DNA (Virus) Vektoren - helmholtz-muenchen.de · DNA (Virus) Vektoren Dr. Armin Baiker, Max von Pettenkofer-Institut. Kriterien für die Einteilung von Vektoren: 1) Adminstration

Molekulare Virologie I

DNA (Virus) Vektoren

Dr. Armin Baiker, Max von Pettenkofer-Institut

Kriterien für die Einteilung von Vektoren:1) Adminstration2) Replikation3) Nukleäre Retention (Persistenz)

Gliederung:

Plasmidreplicons:1) nicht-viral2) viralReplikationsdefiziente Viren:1) Adenovirale (Ad-) Vektoren2) Adeno-assoziiertes Virus (AAV-) Vektoren

Überblick über aktuelle Gentherapiestudien

Replikationskompetente Viren:1) Vaccinia Virus Vektoren2) Onkolytische Viren

Kriterien für die Einteilung von Vektoren:1) Administration

Nackte DNA

Replikationsdefiziente Viren

Replikationskompetente Viren

Kriterien für die Einteilung von Vektoren:1) Administration – nackte DNA

TransfektionPhysikalische Transfektionsmethoden1) Nadel Injektion in Gewebe / Inhalation 2) Hydrodynamischer Gentransfer3) Mikroinjektion in Nukleus4) „Gene Gun“ Transfer5) ElektroporationChemische Transfektionsmethoden1) Kalziumphosphat Co-Präzipitation 2) Kationische Polymere 3) Kationische Lipide („non-bilayer forming“)4) Liposomen („bilayer forming“)

KondensationPositive Ladung(Membranfusion)

Transfektionsmethoden mit „nuclear localization signals“

Geringe Effizienz des Gentransfers

Kriterien für die Einteilung von Vektoren:1) Administration – Replikationsdefiziente Viren

Transduktion

Beibehaltung der Mechanismen der Ausgangsviren zur Infektion (Transduktion) von Zielzellen

Zusammenbau in z.T. komplexen Produktionssystemen

Häufig immunogen (humorale und zelluläre Immunantwort)

Nicht-integrierende Vektoren sind nur „transient“

Dadurch: sehr hohe Effizienz des Gentransfers

Kriterien für die Einteilung von Vektoren:1) Administration – Replikationskompetente Viren

Infektion

Anwendung (Studien) v.a. in der Therapie von Tumoren (onkolytische Viren) und in der DNA Vakzinierung

Basieren auf attenuierten bzw. genetisch modifiziertenreplikationskompetenten Viren

Kriterien für die Einteilung von Vektoren:2) Replikation

(Indirekte) Replikation nach Integration ins Wirtschromosomstabile Expression eines Transgens

Kein Mechanismus zur Replikation vorhandenVerlust des Vektors während der Zellteilungen !transiente Expression eines Transgens

Mechanismen der episomalen Replikation vorhandenstabile Expression eines Transgens

- Kopienzahl des Vektors ?- Zellzyklus (MCM2-7) abhängige Replikation ?

Achtung: nicht mehr oder selten teilende Zellen !!!

ReplikationExkurs: „MCM2-7 licensing“

ORC1-6 assoziiert mit ORI

Schrittweise„assembly“ derInitiatorproteine:1) Cdc6, Cdt12) MCM 103) MCM 2-7

ORC: Origin recognition complexMCM: Minichromosome maintenance (replikative Helikase)Cdk: Cyclin dependent kinaseCdc: Cell division cycle proteinCdt1: cdc 10 dependent transcript 1RPA: Replication Protein ADpb: DNA Polymerase binding protein

S-Phase assoziierteCdK‘s:

Cdc6 Cdc7 / 45

Eintritt in S-Phase(DNA Replikation)

Kriterien für die Einteilung von Vektoren:3) Nukleäre Retention (Persistenz)

(Indirekte) Retention nach Integration ins Wirtschromosomstabile Expression eines Transgens

Kein Mechanismus der Retention vorhandenVerlust des Vektors während der Zellteilungen !transiente Expression eines Transgens

Retentionsmechanismen von Episomen vorhandenstabile Expression eines Transgens

1) Kopienzahl-Strategie2) Bindung an Metaphasechromosom („piggy-back“) Strategie3) Centromer-Strategie4) Selektionsdruck-Strategie5) Verschiedene Endreplikationsstrategien linearer Episomen

Achtung: nicht mehr oder selten teilende Zellen !!!


Gliederung:

Plasmidreplicons1) nicht-viral2) viralReplikationsdefiziente Viren1) Adenovirale (Ad-) Vektoren2) Adeno-assoziiertes Virus (AAV-) Vektoren


Replikationskompetente Viren1) Vaccinia Virus Vektoren2) Onkolytische Viren

Plasmidreplicons:

Nicht-virale Plasmidreplicons und künstliche Chromosomen:1) Historisch: Vektoren für die Hefe2) Vektoren für Säugetierzellen

Virale Plasmidreplicons:1) Das Simian Virus 40 (SV40) Plasmidreplicon2) Das Papillomavirus (HPV / BPV) Plasmidreplicon3) Das Epstein-Barr Virus (EBV) Plasmidreplicon4) „Substituted“ EBV Plasmidreplicons

Administration als „nackte“ (Plasmid-) DNA

MCM 2-7 Abhängigkeit

Nukleäre Retention .

Kopienzahl

Replikation

Ja

STB (CEN) / Kopienzahl

50-100

2µm ORI

Ja

Selektionsdruck .

<10

ORI

Ja

CEN / TEL .

<10

ORI

2 µm - Plasmid ARS Plasmide YAC‘s

Selektionsmarker

ORI

ORID

REP1

IR

IR

FLPREP2

TEL CEN ORI TEL

Spindel (Metaphase)

Spindel (Metaphase)

„rolling circle“ Replikations-intermediat

STB

1976 Nach 1976

ORC

ARS

ORI

Replikation der Plasmide !

Plasmidreplicons / künstliche Chromosomen:Grundlagenforschung in der Hefe

Isolierung (Klonierung in Plasmide)

Entdeckung von autonom replizierenden Sequenzen (ARS)

Grundlagenforschung im Bereich der molekularen Chromosmenstruktur: ORI‘s, Centromere,Telomere

Plasmidreplicons / künstliche Chromosomen:Grundlagenforschung in Säugetierzellen

Eine Übertragung der aus Hefe gewonnenen Erkenntnisse imBereich der Vektorologie auf Säugetierzellen ist sehr langenicht möglich (bis Ende der 1990er Jahre)

(Mögliche) Ursachen:1) Höhere Komplexität von Säugetier ORI‘s2) Technische Schwierigkeiten bei der Transfektion von

Säugetierzellen3) (unbekannte) Epigenetische (Kontroll-) Mechanismen:

- Kopplung von Replikation und Transkription- „Silencing“ durch Methylierung von Promotoren- Mechanismen der Etablierung von Episomen- ???

4) Mechanismen der angeborenen Immunität:- CpG Inseln im Plasmid „backbone“

Der DHFR Locus:

Ursachen:Exkurs: höhere Komplexität von Säugetier-ORI‘s

(ca. 25 kbp)

300 nm chromatin fibernuclear matrix

30 nm chromatin fibernucleosome

MAR

Ursachen:Exkurs: höhere Komplexität von Säugetier-ORI‘sMatrix attachment regions (MAR):

- AT-rich sequences of around 100 bp - 1 kbp - DNA unwinding elements / Base unpairing regions- DNase I hypersensitive sites - Topoisomerase II binding and cleavage sites

In eukaryotischer DNA:- Häufigkeit eines CpG Dinukleotids: 1:60- C sehr häufig methyliert: mCpG- „CpG-reiche“ (ca. 1:16) Regionen häufig assoziiert mit

Promotoren (epigenetische Regulation via „silencing“)

Ursachen:Exkurs: „CpG islands“

Statistische Wahrscheinlichkeit eines CpG Dinukleotids: 1:16

In bakterieller DNA:- Häufigkeit eines CpG Dinukleotids: 1:16- C nicht methyliert: CpG

Mechanismen der angeborenen Immunität können zwischenbakterieller und eukarytischer DNA differenzieren:- Erkannt werden: nicht methylierte CpG Motive- via TLR-9 „signalling“- B-Zellen und Plasmazytoide Dendritische Zellen (pDC‘s)

Ursachen:Exkurs: „CpG islands“

Produktion inflammatorischer Zytokine !


Nukleäre Retention

Kopienzahl

Replikation

Ja

Selektionsdruck

<10

Chromosomaler ORI (!)

selection cassette

Chromosomaler ORI (!)

Selektionsmarker

Plasmidreplicons / künstliche Chromosomen:nicht-viral – Chromosomale ORI Vektoren


Nukleäre Retention

Kopienzahl

Replikation

Ja

CEN / TEL

<10

Chromosomaler ORI

TEL CEN ORI TEL

Spindel (Metaphase)

Plasmidreplicons / künstliche Chromosomen:nicht-viral – Künstliche Chromosomen

Zwei Arten der Konstruktion:- „top - down“ (durch Fragmentierung) [0,5 -1 Mbp]- „bottom – up“ (durch „assembly“ in vitro) [~ 10 Mbp]

Schlechte Handhabbarkeit (Mbp !!!)

1997

Instabilität (?)

Model für die Untersuchung der Chromosomenstruktur

Transkriptions-Komplex

SAF-A

MARs

mRNA

pEPI

Chromosom

Plasmidreplicons / künstliche Chromosomen:nicht-viral – pEPI-Vektoren


Nukleäre Retention

Kopienzahl

Replikation

Ja

SAF-A Bindung an MARs

~10

Transkription in MARs

Kein definierter ORI:ORC und MCM‘s können an verschiedenenStellen des Plasmid „backbones“ assemblieren

Etablierte pEPI Episomen sind (auch ohne Selektionsdruck) mitotisch stabil

1999

Geeignet zur Herstellung transgener Tiere etc.(Schwein, Zebrafisch)

piggy back

Plasmidreplicons:

Nicht-virale Plasmidreplicons und künstliche Chromosomen:1) Historisch: Vektoren für die Hefe2) Vektoren für Säugetierzellen

Virale Plasmidreplicons:1) Das Simian Virus 40 (SV40) Plasmidreplicon2) Das Papillomavirus (HPV / BPV) Plasmidreplicon3) Das Epstein-Barr Virus (EBV) Plasmidreplicon4) „Substituted“ EBV Plasmidreplicons

Administration als „nackte“ (Plasmid-) DNA

Virale Plasmidreplicons:Das Simian Virus 40 (SV40)

Familie: Polyomaviren40 nm großes, ikosaedrisches KapsidNicht umhülltZirkulares, doppelsträngiges DNA Genom (5300 bp)MCM 2-7 unabhängige Replikation (T-Antigen ist replikative Helikase)

5300 bp

Model für die Untersuchung:- der eukaryontischen DNA Replikation- der Chromatinstruktur (Nukleosomen)- der Genregulation („cis acting“ Enhancer)- des alternativen „splicing“

ab 1976


Nukleäre Retention

Kopienzahl

DNA Replikation

Nein

Kopienzahl

100-1000

SV40 ORI + T-Antigen

Virale Plasmidreplicons:Das SV40 („high copy number“) Plasmidreplicon

Anwendung in der Biotechnologie:- Plasmidvektoren mit SV40 ORI und Promoter in cis- Zellinien mit T-Antigen (293T, COS etc.) in trans

Immortalisierung (Transformation) von primären Zellen via T-Antigen („libraries“ !)

Das T-Antigen:- Bindung an SV40 ORI- MCM 2-7 unabhängige, replikative Helikase- Virales Onkoprotein (Inaktivierung von p53 und pRB)- Immunogene Eigenschaften

Virale Plasmidreplicons:Das SV40 („high copy number“) Plasmidreplicon

heute

Virale Plasmidreplicons:Papillomaviren (HPV / BPV)

Familie: Papillomaviren55 nm großes, ikosaedrisches KapsidNicht umhülltZirkulares, doppelsträngiges DNA Genom (7900 bp)MCM 2-7 unabhängige Replikation (E1 ist replikative Helikase)

Chromosom



Kopienzahl

DNA Replikation

Nein

(E1 +) E2 - Chromsom (Kopienzahl)

~ 50 - 150

BPV ORI + E1 + E2

E2

piggy back

Virale Plasmidreplicons:Das BPV („intermediate copy number“) Plasmidreplicon

E1

1980

Anwendung in der Biotechnologie:als BPV 69T Fragment(Depletion von L1 und L2)

Immortalisierung (Transformation)von primären Zellen:E6: p53-DegradationE7: Inaktivierung von pRB

„Warzenbildung“ in vitro

Replikation:E1 ist die replikative Helikase (MCM 2-7 unabhängig)

Retention:E2 (E1) Bindung an Chromosom („piggy back“)

heute (selten)

Virale Plasmidreplicons:Das BPV („intermediate copy number“) Plasmidreplicon

Exkurs:Der HPV Impfstoff (Gardasil / Zervarix)

Gardasil: HPV 6,11,16,18 (Hefe Expressionssystem)Zervarix: HPV 16,18 (Baculovirus Expressionssystem)

Exkurs:Der HPV Impfstoff (Gardasil / Zervarix)

Neuztralisierende AK verhindern Primärinfektion (Reinfektion) mit dem entsprechenden HPV Typ (Dauer der Immunität ?)

Virale Plasmidreplicons:Das Epstein-Barr Virus (EBV)

ori P ori lyt ori lyt

172 kbp

IR: inverted repeatTR: terminal repeatU: unique regionori P: latenter (Plasmid) Ori ori lyt: lytischer ORI

Familie: Herpesviren160 nm großes, umhülltes VirusIkosaedrisches KapsidDoppelsträngiges DNA Genom (172 kbp):- Linear im Virion- Zirkular nach Rezirkularisierung im ZellkernMCM 2-7 abhängige latente Replikation (ori P) MCM 2-7 unabhängige lytische Replikation (ori lyt)

Passives Diffusionslimit:10 nm

Importin (NLS) „mediated“:40 nm

Durchmesser: <160 nm

Andocken des viralen Kapsids und Injektion der DNA

Virale Plasmidreplicons:Exkurs: Herpesviren und die Kernpore

Virale Plasmidreplicons:Exkurs: Komplexe Replikation von Herpesviren

A: Eintritt in Zelle (Fusion / Endocytose)

B: Freisetzung des Kapsids

C: Transport zu Kernporen

D: Einschleussen des linearen Genoms in NukleusRezirkularisierung:- Kaskadenartige Genexpression (IE, E, L)

- Latente Replikation via ori P

- Lytische Replikation via ori lyt:Bildung von Konkatemeren (RCA)

E: Verpackung der Genome in Kapside

F: „Budding an innerer Kernmembran“ (Envelopment)

G: De-Envelopment am ER ins Zytoplasma

H: Re-Envelopment am TGN

I: Freisetzung an Zelloberfläche

AB

CD

EF

G

H

I

Virale Plasmidreplicons:Das Epstein-Barr Virus (EBV) – lytische Replikation

rolling circle Amplifikation (RCA)

MCM 2-7 unabhängig

ori lyt



Kopienzahl

DNA Replikation

EBNA

FR 24 x

DS 4 x

ORC / MCM 2-7

Chromosom

Ja

OriP (FR) + EBNA1 - Chromosom .

~10

OriP (DS) + EBNA1

EBNA

piggy back

Virale Plasmidreplicons:Das EBV („low copy number“) Plasmidreplicon

EBNA1

EBNA1

ORC / MCM2-7 – RekrutierungReplikation

FR

DS

Nukleäre Retention

1985 Latenz-ORI: ori P

FR: family of repeats (24 x)DS:dyad symmetry element (4 x)

40 89 325 386 450 609 641

Gly

-Arg

UR

1

Gly

-Arg

UR

2

NLS

LR1 LR2Gly-Ala DBD

Chromatin Bindung ori P Bindung

EBNA1

TetR::HMGA1a

HMGA1a::EBNA1

AT-h

ook

acid

icHMGA1a

linke

r

386 450 609

NLS

DBD

ori P Bindung

641

AT-h

ook

AT-h

ook

TetR TetR

HMGA1aTetR

linke

r AT-h

ook

acid

ic

AT-h

ook

AT-h

ook

Virale Plasmidreplicons:„Substituted“ EBV Plasmidreplicons

HMGA1: high mobility group AT hook 1TetR:Tetracyclin Repressor

(Chromatin Bindung)

(Chromatin Bindung)(Tet Operator Bindung)

Das EBV Plasmidreplicon ist substituierbar:hier gezeigt: Substitutionen von EBNA1

FR

ORC-Bindung

Chromosomaler ORI

EBNA1

Replikation

FR

4 x TetO

Doxycyclin

EBNA1

TetR::HMGA1a

Replikation

FR

DS

Nukleäre Retention

HMGA1a::EBNA1

Replikation

HMGA1a::EBNA1

Virale Plasmidreplicons:„Substituted“ EBV Plasmidreplicons

Nukleäre Retention Nukleäre Retention

Das EBV Plasmidreplicon ist substituierbar:hier u.a. gezeigt: Substitutionen des ori P (FR bzw. DS)

Trennung von Replikation und nukleärer Retentionpraktische Anwendung z.B. als „ori fishing“ Vektoren

FR: family of repeats (24 x)DS:dyad symmetry element (4 x)


Gliederung:




Replikationsdefiziente Viren:Das Adenovirus (Ad)

E: earlyL: lateITR: inverted terminal repeatsPsi: Verpackungssignal

Familie: Adenoviren60-90 nm großes, nicht umhülltes VirusIkosaedrisches Kapsidca. 51 bekannte, humanpathogene Ad Serotypen Lineares, doppelsträngiges DNA Genom (30-36 kbp):MCM 2-7 unabhängige lytische ReplikationReplikation startet an den „Enden“Rezeptoren: CAR, Integrine

36 kbp

Durchmesser: 60-90 nm

Replikationsdefiziente Viren:Exkurs: Adenovirus und die Kernpore

Replikationsdefiziente Viren:Exkurs: Adenovirale (End-)replikation

G

G

TP dCMP

TP CTPC

G

G

TP C

TPC

5‘

3‘

5‘3‘

3‘

3‘

5‘

3‘

5‘ E2A

G

G TPC 5‘3‘

3‘TP dCMP

5‘

5‘

TP C5‘

G 3‘

+

Lineares Ad Genom mit55 kDa TP an 5‘ Enden

G/C Paarung zwischen80 kDa TP-dCMP unddem G des 3‘ Endesdes Ad Genoms

dCMP bildet freie 3‘ OH-Gruppe als Primer fürdie Replikation

Der nicht-replizierte, einzelsträngige, E2A gebundene DNA-Strang dient als Matrize…

E2A

Replikationsdefiziente Viren:Exkurs: Adenovirale (End-)replikation

G 3‘

TPC 5‘

TPdCMP 5‘3‘

G

G TPC 5‘3‘

3‘TP dCMP

5‘

…für die weitere Replikation unter Ausbildung einer „Pfannenstielstruktur“via ITR‘s (internal terminal repeats)

E2A

ITR‘s

Replikationsdefiziente Viren:Das Adenovirus (Ad) – weitere Informationen

Das „splicing“ wurde an Adenoviren entdeckt

1977: Erstbeschreibung der (Ad transformierten)293 Zellen (Graham et al.)

Transformation durch die E1 Proteine:- E1A Inhibition von pRB- E1B Inhibition von p53

In Kombination führen beide Proteine zur Transformationvon Zellen in vitro

Daher: in allen replikationsdefizienten Adenoviren ist das Gen für E1 deletiert

E1 E3L1 L5L4L3 E4L2E2

L5L4L3 E4L2E2Transgen

Transgen

Wildtyp Ad

AV – 1.gen.

AV – 2.gen.

AV – 3.gen.*

ITR ITR

ITR

ITR

ITR

ITRL1 E3

L5L4L3 E4L2E2Transgen L1

ITR

ITR

Replikationsdefiziente Viren:Adenovirale Vektoren (schematisch)

Δ E1Klonierungskapazität: 5.2 kbp

Δ E1 Δ E3 (oder E2 oder E4)+Klonierungskapazität: bis 13 kbp

Klonierungskapazität: 36 kbpΔ E1-E4 und L1-L5

(*auch bezeichnet als „gene-deleted“ oder „gutless“ AV) Komplexität des Produktionssystems

Genom: 30-36 kbp

transgene production release of

DNA into nucleus

cellular entry

endosomal release

Transduktion mit AV‘s

L5L4L3 E4L2E2transgene AV – 1.gen.

tg

E1

mRNA transcription

Produktion von „1. Generation“ adenoviralen Vektoren (AV‘s)

ITR ITR

E3E4AAA

AAA

AAA

AAA

viral DNA replication=

production of viral proteins

encapsidation of AV-DNA

AV release

L1 E3

tg

tg

assembly

nuclear pore complex

E1

E2

L4

L3L2

L1 AAA

AAA

AAAAAA

Δ E1

Replikationsdefiziente Viren:Adenovirale Vektoren (AV) – Zusammenfassung

Administration (Transduktion) als replikationsdefiziente VirenDadurch: sehr effizienter Gentransfer auch in nicht-teilendeZellen !

Keine Möglichkeit der ReplikationDadurch: nur transiente Expression eines Transgens

Mechansimen der nukleären Retention sind nicht vorhanden(bzw. ungeklärt)Dadurch: nur transiente Expression eines Transgens

AV sind immunogen (z.B. neutralisierende AK !)Dadurch: wiederholte Behandlungen sind nicht effizient

Erfolgreicher Gentherapie-Vektor:Häufiger Einsatz in klinischen Studien

Replikationsdefiziente Viren:Das Adeno assoziierte Virus (AAV)

ITR: inverted terminal repeatrep: Replikationsproteinecap: Kapsid Proteine

Hammerkopfstruktur

Familie: Parvoviren20 nm großes, nicht umhülltes VirusKönnen Menschen infizieren; keine Pathogenität !Lineares, einzelsträngiges (-) DNA Genom (4.7 kbp)Benötigen Helferviren (Adenoviren, Herpesviren) für eine produktive Virusvermehrung (Faktoren z.B. Ad E1A)Ohne Helferviren: site specific integration in Chromsom 19(ITR und rep benötigt)Rezeptoren: Heparansulfat, Integrine, FGFR

Replikationsdefiziente Viren:Exkurs: Parvoviren und die Kernpore

Passives Diffusionslimit:10 nm

Importin (NLS) „mediated“:40 nm

Durchmesser: 20 nm

Parvoviren „passen“ durch die Kernpore

Replikationsdefiziente Viren:Exkurs: AAV (End-)replikation

Neusynthetisierte DNAtrs: terminal resolution siteRep: ReplikationsproteinITR: inverted terminal repeatsITR‘s

Produktive Replikationbedingt Anwesenheit eines Helfervirus !

rep cap

ITR ITR

ITRITR

transgene

Wildtyp AAV

AAV Vektor

Replikationsdefiziente Viren:AAV Vektoren (schematisch)

Klonierungskapazität: 4.8 kbp

Genom: 4.7 kbp

Für die Produktion von AAV Vektoren:(1) Bereitstellung von rep und cap(2) Bereitstellung von Helferviren (Koinfektion)

rep cap

ITR ITR

ITRITRtransgene

tg

repcap

1

2

tg

repcap

mRNA

transcriptionE2 E4

E3

AAAAAA

AAA

rep cap AAA

viral DNA replication

tg

production of viral proteins

tgtg

tg

tg

tg

tg

tg

encapsidation of DNA

AAVV and helper-AD release

helper-AD cellular entry

tg

nuclear entry of AAVV

tg

tg

transgene production

E1

E1 AAA

tg

assembly

wild-type AAV

AAVV

release of DNA into nucleus

Transduktion mit AAV Vektoren

Produktion von AAV Vektoren

Replikationsdefiziente Viren:AAV Vektoren – Zusammenfassung

Administration (Transduktion) als replikationsdefiziente VirenDadurch: sehr effizienter Gentransfer auch in nicht-teilendeZellen !

Keine Möglichkeit der ReplikationDadurch: nur transiente Expression eines Transgens

Mechansimen der nukleären Retention sind nicht vorhanden(bzw. ungeklärt)Dadurch: nur transiente Expression eines Transgens

AAV Vektoren sind wenig immunogen

Erfolgreicher Gentherapie-Vektor:Häufiger Einsatz in klinischen StudienAktuell: Einsatz als DNA Vakzinierungs Vektor gegen HIV


Gliederung:




Familie: Poxviren Zweitgrößtes bekanntes Virus (300 x 200 x 100 nm) Lineares, doppelsträngiges DNA Genom (190.000 kbp)Kovalente Bindung der beiden DNA Stränge an den Enden ! Replikation im Zytoplasma !Vacciniavirus: Impfstoff gegen Pocken (Jenner – Ende 18. Jhd.)

Replikationskompetente Viren:1) Vaccinia Viren

Familie: Mimiviren Ikosaedrisches KapsidZirkulares, doppelsträngiges DNA Genom (1.200.000 kbp)Durchmesser: 400 nm (80 nm Fibrillen)> 1200 ORFs (u.a. Translationsfaktoren, tRNAs, Topoisomerasen)Isoliert aus AmöbenAssoziiert mit Pneumonien (?)

Exkurs: Das Mimivirus

2003

Mycoplasmen: ca. 800 kb !

Replikationskompetente Viren:1) Vaccinia Viren – Replikation im Zytoplasma !

Durch zytoplasmatische Replikation können auch sichnicht-teilende Zellen infiziert werden

Kovalente Bindungder linearen DNA Enden

Replikationskompetente Viren:1) Vaccinia Viren - Zusammenfassung

Administration (Infektion) als replikationskompetente Viren

Durch zytoplasmatische Replikation können auch sichnicht-teilende Zellen infiziert werden

Vaccinia Viren (Stamm MVA „modified Vaccinia Ankara“)kommen häufig zum Einsatz als Vakzinierungsvektorenz.B. rekombinantes MVA-basiertes HIV Vakzin

Weiterhin: dienen als Impfstoff gegen Pocken !

In der Biotechnologie: MVA-Vektoren zur Überexpression der T7 RNA PolymeraseDadurch: Überexpressionssystem von Genen, die hinter T7 Promotoren geschaltet sind (in fast allen kommerziellen Vektoren präsent als Ansatzstelle für Sequenzierprimer)

Replikationskompetente Viren:2) Onkolytische Viren - Geschichte

Aus einer klinischen Beobachtung wird eine Therapieform !

Replikationskompetente Viren:2) Onkolytische Viren – Aktuell: ONYX - 015

ONYX-015 (CI-1042 bzw. H101):

Modifiziertes Adenovirus

Repliziert in und tötet selektiv Zellen mit p53 Mutationen

Mutationen in p53 sind die häufigste genetische Abnormalität von Krebszellen

Onyx-015 trägt eine loss of function Mutation im E1B Lokus

E1B bindet und inaktiviert das Tumor Suppressor Protein p53

Da Wildtyp Ad p53 inaktivieren müssen, um zu replizieren, lässt ONYX-015 (welches dies nicht mehr kann) gesunde Zellen unbeeinflusst

November 2005:Shanghai Sunway Biotech Co. Ltd. announced today that the Chinese State Food and Drug Administration (SFDA) has approved H101 to be used in combination with chemotherapy as a treatment for patients with late stage refractory Nasopharyngeal cancer, a type of head and neck cancer prevalent in China. This marks the first oncolytic viral therapy approved by any regulatory agency in the world.


Gliederung:




Überblick über aktuelle Gentherapie Studien: Verwendete Vektoren - Stand: 2008

Continent Country Gene Therapy Clinical TrialsNumber %

America

USA

882

864

67.4

66Europe *

UK

Germany

Switzerland

France

Belgium

Italy

358

150

74

42

20

19

15

27.3

11.5

5.7

3.2

1.5

1.5

1.1Asia *

Japan

China

37

16

8

2.8

1.2

0.6Australia 19 1.5Africa 1 0.1Multi-Country

12 0.9

Total 1309

Überblick über aktuelle Gentherapie Studien: Differenziert nach Kontinent / Land - Stand: 2008

Molekulare Virologie I„DNA (Virus-) Vektoren“

Vielen Dank für ihreAufmerksamkeit !

Dr. Armin Baiker, Max von [email protected]

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