Aus der Ung~rischen Chemischen Reichsanstalt und Central-Versuehsstation Budapest Abteilung: Bioehemie und Vitamine.

Die Best immung yon Carotinoiden mit Vitamin A- Wirkung mittels der chromatographischen Analyse.

Von

BI~LA BEI~CZE.

Mit 1 Textabbildung.

(Eingegangen am 23. August 1998.)

Die Methode der chromatographischen Analyse (Adsorptionsanalyse) ist yon dem russisehen Botaniker TSWETT begriinde t worden. Er benutzte seine Methode zuerst zum Isolieren yon Pflanzenfarbstoffem Seitdem hat sieh das Anwendungsgebiet der Methode ausgebreitet und heute sind wit im- stande, die L~isungen der verschiedensten Gemische zu ~rennen und mikro- analytisch zu bestimmen. Es ist nioht iibertrieben zu behaupten, dab in priiparativ-chemiseher Hinsicht diese Methode den bekannten klassischen Methoden, Destillation, Krystallisation - gleichwertig ist.

Echte Adsorption, auf weloher die chromatographische Methode meist beruht, ist bei Verbindungen anzutreffen, die hom0opolare Bindungen ent- haiten. Der gel~ste Stoff wird in diesem Falle an der Oberflaehe des Ad- Sorbens gebunden, jedoeh geht gleiehzeitig keine andere Substanz in L~i- sung. Der Vorgang unterliegt , wie es H. FREU:NDLICtt erkannte, der BoE- ~CK~R-OsTwALDschen Gleichung: a ~ k . e n, worin a die Menge des ad- sorbierten Stoffes je Gramm Adsorptionsmitte], e die Konzentration im Gleichgewicht bedeuten soll, k und n sind Konstanten, die.letzte ist ein echter Brueh. Es ist zu bemerken, dab aueh das L~sungsmittel adsorbiert werden kann und dab in diesem Dreiersystem die Menge adsorbierten Stoffes um so geringer ist, je mehr LSsungsmittel adsorbiert wird.

Es gibt eine groIBe Anzahl yon Stoffen, welehe aus ihrer L(isung adsorbiert werden k0nnen. AIs Adsorbens ist im allgemeinen jeder pulverf~irmige Stoff, dessert KorngrSIBe im Bereich yon 1,5 his 10~ liegt, geeignet. Es ist n(~tig, dab das Adsorbens in dem LSsungsmittel, aus welchem adsorbiert werden soil, unlSslich ist und mit dem zu adsorbierenden Stoff nieht reagiert.

Unter den mannigfaltigen Stoffen, die sich praktisch "bewahrt haben, nimmt der Kohlensto]] einen be~onderen Platz ein, well er eine sehr geringe Affinitiit zu Wasser und zu Alkoholen mit kleinem Molekulargewieht be- sitzt, also ein hydrophobes Adsorbens darstellt. Er adsorbiert deshalb ein

Die Bestimmung yon Carotinoiden mit Vitamin A-Wilkung. 247

und dieselbe Substanz aus Wasser, AikohoI, Aceton, Chloroform und Petrol- ather mit in dieser l~eihenfolge abnehmender Intensit~t. Er bewahrt sich ~orziiglich fiir die Adsorption yon in Wasser gel0sten Stoffen.

In den Molektilen anderer haufig angewendeter Adsorbentien befindet sich Sauerstoff; dementsprechend haben diese eine grSl~ere Affinitat zu Wasser nnd zu L6sungsmitteln, die neben wenig Kohlenstoffatomen auch Hydroxylgruppen enthalten. Es sind h y d r o p h y l e Adsorbentien. In bezug auf Adsorptivitat sind sie gleich, nur in der GrOSe der Adsorptionskraft unterscheiden sie sich. Bezfiglich der letzteren ist folgende empirische l~eihe aufgestellt worden :

Aluminiumoxyd. und Hydroxyd, Magnesiumoxyd, Calciumoxyd- und Hydroxyd, Calcitlracarbonat, Calciumsulfat, Calciumphosphat, Talkum, Zucker und Inulin. Die ersten Glieder der Reihe haben die gr88te Adsorptionskraft, diese

wird gegen das Ende der l=[eihe immer kleiner. Die Starke der Adsorptionsbindung hangt, wie schon erwahnt, aul~er yon

der Natur des Adsorbens und des zu adsorbierenden Stoffes auch yon dem L6sungsmittel ab. Je starker ein LSsungsmittel gebunden wird, desto mehr aktive Zentren besetzt es und desto mehr verdrangt es die gel0sten Stoffe. Diese werden also schwacher gebunden.

Die nachstehende Reihenfolge der LOsungsmittel bedeutet auch, alas t. die Adsorption des LSsungsmittels bei Verwendung eines hydrophylen

Adsorbens zunimmt, 2. die eluierende Wirkung des L6sungsmittels starker wird, 3. dementsprechend die Adsorption der gel6sten Stoffe abnimmt.

Die Reihenfolge der L0sungsmittel ist nach W. TRAPP: Petrol~ther, Pentan, Kohlenstofftetrachlorid, Trichlorathylen, Benzol, N[ethylenchlorid, Chloroform, _~ther, Essigester, Aceton, n-Propyla]kohol , )~thyl- und Me= thylalkohol, Wasser, Pyridin.

Adsorbens und LSsungsmittel zusammen bilden das ,,Adsorptionsmilieu'.', welches die GrSl3e der Adsorptionskraft bedingt und dementsprechead auch die Reihenfolge -con S~hichten bei der chromatographischen Analys% also das Ge]ingen tier Trennung. Ein und dasselbe Adsorptionsmilieu kann auf verschiedene Weise zustande kommen : entweder kombiniert man ein starkes Adsorbens mit einem auch starker adsorbierbaren L6sungsmittel (Alu= miniuraoxyd-~ther), oder ein schwaches Adsorbens mit einem kaum ad- sorbierbaren L0sungsmittel (CaCOa-Petrolather). Bei richtiger Wahl des L6sungsmittels und des Adsorbens kann die Gr61~e der Adsorptionskraft beeinflul3t und somit auf den gewfinschten Grad gebracht werden.

Das Heraus]6sen des ad~oIbierten Stoffes - die E l a t i o n - erfolgt durch Velwendung einer gut adsorbie~baren,Fliissigkeit oder eines Gemisches aus L6sung~mittel und Elution~mittel. Die t~eihenfolge der Elutionsmittel ist

248 B~LA B~NCZE:

mit jener der L0sungsmittel identiseh, nut sind hier die Endglieder die am stfirksten eluierenden Fltissigkeiten , daher gilt die Reihenfolge im umge- kehrten Sinne. Kohlenstoff bildet je4oeh eine Ausnahme als hydrophobes Adsorbens, somit ist die Reihenfolge in bezug auf Elution unverfindert.

Beziiglieh der Adsorption sind auf Grund zahlreicher Versuche folgende allgemeingiiltige t/egeln bekanntgeworden:

CapillaraktNe Stoffe werden viel besser und in viel grOgerem Mage ad- sorbiert als inaktive.

Die Adsorption homologer Reihen unterliegt der TR~UBEsehen Regel. Zwisehen Adsorption und Niolekulargewieht besteht ebenfalls eine Be-

ziehung: von den ~hnlieh anfgebauten Verbindungen werden diejenigen mit gr0gerem Molekulargewieht besser adsorbiert.

Die Adsorbierbarkeit isomerer Stoffe kann versehieden sein. Je grtBer die Zahl der po!aren Gruppen in einer Verbindung, desto gr01~er ist ihre Adsorbierbarkeit.

Ungesfittigter Zustand und Doppelbindungen verstiirken die Adsorption. Aromatisehe Verbindungen werden besser adsorbiert als die ~liphati:

schen. Die Adsorbierbarkeit polyeyeliseher Verbindungen wachst mit der Anzahl der ilinge.

~ Zwisehen der Farbtiefe und der Adsorbierbarkeit gibt es gleiehfalls einen Zusammenhang, der mit den ehromophoren und auxiehromophoren Gruppen in Beziehung gebraeht werden kann. Es ergibt sieh, dal3 derjenige Stoff stfirker adsorbiert wird, welel~er Lieht yon gr61~erer Weilenlfinge zu absorbieren vermag.

Die eben besproehenen Regeln beziehen sieh aueh auf die ehromato- graphisehe Analyse, soweit es sieh bei dieser um eehte Adsorption handelt. Diese Methode beruht darauf, dag die zu untersuehende L6sung, welehe mehrere Stoffe enth~lt, dureh ein mit dem Adsorbens gefiilltes Glasrohr gesaugt wird und die gel Osten Stoffe nicht gleichzeitig, sondern naeheinan- tier adsor~iert und so voneinander getrennt werden. Sie Iagern sieh gemag ihrer Adsorptionskraft in h6heren oder tieferen Sehichten der adsorbieren- den Siiule und farbige Verbindungen erseheinen in gut erkenntlichen Ringen.

u

Zur Isolierung der Carotinoide ist die chromatographische Analyse be- senders geeignet, da diese Polyene eine ausgepr~igte Tendenz zur Adsorp- tion haben und als farbige K6rper sehr deutliehe Chromatogramme geben.

Der Zweek unserer Untersuehungen war die Feststellung der Versuehs- bedingungen, unter welehen die Carotinoide mit Vitamin A-Wirkung in Pflanzen, die als Nahrungsmittel dienen, chromatographiseh leieht be, stimmt werden ktnnen. Zu diesem Z~veeke versch~fften wit uns eine Zu- sammenstellung des Sehrifttums fiber die Farbstoffe, welehe in Begleitung

Die Bestimmung yon Carotinoiden mit Vi~b~min &-Wirkang. 249

der Carotinoide und des Kryptoxanthins mit Vitamin A-Wirkung in den verwendeten Pflanzen vorkommen. Es erwies sich als zweckmfil~ig, die morphologisch verschiedenen Pflanzenteile: Wurzel, Blatt, Stengel und Frucht gesondert zu untersuchen, da diese Einteilung sowohl den Pflanzen- physiologen als auch den Forscher auf dem Gebiete der Ern~ihrung zu be- friedigen vermag. Bei dieser Einteilung kommen folgende Carotinoide als Begleitstoffe tier Carotinoide mit Vitamin A-Wirkung in Betracht: Caro- tinoide: a-, ~-, y-Carotin, Kryptoxanthin, Xanthophyll (Lutein), Lyeopin, Zeaxanthin, Capsorubin, Capsanthin. Untersucht warden: Blatt ~nd Sten- gel: Spinat; Frucht: Tomaten, Paprika; Wurzel: Gelbe t/iiben.

In den Bliittern, im Stengel und in den unreifen Friichten ist das Chloro- phyll mit diesen Farbstoffen vergesellschaftet, wiihrend es in den Wurzeln vollst~ndig fehlt.

Es handelt sich also nut um wenige Begleiter der Carotinoide mit Vitamin A-Wirkung. Die Isolierung wird noch durch den Umstand erleiehtert, dag diese kleine Anzahl yon Farbstoffen nicht in jeder Pflanze und in jedem Pflanzenteil vorkommen. Tabelle I umfagt die Formeln und die Konstanten, durch welche die Adsorptionsverh~iltnisse bedingt werden:

Tabelle 1.

Carotinoid Brutto- iormel

09

.-N

A b s o r p t i o n s m a x i m u m i n C S ~ - L S s u n g

m / z

�9

Capsorubin . . Cupsanthin . .

| Zeaxanthin . .

~z Xanghophyll.. Kryptoxanthin

. . . .

~ ~-Carotin . . �9 ;~ ~ ?-Carotin . .

C4ott5so4 C4oHssO3

C~oH5602 C4oH5602 C~otts~O

C4oH56 C4oH56 C~oH~6 C4oH~6

602 586

568 568 552

536 536 536 536

10

II i i i i i0 i i II

13 II 12 I i i i i i I i 10

543 543

519 505 519

548 533,5 521f 569

I 503,51 503,5

483 473 483

507 4:96

485,5 477

470

450 ~ 441 452 >

' 02

493 ~ E ~"

Wenn man die Konstanten der Glieder der angegebenen Polyenreihe mit den sehon bekannten Adsorptionsregeln in Beziehung setzt, erh~lt man ge- niigende Orientierung fiber das zu erwarteade Adsorptionsverhalten der Glieder dieser Reihe, was fiir analytisehe Zweeke einen ausgezeichneten Dienst leistet.

Vom Standpunkt der Adsorptionsanatyse sehien es uns zweekm~gig, dureh eine geeignete Auswahl des LOsungsmittels und des Adsorbens ein

2 5 0 BfiLA BENCZE:

solches ,Adsorptionsmilieu" zu schaffen, dab bei dem Chromatographieren die Carotine mit Vitamin A-Wirkung die Siiule ohne Adsorption durch- laufen, wiihrend die Begleitfarbstoffe zuriickgehalten werden. So ist die Verwendung des eluierenden LOsungsmittels zu umgehen. In dieser Hin- sicht erwies sich CaCO3 geeignet als Adsorhens yon gentigender Feinheit und Petroliither als L0sungsmittel. Aus der Petrol~itherl6sung adsorbiert namlich CaCO a Capsorubin, Capsanthin, Zeaxanthin, Xanthophyll sehr leicht und gut und ehenso das meist vorhandene Chlorophyll. Krypto- xanthin und das mit den Carotinen isomere Lycopin werden durch das- selbe Adsorbens viel weniger gebunden als die vorher Genannten. Es ist ein glticklicher Zufall, dab sich dieses Isomere bei den am geringsien adsorhier- baren Farbstoffen befindet und so yon den Carotinen zu trennen ist. Die verwendete Saule enthielt aktiviertes (2-3 Stunden ]ang auf 150 ~ erhitztes) Calciumcarhonat, hestehend aus in entsprechendem Verh~ltnis gemischtem fein- und grobk6rnigem Calciumcarhonat. Wir haben die chromatographi- schen Analysen mit den unseren Ansprtichen am besten entsprechenden Adsorbentien und L6sungsmitteln ausgefiihrt. Tabelle 2 enthiilt die Er-" gebnisse yon drei durchgefiihrten Versuchen.

TabeUe 2.

Gang tier Untersuchung

1 ]Volumen der Waschflflssigkeit [10 ml Pebrolather . . . . . ; .

. . . . . . .

ml Petrol~ther . . . . . . . 2 Untersuchung der S~andardl6sung

] Sogleich . . . . . . . . . . . . Nach lt~gigem Stehen im Eisschrank Nach 2ti~gigem Stehenira Eisschrank

3 Die Versuchssubstanz rait Na~SOa sicc. entw/issert . . . . . . .

Die Versuchssubstanz mit Alkohol en~w~ssert . . . . . . . . . .

I. Wurzel: Gelbe ~iiben II. Blatt: 8pinat

I. Wurzel

Carotin % mg %

4,4 100 4,3 98 3,7 84

8,1 100

8,5 105

II. Blatt. ] llI. l~l~cht

Carotin % ~ Carotin - - r a g % mg %

- - - - 15,6 - - - - 20;6

20,9

3,3 100 5,0 3,0 91 4,3" 2,6 79 4,1

2,13 100 17,1

2,33 109 17,1

100 ]32 133

ioo 86 82

100

100

III . Frucht: Reifer nrid frischer Paprika, reifer und getrockneter Paprika

Versuch 1: Wir wollten vor allem die zum vollstiindigen Auswaschen n6tige Menge des L6sungsmittels feststellen, insbesondere ftir solche Ver- suchssubsr welche mehrere Farhstoffe und viel Carotin enthalten. Eine solche Substanz ist der reife Paprika. Wir haben dessen Perikarpium

Die Bestimmung yon Carotinoiden mit Vitamin A-Wirkung. 251

in kleine Stticke zerschnitten, im MSrser mit Sand zerrieben und nach- her mit 2-3 g Na~SOt sieo. getrocknet. D a s Gemisch wurde dana au[ eine Glasnutsche gebraeht (ii . G.I.) und mit Petrol~ither gewaschen; das Filtrat ring man unmittelbar in einem 100 ml-Mef~kolben auf und chromatographierte eine bekannte Menge davon in einer Saule yon ge- f~illtem Calciumcarboaat. Die Abmessungen der Saule waren: HShe 12 cm, Durchmesser i cm. Wit habea das durch die S~iule flief~ende LSsungsmitte], welches nur die Carotine enth~lt, in einem 50 ml-Mef~- kolben aufgefangen und die Carotinkonzentration mit dem Photometer bestimmt.

Unsere orientierenden u wurden an mehreren Stoffen durch- gefiihrt. Die in Tabelle 2, Versuch l, angefiihrten Ergebnisse beweisen, dab die HShe der S~iule und das Volumen der Waschfliissigkeit richtig gew~ihlt waren.

In Versttch 2 untersuehtert wit, ob sich die Petroliitherl6sung der extra~ hierten Farbstoffe whhrend des Stehens ver~indert. Wie aus Tabelle 2, Versuch 2, ~ zu entnehmen ist, nimmt die Farbtiefe mit der Zeit ab. Es ist daher ratsam, Extrahieren und Chromatographieren am selben Tag aus- zuftihren.

Versuch 3 bezweckte die Feststellung, auf welehe Weise die Farbstoffe aus unseren l~ohstoffen am schnellsten und vollkommensten herausgelOst werden kSnnen. Wegen des Wassergehaltes der Rohstoffe war erst das Problem der Entwasserung zu 10sen. Man verwendet zweckmfil~ig ein Ent- wasserungsmitteI, welches gleichzeitig Eluiermittel ist. Ein soIches ist der von L. FiJL6P verwendete stark konzentrierte Alkohol. Nach Entfernung des Wassers aus dem Stoff mit Alkohol setzte Fi)L~JP das Ausl0sen des Riickstandes mit Petrol~ither fort. Auch wit versuchten die Entw~sserung mit AIkohol. Sie bew~ihrte sich abet nicht, weil der Alkoholverbrauch sehr grof~ ist und weil oft unangenehm e Emulsionen auftreten. Wir trachteten also, den Gebrauch yon AlkohoI m0glichst auszuschalten oder ihn nur in kleinen Mengen zu verwenden. Ftir die Entwasserung suchten wit nach einer anderen geeigneten Substanz. Als sehr zweekm~il3ig erwies sich wasser- freies Natriumsulfat, yon dem einige Gramm geniigen, um auch Substanzen mit gr6Berem Wassergehalt zu entwiissern. Wir extrahieren nach dem Ent- w~issern mit Petrol~ither und entfernen die schwer 15slichen Ietzten Farb- stoffspuren mit einem Gemisch aus Petrolather und Alkohol (auf l0 ml Petrol~ither kommen 3-4 ml 96%iger Alkohol). Dieses Gemisch wird ge- trennt yon der LSsung in reinem Petrol~ther aufgefangen. Im ganzen kommt nur ein kleines V01umen des Oemisehes zur Anwendung. Aus den wenigen darin enthaltenen Millilitern Alkohol kann man das Wasser ent- fernen, ohne dab beim Auswaschen Emulsionsbildung eintritt. Den zuriick- bleibenden Petrol~ither vereinigen wit nach dem Entwiissern mit der StandardlOsung. Nach unseren Erfahrungen ist das Entw~ssern der Ver-

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suehssubstanzen mit Na2SO ~ sice. viel sieherer als mit Alkohol Die ir~ Tabelle 2, Versueh 3 zusammengestellte n Untersuehungsergebnisse be- weisen, dab das Na~SQ-Verfahre n genaue Werte liefert.

Durchfiihrung der Carotinbestimmung.

Die Bestimmung des Carotins in frisehen oder teehniseh getroekneten Pflanzenteilen fiihren wir folgendermal~en aus:

Die eingewogene Substanz wird im MSrser mit Sand zur Paste verrieben; das Reiben wird nach Zugabe yon einigen Gramm wasserfreiem Natrium- sulfat fortgesetzt. Dann lassen wir das Gemiseh etwa t5 Minuten lang stehen,

his alles Wasser vollkommen gebunden ~st. Getroeknete [ Pflanzenteile lassen wir zun~chst in einem M6rser naeh

Zugabe yon einigen ml Wasser que]len, was ungeffihr eine halbe Stunde dauer}, und dann verfahren Wit

I_ weiter wie angegeben. ' G/~dr/~'~ Nun bi'ir/gen wir die Substanz auf ein Glasfilter

(l'l. G.I.) und waschen sie wahrend des Absaugens' mit Petrol~ther yore Siedepunkt 70-800 C. Die petroI-

;Gumm/ ~therische LOsnng wird i n einem t00 ml-Me•kolben i aufgefangen; die letzten Farbstoffspuren werden rnit

einem Petrol~ither-AlkOhol-Gemiseh ausgelSst (das Ge- misch enthalt auf 10 ml PetroIather 3-4 ml 96~oigen A]k0hol). Wit lassen dies e letzten alkoholischen Anteile

l unmittelbar in einen Sehtitteltriehter einflieSen, schiit- teln, wenn notig, in diesem die Farbstoffe der alkoho. lisehen Phase mit Petrol~ther aus und wasehen naeh dem Ablassen des Alkohols den zurtickbleibenden Petrolather mit Wasser aus, bis er vollkommen alkohol-

k , frei ist. Die petrol~itherisehen Anteile werden naeh Entwassern mit N%SO 4 mit der StandardlSsung ver- einigt.

Zum Chromatographieren dient der in Abb. I dar- Abb. 1. Apparat~ zur ~,~[Cl~romatographie. gestellte Apparat. Die Adsorptionss~ule - gef~lltes

Calciumcarbonat- ist etwa t2 em hoeh und hat einen Durehmesser yon t era. Das Adsorbens wird vorher mindestens 2 Stunden lang bei einer Temperatur von 150 ~ C aktiviert, Bei der Untersuchung yon Substanzen, welche aueh Lyeopin enthalten, wie z.B. Tomaten, verwenden wir eine Adsorptionssaule aus einem Gemiseh yon fein- und grobk6rnigem Calciumearbonat ira Verhaltnis 1:9. Wir trennen das feink0rnige Caleiumearbonat ans dem yon der Fabrik bezogenen gef~llten Caleiumearbonat mit einem Seidensieb ab, das je i em 2 etwa 2600-2800 LSeher hat.

Die Bestimmung yon Carotinoiden mit Vitamin A-Wirkung. 253

Das Adsorptionsmittel wird mit einem Holzstab zu einer zusammen- hangenden und gleiehmagig dichten Sfiule ohne Hdhlraume gestampft. Die Dichte der S~iule kann dureh m~iBig starkes Absaugen mit der Wasserstrahl- pumpe noch gesteigert werden. Man gieBt zuerst das L6snngsmittel auf die S~iule, dann saugt man eine bekannte Menge tier Standardl6sung hindurch. Der Vorlagekolben hat 50 ml inhal t ; wir wasehen mit mindestens 20 ml reinein LSsungsmittel so lange naeh, his das untere Ende der Saule farblos wird. Der Vorlagekolben enthalt nut die Carotine mit Vitamin A-Wirkung, die Extinktion der L6sung wird mit dem PvLFRIC~I-Photometer (Filter S. 45) bestimmt. AuS der Extinktion einer Carotinl6sung m i t bekanntem Carotingehalt ist die Carotinkonzentration der zu untersuehenden L6sung zu bestimmen, da die Farbtiefe der Carotinl~sungen dem LAMBEI/T-BEEt/- sehen Gesetz folgt. Wir verwenden als Standard das internationale ~-Ca- rotinpr~iparat.

Unser Chromatographierapparat ist mit Normalschliffen versehen, was besonders bei Serienuntersuehungen yon Vorteil ist. Das Chromatographier- rohr laBt sieh gegen ein Glasfilter austausehen, das man bei der Elution der Farbstoffe benStigt, augerdem kSnnen Vorlagekolben mit verschiedenem Inha l t angeschlossen werden, ohne dal~ der Apparat zerlegt werden mug.

Literatur.

BUZXGH, ALADXR: Ko]loidik, Budapest 1946. -Fi~L6p, LXSZL6: Untersuchungen zu der chemischen Bestimmung des Carotins. Mitteilungen aus tier tIochschule ~iir Gartenbau und Ampe]ologie, Budapest X. I. 152-161, (1944) - HESSE, G. : Adsorptions- methoden im ehemischen Laboratorium, Berlin 1943. - Z E C H N E I S T E R , I~. : Carotir~oide, Berlin 1934.- Z~CHMEISTER, L. u. L. CROL~OKY : Die ehromatogr~phische Adsorptions- methode, Wien 1937.

Dr. B~LA BENeZE, Orszs Chemiai Int6zet Budapest II, Keleti Ks u. 24.