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Aus der
Medizinischen Klinik I
des St. Josef Hospital Bochum
-Universitätsklinik-
der Ruhr-Universität Bochum
Prof. Dr. med. W.E. Schmidt
Pankreatitis bei Patienten mit Hyperparathyreoidismus:
Assoziation mit Mutationen
im SPINK1 und CFTR Gen
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Tilman Horn
aus Essen
2008
Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent: Prof. Dr. med. W.E. Schmidt
Koreferent: Prof. Dr. med. J. T. Epplen
Tag der mündlichen Prüfung: 29.10.2009
Abstract / Kurzzusammenfassung Tilman Horn
Pankreatitis bei Patienten mit Hyperparathyreoidismus: Assoziation mit Mutationen
im SPINK1 und CFTR Gen
Problem: Die Hyperkalzämie bei Patienten mit primärem Hyperparathyreoidismus
(pHPT) gilt als Auslöser für die Entstehung einer Pankreatitis. Dieser
Zusammenhang scheint nur milde ausgeprägt, denn die Prävalenz-Raten der
Pankreatitis in großen Kollektiven liegen zwischen 1,5 und 3,5 %. Im Rahmen
dieser Dissertation sollte überprüft werden, erstens: wie häufig eine Pankreatitis in
einer der größten Kohorten Deutschlands von Patienten mit einem primären
Hyperparathyreoidismus auftritt und zweitens: ob die Entstehung einer
Pankreatitis möglicherweise durch andere bekannte genetische Risikofaktoren für
eine Pankreatitis wie PRSS1, SPINK1 und CFTR Mutationen bedingt sein könnte.
Methode: In einer Kohorte von 826 Patienten mit pHPT, die prospektiv in den
Jahren 1987 bis 2002 charakterisiert worden waren, wurde bei 38 Patienten eine
Pankreatitis diagnostiziert (4,6 %). Von 25 dieser Patienten (12 Frauen und 13
Männern) konnte DNA gewonnen und auf Mutationen im Serin Protease Inhibitor
Kazal Typ I Gen (SPINK1, N34S), sowie dem kationischen Trypsinogen (PRSS1,
N29I und R122H) mittels Schmelzpunktanalyse untersucht werden. Zur Analyse
der CFTR Mutationen (36 Mutationen/Tn-Polymorphismus) wurde ein
Hybridisierungskit benutzt. Als Kontrolle dienten 50 Patienten mit einem pHPT
ohne Pankreatitis.
Ergebnis: Das Pankreatitisrisiko ist bei Patienten mit einem pHPT um ein 10-
faches erhöht. Bei 4 von 25 Patienten mit pHPT und Pankreatitis konnte eine
N34S Mutation im SPINK1-Gen identifiziert werden (16 %) (OR 8,0;
Konfidenzintervall 1,0- 15,2; p < 0,001), wohingegen keine der 50 Kontrollen eine
Mutation aufwies. Bei 4 Patienten wurden CFTR-Mutationen detektiert (OR 4,2;
Konfidenzintervall 0,4- 7,9; p 0,002) und bei einem Patienten das 5T Allel. Ein
Patient war transheterozygot für eine SPINK1 (N34S) und CFTR (R553X)
Mutation. PRSS1 Mutationen fanden sich bei keinem der analysierten pHPT
Patienten mit Pankreatitis.
Diskussion: Die Auftretenshäufigkeit einer Pankreatitis in der Kohorte mit 4,6 %
ist vergleichbar mit dem Auftreten in zuvor publizierten Studien und gegenüber der
Normalbevölkerung erhöht. Dabei lassen die hier erhobenen Daten erneut
vermuten, dass die pHPT vermittelte Hyperkalzämie nur eine untergeordnete Rolle
bei der Entstehung einer Pankreatitis spielt. Erstmalig wurden zudem additive
Risikofaktoren identifiziert und es konnte gezeigt werden, dass es bei Patienten
mit pHPT und Pankreatitis eine starke Assoziation mit Mutationen im SPINK1- und
CFTR-Gen gibt, als Anhalt für eine multifaktorielle Ursache der Pankreatitis bei
Hyperparathyreoidismus.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung .................................................................................................................... 7 1.1 Hyperparathyreoidismus ..................................................................................... 7 1.2 Pankreatitis.......................................................................................................... 8
1.2.1 Akute Pankreatitis........................................................................................ 9 1.2.2 Chronische Pankreatitis............................................................................. 11
1.3 Genetische Ursachen für eine Pankreatitis ....................................................... 13 1.3.1 Hereditäre Pankreatitis .............................................................................. 13
1.4 Pankreatitis assoziierte und modifizierende Gene ............................................ 14 1.4.1 Serinproteaseninhibitor Kazal-Typ I (SPINK1 : GenBank #AF286028 ).... 14 1.4.2 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) ............ 14
1.5 Pankreatitis und pHPT ...................................................................................... 15 1.6 Fragestellung..................................................................................................... 16
2 Patienten ................................................................................................................... 17 2.1 pHPT-Kohorte ................................................................................................... 17 2.2 Patienten mit pHPT und Pankreatitis ................................................................ 17 2.3 pHPT Kontroll-Gruppe ohne Pankreatitis .......................................................... 18 2.4 Ethikvotum......................................................................................................... 18
3 Material und Methoden: ............................................................................................ 19 3.1 DNA-Extraktion.................................................................................................. 19 3.2 Schmelzkurvenanalyse und Real-Time-PCR am LightCycler™ für SPINK1-
(N34S) und PRSS1-(N29I und R122H) Mutationen...................................................... 20 3.3 Master Mix Ansätze für PRSS1 (N29I, R122H) und SPINK1 (N34S)................ 23 3.4 DNA-Sequenzierung ......................................................................................... 24 3.5 CFTR-Analyse................................................................................................... 25 3.6 Verbrauchsmaterialien ...................................................................................... 27 3.7 Geräte ............................................................................................................... 28 3.8 Statistik.............................................................................................................. 28
4 Ergebnisse ................................................................................................................ 29 4.1 Klinische Daten der Gesamtkohorte.................................................................. 29 4.2 Klinische Daten der Patienten mit pHPT und Pankreatitis ................................ 29
4.2.1 Mutationsanalyse....................................................................................... 30 4.2.2 PRSS 1-Gen-Mutationen........................................................................... 30 4.2.3 SPINK 1-Gen-Mutationen.......................................................................... 30 4.2.4 CFTR-Gen-Mutationen .............................................................................. 32 4.2.5 Transheterozygoter Patient (SPINK1: N34S/ CFTR: R553X) mit pHPT und
Pankreatitis ............................................................................................................... 34
5 Diskussion................................................................................................................. 39 6 Literaturverzeichnis ................................................................................................... 50
Abkürzungsverzeichnis:
ACP alkoholisch bedingte chronische Pankreatitis
AP akute Pankreatitis
CaSR Calcium Sensing Rezeptor
CF zystische Fibrose
CFTR cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
Cl¯ Chlorid-Ion
CP chronische Pankreatitis
DNA Desoxyribonukleinsäure
FRET fluorescence resonance energy transfer
H2O Wasser
HP hereditäre Pankreatitis
ICP Idiopathisch chronische Pankreatitis
LC LightCycler
MgCl2 Magnesiumchlorid
NaCl Natriumchlorid
OMIM Online Mendelian Inheritance in Man
((OMIM):http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
PCR Polymerasekettenreaktion
pHPT primärer Hyperparathyreoidismus
PRSS1 Serinprotease 1 (kationisches Trypsinogen)
PTH Parathormon
SPINK1 Serinproteinaseinhibitor Kazal Typ 1
TP tropische Pankreatitis
Ferner wurden im Text der international gültige Einbuchstaben-Code der Aminosäuren
und die Abkürzungen der Fachzeitschriften verwendet.
5
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Ursachen der akuten Pankreatitis modifiziert nach Greenberger und Toskes
[33] ............................................................................................................................. 10 Tabelle 2:TIGAR-O-Klassifikation (Ursachen der chronischen Pankreatitis) modifiziert
nach Etemad und Whitcomb [29]............................................................................... 12 Tabelle 3 : Mutationen auf dem INNO-LiPA CFTR 19-Teststreifen .................................. 26 Tabelle 4: Mutationen und Tn polymorphismen auf dem INNO-LiPA CFTR 17+Tn-
Teststreifen ................................................................................................................ 27 Tabelle 5: Charakteristik der Gesamtkohorte und der Patienten mit pHPT und Pankreatitis
................................................................................................................................... 35 Tabelle 6: Ergebnis der (PRSS1, SPINK1 und CFTR) Mutationsanalysen bei Patienten mit
pHPT und Pankreatitis ............................................................................................... 36 Tabelle 7: Häufigkeitswahrscheinlichkeit der N34S SPINK1 und CFTR Mutationen bei
pHPT und Pankreatitis ............................................................................................... 37 Tabelle 8: Charakterisierung der Patienten mit pHPT und Pankreatitis............................ 38 Tabelle 9:Studien zur Korrelation pHPT/Pankreatitis........................................................ 39
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Beispiel einer Schmelzkurvenanalyse für eine SPINK1 N34S Mutation ...... 22 Abbildung 2: CFTR Testkarte............................................................................................ 26 Abbildung 3: SPINK1-(N34S)-Schmelzkurvenanalyse für pHPT/Pankreatitis Patienten .. 32 Abbildung 4: INNO LIPA CFTR 19 Testkarte für Patienten mit pHPT und Pankreatitis.... 34
6
1 Einleitung
1.1 Hyperparathyreoidismus
Der Hyperparathyreoidismus ist eine Erkrankung der Nebenschilddrüse mit einer
generalisierten Störung des Kalzium-, Phosphat- und Knochenstoffwechsels
infolge einer vermehrten Parathormonproduktion. Die Erhöhung des zirkulierenden
Parathormons (PTH) führt zu einer Hyperkalzämie und Hypophosphatämie. Der
primäre Hyperparathyreoidismus (pHPT) gehört zu den häufigen
endokrinologischen Erkrankungen mit einer Prävalenz von ca. 0,2 bis 0,4 %.
Frauen sind zwei- bis dreimal häufiger betroffen als Männer [41]. Meistens wird die
Diagnose nach dem 40. Lebensjahr gestellt. Bei mehr als 80 % der Patienten mit
pHPT ist ein singuläres Adenom der Nebenschilddrüse die Ursache [83]. Weitere
Ursachen für einen Hyperparathyreoidismus sind multiple Adenome der
Nebenschilddrüse (5 %), Hyperplasie der Epithelkörperchen (15 %) und
Karzinome der Epithelkörperchen (<1 %). Selten wird ein Hyperparathyreodismus
im Rahmen einer multiplen endokrinen Neoplasien (MEN, autosomal dominante
Vererbung) beobachtet. Die MEN-1 (Wermer-Syndrom) weist neben dem
Hyperparathyreoidismus Tumoren der Hypophyse und des Pankreas auf und ist
mit einer Magensäurehypersekretion und einem Ulkusleiden (Zollinger-Ellison-
Syndrom) assoziiert. Die MEN-2A (Sipple-Syndrom) ist durch ein
Phäochromozytom, ein medulläres Schilddrüsenkarzinom und einen
Hyperparathyreoidismus charakterisiert, bei der MEN-2B (Gorlin-Syndrom) treten
zusätzlich Neurinome auf, meist jedoch kein Hyperparathyreoidismus [34].
Die Störung der Kalziumhomöostase resultiert aus der vermehrten PTH Sekretion
und seiner Wirkung im physiologischen Regelkreis. Dieser ist durch die
Steuerungselemente der ossären Kalzium-Mobilisierung, Steigerung der
intestinalen Kalzium-Resorption und Steigerung der tubulären Kalzium-
Reabsorption gekennzeichnet.
Die klassische Symptomtrias "Stein-, Bein- und Magenpein" im Sinne einer
Nephrolithiasis, der Osteitis fibrosa cystica sowie Dyspepsie oder Ulcera ventriculi
findet man heute eher selten [2, 13]. Die Diagnose des pHPT ist daher oft eine
Zufallsdiagnose bei erhöhtem Kalziumspiegel. Bei genauerer Befragung der
7
Patienten mit pHPT gibt die Mehrzahl der Patienten jedoch Beschwerden wie
Abgeschlagenheit, Müdigkeit, Reizbarkeit und Mangel an sexuellem und
emotinalem Interesse an [36, 37, 54].
Die initiale Verdachtsdiagnose kann laborchemisch bestätigt werden. Es imponiert
ein erhöhtes Kalzium (Serumkalzium > 2,6 mmol/l (Normwert: 2,2-2,6 mmol/l) bei
normaler Nierenfunktion und normalem Gesamteiweiß), ein erniedrigtes Phosphat
und ein erhöhtes intaktes PTH im Serum. Im Urin lässt sich ein erhöhter Kalzium
und Phosphatspiegel nachweisen.
Im Rahmen der Lokalisationsdiagnostik spielt die Sonographie des Halses zur
Diagnostizierung vergrößerter Nebenschilddrüsen, bei eingeschränkter
Sensitivität, eine wichtige Rolle. Sensitiver scheinen Computertomographie oder
Szintigraphie. Die Erfolgsquote der bilateralen explorativen Parathyreoidektomie
durch einen erfahrenen, endokrinen Chirurgen liegt bei ca. 95 Prozent [46].
Die kurative Therapie der Wahl ist eine Entfernung der vergrößerten
Epithelkörperchen, wobei die Indikation zur Operation dann vorliegt, wenn es sich
um einen symptomatischen pHPT handelt.
Durch rechtzeitige Entfernung der vergrößerten Epithelkörperchen ist die
Erkrankung heilbar.
1.2 Pankreatitis
Die Pankreatitis ist eine abakterielle entzündliche Erkrankung der
Bauchspeicheldrüse.
Bereits 1896 wurde von Chiari die Hypothese postuliert, dass das entscheidende
Ereignis für die Entstehung einer Pankreatitis die Selbstverdauung durch die
eigenen Verdauungsenzyme ist [17].
Bei der Pankreatitis kann man die akute, die akut rekurrierende und die
chronische Form unterscheiden (siehe 1.2.1 und 1.2.2).
Die alterspezifische Häufigkeit in den westlichen Industrieländern zeigt einen
Gipfel in der Altersgruppe zwischen 35 und 44 Jahren. Die Inzidenz der akuten
Pankreatitis beträgt ca. 10 Neuerkrankungen pro 100.000 Einwohnern und Jahr
8
[8, 79], die Inzidenz der chronischen Pankreatitis beträgt zwischen 3,5 bis 10
Neuerkrankungen pro 100.000 Einwohner und Jahr [4, 15, 48, 88].
1.2.1 Akute Pankreatitis
Die akute Pankreatitis zeigt einen weit differierenden klinischen Verlauf. Von der
klinisch milde verlaufenden, interstitiell-ödematösen Form (70 - 80 %) [8] bis zur
hämorrhagisch-nekrotisierenden Form (20 - 30 %) [14, 44] mit generalisierter
Sepsis und Multiorganversagen sind alle Ausprägungen möglich und werden im
klinischen Alltag gesehen [76]. Bei der milden Form beträgt die Letalität weniger
als 2 % [9], wohingegen bei schwerem Verlauf die Letalität 15 - 25 % [32] beträgt.
Symptome einer akuten Pankreatitis sind plötzlich einsetzende
Oberbauchschmerzen, Übelkeit, Erbrechen und Fieber. Diagnosekriterien sind
neben den klinischen Symptomen die Erhöhung der pankreatischen Enzyme:
Amylase und Lipase (über das Dreifache des oberen Grenzwertes) und
bildmorphologische Kriterien im transabdominellen Ultraschall oder Abdomen-CT
wie z.B. ein peripankreatisches Ödem oder Nekrosen. Auch die Kalzium-,
Magnesium-, Natrium-, Kalium-, Bikarbonat-, Glukose- oder Fettwerte im Blut
können erhöht sein.
Pathophysiologische Modelle zeigen, dass sich die akute Pankreatitis in drei
Phasen entwickelt [35].
Die erste Phase ist charakterisiert durch die intrapankreatische Aktivierung von
Verdauungsenzymen mit darauf folgender Schädigung der Azinuszellen. Trypsin
spielt hierbei eine entscheidende Rolle, denn neben der Fähigkeit zur Aktivierung
anderer Zymogene wie Proelastase, Chymotrypsinogen besteht die Fähigkeit zur
Autoaktivierung.
Die zweite Phase beinhaltet eine proinflammatorische Reaktion unterschiedlicher
Ausprägung mit Aktivierung, Chemoattraktion und Sequestration von Neutrophilen
im Pankreas, sowie der Ausschüttung unterschiedlicher Zytokine.
Die dritte Phase umfasst die lokalen und systemischen Auswirkungen der
aktivierten proteolytischen Enzyme und der freigesetzten proinflammatorischen
Mediatoren.
9
Vielfältige Auslöser für eine akute Pankreatitis sind bekannt. Die beiden häufigsten
Ursachen sind Gallensteine und Alkoholkonsum (ca. 90 %) [12, 86]. Weitere
Ursachen zeigt Tabelle 1, wobei in diesem Zusammenhang auch die
Hyperkalzämie als mögliche Ursache einer akuten Pankreatitis aufgeführt wird.
Tabelle 1: Ursachen der akuten Pankreatitis modifiziert nach Greenberger und
Toskes [33]
häufige Ursachen - Gallensteine (einschließlich Mikrolithiasis) (30-60 %)
- Alkohol (akuter und chronischer Alkoholismus (15-
30 %)
- Hypertriglyceridämie
- Endoskopisch retrograde
Cholangiopankreatikographie (ERCP), besonders
nach Papillen-Manometrie
- Trauma (besonders stumpfes abdominelles Trauma)
- postoperativ (abdominelle und nicht abdominelle
Operationen)
- Arzneimittel (z.B. Azathioprin, 6-Mercaptopurin,
Sulfonamide, Östrogene,Tetrazykline, Valproat,
antiretrovirale Substanzen)
- Sphinkter-Oddi-Dysfunktion
seltene Ursachen - vaskuläre Veränderungen und Vaskulitis
- (Ischämie nach Herzoperationen)
- Kollagenosen und thrombotisch
thrombozytopenische Purpura (TTP)
- Pankreaskarzinom
- Hyperkalzämie - Periampulläre Divertikel
- Pankreas divisum
- hereditäre Pankreatitis
- mit Pankreatitis assoziierte Mutationen (z.B. SPINK1,
CFTR)
- Zystische Fibrose
- Niereninsuffizienz
sehr seltene Ursachen - Infektionen ( Mumps, Coxsackie-Viren,
Zytomegalievirus, Echovirus, Parasiten)
- Autoimmunerkrankungen ( z.B. Sjögren-Syndrom)
10
Die Therapie der akuten Pankreatitis ist überwiegend auf supportive Maßnahmen
beschränkt, wie intensivmedizinische Überwachung bei schwerem Verlauf,
analgetische Therapie, ggf. Nahrungskarenz, ausreichende
Flüssigkeitssubstitution, eventuell Antibiotika-Gabe und ggf. eine chirurgische
Intervention bei Komplikationen [25]. Circa 90 % der AP-Fälle heilen ohne
Residuen aus, wohingegen es in etwa 10 % zu einem allmählichen Übergang von
der akuten in eine chronische Pankreatitis kommt.
1.2.2 Chronische Pankreatitis
Bei der chronische Pankreatitis (CP) handelt es sich um eine rekurrierende oder
kontinuierliche entzündliche Erkrankung des Pankreas. Sie ist durch irreversible
morphologische Veränderungen charakterisiert und mündet bei einem Teil der
Patienten in einem exokrinen und endokrinen Funktionsverlust [84].
Im Verlauf der Erkrankung kann es durch die exokrine und/oder endokrine
Pankreasinsuffizienz zu Maldigestion, Gewichtsverlust, Steatorrhoe und
Insulinmangeldiabetes kommen. Weitere Komplikationen sind
Pankreaspseudozysten, Milz- und Pfortaderthrombosen, Stenosen des
Pankreasgangsystems oder des distalen Ductus choledochus. Die Patienten
leiden insbesondere an chronischen Oberbauchschmerzen, Gewichtsverlust und
Steatorrhoe. Mit zunehmender Dauer der Erkrankung kann es zu einer malignen
Entartung des Pankreas kommen, wobei das relative Risiko um fünf Prozent
innerhalb von 20 Jahren zunimmt [49].
In bis zu 70 - 80 % der Fälle ist die Ursache für eine CP bei Erwachsenen
äthyltoxisch [3, 28]. Weitere Ursachen können metabolische Störungen und
anatomische Anomalien sein (Ursachen/Risiko-Klassifikationssystem der
chronischen Pankreatitis siehe Tabelle 2), wobei auch in diesem Zusammenhang
die Hyperkalzämie und der pHPT erwähnt werden.
Genetische Ursachen werden als hereditäre Pankreatitis und „modifizierende
Gene“ bezeichnet.
11
Tabelle 2:TIGAR-O-Klassifikation (Ursachen der chronischen Pankreatitis)
modifiziert nach Etemad und Whitcomb [29]
Toxisch-metabolisch
Idiopathisch Genetisch Autoimmun Rezidivierende akute Pankreatitis
Obstruktive Pankreatitis
alkoholisch early onset autosomal dominant (Mutationen des kationischen Trypsinogen im Codon 29 und 122)
isolierte
autoimmune
chronische
Pankreatitis
postnekrotische
(schwere akute
Pankreatitis)
Pankreas divisum
Rauchen late onset modifizierende Gene (z.B. CFTR; SPINK1-Mutationen; kationisches Trypsinogen, Codon 16, 22, 23)
syndrom-
assozierte
autoimmune
chronische
Pankreatitis (z.B.
Sjögren-
Syndrom; PBC)
wiederkehrende
akute Pankreatitis
Sphinkter Oddi
Dysfunktion
Hyperkalzämie, z.B. bei pHPT
tropische (teils
auch genetisch
bedingt)
Gefäßerkrankungen
oder Ischämien
Gangobstruktion
Hyperlipidämie nach Ganzkörper-
bestrahlung
duodenale
ampulläre Zyste
Chronische
Niereninsuffizienz
posttraumatische
Pankreasgang-
narbe
medikamentös
Vergiftungen
12
1.3 Genetische Ursachen für eine Pankreatitis
1.3.1 Hereditäre Pankreatitis
Die hereditäre Pankreatitis (HP) als Unterform der CP wurde zum ersten Mal 1952
von Comfort und Steinberg beschrieben [22]. Die genaue Charakterisierung der
HP ist eng verbunden mit der Identifizierung einer amerikanischen Familie im
mittleren Westen. Bereits 1972 publizierten McElroy und Christiansen in einer
Arbeit im American Journal of Medical Genetics [57] den Stammbaum einer
Familie, deren betroffene Familienmitglieder bereits im Kindesalter an einer
Pankreatitis mit chronischem Verlauf erkrankten. Im Jahr 1996 gelang es
unabhängig voneinander drei Arbeitsgruppen den Genort für die hereditäre
Pankreatitis auf Chromosom 7 (7q35) [51, 67, 103] zu lokalisieren, auf dem auch
wichtige pankreatische Verdauungsenzyme lokalisiert sind (z.B. Carboxypeptidase
A1, Trypsinogen Familie). Whitcomb et al. identifizierten daraufhin, im selben Jahr,
mit Hilfe der DNA der erkrankten Familie, eine Punktmutation im Exon 3 des
kationischen Trypsinogen (PRSS1; OMIM 276000) als Erkrankungsursache für die
hereditäre Pankreatitis [103]. Es handelte sich dabei um den Austausch eines
Arginin durch Histidin an Position 122 der Proteins (R122H). In rascher Folge
wurden weitere Mutationen im PRSS1 Gen beschrieben, z.B. N29I, A16V, D22G
oder K23R, wobei die N29I und R122H Mutationen mehr als 90 % ausmachen. Bis
zum heutigen Zeitpunkt sind mehr als 25 PRSS1 Gen Varianten beschrieben
worden (für die komplette Übersicht: www.uni-
leipzig.de/pancreasmutation/db.html).
Die Definition der HP umfasst ein autosomal dominantes Krankheitsbild
(Penetranz ca. 80 %) mit meist schon im Jugendalter (13,9 ± 12,2 Jahren) [52]
rezidivierenden akuten Pankreatitiden und der Entwicklung einer chronischen
Pankreatitis mit zwei Betroffenen einer Generation oder drei Betroffenen in mehr
als einer Generation [56, 82, 85]. Als Spätkomplikation zeigt sich bei Patienten mit
einer HP eine deutlich erhöhte Inzidenz für das Auftreten von
Pankreaskarzinomen (bis zu 40 % im Alter von 70 Jahren) [52], so dass neben
der funktionellen Bedeutung ein wichtiger klinischer Grund besteht die Patienten
mit einer HP zu identifizieren.
Die Entdeckung der PRSS1 Mutationen unterstützte zudem die Hypothese, dass
Trypsin eine Schlüsselrolle in der Pankreatitisentstehung spielt.
13
1.4 Pankreatitis assoziierte und modifizierende Gene
1.4.1 Serinproteaseninhibitor Kazal-Typ I (SPINK1 : GenBank #AF286028 )
Der Serinprotease-Inhibitor Kazal Typ I (SPINK1; OMIM 167790) ist ein wichtiger
intrapankreatischer Trypsin-Inhibitor, der Trypsin durch kovalente Bindung
zwischen dem katalytischen Serin der Protease und einem Lysin im reaktiven
Zentrum von SPINK1 inhibiert [7]. Lokalisiert ist das SPINK1-Gen auf dem
Chromosom 5 [40]. Die SPINK1-vermittelte Inhibition des Trypsin ist allerdings
temporär, da der Typsin-SPINK1-Komplex selbst als Substrat für Trypsin dient.
Somit kommt es im Verlauf zu einer Reduktion der SPINK1 Aktivität und zur
dadurch vermittelten Wiederherstellung der ursprünglichen Trypsinaktivität. Dies
wird als Phänomen der „temporären Inhibition“ bezeichnet [50]. Chen et al.
beschrieben im Jahre 2000 als erste bei Patienten mit einer idiopathischen
chronischen Pankreatitis (ICP) N34S SPINK1 Mutationen [16], wobei eine
Assoziation erstmals von Witt et al. bei 23 % der untersuchten Patienten mit einer
ICP aufgezeigt werden konnte [104].
1.4.2 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR)
Bei der zystischen Fibrose handelt es sich um eine Erkrankung, die insbesondere
durch eine chronische Lungenerkrankung charakterisiert ist, wobei im Verlauf
auch Komplikationen des Pankreas auftreten können [61, 89]. Sie ist die häufigste
autosomal rezessiv vererbte Erkrankung.
Der Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR; OMIM
602421) ist 1989 als Krankheitsgen der zystischen Fibrose (CF) (OMIM 219700)
identifiziert worden [42, 70] und befindet sich auf dem langen Arm von
Chromosom 7 (7q31). In Deutschland sind 4 % der Bevölkerung asymptomatische
heterozygote Genträger [5, 24]. Bei 1 - 2 % der Patienten mit CF tritt im Rahmen
der Erkrankung eine rezidivierende Pankreatitis auf [81].
Das CFTR-Gen kodiert für einen cAMP-abhängigen Chloridkanal [71] und besitzt
eine bedeutende Rolle in der Sekretion von Bikarbonat und Chlorid.
Aktuell sind bereits mehr als 1500 Mutationen im CFTR-Gen beschrieben worden,
wobei die kodierende Sequenz 27 Exons beinhaltet. In Deutschland sind ca. 72 %
14
der Patienten mit zystischer Fibrose homozygot oder compound heterozygot für
acht Mutationen des CFTR-Gens (∆508F, G542X, R553X, W1282X, N1303K,
621+1G→T, 1717-1G→A und R117H) [93]. Die häufigste Mutation des CFTR-
Gens mit einer Frequenz von 66 % stellt die ∆508F-Deletion dar [93]. Die
Erstbeschreibung von CFTR Mutationen bei Patienten mit einer CP bzw. ICP
erfolgte 1998 durch zwei unterschiedliche Arbeitsgruppen aus England und den
USA [18; 80]. Sharer et al. konnten bei Patienten mit einer CP heterozygote CFTR
Mutationen nachweisen [80], wohingegen Cohn et al. bei Patienten mit einer ICP
CFTR Mutationen diagnostizierten [18].
1.5 Pankreatitis und pHPT
Im Rahmen des pHPT steht die Hyperkalzämie als mögliche Ursache der
Pankreatitis und weitgehend akzeptierter Pathomechanismus im Vordergrund [29].
Die Trypsinaktivierung ist kalziumabhängig, wobei der Anstieg der intrazellulären
Kalziumkonzentration eine entscheidende Rolle spielt. Es ist beschrieben worden,
dass ein erhöhter zytosolischer Kalziumspiegel, ein klassisches Symptom eines
primären Hyperparathyreoidismus, eine akute Pankreatitis auslösen kann [87]. In
den größten Studien zum pHPT ist allerdings nur eine Auftretenshäufigkeit von
einer Pankreatitis zwischen 1,5 % [10, 99] und 6,8 % [1] beschrieben worden.
15
1.6 Fragestellung
Durch die Kooperation mit der chirurgischen Klinik des Universitätsklinikums
Gießen-Marburg gelang es eine der weltweit größten Kohorten von Patienten mit
einem pHPT zu untersuchen. Dabei konzentriert sich diese Dissertation auf
folgende wesentlichen bisher nicht beantworteten Fragestellungen:
1) Wie hoch ist die Prävalenz einer Pankreatitis bei Patienten mit einem
primären Hyperparathyreoidismus in Deutschland?
2) Gibt es zusätzliche genetische Risikofaktoren bei Patienten mit einem
primären Hyperparathyreoidismus und Pankreatitis?
Neben der Auswertung der Datenbank zur Feststellung der Prävalenz wurde die
identifizierte pHPT/Pankreatitis Kohorte auf Mutationen in den SPINK1, PRSS1
und CFTR Genen untersucht. Letztere sind bekannte genetische Risikofaktoren
für eine Pankreatitis. Methodisch wurden dazu PCR, DNA-Sequenzierung und
Hybridisierungskits benutzt.
16
2 Patienten
2.1 pHPT-Kohorte
Über einen Zeitraum zwischen April 1987 und Dezember 2002 wurden
826 Patienten mit Hyperparathyreoidismus in der chirurgischen Klinik des
Universitätsklinikums Gießen-Marburg untersucht und behandelt. Erfasst wurden
Alter und Geschlecht der Patienten, Parathormonspiegel, Phosphat, Kalzium,
Lipase, Amylase und klinische Symptome wie Nierensteine, peptische Ulcera und
Knochenschmerzen. Lag eine Pankreatitis vor, wurde hier unterschieden zwischen
einer akuten, akut hämorrhagischen, akut wiederkehrenden und chronisch
kalzifizierenden Form der Pankreatitis.
Die Behandlung des Hyperparathyreoidismus in der chirurgischen Klinik des
Universitätsklinikums Gießen-Marburg bestand aus einer bilateralen Exploration
und Identifikation von allen vier Epithelkörperchen (Glandulae parathyreoideae),
sowie der Entfernung von vergrößerten Drüsen, sowohl bei sporadischen Fällen
als auch im Falle einer multiplen endokrinen Neoplasie (MEN).
2.2 Patienten mit pHPT und Pankreatitis
Die Diagnose der akuten Pankreatitis wurde anhand folgender Kriterien gestellt: 1)
akute abdominelle Schmerzen; 2) laborchemisch erhöhte Pankreasenzyme
(Lipase oder Amylase ≥ des 3-fachen des oberen Grenzwertes); 3) sonografische
oder radiologische Kriterien für eine AP (Pankreasnekrose, ödematöse
Pankreatitis, interstitielle Kalzifizierung im CT). Die Diagnose der chronischen
Pankreatitis wurde in Anlehnung an die Marseille-Rom-Klassifikation gestellt [77].
In der pHPT-Gesamtkohorte wurden 38 Patienten (4,6 %) mit Pankreatitis
identifiziert, wobei von 25 Patienten DNA gewonnen und auf die spezifischen
Mutationen untersucht werden konnte.
Auf die spezifische Zusammensetzung dieser Patientengruppe wird in Tabelle 5
sowie im Ergebnisteil dezidiert eingegangen.
17
2.3 pHPT Kontroll-Gruppe ohne Pankreatitis
Die Kontroll-Gruppe bestand aus Patienten mit einem primären
Hyperparathyreoidismus ohne Nachweis einer Pankreatitis und wurde aus der
Gesamtkohorte rekrutiert. Es wurde DNA von 50 Patienten aus dieser Population
untersucht. Dabei handelte es sich um 50 Patienten (25 Frauen, 25 Männer; das
Durchschnittsalter bei Operation betrug 60 ± 13 Jahre) mit einem isolierten
primären Hyperparathyreoidismus ohne Hinweise auf eine akute Pankreatitis oder
abdominelle Beschwerden in der Vorgeschichte. Ein Patient aus der Kontroll-
Gruppe wies ein MEN-Syndrom auf.
Eine detaillierte klinische, laborchemische und symptomatische Auflistung der
Patienten zeigt Tabelle 5.
2.4 Ethikvotum
Die vorliegende Studie wurde von der Ethikkommission der Ruhr-Universität-
Bochum als unbedenklich eingestuft (Ethikvotum 2436). Alle Patienten wurden
über die wissenschaftlichen Ziele und Durchführung molekulargenetischer
Untersuchungen aufgeklärt. Die Entnahme von venösem Blut erfolgte nach
Aufklärung und Zustimmung der Patienten.
18
3 Material und Methoden:
3.1 DNA-Extraktion
Die genomische DNA wurde einerseits in der Abteilung für Allgemeinchirurgie des
Universitäts-Klinikum Gießen-Marburg in Marburg aus Nebenschilddrüsengewebe,
welches kryokonserviert war, und im Weiteren in der Medizinischen Klinik I der
Universitätsklinik St. Josef-Hospital in Bochum aus EDTA-Vollblutproben
gewonnen. Die DNA-Extraktion der Proben erfolgte mittels "QIAmp Mini Kit" nach
Anweisungen des Herstellers (Qiagen, Hilden, Deutschland).
Zu Beginn werden 20 µl Qiagen Protease (oder Proteinase K) in ein 1,5 ml großes
Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Dann gibt man 200 µl EDTA-Blut von den
Patientenproben und 200 µl Puffer AL (Lysepuffer) hinzu und das Ganze wird ca.
15 Sekunden auf dem Vortexer gut durchmischt. Nach 10 Minuten Inkubation im
Wasserbad bei 56 °C werden 200 µl Ethanol (96-100 %) hinzugegeben und auf
dem Vortexer für 15 Sekunden durchmischt. Das Gemisch wird nun vorsichtig in
einen Säulenfilter (QIAamp Spin Column), der in einem 2 ml Auffangröhrchen
steckt, gegeben und für 1 Minute bei 8000 rpm zentrifugiert. Die DNA ist jetzt an
das Filtermaterial der Säule gebunden und diese wird auf ein neues
Auffangröhrchen gesetzt, während das alte mit dem Filtrat verworfen wird. Auf die
Säule gibt man 500 µl Puffer AW1 (Waschpuffer 1) und man zentrifugiert erneut
für 1 Minute bei 8000 rpm. Die Säule wird erneut in ein neues Auffangröhrchen
gesetzt, und dann mit 500 µl Puffer AW2 (Waschpuffer 2) erneut gewaschen und
für 3 Minuten bei 13000 rpm zentrifugiert. Um noch kleine Reste des Puffers aus
dem Filter zu lösen, zentrifugiert man diesen in einem neuen Röhrchen ohne
Zugabe eines Puffers für eine weitere Minute bei 13000 rpm. Nach diesem Schritt
gibt man dann nach dem Umsetzen der Säule auf ein 1,5 ml
Mikrozentrifugenröhrchen 200 µl des Elutionspuffers Puffer AE oder H2O dd hinzu
und zentrifugiert nach 1 Minute Inkubation bei Raumtemperatur (15-25° C) für
1 Minute bei 8000 rpm. Die vorher am Filter gebundene DNA befindet sich nun im
Eluat.
19
3.2 Schmelzkurvenanalyse und Real-Time-PCR am LightCycler™ für SPINK1-(N34S) und PRSS1-(N29I und R122H) Mutationen
Zum Nachweis der von uns untersuchten Mutationen haben wir
Polymerasekettenreaktionen (PCR) mit dem LightCycler™System der Firma
Roche Molecular Biochemicals durchgeführt. Es handelt sich dabei um eine Real-
Time-PCR. Grundidee der PCR ist es DNA durch zwei flankierende Primer mit
Hilfe der DNA-Polymerase durch wiederholte Verdoppelung in mehreren Zyklen zu
vervielfältigen. Man verwendet die PCR dabei um kurze, genau definierte Teile
eines DNA-Stranges zu vervielfältigen, wobei nur kurze DNA-Abschnitte bis zu ca.
10 kbp (10.000 Basenpaare) kopiert werden können.
Ein PCR-Prozess besteht aus einer Serie von 20-30 Zyklen. Jeder Zyklus besteht
aus drei Schritten. Zuerst werden durch Erhitzen auf 96° C die
Wasserstoffbrückenbindungen, die die DNA-Stränge zusammenhalten
aufgebrochen. Dies bezeichnet man als Melting = Schmelzen. Man senkt dann die
Temperatur ab und die Primer können sich an die Einzelstrang-DNA anlegen,
hierbei handelt es sich um das so genannte Annealing = Anlagern. Die benötigte
Temperatur (Annealing-Temperatur) hängt vom jeweiligen Primer ab. Man wählt
die Temperatur bei der Standard PCR so, dass sie ca. 3° C unter der errechneten
Schmelztemperatur von Primer und Zielsequenz liegt. Im letzten Schritt füllt dann
die DNA-Polymerase von dem Primer aus beginnend die fehlenden Stränge mit
Nukleotiden auf. Diese bezeichnet man als Elongation = Verlängerung. Die hierbei
benötigte Temperatur (68 -72 °C) hängt von der DNA-Polymerase ab.
Die für die Vervollständigung benötigte Zeit heißt Extensionszeit, diese muss
entsprechend der zur erwartenden Amplifikationsgrösse gewählt werden und
errechnet sich wie folgt: Größe des Amplifikates in bp/25. Wählt man die
Extensionszeit zu kurz, kann die Polymerase das Amplifikat nicht während eines
Zyklus komplett synthetisieren.
Die so in einem Zyklus entstandenen DNA-Stränge bilden dann die Vorlage für
den nächsten Zyklus.
Die Schmelzkurvenanalyse ist ein Verfahren, das auf dem Prinzip der
herkömmlichen PCR beruht und zusätzlich die Möglichkeit der Identifizierung von
Mutationen bietet.
20
Man erreicht die Identifizierung dadurch, dass sich zwei Hybridsonden (Anchor-
und Sensor-Sonde) an das Produkt binden. Man markiert die Sonden mit zwei
Fluorochromen, die sich während der Zyklen an das PCR-Produkt binden. Einer
der Fluorochrome, das Donator-Fluorochrom wird dann durch eine Lichtquelle
angeregt und gibt einen Teil seiner Energie an das Akzeptor-Fluorochrom ab.
Diese Messmethoden benötigen den Gebrauch von spezifischen Sequenz-
Sonden, wie bereits oben beschrieben. Eine dieser Methoden ist die so genannte
Hybridisations-Sonden-Methode. Diese Methode wird benutzt zur DNA-Detektion
und –Quantifizierung und hat eine maximale Spezifität zur Identifikation des
gesuchten Produktes. Man ergänzt zu den Reaktionskomponenten, die auch bei
der konventionellen PCR benötigt werden, zwei speziell entwickelte sequenz-
spezifische Oligonukleotide (zwei Sonden), welche mit zwei verschiedenen
Fluoreszenz-Farben versehen werden.
Die Anchor-Sonde erhält an der 5´-Position einen Farbstoff z.B. LC Red 640
(Acceptorfarbstoff/ z.B. LightCycler Red 640) und an der 3´-Position ein –p
(phosphoryliertes Ende). Die Sensor-Sonde erhält am 3´-Ende eine Markierung
mit z.B. Fluorescein einem Donorfarbstoff. Die Erkennung basiert auf der
Emittierung von einem Fluoreszenz-Signal mit einer spezifischen Wellenlänge
durch den so genannten Fluoreszein-Resonanz-Energie-Transfer (fluorescence
resonance energy transfer = FRET) zwischen den beiden Sonden, nachdem sie
sich an der Zielsequenz angebunden haben. Je größer die Übereinstimmung mit
der Ziel-Sequenz, desto höher ist das Signal.
Führt man im Anschluss daran eine Schmelzkurven-Analyse durch, lassen sich
Mutationen anhand von Schmelztemperaturen identifizieren. Dabei bedient man
sich des Mechanismus, dass jede ds-DNA ihre spezifische Schmelztemperatur
hat. Diese ist definiert als die Temperatur, bei der 50 % der DNA als Einzelstrang
vorliegen. Erreicht man die Schmelztemperatur, kommt es zu einem Knick in der
Kurve (X-Achse: Temperatur; Y-Achse: Fluoreszenz). Trägt man nun die
Temperatur (X-Achse) gegen die dF/dT (Y-Achse) auf, bekommt man in der Kurve
einem Peak, hier liegt genau die Schmelztemperatur (siehe Abbildung 1). Handelt
es sich bei dem bei der PCR entstandenen Produkt um den Wildtyp, hybridisiert
die Sensor-Sonde, bei Wahl der entsprechenden Sonden, zu 100 % mit dem
Template und schmilzt bei höheren Temperaturen ab. Handelt es sich aber um
21
eine Mutation hybridisiert die Sensor-Sonde zu einem geringeren Prozentsatz und
hat einen niedrigeren Schmelzpunkt. Als Kontrolle laufen Wildtyp- und
Mutationskontrollen im Ansatz mit.
Abbildung 1: Beispiel einer Schmelzkurvenanalyse für eine SPINK1 N34S
Mutation
Zur Durchführung der Real-Time-PCR und Schmelzkurvenanalyse mit Hilfe des
LightCycler® der Firma Roche Diagnostics, Mannheim wurde jeweils ein Master
Mix Ansatz für die Mutationen N29I (PRSS1-Gen), R122H (PRSS1-Gen) und
N34S (SPINK1-Gen) entworfen.
22
3.3 Master Mix Ansätze für PRSS1 (N29I, R122H) und SPINK1 (N34S)
PRSS1 (N29I) Master Mix
Zusätze 1x
H2O steril (farblos) 6,2 µl
MgCl2 (blau)(25 mM) 0,4 µl
N29I-Fw (10 µM) 0,5 µl
N29I-Rv (10 µM) 0,5 µl
N29I-Sensor (4µM) 0,2 µl
N29I-Anchor (4µM) 0,2 µl
FAST DNA Master HYBR 1,0 µl
Gesamtvolumen 9,0 µl
Eingesetzte Primer für N29I: • N29I-Fw (5´-ACATGCTATTGACTTGCC) • N29I-Rv (5´-GGCCTGCTGATACCAC) Eingesetzte Hybridisierungssonden für N29I: • N29I-Sensor (5´-GGGCTACAACTGTGAGGAGAA-FL) • N29I-Anchor (5´-LC Red640-CTGTCCCCTACCAGGTGTCC-p)
PRSS1 (R122H) Master Mix
Zusätze 1x
H2O steril (farblos) 6,4 µl
MgCl2 (blau)(25 mM) 0,2 µl
R122H-Fw (10 µM) 0,5 µl
R122H-Rv (10 µM) 0,5 µl
R122H-Sensor (10 µM) 0,2 µl
R122H-Anchor (10 µM) 0,2 µl
FAST DNA Master HYBR 1,0 µl
Gesamtvolumen 9,0 µl
Eingesetzte Primer für R122H: • R122H-Fw (5´-CCCCCAATACGACAGG) • R122H-Rv (5´-ACTAAGGGTCCCACTCA) Eingesetzte Hybridisierungssonden für R122H: • R122H-Sensor neu (5´-CAACGCCCACGTGTCCACCA-FL) • R122H-Anchor neu (5´- LC Red640-TCTCTGCCCACCGCCCCTCCAGCC-p)
23
SPINK1 (N34S) Master Mix
Zusätze 1x
H2O steril (farblos) 8,8 µl
MgCl2 (blau) 1,2 µl
PSTI / Fw (10 µM) 1,0 µl
PSTI / Rv (10 µM) 1,0 µl
PSTI-3FL (10 µM) 1,0 µl
PSTI-3LC (10 µM) 1,0 µl
Fast Start DNA Master HYBR 2,0 µl
Gesamtvolumen 16,0 µl
Eingesetzte Primer für N34S: • PSTI-F3 (5´-ccaatcacagttattccccagag) PSTI-R3 (5´-gtttgcttttctcggggtgag) Eingesetzte Hybridisierungssonden für N34S: • PSTI-3FL Sensor (5´- ccaaatgttacaatgaacttaatggatgc-FL) • PSTI-3LC Anchor (5´- LC Red640-ccaagatatatgaccctgtctgtgggac-p)
Die verwendeten Primer und Hybridisierungssonden wurden von der Firma TIB
MOLBIOL (Berlin, Deutschland) hergestellt.
3.4 DNA-Sequenzierung
Die DNA-Sequenzanalyse wurde mit dem Capillary Electrophoretic Genetic
Analysis System (CEQTM 8000) der Firma Beckman-Coulter im Zentrum für
klinische Forschung der Ruhr-Universität durchgeführt. Eine DNA-Sequenzierung
wurde nur bei Messproblemen mit dem LightCycler und sehr begrenzter DNA
Konzentration und Menge durchgeführt. Dies war in einem Fall nötig, bei dem die
Schmelzkurvenanalyse für N34S SPINK1 unsaubere Ergebnisse ergab. Es
wurden dazu die bereits genannten Primer benutzt und in 2 Ansätzen forward und
reverse Strang sequenziert.
24
3.5 CFTR-Analyse
Aufgrund der begrenzten Menge an DNA und der großen Anzahl an bekannten
Mutationen (> 1500 in 27 Exons) mussten wir uns auf eine Analyse mit der INNO-
LiPA-CFTR-Testmethode beschränken. Dies ist eine validierte Testmethode,
(INNO-LiPA CFTR 19 und INNO-LiPA CFTR 17 + Tn polymorphism Innogenetics
N.V., Gent, Belgien), mit welcher simultan 36 der häufigsten Mutationen und die
Tn-Polymorphismen identifiziert werden können.
Die Testmethode basiert auf dem Prinzip der reversen Hybridisierung mit Hilfe von
allel-spezifischen Oligonukleotiden (ASO). ASO, die die verschiedenen Mutations-
Allele sowie den Wildtyp repräsentieren, sind hier als parallele Banden auf eine
Nitrozellulosemembran aufgebracht und fixiert. Der interessante Bereich eines
Gens wird mit Hilfe von genomischer DNA und biotinylierten Primern in einer PCR-
Reaktion amplifiziert. Das biotinylierte Amplifikat hybridisiert nach chemischer
Denaturierung unter definierten Temperaturbedingungen mit den
membranfixierten Oligonukleotidsonden. Die spezifischen Hybride werden in einer
Folgereaktion sichtbar gemacht. An Strepavidin gekoppelte alkalische
Phosphatase bindet das Biotin der Hybride und katalysiert im Anschluss eine
Farbreaktion, bei der ein unlösliches violett-braunes NBT/BCIP-Präzipitat entsteht.
Dieses Präzipitat schlägt sich an der Stelle der Hybride auf dem
Nitrozellulosestreifen nieder (siehe Abbildung 2: CFTR Testkarte).
25
Abbildung 2: CFTR Testkarte
Mittels dieser Methode können folgende Mutationen detektiert werden:
Tabelle 3 : Mutationen auf dem INNO-LiPA CFTR 19-Teststreifen
M.F508del M.G542X M.N1303K
M.W1282X M.G551D M.1717-1G→A
M.R553X M.CFTRdele2,3(21kb) M.I507del
M.711+1G→T M.3272-26A→G M.3905insT
M.R560T M.1898+1G→A M.S1251N
M.I148T M.3199del6 M.3120+1G→A
M.Q552X
26
Tabelle 4: Mutationen und Tn polymorphismen auf dem INNO-LiPA CFTR 17+Tn-
Teststreifen
M.621+1G→T M.3849+10kbC→T M.2183AA→G
M.394delTT M.2789+5G→A M.R1162X
M.3659delC M.R117H M.R334W
M.R347P M.G85E M.1078delT
M.A455E M.2143delT M.E60X
M.2184delA M.711+5G→A
5T 7T 9T
3.6 Verbrauchsmaterialien
QIAmp DNA Mini Kit Qiagen, Hilden
Oligonukleotide TIB Molbiol, Berlin
Ampli Taq Gold DNA-Polymerase Perkin Elmer, Überlingen
GeneAmp 10xPCR-Puffer, MgCl2, dNTPs Perkin Elmer, Überlingen
LightCycler-Kapillaren Roche Diagnostics,Mannheim
LightCycler Fast Start DNA Roche Diagnostics,Mannheim
Master HYBR Polymerase Roche Diagnostics,Mannheim
ELUCIGENE™ CF29 Orchid Diagnostics, UK
Primer für Exon 1-5 des PRSS1 Gen TIB Molbiol, Berlin
Primer für Exon 1-4 des SPINK1 Gen TIB Molbiol, Berlin
Primer und FRET Sonden TIB Molbiol, Berlin
Standardtips 2,5; 100; 1000 µl Eppendorf
Sequenzing Kit CEQ Beckman-Coulter
27
3.7 Geräte
Zentrifuge Labofuge 400 (DNA-Extraktion) Heraeus
LightCycler (Schmelzkurvenanalyse) Roche Diagnostics
LightCycler-Zentrifuge Roche Diagnostics
Vortexer IKA
Zentrifuge 5417R (Aufreinigung für Sequenzierung) Eppendorf
CEQ™8000 (DNA-Sequenzierung) Beckman-Coulter
3.8 Statistik
Die statistische Analyse wurde mit Hilfe des SPSS-Programm, Version 11.0 für
Windows (Chicago, USA) durchgeführt. Für die statistische Auswertung der Daten
der SPINK1 Mutationen (pHPT mit Pankreatitis versus pHPT ohne Pankreatitis),
wurde der Fisher´s exact Test verwendet. P Werte < 0,05 wurden als statistisch
signifikant angesehen. Zur Analyse der beobachteten versus den zu erwartenden
Häufigkeiten der CFTR Mutationen und des SPINK1/CFTR transheterozygoten
Zustandes wurde ein binominaler Test verwendet.
Die erwartete Häufigkeit der SPINK1 Mutation wurde festgelegt unter der
Annahme, dass die Häufigkeit einer heterozygoten N34S SPINK1 Mutation in der
Kontrollgruppe identisch mit der Häufigkeit in der Normalbevölkerung ist, welche
mit bis zu zwei Prozent angegeben wird [16, 26, 68, 90, 94, 96].
Die erwartete Häufigkeit einer CFTR Mutation von 1/25 gesunder heterozygoter
Mutations-Träger in der Normalbevölkerung wurde unter der Annahme getroffen,
dass die Häufigkeit des Auftretens einer zystischen Fibrose auslösenden
schweren CFTR Mutation 4 % in der deutschen Bevölkerung beträgt [53].
28
4 Ergebnisse
4.1 Klinische Daten der Gesamtkohorte
In der Gesamtkohorte von 826 Patienten trat insgesamt 38-mal eine Pankreatitis
auf. Davon hatten 16 Patienten eine akute, 2 Patienten eine akut hämorrhagische,
6 Patienten eine akut wiederkehrende und 14 Patienten eine chronische
kalzifizierende Pankreatitis.
Bei 24 der 826 Patienten wurde ein MEN-Syndrom diagnostiziert.
Bei der Geschlechterverteilung gab es fast doppelt so viele Frauen wie Männer
(581 Frauen / 245 Männern), dies entspricht der allgemeinen
Geschlechterverteilung des Auftretens eines pHPT, wovon Frauen zwei bis
dreimal häufiger betroffen sind als Männer [41].
Sowohl der PTH (212 ± 11 pg/ml) als auch der Kalziumspiegel (3 ± 0,1 mmol/l)
waren deutlich erhöht. Die ebenfalls bestimmten Werte für Phosphat, Lipase,
Amylase und alkalische Phosphatase lagen im Durchschnitt im Normbereich.
Als klinische Hauptsymptome imponierten bei 45 % der Patienten Nierensteine
und bei 35 % Knochenschmerzen, peptische Ulcera traten nur bei 9 % der
Patienten auf.
4.2 Klinische Daten der Patienten mit pHPT und Pankreatitis
Von 25 der 38 Patienten mit Pankreatitis konnte DNA gewonnen werden. Die
Verteilung in der Gruppe zeigte sich wie folgt: 13 Frauen, 12 Männer;
Durchschnittsalter bei Operation von 57 ± 2,5 Jahren, davon 10 Patienten mit
akuter, 1 Patient mit akut hämorrhagischer, 5 Patienten mit akut wiederkehrender
und 9 Patienten mit chronisch kalzifizierender Pankreatitis.
Anamnestisch ergab sich kein Hinweis auf eine andere Genese der Pankreatitis:
wie Alkoholmissbrauch, biliäre Pankreatitis, Trauma, Hyperlipidämien oder
medikamentös toxische Ursachen. Lediglich bei einem Patienten waren
Gallensteine beim Auftreten der Pankreatitis diagnostiziert worden. Eine biliäre
Genese der Pankreatitis konnte aber ausgeschlossen werden. Bei zwei Patienten
29
trat die Pankreatitis Jahre nach einer Cholecystektomie auf. Bei zwei weiteren
Patienten wurde ein begrenzter Alkoholkonsum angegeben.
Mit Berücksichtigung des Durchschnittsalters bei der Operation (60 ± 13 versus
57 ± 2,5 Jahren) und der Geschlechterverteilung (25 versus 12 Männern und 25
versus 13 Frauen) unterschied sich die Gruppe der Patienten mit Pankreatitis nicht
signifikant von der Kontrollgruppe ohne Pankreatitis.
Der Kalzium- und PTH-Spiegel war sowohl in der Gruppe der Patienten mit einer
Pankreatitis und einem pHPT, als auch in der pHPT-Kontrollgruppe deutlich
erhöht, wobei sich auch hier im Vergleich der beiden Gruppen kein signifikanter
Unterschied zeigte. Der Kalziumspiegel betrug 3,1 ± 0,1 mmol/l und der PTH-
Spiegel 226 ± 71 pg/ml bei den Patienten mit pHPT und Pankreatitis versus einem
Kalziumspiegel von 3,0 ± 0,33 mmol/l und einem PTH-Spiegel von 210 ± 82 pg/ml
in der pHPT-Kontrollgruppe (siehe Tabelle 5).
4.2.1 Mutationsanalyse
4.2.2 PRSS 1-Gen-Mutationen
PRSS1-Gen-Mutationen (N29I und R122H) konnten weder in der pHPT und
Pankreatitis Gruppe noch in der Kontrollgruppe nachgewiesen werden (siehe
Tabelle 6).
4.2.3 SPINK 1-Gen-Mutationen
Insgesamt vier der 25 Patienten (16 %) mit pHPT und Pankreatitis waren Träger
einer heterozygoten N34S Mutation (siehe Abbildung 3). Dagegen wies kein
Patient der pHPT-Kontrollgruppe eine N34S Mutation auf (P< 0,001) (siehe
Tabelle 7). Hinsichtlich ihrer Laborparameter ergaben sich keine signifikanten
Unterschiede. Alle 4 Patienten wiesen ähnliche Kalziumwerte im Vergleich zu den
Wildtyp-Patienten auf, (3.2 versus 3.1 mmol/l; siehe Tabelle 8). Der Mittelwert des
PTH-Spiegel war niedriger im Vergleich zu den Patienten mit dem Wildtyp (123
versus 243 pg/ml; siehe Tabelle 8), bei breiter Streuung jedoch ohne statistische
Signifikanz. Keiner der Patienten mit N34S Mutation berichtete über eine
Familienanamnese, welche eine hereditäre Ursache der Erkrankung nahe legte.
30
Lediglich ein Patient berichtete über einen maßvollen Alkoholkonsum. Das
durchschnittliche Alter für das Auftreten der ersten Pankreatitis-Episode betrug 48
Jahre.
Bei den 4 Patienten mit der N34S SPINK1 Mutation diagnostizierten wir 2-mal eine
akute Pankreatitis (50 %) und 2-mal eine chronische Pankreatitis (50 %). In der
SPINK1-Widtyp-Kohorte trat 8-mal eine akute Pankreatitis (38 %) auf, 1-mal eine
akut hämorrhagische (5 %), 5-mal eine akut wiederkehrende (24 %) und 7-mal
eine chronische Pankreatitis (33 %). Dokumentierte Nierensteine hatten 3 von 4
Patienten (75 %) mit der N34S Mutation, hingegen nur 12 von 21 (57 %) der
Patienten mit dem SPINK1 Wildtyp. Ein peptisches Ulcus hatte einer der 4 (25 %)
Patienten mit der N34S Mutation. Im Vergleich dazu hatten 4 von 21 Patienten
(19 %) mit dem SPINK1 Wildtyp peptische Ulcera. Knochenschmerzen wurden
von den Patienten mit der N34S Mutation nicht angegeben, wohingegen bei den
Patienten mit dem SPINK1 Wildtyp 10 der 21 Patienten (48 %) über
Knochenschmerzen klagten (siehe Tabelle 8).
31
Die bei einer Schmelztemperatur von 58,4 °C gezeigten Kurven zeigen zwei heterozygote N34S SPINK1 Mutationsträger (blaue und graue Kurve). Die grüne Kurve entspricht der heterozygoten Kontrolle.
Abbildung 3: SPINK1-(N34S)-Schmelzkurvenanalyse für pHPT/Pankreatitis
Patienten
4.2.4 CFTR-Gen-Mutationen
Aufgrund der zuvor durchgeführten PRSS1 und SPINK1 Analysen waren für die
CFTR Mutationsanalyse nur noch eingeschränkte DNA Mengen vorhanden und es
konnten nicht alle Patienten untersucht werden. Es gelang von den 25 Patienten
mit pHPT und Pankreatitis 24 Patienten mit dem INNO-LiPA CFTR 19-Teststreifen
und 20 Patienten mit dem INNO-LiPA CFTR 17+Tn-Teststreifen zu untersuchen
(siehe Tabelle 6).
Vier von den untersuchten 24 Patienten (17 %) wiesen eine schwere heterozygote
CFTR-Gen-Mutation auf (P=0,002; im Vergleich zu der normalen Bevölkerung;
siehe Tabelle 7). Es konnte 2-mal die ∆508F- und 2-mal die R553X-Mutation
32
nachgewiesen werden (siehe Abbildung 4). Bei einem Patienten wurde das 5T
Allel gefunden (siehe Tabelle 6). Es ergaben sich keine signifikanten Unterschiede
hinsichtlich der Laborwerte zwischen den Kohorten mit CFTR Mutation und CFTR
Wildtyp (siehe Tabelle 8). Von den Mutationsträgern berichtete kein Patient über
eine zystische Fibrose oder pulmonale Erkrankung in der Familie.
In der Patientenkohorte mit einer CFTR Mutation wiesen 3 Patienten (60 %) eine
akute Pankreatitis auf und 2 Patienten (40 %) eine chronische Pankreatitis. In der
Kohorte mit dem CFTR Wildtyp trat 7-mal eine akute Pankreatitis (37 %), 1-mal
eine akut hämorrhagische (5 %), 5-mal eine akut wiederkehrende (26 %) und
6-mal eine chronische Pankreatitis (32 %) auf. Nierensteine traten bei 3 von 5
(60 %) Patienten mit einer CFTR Mutation auf, hingegen bei 11 von 19 Patienten
(58 %) mit dem CFTR Wildtyp. Peptische Ulcera traten bei keinem der Patienten
mit einer CFTR Mutation auf, im Vergleich dazu bei 5 von 19 Patienten (26 %) mit
dem CFTR Wildtyp. Knochenschmerzen wurden von einem der 5 Patienten (20 %)
mit einer CFTR Mutation angegeben, bei den Patienten mit dem CFTR Wildtyp
gaben 8 von 10 Patienten (42 %) Knochenschmerzen an (siehe Tabelle 8).
33
Die Hybridisierungskitkarte zeigt in Probe 1 den Wildtyp und in Probe 2 eine heterozygote R553X Mutation bei einem Patienten mit pHPT und Pankreatitis
Abbildung 4: INNO LIPA CFTR 19 Testkarte für Patienten mit pHPT und
Pankreatitis
4.2.5 Transheterozygoter Patient (SPINK1: N34S/ CFTR: R553X) mit pHPTund Pankreatitis
Insgesamt wurde ein transheterozygoter Patient mit einer Kombination aus
SPINK1 N34S Mutation und CFTR R553X Mutation identifiziert. Bei diesem
Patienten trat die erste Episode einer Pankreatitis bereits mit 18 Jahren auf. Im
Alter von 28 Jahren wurde bereits eine Pankreaskopfresektion durchgeführt. Die
abdominellen Symptome persistierten jedoch weiterhin. Der pHPT wurde im Alter
von 28 Jahren diagnostiziert und 4 Jahre später operiert.
34
Tabelle 5: Charakteristik der Gesamtkohorte und der Patienten mit pHPT und
Pankreatitis
pHPT-Gesamtkohorte
pHPT-Kontrollgruppe
pHPT- und Pankreatitis-Gruppe
Patienten 826 50 25
MEN-Syndrom 24 1 1
Alter bei Operation 59±0.5 60±13 57±2.5
Geschlecht (m/w) 245/581 25/25 12/13
Parathormon
[<80 pg/ml] 212±11 210±82 226±71
Phosphat
[0.8-1.5 mmol/l] 0.76±0.1 0.8±0.27 0.98±0.15
Kalzium *
[2.2-2.6 mmol/l] 3±0.1 3.0±0.33 3.1±0.1
Nierensteine 371 10 15
Peptische Ulzera 77 3 5
Knochenschmerzen 289 8 10
Pankreatitis: -akute -akut hämorrhagische -akut wiederkehrende
38
16
2
6
14
0
0
0
0
0
25
10
1
5
9 -chronisch kalzifizierende
# Lipase [<190 U/l] 51±4 57±43 227±61
[Lipase bei AP] [1593±759]
Amylase
[8-65 U/l] 32±1 33±15 143±43
Alkalische Phosphatase
[40-190 U/l ] 141±9 139±101 192±23
* Der Kalziumspiegel war bei 753 der 826 Patienten dokumentiert. # Die akute Pankreatitis wurde überwiegend in peripheren Krankenhäusern diagnostiziert; aufgeführt sind die Laborparameter des Aufnahmetags zur OP, sowie die peripher dokumentierten Werte (Lipase bei AP).
35
Tabelle 6: Ergebnis der (PRSS1, SPINK1 und CFTR) Mutationsanalysen bei
Patienten mit pHPT und Pankreatitis
Patient PRSS1 SPINK1 CFTR CFTR
N29I / R122H N34S Mutation Poly T
- # - - 7T/7T 1
- - F508del 9T/7T 2
- - - 7T/7T 3
- - - 7T/7T 4
- N34S - 7T/7T 5
- N34S - 7T/7T 6
- - - 9T/7T 7
- - - 7T/7T 8
- - NDa NDa 9
- - - 7T/7T 10
- - - 7T/7T 11
- - - 7T/5T 12
- - - 7T/7T 13
- - - 9T/7T 14
- - - 7T/7T 15
- N34S - 7T/7T 16
- - F508del 9T/7T 17
- - R553X 7T/7T 18
- - - 7T/7T 19
- - - 7T/7T 20
- N34S R553X 7T/7T 21
- - - NDª 22
- - - 23 NDª
24 - - - NDª
25 - - - NDª
NDª: nicht durchgeführt bei zu wenig DNA-Material #: wies zwei Wildtyp-Allele auf
36
Tabelle 7: Häufigkeitswahrscheinlichkeit der N34S SPINK1 und CFTR Mutationen
bei pHPT und Pankreatitis
Häufigkeiten
Genotypen aerwartete beobachtete O/E ratio 95% CI P-value
SPINK1 (N34S) 2/100 4/25 8,0 1,0-15,2 <0,001
1/25 4/24 4,2 0,4-7,9 0,002 CFTR Mutation CFschwer
5/100 1/20 1,0 0,02-2,0 1,0 5T Allel
1/16400 1/25 656 CFTR heterozygot +N34S heterozygot
13,3-1295,6 <0,001
ª Das Vorkommen der N34S SPINK1 Mutation in der normalen deutschen Population ist geringer als 2 % (0.36 % [104] - 1.6 % [90]). Die erwartete Häufigkeit von schweren Mutationen welche eine CF verursachen wurde mit 1/25 angenommen [53]. Das erwartete Auftreten für das 5T Allel beträgt 5 % [23]. Die erwartete Allel Häufigkeit für die N34S SPINK1 Mutationen und für die Kombination von beiden, CFTR und SPINK1, ist zitiert nach Noone et al. [63]
37
Tabelle 8: Charakterisierung der Patienten mit pHPT und Pankreatitis
pHPT und
Pankreatitis (SPINK1 Wildtyp)
pHPT und Pankreatitis
(SPINK1 N34S heterozygot)
pHPT und Pankreatitis
CFTR Wildtyp a
pHPT und Pankreatitis
CFTR Mutation
Patienten 21 4 19 5
MEN Syndrom 1 0 1 0
Alter bei Operation 58 ± 2 52 ± 8 59 ± 2 49 ± 8
Geschlecht(m/w) 9/12 2/2 8/11 3/2
Parathormon [<80 pg/ml]
243 ± 82 123 ± 43 245 ± 98 203 ± 53
Phosphat [0.8-1.5 mmol/]
1 ± 0.2 0.74 ± 0.2 1 ± 0.2 0.8 ± 0.1
Kalzium
[2.2-2.6 mmol/l] 3.1 ± 0.1 3.2 ± 0.3 3.1 ± 0.1 3.1 ± 0.2
Nierensteine 12 3 11 3
Peptische Ulcera 4 b 1 5 0
Knochenschmerzen 10 0 8 1
Pankreatitis - akute - akut hämorrhagische - akut wiederkehrende - chronisch kalzifizierende
21
8
1
5
7
4
2
0
0
2
19
7
1
5
5
3
0
0
2 6
201 ± 65 209 ± 124 171 ± 39 325 ± 266 § Lipase [<190 U/l] [2236 ± 1029] [689 ± 509] [1480 ± 725] [528 ± 236] [AP]
108 ± 27 321 ± 226 Amylase [8-65 U/l] 156 ± 54 103 ± 53
Alkalische Phosphatase [40-190 U/l]
195 ± 25 178 ± 63 206 ± 29 144 ± 21
a Es konnten nur 24 Proben mit dem INNO-LiPA 19 und 20 Proben mit dem INNO-LiPA 17+Tn Teststreifen untersucht werden. b Ein Patient hatte ein Ulcus duodeni. § Die akute Pankreatitis wurde überwiegend in peripheren Krankenhäusern diagnostiziert; aufgeführt sind die Laborparameter des Aufnahmetags [AP].
38
5 Diskussion
Die Auswertung der Daten von 826 Patienten mit einem Hyperparathyreoidismus
(HPT) erlaubte erstmalig eine umfassende Analyse einer großen Kohorte auf die
folgenden wissenschaftlich ungeklärten Fragestellungen: Wie hoch ist die
Prävalenz einer Pankreatitis bei Patienten mit einem primären
Hyperparathyreoidismus in Deutschland und gibt es zusätzliche Pankreatitis
assoziierte genetische Risikofaktoren bei Patienten mit einem primären
Hyperparathyreoidismus und Pankreatitis?
Zur Beantwortung der ersten Fragestellung erfolgte die Auswertung der prospektiv
über den Zeitraum von 1987 bis 2002 erhobenen Daten hinsichtlich einer
diagnostizierten Pankreatitis, wobei diese bei 38 der Patienten (4,6 %) festgestellt
wurde und dies einem Wert entspricht , der leicht oberhalb der zuvor publizierten
Häufigkeiten liegt (siehe Tabelle 9).
Tabelle 9:Studien zur Korrelation pHPT/Pankreatitis
Studien Zeitraum Patienten mit pHPT
Pankreatitis Häufigkeit Ergebnis
Bess, Edis et al.
1980 [10]
1950-1975 n=1153 N=17 1.5 % Keine Korrelation
van Lanschot and
Bruining 1984 [99]
n=686 N=10 1.5 % Korrelation nicht
ausgeschlossen
Ronni-Sivula 1985
[73]
1956-1979 n=240 N=8 3.3 % Korrelation nicht
beschrieben
Koppelberg,
Bartsch et al.1994
[45]
1987-1992 n=234 N=13 5.6 % Korrelation
vorhanden
Carnaille, Oudar et
al. 1998 [15]
n=1224 N=40 3.2 % Korrelation
vorhanden
Agarwal, George
et al. 2003 [1]
1991-2003 n=87 N=6 6.8 % Korrelation
Vorhanden
Mittelung ∑ n=3624 ∑ n=94 Ø=2.6 %
39
Dabei wird der Zusammenhang zwischen dem HPT und einer Pankreatitis nun
schon seit Jahrzehnten kontrovers diskutiert. Bereits 1962 wurde durch Mixter et
al. [58] ein Zusammenhang zwischen einem HPT und der Pankreatitis postuliert.
Durch zwei in den 90er Jahren publizierten Studien mit großen Patientenkohorten
(n = 1153 und n = 686 Patienten) [10, 99] wurde dies allerdings erstmalig
angezweifelt, denn die Auftretenshäufigkeit einer Pankreatitis bei Patienten mit
HPT betrug lediglich 1,5 %. In ihrer Studie werteten Bess et al. [10] dabei
retrospektiv Daten von 1153 Patienten aus, welche im Zeitraum zwischen 1950 bis
1975 behandelt worden waren. Es wurde nur bei 17 Patienten eine Pankreatitis
diagnostiziert (1,5 %), weshalb die zuvor angenommene Assoziation von HPT und
Pankreatitis angezweifelt wurde. Die Diagnose der Pankreatitis wurde dabei
anhand von abdominellen Beschwerden und erhöhten Laborparametern (Amylase
und Lipase), sowie radiologisch nachgewiesenen Pankreasverkalkungen und
klinischen Zeichen einer exokrinen Pankreasinsuffizienz gestellt. Eine Angabe
über die Diagnosekriterien des HPT, sowie über den Kalziumspiegel wurde nicht
gemacht. Zu bedenken ist, dass es sich zwar um eine sehr große Kohorte
handelte, die verwendeten Daten jedoch retrospektiv erhoben wurden und die
Diagnosekriterien ggf. eine geringere Sensitivität besaßen. Ronni-Sivula wertete
1985 Daten von 240 Patienten aus und gab die Auftretenswahrscheinlichkeit für
eine Pankreatitis mit 3,3 % an [73], die in den letzten größeren Studien durch
Carnaille et al. [15] (1998; n = 1224 Patienten) und durch Agarwal et al. [1] (2003;
n = 87 Patienten) in ihrer Tendenz bestätigt wurden (3,2 % bzw. 6,8 %). Agarwal
et al. [1], die die höchste Prävalenz beschrieben, wiesen bei 6 von 87 Patienten
(6,8 %) eine Pankreatitis nach, wobei die Kohorte mit 87 Patienten sehr klein war
und die Pankreatitis einmal erst nach der operativen Sanierung des HPT auftrat
und somit nicht gesichert durch den HPT bedingt gewesen ist. Dieses Beispiel
erläutert somit sehr anschaulich die Gefahr einer kleinen Studienkohorte und
möglicher systemischer Fehler in den Einschlusskriterien, die bei der
Rekrutierung, der im Rahmen dieser Dissertation untersuchten Patienten,
hinsichtlich dieser beiden Punkte vermieden wurde.
Die Diskrepanz der Auftretenshäufigkeiten einer Pankreatitis bei Patienten mit
einem HPT lässt sich möglicherweise zudem durch sensitivere
Screeningmethoden aber auch durch mögliche, nun zu diskutierende, genetische
Unterschiede durch unterschiedliche Herkunftsländer erklären (siehe Tabelle 9).
40
Anhand der aktuell bestehenden Datenlagen liegen die von uns erhobenen
prospektiven Werte zur Auftretenswahrscheinlichkeit einer Pankreatitis bei
Patienten mit einem HPT mit 4,6 % in einem, mit den bereits publizierten Studien,
vergleichbaren Bereich.
Obwohl die Pankreatitishäufigkeit in den Industrienationen in den letzten 50
Jahren deutlich zugenommen hat, existieren nur wenige Daten zur
Pankreatitishäufigkeit in der deutschen Bevölkerung. Prof. Lankisch aus Lüneburg
hat im Zeitraum von 1988 – 1995 Zahlen zur Epidemiologie der Pankreatitis in
Deutschland erhoben. Die Inzidenz einer akuten Pankreatitis lag in diesem
Zeitraum in der Region Lüneburg bei 19,7/100000 Einwohner/Jahr, die der
chronischen Pankreatitis bei 6,4/100000 Einwohnern/Jahr. Die altersspezifische
Häufigkeit zeigte einen Gipfel für die akute Pankreatitis in der Altersgruppe
zwischen 35 - 44 Jahren und für die chronische Pankreatitis bei 45 – 54 Jahren
[48].
In der hier untersuchten Kohorte trat eine akute Pankreatitis bei umgerechnet
193/100000 Patienten/Jahr auf und eine chronische Pankreatitis bei 113/100000
Patienten/Jahr. Die aktuellen Daten dokumentieren damit, dass das
Pankreatitisrisiko bei Patienten mit einem pHPT um ca. das 10 fache erhöht ist.
Trotzdem tritt sie mit 4,6% insgesamt nur selten auf, insbesondere hinsichtlich der
für Nierensteine (45 %), Knochenschmerzen (35 %) und peptischen Ulcera (9 %)
dokumentierten deutlich erhöhten Auftretenswahrscheinlichkeiten.
Somit muss auch die pathophysiologische Bedeutung der im Rahmen des pHPT
auftretenden Hyperkalzämie und der Zusammenhang mit der Pankreatitis als
monokausaler Auslöser in Frage gestellt werden, der sich in der Aufführung der
Hyperkalzämie bzw. der HPT in den gängigen Risikofaktorentabellen für eine AP
und CP widerspiegelt [32, 41] (siehe Tabelle 1 und Tabelle 2). Die Ergebnisse
deuten darauf hin, dass möglicherweise zusätzliche krankheits-modifizierende
Faktoren (z.B. genetische Faktoren und Umweltfaktoren) die Entwicklung einer
Pankreatitis bei Patienten mit einem pHPT beeinflussen könnten.
Hintergrund der Diskussion einer Korrelation von HPT und Pankreatitis ist der
postulierte pathophysiologische Mechanismus einer Hyperkalzämie vermittelten
intrapankreatischen Trypsinaktivierung [29]. Unter physiologischen Bedingungen
werden die Zymogene, unter ihnen Trypsinogen, im kalziumreichen Milieu des
41
Duodenums durch die Enterokinase aktiviert. Trypsin ist zudem in der Lage,
andere Zymogene wie Proelastase und Chymotrypsinogen zu aktivieren und
besitzt darüber hinaus die Fähigkeit zur Autoaktivierung.
Bei der Pankreatitis beginnt die Trypsinaktivierung bereits innerhalb des Pankreas
und leitet so die Selbstverdauung des Organs und damit die Pankreatitis ein.
Kalzium spielt dabei eine essentielle Rolle. Haverback et al. konnten bereits 1960
nachweisen, dass Kalzium die Trypsinaktivierung steigert [38] und vermuteten,
dass die HPT assoziierte Hyperkalzämie eine vermehrte intrapankreatische
Konversion von Trypsinogen in Trypsin bedingt. Ward et al. zeigten, dass ein
Anstieg des freien zytosolischen Kalziums als Auslöser einer Pankreatitis in Frage
kommt [100, 101]. Diese Hypothese wurde durch Studien an Mäusen durch
Mooren et al. bestärkt [59], denen es durch die Gabe des Kalzium Chelators
BAPTA-AM gelang, nicht nur die Trypsinogenaktivität, sondern auch die
Entstehung einer Pankreatitis signifikant zu reduzieren [59]. Krüger et al.
untersuchten die Trypsinogenaktivierung an isolierten Pankreas-Azinus-Zellen in-
vivo und bestätigten, dass Kalzium zur intrazellulären Trypsinogenaktivierung
notwendig ist [47]. Dabei ergaben sich Hinweise dafür, dass eine zusätzliche
Umverteilung des Kalziums in andere Zellregionen, die Dauer des Kalziumionen-
Einstroms und die Lokalisation der intrazellulären Kalziumionen-Freisetzung direkt
an der Zymogenaktivierung beteiligt zu sein scheinen [47]. Zugleich bestätigten
sie, dass eine Absenkung sowohl der extrazellulären als auch der intrazellulären
Kalziumionen-Konzentration die intrazelluläre Proteasenaktivierung erniedrigt bzw.
vollständig aufhebt [47].
Die Kalziumhomöostase der Azinuszelle ist daher der vermutete kausale
Pathomechanismus bei der Entstehung der Pankreatitis bei Patienten mit einem
HPT. Die hier erhobenen Daten weisen allerdings darauf hin, dass die
Hyperkalzämie nicht der allein auslösende Faktor zu sein scheint. Darüber hinaus
scheint zumindest eine Hyperkalzämie von einer überwiegenden Mehrheit der
Patienten ohne Entwicklung einer Pankreatitis (95,4 %) toleriert zu werden.
In den letzten Jahren wurde die Hypothese der krankheits-modifizierenden
Faktoren bei der Entstehung einer Pankreatitis, im Rahmen einer Hyperkalzämie,
durch weitere Studien unterstützt [30, 31]. Bei der Untersuchung einer Familie mit
einer chronischen Pankreatitis sowie einer familiären hypokalziurischen
42
Hyperkalzämie, die eine asymptomatische Hyperkalzämie bedingt, konnte eine
Kombination einer SPINK1 N34S Mutation mit einer Mutation des Calcium-sensing
Receptors (CaSR) (L518P) als Auslöser der Pankreatitis nachgewiesen werden
[30]. Mutationen im CaSR-Gen waren bis zu dieser Studie einzig als Auslöser für
Erkrankungen des Kalziumstoffwechsels, wie der familiären hypokalziurischen
Hyperkalzämie, der autosomal dominanten Hypokalzämie sowie des schweren
neonatalen Hyperparathyreoidismus bekannt.
Aus den erhobenen Daten lässt sich ebenfalls vermuten, dass zusätzliche
„disease modifier“, hier Mutationen im CaSR, bei der Genese der Pankreatitis eine
Rolle spielen [30], denn erst die Kombination aus CaSR-Mutation und
SPINK1(N34S)-Mutation löste den Phänotyp einer chronischen Pankreatitis aus,
Träger einer einzelnen Mutation (CaSR oder SPINK1) blieben beschwerdefrei
[30]. Eine Studie an einer großen Kohorte mit ICP bestätigte dies, indem eine
weitere Familie mit dieser Konstellation gefunden wurde [31].
Diese Überlegung wird zudem durch die im Jahr 2002 durch Racz et al. publizierte
Charakterisierung des CaSR auf duktalen und azinären Pankreaszellen unterstützt
[69], wobei postuliert wurde, dass der CaSR im Pankreas eine multifunktionale
physiologische Rolle bei der Regulation der Kalziumkonzentration im Pankreassaft
spielen könnte [69]. Interessanterweise wurde im Jahre 2007 eine weitere Studie
von Murugaian et al. publiziert [60], die Mutationen im CaSR Gen bei Patienten mit
einer tropischen Pankreatitis (TP) entdeckten, wobei insbesondere für diese
Kohorten eine Assoziation mit N34S SPINK1 Mutationen bekannt ist. Auch hier
ergeben sich somit Hinweise auf eine multifaktorielle Genese und eine
Abhängigkeit von der Kalziumhomöostase.
Aufgrund der bis zum heutigen Zeitpunkt bestehenden Daten, bezüglich der
Hypothese von krankheits-modifizierenden Faktoren bei der Entstehung einer
Pankreatitis, lag damit die Schlussfolgerung einer Untersuchung auf genetische,
mit Pankreatitis-assoziierter Risikofaktoren nahe.
Zu den im Rahmen dieser Dissertation untersuchen Mutationen gehörten die im
PRSS1-Gen (N29I und R122H), die eine erhöhte Trypsinogenaktivität verursachen
[74, 75] und als Auslöser einer hereditären Pankreatitis bekannt sind. N29I und
R122H sind dabei für mehr als 95% der HP Fälle verantwortlich, wobei auch
seltenere mit HP assoziierte Mutationen wie A121T, V123M oder R122C mittels
43
unserer Methode detektiert worden wären. Keiner dieser Mutationen konnte in
unserer Kohorte nachgewiesen werden. Dies verwundert im Nachhinein nicht, da
im Regelfall bei der durch Mutationen verursachten HP eine Pankreatitis bereits im
Jugendalter (13,9 ± 12,2) auftritt [52] und die Penetranz der Erkrankung mit 80%
sehr hoch ist. Neben einer leeren Familienanamnese betrug das durchschnittliche
Erkrankungsalter in der untersuchten Kohorte bei der Diagnosestellung, 57 ± 2,5
Jahre, was eine HP oder HP-assozierte Mutation unwahrscheinlich macht.
Bei 16 % unserer Patienten (4 von 25 Patienten) konnte dagegen eine SPINK1
Mutation (N34S) nachgewiesen werden. SPINK1 ist der wichtigste
intrapankreatische Trypsin-Inhibitor, der Trypsin durch kovalente Bindung
zwischen dem katalytischen Serin der Protease und einem Lysin im reaktiven
Zentrum von SPINK1 inhibiert. Im Gegensatz zu den PRSS1-Mutationen wird
somit vermutet, dass die N34S Mutation im SPINK1-Gen physiologische
Abwehrmechanismen gegen eine inadäquate oder verfrühte Enzymaktivität
beeinflusst [7, 62, 95]. Es gilt als bestätigt, dass die N34S Mutation als häufigste
SPINK1-Gen-Mutation mit unterschiedlichen Formen der CP assoziiert ist
[72, 105], allerdings scheinen N34S-SPINK1-Mutationen eine Pankreatitis dabei
nicht selbständig auszulösen, sondern nur zusammen mit weiteren genetischen
oder Umweltfaktoren [68, 72].
Weder in-vitro Experimente noch Experimente an knock out Mäusen konnten
dabei bis heute die Rolle der N34S Mutation abschließend erklären. Obwohl es
sich zeigte, dass sich bei einem Ungleichgewicht zwischen Trypsin-Aktivität und
ihrer Hemmung durch SPINK1 eine Pankreatitis entwickelt, führt die N34S
Mutation allein weder zu einem Funktionsverlust des Proteins [39, 55] noch zu
einer eingeschränkten Sekretion [43]. Es ist daher abschließend nicht geklärt, wie
SPINK1 Mutationen zu einem Funktionsverlust oder zu einer
Funktionseinschränkung des Proteaseninhibitors führen und dadurch eine erhöhte
intrapankreatische Trypsinaktivität bedingen.
Nach der Erstbeschreibung von SPINK1-Mutationen bei Patienten mit einer
idiopathischen chronischen Pankreatitis (ICP) durch Chen et al. [16] konnten Witt
et al. als erste eine Assoziation aufzeigen [104]. In Ihrer Studie hatten 23 % der
Patienten mit einer ICP eine SPINK1 Mutationen. Dabei handelt es sich im
Wesentlichen (bei 18 von 22 Patienten (81 %)) um eine N34S Mutation. Im
44
Weiteren zeigten sich seltenere Mutationen am N-terminalen Ende des Moleküls
(P55S). Es fanden sich sowohl heterozygote als auch homozygote N34S-
Patienten (6 von 22 Patienten waren homozygot), wobei ein phänotypischer
Unterschied zwischen beiden Gruppen nicht festzustellen war. In weiteren Studien
wurde dieser Zusammenhang belegt und diskutiert. Dabei scheint eine
Kombination mit anderen Gendefekten oder Umweltfaktoren zur Induzierung der
Erkrankung („disease modifier“) notwendig zu sein [6, 63, 68]. Seit ihrer
Entdeckung wurden N34S Mutationen in weiteren Pankreatitiskohorten mit
tropischer Pankreatitis (44 %) [11] und äthyltoxischen Pankreatitis (6,3 % [78] und
9,2 % [97]) identifiziert.
Bei der TP werden als pathogenetisch additive Risikofaktoren eine Malnutrition,
Antioxidantien-Defizienz oder eine toxische Schädigung des Pankreas durch
Cassavawurzel-Konsum (enthält toxische zyanogene Glykoside) diskutiert, wobei
2007 mit den CaSR Mutationen ein weiterer genetischer Risikofaktor, der auf eine
multifaktorielle genetische Ursache deutet, identifiziert wurde [60].
Bhatia et al. konnten bei 44 Prozent der von ihnen untersuchten Patienten mit
einer TP eine N34S-Mutation nachweisen [11]. Diese Daten lassen vermuten,
dass genetische Dispositionsfaktoren wie z.B. die SPINK1 Mutationen bei der
Pathogenese der TP eine wichtige Rolle spielen.
Weitere Studien konnten eine signifikante Korrelation zwischen N34S Mutationen
und einer alkoholinduzierten chronischen Pankreatitis (ACP) nachweisen
[27; 94; 105], so dass sich vermuten lässt, dass ein modifiziertes
Proteaseninhibitorsystem auch bei einer ACP pathogenetisch bedeutsam ist.
Allerdings scheint der Einfluss der N34S-Mutation nicht so ausgeprägt wie bei der
ICP und TP zu sein, denn es werden lediglich Auftretenshäufigkeiten von 6,3 %
[78] bzw. 9,2 % [97] der SPINK1 Mutationen bei Patienten mit einer AP
angegeben.
Die mögliche Funktion der N34S SPINK1 Mutation als „disease modifier“ wird
auch dadurch deutlich, dass Mutationsträger häufig in der Normalbevölkerung
vorkommen. Dabei wird eine Häufigkeit von 1,6 % in den USA [68, 78], 1,58 % in
Frankreich [16], 1 % in der Schweiz [96], 2,6 % in Finnland [97] und 0,36 % [104]
bzw. 1,6 % [90] in Deutschland beschrieben, die deutlich über der
Pakreatitishäufigkeit liegt.
45
Die N34S SPINK1 Mutationshäufigkeit von 16 % in unserer pHPT/Pankreatitis-
Subgruppe überschreitet die Auftretenswahrscheinlichkeit von ungefähr 1 % in der
Normalbevölkerung signifikant, womit ein zusätzlicher genetischer Mechanismus
der Pankreatitisinduktion bei Patienten mit pHPT bewiesen scheint. Es ist in
diesem Zusammenhang interessant, dass der einzige Patient mit einem pHPT und
einer Pankreatitis, der bis zum jetzigen Zeitpunkt auf die SPINK1 Mutation
getestet wurde, positiv für die N34S Mutation war [27]. Er war ein Bestandteil einer
Gruppe von Patienten, welche als "verschiedenartige" ("miscellaneous")
chronische Pankreatitis bezeichnet wurden, und, obwohl es sich nur um einen Fall
handelt, unterstützt dieses Ergebnis die Hypothese einer genetischen
Komponente.
Im Rahmen dieser Dissertation konnte somit erstmalig gezeigt werden, dass N34S
SPINK1 Mutationen eine wichtige Rolle bei der Entstehung einer Pankreatitis bei
Patienten mit einem pHPT spielen.
Hinsichtlich der CFTR Mutationen ergaben sich ähnliche Hinweise auf einen
genetischen Background. Die Identifizierung einer schweren CFTR Mutation bei 4
(2-mal ∆F508 und 2-mal R553X) von 24 Patienten (17 %) unserer
Patientengruppe unterlegt die mögliche Relevanz additiver genetischer Faktoren
bei Patienten mit pHPT und Pankreatitis. Aktuelle Studien zeigen, dass bei ca.
30 % der Patienten mit einer chronischen oder rezidivierenden Pankreatitis
mindestens ein abnormales CFTR Allel nachweisbar ist, im Gegensatz zu der zu
erwartenden Häufigkeit von 3-4 % der Normalbevölkerung [64, 65, 92].
Das Risiko der Entstehung einer so genannten idiopathischen chronischen
Pankreatitis (ICP) nimmt bei einem Träger der zystischen Fibrose ungefähr um
das 5-fache zu, wobei insbesondere der Terminus „idiopathisch“ bei einer dann
detektierten Mutation umstritten ist. Da nicht alle Träger einer CFTR Mutation an
einer Pankreatitis erkranken, scheinen auch hier weitere Faktoren an der
Entstehung einer Pankreatitis beteiligt zu sein.
Obwohl in verschiedenen Kohorten seit 1998 bis zu 25 % CFTR Mutationen bei
Patienten mit einer ICP aufgezeigt werden konnten [18, 63, 64, 80, 102], ist es bis
zum heutigen Zeitpunkt nicht vollständig verstanden, warum heterozygote CFTR
Mutationsträger anfällig für eine Pankreatitis sind. Noone et al., die den CFTR
gesteuerten Ionen-Transport im Nasenepithel von Patienten mit einer ICP
46
gemessen haben, berichten über einen CFTR vermittelten, beeinträchtigten Cl¯-
Transport bei Patienten mit unterschiedlichen CFTR Mutationen, der darauf
hinweisen könnte, dass es pathophysiologische Auswirkungen im Pankreas geben
könnte [63]. Die CFTR-Protein-Funktion als Anionen-Kanal reguliert direkt den Cl¯-
Ausstrom und indirekt die HCO3¯-Sekretion. Im Weiteren reguliert es den H2O-
und Na+-Einstrom. Patienten mit einer zystischen Fibrose weisen ein abnormales
CFTR-Protein in den Epithelzellen, z.B. im Pankreasgang auf, so dass
möglicherweise eine veränderte Viskosität des Pankreassaftes und/oder eine pH-
Änderung infolge eines gestörten Ionentransportes die Autoaktivierung von
Trypsinogen und damit die Pankreatitisentstehung begünstigt. Zudem vermutet
man, dass es durch die Sekretion eines viskösen Sekrets zu einer obstruktiven
Pankreatitis und damit zum Organuntergang kommen kann [18].
Hinsichtlich der HPT-assozierten Pankreatitis ergeben sich daraus weitere
mögliche pathophysiologische Mechanismen. Während der physiologische
Pankreassaft alkalisch ist und einen hohen Anteil an Kalzium aufweist, könnte die
Kombination aus Hyperkalzämie im Rahmen eines pHPT und verminderter
Flusseigenschaft des Pankreassaft bei einer CFTR Mutation eine Gangobstruktion
durch auskristalisierte „Pankreas-Steine“ auslösen [19].
Die beiden ersten Studien, die zur Assoziation von CFTR Mutationen und
Pankreatitis veröffentlicht wurden, sind 1998 publiziert. Damals beschrieben zwei
Arbeitsgruppen aus England und den USA unabhängig voneinander in zwei
Kohorten mit chronischer bzw. idiopathischer Pankreatitis Mutationen des CFTR
Gens [18, 80]. Cohn et al. fanden bei 26 % ihrer Patienten mit einer ICP eine
CFTR Mutation und bei 19 % ein 5T Allel [18], wohingegen Sharer et al. bei 13 %
der Patienten mit einer CP eine heterozygote CFTR Mutation nachwiesen [80].
Dabei ist bemerkenswert, dass die letztgenannte Studie, die Patienten mit einer
CP auf CFTR-Mutationen untersuchte, zwei Patienten mit einem pHPT enthielt
[80]. Einer dieser Patienten wies eine heterozygote ∆F508-Mutation auf. Obwohl
diese Studie den Grundstein für alle weiteren Studien zu CFTR Mutationen und
Pankreatitis legte, wurde dieser Zusammenhag zwischen CFTR Mutationen in
Patienten mit pHPT und Pankreatitis bis zu dieser Dissertation nicht weiter
untersucht.
47
Man kann CFTR Mutationen in mindestens 5 Kategorien unterteilen, welche sich
durch die molekularen Konsequenzen bzw. die sich daraus ergebenden
Funktionseinschränkungen definieren [91]. Vereinfacht unterscheidet man
zwischen „schweren“ und „milden“ Mutationen. Patienten mit einer zystischen
Fibrose und einer Pankreasinsuffizienz haben jeweils eine „schwere“ Mutation auf
beiden Allelen, wohingegen Patienten mit einer zystischen Fibrose und
ausreichender Pankreasfunktion zumindest eine Mutation haben, welche mit einer
„milden“ Funktionseinschränkung des CFTR Proteins assoziiert ist. Bei der großen
Anzahl an bekannten CFTR-Mutationen (aktuell > 1500) ist eine Testung aller
Exons bei Patienten mit einer Pankreatitis sehr aufwendig und nur mit genügend
vorhandener DNA möglich. Auch aus diesem Grund konnte in dieser Kohorte
keine vollständige CFTR Mutationsanalyse durchgeführt werden. Die Problematik
der „Gengrösse“ (27 Exons) erklärt auch die nur begrenzt vorhandenen Daten
hinsichtlich einer CFTR-Mutationsverteilung in der Normalbevölkerung. Während
die ∆508F-Mutation mit 66 % als häufigste Mutation beschrieben wird [93], ist die
R553X-Mutation in Familien mit einer zystischen Fibrose (~1,8 %) selten [98]. Wir
konnten bei 2 von 24 Patienten (8,3 %) eine R553X-Mutation nachweisen, wobei
offen bleiben muss, ob dies spezifisch für Patienten mit pHPT und Pankreatitis ist.
Da CFTR, PRSS1 und SPINK1 Mutationen verschiedene Proteine betreffen, ergibt
sich eine mögliche synergistische Risikoerhöhung für das Auftreten einer
Pankreatitis bei gleichzeitigem Vorliegen [21, 63]. Der bereits, im Gegensatz zu
den restlichen Patienten, im jungen Alter erkrankte trans-heterozygote Patient mit
pHPT und Pankreatitis (SPINK1: N34S/ CFTR: R553X) unterstützt diese
Hypothese einer Kumulation von genetischen Risikofaktoren eindrücklich.
Dabei ist die These des synergistischen genetischen Effektes weitgehend
akzeptiert und verschiedene Studien konnten bereits Kombinationen von SPINK1
Mutationen und CFTR Mutationen bei Patienten mit einer ICP nachweisen
[6, 20, 63, 66, 102]. Nach den Daten von Noone et al. [63] ist das Risiko eine
Pankreatitis zu entwickeln 40-fach erhöht, wenn zwei CFTR Mutationen vorliegen
und um das 900-fache erhöht, sollte eine Heterozygotie für CFTR und N34S
vorliegen. Cohn et al. beschrieben 2005 ein 10-fach erhöhtes Risiko eine
chronische Pankreatitis zu entwickeln, wenn eine SPINK1 Mutation vorliegt, ein
48
40-fach erhöhtes Risiko für compound heterozygote CFTR Mutations-Träger und
ein 500-fach erhöhtes Risiko sollten beide Genotypen vorliegen [21].
CFTR Gen Mutationen scheinen also ebenso wie die N34S Mutation bei der
Entstehung einer Pankreatitis bei Patienten mit einem pHPT eine wichtige Rolle zu
spielen. Ob weitere CFTR Mutationen bei vollständiger Sequenzierung gefunden
worden wären, kann nicht beantwortet werden, scheint jedoch wahrscheinlich.
Somit wäre auch eine größere genetische Suszeptibilität hinsichtlich der CFTR
Mutationen denkbar.
Abschließend ist zu sagen, dass das Pankreatitisrisiko bei Patienten mit pHPT ca.
10 fach erhöht ist. Dabei scheint die starke Assoziation der N34S SPINK1 und
CFTR Mutationen (inklusive des 5T Allel) bei 9 von 25 Patienten mit pHPT-
assozierter Hyperkalzämie und Pankreatitis, die These zu unterstützen, dass die
Hyperkalzämie lediglich das Risiko für die Entstehung einer Pankreatitis erhöht,
aber möglicherweise nicht als alleiniger kausaler Auslöser gelten kann. Inwieweit
weitere genetische und Umweltfaktoren eine Rolle bei der Entstehung einer
Pankreatitis spielen ist bis zu jetzigen Zeitpunkt ungeklärt.
Es ist daher von Nöten, weitere Kollektive mit pHPT prospektiv auf die von uns
gestellte Hypothese einer multifaktoriellen Genese der Pankreatitis zu
untersuchen, um diese Ergebnisse zu validieren.
49
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58
Danksagung: An dieser Stelle sei allen Personen herzlich gedankt, die direkt oder indirekt zum
Gelingen dieser Dissertation beigetragen haben.
Insbesondere möchte ich meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. med. W.E.
Schmidt, danken, ohne den diese Arbeit nicht zustande gekommen wäre.
Außerdem gilt mein Dank Herrn Dr. med. Peter Felderbauer, der mit viel
wissenschaftlichem Scharfsinn, kritischen Fragen und seiner offenen Art einen
großen Betrag zur Fertigstellung dieser Arbeit beigetragen hat, ebenso wie das
gesamte Team vom Labor des St. Josef-Krankenhaus Bochum.
Mein Dank gilt auch den Kooperationspartnern der vorliegenden Studie, Dr. med.
E. Karakas und Dr. med. V. Fendrich, welche die Proben der Probanten rekrutiert
und uns zugesandt haben. Ebenso möchte ich den beteiligten Patienten für die
Teilnahme an der Studie danken.
Lebenslauf: Persönliche Daten Name: Tilman Horn
Geburtsdatum: 07.03.1972 Geburtsort: Essen
Familienstand: ledig
eine Tochter, 4 Jahre
Persönlicher Werdegang Berufstätigkeit seit 08/2005 Assistenzarzt in der kardiologischen Abteilung der
katholischen Kliniken Essen Nord
07/2000-07/2005 Assistenzarzt in der internistischen Abteilung des
Philippusstift Essen-Borbeck
Studium 1993-2000 Studium der Humanmedizin an der Universität GH
Essen
08/1995 Physikum
08/1996 1. Staatsexamen
03/1999 2. Staatsexamen
04/1999-03/2000 Praktisches Jahr am St.Josef Hospital Oberhausen und
an der Universität von Elche/Alicante
05/2000 3. Staatsexamen
Schulausbildung 1978-1982 Grundschule Schmachtenberg in Essen-Kettwig
1982-1991 Theodor-Heuss-Gymnasium in Essen-Kettwig
Abitur Mai 1991
Zivildienst 1991-1993 Zivildienst als Pflegehelfer in der Fachklinik Rhein/Ruhr
Freiwilliges soziales Jahr 04/1993-09/1993 freiwilliges Soziales Jahr in St. Marienhospital GmbH
Ratingen
Weiterbildungen 08/2006 Facharzt für Innere Medizin
06/2008 Annerkennung des Schwerpunktes Kardiologie
Publikation Felderbauer, P., Karakas, E., Fendrich, V., Bulut, K., Horn, T., Lebert, R., Holland-Letz, T., Schmitz, F., Bartsch, D., Schmidt, W. E. (2007). Pancreatitis Risk in Primary Hyperparathyroidism: Relation to Mutations in the SPINK1 Trypsin Inhibitor (N34S) and the Cystic Fibrosis Gene. Am J Gastroenterol. 102, 1-7
