Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs ... 108 GP WiSe05 Mutationen_prints.pdf · Neurospora Mutanten im Ad-3 Gen ... Chromosom transponieren kann. Barbara McClintock,

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Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06

10. Kurstag: Mutation und Supplementation

sämtliche Arten verändern sich ständig durch Mutationen

"stabile" Vererbung gibt es nicht!

unterschiedliche Allele eines Gens entstehen immer durch Mutationen:

jedes Allel ist eine Mutante!

was ist 'normal'?


Klassifizierung von Mutationen

(1) Lage und Ausmaß der DNA-Veränderung:

"unsichtbare" Mutationen:geringfügige Sequenzänderungen in intergenischen Regionen undHeterochromatin

Genmutationen: Veränderung einzelner Gene

Chromosomenmutationen: Veränderungen ganzerChromosomen (strukturelle Chromosomenaberrationen)

Genommutationen: Veränderungen ganzer Chromosomensätze(numerische Chromosomenaberrationen)

Mutationen werden nach unterschiedlichen Kriterien klassifiziert:

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(2) Art der DNA-Veränderung:


Punktmutationen

Insertionen

Deletionen

Inversionen



(2) Auswirkung:


'silent' Mutationen: keine Änderung der Proteinsequenz

'missense' Mutationen: veränderte Proteinsequenz

'nonsense' Mutationen: verkürztes Protein durch Entstehung vonStopcodons

'frameshift' Mutationen: veränderte Proteinsequenz durchLeserastermutation

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spontan

durch chemische Mutagene

durch physikalische Mutagene

durch biologische Mutagene

Entstehung von Mutationen


ohne äußere Einwirkung von Mutagenen

durch Insertion von Transposons

während der Replikation:

Punktmutationen = Fehlpaarung von Basen (Transition, Transversion)

Leserasterverschiebung (Insertion oder Deletion einer oder weniger Basen)

die meisten spontanen Mutationen werden bereits während oderunmittelbar nach der Replikation effizient repariert!

Spontan auftretende Mutationen

spontane Mutationen entstehen

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alkylierende Agenzien (z.B. Nitrosoguanidin, Ethylmethansulfonat)

Basenanaloga (z.B. 5-Bromuracil, 2-Aminopurin)

interkalierende Agenzien (z.B. Acridinorange, polyzyklische Aromaten)

Basen-modifizierende Agenzien (z.B. Aflatoxin, Nitrit, Hydroxylamin)

Chemische Mutagene

einige der bekanntesten chemische Mutagene:


UV-Strahlung

Röntgenstrahlung

ionisierende Strahlung (α-, β- und γ-Strahlung)

Physikalische Mutagene

die wichtigsten physikalischen Mutagene:

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Biologische Mutagene

Transposons (endogen)

DNA-Reparaturmechanismen (endogen)

alle integrierenden Viren (exogen; z.B. alle Retroviren)


Neurospora Mutanten im Ad-3 Gen (ad-3–) bilden rote Kolonien, die von denweißen ad-3+ Wildtypkolonien leicht unterscheidbar sind

EMS

MMSRöntgenstrahlung

UV-Strahlung

polycyclische aromatische Acridine

Frequenz spontaner und induzierter Mutationen in Neurospora

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Basen-Exzisionsreparatur:

(1) DNA-Glycosylasen schneiden die N-glykosidische Bindung zwischen Base undZucker und erzeugen so Apurin- oderApyrimidin-Stellen (AP-Stellen)

Schädigung vonBasen

Zelluläre Mechanismen zur Reparatur von Mutationen


(2) AP-Endonucleasen erkennen AP-Stellen und erzeugen einenStrangbruch

(3) ausgehend von dem Strangbruchbauen Exonucleasen die DNA inbeide Richtungen ab

(4) Polymerasensynthetisieren neue DNA

(5) Ligase verschließt denStrangbruch

Zelluläre Mechanismen zur Reparatur von Mutationen

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Biologische Mutagene: Mismatch-Reparatur

während der Replikation (oder durch andere Vorgänge) entstandene Fehlpaarungenwerden durch das Mismatch Reparatur System eliminiert

C

Wildtyp Mutante

aber während der Reparatur können auch Mutationen fixiert werden!


Physikalische Mutagene: UV-Strahlung

Versuch 17: UV-Mutagenese eines Antibiotika-Resistenzgens

Lernziel: die Beziehung zwischen Dosis und Wirkung von Mutagenen

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Physikalische Mutagene: UV-Strahlung

UV-Strahlung stimuliert die Bildung von verschiedenen Photoprodukten,z.B. Cyclobutanringen zwischen benachbarten Pyrimidinen (meist Thyminen)

bei der Replikation von Pyrimidindimeren entstehen unterschiedliche Mutationen

Thymindimer


z.B. Photolyasen zur Reversion von UV-induzierten Pyrimidindimeren:

Photolyasen wurden in Bakterien und niederen Eukaryonten, aber nicht inSäugern gefunden

Zelluläre Mechanismen zur Reparatur von UV-Mutationen

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Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06Chromosomenmutationen: Änderung der Chromosomenzahl

Zählen Sie die Kolonien auf den Platten

Sammeln Sie an der Tafel die Werte aller Gruppen, berechnen Siedie Mittelwerte und die Standardabweichung

Tragen sie den Logarithmus der gemittelten Zahl der Koloniengegen die Bestrahlungsenergie auf

Bestimmen Sie k

Aufgaben zum UV-Mutageneseversuch

[Der Versuchsteil zur Bestimmung der Mutationsfrequenz im LacZ alpha-Gen entfällt, weil dieUnterscheidung von blauen und weissen Kolonien nicht eindeutig war.]


Supplementation

Versuch 18: Supplementation bei Matthiola incana

Lernziel: die Fähigkeit zur Interpretation von mutanten Phänotypen inkomplexen biochemischen Reaktionsketten

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Interaktion zwischen Genen

Komplementation

Supplementation (Kompensation)

Polygenie

Pleiotropie

Epistasie


Komplementation

Komplementation: funktionelleErgänzung von zwei Genen(cis-trans-Test)

Mutationen sind: im gleichen Gen in verschiedenen Genen

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Supplementation

Supplementation:Kompensation einerMutation durchZugabe einesZwischenproduktes

Enzym 1 Enzym 2

Substrat ZP 1 ZP 2 Endprodukt

ZP 1

externe Zugabe von ZP1:


Polygenie

Polygenie: an der Ausprägung eines Merkmals sind mehrere Gene beteiligt

Ausbildung von Blütenfarbstoffen (z.B. Anthocyane)heterooligomere Proteine (z.B. Hämoglobin: α-Globin auf Chr. 16, β-Globin auf Chr. 11)....

a) komplementäre Polygenie:

Merkmalsausprägung erfolgt erst beim Zusammenwirken aller beteiligten Gene(z.B. heterooligomere Proteine, mehrstufige Biosynthesewege) - "Serienschaltung"

b) additive Polygenie = quantitative Variation/Vererbung:

bei der Merkmalsausprägung leisten viele Gene kleine additive Beiträge(meist komplexe Merkmale wie Wuchshöhe, Ertrag) - "Parallelschaltung"

Substrat ZP 1 ZP 2 ZP 3 EndproduktA B C D

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Polygenie


additive Polygenie = quantitative Variation/Vererbung:

Beispiel: F2-Spaltung der Kornfarbe von Weizen bei zwei beteiligten Polygenen

die dominanten Allele beider Gene tragen zur Pigmentierung bei


Polygenie


Beispiel: F2-Spaltung bei drei beteiligten Polygenen

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Polygenie

Schema zurEntstehung vonquantitativer Variation

(a) bei zunehmender Zahlder an derMerkmalsausprägungbeteiligten Gene

(b) bei unterschiedlichstarkem Umwelteinflussauf dieMerkmalsausprägung

kein Umwelteinfluss

2 Gene

5 Gene

10 Gene

kein Umwelteinfluss

2 Gene

leichter Umwelteinfluss

starker Umwelteinfluss


Pleiotropie (Polyphänie)

Pleiotropie: ein Gen ist an der Ausprägung mehrerer Merkmale beteiligt

Gene, die an verzweigten Syntheseketten beteiligt sind

Bsp.: Gene E und G von Matthiola incana haben eine pleiotrope Wirkung:der Ausfall eines der beiden Gene wirkt sichauf Blütenfarbe und Blattbehaarung aus

Substrat ZP 1 ZP 2 ZP 3 Endprodukt 3A B

Endprodukt 1 Endprodukt 2

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Epistasie

Epistasie:

die Wirkung eines Genshängt von einem anderenGen ab

oder:

ein mutantes Allel einesGens "maskiert" oderüberdeckt die Wirkung einesanderen Gens

oder:

Wechselwirkung zwischenzwei Genen: diegemeinsame Wirkung weichtvon der Summe derEinzelwirkungen ab


Der Anthocyan - Biosyntheseweg

die weissblühenden Matthiola Pflanzen sind Mutanten der CHS, DFR oder FGT Enzyme

F

E

GF

EG

Dihydroquercetin

Bz1(Mais)

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Anhand der Fähigkeit der weissen Pflanzen zur Weiterverarbeitungvon Dihydroquercetin sollen Sie den Genotyp bestimmen, d.h.feststellen welches der drei in Frage kommenden Gene mutiert ist.

Aufgabe zum Supplementationsversuch


Transposons

Versuch 19: Transposonmutagenese in Mais

Lernziel: das Verständnis der von Transposons verursachten variegiertenPhänotypen

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Entdeckung der Transposons

1914: Rollins Emerson und Marcus Rhoades finden inMais "instabile Mutationen" (variegierte Körner)

1945: Barbara McClintock beschreibt den genetischenLocus Dissociation (Ds) als eine Stelle aufeinem der 10 Maischromosomen, an der sehrhäufig Chromosomenbrüche auftreten. BeiKreuzungen bemerkt sie, daß dieser Locusseine Position verändern und auf ein anderesChromosom transponieren kann.

Barbara McClintock, 1984

1948: McClintock beschreibt den genetischen LocusActivator (Ac), der die Aktivität von Dskontrolliert und auch selbst transponieren kann.

1970: Entdeckung der Transposons in Bakterien

1980: Klonierung des Ac Transposons

1983: Verleihung des Nobelpreises an McClintock

1986: Transfer von Ac in eine andere Pflanze (Tabak)


TE-history 1

Wie erkennt man Chromosomenbrüche?

wxc sh bz

WxC Sh Bz Ds

wxc sh bz

Wx

C Sh BzD s

Chromosomenbrüchein einigen Zellen

azentrischesChromosomenfragment

Zellteilung

wxc sh bz

s

farbig

farblos

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TE-Klassen

Transposons sind ubiquitär verbreitet

Retroelemente ("Klasse I - Transposons"):transponieren über ein RNA-Intermediatsind nur in Eukaryonten bekannt

Retroviren (Säuger)Retrotransposons (Vertebraten, Pilze, Pflanzen)Retrogene (Vertebraten, Pflanzen)

DNA-Elemente ("Klasse II - Transposons"):transponieren durch DNA-Exzision und -Reintegrationgibt es in allen Eubakterien, Archae und Eukaryonten

temperente BakteriophagenIS Elemente (Bakterien)Tn Transposons (Bakterien)Transponierbare Elemente (Vertebraten, Pilze, Pflanzen)


TE in Bacteria

IS-Elemente und Transposons in Bakterien

Transposons (Tn) in Bakterien wurden als mobile genetische Elementeentdeckt, die Antibiotika-Resistenz von Krankheitserregern verursachen.

Insertion Sequences (IS)

Transposons

TPase

0.7 kb - 2 kb

TPase R-Gen

2.5 kb - 20 kb

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Struktur des Mais Transposons Activator (Ac)

Ac

AAAmRNA

TPaseTPaseProtein

TPaseBindestellen

TTTCATCCCTAAAAGTAGGGAT

CAGGGATGAAAGTCCCTACTTTTIRs


Modell des Ac Transpososoms

Die Ac Transposase bindet an dieTerminalen Inverted Repeats und ansubterminale SequenzmotiveDie Ac Transposase agiert alsMultimerProtein-Interaktionen der AcTransposase bewirken die 'Synapsis'der Transposonenden

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Transposons sind Biologische Mutagene

Transposons verursachen Mutationen mit "instabilen" Phänotypen:durch Exzision finden häufige Reversionen statt


Ac/Ds Elemente transponieren in Pflanzen und in Hefe

HefeSaccharomyces cerevisiae

PappelPopulusSalatLactuca sativaFlachsLinum usitatissimum

Lotus japanicusSojaGlycine max

Arabidopsis thalianaPetersiliePetroselinum crispumMöhreDaucus carota

Datura innoxiaPetuniePetunia hybridaKartoffelSolanum tuberosumTomateLycopersicon esculentum

Nicotiana plumbaginifoliaTabakNicotiana tabacumGersteHordeum vulgareWeizenTriticum aestivumReisOryza sativa

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Das Maiskorn: ein ideales Objekt für genetische Analysen

Das Maiskornbesteht aus genetisch verschiedenen Organenbzw. Geweben:

Perikarp

Endosperm

Aleuron

Embryo

diploid (MM); maternales Gewebe

triploid (MMP); doppelte Befruchtung!

triploid (MMP); äußerste Endospermschicht

diploid (MP); Nachkommengeneration


Doppelte Befruchtung bei Pflanzen

Perikarp(2n - maternal)

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Schleifen Sie die Körner an und untersuchen Sie, ob sich die aufder Oberfläche sichtbaren Variegationsmuster in das Innere desEndosperms fortsetzen.

Analysieren Sie die Stärkezusammensetzung im Inneren derKörner durch Anfeilen und Färbung mit Iod-Iodkaliumlösung.Fotografieren Sie die Körner für das Protokoll.

Leiten Sie aus den Phänotypen ab, in welchen Geweben die Waxy,P und Bz Gene exprimiert werden.

Schließen Sie aus den Reversionsmustern auf denEntwicklungszeitraum in dem die Transposons aktiv waren.

Aufgaben zu den Transposon-Mutanten

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