Jg. 38, ]~eft 1~ K. BETKE et al. : Hitzelabilitat und Saurestabilitat yon 'Hamoglobin H 529 1. J~mi 1960

HITZELABILIT~T UND S~URESTABILIT~T YON H~MOGLOBIN H* Von

K. B ~ T ~ , H. t¢. ~At~TI, E. KLEIHAUEt~ und E. BOTIKOFEI~ Aus der Universit~ts~Kinderklinik Freiburg im Breisgau "(Direktor: Prof. Dr. W. KELLER)

~md der ]~Iedizinischen Universi t~ts-Klinik Bern (Direktor: Prof. Dr. W. H/rDO~N)

Hamoglobirr H wurde 1955 yon R~¢As u. Mitarb. beschrieben. Sie entdeckten es bei 2 an~mischen Pa- tienten, Brfidern aus einer Chinesenfamihe. t tb H wandert papierelektrophoretiseh bei p~ 8,6 sehneller als normales Erwaehsenen-Hb (Hb A) und behalf als einzige mensehliehe Hb-Variante eine anodische Wan- derung aueh bei p~ 6,5 bei. Dadurch ist es elektro- phoretisch leicht zu identifizieren. Es wurde bisher immer nut als kleinere Komponente (meist <20%) neben Hb A im Blur der betreffenden Patienten ge- funden.

Bereits Rmxs u. Mitarb. stellten eine auffallende Instabiht/~t yon ]!Ib H lest: Bei Stehenlassen des H~molysats im Kfihlschrank fiel ein Pr/~eipitat aus. Welter ist ffir Hb H charakteristisch, dab die Erythro- eyten bei Inkubation mit Brfllantkresylblau zahl- reiche ,,Innenk6rper" bilden. Diese Erscheinung er- kli~rt sieh daraus, dab Hb H durch Brillantkresylblau pr~cipitiert wird (GovTTXS u. Mitarb., I-~EDENBERG u. Mitarb.).

Bei der Untersuehung einer Patientin mit einer eisenrefrakt/~ren h~Tochromen An/~mie stellten wir Hb H in einer Menge yon 7 % im Blur fest. Ein kli- nisch-h/~matologischer Berieht fiber die Patientin und ihre Familie sell an anderer Stelle erfolgen (B0TI- KOFEI~, M.AI%TI 11. BETKE). Wit nutzten die Gelegen- heir zur Untersuchung einiger Eigenarten yon Hb H aus, und m6chten darfiber berichten.

Drei Capillaren, die 4 rain bei 690 gehMten worden waren, wurden in der Mikroh~matokritzentrifuge scharf zentrifugierL so dal~ sieh das Pr~eipitat absetzte. Der klare Anteil des Hamolysa~s wurde naeh Abbreehen der Capillaren auf die St/~rkebloekelektrophorese gebraeht (Abb. 1).

• ..[.: [ / •

Abb. 1. Stfixkeblockelektrophorese ('Pu 8,6) yon Hb A + t I (links) und l i b A ÷ l i nach 4 rain Erhi tzen auf 69 ~ ( l~ t te ) . Rechts l ib eines normMen Erwachsenen zum Vergleich. Beacbte auch die rechts deutl ich Ihervor- t re tende langsame Frak t ion l ib A~; sie ist be! t Ib A + H k a u m vorhanden.

Die PfeilspiSze a m linken Bildrmnd unten zeigt die Startlinie an

1. Zur Frage der Denaturierung von Hb H in der K~ilte Bei Aufbewahrung eines konzentrierten Hiimoly-

sats (11,4g-%) im Kfihlschrank bei ~-4 ° sahen wir im Gegensa, tz zu RmAs u. Mitarb. auch naeh 4 Mona- ten keine Ausf~]lung eintreten. Im Untersehied zum iiblichen Vorgehen setzen wir Mlerdings zu den frisch hergestellten (QHb)-tt&molysaten 1/30 Vol. emer 5% KCN-L6sung zur besseren Konservierung (KCN ver- hindert nicht nur eine bakterielle Zersetzung, sondern hemmt auch durch seine AlkMit~t aul~erordentlieh die Meth/~moglobinbildung. Der Blutfarbstoff b]eibt auf diese Weise wochenlang praktisch unver/~ndert als 02Hb erhMten).

~hnlieh wird Hb t t dureh Bindung ~n Kohlen- oxyd so stabilisiert, dM~ es im Kfihlschr~nk nieht aus- f~llt (A.GE~ u. LE~r~2~).

2. Hitzedenaturierung ~) Zur Orientierun9 fiber die Hitzeempfindlichkeit setzten

wit konzentriertes tIi£molysat in diinnen Glascapillaren .-- immer p~rweise Hb A und ttb A -~ tt "-- flit ] rain verschie- denen Temperaturen im ~rasserbad ~us. Das Ergebnis zeigt die Tubelle.

Tabelte

T e m p e r a t u r t 65° t 68° 70°

HbA . . . [ klar kl~r Mcht getrfibt Itb A H • I getriibt stark getrfibt dichte Ausf~l]ung

• ]VZit Un~erstiitzung der Deutsehen ]~orschungsgemein- sehaft.

Klin. Wsehr. , 88 .5ah rg .

2j7

Z,g

~ 7j8

~g --7jc

Z,5

. . . . . . . . . . . .

85 °A.~

[_

Abb. 2. t I i tzedena~urierung yon H b A~ und :fib" t I , isoliert aus dem St~rkeblock. 65 a und 69 ~, OH 6,8 (Phosphat) , Cyanh~miglobin

E~yebnis. Hb H-hMtiges H/~molysat zeigt eine De- naturierung schon bei Temperaturen, bei denen nor- males H&molysat noeh klar bleibt. Die Elektrophorese zeigt, dai~ der ausfMlende Blutiarbstoff Hb H i s t . Ira Beispiel der Abb. 1 war der Prozentsatz yon 7 % auf 1,5% zurfickgegangen.

b) die genauere Prfifung der Denaturierungs- g~chwindigkeit dutch Hitze wurde an isoliertem t tb H durchgefiihrt.

Eine gr6Bere Menge frisch hergestelttes Hamotysat (ohne Cy~nidzusatz !) wurde mit der St/~rkeblockelektrophorese a,uf- getrennt. Hb tt und die Hauptkomponente yon Hb A (A1)

36

5 3 0 K. ]~ETKE e~ al. : Hitzelabilitgt und S~urestabilitgt yon Hamoglobin H Klinische Wochenschrift

wurden ge~renn~ mit Wasser aus der Stgrke eluiert. Da A~ eine st/~rkere Xonzentration hatte, wnrde es welter verdiinnt, und zwar dutch Wasser, mit dem wir einen nich~ mit Hb be- ladenen Angel] yore St/~rkeblock eluiert hat~en. Die Xonzen- ~ration der H~molysate bet.rug jetzt 83 rag-%. ~ b H sah deutlich br~unlicher aus (s. nnten, Ziffer 6). Zu je 4 VoI. Hb- LSsung wurde 1 Vol. Transformationsl6sung (0,02 g XsFeCN s

0,02 g KCI~ in 100 ml Wasser) gesetzt, um den Blutfarb- stoff einheitlich in Cyanh~miglobin zu iiberfiihren. - - l~ach Zusa~z yon ~/~o Vol. eines 2 tool. Phosphatpttffers zur Ein- stetlung der Hb-LSsungen ~u~ 1~ 6,8 wurde je 1,5 mI in diinn-

£0

"~ 5z

N ~bA - - o , ~

0 5 lO 75 ~0 25 30 35 40 ~5 50 min

Abb. 3. Denatm'ierung durch Salzs/tm'e. Vergleich yon Hb A und Hb A + H

wandigen Reagensglasern - - immer loaarweise Hb A~ und Hb H - - 20 see lung bei 550 vorgew~rmt und dann fiir die ge- wiinsch~e Zeit in einem Wasserbad yon 65 bzw. 69 ° geschwenkt. Abbrechen der W/ixmeeinwirkung durch Schwenken in 15 ° warmem Wasser. Nach 15 rain Zentrifugieren bei 5000 U/rain wurde der Hb-Gehalt des ~berstands durch Photometrieren bei ) , : 540 m/t (Zeiss-Spek~ralphotometer) bestimmt.

.5olx ~ ....

7,~ Hb N

~ 7,0 - -o :8 - -

o,~ ~ " ~ I - ] l

0:~ 5 7o 75 20 1,5 mfn ~0 Abb. 4. Denaturierung d~rch Salzs~ture, Vergleich yon Hb A~ und Hb H,

isolfert aus dem St~rkeblock

Ergebnis. (Abb. 2): H b H wird un te r den experi- mente l len Bed ingungen bei 650 in 3 m i n zu e/a dena tu- riert, w£hrend H b A~ unbee in f lug t bleibt . Bei 690 ist sehon nach 1 rain mehr als ~/a t t b I{ zerstSrt, wghrend yon H b A~ noch fiber 95 % erhal ten sind. Die Reak- t ionsgeschwindigkeit der Dena tu r i e rung bei 690 ist fiir l i b H f u n d 10mal so hoch wie tfir t t b A r - - Mit An- stieg der Tempera tu r yon 65 auf 690 besehleunigt sigh die Dena tu r i e rung auf das 2,5fache.

3. A tka l idenatur ierung Je 2,7 ml ungepuffer~e LSsung yon I-[b A 1 und Hb H (als

Cyanh~miglobin, s. Ziffer 2 b) wurde in der 1)hotometexkiivet~e mit 0,07 ml n IqaOH versetz~. Die einsetzende Denaturierung wurde im Ablauf der Zeit am Anwachsen der Ex$inktion bei

~ 630 m# veffolgt. Ergebnis . I-Ib I~ wurde ebenso schnell denamr i e r t

wie H b A~. Die t~albwert~zeit be t rug in beiden F~llen

28 see.

4. Si~uredenaturierung

Die Si~urestabi]itgt prfiften wir mi t der yon einem yon tins (K.) entwiekel ten Methode der I )ena tu r ie rung du tch Salzs/~ure. Zuni~chst wurde ein Vergleich der Ausgangshitmolysate, d . h . yon H b A u n d H b A + H durchgeffihrt.

a b Abb. 5a u. b. Fixierte Blutausstriche naoh Elution in Citronens/~urephos- phatpuffer p~ 3,2. a Patient mit Hb A + H. Der Blutfarbs~off ist ira we- ~ntlichen, abet in versclfiedenen Zellen nicht volIst~ndig eluimJ, b Patient mit Thalassaemia minor (3% HbF) . l~eben voIlst/~ndig eluierten Zellen

einzelne Zenen, die noch reichlich Blutfarbstoff (= Hb F) enthalten

700 -

- E

3O 30 ,

mlrl

75 iz5 min rain m~n

p~ ~,~ pi4 3,3 p~ 3,o

Abb. 6. Elution yon Blutfarbstoff, der in Filtrierpapierstiickchen aufgenom- men, getrocknet und fixiert wurde. Das Diagramm zeigt den prozentualen Anteil an Blutfarbstoff, der nach Elutton mit Citronens~ttre-Phosphatpuf~er bei PI~ 3,4, 3,2 und 8,0 noch im Papier ~'erblieb. Elutionsdauer jeweils in den S~ulen angegeben. Schraffiert =~lehrbetrag an zurfickgebliebenem Blutfarbstoff in den mit t tb A + H besohickten FiltiJerpapiersttickchen,

im Vergleich mit Fil~rierpapier, das Hb A enthielt

Dutch TransformationstSsung wurden die Hgmolysate auf 150 rag-% verdiinnt und in Cyanhi~miglobin fibeffi~rt. Je 3 ml wurden mit 1,55 ml ges~ttigtem Ammonsulfat versetzt, das 3% n HCI en*hielt. Die dadureh in Gang gesetzte De- naturierung wurde nach verschiedenen Zeitabsti~nden (lurch Zusa$z yon 0,045 ml 2 n 1NaOH unterbrochen. Filtration und Bes~immung des lmdenaturierten Farbstoffs im Fit~rat bei

= 540 m#. Ergebnis . (Abb. 3): H b A i s t n a c h 1 5 m i n z u f i b e r 9 9 %

zerst6rt. Bei Hb A + I t bleibt naeh 15 mi n noch ein Betrag yon 8 %, der ira weiteren Verlauf n u r ganz lang- sam absinkt . Naeh 45 rain s ind noch 4,7% erhalten. Ex t rapo la t ion der Strecke yon 15- -45 rain nach ZNull ergibt f u n d 10 %, was ann~hernd der elektrophoretiseh im Hi~molysat e rmi t te l ten Menge an t t b H entsprieht .

Nach dem wir mlt dieser Versuchsanordnung 3mM ein identisches Resulta~ erhalten hatten, wurde isoliertes Hb H

Jg. 38, Heft 11 K. ]3~TX~, e~ al. : HRzelabilit~t und Sgures~abiliti~ yon H~tmoglobin H 531 1. Juni 1960

(s. Ziffer 2) mig isotiertem Hb A~ verglichen. Je 2 ml des un- gepufferten Hamolysats (Cyanhgmiglobin) wurde mit 0,97 m] ges~ttigtem Ammonsulfat versetzt, das 3% n HC1 enthiel~. Naeh verschiedenen Zeitabst~nden wurde die Denaturierung dutch Zusatz yon 0,03 ml 2 n N~OH unterbrochen. :Filtration. Bestimmung des undena~urierten Farbstoffs.

E~yebnis. Wahrend Hb A~ raseh zerstSrt wird, ist yon l i b H nach 30 rain noeh 73 % erhalten (Abb. 4). Der in Abb. 4 sichtbare etwas rasehere Abfall in den ersten 3 rain (yon 100 auf 83,4%) dfirfte auf Hb A s zuriickzufiihren sein, das bei der Elution nicht yon Hb H vSllig zu trennen ist.

Hb H wird naeh dem fibereinstimmenden Ergebnis beider Versuehsanordnungen dutch Satzsaure wesent- lich langsamer zerst5rt als Hb A. Naeh den Daten der Abb. 4 verhalten sich die Denaturierungsgeschwin- digkeiten yon Hb A und Hb H rund wie 50:1.

5. Eluierung von /ixiertera Blut/arbsto// Aus fixielCen Blutausstriehen kann man durch Be-

handlung mi t Citronensg~rephosphatpuffer bei p~ 3,2 H b A eluieren, wghrend legates H b (Hb F) in den Ery- throeyten bleibt (BETx~ u. KnSIgAVE~). Auf diese Weise war eine fgrberisehe Darstellung yon Hb F-halti- gen Erythroeyten auf Blutausstriehen m6glieh gewor- den. Bei entspreehender ]~ehandlung der Blutaus- striche unseres Patienten wurden die Erytl~'oeyten nieht vSllig eluiert, sondern behielten in gewisser An- zahl noeh ein wenig Farbstoff (Abb. 5a). Das Blur des Patienten enthielt naeh dem Alkalidenaturierungs- test kein vermehrtes Hb F (0,77%; Normalbereieh 0,3--0,8%). Daher entstand der Verdaeht, dab mSg- lieherweise H b H in ghnlieher ]~%ise wie l i b F sehwe- rer zu eluieren ist.

Zur Priifung wurde ein Modeltversuch angesetzt, Me wir ihn schon zur Aafklarung der verminder~en Eluierbarkeit yon Hb ~ angewendet hatten. Filtrierpapierstiickchen wurden mit abgemessenen Meugen Blutfarbstoff ge~rgnkt, getroeknet und in 80% XthylalkohN fixiert; ansehliegend wurden sie bei 37 ~mit Citronens/iure-Phospha~puffer (p~ 3,0; 3,2; 3,4) be- handelt. Naeh versehiedenen Zeitabstanden wurden sie heraus- genommen und die J~'arbdichte des Eluats gemessen (A= 660 m#). Die Filtrierpapierstiickchen wurden dann zur Feststellung des noch verbliebenen :Farbstoffanteils 7 Std in 0,1 n ttCI extrahier~. Dureh Vergleieh mJ~ einem Kontrollstiickchen, das mit der gMehen Menge Hgmolysat beschiekt und fixierg, abet nieht mit Citronens~urephosphatpuffer behandelt worden war, lieB sieh der noch vorhandene Farbstoff prozentuM ermitteln.

Ergebnis. Der fixierte Blutfarbstoff wurde aus dem Filtrierpapier bei I~b A + H langsarner etuierg als bei H b A. Die naeh der Elution im Filtrierpapier noeh verbliebene Menge an Farbstoff war naeh dem Ergebnis der Salzsgure-Extraktion bei t I b A + t I stets grSl~er als bei Hb A (Abb. 6). Die Differenz zwisehen beiden H/~molysaten betrggt mit auffallender Regelmgl~igkeit rund 10% (10,0, 11,8, 8,0, 8,5), was ann~hernd der im H~tmolysat vorhandenen Menge an Hb I t (elektro- phoretiseh ermitte]t) entsprieht. Das Ergebl~s dieses Versuehs unterstii tzt also die Deutung, dab t t b H ghn- lieh wie Hb F nut schwer aus fixierten Blutausstriehen eluiert wird.

6. SPontane Bildung von Methi~moglobin In H/~molysaten, die aus gewasehenen ErJ~hrocyten

durch Hgmolyse mi t Wasser hergesteUt worden waren und sieh 24 Std im Kfihlschrank befmlden batten, fan- den wit bei Hb A + H 1,9% Meth~moglobin, bei H b A

1% Methi~moglobin. Das nach Ziffer 2 b durch AuG trennung im St~rkebloek isolierte Hb H war im Ver.

Klin. Wschr., 38, ffahrg.

gleieh mit dem gleiehzeitig isolierten Hb A 1 deutlieh brgunlieh. Aus der Extinktion bei 630 m# lieB sieh ein Methgmoglobingehalt yon fund 20% ableiten. Eine genaue ]~estimmung wurde wegen des knappen MateriMs lfieht durehgeftihrt.

Hiernaeh seheint ]Fib H e i n e erh6hte Neigung zur Spontanoxydation zu besitzen.

B e s p r e e h u n g

Die Hitzedenaturierung gibt yon allen Denaturie- rungsmagnahmen am ehesten ein Bild yon der tats/ich- lichen Stabititi~t eines Proteins] weft man annehmen daft, dab Zufuhr yon W~rme lediglich Vorg~nge be- schleunigt, die auch bei Normal temperatur erfolgen, werm auch sehr ]angsam. Die aufgezeigte enorme tIitzeempfindliehkeit yon H b H l~13t also darauf schlie- Ben, dab es sich bei l i b H u m ein sehr unstabiles Pro- tein handel,, das unstabilste Hb, das wit his jetzt ken- nen. Hb F wird gut doppelt so schnell, Hb S knapp doppelt so schnell durch t~ tze zerstSrt wie t t b A (BI~TKE u. GREI~AOmm~). Neuere eigene Messungen an t ib A 1 und H b S, die aus dem St/irkeblock isolieI~ wurden, ergaben ein Verh~ltlHS der Denaturierungs- geschwindigkeiten yon A 1 und S wie 1 : 1,7.

Mit der Feststellung der Unstabflit/~t yon Hb H scheinen wir nichts Neues zu sagen, denn bereits 1%IGAS u. Mitarb. hat ten Hb H als sehr unstabil bezeichnet, well es im Kiihlschrank aus dem H/£molysat ausfiel. Wie oben (Ziffer ]) aber schon bemerkt wurde, kann diese Erscheinung un¢erbunden werden, wenn man das H~.molysat mi t Cyanid oder Kohlenoxyd versetz~. Beide MaBnahmen verhindern die spontane Oxyda- tion zu Meghgmoglobin (die naeh Zi~er 6 bei t t b H be- sonders raseh vor sieh zu gehen scheint), und Megh~mo- globin is~ yon allen Hb-Derivagen alas unstabflste (H~TglDG~). Unsere eigene Untersuchung tier t t i tze- denagurierung wurde daher mi t Cyanh~miglobin dureh- geffihrt, um StSrungen der Rea'ktion dureh MetMmo- globinbildung zu vermeiden.

Die Geschwfindigkeit der Alkalidenaturierunginter- essiert im allgemeinen nur insofern, als man wissen m6ehte, ob ein Hb alkalistabiler ist als I I b A, denn dann wfirde man falsehe Werte in der Bestimmung yon Hb F erhalten. In dieser Beziehung wei$ man seit den ersten Untersuehern, dab l i b H sieh nicht anders verh~tt als I Ib A. Noeh nicht genauer geprfift wurde, ob H b I t vielleieht noch empfindlieher als l i b A. ist, also noch raseher zerst6rt wird. Das w/ire bei die- sere labilen Farbstoff durehaus denkbar. Naeh unse- ren Ergebnissen kann das jedoch verneint werden.

Sehr iiberrasehend ist das Ergebnis der S~iure- denaturierung. Hb H erwies sieh Ms wesentlieh un- empfindlieher als Hb A. Die Differenz ist mi t einem Verhi~ltnis der Denaturierungsgesehwindigkeiten wie rund 1:50 so groB, dab man darauf eine quantitative Bestimmungsmethode liar lib H aufbauen kSnnte. Lei- der ist fiber die S£ureresistenz der anderen Hb-Varian- ten noeh zu wenig bekannt. Man weig nut, dab Hb F 21/2real so resistent ist wie Hb A (KLEIHAV~R). Aufler- dem wurde yon uns orientierend Hb S geprifft; es untersehied sich nieht yon l i b A.

Praktisch wichtig ist ferner das Verhalten yon Hb H bei Elution /ixierter Blutausstriche. Das Ver- fahren ha£te sieh zur rasehen Orientierung fiber das Vorhandensein yon Hb F-haltigen Erythroeyten gut bew~hrt (BETKE u. KL]~ItIAUEI¢. ZIPURSXI u. Mitarb.~

36a

532 ~. BIEGLER et al. : Methode zur Darstellung der unveresterten Fettsauren des Blutes Klinisshe Woehensohrif~

SANSONE U. MASSIMO, OEHLE~T). Hb S und Hb C ver- halten sich naeh eigenen Ergebnissen wie Fib A, d. h., sie werden raseh aus den Ausstrichen eluiert, l ib t t kSnnte nach unseren jetzigen Ergebnissen jedoeh mit der Darstelhmg yon Hb F in Blutausstriehen konkur- rieren. In praxi hat sich allerdings gezeigt, dab aueh bei sehr ~fiedrigen Prozentsatzen yon Hb F im Blur viel eindeutigere Bilder entstehen als wires bei diesem Patienten mit 7 % Hb FI erzielten. Hb F ist - - z. B. bei Thalassaemia minor - - meist sehr ungleiehmgBig verteilt, es findet sieh in wenigen Zellen in st/~rkerer Konzentration und diese Zellen fallen dann sofort auf (Abb. 5b). Hb t t scheint viel gleiehmagiger fiber die Zellpopulation verteilt zu sein. Daffir spricht auch die groBe ZahI yon Zellen mit ,,InnenkSrpern" naeh Inkubation in Brillantkresylblau. So ist der Kontrast, den man naeh Elution erha]t, viel schwacher.

Unsere Ergebnisse zeigen erneut, dab Hb I t eine Sondersteltung ~mter den mensehliehen Hamoglobin- varianten einnimmt. Ihr entsprechen tiefgehende Dif- ferenzen im chemisehen Aufbau. H~ISM~N hatte 1957 mitgetellt, dab die Aminosaurenzusammensetzung bei Hb t I betr/~chtlich von der bei Hb A abweieht. 1959 konnten dann JONES u. Mitarb. zeigen, dag Hb H im Gegensatz zu dem aus je 2 ~- und fl-Polypeptid- ketten bestehenden Hb A ein Tetramer aus 4 fl-Ketten darstellt.

FrauMn B~mITTE Koe~ danken wir ~ar technisehe Assi- stenz.

Zusammen]assung. Berieht fiber die Untersuchung verschiedener Eigensehaften yon Hb H, das in einer

Menge yon 7% im Blur einer Patientin mit eisen- refrakt/~rer An£mie gefunden wurde.

Hb H ist sehr empfindlieh gegen W/~rme. Bei 690 verhalten sich die Denaturierungsgeschwindigkeiten yon t Ib Ji und Hb A wie 10:1. Die aus der Literatur bekannte Prgeipitation yon Hb H bei Kfihlsehrank- temperatur laBt sich dutch Konservierung des tIamo- lysats mit ein wenig Cyanid verhindern.

Die Empfindtiehkeit yon Jib H gegen Alkali ist weder gr6Ber noeh kleiner Ms die von l ib A.

Fib H ist auffallend resistent gegenfiber einer De- naturierung dureh Salzs/~ure. Die Denaturierungs- geschwindigkeit yon Hb A und l ib H verh/~lt sich un- gef/~hr wie 50 : 1.

Einige Beobaehtungen legen nahe, dab t Ib H sieh rascher spontan zu Meth~moglobin oxydiert als t Ib A.

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EINE S~ULENCHROMATOGRAPHISCHE METHODE ZUR DARSTELLUNG DER UNVERESTERTEN F E T T S ~ U R E N DES BLUTES

Y o n

R. BIEGLEt¢, E. B6~LE, W. SC~ADE und W. ABT

Aus der I. Medizinischen Klinik der Univel~ifat ]Frankfur~ a. M. (Direk~or: Prof. Dr. F. ttoF~)

Obwohl sehon ziemlieh lange bekannt ist, dag in den Albuminen des Blutes regelm/tgig geringe Mengen unveresterter Fettsguren (UFS) enthalten sind (KEn- DALL; COH~ ~, HUGHES U. WEAVE), wurde erst neuer- dings wahrseheinlieh gemaeht, dab den Mbumin- gebundenen Fettsguren des Blutes eine groge dynami- sche Bedeutung im Stoffweehsel zukommt. Die zu ihrer Bestimmung angegebenen Methoden weisen noch betraehtliche Untersehiede auf. Ein Tell yon ihnen beruht darauf, dab die titrierbare Aeiditat von Lipidextrakten festgestellt wird, die unter besonderen Kautelen aus Plasma oder Serum gewonnen werden (DAvis; Gaoss~A~ u. Mitarb. ; DOLE; Go~DO~ u. Mit- arb.). Derartige Veriahren, die die Fettsauren in unspezifiseher Weise erfassen, sind in ihrer relativen Einfachheit und ihrer guten Reproduzierbarkeit beson- ders f fir fortlaufende l~eihenuntersuehungen zu ldini- sehen Zweeken geeignet. Vom chemiseh-analytischen Standpunkt aus lassen sie jedoch viele Fragen offen (FtCEDICICKSON U. GORDON). Die rein summarisehen Bestimmungen gestatten auBerdem nicht eine aus- reiehende Kli~rung der vielseitigen Problematik, die bezfigtich dieser eigentfimliehen Blutlipidfraktion in physiologischer und pathologiseh-physiologiseher Hin- sieht noeh gegeben ist. Notwendig sind in diesem Zusammenhang vor allem Untersuchungen fiber die

Zusammensetzung der UFS. tIierffir ist jedoch eine pr/~parative Darstellung erforderlieh.

Verschiedentlieh ist yon einzelnen Autoren eine analytisehe Isolierung der UFS des Blutes bereits ver- sueht worden. So hat man sieh bemfiht, sie yon anderen Bestandteilen der Blutlipidextrakte mit Hilfe der Kiesels~ure-S/~ulenchromatographie abzutrelmen (LIPsK¥ u. Mitarb. ; ItI~SC~ u. AR~E~s). Eine ein- wandfreie Darstellung der UFS hat sieh jedoeh a, uf diese Weise als sehwierig erwiesen (B6TTO~E~ U. Mit- arb.). Die zuletzt genannten Autoren benutzen daher ein grunds~tzlieh anderes Verfahren. Sie versuehen, dureh Ausschfitteln des phospholipidfrei gemachten IApidextraktes mit schwaeh basisehen w~Brigen L6- sungen die UFS Ms Seifen zu gewinnen. Eine vor- herige Entfernung der Phospholipide hat sieh fibrigens aueh f/it die titrimetrisehe Bestimmung der UFS als vorteilhaft erwiesen (SvA~BO~G U. Mitarb.).

DaB ffir die sguIenehromatographisehe Abtren- nung yon freien Fetts&uren aus neutralem 3/[aterial grundsgtzlich aueh die sog. Ionenaustauscher geeignet sind, wurde yon CAsoN u. Mitarb. festgestellt, ihre Anwendbarkeit bei Lipidgemischen yon Bor~ST~6~ sowie yon SAVA~Y-DESNUELLE best/~tigt. Diese Autoren arbeiteten mit dem stark basisehen Amber- lite IRA 400. CA~Lsox u. WADSTI~bN verwendeten