) lagen dagegen innerhalb des Referenzbereiches. Die sowohl für den Menschen (DI MINNO et al. 1986; ROBERT et al. 1993) als auch für den Hund (SHEPARD et al. 1972; HAMMER u. COUTO 1994; RUIZ DE GOPEGUI et al. 1994; MISCHKE et al. 2000) bereits dokumentierte Beeinträchtigung der primären Hämostase bei Patienten mit multiplem Myelom deutete sich auch in den eigenen Untersuchungen an. Bei drei der untersuchten sieben Proben von vier Hunden mit multiplem Myelom waren die Verschlußzeiten beider Meßzellen über den Referenzbereich bzw. über den Meßbereich hinaus verlängert, was auf eine Plättchenfunktionsstörung hinweist. Dabei muß jedoch der bei zwei Proben erniedrigte Hämatokrit von 26 % als die Beurteilung der verlängerten Verschlußzeit einschränkender Faktor berücksichtigt werden. Als wesentliche Ursache der Plättchenfunktionsstörung bei Myelompatienten wird eine unspezifische Anlagerung von Paraproteinen an die Thrombozytenoberfläche angeführt (SHULL et al. 1978; MANNUCCI et al. 1984; DI MINNO et al. 1986, RUIZ DE GOPEGUI et al. 1994). Bei vier Proben erfolgte in dieser Arbeit ein Testabbruch, der eine Erklärung findet in der auch bei Hunden mit Plasmozytom beobachteten Veränderung, des sogenannten „Hyperviskositätssyndroms“ (SHEPARD et al. 1972; HAMMER u. COUTO 1994). Die hierbei vorliegende Hyperviskosität des Blutes bzw. des Serums wird verursacht durch Polymerisation der durch die neoplastischen Plasmazellen in abnormalen Mengen produzierten monoklonalen Immunglobuline (SHULL et al. 1978; MATUS et al. 1986; HAMMER u. COUTO 1994). Der daraus resultierende hohe Gesamteiweißgehalt der Blutproben führte vermutlich zu einer Verstopfung der Membranöffung, bevor ein Verschluß durch die Thrombozytenaggregate erfolgen konnte.

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Daß auch beim Hund eine Thrombozytopathie für die erhöhte Blutungsneigung bei der Verbrauchskoagulopathie mit sekundärer Hyperfibrinolyse verant-wortlich gemacht werden kann, deutete sich in der Untersuchung von SCHULZE (1998) an. Der hier untersuchte Hund mit ausgeprägter Hyperfibrinolyse wies ein deutlich reduziertes Aggregationsmaximum auf. Verursacht wird diese Thrombozytopathie durch die bei diesem Krankheitsbild systemisch zirkulierenden Fibrinogenspaltprodukte, die mit ihrer hohen Affinität zur Plättchenmembran zu einem Coating der Membranglykoproteine führen (BICK 1985). Des weiteren wurden auch erworbene Storage-Pool-Defekte nachgewiesen (PARETI et al. 1976). Alle acht in dieser Gruppe selbst untersuchten Proben von Hunden mit Hyperfibrinolyse wiesen eine Thrombozytopenie, sieben von acht zudem eine Anämie auf. Jedoch zeigt der Vergleich der Hunde mit allenfalls moderater Hämatokritverminderung (Hämatokrit = 36 %) und einer Thrombozytenzahl zwischen 49.000 und 63.000/ µl mit thrombozytopenischen Hunden eine überproportionale Verlängerung der In-vitro- und In-vivo-Blutungszeiten dieser Patienten. Dies deutet auf eine Thrombozytenfunktionsstörung und paßt in den Rahmen der bereits publizierten Ergebnisse. Die eigenen Untersuchungen der Verschlußzeit bei Hunden mit ausgeprägten Koagulopathien spiegeln die auch beim Menschen in diesem Zusammenhang gefundene Spezifität des Plättchenfunktionsanalysengerätes für Störungen der primären Hämostase wider. So wurde auch beim Menschen überwiegend keine wesentliche Beeinflussung der Meßergebnisse durch plasmatische Gerinnungs-störungen beobachtet (DIETRICH et al. 1990c; CARCAO et al. 1998; FRESSINAUD et al. 1998; RAND et al. 1998; FAVALORO et al. 1999). Die Untersuchungsergebnisse zeigen zusammenfassend, daß, obgleich auch beim Hund mit dem Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 Thrombo-zytopenien, die Azetylsalizylsäure-induzierte Thrombozytopathie sowie verschiedene andere Thrombozytopathien (unter anderem auch das Willebrand-Syndrom) aufgezeigt wurden und das Gerät eine hohe Spezifität im Hinblick auf Störungen der primären Hämostase aufwies, die Verwendbarkeit der Methode durch den Einfluß des Hämatokrits deutlich eingeschränkt wird. Letzteres wird zudem durch die Tatsache verstärkt, daß bei Patienten, bei denen ein hämostaseologisches Screening indiziert ist, häufig ebenfalls eine Anämie vorliegt, was auch in dem Patientengut der vorliegenden Arbeit deutlich wurde.

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F. Zusammenfassung Das Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 überprüft die kapilläre In-vitro-Blutungszeit anhand des Blutflusses durch eine Kapillare, an deren Ende sich eine mit einem Induktor der Thrombozytenaggregation beschichtete Membran mit einer zentralen Öffnung befindet (Kollagen/ADP bzw. Kollagen/Epinephrin). Hierbei wird neben der Verschlußzeit optional das Gesamtvolumen des aus der Kapillare bis zum Verschluß der Membranöffnung ausgetretenen Blutes angegeben. Ziel der vorliegenden Studie war die Überprüfung der klinischen Anwendbarkeit des Plättchenfunktionsanalysengerätes PFA-100 beim Hund. Hierzu wurden anhand von klinisch gesunden Hunden (Kollagen/ADP-Meßzelle: n=136; Kollagen/Epinephrin-Meßzelle: n=128) Referenzbereiche erstellt sowie verschiedene präanalytische Untersuchungen durchgeführt. Zudem wurden Hunde mit verschiedenen Erkrankungen untersucht, welche beim Menschen und/oder Hund mit Plättchenfunktionsstörungen einhergehen können. Zu diesen Erkrankungen zählten die Willebrand-Erkrankung (n=2), die Urämie (n=10), verschiedene Hepatopathien (n=9) (n=2: Leberzirrhose mit Kupferspeicherung; n=2: Hepatose; n=3: degenerative Hepatopathie; n=1: Tumormetastasen in der Leber; n=1: Hepatitis), der portosystemische Shunt (n=10), die Leishmaniose (n=12), die akute lymphatische Leukämie (n=7), die chronische lymphatische Leukämie (n=4), das maligne Lymphom (n=9) sowie das multiple Myelom (n=4). Des weiteren gingen Hunde in die Untersuchung ein, die eine Hyperfibrinolyse infolge metastasierenden Karzinoms aufwiesen (n=8). Zur Überprüfung des Einflusses von Azetylsalizylsäure auf die primäre Hämostase des Hundes wurde zum einen klinisch gesunden Hunden Azetylsalizylsäure injiziert, zum anderen Azetylsalizylsäure Blutproben gesunder Hunde zugesetzt. Weiterhin wurden 39 Proben von 32 Hunden mit Thrombozytopenien (Thrombozytenzahl < 150.000/µl) unterschiedlicher Ursache und einem Hämatokrit > 30 % ausgewertet. Zur Beurteilung der Spezifität des Plättchenfunktionsanalysengerätes PFA-100 gingen außerdem Hunde mit plasmatischen Gerinnungsstörungen (Cumarinvergiftung: n=8; Hämophilie A: n=3) in diese Studie ein. Es wurden folgende Ergebnisse erzielt: Mit der Kollagen/ADP-Meßzelle ergab sich beim Hund ein Referenzbereich von 53-98 Sekunden (Median: 73 Sekunden) für die Verschlußzeit und von 227-318 µl (Median: 264 µl) für das Gesamtvolumen. Mit der Kollagen/Epinephrin-

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Meßzelle ergab sich ein Referenzbereich von 92 bis >300 Sekunden (Median: 163 Sekunden) für die Verschlußzeit, wobei die Meßbereichsgrenze von 300 Sekunden erreicht wurde, und von 296-720 µl (Median: 414 µl) für das Gesamtvolumen. Die Referenzwerte der parallel bestimmten In-vivo-Blutungszeit betrugen 60-150 Sekunden für die kapilläre Blutungszeit und 45-90 Sekunden für die subaquale Blutungszeit. Die Präzisionsanalyse ergab für die mit der Kollagen/ADP-Meßzelle gemessene Verschlußzeit einen Variationskoeffizienten von im Mittel (Median) 7,3 %, für das mit dieser Meßzelle bestimmte Gesamtvolumen einen mittleren Variationskoeffizienten von 2,7 %. Beim Vergleich sechs verschiedener Kollagen/ADP-Meßzellchargen ergab sich weder für die Verschlußzeit (p=0,1548, Varianzanalyse) noch für das Gesamtvolumen (p=0,0921) ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den verschiedenen Chargen. Bei der Überprüfung des Einflusses des Meßzeitpunktes nach Blutentnahme (0-24 Stunden) auf die In-vitro-Blutungszeit ergab sich für die Kollagen/ADP-Meßzelle beim globalen statistischen Vergleich mit der Varianzanalyse weder für die Verschlußzeit (p=0,0842) noch für das Gesamtvolumen (p=0,0655) ein Unterschied zwischen den einzelnen Meßzeitpunkten. Für die Kollagen/Epinephrin-Meßzelle ergab sich beim globalen statistischen Vergleich mit dem Friedman-Test ein deutlicher Unterschied (Verschlußzeit: p=0,0120; Gesamtvolumen: p=0,0061). Der lokale statistische Vergleich mit dem Wilcoxon-Test zeigte eine Zunahme der Verschlußzeit vom Zeitpunkt 1-h bis zum 24-h-Wert. Auffällige Unterschiede zeigten sich bei Messungen von Blutproben verschiedener Hämatokritniveaus (Kollagen/ADP-Meßzelle). Schon bei einer Verminderung des Hämatokrits von 40 % auf 30 % ergab sich eine deutliche Verlängerung der Verschlußzeit (p=0,0049, t-Test) bzw. Erhöhung des Gesamtvolumens (p=0,0030, t-Test). Basierend auf Blutproben von thrombozytopenischen und gesunden Hunden ergab sich für die Gruppe der Hunde mit Thrombozytopenie sowie für die Gesamtzahl der Hunde mit der Kollagen/ADP-Meßzelle eine engere Korrelation zwischen Verschlußzeit (Hunde mit Thrombozytopenie: r = - 0,5793; Gesamt-zahl der Hunde: r = - 0,3991) bzw. Gesamtvolumen (Hunde mit Thrombozyto-penie: r = - 0,5493; Gesamtzahl der Hunde: r = - 0,4340) und Thrombozytenzahl

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der Probe im Vergleich mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle. Auch in der Beziehung zur kapillären bzw. subaqualen Blutungszeit war in der Gruppe der Hunde mit Thrombozytopenie mit der Kollagen/ADP-Meßzelle die Korrelation deutlicher ausgeprägt als mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle. Nach Applikation von Azetylsalizylsäure wurde sowohl bei In-vivo-Zusatz als auch bei In-vitro-Zusatz mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle eine ausgeprägte Verlängerung der Verschlußzeit sowie Erhöhung des Gesamtvolumens festgestellt. Mit der Kollagen/ADP-Meßzelle waren diese Veränderungen weniger deutlich ausgeprägt. Unter den untersuchten Erkrankungen mit möglichen erworbenen Plättchenfunktionsstörungen fanden sich vor allem bei der Urämie, bei der Leishmaniose und beim multiplen Myelom wesentliche Hinweise für Funktionsdefekte der Thrombozyten. Bei vielen Erkrankungen erschwerte allerdings die parallel vorliegende Thrombozytopenie und/oder Anämie die Interpretation der Ergebnisse der automatisierten Thrombozytenfunktions-messung. Bei den Blutproben der Hunde mit portosystemischem Shunt lagen die Verschlußzeiten dagegen innerhalb der Referenzbereiche. Bei den Hunden mit Störungen der plasmatischen Gerinnung entsprachen die medianen Verschlußzeiten wie auch die medianen Gesamtvolumina denen der Kontrollgruppe. Obgleich also auch beim Hund mit dem Plättchenfunktionsanalysengerät PFA-100 Thrombozytopenien, die Azetylsalizylsäure-induzierte Thrombozytopathie sowie verschiedene andere Thrombozytopathien wie auch das Willebrand-Syndrom aufgezeigt wurden und das Gerät im Hinblick auf thrombozytäre Hämostasestörungen eine hohe Spezifität aufwies, wird die klinische Verwendbarkeit der Methode durch den Einfluß des Hämatokrits deutlich eingeschränkt.

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G. Summary Anke Helene Keidel Methodical and clinical investigations using the platelet function analyzer PFA-100 in dogs The platelet function analyzer PFA-100 proofs the capillary in vitro bleeding time by the blood flow through a capillary. The membrane at the end of the capillary has a central aperture and is covered with the platelet aggregation inducing substance (collagen/ADP or collagen/epinephrine). The closure time and optional the blood volume flowing out of the capillary until closure of the membrane aperture can be determined. The aim of the study was the testing of the clinical applicability of the platelet function analyzer PFA-100 in dogs. Blood of clinically normal dogs was measured as reference (collagen/ADP-cartridge: n=136; collagen/epinephrine-cartridge: n=128) and various preanalytic studies were done. Additionally, dogs with different diseases which are known to change the platelet function in humans and/ or dogs were examined. These diseases were the von Willebrand disease (n=2), uraemia (n=10), various hepatopathies (n=9) (n=2: liver cirrhosis due to copper hepatotoxicosis; n=2: hepatosis; n=3: degenerative hepatopathy; n=1: liver metastases of a tumour; n=1: hepatitis); portosystemic shunts (n=10), leishmaniasis (n=12); acute lymphatic leukaemia (n=7), chronic lymphatic leukaemia (n=4), lymphosarcoma (n=9) and multiple myeloma (n=4). Dogs with hyperfibrinolysis as a result of metastatic carcinomas were tested (n=8). To prove the influence of acetylsalicylic acid on the primary haemostasis of the dog acetylsalicylic acid was given to clinically normal dogs. Acetylsalicylic acid was added to blood samples of healthy dogs as well. 39 samples of 32 dogs with thrombocytopenia (platelet count < 150.000/µl) of various causes and with haematocrit values > 30 % were examined. The specificity of the platelet function analyzer PFA-100 was assessed in dogs with coagulopathies (coumarin intoxication: n=8; haemophilia A: n=3). Reference range using the collagen/ADP-cartridge was 53 - 98 seconds (median: 73 seconds) for the closure time and 227 - 318 µl (median: 264 µl) for the blood volume. The reference range using the collagen/epinephrine-cartridge was 92 - >300 seconds (median: 163 seconds) for the closure time, which reaches the maximum of measurement range (300 seconds), and 296 - 720 µl (median: 414 µl) for the blood volume. The reference range of in vivo bleeding time was 60 -

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150 seconds for capillary bleeding and 45 - 90 seconds for subaquale bleeding time. For precision study in series, median variation coefficients of 7.3 % (closure time) and 2.7 % (blood volume), respectively, were found. Comparing six different collagen/ADP-cartridge-lot numbers neither the closure time (p=0.1548, ANOVA) nor the blood volume (p=0.0921, ANOVA) was significantly different. The time of sample storage until measurement (0-24 h) did not influence the closure time (p=0.0842, ANOVA) or the blood volume (p=0.0655) using the collagen/ADP-cartridge. Global statistical comparison by Friedman-test revealed clear differences between times for the closure time (p=0.0120) and blood volume (p=0.0061) using the collagen/epinephrine-cartridge. The local comparison with the Wilcoxon-test showed an increase of closure time at 24-h-storage compared to the 1-h-value. Blood samples of various levels of haematocrit (collagen/ADP-cartridge) showed significant differences. The decrease of the haematocrit from 40 % to 30% resulted in a clear increase of the closure time (p=0.0049, t-test) and the blood volume (p=0.0030, t-test). Based on the blood samples of thrombocytopenic and healthy dogs platelet number was closer correlated to the closure time (dogs with thrombocytopenia: r = - 0.5793; total number of dogs: r = - 0.3991), or the blood volume (dogs with thrombocytopenia: r = - 0.5493; total number of dogs: r = - 0.4340) using the collagen/ADP-cartridge in comparison to the collagen/epinephrine-cartridge. In the group of dogs with thrombocytopenias the correlation between the capillary bleeding time or subaquale bleeding time and the results of PFA-100 was closer using the collagen/ADP-cartridge than using the collagen/epinephrine-cartridge. After in vivo and in vitro application of acetylsalicylic acid the measurements with the collagen/epinephrine-cartridge showed a pronounced increase of closure time and blood volume. With the collagen/ADP-cartridge the increase was less remarkable. Particularly the results of dogs with uraemia, leishmaniasis and multiple myeloma indicated platelet function disorders. The interpretation of the automated measurements of platelet function was difficult with diseases

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showing thrombocytopenia and anemia. The blood samples of dogs with portosystemic shunts were all within the reference range. The results of dogs with coagulopathies correspond to the median closure time and the median blood volume of the control group. The platelet function analyzer PFA-100 detected thrombocytopenias, the acetylsalicylic acid induced thrombocytopathia, different thrombocytopathias and the von Willebrand disease. Moreover the platelet function analyzer had a high specificity to disorders of primary haemostasis. However, because of the influence of the haematocrit, its clinical usability is clearly reduced.

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I. Tabellarischer Anhang

192

Tab. 20: Geschlecht (Geschl.), Rasse, Alter, Körpergewicht, kapilläre Blutungszeit (BZ 1) und subaquale Blutungszeit (BZ 2) von 136 klinisch gesunden Hunden.

Lfd. Nr.

Geschl. Rasse Alter

(Jahre; Monate)

Körper- gewicht

(kg)

BZ 1 (sec)

BZ 2 (sec)

1 m Deutscher Schäferhund 7;09 34 75 60 2 m Kuvasz 1;05 39 90 60 3 w Mischling 1;09 14 75 60 4 m Neufundländer 2;09 52 150 75 5 w Labrador 7;09 27 150 60 6 m Deutscher Schäferhund 1;05 35 75 60 7 m Cairn Terrier 7;06 10 105 90 8 wk Beagle 6;06 13 60 75 9 m Deutscher Schäferhund 3;10 35 60 60 10 m Bull Terrier 1;09 19 90 60 11 mk Mischling 3;03 34 90 75 12 m Gordon Setter 1;07 31 105 75 13 wk Kleiner Münsterländer 5;02 18 90 75 14 w Deutscher Schäferhund 4;00 28 105 60 15 m Boxer 7;00 35 120 60 16 mk Mischling 4;00 12 75 60 17 m Riesenschnauzer 2;09 37 75 60 18 w Deutscher Schäferhund 3;09 33 90 60 19 m Foxterrier 2;00 16 120 120 20 w Riesenschnauzer 3;01 34 75 60 21 w Mischling 4;02 41 75 60 22 m Staffordshire Bull Terrier 1;05 32 90 75 23 m Neufundländer 8;09 52 105 75 24 w Riesenschnauzer 1;10 33 105 60 25 wk Landseer 2;09 54 90 60 26 w Mischling 1;60 29 60 45 27 m Magyar Vizlar 4;70 33 90 60 28 wk Mischling 1;50 29 105 60

Fortsetzung Tab. 20:

193

Lfd. Nr.

Geschl. Rasse Alter

(Jahre; Monate)

Körper- gewicht

(kg)

BZ 1 (sec)

BZ 2 (sec)

29 w Mischling 1;01 18 105 75 30 w Berner Sennenhund 6;08 40 90 60 31 m Collie 5;03 33 120 60 32 w Irish Setter 1;01 24 75 60 33 m Deutscher Schäferhund 4;05 37 90 45 34 w Neufundländer 1;01 38 90 60 35 m Kuvasz 1;07 40 105 60 36 w Foxhound 5;08 30 90 75 37 m Deutsch Drahthaar 5;01 39 75 75 38 m Berner Sennenhund 2;11 40 75 60 39 m Golden Retriever 3;00 40 105 75 40 m Dobermann 2;02 41 90 60 41 m Bull Terrier 1;00 25 75 60 42 m Labrador 3;11 38 75 60 43 m Rottweiler 2;01 58 90 60 44 m Dobermann 2;00 40 150 75 45 mk Beagle 8;04 18 180 90 46 m Staffordshire Bull Terrier 3;01 20 75 60 47 m Golden Retriever 3;03 36 120 75 48 w Deutsch Drahthaar 1;01 23 60 60 49 m Golden Retriever 8;08 39 75 45 50 m Kleiner Münsterländer 1;00 27 90 90 51 m Labrador 1;03 33 75 60 52 w Hannover. Schweißhd. 1;01 24 60 45 53 m Deutscher Schäferhund 12;04 42 75 45 54 w Mischling 4;02 18 75 60 55 m Golden Retriever 4;05 32 90 60 56 w Deutsch Kurzhaar 2;07 30 75 60 57 w Labrador 2;08 35 60 60 58 m Labrador 1;03 37 75 105 59 m Boxer 7;04 32 75 45 60 w Deutsch Kurzhaar 5;03 28 90 90 61 m Brandlbracke 1;04 28 75 60

Fortsetzung Tab. 20:

194

Lfd. Nr.

Geschl. Rasse Alter

(Jahre; Monate)

Körper- gewicht

(kg)

BZ 1 (sec)

BZ 2 (sec)

62 m Deutscher Schäferhund 7;02 41 75 60 63 m Airedale Terrier 1;09 35 90 60 64 m Mischling 5;05 20 75 45 65 w Mischling 4;06 22 90 75 66 m Hovawart 2;05 41 90 75 67 w Labrador 3;04 34 90 60 68 w Labrador 1;05 35 90 75 69 w Beagle 8;06 18 105 75 70 wk Beagle 8;01 13 120 90 71 mk Beagle 9;07 18 105 90 72 w Beagle 8;01 14 90 75 73 wk Beagle 6;10 13 105 75 74 w Beagle 7;03 15 120 90 75 wk Beagle 10;03 11 90 75 76 w Beagle 7;04 15 120 90 77 m Elchhund 5;07 18 90 75 78 w Landseer 2;00 60 75 60 79 m Berner Sennenhund 1;07 39 75 60 80 w Labrador 2;05 35 90 75 81 wk Mischling 3;03 35 75 75 82 w Hovawart 2;00 39 75 60 83 m Hovawart 2;05 40 75 60 84 m Berger Picard 2;01 31 90 60 85 mk Beagle 10;01 15 75 60 86 mk Beagle 10;01 16 75 60 87 wk Beagle 12;00 18 105 90 88 wk Beagle 10;02 15 90 75 89 w Mischling 2;11 34 75 60 90 mk Samojede 3;11 40 90 60 91 w Border Terrier 1;10 13 60 60 92 m Beagle 6;10 17 75 60 93 m Zwergschnauzer 3;02 8 90 60 94 m Golden Retriever 4;02 38 60 60

Fortsetzung Tab. 20:

195

Lfd. Nr.

Geschl. Rasse Alter

(Jahre; Monate)

Körper- gewicht

(kg)

BZ 1 (sec)

BZ 2 (sec)

95 w Labrador 3;11 28 75 60 96 w Deutsch Langhaar 2;10 35 90 60 97 w Mischling 4;10 48 90 75 98 m Am. Stafford. Terrier 3;11 22 90 75 99 m Golden Retriever 1;10 35 60 45

100 wk Rottweiler 1;06 38 75 60 101 m Jack Russell Terrier 1;03 10 105 75 102 wk Hovawart 5;01 35 90 75 103 m Malinois 7;09 36 120 90 104 m Deutscher Schäferhund 4;03 37 60 45 105 m Rhodesian Ridgeback 2;06 48 105 75 106 wk Labrador 6;10 35 105 60 107 m Golden Retriever 1;07 30 90 60 108 w Beagle 12;11 14 75 60 109 mk Deutsche Dogge 2;02 56 75 45 110 w Mischling 3;05 20 75 60 111 mk Beagle 11;01 16 90 60 112 m Amerikan. Schäferhd. 5;11 34 60 60 113 w Beagle 9;01 14 105 75 114 w Mischling 3;05 15 90 75 115 m Mischling 6;01 10 75 60 116 wk Beagle 10;00 14 90 60 117 wk Mischling 2;10 12 75 60 118 m Bull Terrier 5;05 26 75 60 119 m Mischling 4;05 29 75 75 120 m Mischling 2;02 32 90 75 121 w Beagle 9;11 14 90 60 122 wk Deutsch Drahthaar 7;11 30 90 75 123 m Mischling 2;08 40 75 60 124 m Flat Coated Retriever 4;10 30 75 45 125 wk Mischling 5;03 29 75 60 126 w Mischling 4;05 30 90 60 127 wk Labrador 3;07 33 75 45

Fortsetzung Tab. 20:

196

Lfd. Nr.

Geschl. Rasse Alter

(Jahre; Monate)

Körper- gewicht

(kg)

BZ 1 (sec)

BZ 2 (sec)

128 wk Dobermann 3;11 31 105 75 129 m Berner Sennenhund 7;08 49 75 60 130 w Deutscher Schäferhund 3;05 36 90 60 131 m Mischling 4;02 22 75 45 132 wk Mischling 3;11 25 75 60 133 m Mischling 2;06 36 120 90 134 m Berner Sennenhund 4;05 47 90 60 135 w Rottweiler 6;07 48 75 60 136 wk Mischling 2;08 44 75 60

w = weiblich; m = männlich; wk = weiblich kastriert; mk = männlich kastriert

Tab. 21: Meßwerte der gesunden Hunde (n=136 bzw. 128): Thrombozytenzahl (Thrz.), Hämatokrit (HKT), Verschlußzeit (VZ) und Gesamtvolumen (GV) bei Messungen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle (Koll/ADP) und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle (Koll/Epi).

Koll/ADP Koll/Epi Proben-Nr.

Thrz. (x103/µl)

HKT (%) VZ

(sec) GV (µl)

VZ (sec)

GV (µl)

1 294 46,3 67 257 144 380 2 274 50,2 59 252 253 515 3 306 37,1 80 291 151 414 4 207 52,1 76 275 171 389 5 411 44,7 60 260 136 397 6 263 46,1 83 299 129 409 7 481 42,8 84 315 279 673 8 359 48,7 63 265 116 363 9 245 42,4 64 257 92 296 10 344 48,0 79 285 161 388 11 271 52,5 63 262 171 395

Fortsetzung Tab. 21:

197

Koll/ADP Koll/Epi Proben-Nr.

Thrz. (x103/µl)

HKT (%) VZ

(sec) GV (µl)

VZ (sec)

GV (µl)

12 253 44,4 68 271 150 480 13 223 46,8 58 265 101 336 14 305 45,9 64 256 161 373 15 252 54,8 72 241 185 367 16 295 55,5 77 259 119 300 17 256 53,9 70 256 106 305 18 172 48,2 63 259 94 304 19 237 53,3 77 266 259 493 20 193 48,8 64 254 97 296 21 371 45,1 69 271 >300 740 22 324 55,0 92 278 227 640 23 307 41,7 71 271 190 443 24 194 42,7 64 278 154 428 25 157 52,7 86 283 218 458 26 239 54,1 53 232 109 303 27 282 48,8 61 244 108 329 28 158 49,2 60 254 123 347 29 345 47,7 75 274 294 585 30 299 49,9 68 258 255 480 31 340 55,0 64 237 139 338 32 397 54,5 61 258 171 411 33 266 55,0 61 240 123 322 34 226 47,9 63 264 223 521 35 211 51,3 52 224 165 382 36 461 47,8 72 268 147 376 37 214 48,9 63 249 104 307 38 322 48,0 70 260 203 463 39 268 44,3 62 274 136 385 40 277 55,8 71 254 123 314 41 256 42,5 79 292 171 427 42 351 50,0 64 273 123 347 43 329 50,6 61 245 116 300 44 218 50,3 62 258 123 350

Fortsetzung Tab. 21:

198

Koll/ADP Koll/Epi Proben-

Nr.

Thrz. (x103/µl)

HKT (%) VZ

(sec) GV (µl)

VZ (sec)

GV (µl)

45 293 41,2 93 318 141 431 46 309 52,3 78 253 267 558 47 265 54,7 69 240 127 340 48 263 46,9 74 273 227 524 49 310 46,6 67 259 134 392 50 212 50,4 80 259 164 396 51 266 47,2 95 288 161 424 52 221 46,9 62 265 157 429 53 247 46,8 68 268 167 431 54 368 45,7 69 240 147 381 55 163 50,8 98 285 125 334 56 238 44,6 95 285 >300 807 57 307 45,8 107 285 157 410 58 277 45,3 68 258 195 463 59 469 40,3 61 250 207 488 60 416 38,6 80 275 153 418 61 343 55,7 84 257 204 433 62 188 49,4 58 227 105 294 63 272 50,0 76 265 221 468 64 301 49,3 69 273 232 510 65 342 48,2 54 245 133 380 66 153 42,8 63 265 144 388 67 256 51,7 62 228 84 248 68 295 51,1 68 250 171 405 69 303 44,5 98 286 >300 618 70 282 42,3 69 263 245 477 71 312 37,5 68 276 189 464 72 383 38,2 76 286 273 591 73 327 49,5 85 281 140 392 74 356 49,4 70 262 235 527 75 366 49,8 84 294 231 553 76 276 44,5 87 303 >300 828 77 284 46,4 76 282 - -

Fortsetzung Tab. 21:

199

Koll/ADP Koll/Epi Proben-

Nr.

Thrz. (x103/µl)

HKT (%) VZ

(sec) GV (µl)

VZ (sec)

GV (µl)

78 229 52,3 64 252 - - 79 368 50,8 64 266 - - 80 228 43,2 64 273 - - 81 258 47,9 67 264 - - 82 218 47,9 53 234 - - 83 226 47,9 66 271 - - 84 152 54,7 80 249 - - 85 191 43,3 86 256 122 356 86 348 46,2 88 265 134 379 87 306 41,5 74 265 191 457 88 286 41,3 86 272 223 530 89 151 49,0 87 243 100 297 90 260 43,0 89 274 142 423 91 245 45,6 99 323 266 720 92 351 44,6 76 267 111 324 93 211 48,8 70 246 87 283 94 210 48,9 76 259 161 446 95 205 46,8 84 287 146 312 96 217 45,9 67 258 199 471 97 312 48,0 73 234 102 328 98 312 56,0 63 229 190 534 99 325 42,0 67 285 178 404

100 212 46,1 74 273 152 418 101 266 49,0 74 251 180 487 102 182 43,4 87 281 289 525 103 195 52,0 64 262 201 490 104 154 45,1 71 235 166 399 105 152 51,1 82 243 253 540 106 251 52,0 62 253 242 556 107 335 46,8 58 254 >300 676 108 383 37,0 89 319 161 453 109 188 49,7 89 257 112 336 110 211 51,2 90 303 168 478

Fortsetzung Tab. 21:

200

Koll/ADP Koll/Epi Proben-

Nr.

Thrz. (x103/µl)

HKT (%) VZ

(sec) GV (µl)

VZ (sec)

GV (µl)

111 391 41,2 97 307 168 472 112 210 40,8 97 313 135 337 113 381 54,1 77 296 198 392 114 241 53,2 74 286 183 613 115 412 39,9 80 299 165 485 116 281 36,9 88 259 107 299 117 333 43,2 77 297 213 485 118 315 43,6 97 255 169 355 119 356 42,9 80 249 191 435 120 363 44,2 77 278 211 452 121 349 43,5 85 280 198 493 122 211 41,5 75 285 157 472 123 191 47,0 69 267 137 405 124 439 47,0 101 330 222 574 125 160 46,7 75 256 94 304 126 171 45,3 95 279 239 564 127 237 43,6 75 254 94 330 128 298 51,8 80 286 155 366 129 262 50,1 65 254 179 418 130 233 44,6 89 264 135 409 131 254 45,2 91 291 186 507 132 310 51,6 71 261 171 414 133 265 48,2 76 234 122 342 134 309 48,7 53 220 169 418 135 202 49,1 51 214 92 311 136 174 51,0 78 256 103 316

201

Tab. 22: Einzelwerte, arithmetischer Mittelwert (x) und Standardabweichung (SD) der Verschlußzeiten sechs verschiedener Kollagen/ADP-Meßzellchargen (PCA-125, PCA-130, PCA-132, PCA-134, PCA-141, PCA-146) gemessen bei klinisch gesunden Hunden (n=8).

Verschlußzeit (sec) Hund Nr. PCA-125 PCA-130 PCA-132 PCA-134 PCA-141 PCA-146

1 77 75 76 75 80 93 2 61 66 66 74 69 63 3 63 66 76 76 59 59 4 60 63 74 71 64 60 5 71 68 66 66 66 58 6 53 53 49 66 54 53 7 60 63 59 69 68 69 8 75 74 86 85 88 75 x

± SD 65,0 ± 8,4

66,0 ± 6,9

69,0 ± 11,5

72,8 ± 6,3

68,5 ± 11

66,3 ± 12,8

202

Tab. 23: Einzelwerte, arithmetischer Mittelwert (x) und Standardabweichung (SD) der Gesamtvolumina sechs verschiedener Kollagen/ADP-Meßzellchargen (PCA-125, PCA-130, PCA-132, PCA-134, PCA-141, PCA-146) gemessen bei klinisch gesunden Hunden (n=8).

Gesamtvolumen (µl) Hund Nr. PCA-125 PCA-130 PCA-132 PCA-134 PCA-141 PCA-146

1 288 275 283 271 287 294 2 255 253 263 251 265 240 3 264 267 282 268 255 262 4 265 275 285 276 270 260 5 261 264 268 263 253 236 6 237 227 238 241 239 231 7 257 269 270 275 273 257 8 253 247 267 244 259 247 x

± SD 260,0 ± 14,3

259,6 ± 16,5

269,5 ± 15,2

261,1 ± 14

262,6 ± 14,6

253,4 ± 20

203

Tab. 24: Einfluß des Meßzeitpunktes nach Blutentnahme auf die mit der Kollagen/ADP-Meßzelle gemessene Verschlußzeit beim gesunden Hund: Einzelwerte, Mittelwert und Standardabweichung.

Verschlußzeit (sec) Zeit nach Blutent.

(h) Hund 1 Hund 2 Hund 3 Hund 4 Hund 5

Mittelwert ± Standardabw.

(sec)

0 95 71 97 90 132 97 ± 22,1 0,5 60 78 82 77 93 78 ± 11,9 1 87 74 80 81 93 83 ± 7,3

1,5 67 60 81 82 78 74 ± 9,7 2 81 66 74 94 83 80 ± 10,5 3 88 72 90 90 98 88 ± 9,5 4 83 86 88 74 81 82 ± 5,4 6 90 82 89 71 125 91 ± 20,3 8 87 110 97 83 110 97 ±12,6 24 97 123 113 79 105 103 ± 16,7

Tab. 25: Einfluß des Meßzeitpunktes nach Blutentnahme auf das mit der Kollagen/ADP-Meßzelle gemessene Gesamtvolumen beim gesunden Hund: Einzelwerte, Mittelwert und Standardabweichung.

Gesamtvolumen (µl) Zeit nach Blutent.

(h) Hund 1 Hund 2 Hund 3 Hund 4 Hund 5

Mittelwert ± Standardabw.

(µl)

0 293 261 307 303 274 288 ± 19,6 0,5 250 261 295 279 282 273 ± 17,8 1 288 244 294 299 303 286 ± 23,9

1,5 269 246 300 292 260 273 ± 22,4 2 273 257 288 314 290 284 ± 21,2 3 293 256 310 314 299 294 ± 23 4 279 265 295 298 292 286 ± 13,7 6 271 266 332 296 360 305 ± 40,4 8 293 307 312 301 332 309 ± 14,7

24 300 300 343 298 318 310 ± 21,2

204

Tab. 26: Einfluß des Meßzeitpunktes nach Blutentnahme auf die mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle gemessene Verschlußzeit beim gesunden Hund: Einzelwerte und Median.

Verschlußzeit (sec) Zeit nach Blutent.

(h) Hund 1 Hund 2 Hund 3 Hund 4 Hund 5

Median (sec)

0 198 171 168 168 161 168 0,5 184 198 152 158 187 184 1 115 192 230 205 182 192

1,5 105 151 274 216 186 186 2 96 128 278 161 126 128 3 115 190 263 125 186 186 4 98 209 185 157 141 157

6 115 117 197 165 215 165 8 132 184 >300 >300 264 264 24 172 226 >300 206 >300 226

Tab. 27: Einfluß des Meßzeitpunktes nach Blutentnahme auf das mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle gemessene Gesamtvolumen beim gesunden Hund: Einzelwerte und Median.

Gesamtvolumen (µl) Zeit nach Blutent.

(h) Hund 1 Hund 2 Hund 3 Hund 4 Hund 5

Median (µl)

0 414 493 472 478 453 472 0,5 447 445 404 465 523 447 1 428 356 558 535 476 476

1,5 371 351 574 504 499 499 2 344 329 635 390 365 365 3 429 360 596 336 483 429 4 439 289 486 458 557 458 6 337 637 473 444 442 444 8 423 377 622 433 636 433 24 451 464 626 504 627 504

205

Tab. 28 und 29: Einfluß des Meßzeitpunktes nach Blutentnahme auf die Verschlußzeit und das Gesamtvolumen in Abhängigkeit von der Messung mit der Kollagen/ADP-Meßzelle (Tab. 28) und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle (Tab. 29) beim gesunden Hund: Ergebnisse des statistischen Vergleichs (p-Wert) zwischen den Werten verschiedener Meßzeitpunkte und dem 0-Wert bzw. 1 Stunden (h)-Wert unter Anwendung des t-Tests (Kollagen/ADP-Meßzelle) bzw. des Wilcoxon-Tests (Kollagen/Epinephrin-Meßzelle). Sternchen kennzeichnen einen signifikanten Unterschied (*).

Tab. 28:

stat. Vergleich gg. 0-Wert stat. Vergleich gg. 1h-Wert Zeit nach Blutentnahme

(h) VZ (sec) GV (µl) VZ (sec) GV (µl)

0 - - 0,0583 0,4088

0,5 0,0422* 0,0951 0,7867 0,8644

1 0,0583 0,4088 - -

1,5 0,0246* 0,0036* 0,0488* 0,1193

2 0,0641 0,3444 0,2302 0,4301

3 0,1072 0,8680 0,9423 0,9610

4 0,1200 0,3872 0,4508 0,5132

6 0,1546 0,7966 0,8578 0,8893

8 0,5146 0,9165 0,9547 0,9496

24 0,6707 0,9425 0,9557 0,9408

Tab. 29:

stat. Vergleich gg. 0-Wert stat. Vergleich gg. 1h-Wert Zeit nach Blutentnahme

(h) VZ (sec) GV (µl) VZ (sec) GV (µl)

0 - - 0,5002 0,5002

0,5 0,6858 0,8927 0,8927 0,8927

1 0,5002 0,5002 - -

1,5 0,5002 0,8927 0,6858 0,5002

2 0,5002 0,3452 0,2249 0,1380

3 0,8927 0,6858 1,0000 0,5002

4 0,6858 0,8927 0,1057 0,6858

6 0,5896 0,6858 0,2012 0,5002

8 0,1380 0,5002 0,0796 0,5002

24 0,0796 0,1380 0,0431* 0,1380 stat. = statistisch, gg. = gegenüber

206

Tab. 30: Einzelwerte, arithmetischer Mittelwert (x) und Standardabweichung (SD) der Verschlußzeit (sec) bei stufenweiser Verminderung des Hämatokrits (40 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %) in Blutproben gesunder Hunde (n=5) durch Zusatz eines entsprechenden Volumens plättchenreichen Plasmas (Kollagen/ADP-Meßzelle).

Hämatokrit (%) Hund Nr. 40 30 25 20 15 10

1 66 74 83 91 101 142

2 82 106 104 133 152 188

3 79 87 93 133 143 160 4 79 92 118 144 146 191 5 77 93 126 137 170 177 x

± SD 77

± 6,2 90

± 11,6 105

± 17,6 128 ± 21

142 ± 25,4

172 ± 20,5

Tab. 31: Einzelwerte, arithmetischer Mittelwert (x) und Standardabweichung (SD) des Gesamtvolumens (µl) bei stufenweiser Verminderung des Hämatokrits (40 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %) in Blutproben gesunder Hunde (n=5) durch Zusatz eines entsprechenden Volumens plättchenreichen Plasmas (Kollagen/ADP-Meßzelle).

Hämatokrit (%) Hund Nr. 40 30 25 20 15 10

1 291 318 347 365 422 550

2 287 320 335 398 456 557

3 318 349 376 488 511 567 4 309 335 426 490 530 625 5 301 352 453 520 601 630 x

± SD 301

± 12,7 335

± 15,8 387

± 50,8 452

± 66,8 504

± 69,2 586

± 38,6

207

Tab. 32: Geschlecht, Rasse, Alter, Körpergewicht der Hunde mit Thrombozytopenie (n=32).

Nr. Geschlecht Rasse Alter (Jahre; Monate)

Körpergewicht (kg)

1a m Bobtail 10;06 40 1b m Bobtail 10;06 40 1c m Bobtail 10;06 40 1d m Bobtail 10;07 40 2 m Mischling 1;00 27 3 m Berner Sennnenhund 11;09 40 4 w Rauhhaarteckel 3;04 10 5 wk Irish Terrier 7;04 14 6 w Kaukasischer Schäferhund 6;09 48 7 m Deutsche Wachtel 1;00 21 8 w Havaneser 7;06 5 9 m Deutsche Wachtel 1;02 27

10 m Bordeaux-Dogge 1;02 56 11 m Cocker Spaniel 4;10 12 12 m Deutscher Schäferhund 12;02 26 13 mk Irischer Wolfshund 6;11 75 14 w Sheltie 5;06 8 15 w Mittelpudel 6;01 9 16 m Deutsche Dogge 1;06 63 17 m Hovawart 5;11 33 18 w Mischling 4;05 15 19 wk Mischling 6;09 17 20 m Golden Retriever 5;01 31 21a w Jagdterrier 6;07 9 21b w Jagdterrier 6;07 9 22a m Mischling 6;07 42 22b m Mischling 6;07 42 23 wk Rauhhaarteckel 12;03 12 24 m Irish Setter 6;06 31 25 w Cocker Spaniel 7;06 11 26a m Samojede 2;11 24 26b m Samojede 2;11 24

208

Nr. Geschlecht Rasse Alter (Jahre; Monate)

Körpergewicht (kg)

26c m Samojede 2;11 24 27 w Kleiner Münsterländer 1;10 20 28 m Labrador 5;02 25 29 m Weimaraner 2;11 37 30 m Mischling 2;03 31 31 m Beagle 5;03 14 32 m Mischling 1;09 36

w = weiblich; m = männlich; wk = weiblich kastriert; mk = männlich kastriert; a,b,c,d = wiederholte Probenentnahme bei einem Patienten

Tabelle 33: Thrombozytenzahl (Thrz.), Hämatokrit (HTK), Prothrombinzeit (PT), aktivierte partielle Thromboplastinzeit (PTT), Verschlußzeit (VZ) und Gesamtvolumen (GV) der Kollagen/ADP-Meßzelle (Koll/ADP) und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle (Koll/Epi) sowie kapilläre Blutungszeit (BZ 1) und subaquale Blutungszeit (BZ 2) von thrombozytopenischen Blutproben (Proben: n=39; Hunde: n=32) mit einem Hämatokrit > 30 %.

Koll/ADP Koll/Epi

Lfd. Nr.

Thrz. (×103/

µl)

HKT (%)

PT (%)

PTT (sec) VZ

(sec) GV (µl)

VZ (sec)

GV (µl)

BZ 1 (sec)

BZ 2 (sec)

1a 7 48,1 80 16,4 >300 814 >300 794 330 180

1b 25 46,4 82 17,3 124 383 291 578 240 135

1c 56 38,1 80 17,5 136 434 >300 752 210 180

1d 128 33,8 75 17,3 90 341 197 539 60 90

2 35 32,7 85 19,0 110 383 227 585 180 150

3 17 43,0 82 22,7 >300 753 >300 796 840 600

209

Fortsetzung Tab. 33:

Koll/ADP Koll/Epi

Lfd. Nr.

Thrz. (×103/

µl)

HKT (%)

PT (%)

PTT (sec) VZ

(sec) GV (µl)

VZ (sec)

GV (µl)

BZ 1 (sec)

BZ 2 (sec)

4 134 34,0 92 18,2 120 421 >233 871 555 300

5 9 44,9 96 24,7 >300 826 >300 843 570 585

6 48 63,2 85 16,7 >300 571 >300 684 >1200 >1200

7 58 42,5 124 14,6 62 259 256 594 90 60

8 12 32,9 95 17,3 >280 873 >246 872 1440 1020

9 13 50,3 120 16,5 104 276 >300 724 150 180

10 97 43,0 135 17,6 242 415 259 393 75 60

11 7 30,4 110 18,3 >278 770 >300 815 >1200 840

12 50 45,6 110 14,5 89 293 142 379 75 90

13 58 44,0 95 19,6 87 297 >300 762 105 90

14 15 45,9 95 19,5 96 326 >300 777 390 300

15 57 48,6 120 18,0 76 280 >300 688 165 120

16 6 35,6 85 14,5 202 459 >300 621 450 315

17 35 33,4 75 17,6 120 359 >300 729 255 270

18 10 37,0 85 16,2 >272 871 >300 779 >1200 >1200

19 3 51,6 130 13,5 226 411 >300 567 450 420

20 61 31,8 105 19,0 108 344 >300 640 150 120

21a 7 32,6 130 14,0 >300 619 >297 870 180 150

210

Fortsetzung Tab. 33:

Koll/ADP Koll/Epi

Lfd. Nr.

Thrz. (×103/

µl)

HKT (%)

PT (%)

PTT (sec) VZ

(sec) GV (µl)

VZ (sec)

GV (µl)

BZ 1 (sec)

BZ 2 (sec)

21b 36 30,7 140 12,5 69 265 >292 869 60 90

22a 32 32,6 77 19,5 >300 712 >300 843 135 120

22b 77 32,8 130 16,0 121 360 237 593 120 240

23 5 34,9 >150 14,9 >300 793 >300 785 >600 >600

24 6 32,1 123 26,6 >294 868 >284 875 210 180

25 6 34,3 120 18,0 >300 805 >300 849 240 150

26a 4 36,3 150 17,3 136 402 >284 870 240 180

26b 48 31,3 150 18,2 85 339 >272 870 150 90

26c 134 31,5 150 17,6 63 271 >295 872 150 90

27 11 36,0 140 13,0 >290 868 >289 868 270 210

28 28 34,9 150 17,5 102 341 162 450 150 75

29 47 34,3 150 16,8 65 265 74 277 75 60

30 81 44,7 150 16,0 109 367 >300 819 135 120

31 91 35,4 150 19,0 193 470 >247 868 240 180

32 52 40,2 150 18,3 149 387 >286 872 240 210

a,b,c,d = wiederholte Probenentnahme bei einem Patienten

211

Tab. 34: Rasse, Geschlecht, Alter, Thrombozytenzahl (Thrz.) und Hämatokrit (HKT) von Hunden mit Willebrand-Erkrankung (Proben: n=4; Hunde: n=2).

Hund Nr. Rasse Geschlecht Alter (Jahre; Mon.)

Willebrand-Faktor-Konz. (%)

1a Dobermann w 1;00 20,0 1b Dobermann w 1;05 22,3 2a Labrador w 0;06 5,2 2b Labrador w 0;06 4,7

Mon. = Monate; w = weiblich; a,b = wiederholte Messungen bei einem Patienten

Tab. 35: Einzelwerte der mit der Kollagen/ADP-Meßzelle gemessenen Verschlußzeit und des Gesamtvolumens sowie der Willebrand-Faktor-Konzen-tration bei einem Hund mit Willebrand-Faktor-Mangel vor und zu verschiedenen Zeitpunkten nach subkutaner Injektion von 0,4 µg Desmo-pressin/kg Körpergewicht.

Meßzeitpunkt Verschlußzeit (sec)

Gesamtvolumen (µl)

Willebrand-Faktor-Konz. (%)

vor Injektion 233 512 20,0 5 Minuten 118 351 26,0

30 Minuten 136 386 29,0 60 Minuten 128 322 28,7 2 Stunden 168 463 26,3 4 Stunden 197 557 24,6 6 Stunden 203 563 22,2 22 Stunden 242 522 16,2

212

Tab. 36: Einfluß der intravenösen Injektion von 20 mg/kg Körpergewicht Azetylsalizylsäure (ASS) auf die Verschlußzeit und das Gesamtvolumen (Bestimmung vor und 120 Minuten nach Injektion) gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle beim gesunden Hund (n=10): Einzelwerte, arithmetischer Mittelwert (x) und Standard-abweichung (SD) (Kollagen/ADP-Meßzelle) bzw. Median (Kollagen/Epi-nephrin-Meßzelle).

Kollagen/ADP-Meßzelle Kollagen/Epinephrin-Meßzelle VZ (sec) GV (µl) VZ (sec) GV (µl) Hund

Nr. vor nach vor nach vor nach vor nach

1 85 90 281 322 100 >295 356 870 2 70 95 262 313 168 >300 479 863 3 84 125 294 427 165 >235 503 871 4 98 122 286 317 262 >300 562 744 5 68 85 276 281 135 >300 422 752 6 86 117 256 324 122 >300 356 689 7 88 111 265 325 134 >300 379 783 8 88 89 259 308 107 >300 299 841 9 102 115 332 298 138 >300 352 710

10 85 101 280 319 115 >300 356 725 x ± SD bzw. Med.

85 ± 10,5

105 ± 14,8

279 ± 22,4

323 ± 38,9 135 >300 368 768

min = Minuten; vor = vor Injektion; nach = 120 Minuten nach Injektion; Med. = Median

213

Tab. 37: Aggregationsmaxima mit ADP und Kollagen sowie kapilläre Blutungs-zeit vor und zwei Stunden nach intravenöser Injektion von 20 mg/kg Körpergewicht Azetylsalizylsäure bei klinisch gesunden Hunden (n=10): Einzelwerte, arithmetischer Mittelwert (x) und Standardabweichung (SD) (Aggregationsmaximum mit ADP und kapilläre Blutungszeit) bzw. Median (Aggregationsmaximum mit Kollagen).

Aggregationsmaximum mit ADP (%)

Aggregationsmaximum mit Kollagen (%)

kapilläre Blutungszeit (sec) Hund

Nr. vor nach vor nach vor nach 1 88,3 83,5 85,1 7,0 120 240 2 87,1 53,5 80,7 10,0 150 300 3 88,2 48,6 87,0 5,0 180 360 4 91,8 80,2 83,5 13,5 180 300 5 87,1 79,6 92,4 19,2 90 150 6 78,3 72,2 83,8 57,5 120 210 7 82,2 70,2 80,0 8,1 150 360 8 81,5 79,2 77,8 0,0 120 240 9 90,0 81,2 85,9 4,8 120 300

10 91,4 76,8 89,9 52,2 150 240 x ± SD bzw. Med.

86,6 ± 4,3

72,5 ± 11,4 84,5 9,1 138

± 27,5 270

± 63,0

min = Minuten; vor = vor Injektion; nach = 120 Minuten nach Injektion; Med. = Median

214

Tab. 38 und 39: Einfluß des In-vitro-Zusatzes von 0,3 g (Tab. 38) bzw. 2 g (Tab. 39) Azetylsalizylsäure (ASS)/ l Blut auf die Verschlußzeit und das Gesamt-volumen (vor Zusatz von ASS; 15 Minuten, 60 Minuten und 120 Minuten nach Zusatz von ASS) gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle beim gesunden Hund unter Mitführung einer Kontrolle (Zusatz von 20µl Natriumchloridlösung /ml Blut, Messung nach 120 Minuten): Einzelwerte, Median (Med.), Minimum (Min.) und Maximum (Max.). Tab. 38:

Verschlußzeit (sec) Gesamtvolumen (µl) Hund Nr. vor 15

min 60

min 120 min Kon. vor 15

min 60

min 120 min Kon.

1 86 83 >300 >300 77 272 268 460 616 273 2 74 147 >300 >300 76 265 371 550 573 277 3 95 86 97 89 79 279 281 302 286 272 4 97 164 >300 >300 82 313 392 596 596 274 5 78 71 90 87 93 256 250 251 261 237

Med. 86 86 >300 >300 79 272 281 460 573 273 Min. 74 71 90 87 76 256 250 251 261 237 Max. 97 164 >300 >300 93 313 392 596 616 277 min = Minuten; Kon. = Kontrolle Tab. 39:

Verschlußzeit (sec) Gesamtvolumen (µl) Hund Nr. vor 15

min 60

min 120 min Kon. vor 15

min 60 min

120 min Kon.

1 60 85 165 >300 71 265 284 407 722 291 2 67 90 >300 >300 77 275 295 777 786 277 3 86 164 >300 >300 77 272 369 718 737 273 4 74 >300 >300 >300 76 265 623 690 677 277 5 75 91 >300 >300 78 285 317 805 771 283 6 80 >300 >300 >300 72 286 757 799 870 292

Med. 75 128 >300 >300 77 274 343 748 754 280 Min. 60 85 165 >300 71 265 284 407 677 273 Max. 86 300 >300 >300 78 286 757 805 870 292 min = Minuten; Kon. = Kontrolle

215

Tab. 40 und 41: Einfluß des In-vitro-Zusatzes von 0,3 g (Tab. 40) bzw. 2 g (Tab. 41) Azetylsalizylsäure (ASS)/ l Blut auf die Verschlußzeit und das Gesamtvolumen (vor Zusatz von ASS, 15 Minuten nach Zusatz von ASS) gemessen mit der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle beim gesunden Hund unter Mitführung einer Kontrolle (Zusatz von 20 µl Natriumchloridlösung /ml Blut, Messung nach 15 Minuten): Einzelwerte, Median, Minimum und Maximum.

Tab. 40:

Verschlußzeit (sec) Gesamtvolumen (µl) Hund Nr. vor

Zusatz 15 min

nach Zus. Kontrolle vor Zusatz

15 min nach Zus. Kontrolle

1 191 >300 162 457 657 395 2 223 >300 209 530 724 499 3 239 >300 215 564 653 510 4 135 >300 181 337 743 477 5 103 >300 115 316 618 336

Median 191 >300 181 457 657 477 Minimum 103 >300 115 316 618 336 Maximum 239 >300 215 564 743 510 Tab. 41:

Verschlußzeit (sec) Gesamtvolumen (µl) Hund Nr. vor

Zusatz 15 min

nach Zus. Kontrolle vor Zusatz

15 min nach Zus. Kontrolle

1 144 >300 182 388 845 446 2 84 >300 76 248 658 244 3 171 >300 148 405 737 349 4 262 >300 191 562 647 433 5 175 >300 150 434 791 411 6 135 >300 131 422 815 416 7 195 >300 129 537 762 409 8 191 >300 162 457 734 395 9 223 >300 209 530 730 499 10 157 >300 150 472 771 422 11 155 >300 195 366 815 432

Median 171 >300 150 434 762 416 Minimum 84 >300 76 248 647 244 Maximum 262 >300 209 562 845 499 min = Minuten; Zus. = Zusatz

216

Tab. 42: Rasse, Geschlecht (Ge.), Alter, Verschlußzeit (VZ) und Gesamt-volumen (GV) gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle (Kollagen/ADP) und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle (Kollagen/Epinephrin) von Hunden mit Urämie (n=10): Einzelwerte, Median (Med.), Minimum (Min.) und Maximum (Max.).

Kollagen/ADP Kollagen/Epinephrin Hund Nr. Rasse Ge.

Alter (Jahre; Mon.) VZ (sec) GV (µl) VZ (sec) GV (µl)

1 Bern. Senn. w 4;07 284 422 >300 741 2 Gold. Retr. w 4;06 133 398 >235 873 3 Bern. Senn. w 5;07 >300 462 >300 523 4 Bern. Senn. w 2;11 88 315 >300 775 5 Dt. Schfhd. m 6;03 102 308 >300 797 6 Gold. Retr. w 4;03 50 250 241 658 7 Hovawart w 10;04 128 352 >300 716 8 Gold. Retr. m 4;01 183 371 >277 870 9 Gold. Retr. m 6;01 122 311 >300 596 10 Dt.Schfhd. w 3;07 67 285 94 369

Med. 125 334 >300 729 Min. 50 250 94 369 Max.

- - - >300 462 >300 873

217

Tab. 43: Meßwerte verschiedener klinisch-chemischer Meßgrößen bei Hunden mit Urämie (n=10) im Vergleich zum Referenzbereich (Ref.bereich): Einzelwerte, Median, Minimum und Maximum.

Hund Nr. Harnstoff (mg/dl)

Kreatinin (mg/dl)

Albumin (g/dl)

Ref.bereich 20-40 < 1 2,75-3,5

1 408 9,62 2,19 2 222 3,30 1,56 3 287 10,3 3,37 4 201 4,95 1,57 5 118 4,75 3,13 6 106 3,02 2,29 7 163 2,60 0,94 8 174 6,26 1,59 9 553 12,07 2,49

10 440 9,51 3,17 Median 212 5,6 2,24

Minimum 106 2,6 0,94 Maximum 553 12,07 3,37

218

Tab. 44: Rasse, Geschlecht und Alter von Hunden mit definierten Hepatopathien (n=9) und Hunden mit auffälligem Ikterus (Hunde Nr. 2a, 3b, 3c, 5 und zusätzlich 6).

Hund Nr. Rasse Geschlecht Alter (Jahre; Mon.)

1a Dt. Schäferhund w 0;05 1b Dt. Schäferhund m 1;11 2a Tibet Terrier m 4;08 2b Foxterrier m 9;06 3a Collie wk 3;00 3b Mischling w 3;07 3c Mischling m 4;01 4 Riesenschnauzer m 7;04 5 Mischling w 1;07 6 Dobermann w 3;03

Mon. = Monate; w = weiblich; m = männlich ; wk = weiblich kastriert; a,b,c = verschiedene Patienten einer Erkrankungsgruppe

Tab. 44a: Thrombozytenzahl (Thrz.), Hämatokrit (HKT), Kapilläre Blutungszeit (BZ 1), subaquale Blutungszeit (BZ 2), Verschlußzeit (VZ) und Gesamtvolumen (GV) gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle (Kollagen/ADP) und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle (Kollagen/Epinephrin) des Hundes Nr.6 aus Tab.44.

Kollagen/ADP Kollagen/Epinephrin Thrz. (x103/µl)

HKT (%) VZ (sec) GV (µl) VZ (sec) GV (µl)

BZ 1 (sec)

BZ 2 (sec)

143 13,5 > 299 873 > 277 872 > 600 420

219

Tab. 45: Meßwerte verschiedener klinisch-chemischer Meßgrößen bei Hunden mit definierten Hepatopathien (n=9) und Hunden mit auffälligem Ikterus (Hunde Nr. 2a, 3b, 3c, 5 und zusätzlich 6) im Vergleich zum Referenzbereich (Referenzb.): Einzelwerte, Median, Minimum (Min.) und Maximum (Max.). Hund Nr. ALT

(U/l) GLDH (U/l)

AP (U/l)

Bilirubin (mg/dl)

Albumin (g/dl)

Referenzb. <50 <6 <190 <0,2 2,75-3,5 1a 102 6,3 244 0,42 2,24 1b 182 12,2 733 0,35 2,81 2a 323 146,8 1053 17,83 2,64 2b 69 8,7 692 0,10 1,75 3a 72 0 181 5,11 1,31 3b 516 77,2 1624 12,7 2,69 3c 1130 58,7 3520 19,59 3,14 4a 21 7,8 417 0,20 2,75 5 592 54,9 696 16,2 3,15 6 19 5,5 749 35,33 2,55

Median 142 10,45 715 8,91 2,67 Min. 19 0 181 0,10 1,31 Max. 1130 146,8 3520 35,33 3,15

220

Tab. 46: Rasse, Geschlecht (Ge.), Alter, Verschlußzeit (VZ) und Gesamt-volumen (GV) gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle (Kollagen/ADP) und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle (Kollagen/Epinephrin) von Hunden mit portosystemischem Shunt (n=10): Einzelwerte, Median (Med.), Minimum (Min.) und Maximum (Max.).

Kollagen/ADP Kollagen/Epinephrin Hund Nr. Rasse Ge.

Alter (Jahre; Mon.) VZ (sec) GV (µl) VZ (sec) GV (µl)

1 Bern. Senn. m 0;04 80 318 >237 872 2 NSDT Ret. m 0;03 76 285 219 688 3 Elchhund w 0;03 54 259 238 562 4 Hovawart m 0;04 56 274 138 509 5 Mischling w 1;00 70 283 >300 858 6 Bern. Senn. w 1;10 73 328 >224 871 7 Ir. Wolfsh. w 0;08 60 277 148 520 8 Labrador w 0;04 54 257 201 685 9 Mischling w 1;00 85 286 190 514 10 Ir. Wolfsh. w 0;06 91 329 204 592

Med. 72 284 212 639 Min. 54 257 138 509 Max.

- - - 91 329 >300 872

221

Tab. 47: Meßwerte verschiedener klinisch-chemischer Meßgrößen im Vergleich zum Referenzbereich (Referenzb.) von Hunden mit portosystemischem Shunt (n=10): Einzelwerte, Median, Minimum und Maximum.

Lfd. Nr. ALT (U/l)

GLDH (U/l)

AP (U/l)

Bilirubin (mg/dl)

NH3

(µg/dl) Referenzb. <50 <6 <190 <0,2 <120

1 26 2,9 279 0,15 463 2 33 3,7 441 0,24 546 3 73 5,0 791 0,12 530 4 21 0,6 225 0,12 295 5 43 2,4 146 0,33 143 6 72 2,4 160 0,49 276 7 50 4,0 221 0,18 491 8 36 5,4 506 0,19 394 9 261 50,2 452 0,15 128 10 17 1,7 296 0,20 472

Median 39,5 3,3 287,5 0,185 428,5 Minimum 17 0,6 146 0,12 128 Maximum 261 50,2 791 0,49 546

222

Tab. 48: Rasse, Geschlecht (Ge.), Alter, Verschlußzeit (VZ) und Gesamtvolumen (GV) gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle (Kollagen/ADP) und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle (Kollagen/Epi) von Hunden mit Leishmaniose (n=12): Einzelwerte, Median (Med.), Minimum (Min.) und Maximum (Max.).

Kollagen/ADP Kollagen/Epi Hund Nr. Rasse Ge.

Alter (Jahre; Mon.) VZ (sec) GV (µl) VZ (sec) GV (µl)

1 Akita Inu m 6;03 146 394 >300 647 2 Labrador w 3;09 128 320 216 416 3 Mischling m 1;10 95 297 221 476 4 Mischling m 3;02 78 289 167 427 5 Mischling m 8;01 153 325 255 406 6 Dobermann m 3;10 >300 566 >300 621 7 Mischling mk 4;04 70 238 129 295 8 Rottweiler w 4;02 145 351 >300 605 9 Mischling w 4;08 98 276 >300 557

10 Dt. Dogge m 3;07 122 289 163 360 11 Mischling mk 2;11 133 344 264 536 12 Mischling wk 3;00 81 331 >207 869

Med. 125 323 238 506 Min. 70 238 129 295 Max.

- - - >300 566 >300 869

Mon. = Monate; w = weiblich; m = männlich ; wk = weiblich kastriert, mk = männlich kastriert

223

Tab. 49: Meßwerte verschiedener klinisch-chemischer Meßgrößen bei Hunden mit Leishmaniose (n=12) im Vergleich zum Referenzbereich (Ref.bereich): Einzelwerte, Median, Minimum und Maximum.

Hund Nr. Harnstoff (mg/dl)

Kreatinin (mg/dl)

Albumin (g/dl)

Gesamteiweiß (g/dl)

Ref.bereich 20-40 < 1 2,75-3,5 6,0 - 7,0

1 38 1,02 2,72 8,66 2 28 0,78 1,82 10,45 3 35 0,84 1,76 4,85 4 23 0,50 2,38 9,54 5 30 0,73 2,76 11,69 6 29 0,75 3,12 7,95 7 30 0,62 1,95 9,03 8 36 0,91 3,21 10,36 9 45 0,38 1,31 12,18 10 76 1,77 2,95 8,32 11 93 1,16 2,17 9,0 12 53 0,54 3,18 5,09

Median 36 0,77 3,32 9,02 Minimum 23 0,38 1,31 4,85 Maximum 93 1,77 3,21 12,18

224

Tab. 50: Rasse, Geschlecht (Ge.), Alter, Verschlußzeit (VZ) und Gesamtvolumen (GV) gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle (Kollagen/ADP) und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle (Kollagen/Epi) von Hunden mit akuter lymphatischer Leukämie (n=7): Einzelwerte, Median (Med.), Minimum (Min.) und Maximum (Max.).

Kollagen/ADP Kollagen/Epi Hund Nr. Rasse Ge.

Alter (Jahre; Mon.)

Leuk. (x103/

µl) VZ (sec) GV (µl) VZ (sec) GV (µl)

1 Labrador m 5;02 14,5 115 355 227 495 2 Weimaraner m 2;11 12,6 74 276 104 305 3 Mischling m 2;03 45 123 382 >300 819 4 Beagle m 5;03 15,3 218 489 >247 868 5 Dt. Schfh. w 9;08 13,5 >300 826 >290 875 6 Mischling w 4;04 749,2 211 420 >300 740 7 Mischling m 1;09 10,8 149 387 >286 872

Med. 14,5 149 387 286 819 Min. 10,8 74 276 104 305 Max.

- - - 749,2 >300 826 >300 875

225

Tab. 51: Rasse, Geschlecht (Ge.), Alter, Verschlußzeit (VZ) und Gesamt-volumen (GV), gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle (Kollagen/ADP) und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle (Kollagen/Epinephrin), von Hunden mit malignem Lymphom (n=9): Einzelwerte, Median (Med.), Minimum (Min.) und Maximum (Max.).

Kollagen/ADP Kollagen/Epinephrin Hund Nr. Rasse Ge.

Alter (Jahre; Mon.) VZ (sec) GV (µl) VZ (sec) GV (µl)

1 Briard w 5;11 >300 716 >300 788 2 Collie m 8;01 96 303 228 542 3 Neufundl. w 3;10 61 248 109 318 4 Dt. Wachtel w 11;09 102 305 >291 872 5 Neufundl. m 4;03 59 243 182 432 6 Dobermann m 10;04 139 434 >287 869 7 Dobermann m 6;00 >214 877 >235 870 8 Neufundl. m 5;11 93 311 296 642 9 Groenendael w 6;02 64 255 >300 747

Med. 96 305 287 747 Min. 59 243 109 318 Max.

- - - >300 877 >300 872

Mon. = Monate; w = weiblich; m = männlich

226

Tab. 52: Rasse, Geschlecht (Ge.), Alter, Verschlußzeit (VZ) und Gesamt-volumen (GV) gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle (Kollagen/ADP) und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle (Kollagen/Epinephrin) von Hunden mit Hyperfibrinolyse (n=8): Einzelwerte, Median (Med.), Minimum (Min.) und Maximum (Max.).

Kollagen/ADP Kollagen/Epinephrin Hund Nr. Rasse Ge.

Alter (Jahre; Mon.) VZ (sec) GV (µl) VZ (sec) GV (µl)

1 Mischling w 14;07 199 489 >237 872 2 West H.W.T. m 13;07 >231 872 >213 871 3 Mischling w 6;00 >287 871 >267 874 4 Dobermann w 6;10 >253 870 >217 870 5 Dt. Schfhd. w 8;08 >286 871 >231 870 6 Dt. Drahthaar w 9;08 >261 874 >255 868 7 Dobermann w 7;06 >188 870 >194 871 8 Ir. Setter w 10;06 >300 742 >300 725

Med. 257 871 234 871 Min. >188 489 >194 725 Max.

- - - >300 874 >300 874

Mon. = Monate; w = weiblich; m = männlich

227

Tab. 53: Rasse, Geschlecht (Ge.), Alter, Thrombozytenzahl (Thrz.), Hämatokrit (HTK), Verschlußzeit (VZ) und Gesamtvolumen (GV) gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle (Kollagen/ADP) und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle (Kollagen/Epi) von Hunden mit Cumarinvergiftung: Einzelwerte, Median (Med.), Minimum (Min.) und Maximum (Max.).

Kollagen/ADP Kollagen/Epi Hund Nr. Rasse Ge.

Alter (Jahre; Mon.)

Thrz. (x103

/µl)

HTK (%) VZ (sec) GV (µl) VZ (sec) GV (µl)

1 Boxer w 0;05 186 17,6 78 347 224 661 2 Mischling w 1;11 258 52,8 57 229 143 345 3 Dt. Schfhd. m 2;03 84 27,2 62 275 181 475 4 Mischling wk 10;09 230 29,0 61 264 >247 870 5 Mischling w 5;03 156 31,0 57 246 92 351 6 Teckel w 4;01 370 24,3 57 264 127 436 7 Teckel w 2;00 164 24,0 69 305 >203 872 8 Bord.-D. w 5;04 228 46,6 67 261 99 334

Med. 207 28,1 62 264 162 456 Min. 84 17,6 57 229 92 334 Max.

- - - 370 52,8 78 347 247 872

Mon. = Monate; w = weiblich; m = männlich; wk = weiblich kastriert

228

Tab. 54: Prothrombinzeit (PT), aktivierte partielle Thromboplastinzeit (PTT) und Thrombinzeit bei Hunden mit Cumarinvergiftung (n=8) im Vergleich zum Referenzbereich (Refb.): Einzelwerte, Median, Minimum und Maximum.

Hund Nr. PT (%) PTT (sec) Thrombinzeit (sec)

Refb. 75-130 14,5-19 14-22 1 <10 66,5 14,2 2 <20 82,1 14,3 3 <20 >100 13,3 4 15 21,6 13,1 5 <20 78,7 14,1 6 <10 136 14,3 7 <10 52,0 11,7 8 <10 57,2 12,0

Median 13 73,0 14,0 Minimum <10 21,6 11,7 Maximum <20 13,6 14,3

Tab. 55: Rasse, Geschlecht (Ge.), Alter, Thrombozytenzahl (Thrz.), Hämatokrit (HTK), Verschlußzeit (VZ) und Gesamtvolumen (GV) gemessen mit der Kollagen/ADP-Meßzelle (Koll./ADP) und der Kollagen/Epinephrin-Meßzelle (Koll./Epi) sowie Faktor-VIII:C-Aktivität bei Hunden mit Hämophilie A.

Koll./ADP Koll./Epi Hund Nr. Rasse Ge.

Alter (Jahre; Mon.)

Thrz. (x103/

µl)

HTK (%) VZ

(sec) GV (µl)

VZ (sec)

GV (µl)

Faktor VIII:C

(%)

1 Dt.Schfhd. m 2;10 58 34,8 53 255 132 399 25 2 Dt.Schfhd. m 9;07 257 44,7 78 263 112 320 8 3 Dt.Schfhd. m 4;02 348 27,8 59 270 163 522 10

Mon. = Monate; Faktor-VIII:C = Faktor-VIII:C-Aktivität (Referenzbereich: 63-144%)

Danksagung

Von Herzen dankbar bin ich allen, die mir bei der Erstellung dieser Arbeit geholfen haben: Herrn Prof. Dr. R. Mischke für die Überlassung des interessanten Themas und die freundliche Unterstützung bei der Anfertigung dieser Arbeit, insbesondere bei der statistischen Auswertung der Ergebnisse. Herrn Prof. Dr. I. Nolte für die Möglichkeit der Durchführung meiner Versuche in der Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Allen Mitarbeitern des Labors der Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover, insbesondere Frau B. Schäffner und Herrn D. Menzel, für unzählige Hilfestellungen und Auskünfte. Allen weiteren Mitarbeitern der Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover, die mir bei der Sammlung der Blutproben behilflich waren. Ganz besonders meinen Eltern, die durch ihre finanzielle Unterstützung und ihren liebevollen Beistand diese Arbeit erst ermöglicht haben. Allen meinen Freunden, insbesondere Antje Krause, Sandra und Markus Eickhoff, Heike Schröder, Kerstin Will und Katja Nimmerfall, für die geduldige Begleitung und die vielen Aufmunterungen. Meinem Freund Michael Stoppel für seinen unerschütterlichen Optimismus und seine tatkräftige Hilfeleistung bei der grafischen Umsetzung der Ergebnisse.