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Aus dem Institut für Humangenetik
(Direktor Univ.-Prof. Dr. med. Klaus Zerres)
SMA-Studie:
Der CNTF-Genotyp als potentieller Einflussfaktor auf den klinischen
Verlauf der infantilen spinalen Muskelatrophie
Von der Medizinischen Fakultät
der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen
zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der Medizin
genehmigte Dissertation
vorgelegt von
Julia Hansmeier
aus Salzkotten
Berichter: Frau Professorin Dr. med. Sabine Rudnik-Schöneborn
Herr Professor Dr. med. Martin Georg Häusler
Tag der mündlichen Prüfung: 18.08.2014
Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis..................................................................................................... III
Abbildungsverzeichnis ...................................................................................................... V
Tabellenverzeichnis .......................................................................................................... VI
1 Einleitung ................................................................................................................. 1
1.1 Klinik der infantilen spinalen Muskelatrophie ............................................................. 1
1.2 Genetik der infantilen spinalen Muskelatrophie ........................................................... 3
1.3 Einflussfaktoren auf den klinischen Verlauf der SMA ................................................. 4
1.4 CNTF – ciliary neurotrophic growth factor .................................................................. 7
1.5 Fragestellung dieser Studie ........................................................................................... 9
2 Material und Methoden ........................................................................................... 10
2.1 Patientenkollektiv und klinische Daten ...................................................................... 10
2.2 Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) .................................... 10
2.3 CNTF-Mutationsanalyse mittels HAE III-Restriktionsverdau ................................... 13
2.3.1 PCR .................................................................................................................13
2.3.2 HAE III-Restriktionsverdau ............................................................................15
2.4 CNTF-Mutationsanalyse mittels Sequenzierung nach Sanger ................................... 16
2.5 CNTF-Mutationsanalyse mittels Pyrosequencing ...................................................... 19
2.5.1 Pyro-Primersynthese .......................................................................................21
2.5.2 PCR und Pyrosequencing ...............................................................................21
2.6 Statistik ....................................................................................................................... 23
3 Ergebnisse .............................................................................................................. 24
3.1 Kenngrößen für das Gesamtkollektiv ......................................................................... 24
3.2 Fallberichte der vier Patienten mit CNTF-Genotyp homozygot mutiert .................... 25
3.2.1 Fallbericht 1: Patient 1057 ..............................................................................29
3.2.2 Fallbericht 2: Patient 1132 ..............................................................................29
3.2.3 Fallbericht 3: Patientin 254 .............................................................................30
3.2.4 Fallbericht 4: Patient 249 ................................................................................30
3.3 CNTF-Genotyp-Verteilung im Gesamtkollektiv ........................................................ 31
3.4 Analyse des CNTF-Allels auf Vorliegen des Hardy-Weinberg-Gleichgewichts ....... 32
Inhaltsverzeichnis
II
3.5 Analyse klinischer Parameter ..................................................................................... 33
3.6 Kaplan-Meier-Analyse für Krankheitsbeginn und Überleben .................................... 40
4 Diskussion .............................................................................................................. 45
4.1 Infantile autosomal-rezessive spinale Muskelatrophie: Pathogenese in vivo
und im Tiermodell ....................................................................................................... 45
4.1.1 SMN-Proteinmangel als Ursache der SMA ....................................................45
4.1.2 SMA-Mausmodelle.........................................................................................47
4.2 Funktion des CNTF im Tiermodell ............................................................................ 49
4.3 Ergebnisse klinischer Studien unter Berücksichtigung des CNTF ............................. 52
4.3.1 Ergebnisse aus vorangegangenen Studien zu verschiedenen neurologischen
Erkrankungen ..................................................................................................52
4.3.2 CNTF-Genotyp-Frequenz im Bezug zum Hardy-Weinberg-
Gleichgewicht .................................................................................................54
4.3.3 CNTF in Bezug auf die klinischen Parameter dieses SMA- Kollektivs .........57
5 Zusammenfassung................................................................................................... 61
6 Anhang ................................................................................................................... 64
6.1 Ergänzung zu Tabelle 8 .............................................................................................. 64
6.2 Ergänzung zu Tabelle 9 .............................................................................................. 65
6.3 Ergänzung zu Tabelle 10 ............................................................................................ 65
6.4 Ergänzung zu Tabelle 11 ............................................................................................ 67
6.5 Ergänzung zu Tabelle 13 ............................................................................................ 69
6.6 Ergänzung zu Tabelle 15 ............................................................................................ 71
7 Literaturverzeichnis ................................................................................................ 72
8 Danksagung ............................................................................................................ 79
9 Erklärung zur Datenaufbewahrung .......................................................................... 80
10 Eidesstattliche Erklärung über den Eigenanteil ........................................................ 81
Abkürzungsverzeichnis
III
Abkürzungsverzeichnis
ALS Amyotrophe Lateralsklerose AMP Adenosinmonophosphat APS Adenosin-5’-Phosphosulphat Aqua dest. Aqua destillata ATP Adenosintriphosphat bp Basenpaar BTFp44 Basal Transcription Factor Subunit p44 bzw. beziehungsweise ca. circa CLC Kardiotrophin-like Zytokin CNTF Ciliary Neurotrophic Factor CNTF-Rα Ciliary Neurotrophic Factor Rezeptor alpha CPAP Continuous Positive Airway Pressure CT-1 Kardiotrophin-1 d.h. das heißt dATP Desoxyadenosintriphosphat dATP·S Desoxyadenosine-alpha-thio-triphosphat DdeI Restriktionsenzym aus Desulfovibrio desulfuricans ddNTPs Didesoxyribonukleosidtriphosphate DNA Desoxyribonukleinsäure dNTPs Desoxyribonukleosidtriphosphate EMG Elektromyographie et al. lateinisch: et alii, für: und andere F-ALS Familiäre Amyotrophe Lateralsklerose FDR False Discovery Rate F-Primer Forward-Primer gp130 Glykoprotein 130 GTF2H2 General Transcription Factor IIH Polypeptide 2 H0 Nullhypothese H1 Alternativhypothese H4F5 = SERF1A/B
Small EDRK-rich Factor 1A/B
HAE III aus Haemophilus aegyptius isoliertes Restriktionsenzym Hinfl Restriktionsenzym aus dem Bakterium Haemophilus influenzae hnRNP heterogeneous nuclear Ribonucleoprotein Particle HPLC High Performance Liquid Chromatography IL-6, IL-11 Interleukin-6 / -11 kDa kilo-Dalton LIF / LIFRß Leukemia Inhibitory Factor / LIF-Rezeptor ß µl Mikroliter M Molare Masse MgCl2 Magnesiumchlorid min Minute ml Milliliter MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification mRNA Messenger-Ribonukleinsäure MS Multiple Sklerose NAIP Neuronales Apoptose Inhibitor Protein NaOH Natriumhydroxid
Abkürzungsverzeichnis
IV
NEB New England Biolabs ng Nanogramm NGF nerve growth factor NNT-1 Novel Neurotrophin-1 NP Neuropoietin OSM Onkostatin M PCR Polymerase Chain Reaction pH potentia Hydrogenii pmn progressive motor neuropathy PPi Pyrophosphat prä-mRNA Präkursor-Messenger-Ribonukleinsäure rpm revolutions per minute R-Primer Reverse-Primer s. siehe SAP Shrimp Alkaline Phosphatase SD Standardabweichung sec Sekunde SF-3 B-Zell stimulierender Faktor 3 SMA Spinale Muskelatrophie SMARD Spinal Muscular Atrophy With Respiratory Distress SMN1 = telSMN Telomerische Kopie des Survival-Motor-Neuron-Gens SMN2 = cSMN Zentromerische Kopie des Survival-Motor-Neuron-Gens SMN-Protein Survival-Motor-Neuron-Protein SNP Single Nucleotide Polymorphismus snRNP small nuclear Ribonucleoprotein Particle ssDNA Einzelstrang-DNA Taq-Polymerase Thermus aquaticus Polymerase Tm Schmelztemperatur des Primers u.a. unter Anderem U/µl Units pro Mikroliter unb. unbekannt Unrip Unr-interacting protein UsnRNA uridylate-rich small nuclear RNA v.a. vor Allem vps54 vacuolar protein sorting 54
Abbildungsverzeichnis
V
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: SMN-Gen-Region 5q13 .......................................................................... 5
Abbildung 2: Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) .................. 11
Abbildung 3: Erkennungssequenz von HAE III ............................................................. 13
Abbildung 4: Per PCR amplifizierter CNTF-Gen-Abschnitt .......................................... 13
Abbildung 5: Restriktionsverdau durch HAE III. ........................................................... 15
Abbildung 6: Sequenzierung per Kettenabbruchsynthese nach Sanger et al. (1977) .... 17
Abbildung 7: dNTP und ddNTP ..................................................................................... 18
Abbildung 8: CNTF-Mutationsanalyse mittels Pyrosequenzierung. .............................. 20
Abbildung 9: Anzahl der SMN2-Kopien bei den einzelnen SMA-Typen ...................... 25
Abbildung 10: Boxplot Überlebensdauer im Vergleichskollektiv SMA 1 mit
2 SMN2-Kopien. ............................................................................................................. 27
Abbildung 11: Boxplot Erkrankungsbeginn im Vergleichskollektiv SMA 1 mit 2
SMN2-Kopien ................................................................................................................. 28
Abbildung 12: Boxplot Erkrankungsbeginn im Vergleichskollektiv SMA 2 mit 3
SMN2-Kopien ................................................................................................................. 28
Abbildung 13: de Finetti-Diagramm ............................................................................... 33
Abbildung 14: Kaplan-Meier-Überlebenskurve für den Parameter Erkrankungsbeginn
im Gesamtkollektiv nach CNTF-Status getrennt ............................................................ 43
Abbildung 15: Kaplan-Meier-Überlebenskurve für den Parameter Erkrankungsbeginn
im Gesamtkollektiv nach SMN-Kopienzahl getrennt ..................................................... 44
Abbildung 16: Kaplan-Meier-Überlebenskurve für den Parameter Überlebensdauer bei
SMA 1-Patienten nach CNTF-Status getrennt ................................................................ 44
Abbildung 17: Erwartete und beobachtete CNTF-Genotyp-Frequenzen ....................... 56
Tabellenverzeichnis
VI
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Liste der verwendeten Reagenzien, Materialien und Geräte ....................... VII
Tabelle 2: Einteilung der SMA-Formen nach Lokalisation und Gendefekt
(verändert nach S. Rudnik-Schöneborn & K. Zerres (2011)) ........................................... 2
Tabelle 3: Übersicht über die Formen der autosomal-rezessiven proximalen
infantilen SMA .................................................................................................................. 3
Tabelle 4: Für die Pyrosequenzierung verwendete Primer ............................................. 21
Tabelle 5: Darstellung des Gesamtkollektivs mit absoluten Häufigkeiten von
SMA-Typ, SMN-Kopienzahl und CNTF-Genotyp ........................................................ 24
Tabelle 6: Patienten mit dem CNTF-Genotyp homozygot mutiert und ihre
Vergleichsgruppen .......................................................................................................... 26
Tabelle 7: CNTF-Genotyp-Verteilung ............................................................................ 31
Tabelle 8: Klinische Parameter in der Gruppe SMA 1 ................................................... 34
Tabelle 9: Klinische Parameter in der Gruppe SMA 2 ................................................... 35
Tabelle 10: Klinische Parameter in der Gruppe SMA 3 ................................................. 36
Tabelle 11: Klinische Parameter im Gesamtkollektiv .................................................... 38
Tabelle 12: Kenngrößen für den Parameter Erkrankungsbeginn in den verschiedenen
Subgruppen des Gesamtkollektivs .................................................................................. 40
Tabelle 13: Kaplan-Meier-Analyse des Einflusses auf die Zeitspanne bis zum
Erkranken getrennt nach den Einfluss-Faktoren SMA-Typ, SMN2-Kopienzahl und
CNTF-Typ im Gesamtkollektiv und in verschiedenen Subgruppen ............................... 41
Tabelle 14: Kenngrößen für den Parameter Überlebensdauer in SMA 1-Patienten ....... 42
Tabelle 15: Kaplan-Meier-Analyse des Einflusses auf die Zeitspanne bis zum Versterben getrennt nach den Einfluss-Faktoren SMN2-Kopienzahl und CNTF-Typ in SMA 1-Patienten ...................................................................................... 42
Tabelle 16: CNTF-Genotyp-Frequenzen in vergleichbaren europäischen Studien ...…55
Tabelle 17: Hardy-Weinberg-Equilibrium in vergleichbaren Studien………………...56
Tabelle 18: Anpassung des Signifikanzniveaus mittels Simes-Prozedur…..………… .59
Liste der verwendeten Reagenzien, Materialien und Geräte
VII
Tabelle 1: Liste der verwendeten Reagenzien, Materialien und Geräte
Reagenzien Hersteller
F-Primer SMN7Hinf-fwd2 5´-CTTCCTTTTATTTTCCTTACAGGGATT-3´
Eurofins MWG Operon (Ebersberg)
R-Primer SMN7-rev2 5´-TCCACAAACCATAAAGTTTTAC-3´
Eurofins MWG Operon (Ebersberg)
F-Primer SMN8-960 5´-GTAATAACCAAATGCAATGTGAA-3´
Eurofins MWG Operon (Ebersberg)
R-Primer SMN8-1120 5´-CTACAACACCCTTCTCACAG-3´
Eurofins MWG Operon (Ebersberg)
Restriktionsendonuklease DdeI NEB (Frankfurt am Main) Restriktionsendonuklease HinfI NEB (Frankfurt am Main) QIAamp DNA Minikit Quiagen (Hilden) Isopropanol absolut Merck (Darmstadt) Pronase 20 mg/ml Merck (Darmstadt)
SALSA MLPA Kit MRCH PO21-A1 SMA MRC Holland (Amsterdam, Niederlande)
A. dest Merck (Darmstadt)
HIDI-Formamid Applied Biosystems (Darmstadt)
Größenstandard LIZTM Size-Standard Invitrogen (Karlsruhe) Ethidiumbromid 1% Merck (Darmstadt)
Biozym LE Agarose Biozym (Hessisch Oldendorf)
TBE-Puffer Invitrogen (Karlsruhe) Blaupuffer Merck (Darmstadt) Längenstandard 100-bp-Leiter Invitrogen (Karlsruhe) dNTP-Mix (12.5 µl dATP, dCTP, dGTP, dTTP (je 100 mM) ad 1000 µl H2O)
Invitrogen (Karlsruhe)
10xPCR-Puffer Invitrogen (Karlsruhe) MgCl2 50µM Invitrogen (Karlsruhe) Tag 5U/µl Invitrogen (Karlsruhe) 10xPCR-Puffer Quiagen (Hilden) Q-Solution 5U/µl Quiagen (Hilden) Taq 5U/µl Quiagen (Hilden)
CNTF-Primer-F (10µM) 5´-CGGTCTCTCTACTCACTCTAAAAC-3´
Eurofins MWG Operon (Ebersberg)
CNTF-Primer-R (10 µM) 5´-CAGGTTGATGTTCTTGTTCATGCCC-3´
Eurofins MWG Operon (Ebersberg)
Restriktionsenzym HAE III 10.000 U/ml NEB (Frankfurt am Main)
Puffer 4 NEB (Frankfurt am Main)
ExoSAP Enzymmix Affymetrix (Santa Clara, USA)
Big Dye Terminator Mix Applied Biosystems (Darmstadt)
Liste der verwendeten Reagenzien, Materialien und Geräte
VIII
Natronlauge 3M Merck (Darmstadt) Ethanol 70 % Merck (Darmstadt) Pyro-Primer-R (10 µM) biotinyliert 5´-CCATCCGCAGAGTCCAGGTTGA-3´
Eurofins MWG Operon (Ebersberg)
Pyro-Primer-F (10 µM) 5´-ACTGGGGTGATGACAGAAGATGTGGT-3´
Eurofins MWG Operon (Ebersberg)
Pyro-Primer-S (10 µM) 5´-TGTGGTGTTTTCCTGTA-3´
Eurofins MWG Operon (Ebersberg)
Streptavidin Sepharose™ HP Biotage AB (Uppsala, Schweden)
Bindungs-Pufferlösung (pH 7.6; 10 mM Tris-HCl, 2 M NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% Tween 20)
Biotage AB (Uppsala, Schweden)
Denaturierungs-Lösung (0.2 M NaOH) Biotage AB (Uppsala, Schweden)
Wasch-Pufferlösung (pH 7.6; 10 mM Tris-Acetat) Biotage AB (Uppsala, Schweden)
Hybridisierungs-Pufferlösung (pH 7.6; 20 mM Tris-Acetat, 2 mM Mg-Acetat)
Biotage AB (Uppsala, Schweden)
High purity Wasser (Milli-Q™ 18.2 MΩ x cm oder equivalent) Biotage AB (Uppsala, Schweden)
Enzymmix “Gold Q96 Reagents” (Luziferase, DNA-Polymerase, Apyrase, Sulfurylase)
Biotage AB (Uppsala, Schweden)
Substratmix “Gold Q96 Reagents” (Luziferin und APS)
Biotage AB (Uppsala, Schweden)
dNTP-Lösungen “Gold Q96 Reagents“ (dTTP, dCTP, dGTP, dATPαS)
Biotage AB (Uppsala, Schweden)
Materialien Hersteller Eppendorf Safe-Lock Tubes 0,5 ml Eppendorf AG (Hamburg)
PCR-Tubes 0,5ml Biozym (Hessisch Oldendorf)
MLPA Analysis Spreadsheet MRC Holland (Amsterdam, Niederlande)
Software GeneMapper Applied Biosystems (Darmstadt)
96-well-Mikrotiterplatte Biotage AB (Uppsala, Schweden)
Präzisionswaage BP 2100 Sartorius AG (Göttingen) 500 ml Erlenmeyer- Glas-Kolben Schott Duran (Wertheim) QIAquick Gel Extraction Kit Quiagen (Hilden) Eppendorf Tubes 1,5 ml Eppendorf AG (Hamburg)
Software Sequencing Analysis 5.2 Applied Biosystems (Darmstadt)
Liste der verwendeten Reagenzien, Materialien und Geräte
IX
Software PyrosequencingTM Assay Design 1.0 Biotage AB (Uppsala, Schweden)
96-well-Platte “PSQ™96 Plate Low” Biotage AB (Uppsala, Schweden)
Reagenzien-Kartusche “PSQ 96 Reagent Cartridge“ Biotage AB (Uppsala, Schweden)
Software PSQ 96 Biotage AB (Uppsala, Schweden)
Software R 2.15.1 R Foundation
Software Microsoft Office 2010 Microsoft Deutschland (Unterschleißheim)
Software SAS 9.1.3 SAS Institute Inc. (Cary, USA)
Software Endnote Web 3.5 Thomson Reuters (New York, USA)
Universal-Pipetten-Spitzen Tip One Starlab GmbH (Ahrensburg) Geräte Hersteller MS1 Minishaker Ika Labortechnik (Staufen)
Thermocycler MJ-PTC200 Biozym (Hessisch Oldendorf)
Gelektrophorese-Apparatur GNA200 Pharmacia Biotech (Freiburg)
Kühlzentrifuge Megafuge 1.0 Heraeus Holding GmbH (Hanau)
Wasserbad GFL1086 GFL (Burgwedel)
Thermocycler MJ-PTC100 Biozym (Hessisch Oldendorf)
ABI 3130 Applied Biosystems (Darmstadt)
Imager Gel Doc 2000 Bio-Rad Laboratories (München)
Pipetten Pipetman P10, P20, P100, P1000 Gilson B.V. (Den Haag, Niederlande)
Photometer Eppendorf AG (Hamburg)
Vakuum-Arbeitsstation “Vacuum Prep Workstation“ Biotage AB (Uppsala, Schweden)
Variomag Monoshake für Mikrotiterplatten Thermo Fisher Scientific (Langenselbold)
Heizplatte “PSQ 96 Sample Prep Thermoplate low” Biotage AB (Uppsala, Schweden)
PyroMark™Q96 ID Biotage AB (Uppsala, Schweden)
Heiz-Rühr-Gerät RCT basic Ika Labortechnik (Staufen) Schütteltisch GFL 3005 GFL (Burgwedel)
1.1 Einleitung
1
1 Einleitung
Die Bezeichnung Spinale Muskelatrophie (SMA) umfasst eine heterogene Gruppe
neuromuskulärer Erkrankungen, die einen Verlust von Vorderhornzellen im
Rückenmark und teilweise auch motorischer Hirnnervenkerne gemeinsam haben
(Crawford & Pardo, 1996). Dieser Verlust resultiert in Lähmungen und
Muskelatrophien. Die Subgruppe der infantilen proximalen autosomal-rezessiven
Muskelatrophien macht dabei den Hauptteil der SMA-Erkrankungen aus. Sie ist mit
einer Inzidenz von 1:10.000 die zweithäufigste autosomal-rezessiv vererbte Erkrankung,
die zum Tod im frühen Kindesalter führen kann (Rudnik-Schöneborn et al., 2002).
Diese sind Inhalt dieser Studie. Innerhalb dieser Gruppe sind der Phänotyp und der
klinische Erkrankungsverlauf sehr variabel. Die Krankheit kann sich äußern durch das
rasche Versterben nach der Geburt bis hin zu nur geringen körperlichen Behinderungen
mit einer fast normalen Lebenserwartung. Durch die Anwendung verschiedener
Hilfsmittel und physikalischer Therapie kann die Lebenserwartung verbessert werden.
In den letzten Jahren erzielte die Forschung zudem große Fortschritte in der Aufklärung
der Pathogenese der SMA. Es konnte jedoch noch keine kausale Therapie entwickelt
werden. Die Suche nach Erklärungsmodellen für die Variabilität in der klinischen
Ausprägung ist allerdings noch nicht abgeschlossen.
1.1 Klinik der infantilen spinalen Muskelatrophie
Einen kurzen Überblick über die Einteilung der gesamten SMA-Formen nach Phänotyp
und Gendefekt bietet Tabelle 2. Die Subgruppe der infantilen proximalen autosomal-
rezessiven SMA umfasst 3 Typen (Rudnik-Schöneborn & Zerres, 2007). Am
schwersten betroffen sind Patienten mit SMA-Typ 1, auch Werdnig-Hoffmann genannt.
Sie erkranken innerhalb der ersten 9 Lebensmonate, erlangen nie die Fähigkeit zu sitzen
und haben aufgrund ihrer generalisierten schweren muskulären Hypotonie eine geringe
Lebenserwartung. Die intermediäre Form SMA Typ 2 zeigt eine rumpfbetonte
Hypotonie. Die Patienten können frei sitzen, jedoch nicht gehen. Der
Erkrankungsbeginn liegt in der Regel zwischen dem 1. und 18. Lebensmonat. Den
mildesten Phänotyp weisen Patienten mit SMA-Typ 3 / Kugelberg-Welander auf. Die
Lebenserwartung ist bei diesem Typ normal. Auch werden die motorischen
Meilensteine inklusive freiem Laufen erreicht.
1.1 Einleitung
2
Tabelle 2: Einteilung der SMA-Formen nach Lokalisation und Gendefekt (verändert nach S. Rudnik-Schöneborn & K. Zerres (2011))
1. Proximale SMA (80-90%)
Autosomal-rezessive SMA Autosomal-dominante SMA
• Infantile SMA (SMA I-III)
• Adulte SMA (SMA IV)
• juvenil
• adult
2. Sonderformen der infantilen SMA
• Diaphragmale SMA (SMARD) (autosomal-rezessiv)
• SMA plus cerebelläre Hypoplasie (autosomal-rezessiv)
• SMA plus Arthrogryposis und Frakturen (autosomal-rezessiv, X-chromosomal)
• SMA plus Myoclonusepilepsie (autosomal-rezessiv)
3. Nicht-proximale SMA
Distale SMA
• Juvenile distale SMA / hereditäre motorische Neuropathie
(autosomal-dominant, autosomal-rezessiv, X-chromosomal)
Scapuloperoneale SMA
(autosomal-dominant,
autosomal-rezessiv)
• Mit Spastik (autosomal-dominant)
• Mit Pyramidenbahnzeichen
(autosomal-dominant, autosomal-rezessiv)
• Mit Stimmbandlähmung (autosomal-dominant)
• Mit Zwerchfelllähmung (autosomal-rezessiv)
• Juvenile distale (monomere) SMA Typ Hirayama
(meist sporadisch)
4. Bulbärparalyse
• Adulte Bulbärparalyse (autosomal-dominant)
• Progressive Bulbärparalyse des Kindesalter Typ Fazio-Londe (autosomal-rezessiv)
• Bulbärparalyse mit Taubheit und distaler SMA (Brown-Vialetto-van-Laere-Syndrom)
(autosomal-rezessiv)
5. Spinobulbäre Muskelatrophie Typ Kennedy (X-chromosomal)
Der Krankheitsverlauf ist beim SMA-Typ 3 allerdings hochgradig variabel. So weisen
hier einige Patienten schon frühkindlich Entwicklungsverzögerungen auf und verlieren
ihre motorischen Fähigkeiten früh, sodass sie im Verlauf auf einen Rollstuhl
angewiesen sind. Andere wiederum durchleben eine normale Entwicklung und zeigen
erst nach dem 3. Lebensjahr progrediente Probleme, beispielsweise beim Treppen
steigen. Der Prozess stoppt allerdings auf einem gewissen Behinderungsniveau, sodass
die Gehfähigkeit auch bis zum Lebensende erhalten bleiben kann (Tabelle 3).
1.2 Einleitung
3
Tabelle 3: Übersicht über die Formen der autosomal-rezessiven proximalen infantilen SMA
SMA 1 Werdnig-Hoffmann
SMA 2 SMA 3 Kugelberg-Welander
Erkrankungs-Beginn
1. - 9. Monat 1. – 18. Monat A < 3. Lebensjahr
B > 3. Lebensjahr
Lebenserwartung gering leicht verringert normal normal Klinik generalisierte
Hypotonie, proximal betont, Beine stark betroffen
generalisierte Hypotonie, Rumpfbetonung, Deformationen, Handtremor
proximal betonte Hypotonie, Motorische Entwicklung verzögert, meist Rollstuhl erforderlich
normale frühkindliche Entwicklung, spät auffällig durch Probleme beim Laufen oder Treppen steigen
Motorische Meilensteine
Sitzen nicht möglich
Sitzen frei möglich Freies Gehen nicht möglich
Gehen frei möglich
1.2 Genetik der infantilen spinalen Muskelatrophie
Trotz der klinisch unterschiedlichen Verläufe sind alle 3 Erkrankungen auf einen
Verlust des Survival-Motor-Neuron-1-Gens (SMN1) im Bereich 5q11.2-13.3 zurück zu
führen (Brzustowicz et al., 1990). Dabei weisen über 90 % der Patienten einen
homozygoten SMN1-Genverlust auf (Lefebvre et al., 1995). Weitere 4 % sind
compound-heterozygot, d.h. ein SMN1-Allel ist mutiert und das andere deletiert, oder
weist eine zum Funktionsverlust führende Mutation auf (Wirth et al., 1999). Aus der
Deletion des Gens resultiert ein SMN-Protein-Mangel.
Das SMN1-Protein ist ca. 38 kDa schwer (Coovert et al., 1997; Liu & Dreyfuss, 1996).
Es wird ubiquitär in verschiedenen Geweben exprimiert. Allerdings ist die
physiologische Expression des Proteins in Motoneuronen besonders hoch. Auch die
Reduktion des Protein-Levels als Folge der SMN-Mutation ist in Motoneuronen
besonders stark (Coovert et al., 1997). Außerdem erklärt sich seine gewebespezifische
Funktion in Motoneuronen durch die dort wahrgenommenen Aufgaben. So erfüllt SMN
eine axonspezifische Funktion durch seinen Einfluss auf den axonalen mRNA-
Transport, v.a. von ß-actin mRNA. Motoneurone sind weiterhin besonders anfällig für
1.3 Einleitung
4
die aus dem SMN-Defizit resultierende gestörte snRNP-Biogenese und
prä-RNA-Prozessierung mit daraus folgenden Veränderungen der Genexpression
(Burghes & Beattie, 2009; Lorson et al., 2010). Ein Verlust des SMN-Proteins führt v.a.
distal zu morphologischen Veränderungen im Motoneuron. Die postnatale Entwicklung
der neuromuskulären Endplatte ist postsynaptisch fehlerhaft. Außerdem ist das Axon
terminal schlecht verzweigt und mit Filament-Aggregaten gefüllt (Ito et al., 2011;
Kariya et al., 2008).
Zusammengefasst ist die SMA also eine Erkrankung der neuromuskulären Verbindung,
die durch fehlendes axonales Aussprossen und eine retrograde Degeneration von der
motorischen Endplatte über das Axon bis zum Neuronenverlust führt (Cifuentes-Diaz et
al., 2002).
1.3 Einflussfaktoren auf den klinischen Verlauf der SMA
Bei der Identifizierung des SMN1-Gens stellte sich gleichzeitig heraus, dass die
gesamte SMN-Genregion in einer zentromerisch gelegenen invertierten Kopie vorliegt
(Lefebvre et al., 1995). Diese beinhaltet auch eine Kopie des SMN1-Gens, SMN2
genannt, und ist nur bei Menschen und Primaten zu finden (Rochette et al., 2001).
Dabei unterscheiden sich SMN1 und SMN2 nur durch den Austausch von 5
Nukleotiden (Lefebvre et al., 1995). Die C/T-Transition in Exon 7 des SMN2-Gens an
Position +6 resultiert in den Verlust des Exons 7 während des Spleiß-Vorgangs, denn
Exon 7 enthält stark regulierte Signalsequenzen (Abbildung 1). Zur genauen Ursache
des Verlusts existieren zwei gleichwertige Theorien: Zum einen führt aberrantes
Spleißen durch Inaktivierung der splice enhancer (Exon-Spleiß-Verstärker) nach
C/T-Transition zu einem verkürzten SMN-Transkript mit Verlust von Exon 7 (Cartegni
& Krainer, 2002; Lorson et al., 1999; Monani et al., 1999). Kashima und Manley (2003)
machten andererseits die Entstehung einer splice silencer site verantwortlich. In einer
Folgestudie konnte gezeigt werden, dass wahrscheinlich beide Mechanismen
gleichzeitig ursächlich sind (Cartegni et al., 2006).
Das Fehlen von Exon 7 ist verantwortlich für das Unvermögen zur Selbstassoziation
und damit für den Funktionsverlust von SMN2 (Lorson et al., 1999). Das Protein ist
somit instabil und wird rasch abgebaut (Lefebvre et al., 1997). Da die Transkription von
SMN2 nur in 10% zu funktionellem SMN-Protein führt, resultiert bei dem Verlust von
1.3 Einleitung
5
SMN1 trotz des Vorhandenseins einer SMN-Gen-Kopie ein SMN-Protein-Mangel
(Coovert et al., 1997; Lefebvre et al., 1997). Allerdings kann durch Konversion und
paternales crossing-over die Anzahl der SMN2-Gen-Kopien von regulär 2 bis auf
maximal 8 erhöht sein (Vitali et al., 1999). In der Konsequenz ergibt sich dadurch
wiederum ein proportional höheres Level an SMN-Protein. Je mehr Kopien,
beziehungsweise SMN-Protein, vorhanden sind, desto milder ist der klinische Verlauf.
Das SMN2-Gen ist somit Einflussfaktor für den Krankheitsverlauf und den SMA-Typ.
Die durchschnittliche Kopienzahl liegt zu 80% bei 1-2 Kopien für SMA 1-Patienten, zu
82% bei 3 Kopien für SMA 2-Patienten und zu 96% bei 3-4 Kopien für SMA 3-
Patienten (Feldkötter et al., 2002).
Abbildung 1: SMN-Gen-Region 5q13 Die gesamte SMN-Gen-Region liegt in einer zentromerisch gelegenen Duplikation vor. Die Kopie des SMN1-Gens, SMN2 genannt, unterscheidet sich allerdings durch 5 Nukleotide. Die C/T-Transition in Exon 7 des SMN2-Gens führt zu aberrantem spleißen. Daher ist die mRNA meist durch den Verlust von Exon 7 verkürzt. Die daraus resultierenden Transkriptionsprodukte stellen nur zu 10% ein voll funktionsfähiges SMN-Protein dar. 90% der Proteine sind nicht zur Selbstassoziation fähig und werden daher rasch abgebaut.
Die SMN2-Kopienzahl allein ist allerdings keine suffiziente Erklärung für die
interindividuelle Variabilität, insbesondere bei SMA 3-Patienten. Daher wurde der
1.3 Einleitung
6
Einfluss weiterer Gene untersucht. In der SMN-Region wurden u.a. folgende co-
deletierte Sequenzen gefunden: BTFp44 (auch GTF2H2 genannt) (Carter et al., 1997),
H4F5 (auch SERF1A genannt) (Scharf et al., 1998), Exon 1-6 des SMN1-Gens und
NAIP (Roy et al., 1995). Eine Korrelation der Anzahl der NAIP-Gen-Kopien mit dem
Schweregrad der Erkrankung konnte nachgewiesen werden.
Außerdem wurde festgestellt, dass die verschiedenen Mutationen in SMN1
unterschiedlich starke Funktionsverluste des SMN-Proteins verursachen. Dies ist
zurückzuführen auf allelische Komplementation (Yu & Howell, 2000), welche den
Ausgleich von Gendefekten auf Proteinebene bezeichnet. Der Ausgleich entsteht durch
den Funktionsgewinn, der erzielt wird, da die Restaktivitäten der beiden Proteine
(SMN1 und SMN2) sich ergänzen. Für die Funktion des SMN-Proteins ist dabei die
Bindung aller seiner Interaktionspartner zu einem funktionellen Komplex von großer
Bedeutung. Mutationen im SMN1-Gen, die zum Verlust einer dieser Protein-
Bindungsdomänen führen, kommen funktionell einem SMN1-Genverlust gleich. Sie
werden als schwere Mutation bezeichnet (Lorson et al., 1998; Sun et al., 2005). Fehlt
beispielsweise die SMN-Bindungsstelle, kann das Protein keine Oligomere bilden und
wird degradiert (Burnett et al., 2009). Fehlt wiederum die Bindungsstelle zu snRNP,
liegt SMN zwar in stabilen Oligomeren vor, ist aber nicht funktional (Buhler et al.,
1999; Pellizzoni et al., 1999). Bei dem Vorliegen milder Mutationen bleibt durch die
Zusammenarbeit mit SMN2 die Funktionsfähigkeit des Komplexes erhalten.
Einen weiteren Ansatz verfolgten Oprea et al. (2008). Für ihre Suche nach
Modifikatoren untersuchten sie die Genexpression in Zellkulturen von miteinander
verwandten SMA-Patienten. Diese wiesen den gleichen Genotyp auf und unterschieden
sich dennoch bezüglich ihres Phänotyps. Klinisch unauffällige Patientinnen wiesen
einen signifikant erhöhten Plastin 3-Spiegel auf. In weiter führenden Experimenten
konnte die Überexpression von Plastin 3 in Zellkulturen und in Zebrafischen SMA-
typische Axonschäden reparieren. Plastin 3 ist ein Protein, welches Aktin bindet und
bündelt (Delanote et al., 2005). Einen Zusammenhang zwischen der Ausprägung der
SMA und der Aktin-Filament-Dynamik konnte auch in anderen Studien nachgewiesen
werden (Bowerman et al., 2009; Nolle et al., 2011).
Vielversprechend erschienen in diesem Zusammenhang die Beobachtungen von
Sendtner et al. (1992). Bei pmn-Mäusen, einem Modell für milde SMA-Formen, stellte
die Arbeitsgruppe eine Verbesserung der Überlebenszeit und der motorischen Funktion
1.4 Einleitung
7
durch die exogene Zufuhr des Wachstumsfaktors CNTF (ciliary neurotrophic factor)
fest. Die erkrankten Mäuse der CNTF-Gruppe wiesen dabei eine erhöhte Anzahl
überlebender Neurone und Axone auf. Gurney et al. (1992) beobachteten in einer
Gruppe adulter gesunder Mäuse nach der exogenen Zufuhr von CNTF ebenfalls
Veränderungen an dessen Axonen. Sie wurden angeregt auszusprossen. Dieses
Aussprossen terminaler Axone, welches zur Vergrößerung der motorischen Einheit
führt, war wiederum auch bei SMA-Patienten mit milden Erkrankungsformen in vivo
beobachtet worden. Es galt als kompensatorischer Mechanismus (Crawford & Pardo,
1996; Hausmanowa-Petrusewicz & Karwanska, 1986). Durch die Zusammenschau der
Forschungsergebnisse rückte CNTF und seine mögliche Rolle als Einflussfaktor auf den
Verlauf der spinalen Muskelatrophie in den Fokus der SMA-Forschung.
1.4 CNTF – ciliary neurotrophic growth factor
Ursprünglich wurde CNTF als neurotrophischer Faktor charakterisiert, der in vitro das
Überleben parasympathischer Neurone des Ziliarnerven aus Hühnerembryos
unterstützte (Adler et al., 1979). Auch für andere neuronale Zellen konnte ein
trophischer Effekt gezeigt werden (Barbin et al., 1984; Manthorpe et al., 1986). Die
ursprüngliche Einordnung in die Familie des NGF (nerve growth factor) wurde später
revidiert und CNTF aufgrund seiner strukturellen Beschaffenheit als Zytokin der
IL-6-Familie eingeordnet. Diese Familie beinhaltet beispielsweise auch LIF, IL-6,
IL-11, OSM, CT-1, CLC, NNT-1, SF-3 und NP (Vergara & Ramirez, 2004). CNTF
nutzt wie andere Mitglieder dieser Familie gp130 und LIFRß als Komponenten seines
dreiteiligen Rezeptorkomplexes. Allein die CNTF-Rezeptor-alpha-Untereinheit ist
CNTF-spezifisch (Stahl et al., 1994). Das CNTF-Protein ist 24 kDa groß (Masiakowski
et al., 1991). Es wird überwiegend in Astrozyten und Schwannschen Zellen exprimiert
(Stöckli et al., 1991). Das Protein ist im Zytosol lokalisiert und weist keine
Signalsequenz zur Sezernierung auf (Stöckli et al., 1989). Das für CNTF kodierende
Gen befindet sich auf Chromosom 11q12.2 (Giovannini et al., 1993). Ein funktioneller
SNP im CNTF-Gen, der zum Knock-out von CNTF führt, wurde von Takahashi et al.
(1994) beschrieben. Eine G/A-Transition an Position -6 des Spleiß-Akzeptors führt
durch aberrantes Splicen zu einem verkürzten und inaktiven Protein. In dieser
japanischen Studiengruppe waren 2,3% homozygot mutiert und 35,8 % heterozygot.
1.4 Einleitung
8
Das CNTF-Proteinlevel ist proportional zur Anzahl der Wildtyp-Allele
(Takahashi et al., 1996). CNTF ist zuständig für die Reparatur und Instandhaltung von
Neuronen und somit für den Erhalt ihrer Funktion. Seit der Beschreibung der
Nullmutation durch Takahashi et al. (1994) wurden daher Versuche unternommen diese
mit verschiedenen neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen in Verbindung zu
bringen. Die CNTF-Nullmutation gilt bei Menschen für die SMA als nicht kausal
(Takahashi et al., 1994). Allerdings gibt es Hinweise für einen Einfluss von CNTF auf
den klinischen Verlauf der SMA-Erkrankung durch seine Funktion als Reparatur-
Faktor. Wobbler- und pmn-Mäuse gelten als ein Modell für eine milde SMA. Sie sind
gekennzeichnet durch den Verlust von Motoneuronen und Axon-Degeneration. In
früheren Studien führte die exogene CNTF-Zufuhr bei diesen Mäusen zum Erhalt der
Motoneurone und Axone. Sie wiesen ebenfalls eine erhöhte Lebenserwartung auf
(Mitsumoto et al., 1994; Sendtner et al., 1992).
Simon et al. (2010) nutzten hingegen Smn+/--Mäuse, ein Mausmodell für SMA 3 und
SMA 4. Trotz einem Verlust von bis zu 40 % der Motoneurone nach 12 Monaten
zeigten diese Mäuse phänotypisch keine Auffälligkeiten. Die Muskelkraft war nicht
reduziert. Als kompensatorischer Mechanismus konnte die Vergrößerung der
motorischen Einheit identifiziert werden. Die Re-Innervation von postnatal denervierten
Muskeln erfolgte durch Aussprossen terminaler Axone. Dieser Mechanismus korrelierte
explizit mit dem CNTF-Genotyp der Mäuse. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde das
CNTF-Protein als das kompensierende Agens benannt.
Die Arbeitsgruppe stellte weiterhin die These auf, dass dieser kompensatorische
Mechanismus in Mäusen nur bei langsam progredienten Formen mit spätem
Erkrankungsbeginn greifen könne. Die akuten SMA-Formen zeigten direkt postnatal
einen rapiden Krankheitsprogress, der sich noch vor dem Einsetzen der CNTF-
Expression ereignete. Es wurde daher angenommen, dass CNTF bei diesen SMA-
Formen keinen Einfluss ausüben würde.
1.5 Einleitung
9
1.5 Fragestellung dieser Studie
Die SMA ist eine intensiv beforschte genetische Erkrankung. Dennoch sind noch keine
ausreichenden Erklärungen für die Variabilität der klinischen Ausprägung vorhanden.
Als wichtigster Einflussfaktor gilt die Anzahl der SMN1-Kopien. Die Erkenntnisse aus
dem Mausmodell von Simon et al. (2010) stellen einen weiteren wichtigen Schritt auf
dem Weg zum Verständnis der SMA dar. Es wurde nachgewiesen, dass die Muskelkraft
erhalten bleibt, wenn denervierte Muskeln durch Nachbarneurone reinnerviert werden.
In dem oben beschriebenen Mausmodell geschah dies abhängig vom CNTF-Genotyp.
Es stellt sich daher die Frage, ob sich die Ergebnisse dieser Studie auch in einem
Kollektiv humaner SMA-Patienten reproduzieren lassen.
Dazu wurden in dieser Arbeit 276 Patienten mit molekulargenetisch gesicherter SMA-
Diagnose untersucht. Bei allen Patienten wurden diverse klinische Parameter wie
beispielsweise Erkrankungsbeginn, motorische Entwicklung, Kraft in den Extremitäten
und die Überlebensdauer bestimmt. Die Zahl der SMN2-Kopien wurde mittels MLPA
ermittelt. Zur Bestimmung des CNTF-Genotyps wurde das Pyrosequencing-Verfahren
verwendet. Anschließend erfolgte die statistische Analyse eines potentiellen Einflusses
des CNTF-Genotyps auf den Krankheitsverlauf der einzelnen SMA-Typen 1-3.
Nach bisherigen Erkenntnissen aus den Mausmodellen wäre bei heterozygotem oder
homozygot mutiertem CNTF-Genstatus ein klinisch rascher und ausgeprägter
Krankheitsverlauf zu erwarten. Ob es darüber hinaus Unterschiede bezüglich des
Einflusses von CNTF zwischen den einzelnen SMA-Typen gibt, ist bislang unklar.
Auf die Untersuchung eines Vergleichskollektivs wurde verzichtet, da hier kein
kausaler Zusammenhang dargestellt werden soll und auch keine Abweichung in der
Inzidenz des SNPs zu erwarten war.
Könnte CNTF als Modifikator der chronischen SMA identifiziert werden, würden sich
neue Perspektiven für die weitere SMA-Forschung eröffnen. So könnte zukünftig der
CNTF-Genotyp in die Diagnostik und Prognosestellung einbezogen werden. Auch eine
Analyse der Potenz als therapeutisches Agens würde in den Fokus rücken.
2.1 Material und Methoden
10
2 Material und Methoden
2.1 Patientenkollektiv und klinische Daten
In die Studie wurden die am Institut für Humangenetik des Universitätsklinikums
Aachen im Zeitraum 1999 bis 2009 diagnostizierten SMA-Patienten eingeschlossen,
welche einen Verlust des SMN1-Gens aufwiesen. Dieser kann durch eine homozygote
Deletion oder eine Konversion des SMN1-Gens bedingt sein. Die molekulargenetische
Diagnose erfolgte durch SMN1-Homozygotie-Nachweis mittels der
Restriktionsendonukleasen Hinfl und DdeI (van der Steege et al., 1995) oder durch
Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (s. Kapitel 2.2). Die für die
Diagnostik notwendige DNA wurde bei Einsendung aus Frischblutproben mittels
Aussalzverfahren isoliert. Bei Proben <1 ml erfolgte die Isolation mittels des QIAamp
DNA Minikits (Quiagen) nach den Anweisungen des Herstellers.
Zur Erhebung der klinischen Daten wurden Befundberichte ausgewertet und
anonymisiert in eine Datenbank übertragen. Die erhobenen Daten umfassten u.a. den
Zeitpunkt des Erkrankungsbeginns, des Versterbens, des Erlernen motorischer
Meilensteine und dessen Verlust. Außerdem wurden typspezifische Befunde erfasst, wie
beispielsweise der Reflexstatus, Muskeltonus und Zustand des respiratorischen
Systems. Eine Einteilung in die in der Einleitung genannten drei Klassen SMA 1 - 3
erfolgte ebenfalls anhand der klinischen Befunde.
2.2 Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (M LPA)
Der quantitative Nachweis der SMN-Genkopien-Zahl ist wichtig, da die SMN-
Kopienzahl ein nachgewiesener Einflussfaktor auf den Verlauf der Erkrankung ist.
Dazu wurde die MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) verwendet
(Schouten et al., 2002). Das Verfahren basiert auf einer Multiplex-PCR, bei der 38
Gensequenzen auf 5q12.2-q13.3 in einem Ansatz untersucht werden können (Abbildung
2). Dabei wird nicht die DNA amplifiziert, sondern sequenz-spezifische MLPA-Sonden.
Im Gegensatz zu Standard-Multiplex-PCR wird hier nur ein Primer-Paar benötigt. Die
amplifizierten Produkte variieren in ihrer Länge zwischen 130 und 490 bp Länge und
werden mittels Kapillarelektrophorese aufgetrennt und quantifiziert.
2.2 Material und Methoden
11
Abbildung 2: Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) Die MLPA dient dem quantitativen Nachweis von SMN 1 und SMN 2-Kopien. Dazu wird die DNA denaturiert. Anschließend erfolgt die Hybridisierung sequenzspezifischer Sondenpaare an benachbarte Zielsequenzen. Diese Sonden bestehen aus den Primer-Bindungsstellen A und B, der Hybridisierungssequenz und einem Zwischenstück mit Sonden-spezifischer Länge. Im zweiten Schritt erfolgt die Ligation des Sondenpaares durch die thermostabile Ligase. Die Ligationsprodukte werden in der nachfolgenden PCR amplifiziert. Dazu genügt ein einzelnes Primerpaar, da alle Ligationsprodukte die Primerbindungsstellen A und B aufweisen. Die so gewonnen PCR-Produkte weisen alle eine spezifische Länge von 130 bis 490 bp auf. Dadurch wird eine Auftrennung mittels Kapillarelektrophorese ermöglicht. Die Menge der PCR-Produkte einer bestimmten Länge entspricht der Kopienzahl der Zielsequenz. Die quantitative Analyse erfolgt durch den Vergleich mit Kontroll-DNA-Proben unter Z uhilfenahme des MLPA analysis spreadsheet (MRC Holland).
Das Verfahren kann in fünf Schritte unterteilt werden: 1. DNA-Denaturierung und
Sonden-Hybridisierung, 2. Ligation, 3. PCR, 4. Kapillarelektrophorese und
5. Auswertung. Im ersten Schritt wurden 100 ng DNA in 5µl Aqua dest. gelöst und in
0,5 ml Safelock Tubes vorgelegt. Die Denaturierung erfolgte im Thermocycler bei 98°C
für 5 Minuten. Sobald der Thermocycler anschließend auf 25°C runtergekühlt war,
konnte in jedes Tube 1,5 µl Salsa-Proben-Mix und 1,5µl MLPA-Puffer zugegeben
werden. Anschließend wurden die Proben erneut für 1 Minute bei 95°C und dann für
weitere 16 - 24 Stunden bei 60°C inkubiert. In dieser Zeit erfolgte die Hybridisierung
sequenzspezifischer Sonden an die DNA. Diese Oligonukleotide bestehen aus einer
DNA-Bindungsstelle, einer Primer-Bindungsstelle und einem Zwischenstück von
variabler Länge. Je zwei Oligonukleotide binden dabei an benachbarte Abschnitte der
Zielsequenz. Auf die Hybridisierung folgte die Ligation. In diesem Schritt wurden die
beiden Oligonukleotide zu einem Strang verknüpft. Dazu wurde ein Ligations-Mix aus
2.2 Material und Methoden
12
3µl Ligase A-Puffer, 3µl Ligase B-Puffer, 25 µl Aqua dest. und 1 µl Ligase auf Eis
pipettiert. Der Thermocycler wurde auf 54°C runtergekühlt und in jedes Tube je 32 µl
Ligase-Mix pipettiert. Nach dem Pipettiervorgang wurden die Proben noch 15 Minuten
bei 54°C und dann 5 Minuten bei 98°C inkubiert. Die anschließende PCR diente der
Amplifikation der verbundenen Sonden. Dazu wurden in einem PCR-Tube auf Eis 5 µl
Ligationsprodukt, 2 µl Salsa-PCR-Puffer und 13µl Aqua dest. vorgelegt. Die PCR-
Tubes wurden in einen auf 60°C vorgeheizten Thermocycler gestellt. Dann wurden
unmittelbar ein Polymerase-Mix aus 1 µl Salsa-PCR-Primer, 1µl Salsa-Dilution-Buffer,
0,25 µl Salsa-Polymerase und 2,75 µl Aqua dest. zugegeben und eine Hotstart-PCR
nach folgendem Protokoll durchgeführt:
33 Zyklen
Anschließend erfolgte eine Kontrolle der amplifizierten Produkte auf einem mit
Ethidiumbromid versetzten 1%-Agarose-Gel (3,5 g Agarose, 350 ml TBE, 70 µl
Ethidiumbromid) hinsichtlich Ausbeute und Spezifität. Dazu wurden 10 µl Produkt mit
10 µl Blaupuffer versetzt und für mindestens 30 Minuten bei 140 Volt aufgetrennt. Das
Ergebnis wurde anschließend auf einem Bild mit dem Imager dokumentiert. Zur
Längendifferenzierung diente eine 100-bp-Leiter. Die Analyse erfolgte dann durch
Kapillarelektrophorese mittels AB 3130. Dazu wurden 1 µl PCR-Produkt, 8,5 µl
Formamid und 0,5µl LIZ-Size-Standard vorgelegt. Die Auswertung erfolgte mittels
MLPA analysis spreadsheet.
Denaturierung 95°C 30 sec Hybridisierung 60°C 30 sec Elongation 72°C 1 min Elongation 72°C 20 min 15°C unendlich
2.3 Material und Methoden
13
2.3 CNTF-Mutationsanalyse mittels HAE III-Restriktionsv erdau
Ein Polymorphismus des CNTF-Gens wurde von Takahashi et al. (1994) beschrieben.
Diese Punktmutation im ersten Intron des CNTF-Gens verändert eine potentielle
Schnittstelle für das Restriktionsenzym HAE III (Abbildung 3).
Erkennungssequenz von HAE III Veränderte Sequenz nach Punktmutation 5'-GGCC-3' 5'-AGCC-3'
Abbildung 3: Erkennungssequenz von HAE III Durch die Punktmutation (rot markiert) wird die Erk ennungssequenz für HAE III im CNTF-Gen verändert.
Zur Charakterisierung des CNTF-Genotyps ist es daher möglich eine entsprechende
Restriktionsanalyse durchzuführen. Dazu wurde der unten stehende Genabschnitt
mittels PCR amplifiziert (Abbildung 4). Der F-Primer bindet an das Intron von
1067 – 1090. Der R-Primer (5´-CAGGTTGATGTTCTTGTTCATGCCC-3´) bindet an
das zweite Exon, wobei hier Guanin gegen Thymidin getauscht wurde, um die dort
vorhandene HAE III-Erkennungssequenz zu entfernen. Der so amplifizierte Abschnitt
(134 bp) wird durch HAE III in 2 Fragmente mit der Länge 94 bp und 40 bp verdaut.
Liegt die Punktmutation vor, bleibt das PCR-Produkt intakt.
3´-GCCAGAGAGATGAGTGAGATTTTG TATGAAATTTAGGGGTGAT TTAAGGACACTGGGGTGATGACAGAAGATGTGGTGTTTTCCTGTATCCTCA/GGCCAGGTGAAGCATCA GGGCCTGAACAAGAACATCAACCTG- 5
Abbildung 4: Per PCR amplifizierter CNTF-Gen-Abschnitt Dieser DNA-Abschnitt des CNTF-Gens wird zum Restriktionsverdau amplifiziert. Die Primerbindungsstellen sind orange markiert. Die HAE III-Erkennungssequenzen sind unterstrichen. Im Bereich des R-Primers wurde Guanin gegen Thymidin getauscht (rot), um die zusätzliche HAE III-Schnittstelle zu entfernen. Die von Takahashi et al. (1994) beschriebene Punktmutation ist grün markiert. Sie führt ebenfall s zum Verlust der Schnittstelle.
2.3.1 PCR
Ein PCR-Mix von 25 µl pro Probe umfasste folgende Reagenzien:
DNA (20 ng/µl) je nach Konzentration der Probe dNTP-Mix 4 µl 10xPCR-Puffer 2,5 µl MgCl2 (50µM) 0,75 µl Taq (Invitrogen, 5U/µl) 0,2 µl CNTF-Primer-F (10µM) 1 µl CNTF-Primer-R (10 µM) 1 µl Aqua dest. ad 25 µl
2.3 Material und Methoden
14
Für jeden Versuchs-Ansatz wurde immer auch ein Mix mit Aqua dest. anstelle von
DNA angesetzt, der als Kontaminationskontrolle dient. Die PCR-Tubes wurden in den
Thermocycler eingestellt und die DNA nach folgendem Protokoll amplifiziert:
35 Zyklen
Anschließend erfolgt eine Kontrolle der amplifizierten Produkte auf ihre Ausbeute und
Spezifität auf einem mit Ethidiumbromid versetzten 1%-Agarose-Gel. Dazu werden
5 µl Produkt mit 5µl Blaupuffer versetzt und für 30-40 Minuten bei 160 V aufgetrennt.
Das Ergebnis wird anschließend auf einem Bild mit dem Imager dokumentiert. Zur
Längendifferenzierung dient eine 100-bp-Leiter. Zeigte sich hier eine Kontamination in
der Kontrolle oder eine geringe Ausbeute, wurde das PCR-Produkt verworfen.
Da die Auswertung des anschließenden Verdaus nicht eindeutig möglich war, wurde
auch eine PCR mit Quiagen-Taq durchgeführt:
DNA (20 ng/µl) je nach Konzentration der Probe dNTP-Mix 4 µl 10xPCR-Puffer 2,5 µl Q-Solution (5U/µl) 5,0 µl Taq (Quiagen, 5U/µl) 0,125 µl Primer-F (10µM) 1 µl Primer-R (10 µM) 1 µl Aqua dest. ad 25 µl
Die Hybridisierungs-Temperatur beträgt 61°C. Ansonsten gilt das oben genannte PCR-
Protokoll. Hierbei wurde ebenfalls eine Kontaminationskontrolle durchgeführt und das
Produkt anschließend gelelektrophoretisch aufgetrennt. Die Ausbeute der PCR-
Produkte erwies sich hier als höher. Allerdings ließ sich die Aussagekraft des Verdaus
trotzdem nicht verbessern.
Daher wurden einzelne PCR-Produkte vor dem Verdau mittels QIAquick Gel
Extraction Kit (Quiagen) aufgereinigt. Dieses Verfahren ermöglicht es das amplifizierte
PCR-Produkt von den Reagenzien im PCR-Ansatz zu trennen. Hierfür wurde das DNA-
Fragment aus dem 1%-Agarose-Gel ausgeschnitten. Das Gel-Stück wird dann in einem
Eppendorfgefäß in einer gewichtsadaptierten Menge QG-Puffer
94°C 5 min Denaturierung 94°C 30 sec Hybridisierung 59°C 1 min Elongation 72°C 1,5 min Elongation 72°C 10 min 15°C Unendlich
2.3 Material und Methoden
15
bei 50°C ca. 10 Minuten inkubiert und gelöst. Der Puffer enthält einen pH-Indikator,
der im optimalen Bereich für die DNA-Adsorption (pH</= 7,5) gelb ist. Anschließend
wird volumen-adaptiert Isopropanol zum Mix hinzugegeben. Im nächsten Schritt wird
der Mix in eine Säule mit einer Membran überführt. Diese Membran bindet die DNA.
Alle anderen Verunreinigungen werden mit 0,75 ml PE-Puffer ausgewaschen und
abzentrifugiert. Die vollständig aufgereinigte DNA wird schließlich in 50 µl Wasser
oder EB-Puffer, welcher basisch ist und eine geringe Salzkonzentration aufweist, gelöst.
Die DNA-Konzentration der Lösung kann photometrisch bestimmt werden.
Auch die Aufreinigung des PCR-Produkts brachte keine Verbesserung der Ergebnisse.
2.3.2 HAE III-Restriktionsverdau
Die für die Mutationsanalyse amplifizierten PCR-Produkte weisen eine Länge von 134
Basenpaaren auf. Das Restriktionsenzym HAE III schneidet DNA an Stellen mit der
Sequenz CCGG zwischen der zweiten und dritten Base. Nach erfolgreichem Verdau
sind zwei Fragmente von 94 und 40 Basenpaaren nachweisbar. Dies entspricht dem
Wildtyp. Den homozygot mutierten Patienten fehlt die Schnittstelle. Somit findet kein
Verdau statt (Abbildung 5).
Abbildung 5: Restriktionsverdau durch HAE III Das PCR-Produkt ist 134 bp lang. Durch HAE III wird es in 2 Fragmente mit der Länge 94 bp und 40 bp verdaut. Eine einzelne Bande bei 134 bp zeigt ein unverdautes PCR-Produkt und weist somit die homozygote Mutation nach. Links ist eine Fotodokumentation der Gelelektrophorese zu sehen. Rechts ist das gleiche Bild als Schema dargestellt.
2.4 Material und Methoden
16
Zum Verdau wurden 10µl PCR-Produkt, 0,5µl HAE III und 1,5µl Puffer 4 in einem
Eppendorfgefäß vorgelegt. Dieses wurde dann für 3 Stunden in einem Wasserbad bei
37°C inkubiert. Der gesamte Mix wurde anschließend mit 5 µl Blaupuffer versehen,
neben einer 100-bp-Leiter und einem unverdauten PCR-Produkt als Kontrolle auf ein
mit Ethidiumbromid versetztes 3%-Agarose-Gel (9 g Agarose, 300 ml TBE, 60 µl
Ethidiumbromid) aufgetragen und bei 120 V mindestens 60 Minuten elektrophoretisch
aufgetrennt. Das Ergebnis wurde mit dem Imager (Gel Doc 2000, Bio-Rad
Laboratories) dokumentiert. Die Auswertung erwies sich jedoch aufgrund einer
geringen Signalstärke als nicht eindeutig. Daher wurde das Gesamtvolumen des
Verdau-Mixes und die relative Enzymmenge erhöht, sodass jeder Ansatz 15µl PCR-
Produkt, 1,5µl HAE III und 4,5µl Puffer 4 enthält. Diese Veränderung führte allerdings
nicht zu einer verbesserten Auswertbarkeit.
2.4 CNTF-Mutationsanalyse mittels Sequenzierung nach Sanger
Zur Evaluierung der Aussagekraft des Restriktionsverdaus wurde eine Direkt-
Sequenzierung von PCR-Produkten zum direkten Mutationsnachweis durchgeführt.
Hierzu wurde eine PCR mit Quiagen-Taq zur Amplifikation des in Abschnitt 2.3
beschriebenen Genabschnitts nach in Abschnitt 2.3.1 dargestellten Protokoll
durchgeführt. Die Kontrolle der amplifizierten Produkte auf ihre Ausbeute und
Spezifität erfolgte auf einem mit Ethidiumbromid versetzten 1%-Agarose-Gel. Das
PCR-Produkt wurde mittels ExoSAP aufgereinigt. Es handelt sich hierbei um einen
enzymatischen Verdau überschüssiger Nukleotide und Primer. Dafür wurden 5 µl des
PCR-Produkts mit 2 µl ExoSAP in einem PCR-Tube vorgelegt. Die Tubes wurden in
einen Thermocycler eingestellt. Zunächst entfernt die Exonuklease bei einer Temperatur
von 37°C für 15 Minuten die überschüssigen Primer und dNTPs. Anschließend
eliminiert die SAP (Schrimp Akaline Phosphatase) bei einer Temperatur von 80°C für
15 Minuten die Exonuklease. Je 7 µl des so gereinigten Produkts wurden in einer
Sequenzier-PCR mit 1 µl CNTF-Primer F oder R und 1,5 µl Sequenzier-Mix angesetzt
und im Thermocycler mittels folgendem Protokoll erneut amplifiziert:
24 Zyklen
96°C 1 min Denaturierung 96°C 10s Hybridisierung 50°C 5s Elongation 60°C 4 min
2.4 Material und Methoden
17
Anschließend erfolgte die Fällung und Reinigung des Sequenzier-PCR-Produkts mittels
Ethanol-Präzipitation. Hierzu wurden 10 µl Sequenzier-PCR-Produkt in einem
Eppendorfgefäß mit 100 µl Natronlauge (90 µl Aqua dest. +10 µl Natriumacetat,
pH4.6-5.2, 3M) und 250 µl Ethanol absolut versetzt und 30 Minuten bei 13.000 rpm
zentrifugiert. Nach Entfernen des Überstandes wurden 250 µl Ethanol 70% zugegeben
und erneut 10 Minuten bei 13.000 rpm zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand
erneut abgesaugt und das Pellet getrocknet. Das Pellet wird dann in 20 µl Formamid
gelöst.
Die Sequenzierung erfolgte mittles der Didesoxy-Methode nach Sanger et al (1977),
auch Kettenabbruchsynthese genannt (Abbildung 6). Ausgehend vom R- oder F-Primer
wurde in der Sequenzier-PCR der komplementäre DNA-Strang mittels DNA-
Polymerase verlängert.
Abbildung 6: Sequenzierung per Kettenabbruchsynthese nach Sanger et al. (1977) In der der Sequenzierung vorausgehenden Sequenzierungs-PCR werden neben dNTPs auch Fluoreszenzfarbstoff-markierte ddNTPs eingebaut. Der Einbau verursacht den Abbruch der Strangsynthese. Es sind so verschieden lange PCR-Produkte erhältlich. Diese werden per Kapillarelektrophorese aufgetrennt und durch einen Laser zur Fluoreszenz angeregt. Da jedes der
2.4 Material und Methoden
18
4 Nukleotide mit einem bestimmten Farbstoff markiert ist, ergibt sich aus der Abfolge der Farbsignale im Elektropherogramm die Abfolge der Basen.
Hierfür standen im Mix die herkömmlichen Desoxyribonukleotide (dNTPs) und
2´,3´-Didesoxyanaloga dieser dNTPs zur Verfügung (Abbildung 7).
Abbildung 7: dNTP und ddNTP Didesoxyribonukleotiden (ddNTPs) fehlen im Gegensatz zu Desoxyribonukleotiden (dNTPs) die 3`-Hydroxy-Gruppe. Daher kommt es durch ihren Einbau während der PCR zum Abbruch der Strangsynthese. Dies ist essentiell für die DNA-Sequenzierung nach Sanger et al. (1977).
Der Anbau dieser ddNTPs führte zu einem Abbruch der Strangsynthese nach einer
zufälligen Länge, da ihnen die 3`-Hydroxy-Gruppe fehlte. Die unterschiedlich langen
Kettenabbruchfragmente wurden durch Kapillarelektrophorese im AB 3130 aufgetrennt
und die ddNTPs durch einen Laser zu verschieden farbiger Fluoreszenz angeregt. Somit
entstand aus der Abfolge der Farbsignale ein Elektropherogramm, welches die DNA-
Sequenz wiedergibt. Die Analyse der Sequenz erfolgte mit dem Programm Sequencing
Analysis 5.2.
2.5 Material und Methoden
19
2.5 CNTF-Mutationsanalyse mittels Pyrosequencing
Die Pyrosequenzierung ist ein quantitatives Verfahren zur Sequenzierung kurzer DNA-
Abschnitte, z.B. der Detektion von SNPs (Ronaghi et al., 1996). Die Methode zeigte
zufriedenstellend zuverlässige Ergebnisse für die CNTF-Mutationsanalyse. Daher
wurde bei allen Patienten dieses Verfahren angewendet.
Hierzu wurde zunächst eine DNA-Amplifikation mittels PCR durchgeführt. Das
Produkt musste nicht weiter aufgereinigt werden. Einer der beiden Primer, in unserem
Fall der R-Primer, war am 5´-Ende biotinyliert. Das biotinylierte PCR-Produkt wurde
dann an mit Streptavidin überzogenen Perlen immobilisiert. In dem folgenden
Waschschritt mit Natronlauge wurde der nicht-biotinylierte Strang abgetrennt. Die
biotinylierte ssDNA blieb weiter an die Perlen gebunden und wurde so in eine
Hybridisierungs-Pufferlösung überführt. In dieser Lösung wurde der Sequenzier-Primer
an die ssDNA hybridisiert. Primer und ssDNA wurden dann mit den Enzymen DNA-
Polymerase, ATP-Sulfurylase, Luziferase und den Substraten Adenosin-5’-
Phosphosulphat und Luziferin inkubiert. Ausgehend vom Primer erfolgte schrittweise
die Strangverlängerung durch gezielte Zugabe von einzelnen komplementären
Desoxyribonukleosidtriphosphaten (dNTPs). Anstelle von Desoxyadenosintriphosphat
(dATP) wurde dabei Desoxyadenosin-alpha-thio-triphosphat (dATP·S) benutzt. Es wird
zwar durch die DNA-Polymerase wie das Original-dNTP eingebaut, wird allerdings
durch die Luziferase nicht erkannt. Wurde ein dNTP durch die DNA-Polymerase
eingebaut, wurde Pyrophosphat (PPi) freigesetzt. PPi wurde dann durch die ATP-
Sulfurylase zu Adenosintriphosphat (ATP) umgesetzt. Dieses ATP lieferte der
Luziferase die Energie das Luziferin zu Oxyluziferin umzusetzen. Hierbei wurde ein
Signal frei, welches mit einer Kamera detektiert wird und als Peak im Pyrogramm zur
Darstellung kam. Die Menge der eingebauten Nukleosidtriphosphate entsprach dabei
proportional der Stärke des Signals und kam in entsprechender Peakhöhe zur
Darstellung.
Abschließend wurde das Enzym Apyrase hinzugegeben, welches nicht eingebaute
Nukleosidtriphosphate und ATP degradierte. Danach wurde der Vorgang für die
weiteren Basen wiederholt. Das Pyrosequencing-Verfahren stellt somit eine schrittweise
Beobachtung der Strangsynthese dar. Eine schematische Darstellung zeigt Abbildung 8.
2.5 Material und Methoden
20
Abbildung 8: CNTF-Mutationsanalyse mittels Pyrosequenzierung 1. Im ersten Schritt wird eine Amplifikation der DNA mittels PCR durchgeführt. Hier ist der R-Primer am 5´-Ende biotinyliert. 2. Die PCR-Produkte werden anschließend über das Biotin an Streptavidin-Perlen gebunden. Die so immobilisierten DNA-Stränge werden in Ethanol gewaschen, mit Natronlauge denaturiert und nochmals mit Waschpuffer gereinigt. Anschließend erfolgt die Hybridisierung des Sequenzier-Primers an die Einzelstrang-DNA. 3. Die Pyrosequenzierungsreaktion stellt die Beobachtung der Strangsynthese in Echtzeit dar. Der Einbau jedes Nukleotids wird über eine chemische Reaktionskaskade einzeln detektiert. Initial wird beim Einbau eines dNTPs durch die DNA-Polymerase Pyrophosphat freigesetzt. Dieses wird durch die Sulfurylase zusammen mit Adenosin-5’-Phosphosulphat zu ATP umgesetzt. Das ATP wiederum liefert der Luziferase die nötige Energie zur Oxidation von Luziferin. 4. Das dabei entstehende Lichtsignal wird detektiert und proportional in einem Pyrogramm dargestellt. Folgen zwei gleiche dNTPs aufeinander, werden sie nicht als Einzelpeaks dargestellt, sondern als ein Peak doppelter Höhe. Am Ende jedes Reaktionszyklus beseitigt das Enzym Apyrase die überschüssigen dNTPs und ATP.
2.5 Material und Methoden
21
2.5.1 Pyro-Primersynthese
Das Design der 3 benötigten Primer erfolgte nach den normalen Standards (Tabelle 4).
Ein Primer war allerdings biotinyliert und per HPLC aufgereinigt, da freies Biotin um
die Bindung an die Perlen konkurriert hätte. Der Sequenzier-Primer sollte nur 1-5 bp
vom SNP entfernt liegen. Das aus der PCR resultierende Produkt sollte so kurz wie
möglich sein, da dies die Ergebnisqualität verbessert. Die Firma Biotage bot für ein
optimales Design eine SNP-Primer-Design-Software an.
Tabelle 4: Für die Pyrosequenzierung verwendete Primer
Primer Sequenz (5´->3´) Modifikation
R (reverse) CCATCCGCAGAGTCCAGGTTGA biotinyliert HPLC-Reinigung
F (forward) ACTGGGGTGATGACAGAAGATGTGGT keine
S (synthesis) TGTGGTGTTTTCCTGTA keine
2.5.2 PCR und Pyrosequencing
Im ersten Schritt wurde eine PCR nach unten stehendem Protokoll durchgeführt:
DNA (20 ng/µl) je nach Konzentration der Probe dNTP-Mix 4 µl 10xPCR-Puffer 2,5 µl MgCl2 (50µM) 0,75 µl Taq (Invitrogen, 5U/µl) 0,2 µl Pyro-Primer-F (10µM) 1 µl Pyro-Primer-R (10 µM) 1 µl Aqua dest. ad 25 µl
32 Zyklen
Nach der Amplifikation wurden 5µl PCR-Produkt und 5 µl Blaupuffer auf ein 1%-
Agarose-Gel aufgetragen. Die Ausbeute und Spezifität wurden mit dem Imager
dokumentiert.
Für die Pyrosequenzierung wird dann die Vakuumarbeitsstation vorbereitet. Die Tröge
94°C 5 min Denaturierung 94°C 30 sec Hybridisierung 64,5°C 1 min Elongation 72°C 1,5 min 72°C 10 min 15°C unendlich
2.5 Material und Methoden
22
wurden mit Ethanol (70%), Denaturierungs-Lösung, Wasch-Puffer und hochreinem
Wasser befüllt. In einer 96-Loch-Platte wurden je Loch 0,4 µM Sequenzier-Primer und
40 µl Hybridisierungs-Puffer vorgelegt.
In einer zweiten 96-Loch-PCR-Platte wurden dann pro Probe 3 µl Streptavidin-
Sepharose-Perlen, 37µl Bindungs-Puffer, 20 µl PCR-Produkt und 20 µl Hochreines
Wasser vorgelegt. Diese Platte wurde 5 Minuten bei Raumtemperatur auf einer
Rüttelplatte inkubiert, der die Mischung in Bewegung hält, sodass die Perlen sich nicht
auf dem Boden absetzen. In dieser Zeit findet die immobilisierende Bindung der PCR-
Produkte an die Perlen statt.
Im Anschluss an die Immobilisation findet die DNA-Strang-Separierung statt. Dazu
wurde die Vakuumpumpe eingeschaltet. Dann wurde das Vacuum-prep-tool zunächst
20 Sekunden in den Trog mit Wasser eingestellt und gewaschen. Anschließend wurde
das Vacuum-prep-tool in die 96-Loch-PCR-Platte eingestellt und die Perlen so an die
Filter im Gerät gesaugt. Die aspirierte Flüssigkeit wurde abgeleitet und verworfen. Zur
Strang-Separation wurde das Vacuum-prep-tool dann je 5 Sekunden in den Trog mit
Ethanol, Denaturierungs-Lösung und Wasch-Puffer überführt. Dann wurde die
Vakuumpumpe abgeschaltet. Das Vacuum-prep-tool wurde dann in die zweite Platte
eingestellt und leicht gerüttelt, sodass die Perlen sich im Hybridisierungs-Puffer vom
Filter ablösten. Die Platte wurde dann auf einer Heizplatte bei 80°C für 2 Minuten
inkubiert. In dieser Zeit fand die Hybridisierung des Sequenzier-Primers statt.
Anschließend wurde die Platte auf Raumtemperatur abgekühlt. In dieser Zeit wurde das
Vacuum-prep-tool nochmal mit dem im letzten Trog verbliebenen Wasser gewaschen.
Außerdem wurde die Reagenzien-Kartusche mit Enzymmix (Luziferase, DNA-
Polymerase, Apyrase und Sulfurylase), Substratmix (Luziferin und APS) und den
dNTPs gefüllt und mit der dann abgekühlten Platte in das PyroMark Q96 ID-Gerät
eingestellt. In der PSQ 96-Software wurde die zu analysierende Sequenz ausgewählt.
Das Gerät analysiert parallel bis zu 96 Proben durch das in Abschnitt 2.5 beschriebene
Verfahren. Die Auswertung erfolgte automatisch anhand der relativen Peak-Höhen und
manuell anhand des Pyrogramms.
2.6 Material und Methoden
23
2.6 Statistik
Die klinischen Daten wurden in einer Microsoft Excel 2007-Datenbank
zusammengetragen. Zur Auswertung wurden die Programme SAS 9.1.3 und R 2.15.1
inklusive „Hardy-Weinberg-Package“ verwendet. Ein Ergebnis galt als signifikant,
sobald p < 0,05 galt.
3.1 Ergebnisse
24
3 Ergebnisse
3.1 Kenngrößen für das Gesamtkollektiv
Das in dieser Studie untersuchte Kollektiv umfasst 276 SMA-Patienten (Tabelle 5). Sie
sind überwiegend europäischer Staatsangehörigkeit (Deutschland, Österreich,
Rumänien, Kroatien). Vereinzelt stammen sie aber auch aus außereuropäischen
Ländern, v.a. dem Nahen Osten. Es befinden sich drei Geschwisterpaare im Kollektiv.
Alle sechs Patienten tragen 2 SMN2-Kopien und sind dem Typ SMA 1 zuzuordnen. 147
der Patienten sind weiblich. 129 der Patienten sind männlich. Alle Patienten weisen
einen molekulargenetisch gesicherten Verlust des SMN1-Gens auf. Dieser resultiert bei
268 Patienten aus einer homozygoten Deletion des SMN1-Gens. Ein kleiner Teil (n =8)
weist eine Genkonversion von SMN1 zu SMN2 auf. Ursache ist die Deletion von Exon
7 des SMN1-Gens. Dessen Exon 8 bleibt erhalten. Es erfolgt mit Exon 1-7 des SMN2-
Gens die Konversion zu einer SMN2-Kopie. Das so entstandene Gen wird Hybridgen
genannt.
Tabelle 5: Darstellung des Gesamtkollektivs mit absoluten Häufigkeiten von SMA-Typ, SMN-Kopienzahl und CNTF-Genotyp
SMA-Typ SMA 1 SMA 2 SMA 3
SMN2-Kopien 1 2 3 4 gesamt 2 3 4 unb. gesamt 2 3 4 5 6 unb. gesamt gesamt
CNTF-Genotyp 1* 1* 4* 4* 5*
AG 4 41 5 2 52 17 2 19 5 12 20 37 108
GG 2 67 13 1 83 2 26 6 34 2 19 19 1 1 42 159
AA 2 2 2 2 0 4
gesamt 6 110 18 3 137 2 45 8 1 56 7 31 39 1 1 4 83 276 (* / unb. = unbekannt)
Das Kollektiv schließt die Typen SMA 1 (n = 137), SMA 2 (n = 56) und SMA 3
(n = 83) ein. Die Kopienzahl variiert insgesamt zwischen 1 und 6 SMN2-Kopien
(Abbildung 9). Beim SMA-Typ 1 weisen 84,7 % der Patienten 1-2 Kopien auf. Beim
SMA-Typ 2 trägt ein Großteil (80,4%) 3 Kopien. Beim SMA-Typ 3 wiederum finden
sich zu 84,3% 3-4 Kopien. Die drei CNTF-Genotypen verteilen sich wie folgt:
Heterozygote (AG) 39,5 %, homozygote Wildtypen (GG) 59 % und homozygot
3.2 Ergebnisse
25
Mutierte (AA) 1,5%. Bei insgesamt 5 Patienten konnte der CNTF-Genotyp nicht
eindeutig bestimmt werden.
Abbildung 9: Anzahl der SMN2-Kopien bei den einzelnen SMA-Typen
3.2 Fallberichte der vier Patienten mit CNTF-Genotyp homozygot mutiert
Aufgrund der geringen Fallzahl für Patienten mit homozygot mutiertem CNTF-Genotyp
wird diese Gruppe hier nochmal gesondert in einzelnen Fallstudien vorgestellt.
Insgesamt befinden sich in unserem Kollektiv vier Patienten mit einem solchen CNTF-
Genotyp. Zwei davon sind SMA 1-Patienten mit 2 SMN2-Kopien. Die anderen zwei
Patienten sind SMA 2-Patienten mit 3 SMN2-Kopien.
Im Vergleich mit dem Gesamtkollektiv fällt ein früher Krankheitsbeginn bei den
homozygot mutierten Patienten auf. Für einen genauen Vergleich wurden zwei
Vergleichsgruppen gebildet, die mit dem SMA-Typ und der SMN-Kopienzahl der vier
Patienten in den Fallberichten übereinstimmen und den CNTF-Genotyp heterozygot
oder homozygot Wildtyp aufweisen. Die Werte der Vergleichsgruppen für die
Parameter Erkrankungsbeginn und Überlebensdauer sind in den Boxplots
(Abbildung 10 – 12) dargestellt.
Der Erkrankungsbeginn in der SMA 2-Vergleichsgruppe liegt im Median bei 58
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
1
2
3
4
5
6
Anzahl Patienten (n)
SM
N2
-Ko
pie
n
SMA 3
SMA 2
SMA 1
3.2 Ergebnisse
26
Wochen (n=43, Range 72 Wochen). Bei Patient 249 wird mit 52 Wochen eine SMA
diagnostiziert. Patientin 254 ist allerdings schon direkt nach der Geburt auffällig.
Dies gilt auch für den Patienten 1132, der bereits nach der Geburt auffällig ist. Die
SMA 1-Vergleichsgruppe erkrankt im Median mit 5 Wochen (n=108,
Range 35,88 Wochen). Patient 1057 liegt mit einem Erkrankungsalter von 5 Wochen
genau auf dem Median (Tabelle 6).
Für die Variable Überlebenszeit lassen sich für die SMA 1-Vergleichsgruppe folgende
Werte ermitteln: Median 4,5 Monate und Range 48,9 Monate. Patient 1057 überlebt 4,9
Monate. Patient 1132 überlebt 5,3 Monate. Sie liegen damit beide über dem medianen
Überlebensalter.
Initial schien bei den homozygot mutierten Patienten im Vergleich mit dem
Gesamtkollektiv ein früher Krankheitsbeginn und eine verringerte Überlebensdauer
vorzuliegen. Zieht man jedoch eine homogenere Vergleichsgruppe mit entsprechendem
SMA-Typ und Anzahl der SMN-Kopien heran, besteht kaum ein Unterschied.
Abschließend lässt sich hier kaum eine Aussage über eine tendenzielle Verbesserung
oder Verschlechterung der klinischen Parameter Erkrankungsbeginn und
Überlebensdauer durch die CNTF-Deletion treffen. Die Fallzahlen sind sehr klein und
zufällige Beobachtungen sind daher nicht auszuschließen.
Tabelle 6: Patienten mit dem CNTF-Genotyp homozygot mutiert und ihre Vergleichsgruppen
Kollektiv Ziel-Variable n Median Range
SMA 1-Vergleichsgruppe Beginn der
Erkrankung in Wochen
108 5 35,88
Patient 1057 1 5 *
Patient 1132 1 0 *
SMA 1-Vergleichsgruppe Überlebens-
dauer in Monaten
108 4,5 48,9
Patient 1057 1 4,9 *
Patient 1132 1 5,3 *
SMA 2-Vergleichsgruppe Beginn der
Erkrankung in Wochen
43 58 72
Patientin 254 1 0 *
Patient 249 1 52 * (* Einzelwert)
3.2 Ergebnisse
27
Abbildung 10: Boxplot Überlebensdauer im Vergleichskollektiv SMA 1 mit 2 SMN2-Kopien Die Box umfasst die Werte zwischen der 25. und 75. Perzentile. Die Linie innerhalb der Box markiert den Median, das + den Mittelwert. Die Fühler enden am kleinsten bzw. größten Wert, der innerhalb des 1,5-fachen Interquartilsabstands über- und unterhalb der Box liegt. Entfernter liegende Ausreißer werden mittels dargestellt. Die roten * markieren die Werte der Patienten aus den Fallberichten.
3.2 Ergebnisse
28
Abbildung 11: Boxplot Erkrankungsbeginn im Vergleichskollektiv SMA 1 mit 2 SMN2-Kopien
Abbildung 12: Boxplot Erkrankungsbeginn im Vergleichskollektiv SMA 2 mit 3 SMN2-Kopien
3.2 Ergebnisse
29
3.2.1 Fallbericht 1: Patient 1057
Der Patient ist klinisch der SMA 1 zuzuordnen. Er verfügt über 2 SMN2-Kopien. Der
Krankheitsbeginn wurde mit 2-3 Monaten angegeben. Die Einsendung zur Diagnostik
erfolgte allerdings bereits mit 5 Wochen. Des Weiteren wurde der Krankheitsverlauf als
fulminant beschrieben. Es wurde von einer rapide progredienten Verschlechterung des
Allgemeinzustands berichtet. Der Junge verstarb mit ca. 5 Monaten aufgrund einer
respiratorischen Insuffizienz.
3.2.2 Fallbericht 2: Patient 1132
Der Patient ist klinisch der SMA 1 zuzuordnen. Er verfügt über 2 SMN2-Kopien. Der
Junge war das jüngste von 4 Geschwistern. Er wurde prophylaktisch in der zweiten
Lebenswoche in einer neuropädiatrischen Ambulanz vorgestellt, da das zweite Kind der
Familie bereits an einer SMA 1-Erkrankung litt. Dieses Geschwister verstarb im Alter
von etwa einem halben Jahr aufgrund einer respiratorischen Insuffizienz. Das vierte
Kind war laut ärztlichem Bericht bis zur U2 unauffällig. Die Eltern berichten jedoch
über seit der Geburt bestehendes schwaches Schreien und auffallend geringe
Bewegungen. Nach postnatal zunächst erfreulicher Entwicklung verschlechterten sich
insbesondere der Ernährungszustand und die Atmung rasch. Der Junge verstarb daher
im 6. Lebensmonat ebenfalls aufgrund einer respiratorischen Insuffizienz.
Die motorischen Meilensteine wie Kopfkontrolle, Drehen des Körpers und Armstütz
wurden nicht erlernt. Rumpf und Extremitäten waren hypoton. Die Muskeleigenreflexe
waren schwach und im Verlauf teilweise fehlend. Weiter fiel ein Faszikulieren der
Zunge auf. Das Trinken war postpartal gut möglich. Nach wenigen Wochen entwickelte
sich jedoch eine Schwäche beim Saugen, sodass ab Ende des zweiten Lebensmonats
eine Freka®-Ernährungssonde angelegt wurde. Auch die Atmung war initial normal. Ab
dem zweiten Lebensmonat wurde sie dann zunehmend stoßend und bauchbetont. Im
vierten Lebensmonat erkrankte der Junge dann an einer Bronchitis. In der folgenden
Zeit war er stets stark verschleimt und zeigte Schwierigkeiten bei der Atmung.
Letztendlich war die zunehmende Ateminsuffizienz im Alter von 6 Monaten letal.
3.2 Ergebnisse
30
3.2.3 Fallbericht 3: Patientin 254
Die Patientin ist klinisch der SMA 2 zuzuordnen. Sie verfügt über 3 SMN2-Kopien. Die
Einsendung zur Diagnostik erfolgte mit 12 Monaten. Seit der Geburt bestand eine
muskuläre Hypotonie. Ferner fiel im Verlauf bei allen U-Vorsorgeuntersuchungen eine
verzögerte motorische Entwicklung auf. Das Drehen des Körpers im Liegen war erst
seit dem 7. Lebensmonat möglich. Die volle Kopfkontrolle erlangte das Mädchen etwa
im Alter von einem dreiviertel Jahr. Der Verlust beider Fähigkeiten wurde mit ca. 1 Jahr
beschrieben. Freies sitzen im Langsitz war ab dem 12. Monat kurzzeitig möglich,
allerdings nur bis zum 2. Lebensjahr. Die aktuellsten klinischen Befunde beziehen sich
auf das 2. Lebensjahr. Zu diesem Zeitpunkt wurde ein Rollstuhl als Hilfsmittel
verwendet. Das Mädchen wies eine ausgedehnte Schaukelatmung auf. Des Weiteren
war ein Faszikulieren der Zunge zu beobachten. Die Kraft war in allen Extremitäten
reduziert, wobei die untere proximale Extremität stärker betroffen war, als die distale
untere oder die obere Extremität. Daraus resultierte eine Froschhaltung. Eine
Sitzkyphose wurde ebenfalls beschrieben. Muskeleigenreflexe waren ubiquitär nicht
auslösbar.
3.2.4 Fallbericht 4: Patient 249
Der Patient ist klinisch der SMA 2 zuzuordnen. Er verfügt über 3 SMN2-Kopien. Der
genaue Krankheitsbeginn ist unbekannt. Die Einsendung zur molekulargenetischen
Diagnostik erfolgte mit 12 Monaten. Die motorischen Meilensteine Kopfkontrolle und
Sitzen wurden altersgerecht erreicht. Sie gingen dann allerdings im Verlauf verloren. So
war die Kopfkontrolle zunächst im Sitzen stabil möglich. Ab dem 3. Lebensjahr war sie
aber kaum noch vorhanden. Freies Sitzen wurde ebenfalls altersgerecht erlernt.
Mit 1 8/12 Jahren war das Sitzen dann nur instabil und mit 3 Jahren nur passiv möglich.
Insgesamt stabilisierte der Junge sich auf dem im 3. Lebensjahr vorhandenen Niveau
der motorischen Fähigkeiten. Der Junge wies seit der Geburt ein schwaches Schreien
und einen schwachen Hustenstoß auf. Ein im 2. Lebensjahr geäußerter Verdacht auf
nächtliche Hypoventilationen bestätigte sich allerdings nicht. Die Kraft war im Rumpf
und allen Extremitäten stark reduziert. Lediglich Hände und Füße konnten aktiv
gehoben werden. Muskeleigenreflexe waren ubiquitär nicht auslösbar. An Hilfsmitteln
erhielt der Junge eine Sitzschale auf fahrbarem Untergestell, zweimal wöchentlich
3.3 Ergebnisse
31
Physiotherapie nach Bobath und Atemtherapie. Die letzten klinischen Angaben
beziehen sich auf das 4. Lebensjahr.
3.3 CNTF-Genotyp-Verteilung im Gesamtkollektiv
In Tabelle 7 ist die Häufigkeitsverteilung der CNTF-Genotypen in den einzelnen SMA-
Gruppen dargestellt. Es fällt eine ungleichmäßige Verteilung des CNTF-Genotyps auf
die einzelnen SMA-Typen auf. In den Typen SMA 1 und SMA 2 macht der Anteil der
homozygoten Wildtypen ca. 61 % aus. Bei den SMA 3-Patienten weisen nur 55,42%
diesen Genotyp auf. Im Gegensatz dazu liegt hier die Anzahl der Heterozygoten mit
44,58 % höher als in den Gruppen SMA 1 (37,96 %) und SMA 2 (35,71%). Insgesamt
scheint mit 39,49 % der Anteil der Heterozygoten am Gesamtkollektiv hoch.
Tabelle 7: CNTF-Genotyp-Verteilung
CNTF-Genotyp AA AG GG Summe
SMA-Typ
SMA 1 total 2 52 83 137
Genotyp-Anteil in %
1,46% 37,96% 60,58% 100%
SMA 2 total 2 20 34 56
Genotyp-Anteil in %
3,57% 35,71% 60,71% 100%
SMA 3 total 0 37 46 83
Genotyp-Anteil in %
0% 44,58% 55,42% 100%
Gesamt- kollektiv
Summe total 4 109 163 276
Genotyp-Anteil in % 1,45% 39,49% 59,06% 100%
Eine ungleichmäßige Verteilung könnte durch eine Assoziation der beiden Merkmale
hervorgerufen werden. Daher wird die Unabhängigkeit der Merkmale CNTF-Genotyp
und SMA-Typ überprüft. Die Untersuchung erfolgt per Fisher´s exact test. Eine
Abhängigkeit zwischen CNTF–Genotyp und SMA-Typ kann nicht nachgewiesen
werden. Mit p = 0,4 wird H1 als nicht signifikant abgelehnt.
3.4 Ergebnisse
32
3.4 Analyse des CNTF-Allels auf Vorliegen des Hardy-Weinberg-Gleichgewichts
Abweichungen von einer zu erwartenden Genotyp-Frequenz lassen sich durch die
Überprüfung des Hardy-Weinberg-Gleichgewichts detektieren. Das Hardy-Weinberg-
Gleichgewicht stellt ein von G. H. Hardy und W. Weinberg entwickeltes
mathematisches Modell dar. Anhand der ihm zugrunde liegenden Formeln
p2 + 2pq + q2 = 1 und p + q = 1
lässt sich die Frequenz eines Allels und die entsprechende Genotypen-Verteilung
errechnen. p steht dabei für die Frequenz des Allels A und q die Frequenz des Allels a.
Die Summe der Frequenzen der drei Genotypen homozygot rezessiv „aa“ bzw.
dominant „AA“ (p2 bzw. q2) und heterozygot „Aa“ (2pq) addiert sich bei vorliegendem
Gleichgewicht zum Wert 1. Eine Abweichung vom Hardy-Weinberg-Gleichgewicht
wird durch den Vergleich von tatsächlichen und erwarteten Häufigkeiten getestet. Dies
wird häufig zur Qualitätskontrolle des Datenmaterials durchgeführt. Die Nullhypothese
H0 lautet, dass keine signifikante Abweichung der tatsächlichen von den erwarteten
Häufigkeiten auftritt. Aufgrund der Gruppengrößen wird hier der Haldane´s exact test
verwendet. Die Ergebnisse werden im deFinetti-Diagramm graphisch dargestellt
(Abbildung 13). Mit p = 0,0023 lässt sich für das Gesamtkollektiv eine signifikante
Abweichung des CNTF-Allels vom Hardy-Weinberg-Gleichgewicht nachweisen.
3.5 Ergebnisse
33
Abbildung 13: de Finetti-Diagramm Auf den Achsen des Dreiecks sind die Genotyp-Häufigkeiten dargestellt. Die grüne Linie markiert mögliche Genotyp-Verteilungen, die im Hardy-Weinberg-Gleichgewicht sind. Der rote Punkt gibt die Verteilung des CNTF-Allels in Gesamtkollektiv an. Die Position ergibt sich aus den Genotyp-Häufigkeiten, die als Länge der Lote des Punkts zu den jeweiligen Seiten des Dreiecks dargestellt werden. Die Länge der Lote, wie auch die Genotyp-Häufigkeiten addieren sich zum Wert 1. Die blaue Linie markiert die Akzeptanz-Region für den Haldane´s exact test bei Signifikanzniveau von α = 0,05. Der Punkt liegt außerhalb der Akzeptanz-Region und zeigt somit, dass die Verteilung des CNTF-Allels nicht im Hardy-Weinberg-Gleichgewicht ist.
3.5 Analyse klinischer Parameter
Ein Schwerpunkt dieser Studie ist die Analyse des Einflusses des CNTF-Genotyps auf
die klinischen Parameter der einzelnen SMA-Typen. Dafür werden explorativ 27
krankheitsspezifische klinische Zielvariablen definiert, erhoben und analysiert. Einzelne
Parameter werden dabei nicht für das gesamte Kollektiv erhoben, da sie Typ-spezifisch
sind. In den Tabellen 8 - 11 sind die Ergebnisse der Analysen zusammengefasst.
3.5 Ergebnisse
34
Angaben zu den Größen der einzelnen Subgruppen in den Analysen, die in
Tabelle 8 – 11 dargestellt sind, finden sich im Anhang.
In der Gruppe der SMA 1-Patienten werden fünf spezifische Parameter analysiert. Die
motorischen Fertigkeiten Armstütz, Kopfkontrolle und Drehen des Körpers werden als
vorhanden gewertet, wenn die Fertigkeit zu irgendeinem Zeitpunkt vorhanden gewesen
ist. Ein verspätetes Erlernen oder ein späteres Verlernen wird dabei nicht negativ
berücksichtigt. Wird die Fertigkeit nie erlernt, wird sie als nicht vorhanden gewertet.
Die Zielvariable Ernährungszustand wird als normal oder reduziert definiert über den
Vergleich des Zustands des Patienten mit den Normwerten der Altersgruppe.
Eine Trinkschwäche ist gegeben, wenn der Patient aufgrund muskulärer Erschöpfung
Auffälligkeiten im Trinkverhalten zeigt.
Bei den folgenden vier Parametern erfolgt die Auswertung mittels Fisher´s exact test:
Armstütz (n = 67, p = 1,0), Körper drehen (n = 67, p = 1,0), Trinkschwäche
(n = 68, p = 0,90) und Ernährungszustand (n = 81, p = 0,80). Die Analyse des
Parameters Kopfkontrolle erfolgt mittels Kruskal-Wallis-Test (n = 80, p = 0,71).
Tabelle 8: Klinische Parameter in der Gruppe SMA 1
Parameter Ausprägung n Tafel Test p-Wert Armstütz möglich / nicht 67 3x2 Fisher´s Exact Test 1,00 Kopfkontrolle möglich / nicht 80 3x3 Kruskal-Wallis-Test 0,71 Drehen des Körpers möglich / nicht 67 3x2 Fisher´s Exact Test 1,00 Ernährungszustand normal / reduziert 81 3x2 Fisher´s Exact Test 0,80 Trinkschwäche vorhanden / keine 68 3x2 Fisher´s Exact Test 0,90
In der Gruppe der SMA 2-Patienten werden drei spezifische Parameter analysiert
(Tabelle 9). Die Analyse aller Parameter erfolgt per Fisher´s exact test.
Für den Parameter Handtremor liegen Daten von 20 Patienten vor (p = 1,0).
Bei der SMA 2 ist ein rumpfbetonter Kraftverlust typisch. Der Parameter kann bei 23
Patienten bestimmt werden (p = 0,032). Aus den muskulären Atrophien resultieren oft
sekundäre Skelettveränderungen wie eine Skoliose, Thorax-Deformitäten oder
Kontrakturen an Hüfte und unterer Extremität. Hier wird die Gruppe ohne jegliche
Deformationen einer Gruppe mit Patienten gegenübergestellt, die Deformationen einer
Art bis hin zu Deformationen in allen 3 oben genannten Bereichen aufweisen
3.5 Ergebnisse
35
(n = 36, p = 0,13). Die Patienten sind nicht detaillierter nach der Anzahl der betroffenen
Bereiche aufgesplittet, da dies zu sehr kleinen Sub-Gruppen führen würde.
Tabelle 9: Klinische Parameter in der Gruppe SMA 2
Parameter Ausprägung n Tafel Test p-Wert Handtremor vorhanden / keine 20 2x2 Fisher´s Exact Test 1,00 Kraft im Rumpf normal / vermindert 23 3x2 Fisher´s Exact Test 0,03 Deformationen vorhanden / keine 36 3x4 Fisher´s Exact Test 0,13
In der Gruppe der SMA 3-Patienten werden sechs spezifische Parameter analysiert
(Tabelle 10). Für den Parameter Treppe steigen wird zuerst erfasst, ob zu irgendeinem
Zeitpunkt die Fähigkeit bestand Treppen zu steigen. Hierzu liegen von 48 Patienten
Daten vor (p = 1,0). In der Sub-Gruppe mit der Fähigkeit Treppen zu steigen wird
weiterhin analysiert, zu welchem Zeitpunkt dies erlernt wurde. Wurde dieser motorische
Meilenstein bis zum 21. Lebensmonat erreicht, wird dies als altersgerechte Entwicklung
gewertet. Ein Erlernen nach diesem Zeitpunkt wird als verspätet bezeichnet.
Da Stehen und Gehen bei SMA 3 definitionsgemäß als diagnostisches Kriterium allen
Patienten möglich ist, wurde für diese beiden Parameter nur der Zeitpunkt erfasst, an
dem diese motorischen Meilensteine erreicht wurden. Dafür werden auch hier jeweils
zwei Gruppen (normal / verspätet) gebildet. Die Fähigkeit zu Stehen sollte mit 10-12
Monaten erlangt werden. Das freie Gehen sollte mit 15-18 Monaten erlernt werden. Für
den Zielparameter Erlernen des Stehens liegen von 38 Patienten Daten vor (p = 1,0), für
den Parameter Erlernen des Gehens 48 Patienten-Daten (p = 0,12).
Da bei der SMA 3 die Gehfähigkeit erhalten bleiben kann, ist eine Rollstuhl-Nutzung
nicht bei allen Patienten notwendig. Für 123 Patienten liegen Angaben vor, ob ein
Rollstuhl genutzt wird (p = 0,14). Bei 25 dieser Patienten ist auch der Zeitpunkt
bekannt, ab dem die Notwendigkeit einer Rollstuhl-Nutzung gegeben war. Diese Daten
werden in einer Kaplan-Meier-Analyse mittels Wilcoxon-Test ausgewertet (p = 0,66).
Alle anderen fünf oben genannten Parameter werden mittels Fisher´s exact test
analysiert.
Der Parameter Erlernen des Sitzens wird bei Patienten mit SMA 2 und 3 erhoben. Das
Erlernen zwischen dem 6. und dem 9. Monat wird als altersgerecht bezeichnet. Die
Analyse erfolgt mittels Fisher´s exact test (n = 67, p = 0,65).
3.5 Ergebnisse
36
Tabelle 10: Klinische Parameter in der Gruppe SMA 3
Parameter Ausprägung n Tafel Test p-Wert
Treppen steigen möglich / nicht 48 2x2 Fisher´s Exact Test 1,00
Erlernen des Treppen Steigens normal / verspätet 37 2x2 Fisher´s Exact Test 0,12
Erlernen des Stehens normal / verspätet 38 2x2 Fisher´s Exact Test 1,00
Erlernen des Gehens normal / verspätet 48 2x2 Fisher´s Exact Test 0,12 Alter bei der erstmaligen Rollstuhl-Nutzung
in Jahren 25 - Kaplan-Meier-Analyse 0,66
Rollstuhl-Nutzung nötig ja / nein 123 3x2 Fisher´s Exact Test 0,14
Erlernen des Sitzens* normal / verspätet 67 3x2 Fisher´s Exact Test 0,65
(* = „Erlernen des Sitzens“ beinhaltet SMA 2- und SMA 3-Patienten)
Für das gesamte Kollektiv werden zehn weitere allgemeine SMA-typische Parameter
bestimmt (Tabelle 11). Die 164 Patienten, bei denen der Reflexstatus vorliegt, werden
in die Sub-Gruppen normale, global vermindert bzw. nur an einer Extremität fehlende
oder global fehlende Reflexe eingeteilt. Typisch sind bei der SMA schwache bis
fehlende Eigenreflexe. Die Analyse erfolgt hier mittels Kruskal-Wallis-Test (p = 0,72).
Die übrigen 9 Zielparameter werden mittels Fisher´s exact test analysiert.
EMG-Befunde liegen bei 63 Patienten vor (p = 0,51). Typischerweise zeigt sich ein
pathologischer chronisch-neurogener Umbau-Prozess.
Ein Muskelbiopsie-Befund wird nur bei 58 Patienten erhoben (p = 1). Es zeigt sich
überwiegend eine neurogene Atrophie.
Typisch für insbesondere die akuten SMA-Formen sind pathologische Befunde im
respiratorischen System. Die Patienten werden diesen Parameter betreffend in zwei
Gruppen eingeteilt: mit unauffälligem respiratorischen Befund und pathologischen
Befunden, die Bauch- oder Schaukelatmung, Apnoe, Dyspnoe, Tachypnoe und andere
Zeichen der respiratorischen Insuffizienz einschließen (n = 188, p = 0,25). Ergänzend
wird erhoben, ob eine Form der invasiven (Respirator-Beatmung über Tubus oder
Tracheostoma) oder nichtinvasiven (CPAP) Atemhilfe verordnet wurde. 91 Patienten
benötigen keine Atemhilfe. 31 greifen auf eine der oben genannten Formen zurück
(n = 122, p = 0,93).
Ein weiterer typischer Befund sind Zungenfibrillationen. Es werden bei 78 Patienten
Zungenfibrillationen beschrieben. Bei 57 Patienten liegt dieses Symptom nicht vor
(n = 135, p = 0,07).
Ein besonderer Fokus liegt auf der Erhebung der Muskelkraft. Die Quantifizierung der
3.5 Ergebnisse
37
Muskelkraft ist allerdings durch die Abhängigkeit vom Untersucher wenig einheitlich.
Daher umfasst die Gruppe mit regelrechter Kraft die als unauffällig oder mit Kraftgrad
4 bis 5 beschriebenen Patienten (Medical-Research-Council, 1976). Als Patienten mit
verminderter Kraft werden die Patienten mit Kraftgrad 1 bis 3 zusammengefasst. Es
werden Befunde für die obere Extremität erhoben, welche proximal Schulter und
Oberarm beinhaltet (n = 200, p = 0,07) und distal Unterarm und Hand
(n = 200, p = 0,04). Analog dazu werden an der unteren Extremität Befunde erhoben.
Die proximale untere Extremität umfasst Hüfte und Oberschenkel (n = 213, p = 0,73)
und die distale untere Extremität Unterschenkel und Fuß (n = 214, p = 0,81).
3.5 Ergebnisse
38
Tabelle 11: Klinische Parameter im Gesamtkollektiv
Kollektiv Parameter Ausprägung n Tafel Test p-Wert SMA 2 + 3
Erlernen des Sitzens
normal / verspätet
67 3x2 Fisher´s Exact Test
0,65
SMA 2 27 3x2 Fisher´s Exact
Test 1,00
SMA 3 40 2x2 Fisher´s Exact
Test 0,50
ALLE
EMG-Befund
unauffällig / neurogen
63 2x2 Fisher´s Exact Test
0,51
SMA 1 23 2x2 Fisher´s Exact
Test 0,62
SMA 2 15 2x2 Fisher´s Exact
Test 0,52
SMA 3 25 2x2 Fisher´s Exact
Test 0,28
ALLE Reflexstatus
normal /
vermindert / fehlend
164 3x3 Kruskal-Wallis-Test
0,72
SMA 1 81 3x3 Kruskal-Wallis-Test
0,45
SMA 2 35 2x2 Wilcoxon-Test 0,68
SMA 3 48 2x2 Wilcoxon-Test 0,77
ALLE
Zungenfibrillationen
vorhanden / keine
135 3x2 Fisher´s Exact Test
0,08
SMA 1 67 3x2 Fisher´s Exact
Test 1,00
SMA 2 32 2x2 Fisher´s Exact
Test 0,02
SMA 3 36 2x2 Fisher´s Exact
Test 1,00
ALLE Muskelbiopsie-
Befund
unauffällig / Atrophie
58 2x2 Fisher´s Exact Test
1,00
SMA 1 19 2x2 Fisher´s Exact
Test 1,00
SMA 3 22 2x2 Fisher´s Exact
Test 1,00
SMA 2 Alle Patienten wiesen die Ausprägung Atrophie auf.
17 3x2
ALLE
Befund respiratorisches
System
unauffällig / pathologisch
188 3x2 Fisher´s Exact Test
0,25
SMA 1 97 3x2 Fisher´s Exact
Test 1,00
SMA 2 39 3x2 Fisher´s Exact
Test 0,06
SMA 3 52 2x2 Fisher´s Exact
Test 0,67
ALLE
Nutzung einer Atemhilfe
ja / nein
122 3x2 Fisher´s Exact Test
0,93
SMA 1 29 3x2 Fisher´s Exact
Test 0,38
SMA 2 40 3x2 Fisher´s Exact
Test 0,17
SMA 3 53 2x2 Fisher´s Exact
Test 0,47
ALLE 200 3x2 Fisher´s Exact
Test 0,07
3.5 Ergebnisse
39
SMA 2 Kraft in der oberen Extremität proximal
normal / vermindert
45 3x2 Fisher´s Exact Test
0,06
SMA 3 56 2x2 Fisher´s Exact
Test 0,40
SMA 1 Alle Patienten wiesen die Ausprägung vermindert auf.
99 3x1
ALLE
Kraft in der oberen Extremität distal
normal / vermindert
200 3x2 Fisher´s Exact Test
0,04
SMA 2 45 3x2 Fisher´s Exact
Test 0,63
SMA 3 56 2x2 Fisher´s Exact
Test 0,13
SMA 1 Alle Patienten wiesen die Ausprägung vermindert auf.
99 3x1
ALLE Kraft in der unteren Extremität proximal
normal / vermindert
213 3x2 Fisher´s Exact Test
0,73
SMA 3 60 2x2 Fisher´s Exact
Test 0,42
SMA 1 Alle Patienten wiesen die Ausprägung vermindert auf.
108 3x1
SMA 2 Alle Patienten wiesen die Ausprägung vermindert auf.
45 3x1
ALLE
Kraft in der unteren Extremität distal
normal / vermindert
214 3x2 Fisher´s Exact Test
0,81
SMA 1 109 3x2 Fisher´s Exact
Test 1,00
SMA 2 45 3x2 Fisher´s Exact
Test 0,38
SMA 3 60 2x2 Fisher´s Exact
Test 1,00
Bei der Analyse der klinischen Parameter erwarten wir für Heterozygote und
homozygote CNTF-Mutanten eine pathologische Ausprägung der klinischen Parameter.
Tatsächlich zeigen sich in der Gruppe der SMA 1-Patienten keine Hinweise auf einen
Zusammenhang des CNTF-Genotyps und der Ausprägung der klinischen Parameter.
Die signifikanten Ergebnisse für die Parameter Kraft im Rumpf und
Zungenfibrillationen in der Gruppe der SMA 2-Patienten weisen wiederum auf einen
möglichen Einfluss von CNTF hin. In der Gruppe der SMA 3-Patienten war für die
klinischen Parameter kein signifikanter Einfluss nachweisbar. In der Auswertung der
klinischen Parameter ergeben sich somit keine starken Hinweise auf einen
weitreichenden Einfluss von CNTF bei der Merkmalsausprägung.
3.6 Ergebnisse
40
3.6 Kaplan-Meier-Analyse für Krankheitsbeginn und Überleben
In früheren Studien wurde immer wieder der Einfluss von CNTF auf die Parameter
Erkrankungsbeginn und Überlebenszeit untersucht. Zumeist ergaben sich Hinweise auf
einen Einfluss von CNTF. Auch in unserem Kollektiv wird für alle Patienten im
Gesamtkollektiv der Erkrankungsbeginn erfasst. Dieser ist als Zeitpunkt des Auftretens
erster SMA-typischer Symptome definiert. Ist dieser Zeitpunkt anamnestisch nicht
genau erfassbar, wird der Zeitpunkt der molekulargenetischen Diagnose als links
zensierter Erkrankungsbeginn definiert. Liegt der Zeitpunkt der molekulargenetischen
Diagnose nach dem in den klinischen Diagnosekriterien festgelegten maximalen
Erkrankungsalter, wird als Erkrankungsbeginn das dem SMA-Typ entsprechende
maximale Erkrankungsalter definiert. Als weiterer Parameter wird nur in der Gruppe der
SMA 1-Patienten die Überlebenszeit erfasst. Der Beginn einer dauerhaften invasiven
Beatmung ist dabei ebenfalls als funktioneller Todeszeitpunkt definiert.
Die Analyse der Parameter Erkrankungsbeginn und Überlebenszeit wird mittels Kaplan-
Meier-Analyse per Log-rank-Test oder Wilcoxon-Test durchgeführt (Tabelle 12 - 15).
Nähere Informationen zu den Größen der einzelnen Subgruppen und dem Anteil der
zensierten Werte für die Kaplan-Meier-Analysen finden sich im Anhang. Die
Überlebenskurven zeigen die Abbildungen 14 – 16.
Tabelle 12: Kenngrößen für den Parameter Erkrankungsbeginn in den verschiedenen Subgruppen des Gesamtkollektivs
Kollektiv Ziel-Parameter n Median Range
Gesamtkollektiv Erkrankungsbeginn in Wochen 276 26 1040
SMA 1-Patienten Erkrankungsbeginn in Wochen 137 6 36
SMA 2-Patienten Erkrankungsbeginn in Wochen 56 61 72
SMA 3-Patienten Erkrankungsbeginn in Wochen 83 264 1040
homozygot Mutierte Erkrankungsbeginn in Wochen 4 2 53
Heterozygote Erkrankungsbeginn in Wochen 109 24 1040
homozygot Wildtypen Erkrankungsbeginn in Wochen 162 29 1040
3.6 Ergebnisse
41
Tabelle 13: Kaplan-Meier-Analyse des Einflusses auf die Zeitspanne bis zum Erkranken getrennt nach den Einfluss-Faktoren SMA-Typ, SMN2-Kopienzahl und CNTF-Typ im Gesamtkollektiv und in verschiedenen Subgruppen
Kollektiv Einfluss-Variable n Test X2 p-Wert
Freiheits-grade
Anteil zensiert
Gesamtkollektiv SMA-Typ 276 Wilcoxon 106,15 <0,0001 2 43,12%
Gesamtkollektiv SMN2-Kopienzahl 276 Wilcoxon 104,73 <0,0001 5 43,17%
Gesamtkollektiv CNTF-Genotyp 276 Wilcoxon 4,34 0,11 2 43,12%
SMA 1-Patienten CNTF-Genotyp 137 Log-rank 3,59 0,16 2 35,12%
SMA 2-Patienten CNTF-Genotyp 56 Wilcoxon 1,06 0,59 2 60,71%
SMA 3-Patienten CNTF-Genotyp 83 Wilcoxon 5,5 0,19 1 49,40%
Bei dem Parameter Erkrankungsbeginn wurde getrennt nach der Ausprägung der drei
Faktoren SMA-Typ, SMN2-Kopienzahl und CNTF-Typ jeweils dessen Einfluss auf die
Zeitspanne bis zum Erkranken verglichen.
Der Erkrankungsbeginn lag für das Gesamtkollektiv im Median bei 26 Wochen (Range
1040; n = 276), für die Subgruppen SMA 1 bei 6 Wochen (Range 36; n = 137), SMA 2
bei 61 Wochen (Range 72; n = 56) und SMA 3 bei 264 Wochen (Range 1040; n = 83).
Der Erkrankungsbeginn unterscheidet sich im Gesamtkollektiv signifikant nach SMA-
Typ (Wilcoxon-Test; n = 276; p<0,0001) und SMN2-Kopienzahl (Wilcoxon-Test;
n = 276; p<0,0001). Dies entspricht den Erfahrungen aus vorangegangenen Studien.
Zwischen den CNTF-Genotypen lässt sich weder im Gesamtkollektiv, noch in den
SMA-Subgruppen, ein signifikanter Unterschied für den Parameter Erkrankungsbeginn
nachweisen (Tabelle 13). In der Subgruppe der homozygoten Wildtypen liegt der
mediane Erkrankungsbeginn bei 29 Wochen (Range 1040; n = 162), in der Gruppe der
Heterozygoten bei 24 Wochen (Range 1040; n = 109) und in der Gruppe der homozygot
Mutierten bei 2 Wochen (Range 53; n = 4).
3.6 Ergebnisse
42
Tabelle 14: Kenngrößen für den Parameter Überlebensdauer in SMA 1-Patienten
Kollektiv Ziel-Parameter n Median Range
SMA 1-Patienten gesamt Überleben in Monaten
137 5 394
homozygot Mutierte Überleben in Monaten
2 3,1 4,3
Heterozygote Überleben in Monaten
52 4,9 393,9
homozygot Wildtypen Überleben in Monaten
83 5,1 29,7
Tabelle 15: Kaplan-Meier-Analyse des Einflusses auf die Zeitspanne bis zum Versterben getrennt nach den Einfluss-Faktoren SMN2-Kopienzahl und CNTF-Typ in SMA 1-Patienten
Kollektiv Einfluss-Variable n Test X2 p-
Wert Freiheits-grade
Anteil zensiert
SMA 1-Patienten SMN2-Kopienzahl 137 Wilcoxon 20,2 0,0002 3 64,96%
SMA 1-Patienten CNTF-Genotyp 137 Wilcoxon 2,47 0,29 2 64,96%
Die Überlebensdauer bis zum Versterben liegt in der Gruppe der gesamten SMA 1-
Patienten im Median bei 5 Monaten (n=137; Range 394 Monate). Ein möglicher
Einfluss der SMN2-Kopien und des CNTF-Genotyps auf die Überlebensdauer wird
überprüft. Dabei zeigt sich, dass das Überleben bei SMA 1-Patienten sich signifikant
nach SMN2-Kopienzahl unterscheidet (Wilcoxon-Test; n = 137; p=0,0002). Das
Überleben der SMA 1-Patienten unterscheidet sich allerdings nicht signifikant nach
CNTF-Genotyp (Wilcoxon-Test; n = 137; p=0,29).
In der Subgruppe der homozygoten Wildtypen liegt die Überlebensspanne bei 5,1
Monaten (Range 29,7 Monate; n = 83), in der Gruppe der Heterozygoten bei 4,9
Monaten (Range 393,9 Monate; n = 52) und in der Gruppe der homozygot Mutierten bei
3,1 Monaten (Range 4,3 Monaten; n = 2).
Im vorigen Kapitel konnte nicht eindeutig ein Einfluss des CNTF-Genotyps auf die
Ausprägung verschiedener klinischer Parameter nachgewiesen werden. Für die hier
dargestellten Parameter Erkrankungsbeginn und Überlebenszeit gilt dies nicht. Es lässt
3.6 Ergebnisse
43
sich weder für den Erkrankungsbeginn noch für das Überleben ein signifikanter Einfluss
nachweisen. Es kann lediglich gezeigt werden, dass die SMN2-Kopienzahl einen
signifikanten Einfluss auf den Erkrankungsbeginn und das Überleben hat.
Abbildung 14: Kaplan-Meier-Überlebenskurve für den Parameter Erkrankungsbeginn im Gesamtkollektiv nach CNTF-Status getrennt
3.6 Ergebnisse
44
Abbildung 15: Kaplan-Meier-Überlebenskurve für den Parameter Erkrankungsbeginn im Gesamtkollektiv nach SMN-Kopienzahl getrennt
Abbildung 16: Kaplan-Meier-Überlebenskurve für den Parameter Überlebensdauer bei SMA 1-Patienten nach CNTF-Status getrennt
4.1 Diskussion
45
4 Diskussion
Bei der Suche nach modifizierenden Faktoren bei der SMA wurden durch diverse
Studien Erkenntnisse erlangt, die darauf schließen ließen, dass der CNTF-Genotyp den
Verlauf einer SMA-Erkrankung beeinflussen könnte. Da die Nullmutation des CNTF-
Gens allerdings selten vorkommt, beziehen sich diese Erkenntnisse vorwiegend auf
einzelne Fallberichte und Tierversuche. Dagegen wird in dieser Studie ein großes
Kollektiv von SMA-Patienten untersucht. Nach bisherigen Erkenntnissen wäre zu
erwarten, dass der Verlust eines oder beider CNTF-Wildtyp-Allele den klinischen
Erkrankungsverlauf verschlechtert. Die Bestätigung oder Falsifikation dieser These ist
Gegenstand dieser Studie. Explorativ wurde dazu die Ausprägung diverser klinischer
Parameter analysiert. Ebenso ist von Interesse, ob bedingt durch morphologische
Unterschiede und Unterschiede im zeitlichen Verlauf zwischen akuten und chronischen
SMA-Formen im zeitlichen Ablauf der Einfluss von CNTF auf bestimmte SMA-Typen
beschränkt ist. Dies konnte in der vorliegenden Studie nicht bestätigt werden.
4.1 Infantile autosomal-rezessive spinale Muskelatrophie: Pathogenese in vivo
und im Tiermodell
4.1.1 SMN-Proteinmangel als Ursache der SMA
In den letzten Jahrzehnten wurden durch eine Vielzahl von Studien die der SMA
zugrunde liegenden Ursachen identifiziert. So resultiert der Verlust des SMN1-Gens
ubiquitär in einen gravierenden SMN-Proteinmangel (Lefebvre et al., 1995). Die Rolle
des SMN-Proteins und möglicher Interaktionspartner soll hier noch einmal dargestellt
werden.
Dass insbesondere in α-Motoneuronen ein SMN-Mangel zu einer spezifischen
Degeneration führt, warf zunächst Fragen auf (Coovert et al., 1997). Es rückte in den
Fokus, inwieweit sich die Bedürfnisse eines Motoneurons von anderen Zelltypen
unterscheiden und zur Pathologie der SMA beitragen. Wie in der Einleitung erwähnt,
gibt es zwei Thesen zu Interaktionspartnern, die das SMN-Protein in α-Motoneuronen
hat. Zum einen konnte nachgewiesen werden, dass das SMN-Protein essentiell für die
snRNP-Biogenese ist (Winkler et al., 2005). Ein Komplex aus SMN, Gemin 2-8, unrip
4.1 Diskussion
46
und ATP ermöglicht in vivo die Ausbildung einer Ringformation von sm-Proteinen.
Dieser Ring kann eine Bindung mit den UsnRNAs eingehen und das snRNP bilden.
Fünf dieser snRNPs wiederum bilden ein Spleißosom (Fischer et al., 1997). Ein Verlust
von SMN führt daher zu einer gestörten Prozessierung von Genen. Tatsächlich lässt sich
eine Veränderung der Genexpression in Motoneuronen von SMA-Patienten nachweisen.
Dabei konnte jedoch nicht genau differenziert werden, welche Gene betroffen sind. Die
Suche gestaltet sich auch deshalb schwierig, da die Zelle bei der SMA auch
stressbedingt die Genexpression verändert (Burghes & Beattie, 2009).
Als weiterer Bindungspartner des SMN-Proteins wurde zum anderen hnRNP
identifiziert (Mourelatos et al., 2001). Die hnRNPs sind vorwiegend nukleär lokalisierte
RNA-Bindungsproteine. Sie binden die Transkripte der RNA-Polymerase, verhindern
so das Falten der Produkte und halten sie bereit für die Interaktion mit anderen
Proteinen. Sie sind ebenfalls beteiligt an der Prozessierung der prä-mRNA, ihres
Transports und der Translokation in das Zytosol. HnRNP und SMN sind im Axon ko-
lokalisiert (Jablonka et al., 2000). In Axonen von α-Motoneuronen konnte ferner eine
spezifische Bindung des SMN-hnRNP-Komplexes an β-Actin-mRNA nachgewiesen
werden (Rossoll et al., 2002). SMN selber geht wiederum eine Bindung zu den
axonalen Mikrotubuli ein (Pagliardini et al., 2000). Ein SMN-Protein-Verlust führt
entsprechend zur Reduktion von β-Actin-mRNA und β-Actin-Protein in Axonen.
Schlussfolgernd ist davon auszugehen, dass das SMN-Protein also am axonalen mRNA-
Transport beteiligt ist (Lorson et al., 2010; Rossoll et al., 2003). Der Transport und die
Verteilung von β-Actin ist dabei sehr wichtig für die Zellfunktion, speziell in
Motoneuronen (Mohr & Richter, 2001). Durch die Axone erhält ein Motoneuron eine
enorme Ausdehnung. Einem funktionierenden Transport der Proteine zu ihrem
Wirkungsort kommt damit eine wichtige Bedeutung zu.
Die beschriebenen biochemischen Veränderungen spiegeln sich entsprechend auch auf
zellulärer Ebene wider. Morphologisch drückt sich ein SMN-Protein-Mangel in einer
Axonopathie aus. Die betroffenen Axone sind terminal schlecht verzweigt, verdickt und
in Retraktion befindlich (Kariya et al., 2008). Außerdem finden sich in den Axonen
Filament-Aggregate. Bei milden SMA-Erkrankungen sind sie im prä-terminalen Axon
nachzuweisen. Bei schweren SMA-Formen häufen sich diese Aggregate früher und in
ausgedehnter Form an. Sie sind dann sowohl im prä-terminalen Axon, als auch
präsynaptisch zu finden. Die Axonopathie führt zu einer retrograden Denervierung
4.1 Diskussion
47
(Cifuentes-Diaz et al., 2002; Kariya et al., 2008).
Auf Seiten des Neurons werden sowohl im Mausmodell, als auch bei SMA-Patienten,
ein Absterben der Motoneurone und eine Reduktion der Zellzahl beobachtet. Ito et al.
(2011) untersuchten dazu post mortem 8 SMA 1-Patienten und einen SMA 2-Patienten
neuropathologisch. Die Reduktion der Zellzahl fiel bei dem SMA 2-Patienten geringer
aus als bei den Patienten der akuten Form. Dies wird durch die von Hausmanowa-
Petrusewicz et al. (1988; 1986) an SMA-Patienten erhobenen EMG-Befunde
untermauert. Patienten mit akuter SMA wiesen im EMG Zeichen einer akuten
Denervierung auf. Ferner zeigten sich normal große motorische Einheiten. Das EMG
der Patienten mit milder SMA zeigte hingegen eine vergrößerte motorische Einheit.
Entsprechend wurde postuliert, dass die Verlaufsform des SMA beeinflusst wird von
der Fähigkeit der überlebenden Motoneurone die denervierten benachbarten
Muskelfasern zu re-innervieren.
Postsynaptisch lässt sich keine Veränderung der Anzahl der motorischen Endplatten
feststellen. Allerdings bleibt die Differenzierung der postsynaptischen Rezeptor-Cluster
aus (Arnold et al., 2004).
4.1.2 SMA-Mausmodelle
Die am Menschen erhobenen Befunde, dass vor allem die Funktionalität der
überlebenden Neurone für die Ausprägung der SMA zuständig ist, bestätigten sich auch
in Mausmodellen der SMA.
Die Modellbildung einer SMA in der Maus stellt zunächst jedoch eine Herausforderung
dar. Die Duplikation der SMN-Region findet sich nur bei Primaten und Menschen,
während SMN2 sogar nur bei Menschen vorliegt (Rochette et al., 2001). Mäuse haben
demnach nur ein Smn-Gen. Dessen homozygoter Verlust ist letal (Schrank et al., 1997).
Um einen SMA-Phänotyp zu generieren, musste das SMN-Protein-Level daher
reduziert werden. Dies gelingt auf verschiedenen Wegen: durch homozygote Smn-
Deletion in Kombination mit Gentransfer von humanem SMN2, durch heterozygote
Smn-Deletion oder durch gewebespezifischen SMN-Protein-Mangel wie beispielsweise
im Cre-loxP-Modell.
Gut bekannte und viel genutzte Mausmodelle weisen eine homozygote Smn-Deletion in
4.1 Diskussion
48
Kombination mit Transgenen auf, die SMN2 enthalten. Bei homozygoter Smn-Deletion
führt das Einfügen von humanem SMN2 in unterschiedlicher Kopienzahl zu einem
SMA-ähnlichen Phänotyp. Eine bis zwei Kopien entsprechen dabei einem akuten
Phänotyp ähnlich der SMA 1. Dieses Modell (Smn-/-; SMN2+/+) gilt als Standardmodell
für die akute SMA. Ab acht oder mehr SMN2-Kopien sind die Mäuse asymptomatisch
(Monani et al., 2000). Durch die Einführung von humaner SMN∆7 cDNA als zweites
Transgen konnte ein weiteres Modell (Smn-/-; SMN2+/+; SMN∆7 +/+) einer akuten
Verlaufsform mit leicht längerer Lebenserwartung generiert werden (Le et al., 2005).
Jablonka et al. (2000) schufen durch die heterozygote Inaktivierung des Smn-Gens
Smn+/- Mäuse, die morphologisch und klinisch einer milden SMA (Typ 3) entsprechen.
Die Arbeitsgruppe verfolgte in einem Kollektiv (n=8) von Smn+/- Mäusen den zeitlichen
Verlauf des Zellverlusts von Motoneuronen. Diese Mäuse wiesen dabei im Vergleich zu
Wildtypen im ersten halben Jahr einen Zellverlust von 40% auf. Weitere 14% traten bis
zum ersten Lebensjahr auf.
Simon et al. (2010) bestätigten diese Ergebnisse. Ihre Smn+/- Mäuse (n=9) wiesen mit 4
Wochen noch keine Reduktion der Zellzahl auf. Im Verlauf folgte dann der Zellverlust
von 23 % im 6. Monat bis zu insgesamt 42 % im 12. Monat. Überraschend war die
Beobachtung, dass im Alter von 12 Monaten die Mäuse klinisch trotzdem unauffällig
waren. Die Muskelkraft war nicht reduziert. Dies warf die Frage auf, ob die Anzahl der
Motoneurone grundlegend entscheidend für die Ausprägung der SMA sei. Tatsächlich
ging dem Absterben der Motoneurone schon ab der 4. Woche eine fortschreitende
Denervierung der neuromuskulären Verbindung voraus.
Cifuentes-Diaz et al. (2002) führten SmnF7/Smn∆7-Mäuse ein. Durch das Cre-loxP-
System wird Exon 7 gewebespezifisch in Motoneuronen deletiert. Dies führt zu einer
rasch fortschreitenden Symptomatik ähnlich einer akuten SMA, die nach ca. 4 Wochen
zum Tod führt. Die Morphologie ist absolut SMA-typisch. Die Arbeitsgruppe
beobachtete ebenfalls bei einer Gruppe dieser Mäuse (n=8) im Alter von 30 Tagen eine
Zellzahlreduktion von 30% gegenüber den Wildtyp-Mäusen. Diese wiesen zum
gleichen Zeitpunkt allerdings zu 78% Axonschäden auf. Daraus folgt, dass die
retrograde Denervierung dem Zellverlust voraus geht und die Axonopathie im
Vordergrund der SMA-Erkrankung steht. Entscheidend ist demnach insbesondere die
Funktionalität der überlebenden Motoneurone. Allerdings kommen solche
gewebespezifischen kompletten Deletionen unter Patienten nicht vor. Daher kann man
4.2 Diskussion
49
aus diesem Modell nur beschränkt Rückschlüsse ziehen.
Nicht allen SMA-Mausmodellen liegt überhaupt ein SMN-Defekt zu Grunde. Dies
entspricht auch der Beobachtung beim Menschen, dass ein Vorderhornzellverlust durch
unterschiedliche Gendefekte verursacht werden kann. Wobbler-Mäuse weisen
beispielsweise einen SMA-ähnlichen Phänotyp mit Neurofilament-Aggregaten und
progressiver Motoneuron-Degeneration auf. Dem zugrunde liegt allerdings die
autosomal-rezessive Mutation von Vps54 (Mitsumoto et al., 1994).
Die durch Schmalbruch et al. (1991) beschriebene pmn-Maus wiederum weist eine
autosomal-rezessive Punktmutation im tbce-Gen auf, die zu Defekten der Mikrotubuli
führt. Klinisch zeigt sich eine caudo-cranial fortschreitende Motoneuron-Degeneration.
Das Mausmodell ermöglicht hohe Fallzahlen, die aussagekräftig statistisch analysiert
werden können. Ferner erleichtert das Mausmodell durch eine kurze Generationsdauer
Verlaufsbeobachtungen. Die Analyse einzelner Mutationen oder des Zusammenspiels
multipler Mutationen ist gezielt möglich. Tiermodelle stellen allerdings immer
artifizielle Konstrukte dar, die sich nicht vollständig auf den Menschen übertragen
lassen.
4.2 Funktion des CNTF im Tiermodell
Die Beobachtung des Verlusts von Motoneuronen bei der SMA rückte den
neurotrophischen Faktor CNTF in den Fokus. Die These, dass CNTF durch den Erhalt
von Motoneuronen in den Verlauf der SMA kompensatorisch eingreifen könne,
erschien zunächst vielversprechend. In zahlreichen in vivo-Experimenten wurde CNTF
daher Tieren exogen zugeführt. Oppenheim et al. (1991) stellten bei Hühner-Embryos
fest, dass die Applikation in vivo die Überlebensrate von Neuronen bei
entwicklungsbedingter Zellapoptose erhöht. Dieser Effekt bezog sich hier allerdings
nicht auf die bei früheren Experimenten in vitro untersuchten Ziliarnerven, sondern
ausschließlich auf Motoneurone.
Ein ähnlicher Effekt ist bei Ratten zu beobachten. Die Applikation verhinderte den
Verlust von Motoneuronen und die folgende Atrophie des Musculus bulbocavernosus in
der Entwicklungsphase (Forger et al., 1993). Somit wurde postuliert, dass CNTF als
Einflussfaktor für das Überleben der Motoneurone in der embryonalen und postnatalen
Entwicklungsphase fungiert.
4.2 Diskussion
50
Diese Aussage steht jedoch in Diskrepanz zu den Erkenntnissen, dass die endogene
CNTF-Expression in vivo bei diesen Tieren erst postnatal zu einem Zeitpunkt hoch
reguliert wird, an dem diese Entwicklung bereits abgeschlossen ist (Stöckli et al., 1989).
Selbst bei CNTF-Knock-out-Tieren konnte eine normale embryonale und postnatale
Entwicklung beobachtet werden. CNTF scheint damit nicht essentiell zu sein für die
neuronale Entwicklung und den Zellerhalt in der Entwicklungsphase.
Im Gegensatz dazu führt eine Nullmutation des CNTF-Rezeptor-α zu einem
gravierenden Motoneuronen-Defizit und ist postnatal letal. CNTF-Rα ist also essentiell
in der embryonalen Entwicklung (Sleeman et al., 2000). Welcher Ligand in dieser Phase
an den Rezeptor anstelle von CNTF bindet, ist noch nicht vollständig geklärt
(DeChiara et al., 1995). Ein wichtiger Faktor für die embryonale Entwicklung scheint
Kardiotrophin-1 zu sein. CT-1 bindet allerdings an gp130. Ein weiterer Faktor,
Leukemia Inhibitory Factor, bindet zwar an CNTF-Rα, wird aber ebenfalls erst
postnatal expremiert und spielt entsprechend keine Rolle in der embryonalen
Entwicklung (Holtmann et al., 2005). Dem LIF konnte postnatal dann ein sogar noch
weiter reichender Einfluss auf die Instandhaltung distaler Axone und der motorischen
Endplatte nachgewiesen werden, als dies bei CNTF der Fall ist. Im Zusammenspiel mit
CNTF könnten die Effekte additiv sein.
Seine eigentliche Funktion übernimmt CNTF erst postnatal, nachdem dessen
Genexpression hoch reguliert wird. Diese Erkenntnisse werden durch Masu et al. (1993)
unterstützt. Sie untersuchten CNTF-Knock-out-Mäuse. Diese Mäuse wiesen postnatal
keine morphologischen Auffälligkeiten auf. Erst ab der 8. Lebenswoche wurde ein
progredienter Verlust von Motoneuronen nachgewiesen. Dieser Verlust resultierte ab
der 24. Lebenswoche in einer signifikanten Muskelschwäche.
Einen progredienten Verlust von Motoneuronen konnten Simon et al. (2010) bei ihren
SMN+/- Mäusen, einem Modell der SMA 3, ebenfalls nachweisen. Ein Teil dieser
Mäuse wurde zusätzlich mit einem CNTF-Knock-out versehen. Diese Mäuse zeigten ab
dem 6. Lebensmonat einen Verlust der Muskelkraft. Im Gegensatz dazu wiesen die
Mäuse mit CNTF-Wildtyp aber keine SMA-typischen Symptome auf.
Für den Erhalt der motorischen Funktionen in der Wildtyp-Gruppe war eine
Vergrößerung der motorischen Einheiten verantwortlich. Morphologisch zeigte sich ab
der 4. Woche ein Aussprossen terminaler Axone von benachbarten Neuronen zur Re-
Innervation denervierter Muskelfasern. Demnach ist CNTF für die Reparatur von
4.2 Diskussion
51
Läsionen der motorischen Einheit und somit für die Instandhaltung der motorischen
Funktionen zuständig. Dies vermittelt CNTF durch die Induktion von axonalem
Aussprossen und die Re-Innervation von Muskelfasern (Gurney et al., 1992; Siegel et
al., 2000). Somit ist der Mechanismus, durch den CNTF als kompensatorisches Agens
wirkt, identifiziert.
Der zeitliche Ablauf des Zusammenspiels von CNTF-Expression und den
morphologischen Veränderungen bei der SMA wird im Mausmodell folgendermaßen
erklärt: In Mausmodellen einer akut verlaufenden SMA versterben die Tiere teilweise
schon innerhalb einer Woche. Wie oben erwähnt, startet bei CNTF-Wildtyp-Mäusen die
Expression des CNTF erst nach der ersten Lebenswoche. Somit wäre bei den akut
verlaufenden SMA-Formen allerdings keine Einflussnahme mehr möglich. Mäuse mit
einer klinisch milden SMA-Ausprägung zeigen dagegen einen wesentlich langsameren
Krankheits-Verlauf. Die Akkumulation von Neurofilamenten findet später und weniger
ausgedehnt statt. In klinisch milden SMA-Typen verlaufen also die Erkrankung und die
CNTF-Expression parallel, sodass CNTF noch die Möglichkeit hat einzugreifen. Ob
dieses zeitliche Zusammenspiel auch auf den Menschen zutrifft, ist nicht klar. Ebenso
bleibt unklar, ob CNTF nur in bestimmten SMA-Typen Einfluss nimmt.
Möglicherweise spielen auch weitere Faktoren eine Rolle. Dazu wären weiterführende
neuropathologische bzw. funktionelle Untersuchungen nötig.
4.3 Diskussion
52
4.3 Ergebnisse klinischer Studien unter Berücksichtigung des CNTF
4.3.1 Ergebnisse aus vorangegangenen Studien zu verschiedenen neurologischen
Erkrankungen
Vielen neurologischen Erkrankungen liegt eine ähnliche Pathologie wie die bei der
SMA zugrunde. So finden sich beispielsweise auch bei der ALS, Morbus Parkinson und
der Charcot-Marie-Tooth-Erkrankung Neurofilament-Aggregate (Al-Chalabi & Miller,
2003a). Daher wurde auch bei solchen Erkrankungen ein Einfluss von CNTF
untersucht.
Thome et al. (1996) fanden in einem Kollektiv aus 297 psychiatrischen Patienten mit
verschiedenen Erkrankungen eine gegenüber dem Vergleichskollektiv signifikant
erhöhte Allelfrequenz des mutierten CNTF-Allels. Sie schlossen somit einen Einfluss
von CNTF in der Ätiopathogenese von psychiatrischen Erkrankungen nicht aus. Die
Genotyp-Verteilung wich in der ebenfalls untersuchten Gruppe von 208 Patienten mit
diversen neurologischen Erkrankungen jedoch nicht signifikant vom
Vergleichskollektiv ab.
Ein kausaler Zusammenhang wurde auch in den nachfolgend aufgeführten Studien nicht
nachgewiesen, da die Anzahl der homozygot Mutierten dort ebenfalls nicht signifikant
höher lag als in Vergleichskollektiven mit gesunden Probanden: Takahashi et al. (1994)
untersuchten dazu 391 japanische Patienten mit Amyotropher Lateralsklerose, Morbus
Parkinson, Guillain-Barré-Syndrom und anderen neurologischen Erkrankungen.
Giess et al. (1998) untersuchten deutsche Patienten mit ALS (n=98), progressiver
Muskelatrophie (n=41), spastischer Paraparese (n=7), primärer Lateral-Sklerose (n=2)
und SMA (n=6).
Gelernter et al. (1997) fanden ebenfalls keine Assoziation der Nullmutation mit
unipolarer Depression (n=59), Schizophrenie (n=66) oder Morbus Alzheimer (n=93).
Insgesamt scheint die CNTF-Nullmutation also eher nicht kausal für diverse
neurologische und psychiatrische Erkrankungen zu sein. Darüber hinaus wurde daher
der Einfluss auf den klinischen Verlauf und den Schweregrad verschiedener
neurologischer Erkrankungen untersucht. Hier ergibt sich aus der Literatur ein
heterogenes Bild. In der Studie von Al-Chalabi et al. (2003b) beispielsweise konnte bei
351 Patienten mit ALS kein Einfluss des CNTF-Genotyps auf den Erkrankungsbeginn
oder das Überleben festgestellt werden.
Diese Ergebnisse bestätigten sich in der Studie von van Vught et al. (2007) mit 264
4.3 Diskussion
53
ALS-Patienten und 9 Patienten mit familiärer ALS.
Auch Hoffmann et al. (2002) konnten für die Parameter Erkrankungsbeginn und
Krankheitsverlauf bei MS-Patienten (n= 349) keine Korrelation mit dem CNTF-
Genotyp feststellen.
Im Gegensatz dazu wiesen Giess et al. (2002a) in einem Kollektiv von 288 Patienten
mit Multipler Sklerose einen negativen Einfluss auf den klinischen Krankheitsverlauf
nach. Die Erkrankung begann bei den sieben Patienten mit homozygoter Nullmutation
im Median 10 Jahre vor der Vergleichsgruppe mit maximal einem CNTF-Null-Allel.
Später wurde bei 38 ALS-Patienten ebenfalls ein signifikant negativer Einfluss auf den
Erkrankungsbeginn, nicht jedoch die Überlebensdauer, nachgewiesen
(Giess et al., 2002b).
Eine in der Vergangenheit bereits durchgeführte Placebo-kontrollierte Studie bei ALS-
Patienten mit subkutaner Injektion von rekombinantem humanem CNTF führte nicht zu
einer Verbesserung der Mortalität. Nebenwirkungen wie Husten, Anorexie und
Gewichtsverlust traten gehäuft auf und führten häufig zum Therapie-Abbruch
(ALS Study Group, 1996).
Versuche an Ratten zeigten dann später, dass die Fusion von rekombinantem CNTF mit
einer Protein-Transduktions-Domäne volle neuroprotektive Aktivität ohne die oben
erwähnten Nebenwirkungen hat (Rezende et al., 2009).
Die zuvor genannten Ergebnisse legen insgesamt nahe, dass eine CNTF-Nullmutation
eine neurologische Erkrankung nicht verursacht. Ob diese Nullmutation allerdings in
die Ausprägung einer bestehenden Erkrankung eingreift, wird kontrovers diskutiert. Der
Einfluss des CNTF-Gens auf den Verlauf der SMA sollte dann proportional zur Anzahl
der vorliegenden Allele sein (Takahashi et al., 1996). Entsprechend ist bei den vier
homozygot mutierten Patienten in dieser Studie mit einer Verschlechterung der
klinischen Parameter zu rechnen. Es fällt auf, dass alle vier Patienten ein starkes Defizit
in der Muskelkraft aufweisen. Der Erkrankungsbeginn und die Überlebensdauer liegen
jedoch innerhalb der Werte der Vergleichsgruppe.
Es handelt sich um Einzelfalldarstellungen. Rückschlüsse auf den Verlauf im
Gesamtkollektiv können nicht ohne weiteres gezogen werden. In der späteren Kaplan-
Meier-Überlebenszeit-Analyse wird zudem kein Einfluss des CNTF-Genotyps auf
Erkrankungsbeginn und Überleben nachgewiesen. In einer vergleichbaren klinischen
Studie von Giess et al. (1998) wurden auch 6 Patienten mit autosomal-rezessiver SMA
4.3 Diskussion
54
eingeschlossen. Leider wies keiner dieser Patienten die Nullmutation auf. Ein Vergleich
mit unseren Daten ist daher nicht möglich.
4.3.2 CNTF-Genotyp-Frequenz im Bezug zum Hardy-Weinberg-Gleichgewicht
Diverse klinische Studien zum Thema CNTF zeigen, dass die Genotyp-Frequenzen von
gesunden Kontrollen und neurologischen Patienten sich nicht signifikant unterscheiden.
Die CNTF-Nullmutation ist also nicht ursächlich für die untersuchten neurologischen
Erkrankungen.
Bei den hier untersuchten SMA-Patienten unterschieden sich allerdings die
CNTF-Genotyp-Frequenzen in den einzelnen SMA-Gruppen. Eine Abhängigkeit der
Ausprägung der SMA vom CNTF-Status wäre als Erklärung möglich. Über einen sehr
gravierenden Einfluss auf die Ausprägung diagnostisch relevanter klinischer Parameter
wäre eine Verschiebung in den SMA-Typen möglich. Es wäre ein hoher Anteil
homozygoter Wildtypen in der SMA 3-Gruppe zu erwarten. Ein homozygot mutierter
Genstatus hingegen würde den Verlust der kompensatorischen Mechanismen bewirken,
so die klinischen Parameter verschlechtern und zu einer Herunterstufung in der SMA-
Typisierung in Richtung SMA 1 führen.
Die Analyse per Fischer´s exact test zeigt jedoch keine Assoziation der Merkmale
CNTF-Genstatus und SMA-Typ. Außerdem stellt sich die Umverteilung entgegen den
oben beschriebenen Erwartungen dar. So finden sich bei den SMA 3-Patienten weniger
homozygote Wildtypen (55,42%), als bei den schwerer betroffenen Patienten mit
SMA 1 und 2 (ca. 61%). Wider Erwarten liegt hier der Anteil der Heterozygoten bei den
SMA 3-Patienten mit 44,58 % höher als in den Gruppen SMA 1 (37,96 %) und SMA 2
(35,71%).
Nicht nur in der SMA 3-Gruppe, auch insgesamt scheint mit 39,49 % der Anteil der
Heterozygoten am Gesamtkollektiv hoch. Allerdings weisen die Ergebnisse aus
Untersuchungen an vergleichbaren europäischen Kollektiven eine große Spannbreite auf
(siehe Tabelle 16). Der Anteil von Heterozygoten reicht von 16,1 % bis 35,7 %. Der
Anteil der homozygoten Wildtypen reicht von 63 % bis 80,4 % (Giess et al., 1998;
Thome et al., 1996).
4.3 Diskussion
55
Tabelle 16: CNTF-Genotyp-Frequenzen in vergleichbaren europäischen Studien
Patienten Studie GG (%) AG (%) AA(%) n Multiple Sklerose-Patienten Hoffmann et
al. (2002) 74,8 22,3 2,9 349
Gesunde Kontroll-Patienten 71,7 26,5 1,8 434
Multiple Sklerose-Patienten Giess et al. (2002a)
unbekannt unbekannt 2,4 288
Gesunde Kontroll-Patienten De Mars et al. (2007)
76 21,5 2,5 490
Amyotrophe Lateralsklerose-Patienten
Giess et al. (1998)
73,5 25,5 1 98
Patienten mit Motoneuronen-Erkrankung
Giess et al. (1998)
80,4 16,1 1,9 56
Gesunde Kontroll-Patienten 69,8 27,0 3,2 126 Amyotrophe Lateralsklerose-Patienten
Orrell et al. (1995)
67 33 0 49
Gesunde Kontroll-Patienten Thome et al. (1996)
72,7 26,2 1,1 59
Neurologische Patienten 208 Psychiatrie-Patienten 63,0 35,7 1,3 297
Dennoch scheint der Anteil von Heterozygoten in unserem Kollektiv auch im Vergleich
mit diesen Zahlen hoch. Läge für das Allel A die in dieser Studie beobachtete Frequenz
0,21 zu Grunde, wären folgende Genotyp-Frequenzen laut
Hardy-Weinberg-Gleichgewicht zu erwarten: 12,5 homozygot Mutierte (4,5 %), 92,5
Heterozygote (33,5%) und 171 homozygote Wildtypen (62,0 %). Die tatsächlich
beobachteten Häufigkeiten weisen ein Defizit von homozygoten Wildtypen und einen
Überschuss von Heterozygoten auf (Abbildung 17). Dies führt zu einer signifikanten
Abweichung vom Hardy-Weinberg-Gleichgewicht.
4.3 Diskussion
56
Abbildung 17: Erwartete und beobachtete CNTF-Genotyp-Frequenzen
Ein ähnliches Abweichungsmuster mit Heterozygoten-Überschuss und einem Defizit an
homozygoten Wildtypen oder Nullmutanten wurde auch in anderen Studien
nachgewiesen. Eine signifikante Abweichung vom Hardy-Weinberg-Equilibrium lässt
sich bei zwei der in Tabelle 17 dargestellten Studien ebenfalls nachweisen.
Tabelle 17: Hardy-Weinberg-Equilibrium in vergleichbaren Studien
Studie Genotyp-
Verteilung ist Genotyp-
Verteilung soll Frequenz des Allels
A
p-Wert Haldane´s exact test
AA AG GG AA AG GG aktuelle Studie 4 109 163 12,5 92,5 171 0,21 <0,01
Takahashi et al. (1994) 9 140 242 18 132 241 0,22 0,04
Orrell et al. (1995) 0 17 32 1,5 13,5 34 0,17 0,37
Thome et al. (1996) 7 176 381 16 158 390 0,17 <0,01
Das Hardy-Weinberg-Gleichgewicht ist ein mathematisches Modell, welches die
Verteilung von Allel- und Genotyp-Frequenzen beschreibt. Dafür muss die untersuchte
Population bestimmte Voraussetzungen erfüllen: Sie sollte ausreichend groß sein und
ihre Individuen zufällige Paare zur Fortpflanzung bilden. Die Allelfrequenz sollte nicht
durch Geschlechtsassoziation oder Evolutionsfaktoren wie Selektion, Gendrift,
Genshift, Migration oder Mutation beeinflusst sein.
1,5%
39,5% 59,0%
4,5%
33,5%
62,0%
0,0%
10,0%
20,0%
30,0%
40,0%
50,0%
60,0%
homozygot Mutierte Heterozygote homozygote Wildtypen
Erwartete und beobachtete CNTF-Genotyp-
Frequenzen
beobachtet
erwartet
4.3 Diskussion
57
Verletzungen dieser Voraussetzungen können ein Abweichen vom Hardy-Weinberg-
Gleichgewicht verursachen. Außerdem kann ein Abweichen durch
Genotypisierungsfehler, Stratifizierung der Studienpopulation und eine Assoziation mit
anderen Faktoren hervorgerufen werden (Wigginton et al., 2005). Es wird generell
empfohlen, Genotypisierungsdaten auf das Hardy-Weinberg-Gleichgewicht zu
überprüfen, da dies als Qualitätskontrolle der Daten verwendet werden kann (Balding,
2006). Um Genotypisierungsfehler als Grundlage der Abweichung auszuschließen,
wurden in dieser Studie valide Labormethoden verwendet. In vielen Arbeitsgruppen
wird die CNTF-Mutationsanalyse mittels HAE III-Restriktionsverdau durchgeführt. Da
dieser in unserem Fall keine reproduzierbaren Ergebnisse lieferte, wurde die
Pyrosequenzierung verwendet. Die Reliabilität der Pyrosequenzierung wurde
nachgewiesen, indem stichproben-artig einzelne Genotypisierungen zur Bestätigung
intern und durch ein externes Labor wiederholt wurden. Ein Abweichen vom Hardy-
Weinberg-Equilibrium kann außerdem Ausdruck einer Assoziation des Nullallels mit
der Erkrankung sein. Allerdings wurde bereits in früheren Studien nachgewiesen, dass
die CNTF-Nullmutation nicht mit dem Auftreten einer SMA assoziiert ist. Ferner
konnte hier nachgewiesen werden, dass keine Assoziation mit dem Auftreten
bestimmter SMA-Typen besteht.
Eine weitere Erklärung liefert G. W. Orrell (1995) in der Diskussion seiner Ergebnisse.
Er vermutet als Ursache für das Defizit von homozygot Mutierten eine durch die
Nullmutation perinatal erhöhte Mortalität.
4.3.3 CNTF in Bezug auf die klinischen Parameter dieses SMA- Kollektivs
Ein wichtiger Aspekt dieser Studie ist die Analyse klinischer Parameter. Es wurden 27
verschiedene Parameter erfasst und ausgewertet.
Problematisch an der Erfassung klinischer Parameter ist, dass die Daten stark abhängig
von der Erfahrung des Untersuchers und der Mitarbeit des Patienten sind. Als weitere
mögliche Fehlerquelle ist die fehlende Standardisierung des Zeitpunkts für die
Erhebung des jeweiligen Kriteriums zu sehen. Somit sind jeweils frühe bis späte
Krankheitsstadien abgebildet. Außerdem wurden hier Daten aus ärztlichen
Befundberichten genutzt, die nicht den individuellen Gesamtverlauf abbilden konnten.
4.3 Diskussion
58
Diese enthalten teilweise nicht alle relevanten Informationen. Um die genannten
Probleme zu minimieren, wurden die einzelnen Ausprägungen der klinischen Parameter
nicht einzeln gegenüber gestellt, sondern in Gruppen zusammengefasst.
Exemplarisch sei dies am Parameter „Nutzung einer Atemhilfe“ verdeutlicht. Die
Angaben umfassten Sauerstoffgabe, Inhalation und CPAP als nichtinvasive Maßnahmen
und einer invasiven Respirator-Beatmung via Tubus oder Tracheostoma. Darüber
hinaus wurden noch Angaben gemacht über den Zeitpunkt der erstmaligen Anwendung
und die Anzahl der Anwendungen. Eine Einteilung nach den Gesichtspunkten invasive/
nichtinvasive Maßnahme, Dauer und Häufigkeit der Anwendung hätte zu extrem
kleinen Subgruppen geführt. Entsprechend wurden die Gruppen nicht nach Art der
Beatmung unterscheiden, sondern binär nach Einsatz von Beatmung „ja“ oder „nein“.
Auch für den Parameter „Muskelkraft“ wurde nicht nach den fünf Kraftgraden nach
Medical Research Counsil unterteilt, sondern die Patienten in den Gruppen
„verminderte“ oder „unauffällige“ Kraft zusammengefasst (Medical-Research-Council,
1976). Dabei gehen filigrane Unterschiede natürlich verloren und werden in der
statistischen Analyse nicht berücksichtigt. Die Vergrößerung der Subgruppen
andererseits führt zu einer Verbesserung der statistischen Aussagekraft.
Die Ergebnisse der statistischen Analyse können für die klinischen Parameter
folgendermaßen zusammengefasst werden: In der Gruppe der SMA 1-Patienten und
SMA 3-Patienten ist kein Einfluss des CNTF-Genotyps auf die Ausprägung der
klinischen Parameter festzustellen.
In der Gruppe SMA 2 besteht bei zwei Parametern ein signifikanter Einfluss. Bei
Patienten mit CNTF-Nullmutation wird eine Schwäche der Rumpfmuskulatur
signifikant häufiger beobachtet. Außerdem liegt bei Patienten mit CNTF-Nullmutation
ein gegenüber dem Wildtyp signifikant gehäuftes Auftreten von Zungenfibrillationen
vor.
Für die Überlebensdauer gibt es in Vergleichsstudien keinen Hinweis auf einen
Einfluss. Diese Erkenntnisse decken sich mit den Beobachtungen dieser Studie.
Die oben beschriebenen Erkenntnisse sollten allerdings kritisch interpretiert werden.
Aufgrund der Fülle von Parametern und damit verbundenen Analysen sollte hier die
Problematik des multiplen Testens berücksichtigt werden. Durch multiples Testen in
einer Stichprobe erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, dass ein signifikanter Unterschied
fälschlicherweise angenommen wird (α-Fehler). Das globale Signifikanzniveau wurde
4.3 Diskussion
59
auf α=0,05 festgelegt. Würde die Korrektur für multiples Testen nach Bonferroni
genutzt werden, müsste das Signifikanzniveau durch die Anzahl der durchgeführten
Tests dividiert werden. Hier würde dann α = 0,05 / 63 = 0,0008 gelten. Somit würden
nur noch drei anstatt sieben Tests signifikante Unterschiede nachweisen. Aufgrund des
explorativen Charakters dieses Studiendesigns ist dieses Vorgehen jedoch zu
konservativ.
Die weniger konservative Kontrolle der false discovery rate (FDR) erreicht mehr Power,
akzeptiert jedoch auch mehr falschpositive Aussagen (Benjamini & Hochberg, 1995;
Simes, 1986). Bei dieser Prozedur werden die p-Werte zunächst aufsteigend nach der
Größe sortiert. Dem kleinsten Wert wird der Rang 1 zugewiesen. α wird dann durch die
Anzahl der durchgeführten Tests dividiert und mit dem Rang des p-Werts multipliziert.
Der p-Wert sollte kleiner sein als das so errechnete Signifikanzniveau des jeweiligen
Ranges. Der höchste Rang, für den P < α gilt, bestimmt, für welche Ränge H0 abgelehnt
werden kann. Diesem Rang folgende Ränge (mit P > α) dürfen H0 nicht ablehnen. Alle
Ränge, die kleiner sind, dürfen H0 ablehnen, auch wenn P > α gilt.
Nach der Korrektur des Signifikanzniveaus wäre somit bei keinem der klinischen
Parameter ein signifikanter Einfluss von CNTF auf dessen Ausprägung nachzuweisen.
Für diese Studie sei dies beispielhaft in Tabelle 18 dargestellt:
Tabelle 18: Anpassung des Signifikanzniveaus mittels Simes-Prozedur
Rang 1 2 3 4 5 p-Wert <0,0001 <0,0001 0,0002 0,0023 0,02
α 0,0008 0,0016 0,0024 0,0032 0,0048 H0 abgelehnt ja ja ja ja nein
Aufgrund der Problematik des multiplen Testens kommt es zu Einschränkungen der
Aussagekraft der Ergebnisse. Im Rahmen einer explorativen Studie sollten die
Ergebnisse demnach nicht als signifikant benannt werden, sondern nur deren auffällig
kleine p-Werte beschrieben werden. So erlangte Erkenntnisse können folgend als
Indikator für das Potential weiterer Untersuchungen dienen. Die Parameter, die hier
auffällig geworden sind, sollten dann in einer Studie mit entsprechend angepasstem
Studiendesign und ausreichend großer Fallzahl gezielt erneut untersucht werden. Würde
4.3 Diskussion
60
CNTF als modifizierender Faktor identifiziert werden, könnten diese Information zur
Beurteilung der Prognose mit einfließen. Möglicherweise könnten sich daraus neue
Erkenntnisse für eine therapeutische Beeinflussung der SMA ergeben.
5 Zusammenfassung
61
5 Zusammenfassung
Diese Studie beleuchtet das Zytokin Ciliary Neurotrophic Factor als potentiellen
Modifikator des klinischen Verlaufs der spinalen Muskelatrophie.
Die autosomal-rezessive infantile spinale Muskelatrophie (SMA) ist eine häufige
neuromuskuläre Erkrankung. Die SMA wird durch homozygote Mutation des SMN1-Gens
verursacht, die zu einem Mangel an SMN-Protein führt. Dies hat nach heutigem
Kenntnisstand eine retrograde Denervierung der neuromuskulären Endplatte, eine axonale
Degeneration und schließlich den Verlust von motorischen Nervenzellen im Rückenmark und
Hirnstamm zur Folge.
Klinisch ist der Krankheitsverlauf der SMA sehr variabel. Es erfolgt daher anhand des
Erkrankungsbeginns und der erreichten motorischen Meilensteine eine Einteilung in die
Typen 1-3. Die SMA 1 ist durch einen akuten Verlauf mit Beginn in den ersten
Lebensmonaten und Versterben meist innerhalb des ersten Lebensjahres gekennzeichnet. Bei
der SMA 2 liegt ein früher Beginn in den ersten 18 Lebensmonaten vor. Die Patienten
erlangen nie die Fähigkeit frei zu gehen. Es folgt dann aber ein meist chronischer Verlauf mit
längerem Überleben bis ins Erwachsenenalter. Patienten mit einer SMA 3 haben eine kaum
eingeschränkte Lebenserwartung.
Als gravierendsten Einflussfaktor auf die klinische Verlaufsform wurde die Anzahl an
zentromerischen Kopien des SMN-Gens identifiziert. Dieses SMN2 genannte Gen
kompensiert teilweise den für die Erkrankung ursächlichen SMN-Proteinmangel.
Morphologisch und funktionell bedeutsam für den Krankheitsverlauf ist die Re-Innervation
der denervierten Muskelfasern durch das terminale Aussprossen terminaler Axone
benachbarter Motoneurone.
Das Zytokin Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF) ist in der Lage, eben diesen Vorgang zu
vermitteln. Eine mögliche Rolle als Einflussfaktor auf den klinischen Verlauf der SMA wird
daher insbesondere aufgrund von Ergebnissen im Mausmodell diskutiert. Einzelne Studien
zeigen einen signifikant früheren Erkrankungsbeginn bei MS- und ALS-Patienten mit CNTF-
Nullmutation. Hier wird erstmals ein großes humanes SMA-Kollektiv untersucht. Durch
einen SNP im CNTF-Gen liegt bei 1-3% der Bevölkerung eine homozygote Nullmutation
vor. Eine G/A-Transition an Position -6 des Spleiß-Akzeptors führt durch aberrantes
Splicen zu einem verkürzten und inaktiven Protein. Dies erlaubt es den Krankheitsverlauf
von SMA-Patienten mit und ohne CNTF-Protein zu vergleichen und so die Rolle von CNTF
5 Zusammenfassung
62
als Modifikator zu beleuchten.
In dieser Studie wurden 276 Patienten mit molekulargenetisch gesicherter SMA der Typen 1-
3 eingeschlossen. Die Kopienzahl des SMN2-Gens wurde durch Multiplex Ligation-
dependent Probe Amplification (MLPA) bestimmt. Die CNTF-Genotypisierung erfolgte
mittels Pyrosequencing. Zusätzlich wurden für den jeweiligen SMA-Typ spezifische
klinische Merkmale erhoben. Die statistische Auswertung umfasste 27 Merkmale, die
insbesondere die motorischen Funktionen einschlossen. Sie wurden per Fisher´s exact test
oder Kruskal-Wallis-Test analysiert. Die Parameter Überlebenszeit und Erkrankungsbeginn
wurden mittels Kaplan-Meier-Analyse untersucht.
Die CNTF-Genotypen verteilten sich wie folgt: 39,5% Heterozygote, 59% homozygote
Wildtypen und 1,5% homozygot Mutierte. Insgesamt tragen vier Patienten die CNTF-
Nullmutation. Sie gehören den Typen SMA 1 und 2 an. Es wurde ein auffälliger
Heterozygoten-Überschuss im Gesamtkollektiv festgestellt, der zu einem signifikanten
Abweichen der Genotyp-Verteilung vom Hardy-Weinberg-Gleichgewicht führte. Ähnliche
Verteilungsmuster sind aus der Literatur bekannt. Eine Erklärung gibt es hierfür nicht.
Als mögliche Ursache wäre denkbar, dass durch ein Fehlen von CNTF und dessen
Kompensationsmechanismen über die entsprechende Verschlechterung der klinischen
Parameter eine Verschiebung des SMA-Typen in Richtung einer niedrigeren Typ-Einstufung
erfolgt. Somit wären bei der SMA 3 vermehrt CNTF-Wildtypen zu erwarten. Eine
Assoziation von bestimmten CNTF-Genotypen und SMA-Typen konnte jedoch nicht
nachgewiesen werden.
In der Kaplan-Meier-Analyse zeigten sich für das Merkmal Erkrankungsbeginn signifikante
Unterschiede zwischen den SMA-Typen und der Anzahl der SMN2-Kopien. Hinsichtlich der
CNTF-Genotypen zeigte sich kein signifikanter Einfluss. Die Überlebensdauer der
SMA 1-Subgruppe unterschied sich signifikant nach SMN2-Kopienzahl, nicht jedoch nach
CNTF-Genotyp.
Die Analyse der Ausprägung der einzelnen klinischen Parameter wies in der Gruppe der
SMA 1-Patienten keinen Einfluss des CNTF-Genotyps nach. Auch in der SMA 3-Gruppe gab
es keine signifikanten Unterschiede in der Merkmalsausprägung zwischen den CNTF-
Genotypen. In der SMA 2-Gruppe zeigten sich für die Ausprägung der Merkmale
Zungenfibrillationen und Kraft im Rumpf auffallend kleine p-Werte. Ein bedeutsamer
Einfluss auf einzelne klinische Parameter innerhalb eines SMA-Typs ließ sich demnach nicht
nachweisen.
5 Zusammenfassung
63
Die Analyse der klinischen Parameter war durch kleine Stichprobengrößen erschwert.
Aufgrund des explorativen Charakters und der damit verbundenen Fülle an untersuchten
Merkmalen sollte eine Korrektur für multiples Testen erfolgen.
Insgesamt ergeben sich im Rahmen dieser explorativen Studie nur wenige Hinweise dafür,
dass bei der SMA der CNTF-Genotyp den klinischen Verlauf beeinflusst. Es sollten sich
jedoch weitere Studien anschließen, um mit einem entsprechenden Studiendesign gezielt die
hier auffällig gewordenen Parameter zu analysieren. Erst dann kann eine Bewertung erfolgen,
ob CNTF als Modifikator der SMA gilt und in Prognosestellung und Therapieforschung mit
einbezogen werden sollte.
6 Anhang
64
6 Anhang
6.1 Ergänzung zu Tabelle 8
Übersicht über die Subgruppen-Größe in der Analyse der einzelnen klinischen Parameter für
SMA 1-Patienten getrennt nach CNTF-Genotyp
Armstütz
CNTF-Status möglich nicht möglich homozygot Mutierte 1 0
Heterozygote 24 2 homozygot Wildtypen 37 3
Kopfkontrolle
CNTF-Status möglich nicht möglich gelegentlich homozygot Mutierte 1 0 0
Heterozygote 25 2 5 homozygot Wildtypen 39 5 3
Drehen des Körpers
CNTF-Status möglich nicht möglich homozygot Mutierte 1 0
Heterozygote 24 2 homozygot Wildtypen 37 3
Ernährungszustand
CNTF-Status normal reduziert
homozygot Mutierte 1 0 Heterozygote 21 14
homozygot Wildtypen 24 21
Trinkschwäche CNTF-Status vorhanden nicht vorhanden
homozygot Mutierte 0 1 Heterozygote 15 14
homozygot Wildtypen 18 20
6 Anhang
65
6.2 Ergänzung zu Tabelle 9
Übersicht über die Subgruppen-Größe in der Analyse der einzelnen klinischen Parameter für SMA 2-Patienten getrennt nach CNTF-Genotyp
Handtremor
CNTF-Status vorhanden nicht vorhanden
homozygot Mutierte 0 0 Heterozygote 4 5
homozygot Wildtypen 6 5
Kraft im Rumpf
CNTF-Status normal vermindert
homozygot Mutierte 1 0 Heterozygote 1 7
homozygot Wildtypen 0 14
Deformationen
CNTF-Status keine 1 Bereich 2 Bereiche 3 Bereiche
homozygot Mutierte 0 0 1 0 Heterozygote 5 5 5 0
homozygot Wildtypen 5 3 6 6
6.3 Ergänzung zu Tabelle 10
Übersicht über die Subgruppen-Größe in der Analyse der einzelnen klinischen Parameter für SMA 3-Patienten getrennt nach CNTF-Genotyp
Treppen steigen
CNTF-Status möglich nicht möglich homozygot Mutierte 0 0
Heterozygote 2 23 homozygot Wildtypen 1 22
Erlernen des Treppen Steigens
CNTF-Status normal verspätet homozygot Mutierte 0 0
Heterozygote 17 4 homozygot Wildtypen 16 0
6 Anhang
66
Erlernen des Stehens
CNTF-Status normal verspätet homozygot Mutierte 0 0
Heterozygote 21 1 homozygot Wildtypen 15 1
Erlernen des Gehens
CNTF-Status normal verspätet homozygot Mutierte 0 0
Heterozygote 21 6 homozygot Wildtypen 20 1
CNTF-Status
Alter bei der erstmaligen Rollstuhlbenutzung
n zensiert
Summe
homozygot Mutierte 0 - Heterozygote 12 0
homozygot Wildtypen 13 0 25 0
Rollstuhl-Nutzung nötig
CNTF-Status ja nein
homozygot Mutierte 0 1
Heterozygote 37 20
homozygot Wildtypen 45 19
Erlernen des Sitzens
CNTF-Status normal verspätet
homozygot Mutierte 1 1
Heterozygote 28 9
homozygot Wildtypen 22 6
6 Anhang
67
6.4 Ergänzung zu Tabelle 11
Übersicht über die Subgruppen-Größe in der Analyse der einzelnen klinischen Parameter im Gesamtkollektiv getrennt nach CNTF-Genotyp
Erlernen des Sitzens CNTF-Status normal verspätet
homozygot Mutierte 1 1 Heterozygote 28 9
homozygot Wildtypen 22 6 EMG-Befund
CNTF-Status unauffällig neurogen
homozygot Mutierte 0 0 Heterozygote 6 25
homozygot Wildtypen 4 28 Reflexstatus
CNTF-Status normal vermindert fehlend homozygot Mutierte 0 0 1
Heterozygote 1 17 51 homozygot Wildtypen 3 18 73
Zungenfibrillationen
CNTF-Status vorhanden keine homozygot Mutierte 1 0
Heterozygote 27 29 homozygot Wildtypen 50 28
Muskelbiopsie-Befund
CNTF-Status unauffällig Atrophie
homozygot Mutierte 0 0 Heterozygote 1 28
homozygot Wildtypen 2 27 Befund respiratorisches System
CNTF-Status unauffällig pathologisch
homozygot Mutierte 1 2 Heterozygote 51 32
homozygot Wildtypen 52 50
6 Anhang
68
Nutzung einer Atemhilfe
CNTF-Status ja nein homozygot Mutierte 0 3
Heterozygote 10 46 homozygot Wildtypen 21 42
Kraft in der oberen Extremität proximal
CNTF-Status normal vermindert homozygot Mutierte 0 3
Heterozygote 14 70 homozygot Wildtypen 7 106
CNTF-Status
Kraft in der oberen Extremität distal
normal vermindert homozygot Mutierte 0 3
Heterozygote 28 56 homozygot Wildtypen 21 92
CNTF-Status
Kraft in der unteren Extremität proximal
normal vermindert homozygot Mutierte 0 3
Heterozygote 2 86 homozygot Wildtypen 5 117
Kraft in der unteren Extremität distal
CNTF-Status normal vermindert homozygot Mutierte 0 3
Heterozygote 14 74 homozygot Wildtypen 17 106
6 Anhang
69
6.5 Ergänzung zu Tabelle 13
Übersicht über die Patienten-Anzahl und die Anzahl der zensierten Werte in den einzelnen Subgruppen der Kaplan-Meier-Analyse für den Parameter Erkrankungsbeginn
SMN-Status im Gesamtkollektiv
Erkrankungsbeginn
n zensiert
1 Kopie 6 1 2 Kopien 119 38 3 Kopien 94 49 4 Kopien 50 28 5 Kopien 1 0 6 Kopien 1 1
unbekannt 5 2
276 119 Summe
SMA-Typ im Gesamtkollektiv
Erkrankungsbeginn
n zensiert
SMA 1 137 44 SMA 2 56 34 SMA 3 83 41
276 119 Summe
CNTF-Status im Gesamtkollektiv
Erkrankungsbeginn
n zensiert
homozygot Mutierte 4 2
Heterozygote 109 36
homozygot Wildtypen
163 81
276 119 Summe
CNTF-Status bei SMA 1-Patienten
Erkrankungsbeginn
n zensiert
homozygot Mutierte 2 1
Heterozygote 52 12 homozygot Wildtypen
83 31
137 44 Summe
6 Anhang
70
CNTF-Status bei SMA 2-Patienten
Erkrankungsbeginn
n zensiert
homozygot Mutierte 2 1 Heterozygote 20 12
homozygot Wildtypen
34 21
56 34 Summe
CNTF-Status bei SMA 3-Patienten
Erkrankungsbeginn
n zensiert
homozygot Mutierte 0 0 Heterozygote 37 12
homozygot Wildtypen
46 29
83 41 Summe
6 Anhang
71
6.6 Ergänzung zu Tabelle 15
Übersicht über die Patienten-Anzahl und die Anzahl der zensierten Werte in der Subgruppen SMA 1-Patienten der Kaplan-Meier-Analyse für den Parameter Überlebensdauer
SMN-Status bei SMA 1-Patienten
Überlebensdauer
n zensiert
1 Kopie 6 3 2 Kopien 110 68 3 Kopien 18 15 4 Kopien 3 3
137 89 Summe
CNTF-Status bei SMA 1-Patienten
Überlebensdauer
n zensiert
homozygot Mutierte 2 1 Heterozygote 52 32
homozygot Wildtypen 83 56 137 89 Summe
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8 Danksagung
79
8 Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Frau Prof. Dr. med. Sabine Rudnik-Schöneborn für die
Bereitstellung des Themas dieser Dissertation und die Betreuung während der
Durchführung. Dies gilt ebenfalls für den Direktor des Instituts für Humangenetik Prof.
Dr. med. Klaus Zerres.
Ich danke Prof. Dr. rer. nat. Thomas Eggermann für die Betreuung der
Labortätigkeiten.
Auch den übrigen Mitarbeitern des Instituts für Humangenetik möchte ich dafür danken
mir jederzeit mit Rat und Tat zur Seite gestanden zu haben.
Ferner bedanke ich mich für die Bereitstellung von DNA und Daten.
Den Mitarbeitern des Instituts für Med. Statistik danke ich für das Nachsehen und die
Bemühungen um Verständigung zwischen Medizin und Mathematik.
Mein Dank geht auch an meine Familie, Kai, Bekannte und Freunde, die mich auf
verschiedenen Etappen mit Geduld und Zuspruch unterstützt haben.
9 Erklärung zur Datenaufbewahrung
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9 Erklärung zur Datenaufbewahrung
Hiermit erkläre ich, dass die dieser Dissertation zu Grunde liegenden Originaldaten
im Institut für Humangenetik des Universitätsklinikums Aachen hinterlegt sind.
10 Eidesstattliche Erklärung über den Eigenanteil
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10 Eidesstattliche Erklärung über den Eigenanteil
Hiermit erkläre ich, Frau Julia Hansmeier an Eides statt, dass ich folgende in der von
mir selbstständig erstellten Dissertation
„SMA-Studie: Der CNTF-Genotyp als potentieller Einflussfaktor auf den klinischen
Verlauf der infantilen spinalen Muskelatrophie“
dargestellten Ergebnisse erhoben habe:
Durchführung sämtlicher dargestellter Experimente, sowie deren statistische
Auswertung mit Einschränkung der unten dargestellten Hilfestellungen.
Bei der Durchführung der Arbeit hatte ich folgende Hilfestellungen, die in der
Danksagung angegeben sind:
- Bereitstellung der Patienten-DNA
- Bereitstellung einzelner Vorbefunde
Julia Hansmeier
Als Betreuer der obigen Dissertation bestätige ich die Angaben von Frau Julia
Hansmeier
Prof. Dr. med. S. Rudnik-Schöneborn