K. L~_NG u. a. : Zur Kenntnis des Pyrokohlens~uredi~thylesters. IV 333

Tabelle 5. Mittelwerte der Organ- und K6rpergewichte yon mgnnlichen Ratten nach d Wochen Fi~tterung mit Vit. C.Addulct

Dosis K6rper~ beide beide m g / k g gewicht g l:[erz g Leber g ]YKilz g l'~ieren g ~ebenn ie ren g ]~oden g

500 200 100

0 (Kontrolle)

254,5 0,863 11,36 0,978 1,55 0,048 2,97 257,5 0,855 11,44 1,118 1,57 0,044 2,65 257,0 0,832 11,39 0,869 1,57 0,046 2,72

241,5 0,826 11,05 1,001 1,47 0,045 2,72

Zusammen]assung

Aminosiiuren, Gallussgure, Chlorogens~ure, Catechin, Milchs~ure und Ascorbin- sgure wurden mit Hilfe yon Pyrokohlensi~uredi~thylester (PKE) carbi~thoxyliert. Eine repriisentative Auswahl yon Carbiithoxyverbindungen, die in mit PKE be- handelten Getr~nken entstehen k6nnen, wurde ~uf ihre akute orale und intraperi- toneale Toxicit~t hin untersucht. Sie waren yon nur geringer Toxiciti~t. Mit dem Umsetzungsprodukt der Ascorbinsi~ure mit PKE wurden auch subakute toxiko- logische Untersuchungen durchgeffihrt. Schitdigende Einfliisse lieBen sich nicht feststellen.

Literatur 1. BO~A~N, G., u. A. LOESE~: Arch. Toxikol. 19, 69--78 (1961). 2. H~C~T, G.: Diese Z. 114, 292--297 (1961). 3. D v ~ , B., W. MARL, H. MEDE~W~LD, K. P~TZSC~KE U. L. A. W ~ o ~ : Diese Z. 132, 200

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(Wiley) 1954. 8. ]~OE, J. I-L : J. biol. Chem. 116, 609 (1936).

Zur Kenntnis des Pyrokohlens~iuredi~ithylesters I V . Mittei~ung

~ber enzymatische Spaltung und Stoffweehsel yon Umsetzungsprodukten des Pyrokohlens~iurediiithylesters mit Bestandteilen yon Lebensmitteln

K. LANO~ ~ . FINGERtIUT~ E. KI{UG un4 W. REIMOLD

Mittei[ung aus dem Physio[ogisch-Chemisch~n Institut der Johannes Gutenberg-Universit~t Mainz

Eingegangen am 20. Mai 1966

Pyrokohlens~uredii~thylester (PKE) zerfitllt im Wasser in CO 2 und Alkohol. Ent- hiilt das Wasser jedoch Substanzen, die ebenfalls mit P K E reagieren k6nnen, wie das in Weia und Fruchts~ften der F~I1 ist, so finden in mehr oder minder groBem Urn- range, abhgngig yon der Konzentra~ion dieser Subst~nzen, Nebenreaktionen start, die zu der Bildung carb~thoxylierter Derivate AnlaB geben. Eine Zulassung der Ver- wendung yon Pyrokohlens~uredi~thylester zur t taltbarmachung yon Getri~nken setzt voraus, dab die Umsetzungsprodukte mit den gel6sten Inhaltsstoffen gesund- heitlich unbedenklich sind.

334 K. LANG, M. FInGER,U% E. K~G und W. R~I~OLD:

ChroIfische Fiitterungsversuche mit einer groi~en Oberdosierung wie sie sonst zur Kl~rung der Frage der Unseh~dlichkeit angestellt werden, lassen sieh in dem vor- liegenden Falle aus versehiedenen Griinden nicht durchfiihren:

1. Infolge der geringen Konzentration der in den behandelten Fruehts~ften oder Wein enthaltenen Reaktionsprodukte lassen sieh die notwendigen hohen Dosen der- selben durch die Getr/inke nieht zuffihren, da die Versuehstiere die erforderlichen Flfissigkeitsmengen nicht aufzunehmen in der Lage sind. Selbst wenn man auf eine hohe I~berdosierung verziehten wiirde, ware die ehronisch aufzunehmende Fltissig- keitsmenge immer noch so grol3, dab mit sekund/~ren Seh~digungen der Tiere, etwa dureh den A]kohol oder bei sauren Fruehts~ften mit Zahnerosionen zu reehnen ware, also mit Folgen, die niehts mit den Wirkungen der zu untersuehenden Substanzen zu tun haben.

2. Langfristige Ffitterungsversuehe mit hohen Dosen sind aueh deswegen un- durehf/ihrbar, weft die zu untersuehenden Substanzen nicht in den erforderlichen Mengen darstellbar sind.

3. Ist die Zahl der zu untersuchenden Substanzen infolge der komplexen Zu- sammensetzung yon Fruehts~ften und Wein fiberaus gro~, so dal3 chronisehe F/itte- rungsversuche mit einem oder nur wenigen der auitretenden Reaktionsprodukte nur einen geringen Aussagewert h~tten.

In dem vorliegenden Falle m/il3ten daher die praktiseh nieht durehffihrbaren F/itterungsversuehe dureh bioehemische Untersuehungen, insbesondere Stoff- weehselversuehe und enzymatisehe Versuehe ersetzt werden, so wie es aueh ffir solche Falle yon dem Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (1) vor- gesehen ist.

Unsere Versuehe erstreekten sich daher in erster Linie auf die Frage, ob die im Getrank entstehenden PKE-Reaktionsprodukte durch die Verdauungsenzyme ge- spalten werden. Denn wenn dies der Fall ist, so entstehen durch die enzymatisehe Hydrolyse unter Abspaltung des Carba~hoxyrestes wieder die in dem Getrank ent- haltenen Ausgangssubstanzen. Die durch die Umsetzung mit PKE entstandene Sub- stanz wird dann fiberhaupt nicht resorbiert, gelangt daher aueh nicht in den Organis- mus und stellt daher/iberhaupt kein toxikologisehes Problem dar. In der Tat konnten wir aueh zeigen, dal3 dies fiir alle untersuehten reprasentativen Vertreter der Sub- stanzgruppen, die mit PKE reagieren, Pflanzenphenole, Hydroxys~uren und Amino- sauren, ferner aueh fiir Di/~thylcarbonat, das Reaktionsprodukt mit Xthanol, zu- trifft. Eine Ausnahme maehte ledigHeh das Reaktionsprodukt mit Aseorbins~ure, dessen Stoffweehsel daher n/~her untersucht werden mul3te, vor allem im Hinbliek auf eine etwaige Speicherung.

Ergebnisse Bei der groi3en Zahl der mit PKE reagierenden Lebensmittelbestandtefle mul3ten

unsere Versuehe auf eine Auswahl repr/~sentativer PKE-Umsetzungsprodukte be- sehrgnkt werden. Aus den versehiedenen Klassen, die ale Bestandteile yon Getranken in Frage kommen und mit PKE reagieren, wurden die in der Tab. 1 angef~hrten ausgewahlt.

Die Spaltung der carb~thoxylierten Phenole und Milehsgure sowie des Diathyl: earbonats wurde manometrisch in der Warbung-Apparatur verfolgt. Gemessen wurde der Druekanstieg durch das aus Itydrogencarbonat in Freiheit gesetzte COs.

Ffir die Versuehe zur Spaltung der Carbathoxyderivate der Pflanzenphenole und Milchs~ure dienten Pankreashomogenate, Dfinndarmsch]eimhauthomogenate und Leberhomogenate ale Enzymquellen.

Zur Kenntnis des Pyrokohlens~iurediiithylesters. IV 335

Tabelle 1. In die Untersuchung einbezogene Substanzen

Subst~nz /geak~ionsproduk~ mi~ P K E

Galluss~ure Chlorogens~ure Catechin Milchs/~ure Glycin L-Prolin L-Valin L-Glutaminsgure ~-Lysin Threonin Methionin Cystein ~thanol Ascorbinsaure

Tri-carbgthoxy-galluss~ure Di-carbi~thoxy-ch]orogens~ure Mono- und Di-carb~thoxy-cateclfin Carb~thoxy-milchs~ure N-Carbathoxy-glycin N-Carb~thoxy-~-prolin N-Carb~thoxy-L-Valin N-Carbathoxy-L-glutamins~ure c¢- und s-N-Carbi~thoxy-n-lysin N-Carbathoxy-threonin N-Carb~thoxy-methionin N, S -Dicarbi~thoxy-cystein Di~thylcarbonat Mono- und Di-carb~thoxy-ascorbins~ure

Tabelle 2. Enzymatische Spaltung yon carbiithoxylierten Pflanzenphenolen. (Zahlenangaben: ~1 CO~ in 2 Std. Mittelwerte aus 2--3 Parallelbestimmungen)

Substrat Pankreas- Dfinndarm- Leber- Addukt mi t homogenat schleimhaut- homogena~

homogenat

Catechin

GaUuss&ure

Chlorogens~ure

98 52 120 69 99 104

110 167 204 85 124 208 43 42 85 88 58

Bei der vollst~ndigen Spaltung der jeweils eingesetzten 5 ~mol Substrat h~tten ira Falle des Mono-carbiithoxy-cateehins 112, im Falle der Tri-earb/ithoxy-gallus- s~ure 336, im Falle der Dicarb/ithoxychlorogens~ure 224 ~1 COs entstehen miissen. Die gefundenen Zahlen zeigen, dab unter den Versuehsbedingungen die in Tab. 3 wiedergegebenen Spaltungsraten erreieht warden (~mol Substrat gespalten durch jeweils 100 mg Protein in 2 Std).

Addukt mi~

Catechin

Galluss~ure

Chlorogens~ure

Tabelle 3.

Pankreas- Dfinndarm- Leber- homogenat schleimhaut- homogenat

homogenat tool ~ mol ~ tool

44 13 5,4 31 22 4,7 16 13 3,1 13 9 3,1 9,5 4,8 1,9

20 7,5

Die Carbi~thoxyverbindungen der untersuchten Pflanzenphenole sind demnach Verbindungen, die unter physiologisehen Verh/iltnissen gut gespalten werden, und zwar am besten dureh Pankreas, etwas weniger ergiebig dareh die Diinndarmsehleim- haut und am wenigsten durch die Leber.

Man karm daraus sehlieBen, dab die Carb/ithoxyverbindungen der Pflanzen- phenole im Magen-Darm gespalten und nicht ungespalten resorbiert werden.

336 K. LANG, M. FIiVGERI~OT, ]~. KI~UG und W. RmMOLI) :

Unter den gleichen Versuehsbedingungen wie bei den Pflanzenphenolen wurde die Carbgthoxy-milchsiiure sehlechter gespalten. In 300 rain wurden dureh Nieren- homogenat 2,6, durch Pankreashomogenat 5,1 und durch Darmhomogenat 7,3 ~1 COo in Freiheit gesetzt.

Auch die Spaltung des Di~thylearbonats wurde manometriseh veffolgt (Tab. 4).

Tabelle 4. Enzymatische Spaltung von 2)igthylcarbonat

l~aBeinhei~en in vcmol [ 1Vieren- Dtinndarmschleim- ]

J homogenat hauthomogenat

~nl CQ/Std je Ansatz . . . . . . . . . . . . . . . . . ] 175 52 2 Std gespaltenes Substrat txmol je Ansatz . . . . . . 15,6 4,6

in 2 Std gespaltenes Substrat tzmol je 100 mg Protein. . . 218 83

Di/~thylcarbonat wurde demnaeh durch Nieren und Dtinndarmschleimhaut intensiv gespalten. Durch Pankreashomogenate wurde praktisch keine Spaltung erreieht. Der Versuchsausfa]l zeigt, dab damit zu rechnen ist, dab per os aufge- nommenes Di~thylcarbonat wghrend der Verdauung vSllig gespalten and nicht un- gespalten resorbiert wird. - Die Ergebnisse sind in guter ~bereinstimmung mit Be- funden yon BOI~A~N undLosssR (2), die in einem chronischenVersuch an Ratten (100 Wochen) nnd I tunden (10 Woehen) bei sehr hoher Digthylcarbonat-Dosis keine nachteiligen Befunde feststellen konnten.

Die Spaltung der Carb~thoxy-Aminos~uren wurde mittels Diinnschichtchroma~o- graphie (Freisetzung der Aminosguren) veffolgt. Die Methode erlaubt halbquantitative Aussagen (Tab. 5).

Tabelle 5. Enzymatische Spaltung yon Carbtithoxy-Aminosiiuren. (ZeichenerM~rung: -- keine, (@) sehwaehe, + starke, + + sehr starke Re~ktion)

Carb~thoxyderivat Y o n

Glycin Prolin Va]in Glutamins~ure Lysin-~- Threonin Methionin Cystein

1Viere Spaltung dutch Darm- Pankreas schleimhau~

- - + - -

+ -- + + + + - - _ _

+ + + (+) + + + +

(+) + + +

- - @ - -

Alle Carb~thoxyaminos~uren erwiesen sich als enzymatisch spMtbar. Als Enzympr~parate dienten, wie bei den Versuchen mit Di/~thylcarbonat,

DiMysate des ~berstandes hochtourig zentrifugierter Homogenate yon ]~inder- organen.

Pyrokohlensi~uredi~thylester reagiert auch mit Ascorbins~ure unter Bildung yon Mono- und Di-carb~thoxyverbindungen. Beide Verbindungen hydrolysieren in Wasser und 0,1 n-HC1 leicht spontan. Das l~eaktionsprodukt zeigt bei der Hydrolyse eine Halbwertszeit yon 5 - 1 0 Tagen.

Bei unseren Versuchen hat sich gezeigt, dab dieses Ascorbins~ure-Umsetzungs- lorodukt durch Enzyme nicht oder nur minimal gespalten wird. AuBerdem st6rte

Zur Kenntnis des Pyrokohlensguredigthylesters. IV 337

hierbei die spontane Hydrolyse. Aus diesem Grunde wurde eLL 14C-markiertes Um- setzungsprodukt der Ascorbins/iure mit PKE 1 auf seLL Stoffwechselverha]ten unter- sucht.

Gesunde normal em~hrte Ratten erhielten die wai]rige LSsung des PKE-Adduktes an Ascor~ bins/~ure. Pro Tier wurden 7,5--12 mg/kg K6rpergewicht gegeben (nur 3 Tiere erhielten zwischen 5--6 mg/kg KSrpergewieht).

Die Versuehe ergaben, dM3 die Aktiviti~t aul~erordentlieh rasch ~us dem Organis- mus ausgeschieden wird, was auf eLLen raschen Abbau des Adduktes schlieften li~l~t. So wurden LLnerhMb yon 24 Std im Mittel 54% Ms i4CO 2 abgegeben. Zu diesem Zeit- punkt waren im Tier, jedoch ohne den Verdauungstrakt, noch 1,5% und n~ch 48 Std noch 0,5% der G~be naehzuweisen. Als entspreehende Werte wurden im Blut ge- messen 0,1 und 0,04% der gegebenen Aktivitat, d. h. dal~ nach 48 Std die im Resttier verbliebene Aktivit/it unter 1 % der Gabe liegt. Im Verdauungstrakt nimmt die Aktivit£t sehr rasch ab, yon 8 0 - 9 0 % nach 1,5 Std bis auf 0 ,3 -0 ,5% naeh 24 Std, wie aus Tab. 1 und 2 zu ersehen ist. Nur bei eLLem Tier (Nr. 18) lag die Aktivit&t nach 24 Std bei 10,5%.

Die in einzelnen Organen gemessenen Werte lagen unter 0,4% der Gabe, bezogen auf das Gesamtorgan. Mit dem Kot wurden nach 24 Std zwisehen 1 2 - 3 4 % der Aktivit~t ausgesehieden, mit dem H a m zwischen 4 - 6 % . H6here Werte im H a m dfirften auf Verunreinigungen mit Kot zurfickzuffihren seLL, wie der in Tab. 6 zu- sammengefM~te Versueh zeigt.

Tabelle 6. Prozent,~taler Anteit der gegebenen Aktivitgt im Resttier, Blur und Verdauungstralct mit wachsender Versuchsdauer. Gabe 7,5--12 mg Substanz-PS 76* pro kg K6rpergewicht (Versuehs-

hummer 1--12)

Versuchsdauer Yers. Nr. ll.esttier B l u r Verdauungstrakt Std % der Gabe % der Gabe % der Gabe

12 24

1,5

3

6

48

1 4,37 0,42 78,5 7 3,05 0,43 92,3 2 2,25 0,22 62,0 8 2,87 0,37 86,5 3 1,58 0,15 38,4 9 3,23 0,36 35,3

10 2,22 0,35 67,7 4 0,92 0,08 3,29 5 3,25** 0,05 0,48

11 0,81 0,09 0,27 6 0,35 0,03 0,08

12 0,60 0,05 0,25 * PKE-Umsetzungsprodukte, vgl. Mitt. III.

** Eine geringe Versehmutzung des Felles mit Ko~ ist mSglich.

Um eLLe Ubersieh~ fiber den Anteil der Aktivit~t zu erhalten, der als 14CO 2 vom Tier veratmet wird, und die Verteilung im Resttier auf eLLzelne Organe zu unter- suehen, wurden ffir 3 Versuehszeiten Bilanzversuehe durehgeffihr~.

Dazu setzten wir die Tiere in geschlossene Apparaturen, bei denen die ausgeatmete Luft dutch Natronlauge geleRet wurde and nach ctem Versuch das dort absorbierte 14C02 gemessen werden koante. Aus friiheren Versuehen war sicherges£ellt, dab dabei keine Aktivi~tsverluste auftreten. Kot mad tIarn wurden aufgefangen. Igach dem Versueh tSteten wir die Tiere wie welter unten beschrieben. Zur Messung wurden entnommen: Blur, Verdauungstrakt, Leber, Lunge, Nieren sowie Kot, Ham and Resttier.

1 tterges~llt vom Isotopenlabor der Farbenfabriken Bayer, Elberfeld, im folgenden aueh PS 76 bezeielmet. Siehe auch III. Mitt., diese Z. 182, 325 (1967).

338 K. LiN~, M. F~Ne~R~UT, E. K~U~ und W. REI~OLD :

In Tab. 7 sind die gefuncIenen ~C-Ak~ivit~ten in °/o der Gabe fiir die Versuchszeiten zusammen- gestellb. Die Tiere erhielten 8,1--10 mg PS 76 pro kg KSrpergewieht.

TabeUe 7. laC-Aktivitiiten verschiedener Materialien und Organe von Batten nach Fi~tterung mit dem PKE-Umsetzungsprodukt PS 76

veratmet~ Harn Kot Verdauungs- trak~ Leber Blur Lunge Niere Resttier Summe im TierkSrper Bflanz

Wiedergefundene ~4C-Aktivit~tt bezogen auf die Zufuhr w/ihrend der Versuchszeit yon 6 Std 12 Std 24 Std

bei Ratte 13 in % 14 in % 15 in % 16 in % 17 in % 18 in % 23 in % 22 a in %

23,7 37,0 35,3 48,0 53,3 45,7 66,5 49,8 3,87 1,22 3,41 4,86 4,86 2,88 I0,7 a 21,9 a

47,3 0,15 58,3 26,7 34,2 29,11 17,9 21,6 23,2 57,3 1,89 16,7 1,0 10,5 1,0 0,42

0,23 0,33 0,17 0,28 0,14 0,18 0,16 0,37 0,14 0,22 0,12 0,15 0,015 0,04 0,01 0,02 0,01 0,018 0,03 0,06 0,02 0,05 0,015 0,037 1,74 2,36 1,74 1,94 1,52 1,10

0,18 0,09

2,18 3,16 2,08 2,51 1,80 1,49 1,35 1,27 100,3 98,8 101,0 98,8 95,22 89,72 97,5 95,0

Anmerkung zur Tabelle: 1 Darin sind 1,65% am Fell klebender Aktivib~t en$halSen (Fell mi$ Kot~ verschmiert, wurde

abgezogen und getrennt aufgearbeitet). -~ Die Sl~offweehselrohre waren mit Kot~ verschmier$. Der Kot war verkrustei~ und nieht zu

sammeln. Wegen der hohen Aktivit/it des Ko$es kSimen dadurch 5--10°/o Aktivi~tsverlust~ ein- getreten sein.

3 Mi~ Kot verunreinig~. 4 Tier 22 wurde 16 S~d vor Versuchsbegilm ohne Nahrung gehalten, Wasseraufnahme ad

libitum.

Da bei den vorangegangenen Versuchen die einwandffeie Trennung yon Kob und ttarn nieh~ mSglich war, fixier~en wit 3 Tiere ffir 24 Std so, dab wir den Ham fiber einem Triehter auffangen konnten, ohne dab er mit Kot in Berfihrung kam. Ham und Kob wurden, wie vorher beschrieben,

Tabelle 8. In Ham und Kot inner- halb 24 Std ausgeschiedene I¢C- Aktivitiit bezogen au/ die zuge/iihrte

Menge

14C-Aktivit~t bezogen auf Zlffutir im

Versuchs-l~r. Kot in % H a m in %

19 20 21

22,6 4,87 22,5 3,90 12,3 6,01

gei~renn$ nach Veraschung gemessen. Die Ergebnisse sind in Tab. 8 zusammengefaBt; Gabe 5,0--5,7 mg PS 76 pro kg KSrpergewicht.

Diskuss ion der Ergebnisse

Die vorstehenden Versuche haben gezeigt, da6 die untersuchten Substanzen dutch Enzyme, ins- besondere durch die Enzyme des Verdauungs~rak- tes, ergiebig aufgespalten werden. Daraus folgert, da$ die PKE-Umsetzungsprodukte nicht in nen- nenswerten Mengen resorbier~ werden und da6 dami~ ein Kumulieren dieser Substanzen im Orga.

nismus auszuschliel~en ist. Durch die enzymatische Spaltung der PKE-Umsetzungs- produkte werden aul]er CO 2 und Alkohol die physiologischen Grundsubstanzen dieser Verbindungen, d .h . Polyphenole, Milchs/iure and Aminosiiuren, also die typischen Bestandteile der Lebensmittel, freigesetzb.

])as Ascorbins/~ure-Umsetzungsprodukt nimm~ insofern eine Sonderstellung ein, als bei ibm keine nermenswerte enzymatische Spaltung festgesbellt wurde. Stoff-

Zur Kenntnis des Pyrokohlensaurediathylesters. IV 339

weehselversuehe mit einem i4C-markierten Aseorbins/~ure-PKE-Addukt haben aber gezeigt, dab diese Substanz relativ schlecht resorbiert wird. Im Kot werden nach 24 Std 2 0 - 3 0 % der Aktivit/~t ausgesehieden, was einer Resorption yon 7 0 - 8 0 % entsprechen wfirde, tIierbei ist abet nieht berficksiehtigt, dab nebenher, auch im Kot, die spontane Zersetzung der Substanz verlguft, so dab die wahre Resorption be- deutend niedriger liegt. Die Spontanhydrolyse des labilen Aseorbins~ure-Adduktes liefert neben Ascorbins/~ure nur normale Stoffwechselprodukte des Vitamin C, niimlich Dehydroascorbins/~ure, Diketogulons/~ure und Furfurol.

Von der gegebenen Aktivit/it fanden sich nach 24 Std im Tier nut noch 0 ,5-2 ,0%. Damit ist sichergestellt, dab es nicht zu einer Speicherung der Verbindung im Organis- m.us kommt; effahrungsgem/~g finder man bei/ihnliehen Stoffweehselversuchen stets, dab 1 - 2 % der Aktivit/it dutch Carboxylierung und andere Reaktion in Fette, Kohlenhydrate und andere Verbindungen eingebaut werden.

Die Ergebnisse zeigen, daft die Umsetzungsprodukte des Pyrokohlens/~uredii~thyl- esters keine toxikologischen Probleme aufwerfen. Gegen die Verwendung des Pyro- kohlens/iuredi/~thylesters ffir die Getr/inkeentkeimung k6nnen daher keine medizini- schen Einw/~nde vorgebraeht werden. -- Ffir die Duldbarkeit des Pyrokohlens/iure- di/ithylesters spricht aueh noeh, dab die Untersuchungen mit dessen Umsetzungs- produkten mit weir hSheren Konzentrationen Ms in der Praxis fiblich durehgefiihrt wurden. Einige Beispiele mSgen zeigen, fiber welch hohe Reserveleistung der mensch- fiche Stoffweehsel bei der Spaltung der PKE-Umsetzungsprodukte verffigt. Als Tagesverzehr wurde 1 1 der naehstehenden Getr/~nke angenommen:

PK]~-Dosis

Rotwein mit 10% Alkohol u. 0,2% Catechinderivaten 100 rag/1 Apfelsaft mit 0,15 % Chlorogens£ure 200 rag/1 Orangensaft mit 0,05% Ascorbinsgare 200 rag/1

Nach den Untersuchungen der Farbenfabriken Bayer mit einem l~C-markierten P K E l£Bg sieh die Mengc an PKE-Addukten im Getr ink errechnen. Die ffir Rotwein und Apfelsaft errechneten Werte sind in Tab. 9 dem Spaltungsverm6gen der menseh- lichen Organe gegeniibergestetlt. -- Ffir die lJbersetzung der Ergebnisse unserer Enzym-Versuche auf den Menschen wnrden folgende Organgewichte angenommen:

Pankreas 100 g mit 10% Proteingehalt Dfinndarmschleimhaut 100 g mit 10% ,, Nieren 350 g mit 12% ,,

Tabelle 9

SpaltungsvermSgen der menschl. Organe in Ilmol Pankreas Diinndarm lgiere I Std 24 Std I Std 24 St4 1 Std 24 Std

PKE-Addukte u. deren iVienge pro 1 Adduk~ mg/~tmol

Rotwein : Dia~hylcarbonat 6 51 Catechin 1,15 3,0

Aplelsalt:

- - - - 4150 100000 46000 1100000 1900 44000 900 22000 - - - -

Chlorogensiure 2,05 4,1 750 18000 310 7400 - - - - /

Bei den Tierversuchen mit dem markierten Aseorbins/iure-Umsetzungsprodukt wurde eine Gabe yon 10 mg/kg in wenigen Std abgebaut. Die Aktivit~t im Resttier yon 3 - 4 % sofort naeh der Gabe sank in 12 Std auf weniger als 1% ab. -- Der oben erw/ihnte Orangensaft enth/ilt naeh PKE-Zusatz 7 mg des Ascorbins~ure-Adduktes;

340 K. LAI~O, M. FINGERHUT, E. K/tUG und W. R~EI~iOLI) :

auf den Menschen bezogen, en t sp r ieh t das 0,1 mg/kg - das is t eine 100fach ge- r ingere Menge als bei unseren Versuehen m i t dem mark ie r t en Ascorb ins£ure -Addukt .

Das A b b a u v e r m 6 g e n des Organismus l iegt demnaeh s te ts um einige Zehner- po tenzen fiber den ta t s~ehl iehen Gegebenhei ten. Eine Begrenzung der P K E - D o s i e r u n g is t h ie rnaeh schwer zu begrfinden.

Fa l l s eine Begrenzung der Dosierung aus ande rem AnlaB wiinsehenswer~ er- soheint, mfiBten hierffir technologische und organolept isehe Grfinde herangezogen werden.

Methodik 1. Enzymatische S~altung von carb~ithoxyllerten Pflanzenphenolen und Carb~ithoxymilchsSure

Gesunde Sprague-Dawley-Rat~en wurden in ~thernarkose entblutet. Die Organe wurden rasch entnommen und sofort gekfihlt.

Leber: 10 g Leber warden mit 0,1 m-NaI-ICOa-Puffer 10H 7,5 der vorher mit CO 2 ges~ttig~ war, aui 30 ml aufgeffillt, und in einem laotter-Elvehjem-ttomogenisator homogenisiert. Der ProteingehMt des Homogenats betrug 70--115 rag/m1.

Dfinndarmschleimhaut: Der Darm wurcte in e~wa 10 em lange St/icke zerleg~, aufgeschlitzt und mit 0,9°/oiger KC1 ausgewaschen. Dann wurde die Schleimhaut mit der Glaskante eines Objek~triigers abgeschabt. Nach Aufffillen mit 0,15 m-KC1-L6sung auf 5 ml wurde das Pr~- para~ homogenisiert. Der l~roteingehal~ betrug 15--35 mg/ml.

1)ankreas: Das Pankreas einer Rathe wurde mit 5 ml 0,15 m-KC1-LSsung homogenisiert. Der Proteingehalt betrug 5 --18 mg/ml.

Zusammensetzung der Ans~ze: 2,2 ml 0,1 m-NattCOa-Puffer pit 7,5 vorher mit CO~ durch- s~r6mt. 0,5 ml Substratl6sung (5 tzmol), mit NaOI-I auf 10I-I 7,5 eingestellt (gegebenenfalls unter Zusatz yon I)imethylformamid Ms L6sungsvermittler). 0,5 ml Gewebehomogenat.

Die Ans~tze wurden mit N2, enthaltend 5O/o CQ, durchstr6m~. Nach Temperaturausgleich warde die Reaktion durch Einkipl0en des im Anhang befindiichen Substra~es in Gang gebracht.

2. Enzymatische Spaltung von J~iiithylcarbonat Iqiere, OarmscMeimhaut und Pankreas yon Rindern wurden sofor~ nach dem Schlachten der

Tiere im VerhK1tnis 1 : 1 mi~ 0,1 m Phosphatpuffer pI-I 7,1 homogenisiert. Nach 10 rain wurde 20 rain bei 27000 × g zentrifugier~. DerUbers~and wurde 18 Stcl in der Kiil~e gegenWasser dialy- siert. Der Eiweil3gehalt betrug bei der Niere 7,2, bei der I)finndarmschleimhaut 5,4 rag/m1.

Ans~tze: 0,2 rnl 0,1 m-IqaHCOa-LOsung, 1,0 ral 0,11 nl-Di~thylcarbonat, 0,4 ml Wasser, 1,0 ml Enzyml6sung (Dialysat).

3. Enzymatische Spaltung der Carbiithoxyaminosguren

Als Enzymquelle dienten die tinter 2. (Diii~hylearbona$) besc~'iebenen I)ialysate des ~ber- standes hochtourig zen~rifugierter I-Iomogenate yon l%inderorganen.

Ans~tze: 0,7 ml 0,01 m-Carb~thoxyaminos~ure in Wasser, 0,1 ml 0,1 m-Phosl0ha~puffer pI-I 7,1, 0,2 ml EnzymlSstmg.

Die Ans~ze wurden 3 Std bei 37 ° C inkubiert, lXlach dem Zentrifugieren warden je 10 izl auf die Diinnschichtplatte aufgebrach~ (MN-Cellulose 300 bzw. M_N-Cellulose 300 HR. 15 g Cellulose- loulver -[- 95 ml Wasser). Als Solvens dien~e _~hanol-Eisessig-Wasser 105 : 15 : 30.

~. Sto]wechsel der Mono- und JDi-carbSthoxyascorbins~iure-~aC Substanz: Es wurde ein ~C-markiertes Umsetzprodukt der Ascorbinshare mit Pyrokotflen-

s~arediathylester-(Carbonyl ~aC) verwendet, welches naeh Angabe der Hersteller radiochromato- graphiseh gepriift wurde und weitgehen4 dem Umsetzungsprodukt der Ascorbinsaare und Pyro- kohlens~aredi~thylester-xaC entsprach, wie es in w~ssri~er schwach saarer LSsung, z. B. bei der Entkeimung yon ~ruchbs~ten mit I)KE, gebildet werden kann. Die Substanz hat~e eine sirup- artige Konsis~enz. Wegen ihrer Instabilit~$ wurde sie bis nnmittelbar vor Versuchsbeginn im Kiihlschrank au~bewahrt.

Zum Versuch wttrden aliq~m~e Teile abgewogen und mi~ Wasser ad 20 ml gelSst und das Gesamtgewicht der L~sung ermittelt. ~iir die Untersuehungen wurden yon der L6snng pro Tier 1,5--2 g abgewogen und den Ratten mit der Sehlundsonde verabreicht.

Zur Kenntnis des Pyrokohlens~uredi~thylesters. IV 341

Durch Differenzw~gung wurde die pro Tier verabreichte Substanzmenge ermittelt. Sie betrug ffir:

Versuch 1-- 6 = 9,8--12,0 mg/kg KSrpergewicht Versuch 7--12 = 7,5-- 8,9 mg/kg KSrpergewieht Versuch 13--18 = 8,1--10,0 mg/kg KSrpergewieht Versueh 19--21 = 5,0-- 5,7 mg/kg KSrpergewieht Versuch 22~23 = 11,5--11,6 mg/kg KSrpergewieht

Tiere: Es wurden gesunde m~nnliehe Sprague-Dawley-Ratten mit einem KSrpergewicht yon 170--230 g eingesetzt. Die Tiere konnten his zum Versuchsbegirm Futter und Wasser aufnehmen.

In einer Versuchsreihe wurde die im Blur, Verdauungstrakt und Resttier verbliebene ~4C- Aktivit/~t in Prozenten der Gabe fiber eine Versuchsdauer bis zu 48 Std ermittelt. Die Tiere wurden nach dem Versuch in Narkose dutch Decapitieren getStet, das austretende Blur in 10 ml 30°/0 iger KOH aufgefangen und das Gewicht ermittelt. Der Verdauungstrakt wurde entnommen und in 20 m130% ige KOH gegeben. Das Resttier wurde gewogen und nach Zerkleinern in 100 ml 30°/0 ige KOH eingebraeht.

A11e Fraktionen wurden durch Erhitzen in eine pipettierbare Form fiberffihrt, die verbleiben- den groberen Skeletteile zerkleinert, zweimal mit KOH ausgelaugt und dann verwor~en. Die Suspensionen wurden aufgefiillt mud sofort aliquote Teile zur Messung entnommen. Im Vakuum wurden die Proben zur Troekne gebracht und der ~C-Gehalt naeh Veraschung mit CO~-Tr/igergas in Ionisationskammern fiberffihrt und gemessen.

Zur Eichung wurden aliquote Anteile der verabreichten LSsungen gemessen und daraus die pro Tier gegebene ~C-Aktivit~t = 100°/0 bestimmt.

Zusammen/assung

Die U m s a t z p r o d u k t e yon Pflanzenphenolen, Hydroxysi~uren, Aminos~uren und A thano l mi t Pyrokohlens~uredi i~thylester werden yon den Verdauungsenzymen so rasch und so ergiebig gesp~lten, d~I3 mi t einer Resorp t ion derselben n icht zu rechnen ist. Sie werfen daher , vom Ges ich tspunkt der Ver t r~gl iehkei t her gesehen, keine Prob leme a u f

Die U m s a t z p r o d u k t e mi t Ascorbins~ure (Mono- und Dic~rbi i thoxy-ascorbins~ure) werden durch die Verdauungsenzyme nicht gespal ten. Unte r suchungen mi t den m i t 14C mark i e r t en Carbi~thoxyverbindungen der Ascorbins~ure erg~ben:

1. Beide Verb indungen werden in wi~l]riger LSsung spon tan mi t einer t I a lbwer t s - zeit yon 5 - 1 0 Tagen hydro lys ie r t .

2. Die Resorp t ion der Verb indungen is t schlecht. 3. Die Verb indungen werden im K 5 r p e r n icht gespeieher t sondern abgebaut .

5~ach 24 S td fmden sich im Organismus nur 0 , 5 - 2 ~ o der verabre ich ten Aktiviti~t. Die Verwendung yon Pyrokohlens~ured i~ thy les te r zur Behand lung yon F rue h t -

s~ften und Wein wirf t daher keine toxikologischen Prob leme ~uf und is t yon der gesundhei t l ichen Seite bUS b e t r a c h t e t du ldbar .

Literatur

1. Technical Report Series Nr. 339, S. 9; hrsg. v. d. World Health Organization, Genf 1966. 2. B o n d A g e , G., u. A. LoEsnR: Arch. Toxikol. 22, 98 (1966). 3. PAVLI, 0., u. D. Lo~K~: Diese Z. 325 (1967).

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