ZÜRCHER HOCHSCHULE FÜR ANGEWANDTE WISSENSCHAFTEN

DEPARTMENT LIFE SCIENCES UND FACILITY MANAGEMENT

INSTITUT FÜR CHEMIE UND BIOLOGISCHE CHEMIE

Identifikation eines unbekannten Enterobakteriums und des Klärschlammisolates ZHAW 134

von

Roger Hiltbrunner und Sarina Rauber

Bachelorstudiengang Chemie mit Vertiefung Biologische Chemie 2010

Abgabedatum: 18. April 2012

Korrektor:

Krebs, Walter

Identifikation eines unbekannten Enterobakteriums ZHAW 134

zhaw Departement N / Roger Hiltbrunner, Sarina Rauber CH10

Zusammenfassung

In diesem Bericht wurde

Grobdifferenzierung, einer Bunten Reihe, einem API 20E Testkit und einem MALDI-TOF aus neun

unterschiedlichen Bakterien identifiziert. Parallel dazu wurde

mit denselben Methoden untersucht. Die Ergebnisse ergaben

Citrobacter freundii. Das Klärschlammisolat wurde als Escherichia Coli identifiziert.

Identifikation eines unbekannten Enterobakteriums ZHAW 134

zhaw Departement N / Roger Hiltbrunner, Sarina Rauber CH10

Inhaltsverzeichnis

1   Einleitung 1  

2   Aufgabenstellung 2  

3   Strategien und Vorgehensweise 3  

4   Grobdifferenzierung 5  

4.1   Makroskopische Charakteristika 5  

4.2   Mikroskopische Beobachtungen und Morphologie 6  

4.3   Physiologische Aspekte 6  

4.4   Kombination der Grobdifferenzierten Ergebnisse 7  

5   Bunte Reihe 8  

5.1   TSI Agar (Triple Sugar Iron) 8  

5.2   Urease Test 8  

5.3   Indol Test 9  

5.4   Methylrot Test 9  

5.5   Zusammenfassung der Resultate 9  

6   API 20E und Maldi-TOF 10  

7   Zusätzliche Tests 12  

8   Literaturverzeichnis 13  

Anhang 1  

Identifikation eines unbekannten Enterobakteriums ZHAW 134 1 Einleitung

zhaw Departement N / Roger Hiltbrunner, Sarina Rauber CH10 1

1 Einleitung

Enterobakterien   sind   gramnegative   und   nicht   sporenbildende   Bakterien.   Ihre   Familie   umfasst   ca.   100  

Spezies.   Sie   sind   in   der   Natur   weit   verbreitet   und   kommen   auch   in   der   Darmflora   vor.   Die   meisten  

Enterobakterien  sind  nicht  gefährlich,  sie  können  aber  als  Opportunisten  fungieren  und  schwere  Infektionen  

bei   Menschen  mit   einem   schwachen   Immunsystem   auslösen.   Die   Identifikation   von   diesen   Bakterien   hat  

einen  grossen  Stellenwert  in  der  medizinischen  Diagnostik[1]  und  der  Qualitätssicherung  von  Gewässern.  Mit  

der   klassischen   Grobdifferenzierung,   einer   bunten   Reihe,   einem   API   20E   Testkit   und   einer   MALDI-­TOF  

Messung  konnten  die  zwei  unbekannten  Bakterien  identifiziert  und  unterschieden  werden.

Identifikation eines unbekannten Enterobakteriums ZHAW 134 2 Aufgabenstellung

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2 Aufgabenstellung

Das unbekannte Enterobakterium von dem Nähragarausstrich ZHAW 134 soll mittels

Grobdifferenzierung, einer Bunten Reihe, einem Api 20E und einem Malid-TOF aus folgenden

neun Enterobakterien identifiziert werden:

Escherichia Coli

Citrobacter freundii

Salmonella enteriditis

Enterobacter cloacae

Proteus mirabilis

Serratia rubidae

Klebsiella terrigena

Pseudomonas aeruginosa

Vibrio fluvialis

Zusätzlich soll das Enterobakterium der

Zuerst wird eine eigene Identifikationsstrategie entwickelt (siehe Anhang). Danach werden die

Identifikationstests mit Hilfe des Unterrichtskripts[2] durchgeführt. Zum Schluss werden die Daten

kritisch ausgewertet und eventuell zusätzliche Tests vorgeschlagen. Zudem werden die Befunde

mit der Literatur und dem Programm PIBWin verglichen.

Identifikation eines unbekannten Enterobakteriums ZHAW 134 3 Strategien und Vorgehensweise

zhaw Departement N / Roger Hiltbrunner, Sarina Rauber CH10 3

3 Strategien und Vorgehensweise

Die Identifikation wird nach dem Skript[2] durchgeführt. Dabei ergibt sich folgendes

Identifikationsdiagramm:

Escherichia Coli

Enterobacter cloacae

Klebsiella terrigena

Citrobacter freundii

Proteus mirabilis

Pseudomonas aeruginosa

Salmonella enteriditis

Serratia rubidae

Vibrio fluvialis

Lactose-Test

+ -

Escherichia Coli

Serratia rubidae

Klebsiella terrigena

Enterobacter cloacae

Vibrio fluvialis

Pseudomonas aeruginosa

Salmonella enteriditis

Proteus mirabilis

Citrobacter freundii

Oxidase-Test

- + Salmonella enteriditis

Proteus mirabilis

Citrobacter freundii Pseudomonas aeruginosa

Urease-Test

- +

Salmonella enteriditis

Citrobacter freundii

Proteus mirabilis

Oxidase-Test

- +

Vibrio fluvialis

Escherichia Coli

Serratia rubidae

Enterobacter cloacae

+

Indol-Test

E. Coli Serratia rubidae

Enterobacter cloacae  

-

Identifikation eines unbekannten Enterobakteriums ZHAW 134 3 Strategien und Vorgehensweise

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Klebsiella terrigena kann aufgrund seiner Unbeweglichkeit identifiziert werden. Um Serratia

rubidae und Enterobacter cloacae sowie Salmonella enteriditis und Citrobacter freundii

voneinander zu unterscheiden, müssen zusätzliche Tests durchgeführt werden (siehe Kapitel 7

).

Identifikation eines unbekannten Enterobakteriums ZHAW 134 4 Grobdifferenzierung

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4 Grobdifferenzierung

4.1 Makroskopische Charakteristika

Die Probe ZHAW 134 wird auf den McConkey Agar mit dem 3-Ösenaufstrich aufgetragen und

inkubiert. Dabei ist eine orange Verfärbung des Agars sichtbar (siehe Abbildung 1), aufgrund der

Peptonfermentation, bei welcher Ammoniak entsteht und somit den pH erhöht.

Abbildung 1: Das unbekannte Enterobakterium fermentiert Pepton. Dabei verfärbt sich der Agar und der Aufstrich orange.

Beim Klärschlammisolat wird Lactose fermentiert, da sich die Kolonien rot verfärben (siehe

Abbildung 2), da der pH-Wert gesenkt wird durch die Milchsäureproduktion.

Abbildung 2: Die roten Kolonien entstanden durch die Lactosefermentation.

Beide Aufstriche sind Geruchsneutral. Pseudomonas aeruginosa hätte einen süsslichen

Gummibärchengeruch.

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Abbildung 4:H2O2 wird sofort in H2O und O2 gespalten, deshalb ist eine Schaumbildung ersichtlich.

4.2 Mikroskopische Beobachtungen und Morphologie

Bei beiden Keimsorten ist eine Beweglichkeit unter dem Mikroskop erkennbar. Zudem sind beide

stäbchenförmig (siehe Abbildung 3), wie es typisch für Enterobakterien ist. Sporen sind keine sichtbar. Die

Grösse des Enterobakteriums liegt zwischen 2-5 urchmesser beträgt se Daten

treffen auch auf das KS-Isolat zu.

Ebenfalls typisch für Enterobakterien ist, dass sie Gram-negativ sind, was bei beiden Keimen die

Gramfärbung aufzeigt. Die Gelbfärbung des Aminopeptasetests vom KS-Isolat bestätigte das Resultat der

Gramfärbung.

4.3 Physiologische Aspekte

Der Katalasetest der Probe ZHAW134 ist positiv (siehe Abbildung 4) und der vom KS-Isolat

negativ, da keine Schaumbildung ersichtlich war.

Beide Proben sind Oxidase-negativ, da keine Blauverfärbung

auf dem BBL DrySlide beobachtet werden konnte. D.h. die

Bakterien besitzen kein Cytochrom c System[2].

Abbildung 3: Beide Mikroorganismen sind stäbchenförmig. Links ist die Probe ZHAW 134 und rechts ist das KS-Isolat nach der Gramfärbung.

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Der Oxidation/Fermentation-Test fällt wie erwartet positiv auf, da

Enterobakterien Glucose oxidativ und fermentativ abbauen können. Dies zeigt

sich durch den gelben Farbumschlag und die Säurebildung, die anhand der

Bläschen im Agar ersichtlich ist (siehe Abbildung 5). Auch das KS-Isolat ist

O/F-positiv. Es handelt sich deshalb beides Mal um fakultativ anaerobe

Keime[2].

4.4 Kombination der Grobdifferenzierten Ergebnisse

Durch die Kultivation auf dem McConkey Agar sind für die Identifikation von ZHAW 134 nur noch

die Enterobakterien relevant, welche Pepton statt Lactose fermentieren[3][4]. Ausserdem kann

Klebsiella terrigena wegen seiner Unbeweglichkeit ausgeschlossen werden. Zudem wird auch

Pseudomonas aeruginosa ausgeschlossen, da es auf den Oxidasetest positive hätte reagieren

sollen[3].

Somit bleiben noch der Citrobacter freundii, Salmonella enteriditis und Proteus mirabilis als mögliche

Enterobakterien übrig.

Abbildung 5: Beim O/F-Test von Probe ZHAW 134 ist deutlich der Farbumschlag nach gelb ersichtlich sowie die Säurebildung (Bläschen).

Identifikation eines unbekannten Enterobakteriums ZHAW 134 5 Bunte Reihe

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5 Bunte Reihe

5.1 TSI Agar (Triple Sugar Iron)

Mit dem TSI Agar werden fermentierende und/oder schwefelreduzierende Enterobakterien

unterschieden. Er enthält Glucose, Lactose und Saccharose sowie Phenolrot als Indikator.

Ausserdem kann der Abbau von Thiosulfat zu Sulfid, welches zu Schwefelwasserstoff

weiterreagiert, nachgewiesen werden indem ein schwarzer Eisensulfatniederschlag durch die

Reaktion mit Eisen ausgefällt wird[2].

So wie schon auf dem McConkey Agar ersichtlich wird die Lactose von der Probe ZHAW 134 nicht

umgesetzt dafür die Glucose (O/F-Test). Die Schrägseite blieb rot (siehe Abbildung 6), das heisst

Lactose und Saccharose wurden hier nicht umgesetzt. Der untere Teil ist jedoch gelb. Hier wurde

Glucose fermentiert. Ein Niederschlag von Eisensulfat ist nicht ersichtlich, obwohl Salmonella

enteriditis und Citrobacter freundii H2S produzieren sollten.

Abbildung 6: Probe ZHAW 134; Das Bakterium fermentiert Glucose. Zudem entstand bei der Schrägseite ein alkalisches Milieu.

Beim KS-Isolat wird Glucose und Lactose fermentiert, da eine Gelbfärbung ersichtlich ist, sowie

eine seitliche orange Färbung (siehe Abbildung 7). Schon der McConkey Agar zeigte auf, dass

Lactose fermentiert wurde.

Abbildung 7: Beim KS-Isolat werden Glucose sowie Lactose und Saccharose fermentiert.

5.2 Urease Test

Einige Bakterien bilden das Enzym Urease mit welchem Harnstoff zu Ammoniak und Kohlendioxid

gespalten wird. Wegen dem Ammoniak steigt der pH-Wert des Mediums, was mit Phenolrot durch

eine dunkelrote Färbung nachgewiesen wird. Dieser Test ist für die Identifikation von Proteus-

Arten geeignet[2].

Die Probe und das KS-Isolat fallen beide negativ aus, da keine Verfärbung zustande kam.

Identifikation eines unbekannten Enterobakteriums ZHAW 134 5 Bunte Reihe

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Abbildung 8 : Links der Probe ist keine pinke Verfärbung an der Oberfläche ersichtlich. Hingegen rechts beim KS-Isolat wird Indol nachgewiesen.

5.3 Indol Test

Alle Keime, die Tryptophan mit dem Enzym

Tryptophanase zu Indol, Ammoniak und Pyruvat

abbauen können, reagieren positive auf den

Indoltest. Mithilfe des Kovacsreagenz wird das Indol

durch eine pinke Färbung nachgewiesen[2].

Der Indoltesttest von ZHAW 134 fällt negativ aus, da

es keine Verfärbung gibt (siehe links Abbildung 8).

Beim KS-Isolat ist jedoch eine pinke Verfärbung an

der Oberfläche sichtbar, somit fällt hier der Indoltest

positiv aus (siehe rechts Abbildung 8).

5.4 Methylrot Test

Bei einer pink-roten Färbung ist der pH-Wert der Probe

unter 4.4 und somit fällt dann der Test positiv aus. Sollte

der pH-Wert über 6.2 liegen verfärbt sich die Probe gelb.

Der Methylrot Test fiel für beide Bakterien positiv aus

(siehe Abbildung 9). Somit fermentieren sie Glucose, wie

es schon auf dem TSI Agar ersichtlich war.

5.5 Zusammenfassung der Resultate

Da die unbekannte Probe urease-negativ reagiert, kann Proteus mirabilis ausgeschlossen

werden[4]. Somit ist das Enterobakterium entweder der Citrobacter freundii oder Salmonella

enteriditis[2]. Eventuell war keine H2S Produktion beim TSI Agar ersichtlich, weil er noch länger

dafür gebraucht hätte.

Abbildung 9: Durch die pinke Verfärbung der Lösung wird die Glucosefermentation nachgewiesen. Oben ist das KS-Isolat, unten die Probe 134.

Identifikation eines unbekannten Enterobakteriums ZHAW 134 6 API 20E und Maldi-TOF

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6 API 20E und Maldi-TOF

Die API 20E Auswertung ergibt für die Probe ZHAW 134 als Bakterium den Citrobacter freundii.

Somit wird Salmonella enteriditis ausgeschlossen.

Für das KS-Isolat erhält man E. Coli. Tabelle 1: Die Resultate und Widersprüche des API 20E Tests werden in dieser Tabelle aufgeführt.

API ZHAW 134 Klärschlammisolat Wiedersprüche Kommentar

ONPG + +

ADH + - ZHAW 134: 24%

LDG - +

ODC . +

CIT + -

H2S + -

URE . -

TDA . -

IND . +

VP . -

GEL . -

GLU + +

MAN + +

INO + - ZHAW 134: 25%

SOR + +

RHA + +

SAC + +

MEL - + ZHAW 134: 82%

Farbe nicht eindeutig

(siehe Abbildung 10)

AMY - -

ARA + +

OX - -

NO2 + +

N2 - -

MOB + +

McC + +

OF-O + +

OF-F + +

Identifikation eines unbekannten Enterobakteriums ZHAW 134 6 API 20E und Maldi-TOF

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RESULTAT

Citrobacter freundii 99.9%, T-

Wert 0.73

Escherichia Coli 1

99.5%, T-Wert 0.96

Kluyvera spp 0.3%

T-Wer 0.53

Die API-Auswertung (Rohdaten siehe Anhang) der beiden Bakterien stimmt auch mit den

vorherigen Tests überein.

Beim MEL Test war das Ergebnis bei der Probe 134 nicht eindeutig (siehe Abbildung 10). Positiv

ist der Test auch, wenn es oben nur leicht blau ist und unten gelb. Den Widerspruch von 82 %

kann dadurch erklärt werden. Bei dieser Probe war auch beim AMY dieselbe Färbung.

Ansonsten sind die Resultate des API 20E Tests eindeutig (siehe Abbildung 11).

Abbildung 11: Oben ist das visuelle Ergebnis des API der Probe 134 und unten das vom KS-Isolat.

Die Ergebnisse der Maldi-TOF-Messungen sind im Anhang zu finden. Sie stimmten mit dem API

Test überein. Leider konnten jedoch die anderen wahrscheinlichen Varianten vom Citrobacter mit

dem PIBWin [5][6].

Abbildung 10: Der API MEL-Test ist aufgrund seiner Farbe nicht eindeutig zu identifizieren.

Identifikation eines unbekannten Enterobakteriums ZHAW 134 7 Zusätzliche Tests

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7 Zusätzliche Tests

Die Grobdifferenzierung und die Bunte Reihe lieferten eindeutige und in sich konsistente

Ergebnisse bis auf den TSI-Agar Test bei der Probe ZHAW 134. Hier war noch kein Eisensulfat

ausgefallen. Eventuell hätte man für die Probe noch länger inkubieren müssen.

Um Salmonella enteriditis von dem Citrobacter freundii schon in der Bunten Reihe zu

unterscheiden, müsste zursätzlich ein Lysin decarboxylase Test durchgeführt werden[4]:

Lysin decarboxylase Test Ergebnis  

Salmonella enteriditis +  Citrobacter freundii -­‐  

Und um Serratia rubidae von Enterobacter cloacae voneinander zu unterscheiden können

folgende Tests zusätzlich durchgeführt werden[5]:

Arginin dihydrolase

Ornithin decarboxylase

Rhamnose PWS

Sorbitol PWS

Dabei reagiert bei diesen Tests der Enterobacter cloacae positiv und Serratia rubidae negativ.

(siehe Anhang).

Dennoch war bei der Probe 134 beim MEL und AMY die Färbung schwer zu bestimmen. Eventuell

sind die beiden Ergebnisse negativ statt positiv. Dann würde der Widerspruch von 84 % bei MEL

gesenkt werden.

Alle Ergebnisse der Probe ZHAW 134 wurden noch mit dem Programm PIBWin verglichen[6]. Die

Matrix wurde von einer Publikation, die die Entwickler empfehlen, entnommen. Das Programm

ergab zwei verschiedene Bakterienstämme. Der Grund liegt in den vielen Tests die von den

Autoren der Publikation durchgeführt wurden. Das Programm ist hilfreich, wenn die gleichen Tests

wie in der vernommenen Matrix gemacht werden oder genügend Tests für eine durchgeführt

werden.

Identifikation eines unbekannten Enterobakteriums ZHAW 134 8 Literaturverzeichnis

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8 Literaturverzeichnis

[1] Internes Dokument: Unterrichtsskript von Krebs, W. (FS12). Thema 7

[2] Internes Dokument: Unterrichtsskript von Krebs, W. (FS12). Thema 8

[3] Internes Dokument: Gram Negative Rods ID Flowchart

[4] Farmer, J.J. et al. Biochemical Identification of New Species and Biogroups of Enterobacteriaceae Isolated from Clinical Specimens. JOURNAL OF CLINICAL

MICROBIOLOGY, Januar 1985, S. 46-76

[5] Holmes & Costas Soc Appl Bact 1992, 29, 127-149 (Publikation und Data)

[6] Bryant TN. PIBWin - software for probabilistic identification. Journal of Applied

Microbiololgy. 2004;97(6):1326-7. (Programm)

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Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Das unbekannte Enterobakterium fermentiert Pepton. Dabei verfärbt sich der Agar

und der Aufstrich orange. ................................................................................................................ 5  

Abbildung 2: Die roten Kolonien entstanden durch die Lactosefermentation................................... 5  

Abbildung 3: Beide Mikroorganismen sind stäbchenförmig. Links ist die Probe ZHAW 134 und

rechts ist das KS-Isolat nach der Gramfärbung. .............................................................................. 6  

Abbildung 4:H2O2 wird sofort in H2O und O2 gespalten, deshalb ist eine Schaumbildung ersichtlich.

........................................................................................................................................................ 6  

Abbildung 5: Beim O/F-Test von Probe ZHAW 134 ist deutlich der Farbumschlag nach gelb

ersichtlich sowie die Säurebildung (Bläschen). ............................................................................... 7  

Abbildung 6: Probe ZHAW 134; Das Bakterium fermentiert Glucose. Zudem entstand bei der

Schrägseite ein alkalisches Milieu. .................................................................................................. 8  

Abbildung 7: Beim KS-Isolat werden Glucose sowie Lactose und Saccharose fermentiert. ............. 8  

Abbildung 8 : Links der Probe ist keine pinke Verfärbung an der Oberfläche ersichtlich. Hingegen

rechts beim KS-Isolat wird Indol nachgewiesen. .............................................................................. 9  

Abbildung 9: Durch die pinke Verfärbung der Lösung wird die Glucosefermentation nachgewiesen.

Oben ist das KS-Isolat, unten die Probe 134. .................................................................................. 9  

Abbildung 10: Der API MEL-Test ist aufgrund seiner Farbe nicht eindeutig zu identifizieren. ........ 11  

Abbildung 11: Oben ist das visuelle Ergebnis des API der Probe 134 und unten das vom KS-

Isolat. ............................................................................................................................................ 11  

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Anhang

Identifikationsstrategie alt:

Die alte Identifikationsstrategie ist fehlerhaft. Je nach Citrobacter freundii reagieren 50 % positiv

auf den Lactose-Test und die andere Hälfte davon negativ. Von Klebsiella reagieren nur 60 %

positiv auf den Methyl-Test. Deshalb wurde die Strategie noch einmal überarbeitet (siehe Tabelle

3).

Tabelle 2: Alte Vorgehensweise, die jedoch fehlerhaft ist.

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Die Bakterienprobe soll auf den McConkey Agar aufgetragen werden.

Spezielle Eigenschaften der Bakterien die zur Hilfe der Identifikation beitragen:

Citrobacter freundii: Recycelt Nitrat

Pseudomonas aeruginosa: Verstoffwechselt SDS, leuchtet unter UV-Licht und riecht nach

Gummibärchen.

Salomnella enteriditis: Erkennbar auf Bismuth/Sulfit Agar und auf SS-Agar. Es entstehen

farblose, transparente Kolonien mit einem schwarzen Punkt in der Mitte.

Enterobacter cloacae: Nimmt SeO weg.

Proteus mirabilis: Verarbeitet keine Lactose, Tryptophan-Test negativ.

Vibrio fluvialis: Auf TCBS- Agar sind die Bakterien gelb. Der Voges Test fällt dann negativ

aus.

Klebsiella terrigena: Normales Wachstum auf Nähragar bei 4°C. Bei 30°C wird das

Wachstum gehemmt.

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Identifikationsstrategie überarbeitet:

Tabelle 3: Überarbeitete Strategie zur Identifikation.

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API 20E:

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Maldi-TOF:

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