Oxidativer- / Nitrosativer-Stresslaborzentrum.org/dokumente/oxidativer-stress.vortrag.pdf · 3 Oxidativer Stress ist eine ständige überschießende Bildung reaktiver Sauerstoffverbindungen

Oxidativer- / Nitrosativer-Stress

Biochemische Grundlagen

1

Dr. med. univ. Kurt Kraus

Laborarzt

MVZ Laborzentrum Ettlingen GmbH

Otto-Hahn-Straße 18 76275 Ettlingen


2

Was ist oxidativer Stress? Was ist nitrosativer Stress?

Was sind die wichtigsten reaktiven Sauerstoffverbindungen(ROS)?

Wie und wodurch entstehen sie?

Wie schädigen sie Gefäße und Neuronen?

Was sind die wichtigsten Antioxidanzien?

Wie werden oxidativer Stress und antioxidative Kapazität gemessen?


Inhalt

3

Oxidativer Stress ist eine ständige überschießende Bildung reaktiver Sauerstoffverbindungen (ROS = reactive oxygen species). Es liegt ein ständiges Ungleichgewicht zwischen aggressiven ROS und schützenden Antioxidanzien vor.

Molekulare Grundlagen


4

Die wichtigsten reaktiven Sauerstoffverbindungen (ROS)


(Hyperoxid-Anion)

• Wasserstoffperoxid

• Stickoxid-Radikal

• Hydroxyl-Radikal

• Peroxynitrit-Anion

Huber J., Grundlagen der Altersprävention

← RNS

← RNS

5

Das Hydroxylradikal entsteht in 2 Reaktionsschritten: Reduktion von dreiwertigem Eisen (z. B. Speichereisen im Ferritin) zu zweiwertigem Eisen durch das Superoxid-Anion:

Rück-Oxidation des zweiwertigen Eisens unter gleich-zeitiger Spaltung von Wasserstoffperoxid*:

* OH‾ = Hydroxid-Anion, OH = Hydroxyl-Radikal Das Hydroxyl-Radikal ist eines der gefährlichsten Radikale!


Entstehung des Hydroxylradikals

Fe 3+ + O2‾ O2 + Fe 2+

Fe 2+ + H2O2 Fe 3+ + OH‾ + OH

6 MVZ Laborzentrum Ettlingen GmbH

Das Peroxynitrit-Anion entsteht durch die Verbindung des Stickoxid Radikals (NO) mit dem Superoxid-Anion (O2‾), vermutlich katalysiert durch die Superoxid-Dismutase (SOD):

ONOO‾ hemmt die Cytochrom C-Oxidase der Atmungskette – im Gegensatz zu NO – nicht reversibel, sondern irreversibel, außerdem die Akonitase des Zitronensäurezyklus.

Das Peroxynitrit-Anion ist äußerst gefährlich!

Entstehung des Peroxynitrit-Anions

NO + O2‾ SOD? ONOO‾

Das Superoxid-Anion

- entsteht unter der enzymatischen Aktivität von Oxidoreduktasen und Oxygenasen im Zytosol, in Peroxisomen und auf Zellmembranen

- entsteht vorwiegend in der

mitochondrialen Atmungskette,

und zwar an Enzymkomplex I

und vor allem an Enzymkomplex III.


Entstehung des Superoxid-Anions

Kunsch and Medford


Schematische Darstellung der mitochondrialen Atmungskette mit den Komplexen I und III

1-4 % des Sauerstoffs werden nicht zu Wasser reduziert (am Komplex IV), sondern zum Superoxid-Anion (vorwiegend am Komplex III).

Entstehung des Superoxid-Anions in der Atmungskette

Elektronenfähre

Staustufe

Überlauf

Elektronen

- Stau

O2 → O2‾

Hemmung der

Cytochrom-Oxidase

durch ONOO‾

↑

III

Horn, F. et al., Biochemie des Menschen

IV V

O2

Entkoppelung

der OXPHOS

Hemmung

↑

↑ ATP-Synthase

II

I

O2 O2 O2 O2 O2‾ O2‾ O2‾ O2‾ O2‾ O2 O2‾

Protonengradient

9

Das Superoxid-Anion entsteht u. a. in der mito-chondrialen Atmungskette aus der Oxidation von NADH zu NAD+ und wird hauptsächlich durch die Superoxid-Dismutase (SOD) entgiftet:

Wasserstoffperoxid entsteht bei der Entgiftung des Superoxid-Anions durch die Superoxid-Dismutase (siehe oben), aber auch bei vielen anderen enzymatischen Reaktionen. Es wird entgiftet u. a. durch Glutathion-Peroxidase (GPX) bzw. Katalase:

2 H2O2 GPX/Katalase 2 H2O + O2


Entgiftung des Superoxid-Anions

O2‾ + O2‾ + 2H+ SOD H2O2 + O2

1. Scherkräfte

2. Angiotensin II

3. biologisches Altern der Gefäße


Hypertonie und altersbedingte

Atherosklerose der Gefäße


Schwankungen des Blutdrucks mit phasenhaft steilem Blutdruckanstieg (psychischer Stress) lösen oszillierende Scherkräfte auf das Gefäßendothel aus, vor allem bei den Arteriolen.

Die oszillierenden Scherkräfte führen zur verstärkten Bildung von H2O2 und O2‾(im Verhältnis 100:1).

Genauer Mechanismus unbekannt (eine Hypothese: über Einwirkungen auf das Zytoskelett).

Entstehung von Peroxynitrit-Anionen ONOO-

Inaktivierung von NO-Radikalen, die im Endothel mit Hilfe des Enzyms eNOS (endotheliale Stickoxid-Synthase) gebildet wurden und unter physiologischen Bedingungen die Gefäßmuskulatur relaxieren

→ NO-Mangel = Vasokonstriktion

Entstehung von Hydroxylradikalen


Folgen der Bildung von O2‾ und H2O2


Fe 2+ + H2O2 Fe 3+ + OH‾ + OH

Oxidation von LDL (oxidiertes LDL)

Oxidation ungesättigter Fettsäurereste in den

Phospholipiden der Zellmembranen zu

Lipidhydroperoxiden


Weitere Folgeschäden durch die ROS:

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Die ROS, das oxidierte LDL und die Lipidhydroperoxide aktivieren den Trankskriptionsfaktor NF-κ B (Nukleärer Faktor κ B) Synthese von Adhäsionsproteinen (ICAM-1;

VCAM-1 = vascular cell adhesion molecule-1, MCP-1 = monocyte chemoattractant protein-1) → Adhäsion von Leukozyten am Gefäßendothel

Synthese pro-inflammatorischer Zytokine

(u. a. TNF-alpha, Il-1, Il-6) Diese stimulieren ihrerseits NF-κ B → Circulus vitiosus

Folge: entzündliche Infiltration der Gefäßwände → Arteriosklerose


verstärkt in der Gefäßwand die Aktivität der

NADPH-Oxidase

→ Superoxid-Anionen

induziert die Synthese der Adhäsionsproteine VCAM-1 und MCP-1

→ Arteriosklerose


Angiotensin II

↑

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1) Mit fortschreitendem Alter stärkere Schädigung der mitochondrialen DNS durch oxidativen Stress im Vergleich zur chromosomalen DNS des Zellkerns, da in den Mitochondrien kein Schutz der DNS durch Histone.

Zunehmend Defekte bei der Synthese von Enzymen der Atmungskette

→ mitochondriale Atmung

→ ROS-Bildung

→ oxidativer Stress

→ Arteriosklerose


Biologisches Altern der Gefäße

↑

↑

↑

↓


2) Mit fortschreitendem Alter zunehmende Beein- trächtigung des Transports der SOD vom Zytosol in die Mitochondrien (Mangan-abhängige SOD2).

Ursache: Punktmutation im Signal-Polypeptid (mitochondrial targeting sequence), das den SOD-Transport in die Mitochondrien veranlasst.

→ Entgiftung von O2‾

→ ROS und oxidativer Stress

→ Arteriosklerose

↑

↓

↑


3) Oxidativer Stress: Oxidation von intrazellulärem Glutathion Permeabilität der Mitochondrienmembran

Cytochrom C wandert aus den Mitochondrien

in das Zytosol

Komplexbildung des Cytochrom C mit Apaf-1 (Apoptosom)

→ Apoptose der Zelle

↑


Zusammenfassung biologisches Altern der Gefäße

1) Schädigung der mitochondrialen DNS

2) Beeinträchtigung des Transports der SOD

3) Cytochrom C wandert aus den Mitochondrien in das Zytosol → Apoptose


1. Entkoppelung der OXPHOS

mit Hemmung der ATP-Synthase

1. Amadori, AGE und RAGE

2. Polyol-Weg

Diabetes mellitus


Hemmung der ATP-Synthase

Hyperglykämie

→ Glucosemetabolisierung durch Glykolyse und Zitratzyklus

→ Coenzyme NADH und FADH2

→ NADH und FADH2 = Elektronendonatoren → Überschuss an Elektronen gelangt in die mitochondriale Atmungskette.

→ beginnender Überlauf der Elektronen auf O2

→ Entkoppelung der OXPHOS → ATP

→ „Rückstau“ der Elektronen, die dadurch verstärkt mit O2 reagieren

→ O2‾

→ Arteriosklerose und Neuropathie

↑

↑

↑ ↑

↓ ↓

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Schematische Darstellung der mitochondrialen Atmungskette mit den Komplexen I und III

1-4 % des Sauerstoffs werden nicht zu Wasser reduziert (am Komplex IV), sondern zum Superoxid-Anion (vorwiegend am Komplex III).

Entstehung des Superoxid-Anions in der Atmungskette

Elektronenfähre

Staustufe

Überlauf

Elektronen

- Stau

O2 → O2‾

Hemmung der

Cytochrom-Oxidase

durch ONOO‾

↑

III

Horn, F. et al., Biochemie des Menschen

IV V

O2

Entkoppelung

der OXPHOS

Hemmung

↑

↑ ATP-Synthase

II

I

O2 O2 O2 O2 O2‾ O2‾ O2‾ O2‾ O2‾ O2 O2‾

Protonengradient

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Bei Hyperglykämie zunächst Glykierung von Amino-gruppen der Proteine über die Bildung von Schiff’schen Basen und Amadori-Produkten (Zwischenprodukte)

→ von den Amadori-Produkten ausgehend weitere

chemische Reaktionen bis zur Bildung von AGEs.


AGE-Synthese (advanced glycation end products)

Löffler, G., Basiswissen Biochemie

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Das Ausmaß der AGE-Synthese ist von der Glucose-Konzentration abhängig. → Bindung der AGEs an Zelloberflächenrezeptoren (RAGEs = Rezeptoren für AGEs) → Bildung von ROS → Aktivierung von NF-κ B → Synthese von Adhäsions- proteinen (ICAM-1, VCAM-1, MCP-1) und pro-in- flammatorischen Zytokinen (TNF-alpha, IL-1, IL-6) → Arteriosklerose und Neuropathie


Polyol-Weg

Stoffwechselweg zum Verbrauch überschüssiger Glucose, die nicht für die Energiegewinnung durch Glykolyse, Zitratzyklus und mitochondrialer Atmungskette verwendet werden kann. Bei Gesunden von untergeordneter Bedeutung. Bei Diabetikern mit Hyperglykämie wird dagegen bis zu einem Drittel der Gesamt-Glucose über den Polyol-Weg verstoffwechselt.


Polyol-Weg:

bei ständiger Hyperglykämie Verbrauch der NADPH- Reserven

NADPH steht für die Glutathion-Reduktase als Coenzym nicht mehr ausreichend zur Verfügung

Erschöpfung der Reserven an reduziertem Glutathion =

wichtigstes Antioxidans → oxidativer Stress → Arteriosklerose und Neuropathie

Glucose + NADPH + H+ Aldo-Reduktase Sorbitol + NADP+

↑


Interferon gamma

stimuliert in Makrophagen die induzierbare Stickoxid-Synthase, welche über Arginin-Citrullin-Zyklus die Synthese des hochreaktiven Stickoxid-Radikals (NO-Radikals) katalysiert.

Physiologische Wirkung des NO-Radikals: Abtöten von Krankheitserregern

Entzündungen / Infektionen


NO-Radikal kann mit Superoxid-Anion zum Peroxynitrit-Anion reagieren

NO-Radikal und Peroxynitrit-Anion hemmen Enzyme des Zitronensäure-Zyklus und der mitochondrialen Atmungskette und damit die Energiegewinnung betroffener Zellen (insbes. von Neuronen). Schädigung der Membran- und Proteinstrukturen von Zellen (u. a. die innere Mitochondrienmembran)

Folge: zelluläre Funktionsstörung (z.B. Erregungsleitungs-störungen) bis zum Zelltod; betroffen sind Neuronen und andere Zellen (z. B. Bindegewebszellen der Gelenkskapseln).


nitrosativer

Stress


NO● hemmt die Cytochrom C-Oxidase der Atmungskette reversibel, ONOO- dagegen irreversibel → Mitochondrienfunktion = Energiegewinnung herabgesetzt

Betrifft vor allem die Neuronen (hoher Energiebedarf).

Axonaler Transport von Zellstrukturproteinen ist eingeschränkt.

Darüber hinaus direkte stressbedingte Schäden an Membran- und Proteinstrukturen der Neuronen.

Neuropathie, z. B. bei chronischer Borreliose massive Freisetzung des Zytokins Interferon-γ durch Th1-Zellen → iNOS-Aktivität in Makrophagen → nitrosativer Stress

↓

↑ ↑ ↑ ↑

30

Marker der Lipidperoxidation

- Malondialdehyd (MDA)

- oxidiertes LDL (oxLDL)


Marker des oxidativen Stresses und der antioxidativen Kapazität

ROS oxidieren ungesättigte Fettsäurereste in den Phospho- lipiden der Zellmembranen. Es entstehen Lipidhydroperoxide = hochreaktive Zwischen-produkte; diese aktivieren den Transkriptionsfaktor NF-κ B (Adhäsionsproteine und pro-inflammatorische Zytokine)

Die Lipidhydroperoxide - werden teilweise durch die Glutathion-Peroxidase (GPX) entgiftet, - gehen teilweise weitere chemische Reaktionen ein

→ Malondialdehyd (MDA)

MDA ist ebenfalls reaktiv und wirkt mutagen, indem es Verbindungen mit Nukleinbasen eingeht und so Punkt- mutationen auslösen kann.


Malondialdehyd (MDA)

↑

- entsteht durch die Oxidation von LDL (vermutlich katalysiert von Lipoxygenasen),

- aktiviert den Transkriptionsfaktor NF-κ B → Adhäsionsproteine und pro-inflammatorische Zytokine


Oxidiertes LDL (oxLDL)

↑


Marker der Nukleinsäureoxidation

8-Hydroxy-2-Desoxyguanosin (OHDG) entsteht durch die Oxidation von Desoxyguanosin in der DNS des Zellkerns und insbesondere der Mitochondrien (in den Mitochondrien kein Schutz durch Histone)

→ zunehmend Defekte bei der Synthese von Enzymen der Atmungskette

→ mitochondriale Atmung

→ ROS-Bildung

→ oxidativer Stress

→ Arteriosklerose

↑

↑

↑

↓


Marker des nitrosativen Stresses

- 3-Nitrotyrosin

- Arginin

- Citrullin/g Kreatinin

entsteht durch die Nitrierung von Tyrosin durch NO∙

bzw. durch ONOO-

Wenn Arginin bzw. Citrullin/g Kreatinin

dann nitrosativer Stress


Arginin + O2 NO-Synthase NO + Citrullin

3-Nitrotyrosin

↓ ↑

LABORZENTRUM ETTLINGEN - KARLSRUHE

Marker der antioxidativen Kapazität

Totale Antioxidative Kapazität (AOC)

Glutathion

Glutathion-Peroxidase (GPX)

Ubichinon (Coenzym Q 10)

Superoxid-Dismutase (SOD)

Vitamin C und Vitamin E

Kofaktoren (Redoxfaktoren) Kupfer, Zink,

Mangan und Selen

MVZ Laborzentrum Ettlingen GmbH 36


Totale antioxidative Kapazität (AOC)

„Globaltest“, mit dem das gesamte Reduktions-vermögen zur Entgiftung von ROS gemessen wird. Methode: Ein chromogenes Radikal wird mit Patientenserum versetzt. Die dann folgende Abnahme der Farbreaktion entspricht der antioxidativen Kapazität. Je größer der oxidative Stress, desto geringer die antioxidative Kapazität.


Glutathion

ist das wichtigste Antioxidans. Reduziert Lipidhydro-peroxide mit Hilfe der Glutathionperoxidase (GPX).

Kofaktor der GPX ist Selen.

Selen ist für die Redox-Reaktionen das Elektronen-Reservoir.

Ubichinon (Coenzym Q 10)

ist einer der Elektronenüberträger innerhalb der mitochondrialen Atmungskette (zwischen Komplex I und Komplex III). Antioxidans und Radikalfänger wie Glutathion.





entgiftet das Superoxid-Anion (O2-∙)

Es gibt 3 Isoenzyme der SOD: SOD1: Vorkommen im Zytosol, enthält als Kofaktoren Kupfer und Zink

SOD2: Vorkommen in den Mitochondrien, enthält als Kofaktor Mangan

SOD3: Vorkommen auf extrazellulären Oberflächen Kupfer und Zink bzw. Mangan dienen als Elektronenreservoir für die Redoxreaktionen.

O2‾ + O2‾ + 2H+ SOD H2O2 + O2



Vitamin E (Tocopherol)

ist ein Antioxidans, das insbesondere ungesättigte Fettsäurereste in Zellmembranen vor der Lipidperoxi-dation schützt (Vermeidung von Lipidhydroperoxiden).

Das so oxidierte Vitamin E wird durch Vitamin C (Ascorbinsäure) regeneriert = reduziert.

Das so oxidierte Vitamin C wird durch Glutathion regeneriert = reduziert.

Vitamin E, Vitamin C und Glutathion wirken also synergistisch.


Rationale Stufendiagnostik

Hierfür gelten folgende Grundsätze:

1) Je größer der oxidative Stress, desto geringer die antioxidative Kapazität.

2) Endprodukte des oxidativen Stresses, wie Malondialdehyd (MDA), oxidiertes LDL (oxLDL) oder 8-Hydroxy-2-Desoxyguanosin (OHDG) sind generell aussagekräftiger als Enzyme, da sie kaum Schwankungen unterliegen.

3) Ist die Aktivität eines Enzyms zu niedrig, sollten seine Kofaktoren (Spurenelemente) kontrolliert werden. Darüber hinaus sind Substrate der Redox-Reaktionen, z. B. die beiden Vitamine C und E zu bestimmen.


1. Stufe

2. Stufe

3. Stufe


Untersuchung Material

Totale Antioxidative Kapazität (AOC) Serum


oxidiertes LDL (oxLDL)

8-Hydroxy-2-Desoxyguanosin (OHDG)

Serum

Serum

Urin (gefroren)


8-Hydroxy-2-Desoxyguanosin (OHDG)

Malondialdehyd (MDA)

Serum

Urin (gefroren)

Heparinplasma, gefroren oder

Serum, gefroren


Glutathion-Peroxidase (GPX)

Glutathion

Glutathion-Reduktase

EDTA-Blut

EDTA-Blut

EDTA-Blut, gefroren

EDTA-Blut

Kofaktoren Kupfer, Zink und Mangan bei

erniedrigter SOD

Kofaktor Selen bei erniedrigter GPX

ggf. Vitamine C und E

ggf. Ubichinon (Coenzym Q10)

Kupfer im Serum,

Zink im Heparinblut,

Mangan im EDTA-Blut

EDTA-Blut

Serum

Serum

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Dr. med. univ. Kurt Kraus


Otto-Hahn-Straße18 76275 Ettlingen

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Oxidativer- / Nitrosativer-Stress

Entstehung und Auswirkungen

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