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Analytische Chemie I
HPLC Betreuer: Alexandra Barofsky, [email protected], 03641-948177 Matthew Welling, [email protected], 03641-948178 IAAC, Lehrstuhl Instrumentelle Analytik, Lessingstr. 8, Raum 302/306, 07743 Jena
Zu Beginn des Praktikums wird ein Antestat zu den Inhalten des Theorieteils durchgeführt. Bitte beachten Sie dazu folgende Kontrollfragen:
• Was sind die Anwendungsgebiete der HPLC? • Wie ist eine HPLC-Apparatur aufgebaut? • Wofür ist die Präzision der Retentionszeit von Bedeutung? • Wofür ist die Präzision der Peakfläche von Bedeutung? • Welche Vorteile hat die Gradientenelution? • Bei Wiederholmessungen einer Gradientenelution wird eine Unpräzision der
Retentionszeit eines Analyten beobachtet. Geben Sie mögliche Ursachen an. • Nennen Sie eine Eigenschaft, die eine Substanz zur Totzeitbestimmung in der
RP- und in der NP-Chromatographie besitzen muss. Nennen Sie jeweils ein Beispiel.
• Was sind die Forderungen an einen internen Standard? 1. Einleitung Chromatographie fasst physikalische Methoden zusammen, bei denen eine Stofftrennung durch Verteilung zwischen einer stationären und einer mobilen Phase erfolgt. Infolge unterschiedlicher Verteilungskoeffizienten verweilen (retardieren) verschiedene Substanzen unterschiedlich lange an der stationären Phase und durchlaufen daher mit unterschiedlicher Zeit die Trennstrecke. Bei der Flüssigchromatographie wird als mobile Phase ein Gemisch aus zwei oder mehreren flüssigen Komponenten verwendet. Die HPLC (High Performance/Pressure Liquid Chromatography) wurde aus der konventionellen Flüssigchromatographie durch Verwendung immer kleinerer Partikel mit enger Korngrößenverteilung als stationäre Phase entwickelt. Damit kann eine
HPLC
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höhere Auflösung, eine verkürzte Analysendauer, höhere Reproduzierbarkeit und eine Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit erreicht werden. Die stationäre Phase befindet sich in einem Rohr, der Trennsäule. Am Ausgang der Trennsäule werden mit einem Detektor die in zeitlicher Reihenfolge eluierten Komponenten des Gemisches anhand substanzspezifischer Eigenschaften nachgewiesen. Die graphische Darstellung der Signalintensitäten über der Zeit stellt das Chromatogramm dar. Bei der HPLC ist die Löslichkeit der Probe in der mobilen Phase eine Voraussetzung. Da die HPLC praktisch auf alle löslichen Gemische anwendbar ist, erlaubt sie die schonende Trennung, die qualitative und quantitative Analyse von anorganischen Ionen, unpolaren und polaren organischen Verbindungen in allen Molekulargewichtsbereichen. Einsatzgebiete der HPLC-Analyse sind z.B.: - Reinheits- und Produktkontrolle von Industriechemikalien - Bestimmung von Gehalt und Reinheit von Wirkstoffen und Arzneifertigwaren - Bestimmung von Umweltschadstoffen - Analyse der Molmassenverteilung von Polymeren - Trennung und Reinigung von Substanzen mittels präparativer HPLC 2. Aufbau einer HPLC-Apparatur Eine HPLC-Apparatur besteht aus Eluentenvorratsgefäßen, Degaser, Hochdruckförderpumpen, Gradientenmischer, Injektor, Vor- und Trennsäule, Detektor sowie Signalverarbeitung/Datendokumentation. Bild 1. HPLC aus dem Praktikum
Degaser
Pumpe A
Pumpe B
Detektor
Injektion
Abfall
Säule
Kommunikation
Degaser
Pumpe A
Pumpe B
Detektor
Injektion
Abfall
Säule
Kommunikation
HPLC
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Eluenten Auch wenn es einen erheblichen finanziellen Aufwand darstellt werden nur hochreine Lösungsmittel verwendet, da sonst im Chromatogramm Verunreinigungen als dominante Signale auftauchen und sich Verunreinigungen auf der Säule anreichern. Gelöste Luft im Eluenten führt zu Problemen bei der Gradientenmischung in der HPLC und erzeugt „Spikes“ in der Detektorzelle, da hier das zuächst auf hohen Druck komprimierte Lösungsmittel wieder auf Normaldruck expandiert. Der Eluent ist deshalb sorgfältig mit einem Degaser, in dem über eine Membran Vakuum anliegt oder durch Spülen mit Helium zu entgasen. Außerdem ist der Eluent vor photolytischer Veränderung zu schützen (braune Flaschen verwenden). Die Algenbildung wird verhindert indem der wässrigen Phase Methanol oder Acetonitril in geringen Mengen zugesetzt wird. In der HPLC unterscheidet man die isokratische Arbeitsweise und die Gradientenelution. Während bei der isokratischen Arbeitsweise die Eluentenzusammensetzung konstant bleibt, wird die Zusammensetzung des Eluenten in der Gradientenelution im Laufe der Trennung verändert. Injektion Die Probeninjektion erfolgt entweder durch einen Autosampler oder durch Handinjektion. Das Injektionsvolumen wird durch eine auswechselbare Probenschleife (Loop) bestimmt.
Bild 2. Handinjektion über eine Injektionsschleife (Links: Laden der Injektionsschleife. Rechts: Der Inhalt der Schleife wird auf die Säule gespült). Säulen Oft werden Kombinationen aus Vorsäulen und Trennsäulen eingesetzt. Die kurze Vorsäule ist dabei mit demselben Material gefüllt, wie die Trennsäule. Substanzen, die die Säule nicht passieren reichern sich auf der Vorsäule an. Diese kann dann bei Verschmutzung und Verringerung der Trennleistung getauscht werden, was erheblich die Lebensdauer der teuren Trennsäule verlängert. Bei der Säulenpackung wird zwischen Normal- und Umkehrphase unterschieden: Die Normalphase (NP) besteht aus Partikeln an deren Oberfläche SiOH-Gruppen gebunden sind. Als mobile Phase werden unpolare Lösungsmittel wie Heptan oder
HPLC
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Hexan verwendet. Die Polarität wird durch einem geringen Anteil an 2-Propanol eingestellt (Hilfsmittel s. Anhang: Lösungsmittelstärke der eluotropen Reihe). Unter dem Sammelbegriff der Umkehrphase (reversed phase, RP) werden chemisch modifizierte Kieselgele zusammengefasst, die hydrophile Gruppen wie n-Octadecyl, n-Octyl, Methyl oder Phenyl tragen. Es werden Basiskieselgele mit mittleren Porenweiten grösser als 6 nm mit Alkoxy oder Chorsilanen umgesetzt, wobei ca. die Hälfte der ursprünglichen Hydroxylgruppen des Kieselgels ersetzt werden. Als mobile Phase werden Mischungen aus Wasser und Acetonitril, Methanol oder THF verwendet. Bild 3.Vergleich von Normal- und Umkehrphase Bei ionischen oder ionisierbaren Verbindungen (z. B. Säuren, Basen) können Pufferlösungen zugesetzt werden. Die Veränderung der Elutionskraft des Eluenten erfolgt durch die Änderung des Wasseranteils. Beachte: Wasser besitzt die geringste Elutionskraft! Die Einführung anderer funktioneller Gruppen am Kieselgel ermöglicht eine Optimierung der Trennleistung für bestimmte Stoffklassen. Hier gibt es zahlreiche verschiedene Ansätze und hunderte verschiedene Phasen sind kommerziell erhältlich. Auch Kationen- oder Anionenaustauscher können in der HPLC zum Einsatz kommen. Die maximale Massenbeladbarkeit von NP-HPLC-Säulen mit einem Material der Partikelgröße dp = 10 µm liegt bei 10 µg Probensubstanz/ml Phase. Die Beladbarkeit von RP-Phasen ist ca. 5- bis 10-mal größer als die von NP-Phasen. Höhere Beladungen führen zur Verminderung der Auflösung.
SiO
O
O
O
SiO
O
O
O
SiOO
Si
O
O
OH
Si
O
O
OH
Si OH
SiO
O
O
O
SiO
O
O
O
SiOO
Si
O
O
O
Si
O
O
O
SiOH
Si
Si
NormalphaseSi-OH
Umkehrphase RP C18
SiO
O
O
O
SiO
O
O
O
SiOO
Si
O
O
OH
Si
O
O
OH
Si OH
SiO
O
O
O
SiO
O
O
O
SiOO
Si
O
O
O
Si
O
O
O
SiOH
Si
Si
NormalphaseSi-OH
Umkehrphase RP C18
HPLC
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Detektoren Der am weitesten verbreitete Detektor ist der UV/Vis-spektrophotometrischer Detektor, der meist bei einer Wellenlänge die Absorbtion registriert. Dieser Detektor wird auch im Praktikum verwendet. Der DAD (Diodenarraydetektor) erlaubt die Aufnahme von UV/Vis-Spektren über den gesamten Wellenlängenbereich. Weit verbreitet ist auch der Massenspektroskopische Detektor der die on line Aufnahme von Massenspektren während der chromatographischen Auftrennung ermöglicht. Wichtige weitere detektoren sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Bild 4. UV/Vis-spektrophotometrischer Detektor im Praktikum Tabelle 1 Wichtige (nicht spektroskopische) Detektoren für die HPLC Detektor Anwendung Nachweisgrenze Linarität RI-D. universell ≈ 1 µg/mL 3 × 103 (Brechungsindex-D.) kein Gradient! Reflektion interferometrisch UV/VIS-D. nahezu universell ≈ 0,3 µg/mL 104
Chromophor (λmax > 195 nm!) Fluoreszenz-D. selektiv ≈ 0,8 pg/mL 103 - 104 nur fluoreszierende Verbindungen oder für Verbindungen
mit funktioneller Gruppe für eine
Derivatisierung (z. B. Veresterung ROH mit RflCOCl)
Deuterium Lampe Spiegel
Wolfram Halogenlampe
SPA 10AV
Flusszelle
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Elektrochemischer D. selektiv ≈ 1 pg/mL - nur oxidierbare oder reduzierbare Verb. für sehr komplexe Matrices
(Bio-, Umweltanalytik) Leitfähigkeitsd. ionenselektiv ≈ bis zu 0,2% ≈ 104 Unterschied in der Leitfähigkeit zweier Verb. ELSD für Substanzen ohne ≈ 0,3 µg/mL (Lichtstreud.) Chromophor (Zucker; Phosphatide) einzige Forderung: Analyt muß wesentlich höher sieden als Eluent 3. Kennzahlen eines Chromatogramms Bild 5. Kennzahlen eines Chromatogramms Totzeit, to Die Totzeit stellt die Zeit die für den Durchlauf des Eluenten durch die Trennsäule benötigt wird dar. Sie wird mit einer nicht-retardierten Verbindung (eine Substanz auszuwählen, die keine Wechselwirkung mit der stationären Phase zeigt) als Zeit von der Probeninjektion (t = 0) bis zur Detektion gemessen. Sie setzt sich aus dem Beitrag der Trennsäule (Säulentotzeit, to,S) und der apparativen Totzeit (to,app) zusammen.
Rel. Int.
t [min]0
tR1
t0 a b10%
W1/2
w
Rel. Int.
t [min]0
tR1
t0 a b10%
W1/2
w
HPLC
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Bsp. für Substanzen zur Totzeitbestimmung: - NP: n-Hexan; Cyclohexan (Detektor: Brechungsindex (RI)) Tetrachlorethylen; Benzen (Detektor: RI; UV) - RP: Thioharnstoff; HCHO (Detektor: UV) D2O; CD3OH; CD3CN (Detektor: RI)
Zur Berechnung der Säulentotzeit, to,S:
tLu
L qFo S
T, = =
⋅ ⋅ ε (1)
L - Säulenlänge in cm u - lineare Strömungsgeschwindigkeit in cm/min q - Querschnitt der Säule in cm2 (q = r2 ⋅ π)
εT - Porosität (das für die mobile Phase frei verfügbare Volumen in der Säule) F - Flussrate in ml/min Der Unterschied der berechneten zur experimentell bestimmten Totzeit ermöglicht Rückschlüsse über die Güte der Säulenpackung und den Anteil der apparativen Totzeit.
Retentionszeit, tR Die Retentionszeit ist die Verweildauer einer retardierten Substanz im chromatographischen System. Sie wird in der Zeitskala im Peakmaximum abgelesen. tR setzt sich additiv aus der Totzeit (t0) und der Verweildauer in der stationären Phase (ts) zusammen. Unter gleichen Bedingungen (Phasensystem, Flussrate, Temperatur) ist tR für eine Substanz konstant. In der Realität beobachtet man geringe Abweichungen aufgrund von oftmals minimalen Unterschieden im Phasensystem.
Nettoretentionszeit, ts
Die Nettoretentionszeit ist die Verweildauer einer Substanz in der stationären Phase. 0s Rt t t= − (2) Retentionsvolumen, VR Für das Retentionsvolumen VR gilt: R RV t F= ⋅ (3) Die Substanzidentifizierung kann durch Vergleich der Retentionszeiten tR oder besser der Retentionsvolumina VR von Probe und Referenzsubstanzen erfolgen. Voraussetzung sind identische chromatographische Bedingungen für Probe und Referenzsubstanz.
HPLC
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Retentionsfaktor, k´ Der Retentionsfaktor ist das Verhältnis der Verweildauer einer Substanz in der stationären Phase (ts) zur Totzeit (to).
0
0 0´ s Rt t tk
t t−
= = (4)
Der Retentionsfaktor ist eine fluss- und säulendimensionslose Größe zur Kennzeichnung des Retentionsverhaltens einer Substanz in einem gegebenen Phasensystem. k´ bestimmt die Auflösung zweier benachbarter Peaks mit und ist daher ein wichtiger Parameter für die Optimierung einer chromatographischen Trennung. Die Werte für k´ steigen in der NP-Chromatographie - mit steigender spezifischer Oberfläche der stationären Phase - mit abnehmender Polarität der mobilen Phase - mit steigender Polarität der Probensubstanzen - ges. KW < unges. KW < Aromaten < Ether < Nitroverbindungen < Ester < Aldehyde/Ketone < Alkohole < Amine < Karbonsäuren Gang der k´-Werte für RP: Die Substanzen werden nach zunehmendem hydrophoben Charakter verzögert. Säuren < Amine/Alkohole/Phenole/Ester < Ether/Aldehyde/Ketone < Aromaten < Aliphaten Der Retentionsfaktor k´ eliminiert weitgehend geringfügige Änderungen im Phasensystem. Der Vergleich der k´-Werte von Probe und Referenzsubstanz ist daher für die Substanzidentifizierung besser geeignet als der Vergleich von tR oder VR. Bei der Analytik von definierten Gemischen wie in der Wirkstoffanalytik werden auch relative Retentionszeiten (RRT) als Parameter für die Substanzidentifizierung dokumentiert. Dabei werden die Retentionszeiten der Komponenten auf eine Referenzsubstanz S im Gemisch bezogen.
RRTtt
R i
R S= ,
, (5)
Trennfaktor, α Der Trennfaktor α ist das Verhältnis der Verweildauer zweier Substanzen an der stationären Phase und daher das Verhältnis ihrer Retentionsfaktoren. Die später eluierende Komponente steht im Zähler.
(6) 1
2
1,
2,
′′
==kk
tt
s
sα
HPLC
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α ist ein Maß für die Selektivität, d. h. für die Trennfähigkeit eines chromatographischen Systems für zwei Substanzen. α > 1 ist eine prinzipielle Voraussetzung für die Trennung eines Gemisches. Bei α = 1 eluieren zwei Substanzen bei der gleichen Retentionszeit. Die Optimierung von α ist die Hauptaufgabe bei der Methodenentwicklung einer HPLC-Analyse. Tailingfaktor, T Die Peakasymmetrie wird durch das Tailing T beschrieben
abT= (7)
Die Strecken a und b werden bei 10 % der Peakhöhe gemessen (Bild 5). Theoretische Bodenzahl (Trennstufenzahl), N Theoretische Bodenhöhe (Trennstufenhöhe), H Die theoretische Bodenzahl N bzw. die von der Säulendimension unabhängige theoretische Bodenhöhe H (von HETP = Height Equivalent to a Theoretical Plate) ist ein Maß für das Trennvermögen einer Säule. Gl. (8) gilt streng genommen nur für einen symmetrischen Peak (Tailingfaktor T = 1).
2 2
1 / 216 5,54 2R R P R
P
t t h tNw w A
π ⋅⎛ ⎞ ⎛ ⎞ ⎛ ⎞= = =⎜ ⎟ ⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎝ ⎠ ⎝ ⎠ ⎝ ⎠
(8)
w - Peakbreite 1 / 2w - Peakbreite in halber Peakhöhe hP - Peakhöhe im Maximum AP - Peakfläche
HLN
= (9)
L - Säulenlänge H resultiert aus der modellhaften Beschreibung des Zusammenwirkens aller peakverbreiternden Prozesse. Daher stellen Trennstufenzahl bzw. -höhe keine Konstanten für eine Säule dar, sondern verändern sich mit der Retentionszeit. Zur Kontrolle der Trennleistung einer Säule ist deshalb stets die gleiche Verbindung zu verwenden. Die theoretische Bodenhöhe H beschreibt die Breite eines Peaks. Folgende Effekte tragen zur Peakverbreiterung bei: Eddy-Diffusion Die unterschiedlichen Wege der Substanz im Säulenbett. Sie ist abhängig von der Teilchengröße, aber unabhängig von der Strömungsgeschwindigkeit.
HPLC
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Längsdiffusion Die radiale Diffusion der Substanz im Eluenten. Der Anteil am Gesamtwert für H ist umgekehrt proportional zur Strömungsgeschwindigkeit u. Stoffaustausch in mobiler und stationärer Phase Die Statistische Verdünnung der Probenmoleküle in Längsrichtung der Säule. Sie ist proportional zur Strömungsgeschwindigkeit u.
Zur Erreichung des Verteilungsgleichgewichtes müssen die Moleküle zwischen stationärer und mobiler Phase wechseln. Da aber nur längs der Säule ein echter Fluss herrscht, werden die Soluten in alle anderen Richtungen durch Diffusion transportiert, welche durch die Viskosität und die Kollision mit den Partikeln behindert wird. Geringe Viskosität und kleine Partikelgrößen wirken einer Bandenverbreiterung daher entgegen.
Infolge der Viskosität der Flüssigkeit erfolgt die Längsdiffusion in der HPLC-Säule sehr langsam, und eine merkliche Bandenverbreiterung infolge der Längsdiffusion ist nur bei sehr niedrigen Strömungsgeschwindigkeiten der mobilen Phase zu beobachten.
Der Stoffaustausch in der stationären Phase ist der einzige Effekt, der eine Stofftrennung bewirkt. Da die Soluten unterschiedlich weit in die stationäre Phase eindringen, trägt sie zur Peakverbreiterung bei. Je tiefer ein Solut eingedrungen ist, desto länger benötigt er für den Rücktransport in den sich längs der Säule bewegenden Eluentenstrom.
Die Van-Deemter-Funktion stellt den Zusammenhang zwischen theoretischer Bodenhöhe (HETP) und der linearen Strömungsgeschwindigkeit für ein gegebenes Phasensystem dar, H = f (u). Van-Deemter-Funktion
H = A + B / u + C ⋅ u (10) A - Eddy-Diffusion B - Längsdiffusion C - Stoffaustausch in mobiler und stationärer Phase
Bild 6: Van-Deemter-Funktion
Lineare Strömungsgeschwindigkeit u [mm/sec]
HETPH = A term + B term + C term
Optimale TrennstufenzahlC
C
A
1B
1B
Lineare Strömungsgeschwindigkeit u [mm/sec]
HETPH = A term + B term + C term
Optimale TrennstufenzahlC
C
A
1B1B
1B1B
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Folgende Forderungen ergeben sich für die Minimierung einer Peakverbreiterung und damit für die Erhöhung der Trennleistung: - Enge Korngrößenverteilung - Gleiche Form der Partikel (möglichst sphärisch statt irregulär) - Gleichmäßige Säulenpackung - Niedrigviskoser Eluent
- Verwendung möglichst kleiner Partikel Bild 7. Einfluss der Partikelgröße auf HETP Reduzierte Trennstufenhöhe, h HPLC-Säulen können mit reduzierten, dimensionslosen Größen miteinander verglichen werden.
pp dN
LdHh
⋅== (11)
h beschreibt die Höhe einer theoretischen Trennstufe in Vielfachen des Korndurchmessers dp. Reduzierte Strömungsgeschwindigkeit, ν
ν =⋅
=⋅
⋅
u dD
L dt D
p
m
p
o m (12)
ν sagt aus, wie schnell die mobile Phase bezüglich des Korndurchmessers dp und des Diffusionskoeffizienten Dm der Substanz fließt
10 μm Partikel1970er
5 μm Partikel1980er
3.5 μm Partikel1990er
Einfluss der Partikelgröße auf HETPHETP
Lineare Strömungsgeschwindigkeit u [mm/sec]
10 μm Partikel1970er
5 μm Partikel1980er
3.5 μm Partikel1990er
Einfluss der Partikelgröße auf HETPHETP
Lineare Strömungsgeschwindigkeit u [mm/sec]
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Reduzierter Strömungswiderstand, ϕ
ϕη η
=⋅
⋅ ⋅==
⋅ ⋅
⋅
Δ Δp dL u
p d tL
p p o2 2
2 (13)
η - Viskosität in Ns/m2 u - lineare Strömungsgeschwindigkeit in m/s Δp - Druckabfall in N/m2 Mit ϕ kann der Druckabfall auf übersichtliche Weise angegeben werden. Problematisch ist die genaue Kenntnis der Viskosität η des Eluenten. Apparatives Totvolumen, Vo,app Das apparative Totvolumen einer HPLC-Anlage ist das Volumen der Apparatur von der Injektion bis einschließlich der Detektorzelle - ohne Säule! Das Totvolumen hat einen wesentlichen Einfluss auf die Peakschärfe und -form und bestimmt daher ebenfalls die Trennleistung einer HPLC-Anlage. Die experimentelle Bestimmung des apparativen Totvolumens erfolgt durch Ermittlung der Zeit t, die eine Testsubstanz (z. B. Aceton) bei ausgebauter Säule vom Injektor zum Detektor benötigt. Vo,app = F ⋅ t (14) Auflösung, R Die Auflösung R zweier benachbarter Peaks 1 und 2 wird aus einem Chromatogramm nach folgender Beziehung berechnet:
,2 ,1 ,2 ,1
1 2 0,5(1) 0,5(2)
2 1,18R R R Rt t t tR
w w w w− −
= ⋅ = ⋅+ +
(15)
Zur Definition von w und w0,5 siehe Bild 5. Eine vollständige Trennung zweier Peaks (Basislinientrennung) ist erreicht bei R > 1,5. Allerdings hängt der Grad der erreichbaren Trennung auch vom Höhenverhältnis A benachbarter Peaks ab. Je größer der Höhenunterschied ist, desto größer muss R für eine Trennung sein. Werte mit R ≥ 2 sind unerwünscht, da sie nur zu längeren Analysenzeiten und mehr Eluentverbrauch führen.
R = 1,5, A = 1:1 R = 1,0, A = 1:1 R = 0,8, A = 1:1 R = 1,5, A = 10:1 R = 1,0, A = 10:1 R = 0,8, A = 10:1
Bild 8: Auflösung R und Höhenverhältnisse A benachbarter Peaks Die Optimierung der Auflösung R ist eine wesentliche Aufgabe in der Trennungsmethodenentwicklung.
HPLC
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Rk
kN= ⋅
−⋅
′+ ′
⋅0 251
12
2,
αα
(16)
R ist proportional zum Selektivitätsterm, zum Kapazitätsterm und zum Effektivitätstem.
Selektivitätsterm, αα−1
Der Selektivitätsterm wird allein durch das Phasensystem bestimmt. Schon geringfügige Änderungen in der Zusammensetzung der mobilen Phase, der stationären Phase oder der Temperatur können eine drastische Änderung von R bewirken. Durch Variierung dieser drei Variablen kann eine HPLC-Methode optimiert werden.
Kapazitätsterm, k
k′
+ ′2
21
Der Kapazitätsterm hat nur im Wertebereich 0 < k´ < 5 einen merklichen Einfluss auf R. Mit steigendem k´-Wert nähert sich der Term asymptotisch an 1. In der Methodenentwicklung stellt die Optimierung des Kapazitätsterms die erste Aufgabe dar. Der optimale Bereich für k´ beträgt 2 bis 5. Ist dieser Optimalbereich für das zu trennende Gemisch erreichbar, ist eine isokratische Arbeitsweise zu bevorzugen. Liegen in einem Gemisch trotz Optimierung die k´-Werte im Bereich k´<1 und k´ > 10, so ist eine Gradientenelution erforderlich. Effektivitätsterm, N Der Effektivitätsterm wird durch die Trennstufenzahl der Säule bestimmt und kann durch Veränderung der Säulenlänge L (siehe Gl. (9)), der Partikelgröße dp und der linearen Strömungsgeschwindigkeit u optimiert werden. N geht jedoch nur mit der Wurzel in Gl. (15) ein. 4. Quantitative Analytik Die quantitative Analyse einer Substanz i erfolgt über deren Peakfläche Ai. Diese ist über einen Bereich, der nach unten hin durch die Nachweisgrenze und nach oben hin durch die Sättigung limitiert ist linear von der Konzentration des Analyten abhängig. Ai = RFi ⋅ ci (17) RFi ist der sogenannte Responsefaktor des Analyten, der über die Kalibrationsfunktion mit Standardlösungen bekannten Gehalts ermittelt wird. Es finden die Einpunktkalibration und Mehrpunktkalibration mittels linearer Regression Anwendung. Einpunktkalibration Die Einpunktkalibration wird vorzugsweise angewendet, wenn der Gehalt in der Probe in einem vorhersehbaren Bereich liegt, z. B. bei routinemäßiger Qualitätskontrolle von Wirkstoffen. Die Konzentration der Kalibrierlösung muss im selben Bereich wie die der
HPLC
14
Probe liegen. Da bei dieser Methode als zweiter Punkt der Kalibriergeraden der Nullpunkt festgelegt ist, darf sich die Differenz zwischen dem Gehalt an Probe und Standard nur geringfügig unterscheiden. a. Externer Standard Die Kalibierlösung muss alle in der Probe zu bestimmenden Komponenten als Reinsubstanzen in bekannter Konzentration enthalten.
RFAci
i
i= (18)
Mit dem nach Gl. 18 ermittelten Responsefaktor RFi und der gemessenen Peakfläche Ax,i kann die unbekannte Konzentration cx,i der Substanz i berechnet werden:
cARFx i
x i
i,
,= (19)
Die erreichbare relative Standardabweichung (RSD) beträgt ca. 0,2 %. Die Präzision wird vor allem durch eine exakte Probendosierung bestimmt. Um gerätebedingte systematische Fehler zu minimieren, ist der Responsefaktor vor jeder Analyse neu zu bestimmen. b. Interner Standard Die Kalibrierlösung enthält die gleichen Komponenten wie die Probe. Zusätzlich werden allen Kalibrierlösungen und der Probe jeweils die gleiche Stoffmenge eines internen Standards S zugesetzt. In der Praxis erfolgt dies durch Zugabe des jeweils gleichen Volumens einer Lösung des internen Standards zu allen Kalibrations- und Probelösungen. Bei der Auswahl eines internen Standards sind folgende Forderungen zu berücksichtigen: - Er darf in der Probe selbst nicht enthalten sein. - Er soll in der Nähe der zu bestimmenden Substanzen eluieren. - Er darf nicht mit anderen Peaks überlappen. - Er soll eine ähnliche Peakintensität wie die Probe aufweisen. - Bei UV/Vis Detektion sollte er eine ähnliche Absorption wie die Probe besitzen. - Er muss genügend stabil sein und in der erforderlichen Reinheit zur Verfügung
stehen. (Geringfügige) Dosierfehler werden mit dieser Kalibrationsmethode ausgeschaltet. Die erreichbare Präzision ist daher besser als mit externem Standard und beträgt ca. 0,1 %. Für den Responsefaktor RF* (mit IS) gilt folgende Beziehung:
RFA cA c
i S
S i* =
⋅⋅
(20)
HPLC
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Ai - Peakfläche der Referenzsubstanz AS - Peakfläche des internen Standards ci - Konzentration der Referenzsubstanz cS - Konzentration des internen Standards Zur Bestimmung einer unbekannten Konzentration cx,i der Substanz i, wird der Probelösung die gleiche Menge an internem Standard zugesetzt. Für die unbekannte Konzentration cx,i gilt die Beziehung:
cA c
A RFx ix i S
S,
,
*=
⋅⋅
(21)
Mehrpunktkalibration mittels linearer Regression Wenn die zu bestimmende Konzentration in einem größeren Intervall liegen kann, müssen die Kalibrierstandards den gesamten Konzentrationsbereich abdecken. a. Externer Standard Die Kalibration erfolgt mit Standardlösungen des zu bestimmenden Analyten. Für die Wertepaare (Konzentration; Peakfläche) lässt sich eine Regressionsfunktion ermitteln. Für einen linearen Zusammenhang gilt die Beziehung:
iiioi caaA ⋅+= ,1, (22)
Die Steigung a1 stellt die Empfindlichkeit der Methode dar und sollte möglichst groß sein. Der Achsabschnitt ao entspricht dem Blindwert. Aus Gl. 22 folgt die Analysenfunktion, mit der die Konzentration unbekannter Proben berechnet werden kann.
i
ioixix a
aAc
,1
,,,
−= (23)
b. Interner Standard Allen Kalibrierstandardlösungen sowie der Probelösung wird die gleiche Menge eines internen Standards zugefügt. Für die lineare Regression erhält man Gl. 24, woraus sich die Beziehung für die Berechnung unbekannter Konzentrationen ableiten lässt (Gl. 25).
s
iiio
s
i
ccaa
AA
⋅′+′= ,1, (24)
si
ios
ix
ix ca
aAA
c ⋅⎟⎟⎟⎟
⎠
⎞
⎜⎜⎜⎜
⎝
⎛
′
′−=
,1
,,
, (25)
HPLC
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5. Praktikumsaufgaben Versuch 1 1.1 Nennen Sie die Parameter der Säule und den Eluent.
1.2 Begründen Sie die Auswahl der Detektionswellenlänge von 270 nm.
1.3 Geben Sie 1 ml/min Flussrate (Hexan/2% i-Propanol) ein und messen Sie über
mindestens 3 min das Volumen, um die Flussrate zu überprüfen.
1.4 Berechnen Sie die relative Standardabweichung.
1.5 Injizieren Sie jeweils 20 μl, 50 μl und 100 μl einer Biphenyllösung und stellen Sie die Retentionszeiten und Peakflächen tabellarisch dar.
1.6 Diskutieren Sie welches Injektionsvolumen bei der verwendeten 20 μl Probenschleife reproduzierbare Retentionszeiten und Peakflächen liefert und wiederholen sie die Injektion mit dem ausgewähltem Volumen 2 mal.
1.7 Bestimmen Sie mit einer geeigneten Verbindung die Totzeit. Zur Auswahl stehen Lösungen folgender Verbindungen: Tetrachlorethan, Tetrachlorethylen, Benzen. Begründen Sie die Eignung bzw. Nichteignung der Substanzen.
1.8 Berechnen Sie die Totzeit mit den gegebenen Säulenparametern und geben Sie die prozentuale Abweichung an. Berechnen Sie das apparative Totvolumen und geben Sie Ursachen für ein zu großes Totvolumen einer HPLC-Apparatur an!
1.9 Welche Ursachen kommen in Betracht, wenn zwischen der berechneten und der experimentell bestimmten Totzeit eine Differenz besteht?
Versuch 2 2.1 Nehmen Sie ein Chromatogramm einer Lösung aus Biphenyl,
Dimethoxybenzaldehyd, Nitrobenzen, Ergosterol und 6-Methoxytetralon auf.
CH3O
O
ErgosterolHO
Nitrobenzen
NO2
Dimethoxybenzaldehyd
CH3O
CHO
OCH3
Biphenyl
6-Methoxytetralon
HPLC
17
2.2 Ordnen Sie die Peaks den Komponenten des Gemischs zu und begründen Sie die Reihenfolge.
2.3 Die Richtigkeit der Zuordnung ist für ausgewählte Peaks durch den Vergleich der UV Spektren mit einer Spektrenbibliothek und/oder durch Aufnahme des Chromatogramms der jeweiligen Reinsubstanz unter den gleichen chromatographischen Bedingungen zu überprüfen.
2.4 Folgende Parameter sind für alle Peaks aus dem Chromatogramm zu ermitteln: Retentionszeit, Nettoretentionszeit, Retentionsfaktor, Retentionsvolumen und Tailing.
2.5 Die theoretische Bodenzahl für Biphenyl, Dimethoxybenzaldehyd und Methoxytetralon zu bestimmen! Die Ergebnisse sind tabellarisch zusammenzustellen!
2.6 Welche Schlussfolgerungen ergeben sich daraus für die Wahl eines Stoffes bzw. Stoffgemisches für die experimentelle Bestimmung der theoretischen Bodenzahl?
Versuch 3 Der Wirkstoff Dihydrotachysterol (DHT) kann aus Dihydrovitamin D2 (DHV) durch jodkatalysierte Photoisomerisierung synthetisiert werden:
CH3
HO
H3C
OH
I2; hv
DHV DHT
3.1 Nehmen Sie ein Chromatogramm des gegebenen Bestrahlungsgemischs auf und geben Sie Retentionszeiten, Retentionsfaktoren, Tailingfaktoren und Auflösung an und bewerten Sie die Kenngrößen.
Es sind Konzentration und Umsatz Xi an DHV in dem gegebenen Bestrahlungsgemisch zu bestimmen! Die Konzentration von DHV vor der Bestrahlung betrug 41,92 μg/ml. Es ist die Mehrpunktkalibration mit der Methode des internen Standards durchzuführen!
3.2 Es ist selbständig eine geeignete Referenzsubstanz für den internen Standard aus folgendem Angebot zu wählen, und die Auswahl ist zu begründen!
OH
OHOH
Vitamin D3 Vitamin D2
Cholesterol
R1 = Ergosterol
Biphenyl
R
R2 = CH3COOR1 = OH
R2 = Ergosterolacetat
OH
OHOH
Vitamin D3 Vitamin D2
Cholesterol
R1 = Ergosterol
Biphenyl
R
R2 = CH3COOR1 = OH
R2 = Ergosterolacetat
HPLC
18
3.3 Es sind aus der Stammlösung von DHV (c = 40 μg/ml) 4 Kalibrationslösungen
herzustellen denen jeweils 0,5 ml der internen Standardlösung zugesetzt werden. Die Volumina der Kalibrationslösungen sollen 2 ml betragen und enthalten jeweils 0,25 ml, 0,5 ml, 0,75 ml oder 1 ml Stammlösung DHV.
3.4 Ermitteln Sie die Kalibrationsfunktion!
3.5 Berechnen Sie die DHV-Konzentration und den Umsatz des Bestrahlungsgemisches indem Sie 1 ml des Bestrahlungsgemisches 0,5 ml der Standardlösung zusetzen und auf 2 ml auffüllen.
3.6 Geben Sie die Konzentration des Standards, die Peakflächen von DHV und des Standards sowie das Verhältnis von ADHV/AS in der Mischung an.
Aufgaben: A1 HPLC-Analysen werden unter gleichen Bedingungen durchgeführt, es wird jedoch eine
veränderte Totzeit gemessen. Welche Informationen erhält man daraus?
A2 Eine Trennsäule mit den Maßen 250 x 3,2 mm ist mit Kieselgel (dp = 5 µm)gefüllt. Mit dem Eluent n-Hexan (Viskosität η = 0,33 mPa s) wurde - mit einem Druckabfall von 70 bar - eine Totzeit von to= 1 min gemessen. Berechnen Sie die reduzierten Größen ν und ϕ!
A3 Das apparative Totvolumen ist mit folgenden Daten für eine HPLC-Anlage zu berechnen und zu bewerten: Testsubstanz: Aceton; Flussrate 0,2 ml/min Gemessene Peakspitze bei t = 35 s Welche Ursachen sind in Betracht zu ziehen, wenn das Totvolumen für eineHPLC-Apparatur zu groß ist!
A4 Eine HPLC-Säule hat die Abmessung 250 x 4 mm. Schätzen Sie ab, welche Mengen an Probesubstanz für eine analytischeTrennung aufgegeben werden kann bei Verwendung von a) einer NP-HPLC-Säule und b) einer RP-HPLC-Säule!
A5 In welcher Reihenfolge eluieren Anilin, Benzoesäuremethylester, Ethylbenzen, Phenol, Thioharnstoff, Toluen und p-Toluidin auf einer RP-Säule und warum?
A6 Welche Veränderungen sind zu erwarten, wenn eine Trennsäule mit der Porenweite von 60 Å anstelle von einer Trennsäule mit 10 nm Porenweite verwendet wird und warum?
HPLC
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6. Anhang Lösungsmittelstärke der eluotropen Reihe Lösungsmittel Lösungsmittelstärke n-Hexan Isooctan Cyclohexan Tetrachlorkohlenstoff Isopropylether Toluen n-Propylchlorid Benzen Diethylether Chloroform Methylenchlorid Tetrahydrofuran Ethylendichlorid Aceton Dioxan Essigsäureethylester Amylalkohol Dimethylsulfoxid Nitromethan Acetonitril Iso- und n-Propanol Pyridin Ethanol Methanol Essigsäure Wasser
0,01 0,01 0,04 0,18 0,28 0,29 0,3 0,32 0,38 0,4 0,42 0,45 0,49 0,56 0,56 0,58 0,61 0,62 0,64 0,65 0,82 0,71 0,88 0,95 groß sehr groß
Literatur: K. K. Unger, Handbuch der HPLC, Teil 1, 1995, GIT Verlag Didaoui L, Touabet A, Ahmed AYBH, et al., Evaluation of dead time calculation in reversed-phase liquid chromatography using a multiparametric mathematical method, HRC Journal of High Resolution Chromatography, 22 (10): 559-564, 1999. Wren SAC, Peak capacity in gradient ultra performance liquid chromatography (UPLC) Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 38 (2): 337-343, 2005. Bildnachweis: www.waters.com www.advancedscientifichealth.com www.cibnor.mx www.abc.net.au http://users.utu.fi/juhrau/birch.jpg Yokono T. Nakahara M, Makino, et al., Application of carbon microbeads for column packing for high performance liquid chromatography, Journal of Materials Science Letters, 7 (8): 864-866, 1988.
