Bakterielle Infektionen und Pathogeninaktivierung · konzentrat FRALE (S-303) Klinische Studien Phase III geplant Prä-klinisch Vollblut Erste Ergebnisse Klinische Studien sind geplant

1

Bakterielle Infektionen und Pathogeninaktivierung

Prof. Harald Klüter Institut für Transfusionsmedizin und Immunologie

DRK Blutspendedienst Baden-Württemberg – Hessen Medizinische Fakultät Mannheim

Universität Heidelberg

Scre

enin

g fü

r A

nti-H

IV

Surr

ogat

scre

enin

g fü

r Non

-A-N

on-B

-H

epat

itis

Scre

enin

g fü

r A

nti-H

CV

Scre

enin

g fü

r p2

4-A

ntig

en

NAT

-Tes

tung

fü

r HIV

/HC

V

Risiko transfusions-assoziierter Infektionen (TTI)

Aktuelles Infektionsrisiko

1 : 360.000 (CI: 0.19-3.36 Mio.) HBV

1 : 10.88 Mio. (7.51-19.72 Mio.) HCV

1 : 4.3 Mio. (2.39-21.37 Mio.)

HIV

Risko einer ta-Virusinfektion

Hourfar MK, et al. Transfusion Transfusion 2008;48:1558-1566

2

Risiko transfusions-assoziierter Infektionen (TTI)

Bush & Kleinmann, Transfusion 2000; 40: 143-159

Scre

enin

g fü

r A

nti-H

IV

Surr

ogat

scre

enin

g fü

r Non

-A-N

on-B

-H

epat

itis

Scre

enin

g fü

r A

nti-H

CV

Scre

enin

g fü

r p2

4-A

ntig

en

NAT

-Tes

tung

fü

r HIV

/HC

V

Bakterien

Aktuelles Infektionsrisiko

1 : 360.000 (CI: 0.19-3.36 Mio.) HBV

1 : 10.88 Mio. (7.51-19.72 Mio.) HCV

1 : 4.3 Mio. (2.39-21.37 Mio.)

HIV

Risko einer ta-Virusinfektion

Hourfar MK, et al. Transfusion Transfusion 2008;48:1558-1566

Schrezenmeier H, et al. Transfusion 2007;47:644-652

Kontaminiertes Thrombozytenkonzentrat

1:1.428

Risiko einer Sepsis 1:50.000

Risiko einer ta-Bakterieninfektion

1996-2009

unclassif ied 7 (0,10%)

IBCT 2637 (39,64%) I&U 421 (6,33%) HSE 703 (10,57%)

Anti-D 721 (10,84%)

ATR 1234 (18,55%)

HTR 443 (6,66%)

TRALI 257 (3,86%)PTP 49 (0,74%)

TACO 52 (0,78%)TAD 5 (0,07%)

Autologous 42 (0,63%)TTI 69 (1,04%)

ta-GVHD 13 (0,19%)

Nebenwirkungen der Bluttransfusion Serious Hazard of Transfusion (SHOT) - Report 1996-2009

N = 6646

3

Todesfälle bis 2009

PTP 2

TACO 5

TAD 0

TRALI 42HTR 11ATR 19

IBCT 27

Anti-D 0HSE 0

I&U 4

unclassif ied 0 ta-GVHD 13TTI 15

Autologous 0

IBCT

I & U

HSE

Anti-D

ATR

HTR

TRALI

PTP

TACO

TAD

Autologous

TTI

ta-GVHD

unclassif ied

Mortalität Serious hazards of transfusion (SHOT), Annual Report 1996-2009

N = 138

= 10,8%

Ereignisse Involvierte Patienten

Todesfälle Erkrankungsfälle

HAV 3 3 3

HBV 10 11 11

HCV 2 2 2

HEV 1 1 1

HIV 2 4 4

HTLV 1 2 2 2

Bakterien 40 43 11 32

Malaria 2 2 1 1

Prionen 1 1 1

vCJD 3 3 3

Total 66 72 15 57

Transfusion-assoziierte Infektionen (TTI) Serious hazards of transfusion (SHOT), Annual Report 1996-2009

SHOT Annual Report 2009

SHOT Annual Report 2009

Art des Blutproduktes und bakterielle Kontamination

4

PTP 101%

TTVI 475% AB0-Inkompatibilität 58

7% TBBI 799%

HTR 13916%

TRALI 19723%

ATR 31737%

TA-GVHD0%

TACO2%

sonstige0%

Kumulative Anzahl der Transfusionsreaktionen (1997-2009) entsprechend den EHN*-Kriterien Hämovigilanzreport PEI, 2009

* ENH: european (intenational) hemovigilance network (INH): definition of adverse events, http://www.ihn-org.net

Transfusionsbedingte bakterielle Infektionen - TBBI - (1997-2009) Hämovigilanzreport PEI, 2009

Transfusionsbedingte bakterielle Infektionen - TBBI - (1997-2009) Hämovigilanzreport PEI, 2009

5

Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchung (1997-2009)

Hämovigilanzreport PEI, 209

Gram negativ

Symptome einer bakteriellen Infektion

•  Fieber, Schweißausbruch •  Schüttelfrost •  Übelkeit, Erbrechen •  Hypotonie / Hypertonie •  Tachykardie •  septischer Schock •  Atemnot •  Rückenschmerzen

Klinik: während / bis zu einigen Stunden nach Transfusion:

Kontaminierte Blutpräparate

Plasma: Bakteriell bedingte Transfusionsreaktion sind extrem selten (Wasserkeime - Pseudomonaden)

Erythrozytenkonzentrate: Vorrangig kälteliebende Keime gram negative - Wachstumsoptimum unter 37 °C

Thrombozytenkonzentrate: Vorrangig gram positive Keime Optimale Wachstumsbedingungen aufgrund der Lagerung bei 22 ± 2 °C

!

6

Ursachen einer Kontamination

•  Subchronische Infektionen

Osteomyelitiden, Endokarditiden

•  Bakterielle Infektionen des Intestinaltraktes

•  Zahnärztliche, endoskopische Eingriffe

Endogene Keime

•  Mangelnde Hände- oder Hautdesinfektion

•  Verarbeitung, Lagerung

•  Unsachgemäße Handhabung

z. B. Auftauen von gefrorenem Frischplasma

Exogene Keime

Prevention bakterieller Kontamination

•  Anamneseerhebung bei dem Spender

Exogene Keime

Endogene Keime

•  Pre-donation Sampling (Juli 2003)

•  Hautdesinfektion

z.B. Bakteriennachweismethoden Pathogeninaktivierung

•  In-line filtration (Oktober 2001)

•  Einführung zusätzlicher Behandlungsschritte:

Prinzip: Pre-donation Sampling

Die ersten 20 ml werden in eine separaten Pouch gefüllt

Klemme 1 Klemme 2

7

Vergleichsuntersuchungen (De Korte et al. Transfusion 2006;46:476-485)

2002-2003: Thrombozytenkonzentrate hergestellt aus Vollblutspenden

Flüssigkultur positiv (%)

Kein Pre - donation Pre - donation

Variable Arm- desinfektion

Anzahl

2x 70% Isopropanol

Anzahl

Kultur positiv (%)

42.582 4.362

405 (0,95) 22 (0,50)

59.400 6.749

505 (0.85) 25 (0,37)

p = 0,05 p = 0,18

p = 0,002

p = 0,001

Kultur positiv (%)

Flüssigkultur positiv (%)

373 (0,88)

427 (0.76)

18 (0,41)

17 (0,25)

Prevention bakterieller Kontamination

•  Anamneseerhebung bei dem Spender

Exogene Keime

Endogene Keime

•  Pre-donation Sampling (Juli 2003)

•  Hautdesinfektion

z.B. Bakteriennachweismethoden Pathogeninaktivierung

•  In-line filtration (Oktober 2001)

•  Einführung zusätzlicher Behandlungsschritte:

Probennahme nach Herstellung

Nach Herstellung: geringe Bakterienzahl 10 ml Probe

Am Ende der Lagerung: hohe Bakterienzahl

Nach 4 Tagen

Sepsis / Tod Probe steril

8

Spätere Probennahme

Nach Herstellung: geringe Bakterienzahl

Thrombozytenpräparat fast am Ende der Lagerung

Nach 4 Tagen

Probenziehung

Wachstumsverhalten von Bakterien im Blut

Kontaminiertes Blutpräparat

10 - 100 Bakterien

Wachstum bis zu 108-9/ml

~ 6 h 24 h Tage

Klinische Relevanz

cut off Schnellmethode

cut off Inkubationsmethode

cut off Pathogeninaktivierung

•  BacTAlert

•  Pall eBDS(

Inkubationsmethode

Schnellmethode

•  NAT (nucleic acid amplification)

•  BactiFlow flow cytometer

Bakterien-Screening-Methoden

9

BactAlert Colorimetrie - Technologie

Farb-Sensor

Farb-Sensor

•  2 x 5 - 10 ml Probe

•  Kontinuierliche Messung des Bakterienwachstums

•  CO2 Produktion als Indikator für Wachstum

•  Farb-Sensor in Silikonmembran im Flaschenboden

•  Sensitiv gegenüber löslichem pCO2

•  1 - 2 Bakterien pro Probe

•  Farbumschlag: Gelb: positiv

Grau: negativ

Inkubations-Methode

BactAlert Colorimetrie - Technologie Inkubations-Methode

Problem: Unspezifische Reaktionen

Positive Ergebnisse, aber im Ausstrich kein

Bakterienwachstum

0,28%

Positive Reaktionen nach Tag 5

Propionibakterien, deren klinische Relevanz offen ist

Diphteroide Keime, gram positive Keime, Staph. spez.

Schrezenmeier et al. Transfusion 2007;47:644 ff

te Boekhorst et al. Transfusion 2005;45:514 ff

Pall system (BDS / eBDS)

•  Probennahme in einen

Satellitenbeutel

•  Inkubation des

Satellitenbeutels bei 37°C

•  Messung des O2-Gehalts

vor Transfusion

•  Nachweisgrenze 1-15

Bakterien pro ml

•  Erfasst keine Anaerobier

Inkubations-Methode

10

Nucleic Acid Amplification (NAT)

Problem

•  Viele verschiedene Bakterienspezies Lösung

•  Amplifikation in einer hoch konservierten Genomregion

•  Universell bei Mikroorganismen

•  z. B. 16s DNA

•  Nachweisgrenze 16 - 500 Bakterien pro ml

•  Zeitdauer bis zum Nachweis: ca. 2-3 Stunden

Schnell-Methode

PEI: negative Testung – TK-Haltbarkeit Tag 5

•  Durchflussbasierte Nachweismethode

•  Prinzip: Ein nicht fluoreszenzierendes Fluorochrom gelangt durch die intakte Zellmembran in die lebendende Zellen. Der Farbstoff wird durch die zellinterne Esteraseaktivität umgewandelt und fluoresziert.

•  Nachweis gram - positiver und - negativer Bakterien

•  PEI: negative Testung – TK-Haltbarkeit Tag 5

Bacti Flow

Schnell-Methode

Bakterien-Screening-Methoden

•  Zeitaufwändig bevor das Ergebnis vorliegt

•  Hohe Sensitivität (1 cfu/ml)

•  Vermehrung der Bakterien in-vitro

•  geringere Bakterienlast ausreichend

•  PROBENNAHMEFEHLER

Inkubationsmethode

Schnellmethode •  Ergebnis liegt schnell vor

•  niedrigere Sensitivität

•  keine Bakterienvermehrung in-vitro

•  hohe Bakterienlast notwendig

•  PROTHRAHIERTE PROBENNAHME

11

Pathogeninaktivierung

•  Effektive Inhibierung von Pathogenen (Viren, Bakterien und Parasiten)

•  Erhalt der biologischen Funktion der Blutkomponente (Erythrozyten, Thrombozyen, Plasmaproteine) über den Lagerungszeitraum

•  Praktikable Methodik

Pathogeninaktivierungsverfahren

•  Effektive Inhibierung primär von Viren

•  Mechanische Verfahren (Nanofiltration)

•  Physikalische Verfahren (ß-Propiolactonbehandlung / UV-Bestrahlung)

•  Verwendbar für Plasma

60er / 70er – Jahre


•  Methylenblau-Licht (590 nm)-Verfahren (MB)

•  Solvent-Detergenz-Verfahren (SD)

Seghatchian et al. Transfus Med Hemother 2011;38:55-64

Hellstern et al. Transfus Med Hemother 2011;38:65-70

12


80er – Jahre

•  Entwicklung neuer Verfahren

•  Erhalt der biologischen Funktion auch

von zellhaltigen Blutkomponenten

(Erythrozyten, Thrombozyten)

Pathogeninaktivierungsmethoden

•  Viren, Bakterien, Protozoen und Leukozyten benötigen DNA bzw. RNS für die Proteinbiosynthese bzw. zur Replikation.

•  Eine Nukleinsäurefunktion ist nicht erforderlich für die biologische Funktion von Erythrozyten, Thrombozyten und Plasmaproteinen.

Prinzip

Zugabe photoaktiver Substanzen und Lichtbestrahlung - direkte Schädigung des Pathogens - Schädigung des Genoms (DNA / RNA)

Eine Zellvermehrung ist nicht mehr möglich


•  Mirasol

Riboflavin (Vitamin B2) + Licht (265-370 nm)

à Plasma

à Thrombozytenkonzentrate

à Erythrozytenkonzentrate

•  Psoralen S-59 (Amotosalen-HCL)

+ UV-A Licht (320-400 nm)


à Plasma

•  Psoralen S-303 (FRALE) à Erythrozytenkonzentrate

•  UV-C Licht (245 nm) à Thrombozytenkonzentrate

13


•  Mirasol


à Plasma






à Plasma



N

N

N

N CH 3

CH 3

O

H

O

CH 2

CHOH

CHOH

CHOH

CH 2 OH


Essentieller Nahrungsbestandteil - täglich empfohlene Menge ist 1,7 mg

Prinzip: Mirasol - Riboflavin und Licht (265-370 nm)

Ito et. al. J Biol Chem 1993; 268: 13221

Pathogen Riboflavin

Elektronenübertragung von der chemisch wirksamen Substanz auf das Pathogen - direkte Zellschädigung

- Genombrüche aufgrund der Interaktion mit der photoaktiven Substanz Energieübertragung von der chemisch wirksamen Substanz auf Sauerstoffmoleküle. Die dabei entstehende aktivierte Form (Singuletzustand) ist reaktiv und kann Lipide, Proteine und DNA/RNA-Basen oxidieren

14

Herstellungsprozess

Zugabe der Riboflavinlösung

Bestrahlung ca. 6-10 Min

Thrombozytenkonzentrat

Transfusion

Riboflavin

• Geeignet für die Pathogeninaktivierung von Thrombozyten- und Erythrozytenkonzentraten sowie Plasma

•  Überschuss an Riboflavin wird nicht aus dem Präparat entfernt, da sowohl das Vitamin als auch die Photoprodukte (Lumichrome) als unbedenklich angesehen werden


•  Mirasol


à Plasma






à Plasma



15

Amotosalen-HCl - Wirkmechanismus

Amotosalen- HCl

UV-A Bestrahlung

Kreuzvernetzungen mit DNA/RNA Wollowitz S. Semin Hematol 2001;38(S11):4-11

Herstellungsprozess CAD - Abreicherung der

Photoprodukte 4-16 Std.

.

7.

Thrombozytenkonzentrat


•  Mirasol


à Plasma






à Plasma



16

Psoralen S-303 - Wirkmechanismus

•  niedriger pH – S 303 •  Zugabe zum Erythrozytenkonzentrat - pH Veränderung – Aktivierung von S-303 •  Anchor bindet an das Genom •  Kreuzvernetzung des Effektorteils mit dem Genom •  Abspaltung von Anchor und Linker •  Anchor - Linker stellen ein nicht reaktives Produkt dar

Herstellungsprozess

Step 1: Zugabe von GSH (Gluthation) und S -303 zum Erythrozytenkonzentrat

Step 2: Das Erythrozytenkonzentrat wird in ein Zwischenlagerungsbeutel überführt – Inkubation bis zu 20 Std. bei 20–25°C. Step 3: Überstand wird nach Zentrifugation abgepresst

Step 4: Das Erythrozytenkonzentrat wird in den Endlagerungsbeutel überführt

Degeneration von S-303 in S-300

17


•  Mirasol


à Plasma






à Plasma



•  Thrombozytenkonzentraten Phase III Studien in Planung

•  Plasma

erste Versuche

UV-C Licht (254 nm)

Amotosalen Riboflavin UV-C

Thrombozyten-konzentrat

Amotosalen HCl (S-59) + UVA

PEI: Zulassungen vorhanden

Europa: Phase III

Deutschland: In-Vitro

In Planung:

Phase III

Plasma Amotosalen HCl (S-59) + UVA

PEI: Zulassungen beantragt

Prä-klinisch

Erste Versuche

Erythrozyten-konzentrat

FRALE (S-303)

Klinische Studien Phase III geplant

Prä-klinisch

Vollblut Erste Ergebnisse Klinische Studien sind geplant

Ausblick

18

•  Erhöhung der Sicherheit der Bluttransfusion

•  Behandlung unabhängig von Spenderuntersuchung

•  Einführung zusätzlicher Untersuchungstest nicht nötig

•  Abbau überflüssiger Testverfahren

•  zusätzliche Kosten der Blutversorgung

•  Nebenwirkung der verwendeten Systeme?

•  Qualitätssicherung-System noch zu etablieren

Pathogeninaktivierung von Blutpräparaten - Ausblick -

Robert Koch Institut – Arbeitskreis Blut

Votum 16 (V16): Mindestanforderungen zur Sterilitätstestung von Blutprodukten

Probenumfang: 0.4 x n

Flüssigmedien:

Nachweis aeroben / anaerober Bakterien und Pilzen in mind. 2 Medien (Thioglycolat-Nährmedien, Fa. Biomerieux, BactAlert)

Inokulum-Volumen: 5 - 10 ml pro Flasche, 7 Tage, 30-37°C (Automaten)

Bei positivem Befund: Ausstrich auf festem Nährmedium – Bebrütung mind. 48 Stunden

Bei positivem Befund: Keimdifferenzierung Wiederholungsansatz

Robert Koch Institut – Arbeitskreis Blut

Votum 16 (V16): Mindestanforderungen zur Sterilitätstestung von Blutprodukten

Ergebnisinterpretation:

Ist der erste Ansatz einer Sterilkontrolle positiv, sind Wiederholungsansätze ratsam. Bleiben bei der Wiederholungsuntersuchung alle Ansätze steril, wird die Sterilkontrolle als negative bewertet. Bei erneutem Nachweis desselben Keims ist das Ergebnis der Sterilkontrolle positiv.

Wird in der Wiederholungsuntersuchung ein anderer Keim als im ersten Ansatz nachgewiesen, sollte die Sterilkontrollmethode kritisch überprüft werden, da der Verdacht auf Sekundärkontamination besteht.

19

Ergebnis der Sterilitätskontrollen Baden-Württemberg – Hessen 2010

FFP (Apherese) 1 / 365 0 / 365

FFP (VB) 6 / 1465 0 / 1465

EK (VB) 15 / 3072 3 / 3072 2 / 3072

EK (Apherese) 0 / 76

TK (VB) 12 / 806 6 / 806 4 / 806

TK (Apherese) 1 / 201 1 / 201 0 / 201

BactAlert 2. Ausstrich 1. Ausstrich

Documents

Bakterielle Infektionen und Pathogeninaktivierung · konzentrat FRALE (S-303) Klinische Studien Phase III geplant Prä-klinisch Vollblut Erste Ergebnisse Klinische Studien sind geplant