Lebensmittel- und Umweltanalytik mit der Spektrometrie || UV-VIS-Spektrometrie

3 UVVIS-Spektrometrie Heinz- Dieter Win keler

3.1 Einfiihrung [3-1 bis 3-20]

Die Eigenschaft von Ionen und Molekulen, in Liisung elektromagnetische Strahlung im sichtbaren (VIS) und ultravioletten (UV) Spektralbereich zu absorbieren, ist die Grundlage einer Reihe wichtiger qualitativer und quantitativer, analytischer Metho- den im Bereich der Umwelt- und Lebensmittelanalytik. Allgemein kann gesagt werden, daD die Absorption eine Energieaufnahme darstellt, die Molekule oder Ionen von einem Grundzustand in einen angeregten Zustand uberfiihrt , wobei die absor- bierte Wellenlange ein MaB fur die Energiedifferenz zwischen den entsprechenden Zustanden ist. Die UVNIS-Spektrometrie ist daher eine Absorptionsspektrometrie- art, bei der die Schwachung der einfallenden elektromagnetischen Strahlen bestimmt wird.

Die Energie der Strahlung ist mit der Wellenlange durch die Beziehung

E = h * v (3.1)

verknupft. Hierbei ist E die Energie eines entsprechenden Photons, h die Planksche Konstante (6.625 - J - s) und n die Frequenz mit der Einheit s-’ oder Hertz. Die Frequenz steht wiederum mit der Wellenlange 1 (in nm) in folgendem Zusammenhang

c v = - A

Hierbei steht c fur die Lichtgeschwindigkeit (2.9979 x 10’ d s ) . Eingesetzt in die Glei- chung (3.1) ergibt sich

hc A

E = - (3.3)

Gleichung (3.1) zeigt, daB die elektromagnetische Strahlungsenergie umgekehrt proportional zur Wellenlange ist, woraus folgt, dal3 rnit Verringerung der Wellenlange die Energie der Photonen zunimmt.

Die Dimension fur die Wellenlange ist nach dem SI-System das Meter. Da die zum UVNIS-Bereich korrespondierende Wellenlange 1 der elektromagnetischen Strahlung 1,8 * lo-’ bis 8 . lo-’ m entspricht, ist es allgemein ublich, die Angabe in Nanometer (nm; 1 Nanometer = lo4 m) anzugeben. Im Gegensatz hierzu, wird bei der IR-Spek- trometrie vorwiegend mit der Wellenzahl gearbeitet, bei der als Dimension cm-’ gebrauchlich ist.

Lebensmittel-und Umweltanalytik mit der Spektrometrie Herausgegeben von Lothar Matte1

CoDvriaht Q 1995 VCH Verlaasaescllscliaft mbk

112 3 UV-VIS-Spektrometrie

Tab. 3-1: Einteilung der ultravioletten und sichtbaren Spektralregionen.

Wellenlange Spektralbereich Farbe

< 175 175-200 200-400 400-435 435-480 480-490 490-500 500-560 560-595 595-610 610-750

Vakuum-UV N2-UV uv VIS VIS VIS VIS VIS VIS VIS VIS

- violett blau blaugriin griin gelbgriin gelb orange rot

(3.4) 1 Wellenzahl (cm-') Y = - A

Die GroBe der Strahlungsenergie nach Gleichung (3.3), die dazu benotigt wird, ein Atom, Molekul oder Ion in einen angeregten Zustand zu uberfuhren, bestimmt somit die Lage des Spektrums im Bereich der elektromagnetischen Strahlung. Fur die Adsorptionsspektrometrie im USNIS-Bereich laBt sich dieser durch die in Tab. 3-1 zusammengestellten Angaben charakterisieren.

3.1.1 Die Wechselwirkung elektromagnetischer Strahlung mit organischen Molekiilen

Die Absorption elektromagnetischer Strahlung von organischen Verbindungen im US/ VIS-Spektralbereich ist von Elektronenubergangen zwischen verschiedenen Energie- zustanden begleitet. Diese Ubergange erfolgen im allgemeinen von einem bindenden in ein antibindendes Molekulorbital, wobei sich die Elektronenubergange mit Hilfe der beteiligten, aus der organischen Chemie bekannten,Molekiilorbitale klassifizieren lassen. Das besetzte bindende Molekulorbital einer C-C- oder C-H-Einfachbindung wird beispielsweise als sigma-(a)-Orbital und der Elektronenubergang von dem bindenden in den antibindenden Zustand als a + u* (a* (Sigma-Stern) = Symbol fur ein antibindendes a-Orbital) bezeichnet.

Weitere Molekulorbitale, die fur das Verstandnis von Absorptionseigenschaft von Molekulen im USNIS-Bereich eine Bedeutung haben, sind die Pi (n)- und die n-Orbi- tale. So ist die chemische Bindung zwischen doppeltgebundenen Kohlenstoffatomen durch ein a-Orbital und ein n-Orbital und die Dreifachbindung durch ein a-Orbital und zwei n-Orbitale reprasentiert. Die n-Orbitale hingegen sind Orbitale, die nicht zu einer Bindung beitragen. Sie sind mit zwei Elektronen besetzt, die als einsames Elek- tronenpaar bezeichnet werden und beispielsweise in Halogenen, Stickstoff und Sauer- stoff auftreten.

3.1 Einfiihrung 113

Wie aus dem a-Orbital, konnen aus Symmetriegrunden gemaB der ,,Auswahlregel" auch aus besetzten bindenden n-Orbitalen Elektronen in n*-Orbitale angehoben werden. AuBerdem sind noch Ubergange nichtbindender n-Orbitalelektronen in leere antibindende a*- oder n*-Orbitale bekannt.

Aus den moglichen Elektronenubergangen, die mit der Absorption von USNIS- Strahlung einhergehen, sind demgemaB folgende zu nennen a + a*, n + n*, n + n*, n + a*.

Neben diesen Elektronenubergangen, deren Nomenklatur auf einem vereinfachten MO-Model1 basiert, gibt es noch weitere bzw. differenziertere Systeme zur Kennzeich- nung von Elektronenzustanden und -ubergangen, wobei hier jedoch auf weiterfiihrende Literatur verwiesen wird.

Die GroBe der Strahlungsenergie, die bei einem Elektroneniibergang absorbiert wird, hangt, wie aus Abb. 3-1 zu ersehen ist, von der Natur des Elektronenuberganges ab. So erfordern a + a*-Uberginge die meiste Energie und liegen in einem Bereich von kleiner 150 nm. Eine Moglichkeit, diese Ubergange zu beobachten, stellt die Vakuum- Ultraviolett-Spektrometrie dar. Letztere ist jedoch schwierig zu handhaben und findet daher in der Praxis der UV-Spektroskopie vergleichsweise wenig Anwendung.

Wie der Abb. 3-1 zu entnehmen ist, benotigen die im vorangegangenen Abschnitt genannten Elektronenubergange weniger Energie als die a + a*-Ubergange. Typi- sche n + a*-Ubergange, die normalerweise bei organischen Molekiilen mit Hetero- atomen (Cl, Br, I, F, S, 0 und N) auftreten, erfolgen in einem Bereich zwischen 150 und 260 nm, d. h. deutlich langwelliger, so daB ein groBer Anteil dieser Ubergiinge bereits mit einem Routine-UV-Spektrometer verfolgt werden kann. Als Beispiel kann hier das Methyljodid herangezogen werden, das eine Absorption bei 258 nm aufweist.

Da die meisten einschlagigen UV-Spektrometer uber einen MeBbereich von 175 bis lo00 nm verfiigen, spielen fur die analytische Anwendung der UV-Spektroskopie organische Molekule, in denen n + n*- und n + n*-Ubergange auftreten, die groBte Rolle, da diese im nahen UV bis zum visuellen Spektralbereich (180 bis 700 nm) stattfinden.

Molekulorbitaltyp

(3*

Q, AE X*

.- C

n

7c

(3

Abb.51: Molekiilorbitale und Elektroneniiberglnge.


Linienspektrum

Bandenspektrum

Abb.+2: Linien- und Bandenspektrum.

In diesem Zusammenhang ist es wichtig anzusprechen, daB die Absorptionsfahig- keit eines Molekuls von elektromagnetischer Strahlung von der Natur des Elektronen- uberganges abhangig ist. Ein Ma13 hierfiir ist der molare Extinktionskoeffizient ( E )

(siehe auch Abschnitt 3.2.1) mit der Dimension L x mol-' X cm-'. Je intensiver ein Molekul in Abhangigkeit von der Wellenlange elektromagnetische

Strahlung absorbiert, um so hoher ist sein Extinktionskoeffizient. Vergleicht man x + x*- und n + x*-Ubergange, so liegen die Extinktionskoeffizienten p + p* in einem Bereich von E = 10000 bis 100 000 und fur n +x*-Ubergange zwischen 100 und 10000 dm' x mol-' x cm-'.

Neben den Elektronenzustanden konnen Molekule auch in den unterschiedlichsten Schwingungs- und Rotationszustanden vorkommen, aus denen Elektronen in einen angeregten Zustand uberfuhrt werden konnen. Demnach setzt sich der Energiezu- stand eines Molekuls wie folgt zusammen:

EGesarnt = EElektronenzustande + ESchwingungszustand + ERotationszusland -k Esonst

Aufgrund der groBen Anzahl moglicher Kombinationen dieser drei Energiezustande eines Molekuls, sowohl im Grund- als auch im angeregten Zustand und der Tatsache, da13 diese Energiezustande sehr dicht beieinander liegen, sind die Elektronenuber- gange im Normalfall durch UV-Spektrometer nicht aufzulosen. Tragt man die Absorp- tion eines Molekuls gegen die Wellenlange auf, so erhalt man kein, wie in der Atomab- sorptionsspektroskopie ubliches Linienspektrum, sondern ein sogenanntes Banden- spektrum (Abb. 3-2).

3.1.2 Definitionen

Wie bereits in den vorangegangenen Abschnitten beschrieben, hlngt die Lage einer Absorptionsbande im allgemeinen von der Natur des betreffenden Elektronenuber- ganges ab. Der Bereich eines Molekuls, in dem Elektronenubergange stattfinden, d. h. der Teil einer Atomgruppe, der Strahlungen absorbieren kann, wird als Chromo-

3.1 Einfiihrung 115

Tab. 3-2: Absorptionen isolierter chromophorer Gruppen (energiearmste Elektronenubergange).

Chromophor abergang Beispiel 'maxa (nm) Emaxa

C-H o+o* CH4 122 intensiv

C-c o+o* H3C-CH3 130 intensiv

-0- n+o* Hz0 167 1500 n+o* H3C-OH 183 200 n A o * G H a H 5 189 2000

-S- n+o* H3CSH 235 180 n+o* HjCS-CHj 228 620 n+a* GHrS-S-GHj 250 380

-N- n+o* NHs 194 5700 I n+o* CzHrNHz 210 800

n+o* GHrNH-GH5 193 3000 n+o* (GH5)3N 213 6Ooo

-HAL n+o* HsC-CI n+a* H3C-Br n+o* H3C-I n+o* CHI3

173 204 258 349

200 260 380

2170

n+n* HzC=CHz 165 16000 n+n* CZHAH = CH-CZHS 185 7940

n+n* HC=CH 173 6OOo n+n* H-C C-CZH5 172 2500

n+n* H3C=CH2 293 12 n+n* 0 187 950

\ I 7="\

7="

-CEC-

\ I1

H3C - C - CH3

II H3C - C- CH3

n+n* 0 273 14

\ S II

n+ n* H3C - C - CH3 460 schwach

n+n* HjC-CH=N-OH 190 8000 n+n* H~C-CHZN-OH 219 15

n+n* 353 240

\ 7="- -N=N-

343 25

N=N 300 100 \ 665 20 CH3

(H3C),C-NO (H&),C-NO

-NO2 n+n* HsC-NO2 210 loo00 n+n* 278 10

116 3 UV-VIS-Spektrornetrie

phor (chroma, gr. : Farbe, phor von pherein, gr. : tragen) bezeichnet. Der Tab. 3-2 konnen die ungefahre Lage und Intensitaten einiger wichtiger, isolierter Chromophore entnommen werden.

Besitzt eine chemische Verbindung mehrere isolierte Chromophore, so setzt sich das korrespondierende USNIS-Spektrum aus diesen Chromophoren zusammen.

Von besonderer Bedeutung fur die angewandte USNIS-Spektrometrie sind Verbin- dungen mit konjugierten Chromophoren. Letztere konnen im Vergleich zu den isolierten Chromophoren die absorbtiven Eigenschaften verstarken, was als hyperchromer Effekt bezeichnet wird. Erfolgt daruber hinaus eine langerwellige Verschiebung der Absorptionsbande (Rotverschiebung), so bezeichnet man dies als bathochromen Effekt oder bathochrome Verschiebung. Die Umkehrungen werden hypsochromer (Abschwachung der Bandenintensitat) und hypochromer Effekt (Verschiebung zu kur- zeren Wellenlangen; Blauverschiebung) genannt .

Weiterhin kennt man in diesem Zusammenhang noch die sogenannten auxochro- men Gruppen. Dieses sind Substituenten an Chromophoren, die eine bathochrome Verschiebung undloder hypochromen Effekt bewirken. Zu den wichtigsten Auxochro- men gehoren vor allem funktionelle Gruppen mit einsamen Elektronenpaaren wie NR2, NOz, -OR, -S03H, -Halogen etc. Als explizites Beispiel kann hier die bathochrome Verschiebung einer Absorptionsbande von 190 nm nach rd. 230 nm angefuhrt werden, die in einer isolierten Doppelbindung durch Konjugation mit dem freien Elektronenpaar eines Stickstoffatoms in einem Enamin stattfindet.

3.2 Qualitative USNIS-Spektrometrie [3-21 bis 3-27]

In dem vorangegangenen Abschnitt wurde auf die Theorie zur Natur der Elektronen- ubergange in chemischen Verbindungen und den hieraus resultierenden spektroskopischen Eigenschaften im USNIS-Bereich nur allgemein eingegangen. Es ist jedoch wichtig darauf hinzuweisen, daS das Wissen um die Absorptionseigenschaften einfa- cher Chromophore, sowie der EinfluS von Strukturanderungen (z. B. Substitutionsef- fekte) auf die Absorptionseigenschaften von Molekulen fur den organischen Analyti- ker - u. a. im Rahmen der analytischen Methodenentwicklung - ein wichtiges Werk- zeug darstellt. So ist es nutzlich, bereits im Vorfeld abschatzen zu konnen, ob die Sub- stanz oder Substanzgruppe, die untersucht werden soll, im Spektralbereich aktiv ist, der von Routine-Spektrometern bzw. Detektoren abgedeckt wird (200 bis 1000 nm) und hier eine ausreichend intensive Absorptionsbande besitzt bzw. besitzen. Hieraus resultiert wiederum, ob die USNIS-Spektrometrie z. B. als Detektionsmoglichkeit fur eine analytische Methode geeignet sein konnte.

Bei dem Wunsch auf Vertiefung dieser Kenntnisse wird in diesem Zusammenhang auf die weiterfiihrende Literatur verwiesen.

3.2 Qualitative USNIS-Spektrometrie 117

28

3.2.1 USNIS-Spektren

lsoproturon

Neben den Grundkenntnissen zur Wechselwirkung zwischen Materie und Strahlung mu13 der Praktiker in der Lage sein, USNIS-Absorptionsspektren als Werkzeug zu gebrauchen.

Die Messung eines USNIS-Absorptionsspektrums wird gewohnlich in einer verdiinnten Losung aufgenommen, wobei das Losungsmittel so gewahlt wird, daB moglichst wenig Interferenzen mit der zu vermessenden Substanz auftreten. Hierbei kann sich die Substanz in einer Quarzkiivette, einer DurchfluBkiivette oder in der MeBzelle eines HPLC-Systems befinden.

Die Aufnahme des Spektrums erfolgt so, daB die Extinktion in Abhangigkeit von der Wellenlange aufgenommen wird. Die graphische Darstellung erfolgt in einem Koordinatensystem, wobei im Normalfall die Wellenlange A in Nanometern (nm) der x-Achse entspricht und die Extinktion (engl. : absorbence (A. U. oder Abs.)) als AbsorptionsmaB gegen die y-Achse aufgetragen wird.

In Abb. 3-3 wird das UV-Spektrum des Pflanzenschutzmittels Isoproturon wiedergegeben. Wie der Abbildung zu entnehmen ist, besitzt Isoproturon zwei intensive Absorptionsbanden, wobei die maximale Absorption bei 203 nm und bei 242 nm detektiert wurde. Das Maximum in einem USNIS-Spektrum nennt man Absorptions- maximum mit dem Symbol A,,,. Das zwischen den beiden Peakmaxima vorhandene Absorptionstal wird als Amin oder mit der englischen Terminologie Valley (engl. : valley = Tal) bezeichnet.

Die Informationen, die dem Spektrum zu entnehmen sind, konnen etwa zum Auf- bau einer analytischen Methode zum Nachweis des Isoproturons mit der Hochlei- stungs-Fliissigkeitschromatographie (HPLC) und UV-Detektion dienen.

- ... - __ _____

Abb. 3-3: Spektrum Isoproturon.


Dem UV-Spektrum entsprechend konnte fur die Detektion des Isoproturons eine Detektionswellenlange im A,,, bei 203 nm gewahlt werden, da hier die Absorptions- bande mit der groflten Intensitat im vermessenen Spektralbereich vorliegt. In der Pra- xis wurde jedoch nur ungern eine Detektionswellenlange von um 200 nm gewahlt werden, da in diesem Bereich viele organische Substanzen u. a. auch einige in der Flussig- keitschromatographie benutzte Elutionsmittel eine nachweisbare UV-Aktivitat besit- Zen. Dieser Sachverhalt bedeutet, daB man in diesem spektralen Bereich mit einem vergleichsweise hohen Grundrauschen und in Abhangigkeit von der zu untersuchenden Matrix, haufig mit Interferenzen (z. B. hohe Blindwerte) rechnen mu13, was sich vor allem bei der organischen Spurenanalytik nachteilig auswirkt. Folglich versucht man immer, die Detektionswellenlange auf das langwelligste Absorptionsmaximum rnit ausreichender Intensitat einzustellen. Am expliziten Beispiel des Isoproturons ware dies eine Detektionswellenlange von 242 nm.

Mittels Diodenarray-Technik ist es derweil moglich, ein gesamtes USNIS-Spek- trum in weniger als 0.1 Sekunde zu vermessen und graphisch darzustellen, was es ermoglicht, chromatographische Trennungen, beispielsweise mit der HPLC, spektren- mal3ig zu verfolgen. Hierdurch gewinnen im Rahmen der Auswertung von Analysen- verfahren - neben den Absorptionsmaxima (A,,,) - auch Valleys (A,,,) sowie die Wen- depunkte von Adsorptionsbanden, speziell fur Identitatsvergleiche und Reinheitskri- terien von organischen Substanzen an Bedeutung.

Der Computer ist mittlenveile allgemeines Hilfsmittel bei der Steuerung von Spektro- metern und der Bearbeitung von Meadaten. Viele Softwareversionen machen es moglich, neben der Aufnahme von Spektren auch die Ableitungen der Extinktion nach der Wellenlange zu erstellen. In Abb. 3-4 ist die 1. Ableitung der Extinktion nach der Wellen- Iange (dAldA) von Isoproturon dargestellt. Diese Darstellung wird als Derivativ-Spek- trum bezeichnet und findet als analytisches Hilfsmittel mehr und mehr Anwendung.

nm->200 220 240 260 280 300 320 340

Abb. 3-4: Derivativ-Spektrum von Isoproturon.

3.3 Quantitative UV-Spektroskopie (Photometrie) 119

Aus der Mathematik der Kurven ergeben sich folgende Zusammenhange. Ein Maximum oder ein Minimum wird in der 1. Ableitung zum Nulldurchgang. Ein Wen- depunkt wird zu einem Maximum oder Minimum und in der 2. Ableitung zum Null- durchgang .

Mittels der Derivativ-Spektroskopie lassen sich einige analytische Fragestellungen, u. a. in der Spurenanalytik, besser bearbeiten, da kleine Veranderungen an einem Spektrum besser beobachtet werden kiinnen.

3.3 Quantitative UV-Spektroskopie (Photometrie)

3.3.1 Bouguer-Lambertsches Absorptionsgesetz

Neben den qualitativen Zusammenhangen fur die Wechselwirkung zwischen Strahlung und Materie kann man auch quantitative Aussagen (Photometrie) tatigen. Gesetzma- Bigkeiten zur Photometrie wurden bereits im 18. Jahrhundert experimentell von Bou- guer und Lambert beschrieben. Sie fanden, daB die einfallende Lichtintensitat (Z) in einer homogenen Usung exponentiell abnimmt, und zwar in Abhangigkeit von der Weglange bzw. Schichtdicke, die der Lichtstrahl zurucklegt. Folgende GesetzmaBig- keit konnte abgeleitet werden:

A = log Zo/Z = -log Z/Zo = log 1/T = kid (3.5) Hierbei ist A die dekadische Extinktion, die manchmal noch als ,,optkche Dichte" und im Englischen als ,,absorbence" bezeichnet wird. Zo wird als einfallende Strahlungsin- tensitat (engl. : incident intensity) und Z als austretende Strahlungsintensitat (engl. : transmitted intensity) bezeichnet. Tist die Transmission (engl. : transmittance), k' eine Konstante fur das chemische System und d die Schichtdicke des Volumenelementes, die der Lichtstrahl durchlauft.

Die kontinuierliche Abnahme der Strahlungsintensitat beim Passieren einer Losung ist in Abb. 3-5 illustriert. Entspricht die Abnahme der Durchlassigkeit einer exponen- tiellen Funktion ( I = lo. I$'d), so sinkt die Intensitat der eintretenden Strahlung nach 1 cm Schichtdicke auf 50 % (M) der Ausgangsintensitat Zo, nach 2 cm auf 25 % (%) und nach 3 cm auf 12.5 % (%) Zo. Die Abb. 3-5 zeigt auch die hierzu aquivalente lineare Funktion, wenn die Extinktion (A = log Zo/Z) gegen die Schichtdicke aufgetragen wird.

3.3.2 Beersches Gesetz

Die Zusammenhange zwischen Konzentration einer absorbierenden Substanz, die in einer verdunnten Losung vorliegt, und der Durchlassigkeit von Strahlungsenergie wurden von Beer (1852) entdeckt. Das Beersche Gesetz wird durch Gleichung (3.6) aus- gedriickt.

A = log 1/T= k2c (3.6)


0.9 -I

9 0.6-

.- z C X W 0.3-

.- -

0.0 -

Ocm ~ c m 2 c m

iix I,,

m

A3=0.903

Abb. 3-5: Exponentielle Abnahme der Strahlungsintensitat in Abhangigkeit von der Schicht- dicke und die lineare Zunahrne der Absorption in Abhangigkeit von der Schichtdicke.

und sagt aus, darj die reziproke Exponentialfunktion der Transmission eine lineare Funktion der Extinktion ist. k2 ist hierbei eine stoffspezifische Konstante des chemischen Systems und C die Konzentration der absorbierenden Substanz.

Die Abb. 3-6 versucht diesen Sachverhalt darzustellen. Sinkt die Durchlassigkeit Zo einer 0.1 molaren Losung des Stoffes X und einer Schichtdicke von 1 cm um 50 % auf einen Transmissionswert von 0.5, so wiirde der Transmissionswert bei Verdopplung der Konzentration auf 0.2 Mol auf einen Wert von T = 0.25 (25 % der eintretenden Strah- lungsintensitat) und bei 0.3 Mol auf T = 0.125 (12.5 %) abfallen. Ein Transmissions- wert von 0.125 wiirde ebenfalls erreicht werden, wenn die Schichtdicke um den Fak- tor 3, d. h. auf 3 cm vergrol3ert wurde. Dieser Sachverhalt zeigt bereits die Zusam- menhange zwischen Konzentration und Schichtdicke auf, die zur Kombination der besprochenen Absorptionsgesetze fiihrten.

3.3.3 Bouguer-Lambert-Beersches Gesetz

Werden in einer zu untersuchenden Liisung sowohl die Schichtdicke als auch die Kon- zentration verandert, so IaBt sich dies durch die Kombination des Bouguer-Lambert- schen mit dem Beerschen Gesetz beschreiben.


~ ~ ~~

Abb. 3-6: Exponentielle Abnahme der Strahlungsintensitat in Abhangigkeit von der Konzentra- tion.

A = kl * k2 * c * d (3.7)

Die Proportionalitatsfaktoren k , - k2 werden zu dem neuen stoffspezifischen Faktor

A = E * c * ~ (3.8)

A = & =

c = d =

Extinktion (dimensionslos) molarer Extinktions- oder Absorptions-Koeffizient (I * mol-' - cm-') (engl. : molar absorbtivity) molare Konzentration (mol . I-') Schichtdicke (cm)

Gibt man die Konzentration c' in g . L-' an, erhalt der Extinktionskoeffizient (engl. : absorbtivity) den Buchstaben a und die Dimension L - g-' - cm-' und wird zu:

A = a * c' * d (3.9)

Der Extinktionskoeffizient ist abhangig von der Wellenlange, wobei der numerische Wert mit der Intensitat des entsprechenden Elektronenuberganges des absorbierenden Teilchens korreliert .

Je intensiver ein Elektronenubergang, um so hoher der Extinktionskoeffizient bei der entsprechenden Wellenlange. Tragt man die Extinktion gegen die Wellenlange I auf, so erhalt man das korrelierende Absorptionsspektrum.

Man kann somit sagen, daB jede Substanz bei jeder Wellenlange einen unterschied- lichen Extinktionskoeffizienten besitzt. Im allgemeinen gibt man jedoch zur Charakte-


risierung einer Substanz nur die Werte der Extinktionskoeffizienten in den Absorp- tionsmaxima an und bezeichnet diese fur ein A,,,= mit Die numerischen E-Werte liegen fur hohe Absorptionsintensitaten bei lo5. Werte von lo4 bis lo3 entsprechen mitt- leren Intensitaten, darunter spricht man von schwachen Banden.

Aus der Extinktion A ergibt sich nach Gleichung (3.10) der molare Extinktionsko- effizient :

A Emax = - c * d

(3.10)

mit einer Dimension von L mol-' . cm-' fur E. Analog hierzu oder durch Umrech- nung laBt sich a (L - g-' cm-') berechnen.

1st der Extinktionskoeffizient einer Substanz bekannt, so kann - gemaR des Bou- guer-Lambert-Beerschen Gesetzes - anhand der gemessenen Extinktion A die Kon- zentration in der Losung nach Gleichung (3.11) bestimmt werden.

(3.11)

Gleichung (3.11) ist die Basis des Bouguer-Lambert-Beerschen Gesetzes fur die meisten Applikationen im Bereich der quantitativen, spektroskopischen Analyse.

3.3.4 Bestimmung des Extinktionskoef'fizienten

Die korrekte Bestimmung des Extinktionskoeffizienten ist relativ aufwendig. So mu13 sichergestellt sein, da13 die Substanz hochrein vorliegt. Dies kann durch eine Elemen- taranalyse und Anwendung zusatzlicher spektroskopischer Methoden gewahrleistet werden. Sodann sollte man feste Substanzen in einer Trockenpistole im Vakuum bei einer dem Schmelzpunkt angepasten Temperatur trocknen. Hierbei mu13 beachtet werden, dal3 kristalline Substanzen in Abhangigkeit von der KristallgroSe neben Kri- stallwasser auch Losungsmittel einschlieaen konnen. Als Trockenmittel konnen klassi- sche Trocknungsmittel wie Kieselgur oder Phosphorpentoxid eingesetzt werden. Von den so vorbereiteten Substanzen kann dann eine definierte Losung im ppm-Bereich (pg/mL) hergestellt und die Extinktion in einem Maximum vermessen werden.

An einem expliziten Beispiel wird nachfolgend die Berechnung der Extinktions- koeffizienten fur das Pflanzenschutzmittel Phenmedipham Herbizid aufgezeigt. In Abb. 3-7 wird das UV-Spektrum von Phenmedipham - gelost in AcetonitrilWasser 1 : 1 - wiedergegeben. Phenmedipham besitzt im spektralen Bereich von 200 bis 350 nm zwei Maxima ,,mittlerer Intensitat" bei 206 und 238 nm und eine ,,schwache Bande" bei 272 nm.

Zur Durchfuhrung der Bestimmung wird Phenmedipham (Schmelzbereich 142-145 "C) 24 Stunden bei 60 "C im Vakuum in einer Trockenpistole (Trockenmittel Phosphorpentoxid) betrocknet. Nachfolgend wird eine Stammlosung hergestellt (21.8 mg pro 100 mL Acetonitril), ein Aliquot entnommen und auf eine Konzentration von 2.18 mg/L mit Acetonitril/Wasser 3: 1 verdiinnt. Die Losung wird bei 206,238 und 272 nm vermessen. Die Schichtdicke betragt 1 cm.


nm-> 200 220 240 260 280 300 320

Abb. 3-7: Spektrum Phenmedipham.

Berechnung der Extinktionskoeffizienten anhand der gemessenen Extinktion A :

)L?72+A = 0.0143A.U~ = A/k - d = 0.0143/0.00218 . 1 = 6.56 L * g-' . cm-'

& - + A = 0.186 A.Ua = A/k + d = 0.186/0.00218 . 1 = 85.33 L - g-' cm-'

3y,+A = 0.260 A.Ua = A/k - d = 0.260/0.00218 - 1 = 119.2 L . g-' . cm-'

E = A/c d = 0.0143/7.3 - lo4 - 1 = 1970 L . mol-' . cm-'

E = A/c - d = 0.186/7.3 . lo4 1 = 25600 L - mol-' . cm-'

E = A/c . d = 0.0143/7.3 - lo4 - 1 = 35800 L - mol-' - cm-'

3.3.5 UVMS-Spektrometer

Prinzipiell bestehen alle UVNIS-Spektrometer aus den folgenden Komponenten:

1. Strahlungsquelle 2. Probenraum 3. Empfanger

In UVNIS-Spektrometern werden im allgemeinen Wasserstoff-Deuterium-Lampen fur den UV-Bereich und Wolfram bzw. Wolfram-Halogen-Lampen fur den sichtbaren Bereich eingesetzt. Die Wasserstoff-Deuterium-Lampe liefert ein kontinuierliches Spektrum von 180 bis 400 nm. Im Bereich > 400 nm werden fur die Wasserstoff-Deu- terium-Lampe einige scharfbandige Ubergange beobachtet, die zur Eichung der Wel- lenlangenskala herangezogen werden konnen. Die Wolfram-Lampe bzw. Wolfram- Halogen-Lampe liefert ein kontinuierliches Spektrum erst ab 300 nm.

Bei den modernen Spektrometern wird bei der Messung eines UVNIS-Spektrums automatisch zwischen den beiden Lampen bei 325 nm umgeschaltet. Die meisten Gerate gestatten die Messung von 190 bis 900 nm.

Der weitere Aufbau eines UVNIS-Spektrometers richtet sich nach der Detektor- art. Als Detektor kann sowohl eine Photozelle bzw. ein Photomultiplier (Sekundar- elektronenvervielfacher) oder ein Photoelement oder Photodioden eingesetzt werden.

Bei Verwendung einer Photozelle bzw. eines Photomultiplier als Detektor wird das Licht, bevor es auf die MeBkuvette oder Zelle trifft, monochromatisiert, d. h. es wird aus dem kontinuierlichen Lichtspektrum ein Wellenlangenbereich selektiert. Die Transmission einer Probe wird dann bei einer bestimmten Wellenlange (Photometer)


oder in Abhangigkeit von der Wellenlange in einem Wellenlangenbereich ermittelt. Die einfachsten Vorrichtungen zur Selektion einer Wellenlange sind Filter oder Filter- liisungen. Eine weitere Moglichkeit besteht darin, MeBlicht durch einen Prismen- oder Gittermonochromator zu zerlegen. Heute dienen fur die Wellenlangenselektion fast ausschliefllich Gittermonochromatoren. Nach der Selektion des Wellenlangenberei- ches wird das Licht zum Detektor gefiihrt. Je nach MeBprinzip unterscheidet man Ein- strahl- und Zweistrahlgerate.

Einstrahlgerate arbeiten im allgemeinen nach dem Substitutionsprinzip, d. h. Refe- renz- und MeBkuvette werden nacheinander in den Strahlengang gebracht. Zuvor erfolgt die Einstellung des 0-Wertes mittels Shutter (geschlossener Strahlengang) und Messung des Dunkelstromes. Danach wird die Vergleichskuvette in den Strahlengang geschoben und auf den Transmissionswert 100 % oder Extinktionswert 0 abgeglichen. Durch elektronische Verarbeitung wird bei vielen Geraten das Ergebnis digital in % T oder Extinktion wiedergegeben.

Beim Zweistrahlgerat wird der primare Lichtstrahl in zwei Strahlengange aufgeteilt, die in einem Abstand von etwa 10-15 cm Referenz- oder MeBkuvette zeitlich nacheinander durchstrahlen, so dal3 nach Wiedervereinigung beider Strahlengange Licht wech- selnder Intensitat auf den Empfanger fallt und ein Wechselspannungssignal erzeugt. Im Fall feststehender Strahlenteilerelemente muB durch einen Chopper die zeitliche Ver- schiebung der Durchstrahlung der beiden Kuvetten ermoglicht werden. Bei einem rotierenden Sektorspiegel ubernimmt das Strahlenteilerelement selbst die Funktion.

Der wesentliche Unterschied von Spektrometern, die mittels Diodenarray-Technik arbeiten, zu konventionellen Spektrometern mit Gittermonochromatoren ist, daB anstelle des Monochromators ein Polychromator benutzt wird. So wird das Licht eines Kontinuumstrahlers in den Strahlengang mit der Probe geleitet, das nach Austritt auf einen Polychromator fallt, der das Licht auf einer Diodenreihe abbildet. Die entsprechende Diode erzeugt ein zur Wellenlange gehoriges Signal, das zur Datenverarbei- tung weitergeleitet wird. Fur den Wellenlangenbereich von 190 bis 800 nm werden haufig mehr als 500 Einheiten eingesetzt.

Die Vorteile der Diodenarray-Spektrometer bzw. Detektoren gegenuber Mono- chromatoren ublicher Bauart sind, daB das gesamte Spektrum von 190 bis 800 nm in weniger als 0.1 Sekunden gemessen, dargestellt und bei Messungen an den Flanken von Absorptionsbanden qualifiziert werden kann, weil keine optischen Teile bewegt werden.

3.3.6 Abweichungen vom Bouguer-Lambed-Beerschen Gesetz

Geht man von der strikten Anwendung des Bouguer-Lambert-Beerschen Gesetzes aus, so sollte die Extinktion linear proportional zur Konzentration einer Spezies bei einer definierten Wellenlange sein. Weiterhin wird angenommen, daB jedes absorbie- rende Molekul einer Spezies, eine fur sich unabhangige Einheit bildet. Wie man sich vorstellen kann, ist dies eine Idealvorstellung und daher nicht weiter verwunderlich, daB in der Praxis Abweichungen vom Bouguer-Lambert-Beerschen Gesetz auftreten konnen. Aus diesem Grunde ist es immer angebracht, die Linearitat fur den Konzen- trationsbereich zu uberprufen, den eine Methode abdecken soll.


3.3.6.1 Chemische Abweichungen

Die hlufigsten Abweichungen vom Bouguer-Lambert-Beerschen Gesetz beruhen im weitesten Sinne auf chemischen Veranderungen bzw. physikalisch-chemischen Wech- selwirkungen. So kann es in Liisungen in Abhangigkeit von verschiedenen Faktoren, wie der Konzentration, Temperatur, Liisungsmittel und pH-Wert durch Dissoziation, Assoziation oder chemischer Reaktionen zu einer scheinbaren Konzentrationslnde- rung oder Verschiebung der Absorptionsmaxima innerhalb einer MeBreihe kommen, die eine Abweichung von der Linearitat bewirken konnen.

Zur Verdeutlichung kann folgendes Beispiel herangezogen werden. Es sol1 eine Kalibrierfunktion fur eine UV-aktive weiche Saure ermittelt werden, die in die beiden Spezies HA oder A- dissoziieren kann und deren Dissoziationsgrad mit der Konzentra- tion an HA variiert. Nimmt man an, daB der Anteil der Spezies A- mit zunehmender Konzentration abnimmt, so kommt es bei einem > eHa zu einer negativen Abwei- chung und im umgekehrten Falle zu einer positiven Abweichung vom Bouguer-Lam- bert-Beerschen Gesetz. Im Falle sA- = EHA wurde keine Abweichung beobachtet werden. In den meisten Fallen kann ein derartig chemisches Verhalten durch die Einstel- lung eines sehr geringen bzw. hohen pH-Wertes oder aber durch Pufferung vermieden werden.

3.3.6.2 Medium- und Losungsmitteleffekte

Abweichungen von der Linearitat konnen auch durch sogenannte ,,Medium"- oder Liisungsmitteleffekte bewirkt werden. Im allgemeinen erfolgt dies durch eine Veran- derung der zwischenmolekularen Wechselwirkungen (z. B. Dipol-Dipol-Wechselwir- kungen), die etwa durch Zugabe von Salzen oder Variation der Losungsmittelzusam- mensetzung erreicht werden kann.

Als Beispiel kann hier die Verschiebung der Absorptionsbande im Aceton angefuhrt werden, die dem j x*-Ubergang des einsamen Elektronenpaares am Carbo- nylsauerstoff zugeordnet wird.

Der Abb. 3-8 ist zu entnehmen, daB Aceton bei einer Losungsmittelzusammenset- zung von 90 % Wasser und 10 % Acetonitril ein Absorptionsmaximum bei 270 nm besitzt. Dieses Maximum wird mit zunehmendem Anteil an Acetonitril bathochrom verschoben. Bei einer Losungsmittelzusammensetzung von 10 % Wasser und 90 % Acetonitril liegt das Maximum nunmehr bei 275 nm.

Dieser Sachverhalt zeigt, daB in einem analytischen System, in dem sich die Losungszusammensetzung andern kann, wie beispielsweise in der Gradienten-Fliissig- keitschromatographie, bei einer Detektion im UVNIS-Bereich die Abhangigkeit des Spektrums von der Losungsmittelzusammensetzung zu uberprufen ist.

3.3.6.3 InstrumenteUe Abweichungen

Das Bouguer-Lambert-Beersche Gesetz setzt monochromatisches Licht voraus, da der Extinktionskoeffizient von der Wellenlange abhangig ist. Da eine sogenannte


105 194 24 1

AcCNIH,O 5:5 km= 273 nm

4

Monochromasie nicht in dem AusmaR zu verwirklichen ist, wie eine Reihe von Proble- men und die Genauigkeit der MeRmethode es verlangen, mussen ,,scheinbare" Abwei- chungen instrumenteller Art als MeRfehler mit in die Methode einbezogen werden. Diese Fehler lassen sich jedoch bei konstant gehaltenen Versuchs- bzw. MeBbedingun- gen in den meisten Fallen vernachlassigbar klein halten.

Ein weiterer Fehler ist auf die begrenzte Genauigkeit der Meagerate in den Extrembereichen der Extinktion zuruckzufiihren, d. h. in der Nahe von A = 0 oder A = 03. Der Fehler in diesen Grenzbereichen liegt in der logarithmischen Abhangig- keit der MeflgroRe. Nach Kortum liefern alle Messungen zwischen etwa 15% und 70 % Transmission (A = 0.15 bis 0.8) fur die meisten Zwecke jedoch geniigend zuver- lassige Werte.

Nicht unerwahnt sollte die Verfalschung kleiner Transmissionswerte durch Falsch- licht (oft auch als Streulicht bezeichnet) bleiben. Unter Falschlicht versteht man fremdwelliges Storlicht, das der mittels Monochromator gewahlten Strahlungswellen- Iange iiberlagert ist. Vereinfacht kann gesagt werden, daR das Falschlicht zusatzlich zum Detektor gelangt und eine scheinbare Erhohung der Transmission bewirkt.

Tab. 3-3: EinfluR des Falschlichtes auf den MeBfehler.

Transmission Extinktion T + 0.05 Gemessene MeBfehler T Yo A Falschlicht Extinktion in %

10 1 .o 1 2.0 0.1 3.0 0.01 4.0

10.05 0.998 0.2 1.05 1.980 1 0.15 2.820 6 0.06 3.220 19.5

3.4 Gehaltsbestimmung mittels UVNIS-Spektrometrie 127

Der Falschlichtanteil ist geratespezifisch und liegt bei den meisten neueren Routi- negeraten, gemaB den Angaben der Geratehersteller, bei ca. 0.05 % . Trotz des geringen Wertes kann das Falschlicht sich speziell bei niedrigen Transmissionswerten als sto- rend erweisen (Tab. 3-3). Ein weiterer Punkt, der zu erwahnen ist, betrifft die Erho- hung des Falschlichtanteils mit zunehmendem Alter der Gerate. Bei alteren Geraten kann dieser bis zu 0.3 % erreichen.

3.4 Gehaltsbestimmung mittels UVNIS-Spektrometrie

3.4.1 Spektrophotometrische Gehaltsbestimmungen

Die quantitativen Einzelstoffbestimmungen auf der Basis der Photometrie im UV/ VIS-Bereich haben auf dem Gebiet der Umwelt- und Lebensmittelanalytik einen unverandert hohen Stellenwert, trotz der Tatsache, da8 es inzwischen zahlreiche alter- native Methoden aus allen Bereichen der instrumentellen Analytik gibt. Sie erfolgt durch die Bestimmung der Extinktion A einer absorbierenden Losung auf der Basis des Bouguer-Lambert-Beerschen Gesetzes. Diese Art der quantitativen Einzelstoffbe- stimmung kann auf

a) Substanzen mit UVNIS-Aktivitat, b) UVNIS-aktive Derivate nichtabsorbierender Substanzen, c) UVNIS-aktive Komplexe nichtabsorbierender Substanzen, z. B. bei Kationed

angewandt werden.

Die Berechnung der Gehalte wird nach folgenden Verfahren durchgefiihrt:

1. direkt ; unter Verwendung des Bouguer-Lambert-Beerschen Gesetzes, 2. mittels Referenzlosungen, 3. mittels Kalibriergeraden bzw. Kalibrierfunktionen.

Anionen oder Elementen

3.4.1.1 Gehaltsbestimmung unter Verwendung des BouguepLambert-Beerschen Gesetzes

Durch Messung einer Extinktion A der Liisung einer absorbierenden Substanz, kann man deren Gehalt durch die direkte Anwendung des Bouguer-Lambert-Beerschen Gesetzes, gemaB Gleichungen (3.12) und (3.13) bestimmen. Dies ist jedoch nur moglich, wenn der Extinktionskoeffizient bei der angewandten Wellenllnge, dem verwendeten Losungsmittel sowie die Schichtdicke d bekannt ist. Hiernach ware:

(3.12) A,, = EX * C, * d

und


A h = ah * c: . d

Der Gehalt lielje sich mittels Gleichung (3-14)

cx = A A ~ A d

mit c, = mol . L-'

oder Gleichung (3-15)

A ah * d

c; = h

(3.13)

(3.14)

(3.15)

mit c: = g L-' bestimmen.

3.4.1.2 Gehaltsbestimmung mittels einer Referenzlosung

Die Gehaltsbestimmung einer gelosten absorbierenden Substanz kann auch durch den Vergleich einer Losung unbekannten Gehaltes mit einer korrelierenden Referenz- bzw. Standardlosung erfolgen. Werden die Referenz- und die unbekannte Losung unter gleichen Bedingungen vermessen, so erhalt man zwei Extinktionswerte, die im Idealfall folgenden Gleichungen entsprechen:

Da E und d in beiden Systemen gleich sind, konnen die Gleichungen kombiniert und reduziert werden, man erhalt Gleichung (3.16) mit:

(3.16)

und nach Umstellung erhalt man die Konzentration der unbekannten Losung gemalj Gleichung (3.17)

C, (3.17)

Eotz der Tatsache, dafl auf Grund der einfachen mathematischen Anwendung diese Art der Gehaltsbestimmungen, die man auch ,, Einpunktkalibrierung" nennt, noch haufig Anwendung findet, entspricht sie nicht mehr den derzeitigen Anforderungen an Qualitatssicherungssysteme. Der Grund hierfur liegt in der Tatsache, dafl diese Art der Kalibrierung haufig falsch verwandt und Abweichungen vom Bouguer-Lambert- Beerschen Gesetz nicht direkt erfaflt werden konnen.

3.4.1.3 Gehaltsbestimmungen uber Kalibriergeraden oder Kalibrierfunktionen

3.4.1.3.1 Vorgehensweise beim Arbeiten mit Kalibriergeraden [3-341

Zur Erstellung einer Kalibriergeraden werden eine Reihe von Standardlosungen unterschiedlicher Konzentration hergestellt, wobei diese einen Konzentrationsbereich

a


A A, -

. Blindwert

I I I

< 1.0

Konzentration I Konzentration 2 Konzentration 3

(b) 2.0 4.0 8.0

Konzentration in mglL

Abb. 59: (a) Kalibriergerade, (b) Gehaltsbestimmung iiber eine Kalibriergerade.

abdecken sollten, der mit den zu erwartenden Gehalten der Realproben iiberein- stimmt. Die Standardlosungen werden vermessen und der bestimmte Extinktions- wert A in einem Diagramm gemiif3 Abb. 3-9 gegen die Konzentration aufgetragen. Im Idealfall sollte sich bei Verbindung der MeBpunkte eine Gerade ergeben.

Von einer im Gehalt unbekannten Probe wird ebenfalls die Extinktion gemessen und der MeBwert in das Diagramm (z. B. auf Millimeterpapier) eingetragen. Durch Extrapolierung erhalt man den Gehalt der unbekannten Probe.

3.4.1.3.2 Vorgehensweise beim Arbeiten mit einer Kalibrierfunktion

Alle Mefiwerte sind rnit mehr oder weniger Fehlern behaftet. Mit statistischen Metho- den ist es moglich, die Kalibriergerade als Kalibrierfunktion auszudrucken. Man ver-


wendet dabei die Methode der linearen Regression bzw. Anpassung der Kalibrierfunk- tion nach dem Verfahren der kleinsten Fehlerquadrate.

Die allgemeine mathematische Gleichung hierfur lautet :

(3.18)

y = Wert auf der Ordinate, hier die Extinktion A x = Wert auf der Abszisse, hier die Konzentration a = Steigungsfaktor der Geraden, der Extinktionskoeffizient bei definierter Wellen-

b = Achsenabschnitt entsprechend dem Blindwert

Sind in einer beliebigen Geradengleichung der a-Wert (Steigung) und der Achsen- abschnitt b (Blindwert) gegeben, so kann fur jeden y-Wert (hier die Extinktion als MeBwert) der entsprechende x-Wert (hier die Konzentration) berechnet werden. Das Verfahren der linearen Regression zielt nun darauf hin, aus einer Reihe von Wertepaa- ren, die aus Standardlosungen gemaB Abschnitt 3.4.1.3.1 ermittelt werden konnen, die beiden Werte m und b zu berechnen und daraus die korrelierende Funktionsgleichung zu erstellen.

Die Faktoren a und b werden nach dem Verfahren der kleinsten Fehlerquadrate nach Gleichung (3.19 und 3.20) berechnet.

Iange

z x * zxy-z2 * z y (xx)2-n . x x 2

a = (3.19)

(3.20)

Aus den MeBwerten kann weiterhin der Korrelationskoeffizient r berechnet werden. Der Korrelationskoeffizient r beschreibt die Gute der linearen Gleichung. Die r-Werte konnen zwischen 0 und ? 1 liegen. Bei einem r-Wert von +1 oder -1 liegen alle MeB- werte auf der theoretisch berechneten Geraden. Je mehr der r-Wert gegen Null geht, desto weniger ist ein h e a r e r Zusammenhang der MeBwerte vorhanden. Je naher der Wert bei 1 liegt, um so besser ist ein h e a r e r Zusammenhang zu belegen. Fur den Arbeitsbereich einer analytischen Methode sollte der Korrelationskoeffizient der Kali- brierfunktion in jedem Fall groBer als 0.98 sein.

Fur die Vertiefung der statistischen Auswertung wird auf die einschlagige Literatur verwiesen .

3.4.2 Computerunterstiitzte Auswertung von MeBwerten

Wie bereits erwahnt, stellen die Konzentrationsbestimmungen immer noch die haufigsten Anwendungen der UVNIS-Spektrometrie dar. Das ist der Grund dafur, daB Geratehersteller speziell diesem Bereich eine hohe Aufmerksamkeit widmen. So besitzen die entsprechenden Software-Pakete zur Steuerung von Spektrometern


zusatzlich - oftmals nur als Option - umfangreiche Moglichkeiten zur statistischen Auswertung der MeBdaten. Uber die Erstellung einer linearen Regressionsgeraden hinaus kann fur nichtlineare Systeme uber die Methode der kleinsten Quadrate auch eine quadratische oder kubische Anpassung der Kalibrierfunktion erfolgen.

Mittels Datenverarbeitung lassen sich noch weitere statistische Kenndaten fur eine analytische Methode errechnen, die im Rahmen der GLP fur die Methodenvalidie- rung verlangt werden, wie u. a. Uberprufung der Reproduzierbarkeit der Methode, Linearitltstest, Berechnung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen etc. Man ist jedoch nicht nur auf die Software-Pakete der Gerltehersteller angewiesen, sondern kann die Berechnungen auch mittels moderner Tabellenkalkulationsprogramme abwickeln.

3.4.3 Durchfiihrung von Analysenverfahren

Fur die Bereiche Wasser-, Umwelt- und Lebensmittelanalytik gibt es haufig vorgege- bene oder gesetzlich festgelegte photometrische Verfahren. Zu nennen sind hier Sammlungen von Methoden wie u. a. :

- Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser- und Schlammuntersuchung

- die Verfahren zur Lebensmitteluntersuchung nach 9 35 des Lebensmittel- und

- und daruber hinaus die alternativen Verfahren der Environmental Protection

nach DIN 3840x;

Bedarfsgegenstande-Gesetz (LMBG) ;

Agency (EPA) . Da diese Verfahren festgelegt sind, gibt es eine Reihe von Anbietern, die ,,Reagen- zienkits" und ,,Kuvettenkits" mit gebrauchsfertigen Reagenzien fur die relevanten Analyten anbieten. Diese Kits werden vor allem im Bereich der Wasser- und Umwelt- analytik vertrieben und vereinfachen die Uberwachung einer Vielzahl von Parame- tern, da z. B. bei ,,Kuvettenkits" die Analysenprobe nur noch in die vorbereitete MeB- kuvette dosiert werden mug. Fur Analysenmethoden, die auf enzymatischen Reaktio- nen basieren, gilt das gleiche.

Die zu einer Methode gehorigen Wartezeiten, z. B. fur die Derivatisierung oder Komplexbildung sowie die entsprechenden Wellenlangen und Kalibrierfaktoren, konnen direkt in Pc's eingelesen werden und vereinfachen so die Handhabung bestimmter Analysenmethoden. Aber auch die Zusammenstellung der notwendigen Reagenzien, die Verfahrensschritte und die Geratebedienung, die auf der praktischen Ausfuhrung im Anwendungslabor basiert, sind in einer Reihe von Methodensammlungen festge- halten und eroffnen den Weg zu einer umfangreichen Anwendung der photometri- schen Analyse .


3.5 Applikation im Lebensmittelbereich (Bestimmung von Hydroxyprolin)

Fur die Untersuchung von Lebensmitteln existiert eine umfangreiche Amtliche Samm- lung von Untersuchungsverfahren nach 0 35 LMBG. Nachfolgend wird die Bestim- mung des Hydroxyprolingehaltes in Fleisch und Fleischerzeugnissen gemaB der 0 35- LMBG-Methode beschrieben.

3.5.1 Kurzbeschreibung

Diese amtliche Methode [3-351 beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung des Hydro- xyprolingehaltes in Fleisch und Fleischerzeugnissen.

Die Probe wird durch Kochen mit Salzsaure aufgeschlossen. Nach Abtrennung des Fettes wird das Hydroxyprolin unter Verwendung von Chloramin T oxidiert. Das Oxi- dationsprodukt bildet mit 4-Dimethylaminobenzaldehyd rotgefarbte Verbindungen. Die Extinktion der diese Verbindungen enthaltenden MeBlosung wird photometrisch bei etwa 558 nm gemessen. Sie ist der Hydroxyprolinkonzentration direkt proportional. Die Konzentration wird in g/lOO g der Probe angegeben.

3.5.2 Chemikalien

Soweit nicht anders angegeben, sind analysenreine Chemikalien zu verwenden. Das Wasser muB entweder destilliert oder von entsprechender Reinheit sein.

- Salzsaure, c') etwa 6 moVL (etwa 6 N)') - Petroleumbenzin, Siedebereich 60 bis 80 "C - Pufferlosung mit dem ph-Wert etwa 6.8

26.0 g Citronensaure-Monohydrat, 14.0 g Natriumhydroxid-Platzchen und 78.0 g Natriumacetat (wasserfrei) werden in etwa 500 mL Wasser gelost, mit 100 mg Natriumathylmercurithiosalicylat (rein) versetzt und quantitativ in einen 1000-ml- MeBkolben uberfiihrt. Nach Zusatz von 250mL 1-Propanol wird mit Wasser zur Marke aufgefiillt. Bei Schutz vor Lichteinwirkung und einer Aufbewahrungstempera- tur von 4 "C ist die Pufferlosung etwa zwei Monate haltbar.

- Hydroxyprolin-Stammlosung, @*) = 600 mg/L2) 120 mg L-Hydroxyprolin (fur biochem. Zwecke) werden in Wasser gelost; die Losung wird im 200-mL-MeBkolben zur Marke aufgefiillt (vor dem Auffiillen kann

')c = Stoffmengenkonzentration 2)e = Massenkonzentration ")w = Massenanteil

3.5 Applikation im Lebensmittelbereich 133

die Stammlosung durch Zusatz von 50 mg Natriumathylmercurithiosalicylat (rein) konserviert werden).

5 mL der Stammlosung werden in einen 500-mL-MeBkolben pipettiert und rnit Was- ser zur Marke aufgefiillt.

Von der verdunnten Hydroxyprolin-Stammlosung werden 10 mL, 20 mL, 30 mL bzw. 40 mL in 100-mL-MeBkolben pipettiert. Nach Zusatz von jeweils etwa 30 mg Natriumathylmercurithiosalicylat (rein) wird mit Wasser zur Marke aufgefiillt. Die Konzentrationen dieser Standardlosungen betragen 60, 120, 180 bzw. 240 pgl 100 mL. Die Standardlosungen sind bei Raumtemperatur etwa eine Woche, bei 4 "C etwa zwei bis 3 Monate haltbar.

1.4 g Chloramin T (Trihydrat) werden in 100 mL der Pufferlosung gelost. Bei Schutz vor Lichteinwirkung und einer Aufbewahrungstemperatur von 4 "C ist das Reagenz etwa eine Woche lang haltbar.

10.0 g 4-Dimethylaminobenzaldehyd (zur Synthese) werden in 35 mL Perchlorsaure (0"' etwa 60%3), Dichte etwa 1.53 @mL) gelost. AnschlieBend werden langsam 65 mL 2-Propanol hinzugefugt. Diese Liisung sollte erst am Tage der Verwendung hergestellt werden.

- Hydroxyprolin-Stammlosung, ,p2) = 6 m&

- Hydroxyprolin-Standardlosungen

- Oxidationsreagenz

- Farbreagenz

3.5.3 Gerate und Hilfsmittel

- Aluminium- oder Kunststoffolie. - Rund- oder Erlenmeyerkolben, 100 mL NS 29, mit einem luft- oder wassergekuhl-

- Elektrisches Heizgerat, z. B. Heizblock, Heizhaube, Heizplatte oder Sandbad; vor-

- Glastrichter, Durchmesser etwa 100 mm. - Faltenfilter, Durchmesser 18.5 cm. - Erlenmeyerkolben 500 mL, enghalsig. - Wasserbad mitThermostat, geeignet zur Einhaltung derTemperatur 60 "C f 0.5 "C. - Glaskuvetten, Schichtdicke 1 cm. - Spektralphotometer oder photoelektrisches Colorimeter mit einem Interferenzfil-

ten RuckfluBkuhler.

zugsweise mit Zeitschaltuhr,

ter, dessen Absorptionsmaximum bei etwa 558 nm liegt.


3.5.4 Probennahme

- Probennahme-Prufplan

- Probennahme-Technik

(liegt im Rahmen der amtlichen Sammlung z. Z. noch nicht vor).

Zur Verpackung der Proben soll fettabweisendes und wasserdichtes Material, z. B. Kunststoff-Folienbeutel verwendet werden. Im ubrigen ist die Probe fachgerecht so zu befordern und lagern, daB ihre Beschaffenheit zum Zeitpunkt der Probenent- nahme erhalten bleibt. Fur die Probenvorbereitung zur Untersuchung sind 300 g Probenmaterial in der Regel ausreichend. Sondervorschriften bleiben hiervon unberuhrt.

3.5.5 Durchfuhrung

3.5.5.1 Vorbereitung der Probe

Vorschriften zur sensorischen Untersuchung und Identitatssicherung der Proben, z. B. uber die Aufbewahrung von Verpackungs-, Etikettierungs- und Umhullungsmaterial bleiben unberuhrt.

- Behandlung der Proben vor der Zerkleinerung Hullen sind, soweit wie moglich, zu entfernen.

- Probenzerkleinerung Eine merkliche Erwarmung der Proben wahrend der Zerkleinerung und Homogeni- sierung ist zu vermeiden. Ausgetretenes Wasser, abgesetztes Fett und Gallerte werden beim Homogenisieren hinzugefugt.

Das Homogenisat ist randvoll in die Probenbehalter einzufullen und so zu lagern, daB Verderb und Veranderung seiner Zusammensetzung verhindert werden. Die Probeneinwaage ist der Homogenisierung moglichst direkt anzuschlieBen. Soweit dies nicht moglich ist, ist das homogenisierte Probenmaterial vor der Einwaage sorgfaltig durchzumischen. Vor der Analyse soll die Probe Zimmertemperatur haben. Ein vorheriges Durchruhren von Hand ist erforderlich.

- Behandlung der Proben nach der Zerkleinerung

3.5.5.2 Bestimmung

Etwa 4 g der gut homogenisierten Probe werden unmittelbar oder mit Hilfe eines Wageschiffchens aus Aluminium- oder Kunststoffolie auf 1 mg genau in den 100-mL- Rund- oder -Erlenmeyerkolben eingewogen. Es werden 30 mL Salzsiiure und einige Siedesteinchen hinzugefugt. Unter Verwendung des Heizgerates wird die Losung bis zum schwachen Sieden erhitzt und 8 h unter RuckfluB gekocht.


Das Hydrolysat wird quantitativ mit Wasser in einen 500-mL-MeSkolben uberfuhrt, mit etwa 5 mL Petroleumbenzin versetzt und mit Wasser so bis zur Marke aufgefullt, daB die Petroleumbezinschicht mit dem darin gelosten Fett uber der Marke liegt. Nach griindlichem Mischen wird die fetthaltige Petroleumbenzinschicht durch Absaugen entfernt und die wal3rige Phase durch ein Faltenfilter in einen 500-mL-Erlenmeyerkol- ben filtriert. Das Hydrolysat kann bei Raumtemperatur eine Woche, im Kiihlschrank vier Wochen lang aufbewahrt werden.

Aus dem Hydrolysat wird eine geeignete Verdunnung hergestellt, so daB die erwar- tete Hydroxyprolinkonzentration im Bereich von 0.6 bis 2.4 pg/mL liegt. Das geschieht durch Verdunnen eines entsprechenden Volumens (V), in aller Regel 10 mL, des Hydrolysates mit Wasser in einem 250-mL-MeBkolben.

4 mL der hergestellten Verdunnung werden in ein Reagenzglas pipettiert, mit 2 mL Oxidationsreagenz versetzt, gemischt und bei Raumtemperatur 20 min k 1 min ste- hengelassen. AnschlieBend werden 2 mL Farbreagenz zugesetzt . Nach grundlichem Durchmischen wird das Reagenzglas schnell in ein Wasserbad von 60 "C f 5 "C gestellt und dort 15 min belassen. Danach wird das Reagenzglas unter flieaendem Leitungs- wasser mindestens 3 min gekuhlt und bis zur Messung 'h h bei Raumtemperatur ste- hengelassen. Die Extinktion der Losung wird bei etwa 558 nm in einer Glaskuvette (Schichtdicke 1 cm) gemessen.

In gleicher Weise wird ein Blindversuch durchgefuhrt. Anstelle von 4 mL des verdunnten Hydrolysates werden 4 mL Wasser eingesetzt und eine Doppelbestimmung durchgefuhrt. Die beim Blindversuch ermittelte Extinktion wird von den beim Haupt- versuch gemessenen Extinktionswerten abgezogen.

3.5.5.3 Erstellung der Kalibriergeraden

Zur Erstellung der Kalibriergeraden werden anstelle der hergestellten Verdunnungen des Hydrolysates jeweils 4 mL der Hydroxyprolin-Standardlosungen (entsprechend 2.4; 4.8; 7.2 bzw. 9.6 pg Hydroxyprolin) zur Messung der Extinktion verwendet. Von den gemessenen Extinktionswerten wird der ermittelte Blindwert abgezogen. Die Bestimmungen der Hydroxyprolin-Kalibrierwerte werden zweifach durchgefuhrt.

3.5.6 Auswertung

3.5.6.1 Graphische Auswertung

Die Extinktionswerte aus den Standardlosungen nach Abschnitt 3.5.5.3 werden in einem Koordinatensystem auf Millimeterpapier gegen die Hydroxyprolingehalte in pg/ mL aufgetragen. Bei verdunnten Hydrolysaten mit unbekannter Konzentration wird die der Extinktion entsprechende Konzentration x in &mL aus der Kalibriergeraden abgelesen.

Konzentrationen unter 0.6 pg/mL konnen nicht ausgewertet werden, da die Eich- werte in diesem Bereich nicht mehr durch eine Gerade darstellbar sind. In diesem Fall


mu13 die Bestimmung rnit einer Verdunnung hoherer Konzentration wiederholt werden.

3.5.6.2 Auswertung durch Berechnung einer Kalibriergeraden

Die Berechnung der Kalibriergeraden wird rnit Hilfe der 4 MeBwertpaare aus den Hydroxyprolin-Standardlosungen (siehe Abschnitt 3.5.2) durchgefuhrt (Tab. 3-4).

Tab. 3-4: Aufbau der Kalibrierfunktion fiir Hydroxyprolin.

Hydroxyprolinkonzentration Extinktion (in @mL)

XI = 0.6 x2 = 1.2 x2 = 1.8 X, = 2.4

YI Y2

Y , Y 4

a) Berechnung der Faktoren der Kalibriergeraden

Es wird eine lineare Funktion y = a + bx berechnet. Die Faktoren a (Achsenabschnitt = Blindwert) und b (Steigerung) werden nach dem Verfahren der kleinsten Fehler- quadrate berechnet :

z x * 2xy-Z2 * Zy a =

(zx)’-n . Ex2

Zx * Zy-n * Zxy b = (Zx)*-n . zx2

(3.21)

(3.22)

Durch Einsetzen der vorgegebenen Hydroxyprolinkonzentration der vier Standardlo- sungen fur x lassen sich die Gleichungen (3.21) und (3.22) folgendermafien zusam- menfassen :

(3.23)

(3.24)

a = y14-0.5 y2-0.5 y4

b = 0.5 yl-o.17 y2+0.17 y3+0.5 y4

b) Prufung der Kalibriergeraden auf Ausgleich und Linearitat

Nach der Berechnung der Faktoren a und b der Kalibriergeraden werden nacheinander die gemessenen Extinktionen y , bis y4 der Standardlosungen in eine der folgenden Gleichungen eingesetzt :


y = a+bx

x = - Y-a b

(3.25)

(3.26)

Fur x mussen sich dann mit moglichst grol3er Annaherung die theoretischen Werte 0.6; 1.2; 1.8 und 2.4 pg/mL ergeben.

c) Berechnung der Hydroxyprolinkonzentration im verdiinnten Hydrolysat

Die Hydroxyprolinkonzentration x in pg/mL im verdunnten Hydrolysat wird aus der gemessenen Extinktion y nach Gleichung (3.26) berechnet. Konzentrationen unter 0.6 pg/mL und uber 21.4 pg/mL konnen nicht ausgewertet werden (siehe Abschnitt 3.5.6.1).

3.5.6.3 Berechnung

Der Hydroxyprolingehalte w in @lo0 g der Probe wird nach folgender Gleichung berechnet :

12.5 * x m . V

w=-

V = Volumen des Hydrolysates in mL, das fiir die Verdunnung auf 250 mL verwen-

x = Hydroxyprolinkonzentration in pg/mL im verdunnten Hydrolysat, bestimmt

m = Probeneinwaage in g

Als Ergebnis wird das arithmetische Mittel aus zwei Bestimmungen aus getrennten Einwaagen auf zwei Stellen nach dem Komma gerundet angegeben, wenn die Bedin- gungen der Wiederholbarkeit nach Abschnitt 3.5.6.4 erfiillt sind.

det wurde (Abschnitt 3.5.5.2)

nach den Abschnitten 3.5.6.1 oder 3.5.6.2

3.5.6.4 Zuverliissigkeit der Methode

- Wiederholbarkeit (r):

r = 0.014 g/100 g;

- Vergleichbarkeit (R):

R = 0.05 g/1o0 g;

s, = k 0.0048 g/loo g

sR = * 0.0153 g/lOO g


3.6 Applikation in der Umweltanalytik

Eine in der Umweltanalytik haufig durchgefuhrte photometrische Methode ist die Bestimmung des Phenol-Index [3-28 bis 3-34]. Phenole sind weiter als Insektizide, Fungizide und deren Metaboliten sowie Desinfektionsmittel verbreitet. Die intensive Verwendung dieser Verbindungsklasse, vor allem der halogenierten Phenole, fuhrt wegen toxischer Eigenschaften dieser Chemikalien zu einer Reihe von Umweltproble- men. Phenole, die sich nach der Aufbereitung des Wassers mittels Chlorung durch Geruchs- und Geschmacksbeeintrachtigungen bemerkbar machen, kommen in der Regel mit anderen Phenolen aus Einleitungen von industriellem und hauslichem Abwasser zusammen vor. Die Wirkung einzelner Phenole auf Mensch und Umwelt (chronische Toxizitat, Desinfektionsmittel) resultieren in niedriggehaltenen Grenzwer- ten der TVO von 0.5 pg/L fur die Summe der Phenole.

Die Untersuchung von Wasser auf Phenole kann sowohl mittels Gaschromatogra- phie nach Derivatisierung oder mittels HPLC und UV- bzw. DAD-Detektion durchgefuhrt werden. Mit diesen Methoden konnen die einzelnen Verbindungen differenziert erfaBt werden, eine fur die Beurteilung oft erforderliche Bestandsaufnahme. Aber auch die photometrische Bestimmung des Phenol-Index, als Summenparameter, wird in vielen Wasserlaboratorien noch routinemaflig durchgefuhrt. Nach der photometri- schen Bestimmung wird in Abschnitt 3.6.2 ein erprobtes empfindliches Arbeitsverfah- ren zur Bestimmung in naturlichen Wassern aufgefuhrt und ein Hinweis auf eine im Rahmen von DIN erscheinende Methode gegeben.

3.6.1 Quantitative Bestimmung

Fur die Bestimmung des Phenolgehaltes als Summenparameter bestehen erprobte DIN-Methoden, wobei in den nachfolgenden Abschnitten diese Methoden als Beispiel fur die Durchfuhrung einer quantitativen Bestimmung eingehender beschrieben werden.

DIN Methodenubersicht zur Bestimmung des Phenol-Index

Photometrische Bestimmung mit 4-Nitroanilin

Photometrische Bestimmung mit 4-Amino-2.3-dimethyl-l-phenyl-3-pyrazolin-5-on (4-Aminoantipyrin)

Photometrische Bestimmung ohne Destillation mit 4-Aminoantipyrin

Photometrische Bestimmung nach Destillation und Farbstoffextraktion

DIN 38409-H16:

DIN 38 409-H16-1:

DIN 38409-H16-2:

3.6 Applikation in der Umweltanalytik 139

DIN 38 409-H16-3: Photometrische Bestimmung nach Destillation ohne Farbstoffextraktion

3.6.2 Photometrische Bestimmung rnit 4Amino-2.3-dimethyl-l-phenyl-3-pyrazolin-5-on (4Aminoantipyrin) gemaB DIN

Geeignet zur Bestimmung von Phenolen im Massenkonzentrationsbereich zwischen 0.02 und 1.0 m g L

ErfaBt werden: Phenol, ortho- und meta-Bindungen des Phenols und je nach pH-Wert p-Bindungen des Phenols mit Carboxyl-, Halogen-, Methoxy- oder Sulfonsauregrup- pen.

Nicht erfaBt werden: p-Bindungen des Phenols rnit Alkyl-, Aryl-, Nitro-, Benzoyl-, Nitroso- oder Aldehydgruppen.

3.6.2.1 Prinzip

Phenole und Phenolhomologe bilden in alkalischer Lijsung mit 4-Aminoantipyrin in Anwesenheit von Kaliumperoxodisulfat oder Kaliumhexacyanoferrat (111) Antipyrin- farbstoffe, die mit Chloroform ausgeschuttelt und bei 460 nm photometrisch ausgewertet werden konnen.

3.6.2.2 Storungen und Vorbehandlung

Um biochemische und chemische Oxidationen zu unterbinden, wird die Wasserprobe in einer braunen Glasstopfenflasche sofort nach der Probennahme mit ortho-Phos- phorsaure auf einen pH-Wert unter 4 gebracht und bei Anwesenheit von Schwefelver- bindungen kurz geruhrt oder beluftet . AnschlieSend wird 1 g/L Kupfer(I1)-sulfat- Pentahydrat zugegeben, gemischt und die Flasche verschlossen. Die Storwirkung von Cyanid-Ionen kann durch Zusatz von Cobalt(I1)-sulfatlosung bei der Destillation aus- geschaltet werden. Kuhl aufbewahrt ist die Wasserprobe in der Form ein Tag haltbar. Erfolgt die Phenolbestimmung unmitteibar nach der Probennahme, kann die beschrie- bene Behandlung entfallen.

Oxidierende Substanzen, d. h. solche, die sich durch Freiwerden von Iod nach Ansauern in Gegenwart von Kaliumiodid anzeigen, werden durch Zugabe eines Uber- schusses an Ascorbinsaure oder Eisen(I1)-sulfat sofort nach der Probennahme besei- tigt.

Bei Anwesenheit reduzierend wirkender Verbindungen (Uberprufung z. B. rnit Kaliumiodat-Starkepapier) wird der Wasserprobe vor der Destillation, die normalerweise bei einem pH-Wert von 4 durchgefiihrt wird, Eisen(II1)-sulfat zugegeben.


3.6.2.3 Gesamtphenole

500 mL der evtl. vorbehandelten Wasserprobe oder je nach Phenolkonzentration ein kleineres, mit Wasser zur Analyse auf 500 mL aufgefulltes Volumen, werden in einem 1000-mL-Scheidetrichter unter jeweiligem Umschutteln mit 20 mL Pufferlosung (der pH-Wert der Probe sol1 10 k 0.2 betragen; ansonsten ist die saure Probe vorher rnit Natronlauge auf pH 4 zu bringen), 3 mL 4-Aminoantipyrin und nach 2 min rnit 3 mL Kaliumperoxodisulfatlosung versetzt. Das Reaktionsgemisch bleibt nun 30 min licht- geschutzt stehen. AnschlieBend wird der entstandene Farbstoff mit 25 mL Chloroform 5 min lang gleichmaaig ausgeschuttelt. Danach wird die organische Phase uber etwa 5 g Natriumsulfat wasserfrei durch ein kleines, trockenes Papierfilter in einem 25 mL MeSkolben abgelassen, mit Chloroform bis zur Marke aufgefullt und bei 460 nm gegen eine gleichbehandelte Blindprobe gemessen.

Die Bezugskurve wird mittels Standardlosungen aus Phenol aufgestellt, die in der- selben Weise wie die Wasserprobe behandelt werden.

3.6.2.4 Wasserdampffluchtige Phenole

Erforderlich ist eine Destillationsapparatur, bestehend aus 1000 mL Destillationskol- ben, Kugelaufsatz, Liebig-Kiihler Cjeweils mit Glasschliffverbindungen) und 500 mL MeSzylinder als Vorlage. 500 mL der evtl. vorbehandelten Wasserprobe werden im Destillationskolben mit ortho-Phosphorsaure unter Verwendung von Methylorange als Indikator bis auf einen pH-Wert unter 4 gebracht und mit 5 mL (Kupfer(I1)-sulfatlosung sowie 5 mL Cobalt(I1)-sulfatlosung versetzt. Wenn das Wasser bei der Proben- nahme zur Konservierung bereits behandelt worden ist oder kein Cyanid enthalt, konnen diese Zusatze entfallen.

Durch Zufugen von 50 mL Pufferlosung wird die Probelosung auf pH 4 eingestellt. Nach Uberdestillieren von 400 mL wird die Destillation unterbrochen und rnit phenolfreiem Wasser zur Analyse auf 500 mL aufgefullt. Das Volumen des Destillates sollte immer gleich dem Ausgangsvolumen der Wasserprobe sein.

500 mL Destillat oder ein Aliquot rnit phenolfreiem Wasser zur Analyse auf 500 mL aufgefullt, wird in einen Scheidetrichter gegeben und rnit 20 mL Pufferlosung pH 10 versetzt, wobei der pH-Wert der Losung anschlieflend 10 k 0.2 betragen sol1 (evtl. muS rnit Natronlauge eingestellt werden). Nun werden 3 mL 4-Aminoantipyrin- losung hinzugegeben und nach Schutteln mit ebenfalls 3 mL Kaliumhexacyanoferrat- (111)-Losung versetzt und wiederum geschiittelt.

Nach funf bis zehn Minuten wird der entstandene Farbstoff durch ca. 5 min langes Schiitteln rnit 25 mL Chloroformphase uber etwa 5 g Natriumsulfat wasserfrei in einen 25 mL MeBkolben filtriert und das Filtrat durch Nachwaschen mit Chloroform bis zur Marke aufgefullt. Die Losung wird innerhalb von vier Stunden bei 460 nm gegen Chloroform photometriert.

In gleicher Weise wird eine Blindprobe bestimmt, bei der anstelle der Wasserprobe 500 ml Wasser zur Analyse eingesetzt werden.

3.6 Applikation in der Umweltanalytik 141

3.6.2.5 Reagenzien

Soweit nicht anderweitig beschrieben, sollen alle verwendeten Reagenzien den Rein- heitsgrad zur Analyse aufweisen. Insbesondere sind alle Liisungen rnit phenol- und chlorfreiem Wasser zur Analyse anzusetzen.

Reagenzzubereitungen

- 4-Amino-2.3-dimethyl-l-phenyl-3-pyrazolin-5-on-Liisung (4-Aminoantipyrin- Losung) : 2.0 g des Reagenzes werden in Wasser zur Analyse zu 100 mL gelost. Diese Liisung sollte taglich vor Gebrauch frisch angesetzt werden.

15 g Cobalt(I1)-sulfat-Heptahydrat werden in Wasser zur Analyse zu 100 mL gelost.

8 g Kaliumhexacyanoferrat(II1) werden in Wasser zur Analyse zu 100 mL gelost. Diese Liisung ist etwa eine Woche haltbar.

0.65 g Kaliumperoxodisulfat werden in Wasser zur Analyse zu 100 mL gelost. Diese Liisung ist etwa eine Woche haltbar.

100 g Kupfer(I1)-sulfat-Pentahydrat werden in Wasser zur Analyse zu 1000 mL gelost.

1.0 g Phenol werden in Wasser zur Analyse zu lo00 mL gelost. Die Liisung mu0 klar und farblos sein. 1 mL entspricht 1 mg Phenol. Von dieser Losung werden die erforderlichen Verdunnungen zum Aufstellen der Bezugskurve jeweils bei Bedarf frisch angesetzt.

40 g Natriumhydroxid-Platzchen in Wasser zur Analyse losen und weiter mit Wasser zur Analyse auf 100 mL auffullen.

10 mL ortho-Phosphorsaure 85 YO werden mit 85 mL Wasser zur Analyse gemischt.

150 mL Ammoniaklosung 25 % , 3 4 g Ammoniumchlorid und 200 g Kalium- Natrium-Tartrat werden mit Wasser zur Analyse gelost und zu 1000 mL aufgefullt.

Ein Volumenteil Salzsaure 25 YO wird mit einem Volumenteil Wasser zur Analyse gemischt .

Anmerkung: Abwasser, rnit reinen Phenollosungen versetzt, werden nach Methode 1 alkalisch und nach 2 sauer konserviert. Die Wasser sind, bis zu sechs Tage kuhl aufbe-

- Cobalt(I1)-sulfatlosung:

- Kaliumhexacyanoferrat(II1)-Losung:

- Kaliumperoxidsulfatlosung :

- Kupfer(IQsulfat1osung:

- Phenol-Standardlosung :

- Natronlauge 400 g/L:

- Phosphorsaure:

- Pufferlosung pH-Wert 10:

- Salzsaure ca. 12 Y :


wahrt, unverandert haltbar, d. h. die in den verschiedenartig konservierten Wasserpro- ben gemessenen Phenolwerte bleiben ein bis sechs Tage konstant.

3.7 UVNIS-Spektrometrie mittels Diodenarray-Technik

Der wesentliche Unterschied der Diodenarray-Technik zu konventionellen mecha- nisch-scannenden Photometern (Monochromatoren) ist, daB Diodenarray-Spektro- meter keine beweglichen Teile besitzen und das gesamte, stillstehende Spektrum gleichzeitig auf eine Reihe von Dioden abgebildet werden kann. Die entsprechende Diode erzeugt ein zur Wellenlange gehoriges Signal, das zur Datenverarbeitung weitergeleitet wird. Fur den Wellenlangenbereich von 190 bis 800 nm werden haufig mehr als 500 Einheiten eingesetzt.

Die Vorteile der Diodenarray-Spektrometer bzw. Detektoren gegenuber Mono- chromatoren ublicher Bauart ist, daB das gesamte Spektrum von 190 bis 800 nm in weniger als 0.1 Sekunden gemessen und dargestellt werden kann und daB bei Messun- gen an den Flanken von Absorptionsbanden quantitative Messungen durchgefuhrt werden konnen, weil keine optischen Teile bewegt werden. Dies ist der Grund, wes- halb die Diodenarray-Technik, als Detektionsprinzip in der Chromatographie, die Monochrom-Detektoren mehr und mehr verdrangen wird, letztlich weil die vielfach geauBerte Ansicht, daB nicht die Empfindlichkeit von Einstrahlgeraten erreicht wird, sich als unwahr erwiesen hat und es bereits Gerate gibt, die vergleichbare und sogar bessere Werte liefern.

Daruber hinaus gestatten die Diodenarrays neben einer Peakerkennung, die spek- trale Identifizierung und die Kontrolle der Peakreinheit. Anwendungsmoglichkeiten des Diodenarrays im Bereich der Wasser- und Umweltanalytik werden in den nachfolgenden Abschnitten aufgefuhrt.

3.7.1 Analytik von polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAW

Im Bereich der Umweltanalytik gewinnt die Bestimmung von polycyclisch aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK) immer mehr an Bedeutung. PAK entstehen aus organischen Materialien durch Pyrolyse oder bei unvollstandiger Verbrennung. Quel- len sind Abgase durch Hausbrand, industrielle Verbrennungsofen, Autoabgase, Tabak- rauch etc. PAKs werden als Umweltkanzerogene eingestuft und sind daher im Zusam- rnenhang mit Fragen des Umweltschutzes von grol3er Aktualitat. Nach dem derzeitigen Stand der Kenntnisse ist jedoch nicht sicher, ob nur einzelne PAKs als Kanzero- gene anzusehen sind oder ob die Surnme der PAKs ein potentielles Krebsrisiko dar- stellen.

Vor diesem Hintergrund wird deutlich, daf3 das Interesse um das Wissen uber den Gehalt an PAKs in den unterschiedlichsten Matrizes standig wachst und das nicht nur

3.7 UVNIS-Spektrometrie mittels Diodenarray-Technik 143

Tab. 3-5: 16 PAK nach EPA.

ID Nr. Benennung Molare Masse g/mol Summenformel

1 Naphthalin 128.2 GoHs 2 Acenaphthylen 152.1 G2HS 3 Acenaphten 154.2 Cl2HlO 4 Fluoren 166.2 Ci&

Tvo-, 7 Fluoranthen 202.3 C16HIO 8 Pyren 202.3 ClbHlO 9 Benzo(a)antracen 228.3 CmHn

10 Chrysen 228.3 C18H12 Tvo-, 11 Benzo(b)fluoranthen 252.3 c 2 o H 1 2

Tvo+ 12 Benzo(k)fluoranthen 252.3 C2OHl2 TvO-, 13 Benzo(a)pyren 252.3 C20H12

14 Dibenzo(a,h)anthracen 278.2 C&M TvO+ 15 Benzo(ghi)perylen 276.3 C22H12 TvO+ 16 Indenopyren 276.3 C22H12

5 Phenanthren 178.2 C14HI0

6 Anthracen 178.2 C14HI0

in bezug auf die drei klassischen Umweltmatrizes Wasser, Boden, Luft, sondern auch bei Lebensmitteln und Bedarfsgegenstanden. Ein Bereich, der vermehrt Beachtung findet, ist die Beurteilung von Brandschaden bzgl. der PAK-Kontamination.

Bei der Stoffauswahl der PAK, die in die Beurteilung einer bestimmten Matrix eine Rolle spielen und auch zukunftig in DIN-Methoden einfliesen werden, orientiert man sich an der US-EPA-Liste (Environmental Protection Agency; Methode 610). Diese beinhaltet 16 polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe (Tab. 3-5). Im Rahmen der Trinkwasserverordnung wird auf 6 PAK gepruft, die jedoch in der EPA-Liste ent- halten sind.

Die heute wohl wichtigste chromatographische Technik zur Bestimmung von PAKs, ist neben der Gaschromatographie (GC) die Hochleistungsflussigkeitschromatographie (HPLC). Hochleistungsflussigkeitschromatographen lassen sich mit UVNIS-, Fluores- zenz- oder Diodenarray-Detektoren (DAD) koppeln. Hierbei ist der Fluoreszenz-Detek- tor, wenn eine hohe Empfindlichkeit verlangt wird, d. h. die Bestimmung von PAK im Pikogrammbereich, der Detektor der Wahl. Fur den Nachweis und die Bestimmung von PAK im unteren Nanogrammbereich und bei komplexen Proben, bei denen das Krite- rium der Retentionszeitenubereinstimmung nicht mehr ausreicht, hat sich der DAD als vorteilhafter enviesen, da durch die Aufnahme der UV-Spektren noch zusatzliche Infor- mationen zur Charakterisierung von PAK gewonnen werden kijnnen [3-37,3-381.

3.7.1.1 Bestimmung von PAK mittels HPLC und Diodenarray-Detektion

Voraussetzung fur die Bestimmung der PAK als Multikomponentensystem ist die chromatographische Auftrennung, fur die mittlerweile eine Reihe von Spezialsaulen zur Verfugung stehen (Abb. 3-10).

144

mAb!

100

50

3 UV-VIS-Spektrometrie

h

13

10 20 30 40 min

Abb.3-10: Chromatogramm der Auftrennung von 16 PAKs gemaB DIN-Entwurf 38407 F 12. Zuordnung siehe Tab. 3-5.

Analysenbedingungen der PA K-Bestimmung mittels HPLC:

HPLC-Saule: LiChrospher PAH; 250 x 3 mm (Merck, Darmstadt)

Eluenten : LM A = Acetonitril (fur die Chromatographie) LM B = Wasser (fur die Chromatographie)

Gradient : 0- 3 min isokratisch 60 % LM A 3-10 min linear auf 95 % LM A

10-50 min isokratisch 95 % LM A

Equilibrierzeit: 20 min

Mischkammer: 1.7 mL

Fluorate: 0.35 mL/min

Temperatur: 25 "C

Diodenarray-Detektor : Spektraler Bereich 200-450 nm, Bandbreite 1 nm


Bei der qualitativen Auswertung von Proben mittels DAD kann neben der Retentions- zeit als Analysenparameter die Identifizierung der PAK uber die UV-Spektren durchgefuhrt werden. Die entsprechenden Referenzspektren konnen anhand von Reinsub- stanzen oder bei Kenntnis der Elutionsfolge der entsprechenden PAK mittels eines Multikomponentenstandards bestimmt werden. Weiterhin sollte berucksichtigt werden, daB das bsungsmittel bzw. die Liisungsmittelzusammensetzung einen EinfluB auf die Maxima der Absorptionsbanden haben kann. Dies bedeutet, daB es immer von Vorteil ist, seine eigene Spektrenbibliothek zu erstellen, die unter den angewandten Analysenbedingungen (Gradient) erstellt wurde.

3.7.1.2 Anwendungen

Ein Bereich, in dem sich der DAD als empfindlich genug erwiesen hat, ist die Klassifi- zierung von Bodenqualitaten nach den derzeitigen Richtlinien, z. B. bei Kinderspiel- platzen. Zur Aufarbeitung von Bodenproben fur die PAK-Analytik sind verschiedene Verfahren entwickelt worden. Neben der Extraktion mit uberkritischen Gasen stehen fur eine Normvorlage derzeit zwei Probenvorbereitungen zur Diskussion. Dies ist zum einen die Soxhlet-Extraktion der homogenisierten Bodenprobe mit Toluol und zum anderen ein Verfahren fur gering belastete Boden, das Aceton als Extraktionsmittel vorsieht (ISOKD 13 877 Soil quality determination of polynuclear aromatic hydrocar- bons (PAH)-HPLC-Method (Februar 1994)).

20 30 40 min

Abb. 3-11: HPLC-Chromatogramm einer Bodenprobe. rnit 0.16 mgkg Benzo(a)pyren.


nrn->200 220 240 260 280 300 320 340 360 300 400 420 440

Abb. 3-U: Positive Identifizierung des UV-Spektrums von Benzo(a)pyren aus einer Realprobe durch Vergleich mit einem Standardspektrum.

Aber auch die Ultraschallextraktion in Verbindung mit polaren Losungsmitteln eig- net sich als einfaches Verfahren fur die Aufarbeitung von Bodenproben.

Die Abb. 3-11 gibt das mittels DAD erstellte HPLC-Chromatogramm einer gering belasteten Bodenprobe wieder. Hierzu wurden 15 g homogenisierte, luftgetrocknete Bodenprobe in einem dicht zu verschlieBenden 20 mL fassenden Schraubkappen-Rea-

mAbs

0

nm->220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440

Abb. 3-13: Positive ldentifizierung des UV-Spektrums von Fluoranthen aus einer Realprobe durch Vergleich mit einem Standardspektrum.


mAbs

0

nrnx200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440

0 .

nrnX200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440

Abb. 3-14: Positive Identifizierung des UV-Spektrums von Benzo(b)fluoranthen aus einer Real- probe durch Vergleich mit einem Standardspektrum.

genzglas mit 10 mL Isopropanol 1 h im Ultraschallbad extrahiert und ohne weitere Aufarbeitung 20 pL injiziert. Mittels Spektrenvergleich (Realprobe - Standard) war es moglich, trotz der geringen Konzentration, Benzo(a)pyren positiv zu identifizieren (Abb. 3-12). Die Konzentration betrug umgerechnet 0.16 mg/kg Boden.

Als weiteres Beispiel werden in den Abb. 3-13 und 3-14 die durch Spektrenvergleich identifizierten PAK Fluoranthen (0.4 mg/kg) und Benzo(b)fluoranthen (0.09 mgkg)

I I 10 20 30 rnin 40

Abb. 3-l5: Chromatogrammvergleich einer gering belasteten Bodenprobe gem&B Abb. 3-11 mit einem stark belasteten Kokereiboden.


rn

401

201

I 10 15 20 25 30 nin

Abb. 3-16: HPLC-Chromatogramm einer Distelolprobe auf PAK.

dargestellt. Dieses Beispiel zeigt, da13 die Diodenarray-Detektion empfindlich genug ist, auch zukiinftigen gesetzlichen Anforderungen beziiglich der Klassifizierung der Bodenqualitat zu geniigen. Als weiteres Beispiel wird in Abb. 3-15 das in Abb. 3-11 dargestellte Chromatogramm einer Bodenanalyse mit geringer Belastung einem verdiinnten Extrakt einer Bodenprobe gegenubergestellt, die einem Kokereigelande entnommen wurde.

Eine weitere interessante Anwendung, die sich als Erganzung zur HPLC-Methode mit wellenlangenprogrammierter Fluoreszenz ergab, ist die Untersuchung einer Distelolprobe auf PAK. Die aufwendige Aufarbeitung der Probe erfolgte nach einem Entwurf der DFG-Einheitsmethode C-111 17 a (1.10.1993). Im Rahmen der Untersu- chung konnten mittels Fluoreszenzdetektion zwar noch 0.0002 mg/kg Benzo(a)pyren bestimmt werden, jedoch erfolgte aufgrund starker Interferenzen im Bereich der ,,leichten" PAK bis Pyren keine Zuordnung und Quantifizierung.

Hier fuhrte die Anwendung des DAD, wie der Abb.3-16 zu entnehmen ist, zu einem positiven Nachweis von Fluoren (0.3 mg/kg), Phenanthren (0.2 mg/kg) und Antracen (0.9 mgkg), wobei sich derzeit noch keine Hinweise iiber die Herkunft dieser PAK ergeben haben und noch nicht ausgeschlossen werden kann, da13 im Rahmen der Aufarbeitung eine Kontamination erfolgt ist.

Die Identifizierung erfolgte mittels DAD, wobei die mit den Peaks korrelierenden UV-Spektren durch den Vergleich mit Standard-PAK-Spektren identifiziert und quantifiziert wurden (Abb. 3-17 bis 3-19).

Dieses Beispiel sol1 zeigen, da13 bei Kenntnis, was die UV-Spektrometrie bietet, sich des ofteren interessante Moglichkeiten eriiffnen, analytische Probleme zu losen.


I nm-r220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440

Abb. 3-17: Positive Identifizierung des UV-Spektrums von Anthracen aus einer Distelolprobe durch Vergleich mit einem Standardspektrum.

nm->220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 4 I

Abb. 3-18: Positive Identifizierung des UV-Spektrums von Phenanthren aus einer Distelolprobe durch Vergleich mit einem Standardspektrum.

150

1: 41

mAb:

0

nm-X


K) 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440

Abb. 3-19: Positive Identifizierung des UV-Spektrums von Pyren aus einer Distelolprobe durch Vergleich mit einem Standardspektrum.

3.7.2 Analytik von Pflanzenbehandlungs- und Schadlingsbekampfungsmitteln (PSM)

In der Lebensmittel- und Umweltanalytik hat die Bestimmung von Pflanzenbehand- lungs- und Schadlingsbekampfungsmitteln (PSM) - auch Pestizide genannt - einen hohen Stellenwert, da wir es hier mit biologisch wirksamen Substanzen zu tun haben, die - im Hinblick auf den Pflanzenschutz - bewul3t in unser Okosystem eingebracht werden. Da es sich bei PSM um Substanzen handelt, die ein mehr oder weniger hohes toxisches Potential besitzen, hat der Gesetzgeber im Rahmen der Vorsorge u. a. Hochstmengen fur Pflanzenbehandlungs- und Schadlingsbekampfungsmittel auf pflanzlichen Lebensmitteln festgelegt und in der Riickstandshochstmengen-Verord- nung (RHmV) fixiert.

Die landwirtschaftlichen Systeme, in denen PSM eingebracht werden, sind als offene Systeme anzusehen. So ist es nicht weiter verwunderlich, dal3 Wirkstoffe ihr Anwendungsgebiet verlassen und unerwiinschterweise in anderen Bereichen wieder auftauchen konnen. Ein grol3er Anteil der zugelassenen Pestizide ist wasserloslich und kann nach Ausbringung durch Auswaschen und Versickern in Grund- und Oberfll- chenwasser gelangen. Auf diesem Wege sind PSM in der Lage, unser Trinkwasser zu kontaminieren.

In diesem Zusammenhang darf nicht unerwahnt bleiben, dal3 speziell im Bereich der Riickstandsanalytik von PSM in und auf Lebensmitteln die gaschromatographi- sche Trennung mit einer umfangreichen Palette an Detektoren, wie u. a. das Massen- spektrometer, der ECD oder der Stickstoff-Phosphor-Detektor eine vorherrschende Rolle spielt.


Auf dem Gebiet der Wasseranalytik liefert jedoch die HPLC mit dem UV- oder Diodenarray-Detektor, speziell bei der Bestimmung einer Reihe von thermolabilen Phenylharnstoffen, sehr gute Resultate. Mit der Methode konnen aber auch Wirk- stoffe aus den Stoffklassen der Triazine, substituierter Anilide und Carbamate bestimmt werden. Speziell die Substanzklassen, die mittels HPLC und UV-Detektion erfaDt werden konnen, beinhalten eine Reihe von Herbiziden, die zu den mengenma- Dig am haufigsten eingesetzten PSM gehoren. Zu nennen sind hier u. a. das Diuron und das Isoproturon.

Fur die Verwendung der HPLC mit UV-Detektion existiert bereits ein DIN-Ent- wurf (DIN 38407 F-12). Mit dieser Methode ist man in der Lage, eine Reihe von wich- tigen Herbiziden mit der in der Trinkwasser-Verordnung geforderten Empfindlichkeit zu erfassen. Im Rahmen des DIN-Entwurfes 38407 F-12 wurde die in Tab. 3-6 aufge- fuhrte Stoffauswahl getroffen.

Fur Trinkwasser ist in Deutschland ebenfalls eine Hochstmenge an Pflanzenschutz- mitteln im Rahmen der Trinkwasser-Verordnung (TVO) festgesetzt, die bei 0.1 pg/L je Wirkstoff einschlieDlich ihrer toxischen Abbauprodukte und bei 0.5 pg/L in der Summe der PSM liegt. Diese Hochstmengen wurden in den Richtlinien ,,Qualitat von Wasser fur den menschlichen Gebrauch" von der EU ubernommen.

Derzeit werden europaweit rund 400 PSM verwendet. Entsprechend den unter- schiedlichen Einsatzgebieten z. B. gegen Insekten (Insektizide), schadliche Pike (Fun- gizide) oder Unkrauter (Herbizide), besitzen die einzelnen Pestizide differierende chemische Strukturen. Zu ihrem Nachweis mussen daher die unterschiedlichsten analytischen Methoden eingesetzt werden.

Um moglichst viele PSM in einer entsprechenden Matrix zu bestimmen, stehen im Zentrum einer optimalen Untersuchungsstrategie immer gruppenerfassende Sammel- methoden, Multimethoden genannt, mit denen eine mehr oder weniger hohe Anzahl an PSM erfaDt werden konnen. Die Auftrennung der PSM in einem Substanzgemisch kann sowohl mittels Gaschromatographie (GC) als auch mit der Hochleistungsflussig- keitschromatographie (HPLC) durchgefiihrt werden.

Tab. 3.6: Stoffauswahl gemll3 DIN 38407/T12.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Atrazin Desethylatrazin Cyanazin Sebuthylazin Terbuthylazin Hexazinon Chlortoluron Diuron Isoproturon Linuron Methabenzthiazuron Metobromuron Metoxuron Monolinuron Metazachlor Metolachlor

Triazin Triazin-Metabolit Triazin Triazin Triazin Phenylharnstoff Phenylharnstoff Phenylharnstoff Phenylharnstoff Phenylharnstoff Phenylharnstoff Phenylharnstoff Phenylharnstoff Phenylharnstoff Anilid Anilid


3.7.2.1 Bestimmung von PSM mittels HPLC und Diodenarray-Detektion

Unter den analytischen Grundbedingungen des 0. a. DIN-Entwurfes sind neben den in der Auswahlliste enthaltenen Stoffen noch eine Reihe weiterer Pestizide zu erfassen.

In Abb. 3-20 ist die chromatographische Trennung einer Standard-Pestizid- Mischung bei einer Wellenlange von 220 nm wiedergegeben. Fur die chromatographische Trennung wurde eine Trenndule mit Superspher@ 60, RP-select B-Material verwendet. An dieser Stelle darf der Hinweis nicht fehlen, dal3 das hier gewahlte Saulen- material eine Auswahl aus einer Reihe von Materialien darstellt, die fur die Trennung von Pestiziden gemal3 DIN 38407-F12 geeignet ist.

0 20 40 60 min

Abb. 3-20: HPLC-Chromatogramm der Trennung einer Standard-Pestizid-Mischung von 32 Pestiziden. Zuordnung siehe Tab. 3-7.

Tab. 3-7: Liste Standardmischung PSM.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11

Desisopropylatrazin Metamitron Fenuron Desethylatrazin Chloridazon Crimidin Desamino-Metamitron Metoxuron Simazin Monuron Cyanazin

12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Methabenzthiazuron Atrazin Chlortoluron Monolinuron Diuron Isoproturon Metobromuron Metazachlor Propazin Buturon Terbuth ylazin

23 24 25 26 27 28 29 30 31

Linuron Prometryn Anilazin Terbu tryn Metolachlor Parathion-meth yl Chlorfenvinphos Vinclozolin Parathion-ethyl


Analysenbedingungen der PSM-Bestimmung mittels HPLC:

HPLC-Slule: Supersphefl60, RP-selectB; 5 pm; 125 x 2 mm (Merck, Darmstadt)

Eluenten: LM A = Acetonitril (fur die Chromatographie) LM B = Wasser (fur die Chromatographie) mit 1 mmol K,HPO,

Gradient : Start: 14% LM A 0-55 min auf 43 % LM A

55-80 min auf 95 YO LM A

Equilibrierzeit : 20 min bei 14 YO LM A Mischkammer: 1.7 mL FluBrate: 0.24 mumin Temperatur : 19 "C

Diodenarray Detektion: Spektraler Bereich 200-350 nm, Bandbreite 1 nm

Im allgemeinen wird bei der Auswertung von Realproben die Identifizierung der Pestizide uber die Retentionszeiten und Vergleich der Extinktionskoeffizienten bei zwei oder drei Wellenlangen im UV-Bereich als ausreichend angesehen. Trotzdem besteht hier immer die Gefahr, daB die entsprechenden Peaks falschen Substanzen zugeordnet werden konnen. Bei Verwendung eines Diodenarray-Detektors, der in der Lage ist, kontinuierlich UVNIS-Spektren zu speichern, konnen die Analysenergeb- nisse zuverlassiger abgesichert werden.

In Abb. 3-21 ist das Chromatogramm einer Wasseranalyse wiedergegeben. Hier wurde eine 1 L Wasserprobe mittels Festphasen-Extraktion urn den Faktor 2000 angereichert. Die Probe wurde einem Hausbrunnen entnommen, der in unmittelbarer Nahe einer landwirtschaftlich intensiv genutzten FlBche angelegt worden war.

40

20.

ISOPROTURON

0 20 40 60 min

Abb. 3-21: HPLC-Chromatogramm einer Wasseranalyse auf Pflanzenschutzmittel.


50 50

mAbs

nm-> 200 220 240 260 280 300 320 340

Abb. 3-22: Positiver Vergleich des Spektrums eines Peaks bei 48.9 min mit dem Isoproturon- Standardspektrum.

Der Vergleich des Spektrums (Abb. 3-22 und 3-23) des Peaks bei 48.9 Minuten mit dem Isoproturon-Standardspektrum aus einer Spektren-Bibliothek fallt positiv aus, was durch einen Similarity-Index von 0.9999 ausgedruckt wird.

Bei den jeweiligen Spektren hat man sowohl die Moglichkeit, diese direkt zu ver- gleichen (Abb. 3-22) oder einen Normalisierungsmodus (Abb. 3-23) zu wahlen, der im gewahlten Spektralbereich die Spektren dem hochsten Absorptionsmaximum an- gleicht und somit einen visuellen Vergleich erleichtert. Weitere Identifizierungen, wie beispielsweise die von Atrazin bei 43.5 Minuten (Abb. 3-24) oder Cyanazin (ohne Spektrum) konnen automatisch durchgefiihrt werden. Eine Reihe von Wasserinhalts- stoffen besitzen jedoch gleiche Retentionszeiten wie verschiedene Phenylharnstoff- Pestizide. So ware der Peak bei 44.9 Minuten aufgrund der Retentionszeit dem Wirk-

29 I

I

nm-> 200 220 240 260 280 300 320 340

Abb. 3.23: Vergleich des Spektrums eines Peaks bei 48.9 min mit dem Isoproturon-Standard- spektrum im Normalisierungsmodus.


58 M

mAbS

C

nm->

Abb.3-24: Positiver Vergleich des Spektrums eines Peaks bei 43.5 min mit dem Atrazin-Stan- dardspektrum.

mAbs

0

nm-> 200 220 240 260 280 300 320 34C

349

Abb. 3-25: Negativer Vergleich des Spektrums eines Peaks bei 44.9 min mit dem bei dieser Retentionszeit zu erwartenden Chlortoluron-Standardspektrum.

stoff Chlortoluron zuzuordnen. Durch einen Spektrenvergleich (Peak-Standard; Abb. 3-25) kann diese Zuordnung nicht besttitigt werden.

3.7.2.2 Probenvorbereitung

Auch wenn ein leistungsfahiges Nachweis- und Bestimmungsverfahren die Basis fur analytisches Arbeiten ist, so ist doch die Probenvorbereitung vom Stellenwert gleich- zusetzen. Speziell fur Wasserproben hat sich die Festphasen-Extraktion (engl. : solid


phase extraction (SPE)) als eine geeignete Probenvorbereitungsmethode erwiesen, mit der die im Wasser vorhandenen Verbindungen angereichert, rnit Losemittel eluiert und anschlieflend rnit der HPLC und UV- bzw. Diodenarray-Detektion identifiziert und quantifiziert werden konnen.

Hier haben sich vor allem RP-18-Materialien und neuerdings auch Anreicherungs- phasen auf Polymerbasis bewahrt. Detaillierte Probenvorbereitungsvorschriften sowie Probenvorbereitungssysteme werden von allen Herstellern oder Vertretern von Anrei- cherungsphasen fur Anwender zur Verfugung gestellt.

Die vielen Probleme, die bei der Probenvorbereitung auftauchen konnen, lassen sich - trotz guter und detaillierter Vorschriften - nur durch Erfahrungen losen.

3.8 Derivatisierung in der UVNIS-Spektrometrie am Beispiel von Carbonylverbindungen

Zur Losung bestimmter analytischer Probleme kann es notwendig werden, die zu untersuchende Verbindung oder Verbindungsklasse zu derivatisieren, um diese fur bestimmte Trennverfahren verfugbar oder einen entsprechenden Detektor sichtbar bzw. sensitiver zu machen. Bei der Bestimmung organischer Verbindungen aus dem Bereich Lebensmittel- und Umweltanalytik unter Verwendung der UVNIS-Spektro- metrie, finden Derivatisierungsreaktionen dann Anwendung, wenn die zu untersuchende Substanz oder Substanzklasse ein ungunstiges Absorptionsverhalten, d. h. relativ niedrige Extinktionskoeffizienten im UVNIS-Spektralbereich besitzt. Dies gilt z. B. fur gesattigte Ketone, Aldehyde, Alkohole und niedere Carbonsauren. Fur einen solchen Fall bietet sich u. a. eine Derivatisierung an. Ein Beispiel ist die Bestimmung von Aldehyden und Ketonen als Denvate des 2.4-Dinitrophenylhydrazins (DNPH). Bei dieser Derivatisierung entstehen aus den Aldehyden und Ketonen 2.4-Dinitro- phenylhydrazone (Schiffsche Basen), die Absorptionsmaxima rnit um e = 28000 L *

mol-' . cm-' zwischen 350 und 410 nm besitzen (Abb. 3-26). Wie dem Reaktionsschema zu entnehmen ist, reagiert das 2.4-Dinitrophenylhydra-

zin mehr oder weniger mit den meisten Carbonylverbindungen. Dieser Sachverhalt zeigt, daB viele Derivatisierungen nur in Kombination mit einer leistungsfahigen chro- matographischen Trennung sinnvoll sind. Fur die chromatographische Trennung von 2.4-Dinitrophenylhydrazonen bietet sich insbesondere die Fliissigkeitschromatogra- phie rnit UV- bzw. Diodenarray-Detektion an. Eine Trennung der vier Carbonylverbin- dungen Formaldehyd, Acetaldehyd, Aceton und Propionaldehyd ist in Abb. 3-27 wiedergegeben sowie in den Abb. 3-28 und 3-29 die Spektren des Formaldehyd-DNPH und Acetaldehyd-DNPH.

3.8 Derivatisierung in der UVNIS-Spektrometrie 157

Derivatisieru ngsrea ktion

Carbonylverbindung

R, Q R-

R, O,N 0 NH-NH, +o=c( O,N 0 NH-N=C( + H,O c)

2,4-Dinitrophenyl hydrazin DNPH-Derivat (DNPH) (2,4-Dinitrophenylhydraton)

Abb. 326: Schematische Darstellung der Umsetzungsreaktion von Carbonylverbindungen mit 2.4-Dinitrophenylhydrazin (DNPH).

m 1 5

1 O(

5(

C

Propionaldehyd

Acetalc

Formaldehyc

Aceton

J

20 40 min

Abb. 3-27: HPLC-Chromatogramm einer Standardmischung von DNPH-Derivaten des Form- aldehyds, Acetaldehyds, Aceton und Propionaldehyds.

158

35

mAbs

0

nm->;


Formaldehyd-DNPH

- -~ - -~

I 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 44C

Abb. 3-28: Spektrum von Formaldehyd-DNPH.

13:

mAb

(

nm->: 0 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440

Abb. 3-29: Spektrum von Acetaldehyd-DNPH.

3.8 Derivatisierung in der UVNIS-Spektrometrie 159

Analysenbedingungen der Aldehyd-Bestimmung mittels HPLC:

HPLC-Saule: SuperspheF60, RP-select B; 5 pm; 125 x 2 mm (Merck, Darmstadt)

Eluenten : LM A = Acetonitril (fur die Chromatographie) LM B = Wasser (fur die Chromatographie)

Gradient: Start: 30 % LM A 0-40 min auf 80% LM A 40-45 min auf 95 % LM A 10 min isokratisch bei 95 % LM A

Equilibrierzeit : 15 rnin bei 30 % LM

Mischkammer: 1.7 mL

FluBrate: 0.23 mumin

Temperatur: 25 "C

Detektion: UV bei 355 nm

Allgemeine Vorschrift zur Darstellung von DNPH-Derivaten von Carbonylverbindungen :

10 mmol der entsprechenden Carbonylverbindungen (UberschuB) werden je nach Ver- bindung in 10-20 mL Acetonitril, gelost, mit 2 mmol 2.4-Dinitrophenylhydrazin in Acetonitril versetzt. Man laBt 10-20 min reagieren und gibt sodann die Reaktionslb- sung in 150 mL einer wasserigen 1N HCl.

Der gelbe Niederschlag wird abgesaugt und zweimal mit je 30 mL dest. Wasser gewaschen. Nach Trocknung uber einem Trocknungsmittel im Vakuum wird die Rein- heit des Derivates - Regel bei 98-99 % - mit der HPLC uberpruft. Falls zuviel Aus- gangsprodukt (DNPH) oder Verunreinigungen im HPLC-Chromatogramm zu sehen sind, mu8 aus Ethanol umkristallisiert werden.

3.8.1 Formaldehyd-Bestimmung in Innenraumen

Anwendung findet die Analytik auf Aldehyde - mit Schwerpunkt auf Formaldehyd - vor allem bei der Luftuntersuchung in Innenraumen. Der Grund hierfur liegt in der Tatsache, daB empfindliche Menschen schon auf sehr geringe Konzentrationen an For- maldehyd in der Raumluft reagieren konnen.

Wie Untersuchungen gezeigt haben, liegt eine zum Teil naturliche Grundbelastung an Formaldehyd, Acetaldehyd und in geringem MaBe auch einiger hoherer homologen Aldehyde vor, die in Abhangigkeit von Parametern wie u. a. die lokalen Verhaltnisse, Tageszeit, Sonneneinstrahlung etc. in einem Bereich von 0.0001 und 0.001 ppm liegen

160

mL

1000

500

C


DF

'k-

:ormaldehyd-DNPH

ketaldehvd

nin

Abb. 3-30: HPLC-Chromatogramm einer Raumluftanalyse auf Formaldehyd.

konnen. Hohere Werte, beispielsweise Uberschreitungen der Grenzwertempfehlun- gen von 0.1 ppm in Innenraumen sind in der iiberwiegenden Zahl der untersuchten Falle nur sehr wenigen Quellen zuzuordnen. An erster Stelle sind hier formaldehyd- gebundene Spanplatten, z. B. in Mobeln, zu nennen, die jedoch stark in der Anwen- dung zuriickgegangen sind.

Eine weitere nicht zu unterschatzende Quelle ist der Zigarettenrauch. Werden in einem Raum 5 bis 10 Zigaretten geraucht, konnen Konzentrationen bis 0.1 ppm Form- aldehyd auftreten.

Wird Formaldehyd nach der DNPH-Methode bestimmt, so liegt das Prinzip der Derivatisierung darin, Raumluft durch eine Waschflasche zu leiten, die eine saure wasserige 2.4-Dinitrophenylhydrazin-Losung (0.25 g/100 mL 6 N HCI) enthalt. Die durchgeleiteten Carbonylverbindungen werden derivatisiert und nach Extraktion mit einem unpolaren Losungsmittel mittels HPLC und UV-Detektion nach der unter 3.8.1 angegebenen HPLC-Methode analysiert .

Eine Quantifizierung kann iiber entsprechende Standard-Losungen, in denen eine definierte Carbonyl-Menge derivatisiert und anschliel3end vermessen wird, erfolgen oder durch die Einwaage von praparativ dargestellten Standard-DNPH-Derivaten.

Die Abb. 3-30 zeigt das HPLC-Chromatogramm einer Raumluftanalyse, bei der 0.8 ppm Formaldehyd (1 ppm Formaldehyd - 1.25 mg/m3 Luft bei 25 "C) bestimmt werden konnten.

3.9 Literatur 161

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Documents

Lebensmittel- und Umweltanalytik mit der Spektrometrie || UV-VIS-Spektrometrie