Versuch 9

„SDS - PAGE“

Protokollant: Max Mustermann E-mail: max@quantentunnel.de Studiengang: X Gruppen-Nr: X Semester: X Betreuer: Dr. Tina Endres & Dr. Claudia Prinzen Wird benotet?:

Einleitung Ziel des Versuches ist es, mit Hilfe der SDS-PAGE bestimmte Proteingemische aufgrund ihres Molekulargewichtes zu trennen und daraus bestimmte Proteine identifizieren. Es wurden aufgeschlossene prokaryotische Zellen mit einer eukaryotischen Zelllinie und anderen Proteinen verglichen. Die Bakterien- und die Eukaryotenproben wurden einmal ohne Behandlung von DTT einmal mit vorheriger Behandlung von DTT aufgetragen. Für die prokaryotischen Proben wurde Cytosol aus transformierten Escherischia coli-Bakterien verwendet. Bei den transformierten Bakterien waren Plasmide vorhanden auf denen es kodierende Bereiche für die Proteine TEV-Protease, GST und mgp80 gab. Bei Induktion mit IPTG sollten diese Proteine überexprimiert werden. Zur Herstellung der Proben eukayrotischer Herkunft wurden Zellen der Zelllinie SH SY5Y (Humane Neuroblastom) verwendet. Auf die Gele wurde hier aufgetragen Cytosol und Zellpellet. Weiterhin wurde BSA (Bovine Serum Albumine), FCS (fetal cattle serum) und Lysozym auf die Gele aufgetragen. Bei allen vier Gelen wurde eine Standard Protein Lösung bekannter Zusammensetztung als Marker verwendet. SDS-PAGE Die SDS-PAGE (sodium-docecyl-sulfat – polyacrylamid-gelelektrophorese) ist eine Methode zur Auftrennung von Proteinen nach ihrer Größe. Das Gel in dem die Auftrennung stattfindet besteht aus Acrylamid Molekülen die in einer radikalischen Reaktion zum fertigen, dreidimensional vernetzten, Gel polymerisieren. Je höher der Anteil an Acrylamid im Gel, desto geringer die Porengröße. Das aufzutrennende Proteingemisch wird vor dem Auftragen mit SDS und z.B. Mercaptoethanol (im Versuch Dithiothreitol) behandelt.

SDS (Sodium-dodecyl-sulfate) DTT (Dithiothreitol) Die Aufgabe dieser Reagenzien ist es die Proteine zu denaturieren. Dithiothreitol spaltet Disulfidbrücken indem es diese reduziert. Somit werden Proteine aus mehreren Untereinheiten die durch S-S –Brücken verbunden sind, in die einzelnen Untereinheiten aufgespalten. Die Aufgabe des SDS ist es, die Untereinheiten nun zu entfalten. Es lagert sich in der Regel ein Molekül SDS an zwei Aminosäurereste an. Durch die negative Ladung, die das SDS trägt, wird jetzt die AS-Kette entfaltet. Außerdem wird die eigene (native) Ladung des Proteins maskiert, so dass sich alle Proteine nun im gleichen Ladungszustand befinden. Bei Anlegen einer Spannung an das Gel mit behandelten Proteingemischen wandern alle Proteine zum Plus-Pol (da SDS negativ geladen), die Auftrennung erfolgt rein

nach der Größe (Länge) der AS-Ketten. Kurze AS-Ketten passen besser durch das engmaschige Netz, wandern also schneller als Lange, die somit später unten ankommen. In der Regel bestehen SDS-Polyacrylamidgele aus zwei Abschnitten: Dem großporigen Sammelgel und dem engporigen Trenngel. Das Sammelgel wird dem Trenngel vorgeschaltet, so dass die Proteine nicht schon während des Auftragens in das Trenngel diffundieren und somit das Ergebnis verfälschen. In einem nativen Gel (ohne SDS) wandern die Proteine rein aufgrund ihrer nativen Ladung. Sie behalten hier ihre native Konformation und somit auch ihre Funktion bei. Coomassie-Färbung Die Coomassie-Färbung mit Coomassie (Brilliant) Blue R-250 ist eines der am häufigsten verwendeten Verfahren zur Visualisierung von Proteinen nach einer Polyacylamidgelelektrophorese (PAGE). Der Farbstoff wurde ursprünglich als Wollfarbstoff entwickelt und erhielt seinen Namen in Gedenken an die britische Besetzung der Ashanti-Hauptstadt Kumasi oder "Coomassie" 1896. Die Coomassie-Färbung kann zwar zur Quantifizierung der Proteine verwendet werden, färbt aber Polypeptide mit vielen basischen Resten (Lysin, Arginin) verstärkt an. Induktion durch IPTG Die Neubildung eines Proteins als Antwort auf ein äußeres Signal bezeichnet man als Induktion. IPTG( Isopropylthiogalaktosid) ist ein künstlicher Induktor des lac-Operons von E. coli, der natürliche ist die Lactose. Bei dem Bakterienstamm der im Versuch verwendet wurde, wurde der lac-Operator den Strukturgenen der gewünschten Proteine (TEV, GST, MGP-80) auf dem Plasmid vorgeschaltet. An den Operator eines Operons bindet ein Repressorprotein (in unserem Fall der lac-Repressor) und verhindert somit die Transskription der nachgeschalteten Strukturgene. Der Repressor erfährt durch Bindung eines Induktors (in unserem Fall IPTG, da das Medium frei von Lactose war) eine Konformationsänderung und gibt die Operatorstelle frei. Jetzt kann die RNA-Polymerase die Strukturgene ablesen und die m-RNA herstellen, die für die Synthese der Proteine nötig ist. IPTG ist ein geeigneter künstlicher Induktor, da er im Gegensatz zur Laktose im lac-Operon nicht durch die gebildeten Enzyme gespalten wird. Seine Konzentration bleibt also konstant. Gibt man also IPTG zu den Bakterienproben, wird mehr m-RNA gebildet und dadurch auch mehr Protein. TEV-Protease (27 kD) Die TEV-Protease (aus dem Tobacco Etch Virus) ist ein monomeres Protein mit dem Molekulargewicht von 27 kD. Es erkennt eine sogenannte TEV-Site bestehend aus der Aminosäure (AS)-Sequenz Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly, welche sie zwischen den AS Gln und Gly spaltet. Viele neuartige Vektoren (zB. pETM-11) enthalten zwischen dem His-tag und der multiplen Klonierungsstelle eine derartige TEV-Site, die es möglich macht, den His-tag im Anschluß an die Aufreinigung durch Verdau mit TEV-Protease wieder vom Protein abzuspalten.

Glutathion-S-Transferase (GST) (26 kD) Die Glutathion-S-Transferase besitzt ein katalytisches Zentrum mit einer Kopplungsstelle für Glutathion. Die Funktion der Glutathion-S-Transferase besteht in der Ankopplung von Glutathion an zahlreiche Substanzen wie Antibiotika, Pestizide, Insektizide, Karzinogene und anderen Medikamenten, die im Körper umgewandelt werden. Durch die Konjugierung wird das Substrat wasserlöslich und kann direkt über die Galle und Niere ausgeschieden werden. Das Glutathion-Glutathion-S-Transferase System stellen eines der wichtigsten Schutzsysteme gegen Peroxide und elektrophile körperschädigende Reaktionspartner dar. Es treten z.B. erhöhte Konzentrationen bei Tumorpatienten auf. Clusterin (mgp80) (70 kD) Clusterin ist ein hoch konserviertes Protein aus zwei Unetereinheiten (34kD und 36kD). Es kommt in vielen Species und Gewebetypen vor. Clusterin hat viele Aufgaben. Es wirkt zB. beim programmierten Zelltod, beim Membran-Recycling, bei der Zell-Zell-Adhäsion und der SRC induzierten Transformation mit. In vielen Tumoren wird dieses Protein überexprimimiert. Lysozym (14,5 kD) Lysozym ist ein gut charakterisiertes und bekanntes Enzym aus dem Hühnereiweiss. Daneben kommt es auch in der menschlichen Tränenflüssigkeit vor. Es besteht aus 129 Aminosäureresten und besitzt ein Molekulargewicht von ca. 14.500 Dalton. Natürliches Lysozym hat basischen Charakter mit einem isoelektrischen Punkt bei pH 10,5 – 11,0. Sein Wirkungsoptimum liegt bei pH 4,5. Es greift die Zellwände von Bakterien an und soll somit zum Tod der Bakterien führen. Albumin (67 kD) Albumin gehört zur großen Gruppe der Plasmaproteine. Es ist das kleinste aber auch das am häufigsten vorkommende Protein im Plasma (ca. 60%) Die Hauptaufgabe des Albumin ist die Aufrechterhaltung des kolloidosmotischen Drucks, der die Flüssigkeitsverteilung im Körper bestimmt. Albumin macht 80 Prozent des kolloidosmotischen Drucks des Plasmas aus. Albumin fungiert darüber hinaus als Transportprotein. Bilirubin, Fettsäuren, Thyroxin, Kalzium, Vitamine und viele andere Stoffe und Medikamente wie beispielsweise Penizillin werden an Albumin gebunden im Blut durch den Körper transportiert. Weiterhin dient Albumin als Reserve-Eiweiß. Außer im Blut kommt Albumin noch in der Haut, im Muskel und Liquor (Hirn- und Rückenmarksflüssigkeit) vor.

Material und Methoden Der Versuch wurde exakt nach Versuchsanleitung durchgeführt bis auf dass die verwendeten Proben schon hergestellt waren und nur noch mit PPP und DTT vermengt werden mussten. Die verwendeten Materialien sind im Skript auf den Seiten 36 bis 41 aufgelistet.

Ergebnisse

Der Marker enthält Proteine mit bekannten Molekulargewichten.

Bande 1 2 3 4 5 6 7

Molekulargewicht 200 kD 119 kD 66 kD 43 kD 29 kD 20 kD 14,3 kD

Gel 1: Bakterienproben ohne DTT

Gel 2: Bakterienproben mit DTT

Spur Probeninhalt

1 -

2 -

3 TEV -IPTG

4 TEV +IPTG

5 Marker

6 GST -IPTG

7 GST +IPTG

8 Mgp80 -IPTG

9 Mgp80 +IPTG

10 -

Spur Probeninhalt

1 -

2 TEV -IPTG

3 TEV +IPTG

4 Marker

5 GST -IPTG

6 GST +IPTG

7 Mgp80 -IPTG

8 Mgp80 +IPTG

9 -

10 -

Gel 3: Eukaryotenproben ohne DTT

Gel 4: Eukaryotenproben mit DTT

Spur Probeninhalt

1 -

2 Cytosol

3 Zellpellet

4 Marker

5 -

6 FCS

7 -

8 BSA

9 Lysozym

10 -

Spur Probeninhalt

1 -

2 Cytosol

3 Zellpellet

4 Marker

5 -

6 FCS

7 -

8 BSA

9 Lysozym

10 -

Auswertung: Vergleich IPTG-induziert – nicht IPTG-induziert anh and von Gel 1: Bei Gel1 in der 3. Spalte wurde Bakterien-Cytosol aus Bakterien mit TEV-Gen auf dem Plasmid (TEV-Probe), aus nicht IPTG induzierten Bakterien, augetragen. Zu sehen ist eine Vielzahl von Banden. Vergleicht man nun diese Spalte mit der 4., bei der IPTG anwesend war, so fällt auf, dass nur noch 3 Banden deutlich zu sehen sind. Eine lässt sich durch Vergleich mit dem Marker als die Bande von TEV-Protease identifizieren: Die TEV-Protease hat ein Molekulargewicht von 27kD. IPTG ist der Transkriptionsfaktor: bei Anwesenheit von IPTG wird die TEV-Protease verstärkt transkribiert. Die anderen zwei erkennbaren Banden in Spalte 4 lassen sich dadurch erklären, dass noch ein anderes Plasmid in Bakterium vorhanden war (wie uns die Betreuer mitteilten). Das Verschwinden der anderen Banden ist dadurch zu erklären, dass wahrscheinlich die Konzentrationen der Lösung niedriger war als bei der nicht IPTG induzierten Probe. In Spalte 5 und 6 war GST in der Probe enthalten. Nur die Bakterien von denen die Probe in Spalte 6 stammt wurden mit IPTG induziert. Auch hier dient IPTG als Transkriptionsfaktor. In Spalte 6 ist deshalb die Bande für GST (GST = 26 kD) breiter als in Spalte 5 � GST wurde überexprimiert. Dasselbe gilt auch für Spalte 8: hier wurde MGP-80 überexprimiert. MGP-80 besitzt ein Molekulargewicht von 70 kD. Vergleich mit und ohne DTT anhand von Gel 1 und Gel 2: DTT denaturiert Proteine indem es Disulfidbrücken spaltet. Proteine, die aus mehren Untereinheiten bestehen, welche meist durch Disulfidbrücken verknüpft sind werden bei Zugabe von DTT in die Monomere zerlegt. Zu erwarten wäre deshalb eine Aufspaltung der Banden bei Dimeren bzw. Oligomeren. Bei der 2. Spalte bei Gel 2 erkennt man die Banden sehr schlecht. Wahrscheinlich wurde zu wenig von der Probe aufgetragen. Da die TEV-Protease ein Monomer ist, zeigt sich keine Veränderung der Banden im Vergleich zu Gel 1. Hingegen ist das MGP-80 ein Dimer, welches aus 2 identischen Untereinheiten besteht. Da es ein Molekulargewicht von 70 kD besitzt, hätte man nach Behandlung der Probe mit DTT eine Bande bei ca. 35 kD sehen sollen. Dies war nicht der Fall. Grund dafür könnte eine zu geringe Menge an DTT sein. Ebenfalls möglich wäre, dass die Disulfidbrücken, die die Untereinheiten verbinden für das DTT zu schlecht zu erreichen war. GST ist ebenfalls ein Dimer. Die Bande des GST spaltet sich aber auch nicht auf, weswegen für GST das gleiche gilt wie für das MGP-80. Auch Pipettierfehler können nicht ausgeschlossen werden. Die Proteine in Marker sind alle Monomere, da auch hier keine Aufspaltung der Banden zu sehen ist.

Vergleich mit und ohne DTT anhand von Gel 3 und Gel 4: Vergleicht man die Spalten, bei denen Cytosol aufgetragen wurde, sieht man, dass bei Gel 3 keine Banden sichtbar sind, sondern nur Schmier. Bei Gel 4 allerdings sind Banden zu erkennen. Eine Erklärung hierfür ist, dass bei Herstellung der Probe für Gel 3 die Ausgangsprobe nicht korrekt gemischt wurde: hier wurde nur der Überstand entnommen und nicht das Sediment, dass die Proteine enthält. Deshalb ist kein Vergleich möglich. Bei der Pellet-Probe ist derselbe Fehler aufgetreten, deshalb ist auch hier kein Vergleich möglich. Die Bestandteile des FCS und somit auch das BSA sind alles Monomere, ebenso das Lysozym, deshalb kommt es nach Zugabe von DTT nicht zu einer Veränderung der Banden (außer bei Lysozym; dies ist aber durch Fehler bedingt). Vergleich FCS und BSA anhand von Gel 3: Beim BSA dürfte normalerweise nur eine Bande vorhanden sein. Zu sehen sind aber mehrere. Da das BSA aus FCS hergestellt wurde, liegt die Vermutung nahe, dass hier keine saubere Auftrennung stattgefunden hat. Was man aber sieht, ist, dass der Hauptbestandteil des FCS eben das BSA ist (Deshalb wurden diese Proben direkt nebeneinander aufgetragen). Vergleich Eukaryot und Prokaryot anhand von Gel 1 und Gel 4: Ein Vergleich zwischen Eukaryoten- und Prokaryotenproben ist kaum möglich, da die Banden des Cytosols bei Eukaryoten sehr schlecht zu erkennen sind. Zu erwarten wäre allerdings, dass bei Prokaryoten mehr Proteine und somit mehr Banden vorhanden sind, da Bakterien nur aus einer Zelle bestehen und deshalb alle benötigten Proteine in dieser Zelle vorhanden sein müssen. Bei Eukaryoten hingegen liegt eine Spezifizierung der Zellen vor, deshalb werden nicht alle Proteine in jeder Zelle exprimiert. Größenbestimmung von FCS, BSA und Lysozym anhand vo n Gel 3 und Gel 4: Vergleich man die breite Bande des BSA und des FCS mit den Banden des Markers so lässt sich ein Molekulargewicht von ca. 55 kD (auf Gel 3) bzw. 66 kD (auf Gel 4) abschätzen. Der Literaturwert von Rinderserumalbumin (Hauptbestandteil von FCS) beträgt 67 kD. Das Molekulargewicht von Lysozym lässt sich analog bestimmen: Aus der Abschätzung bei Gel 3 ergibt sich ein Molekulargewicht von 14 kD, bei Abschätzung aus Gel 4 eines von ~13 kD. Der Literaturwert für das Molekulargewicht von Lysozym liegt bei ~ 14 kD. (Literaturwerte aus Stryer)

Fehleranalyse Fehler, die möglicherweise unterlaufen sind: -Falsche Aufarbeitung bzw. ungenügende Mischung der augeteilten Proben: Nur der Überstand dieser wurde zu den aufgetragenen Endproben weiterverarbeitet. (Ist mir selbst passiert beim Zellpellet �) -Ungenaue Auftragung der Proben in die Spuren � benachbarte Proben vermischen sich (siehe Gel 4 Spur 9: Aufgetragen wurde reine Lysozymlösung, hergestellt aus reinem Lysozym-Pulver. Zu sehen sind zwei Banden, eine von Lysozym und eine auf der gleiche Höhe von BSA. Daher ist es naheliegend, dass auch bei anderen Spuren ungenau aufgetragen wurde.). -Unreine Proben: siehe BSA -Pipettierfehler: z.B. zu wenig DTT zugegeben

Literatur -Skript zum Biochemischen Grundpraktikum, Institut für Biochemie, J.-G.-Universität-Mainz -Biochemisches Praktikum, Kleber, Schlee, Schöpp, Verlag: Gustav Fischer, 1997 -Biochemie, Stryer, Verlag: Spektrum, 1994 (2. durchgesehene Auflage) -www.netdoctor.de -www.wikipedia.de -www.fennerlabor.de -https.heid.ub.uni-heidelberg.de → Dissertation von Christian Moeskes