Pfliigers Archiv, Bd. 258, S. 230--242 (1953).

Aus dem Zoologische n Institut der Universitgt Graz.

(~ber die fermentative Verwandlung von Substanz P aus sensiblen Neuronen in die Erregungssubstanz

der sensiblen Nerven. Von

KARL UMRATH.

Mit 1 Textabbildung.

(Eingegangen am 4. Mai 1953.)

Einleitung. LoEva und HELLAUER 12 haben gefunden, dal~ die sensiblen Nerven

kein oder nur sehr wenig Acetylcholin enthalten. UMRAT~ und HELLAV- ~R 17 konnten in Degenerationsversuchen am Nervus opticus zeigen, dab nach Durchschneidung des Nerven das Acetylcholin im zentralen Smmpf zu~immt, wghrend die Erregungssubstanz der sensiblen Nerven dort abnimmt. Das wenige Aeetylcholin im Opticus gehSrt also eholinergen Fasern an, deren ZellkSrper beim Kaninchen in den vorderen Vierhiigeln liegen, und nicht den sensiblen Fasern, deren ZellkSrper in der Netzhau~ liegen.

Die sensiblen Nerven haben, wie HELLAUE~ und U~ATH 9 zeigten, eine eigene Erregungssubstanz, die sich am denervierten Kaninchenohr durch eine Cal0illarerweiterung und die dami~ verbundene l%Stung nach- weisen lgBt. Diese Substanz scheint auch in Neuronen des Zentralnerven- systems vorzukommen, die im ehemischen Sinn sensibel sind. HELLAgER s (1953) hat dann gezeigt, dab yon don Rfickenmarkswurzeln nur die sensiblen, dorsalen diese Substanz enthalten, w~hrend die geringe Wirk- samkeit yon Ext rak ten aus ventralen Riiekenmarkswurzeln am dener- vierten Kaninchenohr auf einer unspezifischen Substanz beruht, die mit den EiweiBkSrloern fiillbar ist. Dabei waren unsere Extrakte so hergestellt, dab sie mSglichst wenig unspezifische, auch in den ventralen Riieken- markswurzeln vorkommende, ealoillarerwei~ernde Stoffe enthielten.

Besonders wichtig ersehien uns immer der Naehweis, dab die Er- regungssubstanz der sensiblen Neurone durch ein Ferment abgebaut wird, das nur im Nervensystem und da vorwiegend in sensib]en Neuronen vorkommt~ (HV, LLAUE~ unCl U ~ A T g 9 und U~RAT~ und HELLAVER~6). DaB cliese Erregungssubstanz der sensiblen Neurone auch der ~ber- ~ragung an zentralen Synapsen dient, geh~ vor allem daraus hervor, dab sieh ihr fermentativer Abbau dureh Kramlofgifte hemmen lgBt, wobei,

Uber die fermentative Verwandlung yon Substanz P. 231

wie HELLAUEI¢ und UMlCATI~ 1° und U~mAT~ 15 gezeigt h~ben, die krampf- auslSsende Wirkung dieser Gifte der fermenthemmenden durchaus parallel geht. In diesem Zusammenhang sei erw~hnt, dal~ nach BR~MEI~ und B O ~ T 2 die Krampfgifte die synaptischen Potentiale an den Moto- neuronen vergr51~ ~rn und dab A])I~IA~ und Mo~czzI 1 auf Grund elektri, scher Untersuchungen an der GreBhirnrinde vermuteten, dal~ die Kraml0fgifte dutch die Hemmung des fermentativen Abbaues einer Er- regungssubstanz wirken.

Die yon EULEI¢ und GADDUM 4 entdeckte Substanz P kommt haupt- si~chlich im Darm und im Nervensystem vor. LEMBlSCX 11 glaubt, dab sie hier vorwiegend in sensiblen Neuronen vorkommt, er fand beim l~ind in den dorsalen Rfickenmarkswurzeln etwa 10Inal soviel P wie in den ventralen. P]~l~OW 13 fand beim Hund aueh in cholinergen Nerven be- tr~ehtliehe Mengen yon P, in den ventralen l~fickenmarkswurzeln etwa halb soviel wie in den dorsalen.

Ieh hatte mir, unter dem Eindruck der Befunde yon L]~MB~CX 11, vor- genommen zu untersuchen, ob sich die Substanz P a u s Darm yon der aus Nervensystem unterscheidet und ob die letztere mit der Erregungs: substanz der sensiblen Nerven zusammenhgngt. Die Untersuchung war mir dureh die Entdeckung eines Fermentes mSglich, das die Substanz P in vitro auBerordentlieh raseh abbaut und das wahrscheinlich in r ive eine wichtige l~olle sl0ielt. Die ersten Versuche habe ich gemeinsam mit Herrn Dr. LEMBECK durehgeffihrt, als er mir Einblick in seine Untersuchungen gewghrte. Ich danke ihm auch hier ffir dieses freundliche Entgegen- kommen bestens. Die ersten Ergebnisse dieser Fermentversuche sind sehon bei I~EMB]~OK 11 und bei HV~I, LAVE1V knrz erw~hnt.

Im Laufe der vorliegenden Untersuehung hat sich allerdings gezeigt, daI~ die Substanz P bei KrSten in den ventralen Rfickenmarkswurzeln in nicht viel geringerer Menge vorkommt als in den dorsalen. Nach all dem enthalten bei manchen Tieren auch cholinerge Nerven betriichtliche Mengen yon P. Dieses scheint sich abet in maneher Beziehung ab- weichend yon dem anderer Herkunft zu verhalten. Eine Untersuchung fiber die Beziehung yon Pans cholinergen/qerven zum Acetylcholin ist im Gange.

Methodik: Die P-haltigen Extr~k~e wurden durch kurzes Kochen der hSchstens grob zer-

stiickelten Gewebe in der dreifachen Menge einer LSsung yon 0,65% NaC1 und 0,01~o CaCI~ hergestellt. Die l~iickenmarkswurzeln wurden nach der Entnahme gar nicht mehr zerkleinert, Gehirn und lZfickenmark nach dem Kochen noch etwas zerdrtickt, :Nerven meist der Lange nach aufgespalten. Veto lgind habe ich t~iicken- markswurzeln, l~iickenmark lind Dfinndarm extrahiert, veto Meerschweinchen Gehirn mid Dfinndarm, yon KrSten ~Ierven und t~fickenmarkswurzeln. AnBerdem stand mir durch die Freundlichkeit yon Herrn Prof. UL~ S. v. EvL~I~ eines seiner gereinigten P-Pri~parate aus Pferdedarm mi* 4 E pro Mflligramm zur Verfiigung,

232 K. UM~_¢Tm

das allerdings im Vergleich zu den reinsten Pri~paraten yon P ~ . ~ o w la mi t 3000 E pro Milligramm als noch sehr unrein bezeichnet werden m u l l

Die Best immung der Substanz P erfolgt an isolierten Stricken des I leum yon Meerschweinchen in luftdurchperl ter Tyrodel6sung bei 39 ° C. Zur Aussehaltung yon Acetylcholin und His tamin enthiel t die TyrodelSsung Atropin 10 .8 und Neoantergan 10-% Zur Ausscttaltung der Wirkung des Acetylcholins der Ext rak te h~gte auch Atropin 10 -~ genfigt. Einige darauf gerichtete Versuche zeigten, dab Atropin in dem ganzen Bereich yon 10 .7 bis 10 - t die P-Wirkung sehr wenig beeinfluBte. Nur in den ersten Minuten naeh dem Wechsel der Atropinkonzentra t ion im Darmbad war die P-Wirkung meist herabgesetzt. Genauere Vergleiehe yon P-hal t igen Ex- trakgen verschiedener Herkunf t zeigten, dal3 durch hohe Atropinkonzentra t ionen die Ext rak te aus Nervensystem einsehlieBlich derjenigen aus ventra len und dor- salen Rfiekenmarkswurzeln yon Kr6ten, relat iv etwas an Wirksamkei t gewannen, w~hrend durch niedrige Atropinkonzengration die Ext rak te aus Darm und das Pr/~parat yon v. EVLER aus Darm relativ wirksamer warden.

Beim Test der Subsganz P wurden yon den P-hal t igen LSsungen Meine Mengel~ der den Darm umgebenden TyrodelSsung zugesetzt. Zur Feststel lung des fermenta- given Abbaues auf die H~lfte wurden die durch eine best immte Extrakgmenge zu verschiedenen Zeiten des Abbaues ausgelSsten Kont rak t ionen mi t denjenigen ver- gliehen, die durch die halbe Menge des Ext raktes ohne Ferment ausgel6st wurden.

Die Testung der Erregungssubstanz der sensiblen Neurone erfolg~e naeh HEL- LAU]~ U. U~AwJ~9 und UN~Aw~ u . HELLAUER 16 an Kaninehenohren, deren Nervus auricularis magnus durehsehni t ten worden war. ]4 Tage nach der Operation sind die mitgleren Part ien der Ohren ffir die Erregungssubstanz der sensiblen Nerven fiberempfindlieh, w/~hrend ihre Empfindlichkeit fiir andere Substanzen abgenommen hat . Zum VergMeh zweier Ex t rak te injizierte ieh meist den einen in das linke Ohr oben und in das reehte unten, den anderen in die korrespondierenden Stellen des jeweils anderen Ohres. Nur bei den Ex t r ak t en aus Kr6tennerven babe ieh oft wegen d e r n u r geringen verffigbaren Menge an jedem Ohr nur eine In jekt ion angebracht. Ex t rak te 1:4 aus dorsalen Rfickenmarkswurzeln vom l~ind bedingen eine starke RStung durch Capillarerweiterung, die etwa 15--25 rain naeh der In jekt ion maximal ist. Nine Verdi innung soleher Ext rak te auf das 2, 4 und 8Iache ist je als deutliche Abstufung in der RSgung zu erkennen, die Verdfinnung auf das 16faehe bildet die letzte Stufe, die niehg mehr oder nicht mehr starker als RlZgOEg-LSsung r6tet. Diese Stufen wurden yon U~a:aAw~I u. H~LLAVJ~ TM mit 0 bis 4 bezeiehneg. Bei Ex t rak ten 1:4 bedingen dorsale Rfickenmarkswurze]n yore Rind im allgemeinen RStungs- stufe 4, gemisehte Saugetiernerven, enssprechend ibrem geringeren Gehalt an sen- siblen Fasern, 3, KrStennerven 1.

Als einen zweiten Nachweis der Erregungssubstanz der sensiblen Nerven habe ich die Eintropfung ins menschliche Auge verwendet, wo sie einen meist leieht brennenden Sehmerz an der Hornhaug auslSst (Um~AT~X~). Der Naehweis ist inso- fern spezifisch als ieh 1~ gezeigt habe, dab dieser Schmerzeffekt den Ex t rak ten aus vent ra len Wurzeln nieht in der Weise zukommt und dub er in den Ex t r ak t en aus dorsalen Wurzeln beim f e m e n t a t i v e n Abbau der Erregungssubstanz der sensiblen Nerven oder bei Abbau dureh Kochen bei alkaliseher Reakgion versehwindet. Ieh habe yon zwei zu vergleiehenden Ex t r ak t en einigen Versuchspersonen in jedes Auge einen E x t r a k t eingetropft, ohne dab sie fiber den zu erwartenden Unterschied orien- t ier t waren, und dann gefragt, welehe Eintropfung deutlicher zu bemerken bzw. welehe etwas brennend sehmerzhaft war. Es gibt, wie ieh sehon aus meiner ersten Unter- suchung 1~ weiB, Versuehspersonen, welehe eine solche Entscheidung besonders leieht u n d sieher treffen. So welt es m6glich war habe ieh reich besonders dieser bedient. Nine Probe habe ich immer in entsprechender ~¥eise an mir ausfiihren lassen.

Uber die fermentative Verwandlung yon Substanz P. 233

Die FermentlSsung zum Abbau der Substanz P habe ich meist aus Teflen des ~Tervensystems hergestellt, nur gelegentlich auch aus Darm oder aus Leber. Das sterfl entnommene Gewebe wurde sterfl in einer Reibscl~ale Zerrieben und mi$ der 100fachen Menge bikarbonatfreier, ffoschisotonischer l~I~Gn~-L5sung aufgenom- men. Ihre hohe Wirksamkeit erreichten die Fermentl5sungen erst dutch eine In- kubation, die ich durch 16--18 Std bei 33 ° C durchgeffihrt habe. Den fermentativen Abbau h~be ich bei Zimmertemperatur yon 20--22 ° C vorgenommen und dazu der P-haltigen LSsung meist 0,1 ihres Volumens FermentlSsung zugesetzt, so dab diese in Bezug auf dus rob zerriebene Gewebe 1:1000 verdiinn~ war. Wenn der Abbau ureter diesen Umst~nden so rasch erfolgte, dab er sich zeitlich nicht mehr verfolgen liel~, hube ich der P-haltigen LSsung nut 0,02-ihres Vohmens FermentlSsung zu- gesetzt, so dab diese schlieBlich 1 : 5000 verdfinnt war.

Fermentextrakte, die durch Inkubation wirksam geworden waren, verloren ihre Wirks~mkeit bei Aufbewahrung dutch 15 Tage im Kiihlschrank nicht. Bei Zimmertemperatur hielten sie sich bei ur/verminderter oder sogar etwas zunehmen- tier Wirksamkeit bis zu 9 Tage. Halbstfindiges Erw~rmen auf 56 ° C wurde in den ersten Tagen oft ohne Wirks~mkeits~bnahme, mRunter sog~r bei geringer Wirk- samkeitszunahme ertragen.

Je ein Versuch mi$ halbstfindiger Erw~rmung zeigte bei 70 ° C noch keine Wirk- samkeitsabnahme, bei 80 und 90 ° C aber eine gewisse Wirksamkeitsabnahme der FermentlSsung. Kurzes Aufkochen zerstSrte die Fermentwirkung.

El~v~rmen durch 3 Std auf 56 ° C oder durch 1t/2 S~d auf 70 ° C vor der Inku- ba$ion verminderte die Wirksamkeit, dasselbe Erwgmen nach der Inkubation verminderte sie nicht. Inkubation durch 16 Std bei 56 ° C lieferte FermentlSsungen yon guBerst geringer Wirksamkeit. Nach 8 Std bei Z.immertemperatur und 16 Std bei 33 ° C hatten sie wesent]ich an Wirksamkeit zugenommen, standen aber einem Ferme~/textrakt noch nach, der nach der normalen Inkubation bei 33 ° C durch 16 Std bei 56 ° C gehalten worden war.

]]rgebnisse.

Der A bbau der Substanz P mit inlcubiert gewesener Fermentl6sung.

Frisch hergestel l te Ferment lSsungen h a t t e n nur eine verhgltnismgl~ig

geringe Wirkung ; mi tun te r war bei solchen aus dorsalen Rfiekenmarks-

wurzeln in der Verdf innung 1 : 1000 an P-hal t igen E x t r a k t e n aus Nerven-

sys tem und an solehen aus D a r m auch nach 40 rain kein Abbau zu er-

kennen. Bei Aufbewahrung durch einige Tage im Ki ih lschrank bei -~ 2 ° C

nahmen die Ferment lSsungen nicht wesentl ich an Wirksamke i t zu, eine

nachfolgende i n k u b a t i o n war normal wirksam.

Meist habe ieh die Ferment lSsungen erst nach einer 16--18 stfindigen

Inkuba t i on bei 33°C untersucht . Ferment lSsungen aus dor sa len u n d

solehe aus ven t ra len Rf ickenmarkswurze ln v o m R i n d waren ungefahr

gleich wirksam und bau ten in der Verd i innung 1:1000 E x t r a k t e 1 :4 aus

Gehirn oder aus dorsalen Ri iekenmarkswurze ln meist in 1 - - t ~ min auf

die Hgl f te der urspri ingl ichen Wirksamke i t ab, E x t r a k t e aus D a r m yore R i n d oder Meerschweinchen und LSsungen des P-Pr~pura tes yon v. E v -

LER mi t 4 E pro mg in etwa 3 rain. E in gelegentl ich hergeste l l ter Fe rmen t - ex t r ak t aus l~ i i ekenmark v o m l~ind war ghnlich wirksam. Fe rmen t -

ex t r ak te aus Meerschweinchengehirn waren meist etwas wirksamer, so

234 K. UM~XT~:

dalt bei ihnen in der Verdfinnung 1 : 5000 ungef~hr dieselben Abbauzeiten zu beobachten waren, wie ieh sie eben far die Fermentextrak~e ans Rfiekenmarkswurzeln in der Verdfinnung 1:1000 erw~hnt babe. Far- mentextrakte aus dem Nervus ischiadieus yon Meerschweinchen waren oft etwas weniger wirksam wie die aus dorsalen Rfickenmarkswurzeln, wahrscheinlich wegen ihres gr61]eren Gehaltes ~n bindegewebigen ttfillen. Ein gelegentlich hergestellter Fermentextrakt aus Rinderdsrm war ghnlich wirksam, zwei Fermentextrakte aus Meerschweinchenleber waren auff~llend wenig wirksam, der wirksamere hat in der Verdfinnung 1 : 1000 einen Extrakt aus dorsalen Rfiekenmarkswurzeln in ]0 rain, einen aus Darm in 35 min auf die ttglfte abgebaut.

An bei Zimmertemperstur slternden Fermentextrakten aus Rficken- msrkswurzeln habe ieh, einmal schon am 2. Tag, einmal erst am 10. Tag nach der tterste]lung, beobaeh~et, dal~ bei noch unverandertem Abbau P- haltiger Extrakte aus Nervensys~em, also in der Verdfinnung 1 : 1000 in etws 11/? min aufhalbe Wirksamkeit, der Abbau P-hsltiger Dsrmextrakte sehr verlangssmt war, so dal3 ihre Wirksamkei~ stats in 3 min erst in 15 30 rain auf die H~lfte abgebaut war. Ebenso langsam wurde such eine LSsung des aus Dsrm gewonnenen t?-Prgparates mit 4 E pro mg ab- gebaut. An Fermen~extrakten, die diese Alterungserscheinung noch nicht zeigten, konnte ieh sie mitunter durch halbstfindiges Erwgrmen suf 56 ° erzeugen, einmal sehr deutlich bei einem 9 Tage alten Fermentextr~kt. Als B~ispiel ffihre ich einen 10 Tage alten Fermentextrakt aus ventralen Rfickenmarkswurzeln an, der in der Endverdfinnung 1 : 1000 Extrakt sus dorsalen Rfickenmsrkswurzeln 1 : 4 in etwas fiber 1 min anf die It~lfte der Wirksamkeit abbaute, einen Ext rsk t aus Darm 1:4 und einen noch 5fsch verdfinnten, also ] : 20, in 14 rain und in ebenfalls 14 rain eine LSsung des Pr~parates yon v. EVLER. Der Versuch zeigt auch, dal~ in dem in Frage kommenden Bereich die Substratkonzen~ration ohne wesentlichen Ein- fluB auf die Geschwindigkeit des Abbaues ist.

Nach den besprochenen Versuchen fiber den raschen fermentativen Abbau hslte ich die Substsnz P aus Nervensystem far verschieden yon der aus Darm. Far diese Auffassung spricht auch die yon P~s~Now 13 bei den letzten yon ibm angewandten Reinigungsschritten beobachtete grSl~ere Labilit~t der Substanz P aus Nervensystem.

Der rasche fermentative Abbau der Subst~nz P ~ns Nervensystem l ~ t sieh dnrch Strychnin, auch in der Verdfinnung 1:1000, nicht hemmen und unterseheidet sieh auch dadureh yon dem viel langsameren fermentstiven Abbau der Erregungssubstanz der Sensiblen Nerven, der durch Stryehnin 1 : 10000 praktiseh vo]lkommen gehemmt wird.

Die meist sehr geringe Darmwirksan~keit in den Extrak~en aus ventralen Rfiekenmarkswurzeln yore Rind babe ieh in einigen F~llen fermentativ abzubauen versucht. Bei der such sonst angewandten

Uber die fermentative Verwandlung der Substanz P. 235

Fermentverdfinnung 1 : 1000 war meist keine oder nut eine sehr geringe Wirksamkeitsabnahme festzustellen, etwa in 40 rain um 1/3, Fiir Extrakte aus KrStennerven ist anzunehmen, dab ungefEhr ihre halbe P-Wirkung aus cholinergen Fasern stammt, denn die ventralen Riickenmarks- wurzeln der KrSten haben fast ebensoviel P-Wirkung wie die dorsalen. Dementsprechend erfolgte der Abbau in Extrakten aus Kr6tennerven 1 : 4 bei der Fermentverdiinnung 1 : ]000 auch in 40 min nur auf die halbe P- Wirkung.

Nach diesen Befunden halte ich die Substanz P der cholinergen Neurone ffir verschieden yon der der sensiblen Neurone. Daffir, dab in cholinergen Neuronen fiberhaupt eine P-Wirkung anzunehmen, ist, spricht auch folgendes. FLORE¥ 8 hut gefunden, dal~ die t ' -Wirkung am Darm nur bei schwach alkalischer Badel6sung zu beobachten ist, nicht in ungepufferter TyrodelSsung bei schwach saurer t~eaktion. Ich habe Extrakte aus Darm, aus dorsalen und aus ventralen Riickenm~rkswur- zeln aufihre P-Wirkung am'Darm in gepufferter, schwach alkalischer und in ungepufferter, sehwach saurer L6sang untersucht. Im sauren Bad war die Wirkung der Darmextrakte and die .der Extrakte aus dorsalen l~iickenmarkswurzeln sehr stark vermindert, aber auch die Wirkung der Extrakte aus ventralen Rfickenmarkswurzeln war oft deutlich vermin- deft, so dab die Wirkungen der Extrakte aus den beiderlei Rficken- markswurzein nut wenig verschieden waren.

Ein fermentativer Abbau der Substanz P wurde schon yon v. EC~E~ 3 mit Trypsin durehgefiihrt und yon G~L~I~G 7 mit einem Ferment, alas er ~us Darm and aus Stammganglien des Gehirns gewinnen konnte, aber nicht aus Riickenmark. Ob P yon verschiedener Herkunft dutch diese Fermente versehieden rasch abgebau~ wird, seheint nicht untarsueht worden zu sein.

Die Entstehung von Erregungssubstanz der sensiblen Nerven in P-haltigen Extrakten dutch inkubiert gewesene Fermentl6sung.

Die Entstehung der Erregungssubstanz der sensiblen Nerven mul3te am leiehtesten in einem Extrakt n~chweisbar sein, der vor der Ferment- einwirkung wenig yon dieser Erregungssubstanz und viel Substanz P ent- hielt. Einen solchen ]iefern die KrStennerven; ihre Extrakte 1 : 4 bewirken am denervierten Kaninchenohr nur eine RStung yon Stufe 1 und haben damit nut etwa 1/s der Menge an sensibler Erregungssubstanz wie so]che yon dorsalen Rfickenmarkswurzeln yore Rind mit RStungsstufe 4. Die P-Wirkung in Extrakten aus Kr6tennerven ist dabei reichlich doppelt so grog wie in solchen aus dorsalen gfickenmarkswurzeln yore Rind, wobei allerdings in den Kr6tennervenextrakten nur die H~lfte der P-Wirkung durch das inkubiert gewesene Ferment abbaubar ist. Tats/~chlich konnte ich in den Extrakten aus Kr6tennerven und nur in diesen die En~stehung der Erregungssubstanz der sensiblen Nerven auf folgende einfache Art nachweisen :

236 K, U ~ A ~ :

Ich habe aus K r S t e n n e r v e n dureh Kochen e inen E x t r a k t 1 :4 her- gestellt, naeh 40 rain die Ne rven daraus entfernt , S t rychn in 1 : 10000 zu- gegeben u n d den E x t r a k t in zwei gleiche Teile geteilt. Der eine Teil er- hiel t i nkub ie r t gewesenes F e r m e n t I : i 0 0 0 u n d wnrde 40 rain nachher gekocht, der andere Teil erhielt in Yersueh 1 ke inen Zusatz, in den ¥e r - suehen 2 - - 6 du tch Koehen inakt iv ier tes tJerment 1 : 1000. i m I t o r n h a u t - tes t am menschl iehen Auge ist das F e r m e n t selbst n ieh t sehmerzaus- 15send, dg m a n du tch frisches t~erment aus dorsMen Ri ickenmarks- wurzeln in h6herer Konzen t r a t ion , ohne St ryehninzusa tz , in E x t r a k t e n 1 : 4 aus dorsalen Ri ickenmarkswurze ln vom R i n d die Er regungssubs tanz der sensiblen N e r v e n a b b a u e n u n d dami t die I t o r n h a u t w i r k u n g be- seit igen k a n n ( U ~ A ~ 1 4 ) . I m Test am K a n i n c h e n o h r wirkt das ]~erment selbst in der hier angewand ten Verd i innung aueh nicht , in h6herer K o n z e n t r a t i o n vers tgrk t es al lerdings die R S t u n g etwas.

Die Versuehssrgebnisse s ind in Tab. 1 zusammengeste l l t , m a n sieht, dag die mi t F e r m e n t behande l t en E x t r a k t e a in denerv ie r ten Xan inchen- ohr im Durehsehni t t eine I~Stungsstufe mehr ergeben, also etwa doppelt so viel Er regungssubs tanz der sensiblen Nerven entha l ten , als die E x t r a k t e ohne Fermente inwi rkung . Von im ganzen 13 Tes ten an K a n i n c h e n waren

Tabelle 1. Wir~amke i t yon KrStennervenextra~ten 1:4, a) nach Einwirkung yon Ferment 1:1000 dutch 40 Miniten, b) in Versuch I ohne ~'erment, in Versuch 2 - - 6 mit durch Kochen

inaktiviertem Ferment 1:1000.

I, An der menschlichen ttornhaut R6tungsstufeu a m Kaninchenohr I + schmerzhaft, -- nicht schmerzhaft Versuchs- t

hummer a) mit b) ohne a) mit b) ohne

~ermentwirknng :~ermentwirl~ng

1 2 1 2 1

2 2 1 2 1 1 1

3 1 0

4 2 1

4* ] ]

4* 1 1

5 2 l 2 1

6 2 1 -- - - 2 0

* Kaninehenohren erst vor 10 Tage~ denerviert, daher fiir die Erregungs- subst~nz der sensiblen Nerven noch nicht maximal empfindlich.

0bet die fermentative Verwandlung yon Substanz P. 237

nur bei dreien keine I~5tungsunterschiede zu erkennen und yon diesen betreffen zwei Kaninchen, deren Ohren ers~ vor 10 Tagen denerviert worden waren und deshalb fiir die Erregungssubstanz der sensiblen Nerven noch nicht roll empfindlich waren. Eine Woche spgter waren in Versuch 5 an denselben beiden Kaninchen deutliche RStungsunterschiede zu erkennen, mit einer st~rkeren Wirkung der Extrakte mit Ferment- einwirkung. An der menschlichen Hornhaut war der I(rStennerven- ex~rakt mit Fermenteinwirkung immer deutlicher zu empfinden bzw. schmerzhafter als der andere. In Versuch 6 war der Strychninzusatz Un~erblieben. Er war wohl iiberhaupt wegen der hohen Verdfinnung und kurzen Einwirkungszeit des FermenSes kaum yon Bedeu~ung, weft ein fermentativer Abbau der Erregungssubstanz der sensiblen Nerven nicht so rasch in merklichem Ausmal~ erfolgt. In zwei Versuchen der Tab. 1 habe ich durch Versuche am ~eerschweinchendarm festgestellt, dal3 durch die Fermentwirkung die P-WirksamkeR auf etwa 1/2 abgenommen haste. Im ganzen zeigen die Versuche der Tab. 1 eine sichere Zunahme der Erregungssubstanz der sensiblen Nerven bei der Fermenteinwirkung.

In Extrakten aus dorsalen Riickenmarkswurzeln yore t~ind lieB sich bei solchen Versuchen keine RStungszunahme am Kaninchenohr er- kennen, weil sie schon yon vorneherein einen sehr hohen t~Stungsgrad bedingten. Da HE~nAVE~ s gefunden hat, daI3 sich in diesen Ex~rakten durch Kochen bei alkalischer Reaktion die Erregungssubstanz der sensiblen Nerven leicht+r z~rstSren lgl]t als die Substanz P, bin ich folgenderma~en vorgegangen:

Ich habe einem Extrak~ aus dorsalen Rtickenmarksw-arzeln 1:4 Strychnin !:10000 zugese~zt und in zwei Eprouvetten je 4 cm s yon ibm eingebracht. Dann habe ic h einer Eprouvette 0,2 ems ~ n NaOH zugesetzt, sie far 10 rain ins koehende Wasserbad gebracht, darauf nnter der Wasserleitung gektihlt und mit ~ n tiC1 neutralisiert. Darauf babe ich beiden Eprouvetten inkubiert gewesene Ferment- 15sung zugesetzt, so da~ diese in der Endverdtinmmg 1 : 4000 durch 40 rain einwirl~e. Dabei wurde, wie Kontrollversuche zeig~en, die Darmwirksamkeit weitgehend zer- st6rt. Zur Unterbrechung der Fermentwirkung habe ich die Eprouvetten fiir 3 rain in kochendes Wasser getaucht und dana in kaltem Wasser wieder abgektihlt. Schliel]lich wurde mit der zweiten Eprouvette der Na0H-Zusatz, das 10 rain lange Einbringen ins kochende Wasserbad, das Abktihlen und das Neutralisieren in genau derselben Weise durchgeftihrt, wie es Anfangs mit der ersten geschehen war.

Ich habe 3 solche Versuche ausgef/ihr~ und je@n an zwei Kaninchen getestet. Von den im ganzen 12 Vergleichen zwischen links und rechts zeig~en 9 einen nicht sehr gro~sn aber deutlichen Unterschied in dem Sinn, dab der zuerst bei alkaliseher Reaktion .gekochte und dann mit Ferment behandelte Extrak~ der wirksamere war.: IIi einem Yergleich war der Unterschied in diesem Sinn nur gering, in den zwei iibrigen war kein Unterschied festzustellen, Wenn das Ferment die Substanz P in die Erregungssubstanz der sensiblen Nerven verwandelt, 'welche dutch Kochen bei alkalischer Reaktion leichter zerstSrt wird, so mul~, in tJ-ber-

238 K. UM~T~ :

einstimmung mit dem experimentellen Ergebnis, mehr Wirksamkeit am Kaninehenohr fibrig bleiben, wenn die ti 'ermentwirkung erst naeh dem Koehen bei alkMischer t~eaktion stat~findet .

Versuche an degenerierenden Nerven.

Ieh babe an Meerschweinchen einen Ischiadicus durchschnitten, die Tiere zu verschiedener Zeit nach der Operation getStet, aus beiden Nerven steril FermentlSsungen l :100 hergestellt und diese fiber Naeht, etwa 18 Std, bei 33 ° inkubier~. Die Wirksamkeit dieser beiden Ferment - 15sungen wurde am P-Abbau in Ex t rak ten aus dorsalen l~fickenmarks- wurzeln oder aus Gehirn getestet, indem die Mengen der zugesetzten

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O 7 2 3 ~ 5 6 7 8 S 70 N 72 73 Z4 75 ?~ge noch #er #efven#~rc/isc/zne/d~n]

i b b . 1. Gehal~ des degenerierenden Nerven ~n Sub- s~anz P ( . . . . . P), un Ferment , das P ~bbaut (o _ _ / v ) und an Erregungssubstanz der sensiblen Nerven

+ - E) in Prozenten des Gehaltes des normalen Nerven in Abh~ngigkeit yon der Zeit nach der

N crvendur chschneidung.

Ferment lSsungen var i ier t wurden, bis ein gleich raseher Abbau resultierte. Die hier- zu notwendige Menge der FermentlSsung des normalen Nerven geteilt dureh die des degenerierenden ergab den prozentuMen FermentgehMt des dege~erierenden Nerven.

Die ,Ergebnisse sind in Abb. 1 durch Kreise verzeieh-

~ne~ und durch die Kurve F verbunden. Man sieht, daG der FermentgehMt bis zum 6. Tag nach der Nervendurch- schneidung unver~ndert i s t und dann rasch abnimmt. Am 12. und 15. Tag ~ a r er

mit weniger ~ls 1/20 des normalen nur mehr schwer zu erf~ssen. Die Streuung scheint zum Teil d~her zu rfihren, da8 der Unterschied zwischen beiden Nerven bei hohem Fermentgehal t des normMen Nerven meist grSBer ausf~llt ~ls bei geringem Fermentgehal t des normalen Nerven.

Zum Vergleich sind in Abb. 1 noch der Gehalt an P und cter ~n Er- regungssubstanz der sensiblen Neurone yon degenerierenden Nerven be- zogen auf die normalen der Gegenseite nach noch unver6ffentlich~en Yer- suchen yon Dr. LEM]~ECX und mit eingetragen. Die Werte yon P, die sich auf Kaninchen- nnd t%attennerven beziehen, lagen fiir die degenerieren- den Nerven vom 2; bis zum 15. Tag bei etwa 60~o derjenigen der nor- mMen. Die durch die Xurve E verbundenen Xreuze stellen die mit I-Iilfe der l%6tungsstufen am denervierten Kaninchenohr gesch~tzten Wer~e der Erregungssubstanz der sensiblen Nerven im degenerierenden Nerven be- zogen anf den normalen dar. Jeder durch ein Kreuz eingetragene Yersuch

~ber die fermentative Verwandlung yon Substanz P. 239

wurde an 2- -3 Kuninehen getestet. Die Nerven s tammten im Mlgemeinen yon Kaninehen, nur in dem Versueh mit 10 Tsgen yon Ratten. Bei den am Ksninehenohr getesteten YersUchen wurden gleich lange Nerven in gleiehen L5sungsmengen extrahiert, die Quellung des degenerierenden Nerven war also nieht yon EinfluB. Auch bei den Best immungen yon P war dieser EinfluB ausgesehaltet. Den Fermentbest immungen liegen allerdings sus teehnisehen Grtinden gMehe Nervengewiehte zugrunde. W~ren die Werte auf gleiehe Nervenl/~ngen bezogen, so w/~re der Abfsll der Kurve etwas weniger steil.

Die Abb. 1 seheint mir folgende Auffassung nahe zu legen. Die erste Abnshme der Erregungssubstanz der sensiblen Nerven um den 2. Tag rtihrt daher, dab die Substsnz P, aus der sie fermentat iv entsteht, sieh um den ersten Tag vermindert. Die zweite Abnshme, mn den 8. Tag, riihrt dsher, dab nun das Ferment sbnimmt.

Die capillarerweiternde Substanz in den Darmextralsten.

Wir haben gesehen, dab in Ext rak ten aus sensiblen Nerven eine darmwirksame Substanz P und die eapillarerweiternde Erregungssub- st~nz der sensiblen Nerven enthalten ist. Das rasch wirkende, inkubiert gewesene Ferment verwandelt die Substanz P in die Erregungssubstanz der sensiblen Nerven, greift abet diese selbst nicht an. Das dutch Krsmpf- gifte hemmbsre Ferment b a n t die Erregungssubstanz der sensiblen Nerven ab.

Durch die Untersuchungen yon FIscJ~E~ und VooT 5 und yon PE~- ~ow is is t srwiesen, dsg such die Dsrmext rak te neben siner vorwiegend dsrmwirksamen Substsnz P noeh sine blutdruckssnkende Substanz ent- hslten. Wir hsben gesehen, dab die Substsnz P aus Darm dureh dss rasch wirkende, inkubiert gewesene Ferment in ~hnlicher Weise, nnr vielfsch etw~s lsngssmer, angegriffen wird, wie die aus sensiblen Neu- ronen.

Die blutdrucksenkende, capillarerweiternde Substanz kommt sowohl in ungereinigten Darmextrakten vor, sis such in dutch FgUungen wenig gereinigten Pr~psraten. HELLAV~S~ s hat fiir das such mir vorliegende P- Prgpara t yon v. EVLE~ mit 4 E pro Mflligramm gezeigt, daB es in einer LSsung yon 1 E pro Xubikzentimeter am denervierten Kaninehenohr ghnlich wirksam ist wie ein Ex t rak t ass dorsMen Rfiekenmarkswurzeln vom t~ind 1:4. Gegen Kochen in Mksliseher LSsung fsnd er die capillar- erweiternde Substanz ebenso empfindlich wie die darmwirkssme und etwas weniger empfindlich wie die Erregungssubstanz der sensiblen Nerven.

Ieh babe versueht, die eapillarerweiternde Substanz fermentat iv ab- zubsuen. Die friseh hergestellte Fermentl6sung s t smmte ass dorsalen Rfiekenmsrkswurzeln und wirkte dureh 18 Std bei 33°C in der End-

240 K. U~iT~ :

verdfinnung 1 : 300 oder 1 : 400 ein. In zwei Versuchen mit Darmextraktea 1:4 zeigte sich kein fermentativer Abbau der rStenden Wirkung am Kaninchenohr. In neutralisierten LSsungen des genannten P-Pr~parates yon v. E u L ~ aus Darm lie[t sich am Kaninchenohr in einem Yersuch kein Abbau erkennen, 3 Versuche lie$en ihn nur andeutungsweise'er- kennen. Die darmwirksame Substanz P war abgebaut. Parallelversuche mit Extrakten 1:4 aus dorsalen Riickenmarkswurzeln zeigten den fiblichen, weitgehenden Abbau der Wirkung am Kaninchenohr.

Die Schmerzausl6sung an der menschlichen Hornhaut habe ich mi t LSsungen des P-Pr~parates Yon v. EUL]~ in froschisotoner RING~- 15sung, die auf pH 7 eingestellt waren, untersucht: Eine LSsung, die 20 mg, also 80 E pro Kubikzentimeter enthielt, wurde gegenfiber bi- kabonatfreier l~r~Gna-LSsung yon 3 Versuchspersonen leicht erkannt. Mir und Herrn Dr. FLo~EY erschien der Unterschied um soviel deut- lieher als in meinen friiheren Yersuchen mit Extrakten aus dorsalen l~fickenmarkswurzeln, dal~ an der Schmerzwirkung der LSsung nicht zu zweifeln war. Die LSsung enthielt ja nach der Austestung des Pr~pa- rates durch HELLiU]~ s am denervierten Kaninchenohr 40--80real so- viel Wirksamkeit wie die damals yon mir angewandten Extrakte aus dorsalen Rfickenmarkswurzeln. Die Hornhautempfindlichkeit scheint abet individuell sehr verschieden zu sein, denn in einem spateren Versuch wurde eine LSsung yon 60 E pro Kubikzentimeter yon 2 anderen ¥er- suehspersonen nieht als deutlich schmerzhaft empfunden.

Eine LSsung yon 80 E pro Kubikzentimeter babe ich dureh 14 rain mit einem inkubiert gewesenen Ferment in der Verdfinnung 1 : 1000 ab, gebaut, wobei die P-Wirkung am Meerschweinehendarm ungef~hr auf ein Zehntel herabgesetzt wurde. Die Testung an 4 Versuchspersonen zeigte, dal~ die rasch abgebaut e und die AnsgangslSsung an der Horn- haut gleich schmerzhaft waren. Die 5fach verdfinnte AusgangslSsung, also 16 E pro Kubikzentimeter, an 2 Yersuchspersonen getestet, wurde als deutlich schw~cher empfunden, sowohl unmittelbar beim Eintropfen, als aueh weniger nachhaltend, sie wurde aber gegeniiber RINGn~-LSsnng deutlich erkannt.

Eine neutra]isierte LSsung des P-Prap~rates h~be ich mit ein Zehntel ihres Volumens ~ n NaOH versetzt und sie flit 20 rain ins kochende Wasserbad gebracht. Nach der folgenden 1Neutralisation hatte sie und die entsprechend verdfiante Ver- gleichslSsung etw~ 15 mg pro Kubikzentimeter, die VergleichslSsung daher 60 E pro Kubikzentimeter. 4 Versuchspersonen erkannten die unbehandelte Vergleichs- 15sung als deutlich schmerzhafter, 2 weitere hatten bei keiner der beiden LSsungen eine Sehmerzempfindung, es waren die 2 schon oben erwahnten Versuchspersonen.

Seinerzeit habe ich 1~ dureh ehmn frischen Fermentextrakt 1:40 die schmerzauslSsende Wirkung in Extrakten aus dorsalen Rfickenmarks- wurzeln bei 38°C in etwa 4 Std abbauen kSnnen. Jetzt babe ieh in 2 Versuehen Solches frisches Ferment 1:40 bei 33 ° C durch 16 Std auf

Uber die fermentative Verwandlung der Substanz P. 241

LSsungen yon 60 und 50 E pro Knbikzentimeter des EvLE~sehen P- Priiparates einwirken lassen. I m ersten Versuch hat te die Kontroll- 15sung einen Zusatz yon gekochtem Ferment nnd wurde mit inkubiert, im zweiten hat te sie einen Zusatz yon RING~-L6sung und kam in den Kiihlsehrank. Die Darmwirksamkeit war durch das Ferment immer voll- st,/~ndig abgebant, in dem ersten Versueh war sie auch in der Kontroll- 15sung sehr stark vermindert, in dem zweiten war sie in der Kontroll- 15sung erhalten. Die oftmalige Testung a n 3 Versuchspersonen zeigt,e, dab die SchmerzauslSsung an der Hornhaut durch die Fermentwirkung nicht, vermindert war. Alle LSsungen wurden deutlich empfunden, eine Entscheidung, welehe schmerzhafter sei, war schwer, moist wurde die mit dem Ferment behandelte fiir etwas schmerzhafter gehalten.

Nach diesen Versuchen kommt in Darmextrakten bzw. in wenig ge- reinigten P-Pr/~paraten aus Darm eine Substanz vor, die, wie die Er- regungssubstanz der sensiblen Nerven , am denervierten Kaninchenohr capillarerweit,ernd und an der menschlichen Hornhaut schmerzhaft wirk~. Beide Substanzen lassen sieh dureh Kochen bei alkaliseher Re- aktion zerst,Sren, die Sulcstanz aus Darm ailerding s etwas schwerer als die E:regnngssubst,anz der sensiblen Nerven. Das dureh die Krampf- gift,e hemmbare Ferment, zerstSrt die Erregungssubstanz der sensiblen Nerven leicht, die Substanz aus ] )arm unter denselben Bedingungen aber nicht oder kaum. Die Substanz aus Darm diirfte sieh daher zur Erregungssubstanz der sensiblen Nerven ~hnlich verhalten, wie das Aeetyl-/~-methyleholin oder gar das Pilocarpin zum Acetylcholin.

Zusammenfassung. l~ohe Ext rakte aus Nervensystem gewinnen dureh mehrst/indige In-

kubat ion bei 38 ° C eine hohe Fermentaktivit/~t, die einen raschen Abbau der Substanz P a u s sensiblen Nerven oder aus Darm ermSglicht.

Besonders yon FermentlSsungen, die bei Zimmertemperatur gealtert sind, wird bei diesem raschen ferment,ativen Abbau die Substanz P aus sensiblen Nerven rascher zerstSrt als die ans Darm.

In Ext rak ten aus KrStennerven entsteht durch das inkubiert, ge- wesene, raseh wirkende Ferment, Erregungssubstanz der sensiblenNerven, was durch den RStungstest, am denervierten Kaninehenohr und dutch den Schmerztest an der menschliehen Hornhaut naehweisbar ist. In Ext,rakten aus dorsalen Riickenmarkswurzeln vom Rind, die yon vorn- herein mehr Erregungssubstanz der sensiblen Nerven enthalten, lgBt sich deren Zunahme bei der Fermenteinwirkung nur dnrch einen etwas komplizierteren Versueh zeigen.

Auch die Verh/~ltnisse an degenerierenden S~ugetiernerven sprechen filr die fermentative Verwandlung yon Substanz P in die Erregungs- substanz der sensiblen Neurone. Die Substanz P hat yore 2. Tag nach

242 K. UM~T~: Uber die fermentative Verwandlung yon Substanz P.

der Nervendurehschne idung an etwa 60~o ihres Normalwertes . Dem- entsprechend zeigt die Er regungssubs tanz der sensiblen Neurone vom 2. bis zum 6. Tag ~hnlich reduzier te Werte . Das F e r m e n t n i m m t bis zum 6. Tag n icht ab u n d zeig~ yore 8. zum 12. Tag eine sehr s tarke Abnahme. Paral lel dami t n i m m t die Er regungssubs tanz der sensiblen Neurone am 8. u n d 10. Tag sehr s tark ab.

Die in E x t r a k t e n aus D a r m u n d in e inem P-Pr~para~ yon v. Eu~E~ noeh enthal~ene capi l larerweiternde Subs tanz ~hnelt der Erregungs- subs~anz der sensiblen Neurone auSzr du tch diese capi l larerweiternde Eigenschaf t noch dadurch, dal~ sie an der H o r n h a u t Schmerz auslSst. Sie wird, wie die Er regungssubs tanz der sensiblen Neurone, dureh Kochen bei alkalischer l%eaktion zerstSr~, ist abe t nach H E ~ A V ~ hier- bei weniger empfindlich. Sie wird durch das im Nervensys tem en~haltene, du tch Krampfgi f te hemmbare Fe rmen t , das die Er regungssubs tanz der sensiblen Neurone abbau~, n ich t oder k a u m abgebaut .

Der Rockefeller Foundation danke ich fiir ein Stipendium ffir eine tcchnische Assistentin, wodurch auch diese Arbeit wesentlich' gefSrdert wurde.

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Prof. Dr. KARL UMRAT]~, Zoologisches Institut, Universitat Graz~ Universitatsplatz 2, 0sterreich.